JP2014533931A - 病原体を防除するためのアミノ酸配列 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ティラピア（ナイルティラピア）の鰓抽出物から単離し、精製した抗菌性ペプチドに関する。前記ペプチドは、化学合成又は通常の分子生物学手法による細菌及び酵母などの異種系での発現によって生成することができる。前記ペプチドは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌及びウイルスを含めた種々の生物に対して抗菌活性を示す。本発明は、前記抗菌性ペプチドを含む、病原体を防除するための組成物も包含する。本発明は、ワクチン調製物中の分子アジュバントとしての前記ペプチドの使用にさらに関する。
Description
本発明はバイオテクノロジー分野に関し、特に、抗菌性ペプチドを獲得し、病原体の防除のためにそれを使用するバイオテクノロジー分野に関する。抗菌性ペプチドを与えると、病原体によって引き起こされる疾患の抑制が抗菌性ペプチドによって効果的に達成される。さらにこれらのペプチドは、ワクチン中に含まれる種々の抗原によって誘導される免疫応答を増強するのに寄与する。
魚は、広範囲の病原体に対して第一防御として働く強力な先天免疫系を有しており、（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（２００８）Ｆｉｓｈ ａｎｄ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：６２５〜６３２）、適応免疫系は十分に発達していない（Ｍａｇｎａｄｏｔｔｉｒ、（２０１０）Ｍａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３６１〜３７９）。魚が病原体と戦う方法の一つは、先天防御機構としての抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の分泌による。ＡＭＰは、先天免疫系での根本的な役割を有し、感染を引き起こす種々の細菌、真菌、ウイルス及び他の病原体から保護する（Ｓｏｌｏｍｏｎ、（２００８）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．７：１１６〜１１８）。一般に、ＡＭＰは、病原体の標的である唾液、粘液、循環系及び他の領域に分泌される（Ｎｏｇａら（２０１０）Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｄ：Ｇｅｎｏｍ Ｐｒｏｔｅｏｍ．６：４４〜５４）。
ＡＭＰは、そのアミノ酸組成及び構造に基づいて５つのカテゴリーに分類される。これらのカテゴリーには、陰イオン性ペプチド、α−ヘリックス両親媒性構造を有する直鎖ペプチド、特定のアミノ酸で強化された陽イオン性ペプチド、ペプチド断片及び分子内結合を形成するシステインを有するペプチドが含まれる（Ｂｒｏｇｄｅｎ（２００５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：２３８〜５０；Ｂｏｍａｎ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１７３：５〜１６）。陰イオン性ペプチドはミリモル濃度で産生され、補助因子として亜鉛を必要とし、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して抗菌活性を示す。両親媒性α−ヘリックス構造を有する直鎖及び陽イオン性ペプチドは、４０個未満のアミノ酸を有し、中央部分にヒンジ領域を有する三次元構造を持つ。その構造は溶液中で乱れるが、これらの分子は、膜と接触している場合はα−ヘリックス二次構造をとる（Ｂｒｏｇｄｅｎ（２００５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：２３８〜５０）。特定のアミノ酸で強化された直鎖陽イオン性ペプチドから成る他の群はシステイン残基を持たないため、これらのペプチドは溶液中で非常に柔軟な構造を有する（Ｂｒｏｇｄｅｎ（２００５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：２３８〜５０）。４番目の群は荷電ペプチドを含み、これは大きなタンパク質の断片である。これらのペプチドは、抗菌活性及び他の群のペプチドと類似した構造を持つ（Ｂｅｌｌａｍｙら（１９９２）Ｊ Ａｐｐｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３：４７２〜９；Ｚａｎｅｔｔｉら（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７４：１〜５）。５番目のペプチド群は約３８０のメンバーから成り、これらは、分子内結合及びβシート構造を形成する６つの保存されたシステイン残基を含む（Ｂｒｏｇｄｅｎ（２００５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：２３８〜５０）。この群は、デフェンシン及びヘプシジンを含む（Ｂｏｍａｎら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１７３：５〜１６）。
ＡＭＰは構造的特徴の差異によって通常分類されるが、これらのペプチドのほとんどに共通している特色もある。例えば、ＡＭＰは一般に６０個未満のアミノ酸を有し、生理的条件下で広い抗菌活性スペクトルを有し、正電荷を有する（Ｚａｓｌｏｆｆ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１５：３８９〜３９５）。ほとんどの両親媒性ＡＭＰは、細菌及びエンベロープウイルスなどの病原体の脂質細胞膜とのその相互作用に基づいて、これらのペプチドの作用機構に寄与する構造をとる（Ｓｈａｉ（２００２）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ６６：２３６〜４８；Ｊｅｌｉｎｅｋ及びＫｏｌｕｓｈｅｖａ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．６：１０３〜１４）。この相互作用原因は、病原体の脂質膜を迅速に不安定化／易透化する。いくつかの知見は、孔形成機構に加えて、ＡＭＰは、細胞壁、核酸及びタンパク質の合成を阻害することができ、酵素活性さえも阻害することができることを示唆している（Ｂｒｏｇｄｅｎら（２００５）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５５８〜６４；Ｃａｍｐａｇｎａら（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：１７７１〜８）。
微生物は抗生物質に対する抵抗性を発達することができるため、及び病原体によって引き起こされる、適切な治療法がない疾患が存在するため、抗菌活性を有する新しい分子を探索することが必要である。
したがって、解決すべき重要な課題は、新しい抗菌製品、特に、幅広い病原体を効率的に防除することができ、さらに先天免疫及び適応免疫に影響を与え、水産養殖を含めた、ヒトの医学及び獣医学において極めて重要な面を有するタンパク質及び／又はペプチドを開発することである。
本発明は、細菌、ウイルス又は真菌によって引き起こされる感染症を含めた、病原体によってもたらされる感染症を防除及び治療するための新しい代替物を提供することによって、上述の課題を解決する。本発明では、配列番号１、２及び３として識別される抗菌性ペプチドを初めて報告する。配列番号１、２及び３として識別されるものをアミノ酸配列中に含むアミノ酸配列又は配列番号１、２若しくは３として識別されるペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列も、本発明の一目的である。
ティラピア（ナイルティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ））の鰓タンパク質抽出物から、３つのペプチドを単離し、配列決定し、これらを、オレオクロマイシン（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｃｉｎ）Ｉ、オレオクロマイシンＩＩ及びオレオクロマイシンＩＩＩと称した。これらのペプチドは、文献に報告されておらず、配列番号１、２及び３として本発明で示す。これらのペプチドは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、ウイルス及び真菌に対して抗菌効果を持つ。本発明のペプチドは、その天然源からの単離によって得ることができる。加えて、これらのペプチドは、化学合成又は組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）技術によって得てもよい。
本発明の一実施形態では、抗菌性ペプチドは、細菌、酵母又は高等生物の細胞での組換体の発現によって得る。これらの抗菌性ペプチドは、様々な宿主系で発現させることができ、それらから単離することができる。特定の実施形態では、抗菌性ペプチドを酵母で発現させることができる。好ましい実施形態では、組換えＤＮＡ技術による発現は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で、好ましくは培養上清で行われる。本発明の抗菌性ペプチドは、細菌で発現させてもよい。別の好ましい実施形態では、組換えＤＮＡ技術による発現は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる。本発明のペプチドは、タンパク質単離手法によって宿主から得てもよく、この手法は当業者に広く知られており、例えばクロマトグラフィー手法、洗浄ペレット及び他の手法などである。
抗菌性ペプチドの使用は、他の抗菌剤と比較して利点がある。なぜなら、抗菌性ペプチドはサイズが小さく（約５ｋＤａ）、そのため、水産養殖にとってコスト的に有利で且つ汚染レベルが低い投与経路である浸漬によって与える場合は、水生生物の皮膚及び粘液から吸収されやすい。別の利点は、抗菌性ペプチドが、先天免疫及び適応免疫の活性を刺激し、病原因子による感染への抵抗性を増大させることである。
各ペプチドのアミノ酸配列を考慮して縮重オリゴヌクレオチドを設計して、各成熟ペプチドをコードするヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅した。したがって、本発明の別の目的は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から成る群から選択される核酸配列を含む核酸である。
本発明の別の目的は、配列番号１、２及び３として識別されるアミノ酸配列又は配列番号１、２若しくは３として識別されるペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸である。
本発明は、配列番号１、２及び３として識別されるペプチド又は配列番号１、２若しくは３として識別されるペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するペプチドを含む、病原体防除のための組成物も提供する。
本発明の一実施形態では、配列が主張される抗菌性ペプチド（及びそれを含む組成物）を使用して多種多様な病原体、例えば細菌性病原体（中でも、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、腸内細菌、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、粘液細菌（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ））；ウイルス性病原体（中でも、伝染性造血器壊死症ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、出血性敗血症ウイルス（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、コイ出血性ウイルス（ｃａｒｐ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｖｉｒｕｓ）、コイ春ウイルス血症ウイルス（ｓｐｒｉｎｇ ｖｉｒｅｍｉａ ｏｆ ｃａｒｐ ｖｉｒｕｓ）、ヒラメラブドウイルス（Ｈｉｒａｍｅ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）又はライギョラブドウイルス（Ｓｎａｋｅｈｅａｄ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、リンホシスチスウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、伝染性サケ貧血（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｓａｌｍｏｎ ａｎｅｍｉａ））、真菌、並びに卵菌（中でも、ミズカビ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）、ワタカビ（Ａｃｈｌｙａ）、イクチオスポリジウムホフェリ（Ｙｃｈｔｈｙｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｈｏｆｅｒｉ））を防除することができる。
本発明の一実施形態では、オレオクロマイシンＩペプチド、オレオクロマイシンＩＩペプチド及びオレオクロマイシンＩＩＩペプチド、並びにそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するペプチドを、哺乳動物及び水生生物を含めた様々な生物において病原体を防除するのに使用する組成物中に調合する。病原体の防除において、こうした組成物を予防的及び治療的の両方で投与する。投与経路としては、ヒトでの薬物投与について、及び動物の場合には医薬品又は添加物について使用される全ての投与経路が挙げられ、これらは当業者に周知である。一実施形態では、病原体防除のための本発明の組成物は、経口的、非経口的に又は薬浴によって投与する。
病原体防除のための組成物を製造するための、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドの使用も、本発明の一態様である。
それらの別の態様は、いくつかの生物を攻撃する病原体を防除するための方法を提供することであり、これは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む有効量のペプチドを前記生物に投与することを特徴とする。
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、０．１から１０μｇ／魚の濃度で定期的に注入することによって、０．０１から０．１ｍｇ／水１Ｌの間のペプチド濃度で１〜１５日の間隔（連日又は隔日）で淡水又は海水中で薬浴させることによって、魚に与える。ペプチドは、約５０〜７５０μｇのペプチド／ｋｇ飼料の濃度で、魚用の飼料添加物として与えることもできる。全てのケースで、病原体、中でもウイルス、細菌又は真菌などによって引き起こされる疾患に対する抵抗性が有意に増大する。
さらに本発明は、ワクチンに対する分子アジュバントとして有用なペプチドを提供する。本発明においては、用語「分子アジュバント」は、ワクチン抗原に対する免疫応答をモジュレートし、免疫応答の増大をもたらすことができるタンパク質性分子を指す。
したがって本発明は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む分子アジュバントとしてのペプチドとワクチン抗原とを含有するワクチン組成物も提供する。
本発明の別の態様は、ワクチン抗原に対する免疫応答を増大させる方法であって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを、ワクチン中の分子アジュバントとして用いる方法を提供することである。
（例１）
ティラピアの鰓抽出物からの抗菌性ペプチドの単離及び精製
ティラピア（ナイルティラピア）の鰓弁を液体窒素に浸けて細断し、生成粉末を１００℃で１０分間加熱し、冷却させた。ＨＣｌ ２Ｍ、ギ酸１０％（ｖ／ｖ）、ＮａＣｌ ２％（ｗ／ｖ）及びトリクロロ酢酸１％（ｖ／ｖ）の溶液を１５０ｍＬ加えてタンパク質を抽出し、続いて１〜２分間ホモジナイズした。このホモジネートを２００００×ｇで３０分間遠心分離し、上清をｐＨ４．０に調整し、濾過した。得られた濾液を酸抽出物として使用し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）にアプライした。トリフルオロ酢酸０．１％（ｖ／ｖ）で洗浄後、ペプチドに相当する画分を８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸で溶出した。溶出液を乾燥させ、酢酸１Ｍ中に溶解し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５のマトリックスに吸着させた。酢酸１Ｍ、ピリジン２Ｍ及びピリジン２Ｍ／酢酸（ｐＨ５．０）を用いた連続的な溶出ステップによって、５つの画分を得た。各画分に対して抗菌活性を実行し、次の精製ステップ用に画分２を選択した。
ティラピアの鰓抽出物からの抗菌性ペプチドの単離及び精製
ティラピア（ナイルティラピア）の鰓弁を液体窒素に浸けて細断し、生成粉末を１００℃で１０分間加熱し、冷却させた。ＨＣｌ ２Ｍ、ギ酸１０％（ｖ／ｖ）、ＮａＣｌ ２％（ｗ／ｖ）及びトリクロロ酢酸１％（ｖ／ｖ）の溶液を１５０ｍＬ加えてタンパク質を抽出し、続いて１〜２分間ホモジナイズした。このホモジネートを２００００×ｇで３０分間遠心分離し、上清をｐＨ４．０に調整し、濾過した。得られた濾液を酸抽出物として使用し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）にアプライした。トリフルオロ酢酸０．１％（ｖ／ｖ）で洗浄後、ペプチドに相当する画分を８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸で溶出した。溶出液を乾燥させ、酢酸１Ｍ中に溶解し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５のマトリックスに吸着させた。酢酸１Ｍ、ピリジン２Ｍ及びピリジン２Ｍ／酢酸（ｐＨ５．０）を用いた連続的な溶出ステップによって、５つの画分を得た。各画分に対して抗菌活性を実行し、次の精製ステップ用に画分２を選択した。
選択した画分を凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリル４０％中に溶解した。一定分量の溶液をＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷカラム（ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））にアプライして、トリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリル４０％で溶出した。同一画分をこのカラムに繰り返し注入し、分子量が５ｋＤａより小さく且つ抗菌活性を示す生成画分を凍結乾燥し、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及び質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）にかけた。この画分の分子量を、トリシン−ナトリウムドデシルサルファート（１６．５％ Ｔ／３％ Ｃ）（トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する）によるゲル電気泳動で決定した。
ＨＰＬＣによるタンパク質分離を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ１１００システムで行った。溶媒Ａはトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリル５％とし、溶媒Ｂはトリフルオロ酢酸０．０８５％を含むアセトニトリル８０％とした。画分Ａを溶媒Ａで還元し、Ｃ８−３カラム（４．６×１５０ｍｍ）によるＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。勾配は、０〜２分を０％の溶媒Ｂ、２〜５分を０〜２０％の溶媒Ｂ、５〜５５分を２０〜４７％の溶媒Ｂ、５５〜８０分を４７〜１００％の溶媒Ｂとした。抗菌活性を示す生成画分を凍結乾燥し、アセトニトリル２５％を含むＫＨ２ＰＯ４／Ｈ３ＰＯ４ ５ｍＭ（ｐＨ３．０）で還元し、ＰｏｌｙＳｕｌｆｏｅｔｈｙｌ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅカラム（４．６×２００ｍｍ）に負荷した。画分をＫＣｌの直線勾配で溶出した。最も高い抗菌活性を示した画分の分子量は、２５２７．３、２９８１．９及び３６５４．６Ｄａであった。これらのペプチドを、それぞれオレオクロマイシンＩ、ＩＩ及びＩＩＩと名付けた。抗菌活性を有する各ペプチドのアミノ酸配列を決定した。今後は、これらを、それぞれ配列番号１、２及び３として識別する。さらに、ＢｌａｓｔＸプログラムを用いて配列解析を行い、これらのペプチドがこれまでに報告されていないことが分かった。
（例２）
大腸菌において細胞内で及び酵母Ｐ．パストリスにおいて細胞外で抗菌性ペプチドを発現するためのベクターの構築
大腸菌において細胞内で及び酵母Ｐ．パストリスにおいて細胞外で抗菌性ペプチドを発現するためのベクターの構築
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ティラピア（ナイルティラピア）の鰓から単離したリボ核酸（ＲＮＡ）から逆転写反応によって得た。この反応は、「Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に記載されている説明に従って行った。簡単に述べると、４μｇの全ＲＮＡを核酸分解酵素フリーの微量遠心機チューブに入れ、７０℃で１０分間インキュベートした。その後、残りの反応成分（４μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２μＬの１０ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液、２μＬの１０×逆転写バッファー、０．５μＬのＲＮＡ分解酵素阻害剤、１μＬのオリゴ（ｄＴ）５００μｇ／ｍＬ、２０ユニットの逆転写酵素及び前もってジエチルピロカーボナートで処理した水（最終容量２０μＬ））を加えた。この反応は、４２℃で１５分間インキュベートし、５分間の９５℃で止めた。
抗菌性ペプチドの成熟領域をコードするヌクレオチド配列を、各ペプチドのアミノ酸配列から設計した縮重合成オリゴヌクレオチドを使用して、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。全てのケースで、期待される大きさのＤＮＡバンドが得られた。これらのバンドをアガロースゲルから精製し、市販ベクターのｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入して、配列を決定した。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列番号４、５及び６として識別した。
抗菌性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、制限酵素部位ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩを用いて大腸菌発現ベクターｐＡＲ３０４０に挿入した（図１Ａ）。各ペプチドに対応するバンドを増幅するために、それぞれの５’及び３’末端の特異的な配列を認識し、且つこの発現ベクターへクローニングしやすくする制限酵素の認識部位を有するオリゴヌクレオチドを使用した。各ペプチドについて、組換えクローンのうちの一つを選択して、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株を形質転換し、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍＭを誘導物質として使用して、Ｔ７プロモーターの制御下で遺伝子発現を誘導した。遺伝子発現は、３７℃で６時間行った。組換えペプチドの発現は、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＳＩ−ＭＳによって確認した。
ｐＰＳ９及びｐＰＳ１０ベクター及び各ペプチドの５’及び３’配列を認識し且つ制限酵素認識部位を有する特異的なオリゴヌクレオチドを使用して、Ｐ．パストリスでの抗菌性ペプチド発現ベクターを構築した。ｐＰＳ９ベクターへのクローニングについてはＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ部位を使用し、ｐＰＳ１０ベクターへのクローニングについてはＮａｅＩ及びＳｐｅＩ部位を使用した。これらのクローニングストラテジーでは、目的のタンパク質にアミノ酸が付加されない（図１Ｂ）。
プラスミドを直鎖状にしてから、Ｐ．パストリスＭＰ３６株を形質転換した。この形質転換はエレクトロポレーションによって行った。ＭＰ３６株は栄養要求変異体ｈｉｓ３であり、形質転換後にＨｉｓ＋表現型を獲得した。
形質転換体クローンをドットブロットによって特定した。サザンブロット手法によって、これらのクローンでは、組換えプラスミドの発現カセットによるＰ．パストリスの遺伝子ＡＯＸ１の置換によって組込みが起こったことが確かめられ、これらは、Ｍｕｔｓ表現型（メタノール低利用）及びＨｉｓ＋に相当した。酵母Ｐ．パストリスは低レベルの自己タンパク質を分泌し、且つその培養培地はタンパク質を補充する必要がないので、培地中の全タンパク質の大部分（８０％タンパク質超）を占める、細胞外培地に分泌される異種タンパク質を期待することができる（Ｔｓｃｈｏｐｐら（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１３０５〜１３０８）。
Ｐ．パストリスでのペプチド発現は、培養培地にメタノールを加えて５リットルで行った。組換えペプチドの発現及びその完全性をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＳＩ−ＭＳで確認した。
（例３）
抗菌性ペプチドの精製及び生物活性アッセイ
組換えで得た抗菌性ペプチドを、大腸菌を破壊した上清又はＰ．パストリスの培養上清から精製した。最初に、孔径が１ｋＤａの膜を使用して、酢酸ナトリウム２５ｍＭ（ｐＨ４．５）中で透析を行った。透析産物を、酢酸ナトリウム２５ｍＭ（ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの樹脂にアプライし、塩化ナトリウム１Ｍ、Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ（ｐＨ７．６）でタンパク質を溶出した。ペプチドを含む画分を回収し、孔径が１ｋＤａの膜を用いる限外濾過システムを使用して濃縮した。検出用に、２５４ｎｍの波長を用いた。精製をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、タンパク質をクマシーブルー染色で可視化した（図２）。
抗菌性ペプチドの精製及び生物活性アッセイ
組換えで得た抗菌性ペプチドを、大腸菌を破壊した上清又はＰ．パストリスの培養上清から精製した。最初に、孔径が１ｋＤａの膜を使用して、酢酸ナトリウム２５ｍＭ（ｐＨ４．５）中で透析を行った。透析産物を、酢酸ナトリウム２５ｍＭ（ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの樹脂にアプライし、塩化ナトリウム１Ｍ、Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ（ｐＨ７．６）でタンパク質を溶出した。ペプチドを含む画分を回収し、孔径が１ｋＤａの膜を用いる限外濾過システムを使用して濃縮した。検出用に、２５４ｎｍの波長を用いた。精製をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、タンパク質をクマシーブルー染色で可視化した（図２）。
本発明のペプチドは、当業者に知られている方法を用いて化学合成によっても得た。ペプチドの抗菌活性を微量希釈法によって測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために、各ペプチドを１：２に連続希釈した。１０マイクロリットルの各希釈ペプチドを、９０μＬの細菌又は酵母の懸濁液（１ｍＬ当たり５ｘ１０５ＣＦＵ（コロニー形成単位））と共に、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（細菌）又はＳａｂｏｕｒａｕｎｄブロス（真菌）中で、２８℃（魚の病原体及び真菌用）又は３７℃（哺乳類の病原体用）で１８時間インキュベートした。ＭＩＣは、細菌の発育を阻止する最低のペプチド濃度であると定義される。全てのアッセイは、３重で行い、（微生物を含まない）培養培地及びペプチドを加えない微生物を対照として使用した。結果を表１に示す。
（例４）
抗菌性ペプチドで前もって処理したティラピアにおけるエロモナス・ヒドロフィラ感染に対する抵抗性の測定
腹腔内注入によるペプチド投与
次に、ｉｎ ｖｉｖｏでの耐病性の増強に対する抗菌性ペプチドの有用性を評価した。第一の試験では、体重が１０ｇのティラピア（ナイルティラピア）を１３０匹使用し、これらを、群当たり１０匹の動物の１３実験群に無作為に割り振った。このアッセイは、Ａ．ヒドロフィラの攻撃に対する魚の生存率を高めるのに必要な最小処理時間を決定するために行った。各ペプチドを、魚１匹当たり１μｇの濃度で腹腔内注入によって、２、４、８及び１５日間投与した。ＰＢＳを投与したさらなる群を対照として置いた。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳ
群２：２日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群３：４日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群４：８日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群５：１５日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群６：２日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群７：４日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群８：８日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群９：１５日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群１０：２日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
群１１：４日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
群１２：８日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
群１３：１５日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
抗菌性ペプチドで前もって処理したティラピアにおけるエロモナス・ヒドロフィラ感染に対する抵抗性の測定
腹腔内注入によるペプチド投与
次に、ｉｎ ｖｉｖｏでの耐病性の増強に対する抗菌性ペプチドの有用性を評価した。第一の試験では、体重が１０ｇのティラピア（ナイルティラピア）を１３０匹使用し、これらを、群当たり１０匹の動物の１３実験群に無作為に割り振った。このアッセイは、Ａ．ヒドロフィラの攻撃に対する魚の生存率を高めるのに必要な最小処理時間を決定するために行った。各ペプチドを、魚１匹当たり１μｇの濃度で腹腔内注入によって、２、４、８及び１５日間投与した。ＰＢＳを投与したさらなる群を対照として置いた。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳ
群２：２日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群３：４日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群４：８日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群５：１５日間連続投与のオレオクロマイシンＩ
群６：２日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群７：４日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群８：８日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群９：１５日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩ
群１０：２日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
群１１：４日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
群１２：８日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
群１３：１５日間連続投与のオレオクロマイシンＩＩＩ
ペプチドの投与期間後、半致死量（ＬＤ５０）のＡ．ヒドロフィラを腹腔内注入して攻撃試験を行い、死亡率を７日間記録した。相対生存率（ＲＰＳ）を以下のように計算した：
ＲＰＳ（％）＝（対照の死亡率（％）−処置群の死亡率（％））／（対照の死亡率（％））ｘ１００
ＲＰＳ（％）＝（対照の死亡率（％）−処置群の死亡率（％））／（対照の死亡率（％））ｘ１００
結果として、オレオクロマイシンＩ及びオレオクロマイシンＩＩＩで１５日間処理した魚が、ＰＢＳを与えた群と比較して、（ＲＰＳとして計測した）生存率が４５％増大したことが観察された。一方、オレオクロマイシンＩＩで８日間処理した群は、ＰＢＳを与えた群と比較して生存率（ＲＰＳ）が４８％増大した。
Ａ．ヒドロフィラ攻撃後の魚の生存率を増大させるのに必要なペプチドの至適用量を決定するために、第二の試験を行った。体重が約１０ｇのティラピア（ナイルティラピア）を１３０匹使用し、これらを、それぞれ１０匹の動物の１３実験群に無作為に割り振った。各ペプチドを魚１匹当たり０．５、１、５及び１０μｇの濃度で１５日間投与した。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳ
群２：オレオクロマイシンＩ ０．５μｇ／魚
群３：オレオクロマイシンＩ １μｇ／魚
群４：オレオクロマイシンＩ ５μｇ／魚
群５：オレオクロマイシンＩ １０μｇ／魚
群６：オレオクロマイシンＩＩ ０．５μｇ／魚
群７：オレオクロマイシンＩＩ １μｇ／魚
群８：オレオクロマイシンＩＩ ５μｇ／魚
群９：オレオクロマイシンＩＩ １０μｇ／魚
群１０：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．５μｇ／魚
群１１：オレオクロマイシンＩＩＩ １μｇ／魚
群１２：オレオクロマイシンＩＩＩ ５μｇ／魚
群１３：オレオクロマイシンＩＩＩ １０μｇ／魚
群１：ＰＢＳ
群２：オレオクロマイシンＩ ０．５μｇ／魚
群３：オレオクロマイシンＩ １μｇ／魚
群４：オレオクロマイシンＩ ５μｇ／魚
群５：オレオクロマイシンＩ １０μｇ／魚
群６：オレオクロマイシンＩＩ ０．５μｇ／魚
群７：オレオクロマイシンＩＩ １μｇ／魚
群８：オレオクロマイシンＩＩ ５μｇ／魚
群９：オレオクロマイシンＩＩ １０μｇ／魚
群１０：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．５μｇ／魚
群１１：オレオクロマイシンＩＩＩ １μｇ／魚
群１２：オレオクロマイシンＩＩＩ ５μｇ／魚
群１３：オレオクロマイシンＩＩＩ １０μｇ／魚
ペプチド投与１５日後に、ＬＤ５０のＡ．ヒドロフィラを腹腔内注入して攻撃試験を行い、死亡率を７日間記録した。ＲＰＳを上記のように計算した。攻撃してから７日後に、３つのペプチド全てが用量依存的効果を示し、これらは、１０％の生存率を示したＰＢＳのみを与えた群と比較して、８４％から８８％のＲＰＳを有する。
薬浴によるペプチド投与
Ａ．ヒドロフィラ攻撃後の魚の生存率に対する薬浴投与による各ペプチドの効果を判定するために、試験を行った。孵化してから５日後の１３００匹のティラピア（ナイルティラピア）幼生を使用し、これらを、各１００匹の幼生の１３実験群に無作為に割り振った。各ペプチドを、水１リットル当たり０．０１、０．０５、０．１及び０．５ｍｇのペプチド濃度で１５日間投与した。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳ
群２：オレオクロマイシンＩ ０．０１ｍｇ／Ｌ
群３：オレオクロマイシンＩ ０．０５ｍｇ／Ｌ
群４：オレオクロマイシンＩ ０．１ｍｇ／Ｌ
群５：オレオクロマイシンＩ ０．５ｍｇ／Ｌ
群６：オレオクロマイシンＩＩ ０．０１ｍｇ／Ｌ
群７：オレオクロマイシンＩＩ ０．０５ｍｇ／Ｌ
群８：オレオクロマイシンＩＩ ０．１ｍｇ／Ｌ
群９：オレオクロマイシンＩＩ ０．５ｍｇ／Ｌ
群１０：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．０１ｍｇ／Ｌ
群１１：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．０５ｍｇ／Ｌ
群１２：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．１ｍｇ／Ｌ
群１３：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．５ｍｇ／Ｌ
Ａ．ヒドロフィラ攻撃後の魚の生存率に対する薬浴投与による各ペプチドの効果を判定するために、試験を行った。孵化してから５日後の１３００匹のティラピア（ナイルティラピア）幼生を使用し、これらを、各１００匹の幼生の１３実験群に無作為に割り振った。各ペプチドを、水１リットル当たり０．０１、０．０５、０．１及び０．５ｍｇのペプチド濃度で１５日間投与した。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳ
群２：オレオクロマイシンＩ ０．０１ｍｇ／Ｌ
群３：オレオクロマイシンＩ ０．０５ｍｇ／Ｌ
群４：オレオクロマイシンＩ ０．１ｍｇ／Ｌ
群５：オレオクロマイシンＩ ０．５ｍｇ／Ｌ
群６：オレオクロマイシンＩＩ ０．０１ｍｇ／Ｌ
群７：オレオクロマイシンＩＩ ０．０５ｍｇ／Ｌ
群８：オレオクロマイシンＩＩ ０．１ｍｇ／Ｌ
群９：オレオクロマイシンＩＩ ０．５ｍｇ／Ｌ
群１０：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．０１ｍｇ／Ｌ
群１１：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．０５ｍｇ／Ｌ
群１２：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．１ｍｇ／Ｌ
群１３：オレオクロマイシンＩＩＩ ０．５ｍｇ／Ｌ
ペプチド投与１５日後に、ＬＤ５０のＡ．ヒドロフィラを薬浴によって投与して攻撃試験を行い、死亡率を１０日間記録した。ＲＰＳを先に述べたように計算した。攻撃してから１０日後に、３つのペプチド全てが用量依存的効果を示し、これらは、１８％の生存率を示したＰＢＳのみを与えた群と比較して、７６％から８９％のＲＰＳを示した。
飼料添加物としての経口投与
Ａ．ヒドロフィラ攻撃後の魚の生存率に対する、飼料添加物として経口的に投与する各ペプチドの効果を判定するために、試験を行った。体重が約１０ｇの１３０匹のティラピア（ナイルティラピア）を使用し、これらを、各１０匹の動物の１３実験群に無作為に割り振った。各ペプチドを、５０、２５０、５００及び７５０μｇ／ｋｇ飼料の濃度で３０日間投与した。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳ
群２：オレオクロマイシンＩ ５０μｇ／Ｋｇ
群３：オレオクロマイシンＩ ２５０μｇ／Ｋｇ
群４：オレオクロマイシンＩ ５００μｇ／Ｋｇ
群５：オレオクロマイシンＩ ７５０μｇ／Ｋｇ
群６：オレオクロマイシナ ＩＩ ５０μｇ／Ｋｇ
群７：オレオクロマイシナ ＩＩ ２５０μｇ／Ｋｇ
群８：オレオクロマイシナ ＩＩ ５００μｇ／Ｋｇ
群９：オレオクロマイシナ ＩＩ ７５０μｇ／Ｋｇ
群１０：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ５０μｇ／Ｋｇ
群１１：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ２５０μｇ／Ｋｇ
群１２：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ５００μｇ／Ｋｇ
群１３：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ７５０μｇ／Ｋｇ
Ａ．ヒドロフィラ攻撃後の魚の生存率に対する、飼料添加物として経口的に投与する各ペプチドの効果を判定するために、試験を行った。体重が約１０ｇの１３０匹のティラピア（ナイルティラピア）を使用し、これらを、各１０匹の動物の１３実験群に無作為に割り振った。各ペプチドを、５０、２５０、５００及び７５０μｇ／ｋｇ飼料の濃度で３０日間投与した。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳ
群２：オレオクロマイシンＩ ５０μｇ／Ｋｇ
群３：オレオクロマイシンＩ ２５０μｇ／Ｋｇ
群４：オレオクロマイシンＩ ５００μｇ／Ｋｇ
群５：オレオクロマイシンＩ ７５０μｇ／Ｋｇ
群６：オレオクロマイシナ ＩＩ ５０μｇ／Ｋｇ
群７：オレオクロマイシナ ＩＩ ２５０μｇ／Ｋｇ
群８：オレオクロマイシナ ＩＩ ５００μｇ／Ｋｇ
群９：オレオクロマイシナ ＩＩ ７５０μｇ／Ｋｇ
群１０：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ５０μｇ／Ｋｇ
群１１：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ２５０μｇ／Ｋｇ
群１２：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ５００μｇ／Ｋｇ
群１３：オレオクロマイシナ ＩＩＩ ７５０μｇ／Ｋｇ
ペプチド投与３０日後に、ＬＤ５０のＡ．ヒドロフィラを腹腔内注入して攻撃試験を行い、死亡率を１０日間記録した。ＲＰＳを計算した。攻撃してから１０日後に、３つのペプチド全てが用量依存的効果を示し、１３％の生存率を示したＰＢＳのみを与えた群と比較して、８０％から９５％のＲＰＳを示した。
（例５）
マウスにおける黄色ブドウ球菌又は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による感染に対する抵抗性の判定
抗菌性ペプチドのオレオクロマイシンＩ及びオレオクロマイシンＩＩが、細菌の黄色ブドウ球菌及び緑膿菌の致死量の感染からマウスを保護することができるか検討した。このアッセイでは、体重が２５ｇの４週齢の雄マウス（ＩＣＲ）を使用した。細菌は、トリプトンソイブロス中で、３７℃で８時間増殖させた。
マウスにおける黄色ブドウ球菌又は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による感染に対する抵抗性の判定
抗菌性ペプチドのオレオクロマイシンＩ及びオレオクロマイシンＩＩが、細菌の黄色ブドウ球菌及び緑膿菌の致死量の感染からマウスを保護することができるか検討した。このアッセイでは、体重が２５ｇの４週齢の雄マウス（ＩＣＲ）を使用した。細菌は、トリプトンソイブロス中で、３７℃で８時間増殖させた。
９０から１００％の死亡率をもたらすのに必要な細菌量を、ＰＢＳで培養液を希釈して調製した。５５０ｎｍでの吸光度に基づいて生存コロニー数を推定し、接種液の段階希釈物をプレーティングして検証した。試験微生物及び投与経路に応じて、４．５×１０６及び１．４×１０９ＣＦＵ／マウスの用量を使用した。
１５匹のマウスを各用量について感染させ、感染後７〜１０日間、生存率をモニターした。第一の試験では、細菌を腹腔内投与した後直ぐに、０．５ｍｌのＰＢＳ（陰性対照）又は選択した抗菌性ペプチドを含むＰＢＳを腹腔内注入によってマウスに与えた。第二の試験では、黄色ブドウ球菌を静脈内に投与した。この細菌を投与した後直ぐに、マウスに０．２ｍｌのＰＢＳ又は抗菌性ペプチドを含むＰＢＳを静脈内に与えた。
結果として、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に投与したオレオクロマイシンＩペプチド及びオレオクロマイシンＩＩペプチドが黄色ブドウ球菌及び緑膿菌による死亡率を、対照群の９０〜１００％からペプチド処理群の５〜２９％に低下させることが分かった。
黄色ブドウ球菌の静脈内感染及び２．５ｍｇ／ｋｇの用量でのペプチド投与については、死亡率は、対照の９０〜１００％からペプチド処理群の１８〜４０％まで低下した。
（例６）
イリドウイルス感染に対する抗菌性ペプチドの活性
ＥＰＣ細胞（コイ丘疹性上皮腫）を、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０中で、２８℃、５％ＣＯ２及び９５％相対湿度でインキュベートした。それぞれの５’及び３’末端配列を認識する特異的プライマーを用いて、本発明の抗菌性ペプチドをＰＣＲによって増幅し、ｐＴａｒｇｅＴベクターに挿入して、ｐＴａｒｇｅＴ−オレオクロマイシンＩプラスミド、ｐＴａｒｇｅＴ−オレオクロマイシンＩＩプラスミド及びｐＴａｒｇｅＴ−オレオクロマイシナＩＩＩプラスミドを作出した。
イリドウイルス感染に対する抗菌性ペプチドの活性
ＥＰＣ細胞（コイ丘疹性上皮腫）を、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０中で、２８℃、５％ＣＯ２及び９５％相対湿度でインキュベートした。それぞれの５’及び３’末端配列を認識する特異的プライマーを用いて、本発明の抗菌性ペプチドをＰＣＲによって増幅し、ｐＴａｒｇｅＴベクターに挿入して、ｐＴａｒｇｅＴ−オレオクロマイシンＩプラスミド、ｐＴａｒｇｅＴ−オレオクロマイシンＩＩプラスミド及びｐＴａｒｇｅＴ−オレオクロマイシナＩＩＩプラスミドを作出した。
ＥＰＣ細胞を９０％のコンフルエンスまで増殖させ、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、１μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度の抗菌性ペプチドをコードする遺伝子を含むベクター及びｐＴａｒｇｅＴ空ベクターで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞での抗菌性ペプチドの発現をＲＴ−ＰＣＲによって解析した。ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイドで染色した２％アガロースゲルで可視化した。トランスフェクションしてから２４時間後に、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、種々の濃度のラナグリリオウイルス（ＲＧＶ）で処理した。感染させてから４８時間後に、各ウェルの上清を収集し、３回凍結融解した。ＲＧＶの力価を測定するために、血清フリー培地の上清で段階希釈を行い、細胞をＥＰＣで力価測定した。各希釈は３重で試験した。平均±Ｓ．Ｅとしてデータを表す。ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて群間の差異を解析した。
１０５、１０４、１０３及び１０２ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＲＧＶで細胞を感染させた場合、抗菌性ペプチドを発現している残りの細胞と比較して、空ベクターｐＴａｒｇｅＴでトランスフェクトした細胞において、インキュベーションを４８時間した後に有意な細胞変性効果が観察された。抗菌性ペプチドを発現している細胞のウイルス力価は、空ベクターでトランスフェクトした細胞の力価よりも有意に低かった（ｐ＜０．０１）（図３）。
（例７）
抗菌性ペプチドによるＬＰＳの中和
抗菌活性及び耐病性増大の可能性に加えて、本発明の抗菌性ペプチドがＬＰＳを中和することができるかを、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）試験によって検討した。このアッセイは、中和されていない遊離ＬＰＳの存在を検出する。種々の濃度のペプチドを、０．５ＥＵ／ｍｌのＬＰＳと共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＬＰＳ単独をアッセイの陽性対照として使用した。続いて、１００μＬの混合液を等量のＬＡＬ試薬に加えた。混濁度の動態を、Ｔｕｂｅ Ｒｅａｄｅｒ ＡＴｉ−３２１機器（Ｌａｂ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）を使用して測定した。図４に示すように、本発明の抗菌性ペプチドは、用量依存的にＬＰＳ中和能力を有する。オレオクロマイシンＩペプチド、オレオクロマイシンＩＩペプチド及びオレオクロマイシンＩＩＩペプチドのＥＣ５０は、それぞれ１．２３μＭ、１．４１μＭ及び２．９９μＭであった。
抗菌性ペプチドによるＬＰＳの中和
抗菌活性及び耐病性増大の可能性に加えて、本発明の抗菌性ペプチドがＬＰＳを中和することができるかを、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）試験によって検討した。このアッセイは、中和されていない遊離ＬＰＳの存在を検出する。種々の濃度のペプチドを、０．５ＥＵ／ｍｌのＬＰＳと共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＬＰＳ単独をアッセイの陽性対照として使用した。続いて、１００μＬの混合液を等量のＬＡＬ試薬に加えた。混濁度の動態を、Ｔｕｂｅ Ｒｅａｄｅｒ ＡＴｉ−３２１機器（Ｌａｂ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、ＵＫ）を使用して測定した。図４に示すように、本発明の抗菌性ペプチドは、用量依存的にＬＰＳ中和能力を有する。オレオクロマイシンＩペプチド、オレオクロマイシンＩＩペプチド及びオレオクロマイシンＩＩＩペプチドのＥＣ５０は、それぞれ１．２３μＭ、１．４１μＭ及び２．９９μＭであった。
（例８）
分子アジュバントとしての抗菌性ペプチドのオレオクロマイシンＩ、オレオクロマイシンＩＩ及びオレオクロマイシンＩＩＩの使用
５つの実験群を、各１２匹のティラピア（ナイルティラピア）から形成した。各５０ｇの体重のティラピアに、ＰＢＳ、ホルマリンで失活させたＡ．ヒドロフィラの細胞、及び１μｇ／魚の用量で各ペプチドを加えた、ホルマリンで失活させたＡ．ヒドロフィラの細胞を腹腔内注入した。注入は、０及び１４日目に行った。０及び２１日目に魚の尾静脈から血液を採取し、使用するまで−２０℃で血清を保管した。
分子アジュバントとしての抗菌性ペプチドのオレオクロマイシンＩ、オレオクロマイシンＩＩ及びオレオクロマイシンＩＩＩの使用
５つの実験群を、各１２匹のティラピア（ナイルティラピア）から形成した。各５０ｇの体重のティラピアに、ＰＢＳ、ホルマリンで失活させたＡ．ヒドロフィラの細胞、及び１μｇ／魚の用量で各ペプチドを加えた、ホルマリンで失活させたＡ．ヒドロフィラの細胞を腹腔内注入した。注入は、０及び１４日目に行った。０及び２１日目に魚の尾静脈から血液を採取し、使用するまで−２０℃で血清を保管した。
Ａ．ヒドロフィラに対する凝集抗体価を、９６ウェルプレート中で凝集アッセイによって測定した。血清試料の段階希釈（５０μＬ）をＰＢＳ中で作製し、ホルマリンで失活させた５０μＬのＡ．ヒドロフィラ細胞（４ｘ１０９細胞／ｍｌ）を各ウェルへ加え、十分に混合した。このプレートを一晩室温でインキュベートしてから、凝集を調べた。凝集抗体価は、凝集が陽性となる最も高い血清希釈の逆数で表わした。
Ａ．ヒドロフィラに対する凝集抗体反応を図５に示す。免疫化してから３週目の平均凝集抗体価の知見は、抗菌性ペプチドと共に同時投与した失活細菌細胞を注入した群の力価が、細菌だけ（ｐ＜０．００１）又はＰＢＳ（ｐ＜０．０００１）を注入した群より優れていたことを示す。さらに、ＰＢＳを注入した群と細菌だけを注入した群の間の抗体価に有意差があった（ｐ＜０．００１）。
（例９）
マウスにおける、卵白アルブミン（ＯＶＡ）と抗菌性ペプチドのオレオクロマイシンＩ、オレオクロマイシンＩＩ及びオレオクロマイシンＩＩＩの同時免疫化の体液性及び細胞性免疫応答に対する効果
Ａ）第一免疫化計画
体重が２０ｇの２４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを選択し、これらを各６匹の動物の４試験群に分けた。陰性対照群（ＰＢＳ／ＯＶＡ）は、０．２ｍＬのＰＢＳに入れた６μｇ用量のＯＶＡを０及び７日目に腹腔内に接種した。ペプチド（ＰＢＳ／ＯＶＡ＋ペプチド）処理群は、０．２ｍＬのＰＢＳに入れた６μｇ用量のＯＶＡ＋０．５μｇのペプチドを０及び７日目に腹腔内に接種した。免疫化プロトコールの１５日目に、血液を動物のために採取し、全ＩｇＧ力価を評価した。
マウスにおける、卵白アルブミン（ＯＶＡ）と抗菌性ペプチドのオレオクロマイシンＩ、オレオクロマイシンＩＩ及びオレオクロマイシンＩＩＩの同時免疫化の体液性及び細胞性免疫応答に対する効果
Ａ）第一免疫化計画
体重が２０ｇの２４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを選択し、これらを各６匹の動物の４試験群に分けた。陰性対照群（ＰＢＳ／ＯＶＡ）は、０．２ｍＬのＰＢＳに入れた６μｇ用量のＯＶＡを０及び７日目に腹腔内に接種した。ペプチド（ＰＢＳ／ＯＶＡ＋ペプチド）処理群は、０．２ｍＬのＰＢＳに入れた６μｇ用量のＯＶＡ＋０．５μｇのペプチドを０及び７日目に腹腔内に接種した。免疫化プロトコールの１５日目に、血液を動物のために採取し、全ＩｇＧ力価を評価した。
図６は、各ペプチドと共に同時投与したＯＶＡによるマウスの免疫化によって誘導される全ＩｇＧ力価を示す。ＰＢＳ／ＯＶＡ＋ペプチド群の動物は、ＯＶＡに対して特異的な全ＩｇＧ力価を示し、対照群より統計的に優れていた。この挙動は、全てのペプチドで維持された。
Ｂ）第二免疫化計画
６週齢の６４匹のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを選択して、これらを各８匹のマウスの８実験群に分けた。免疫原は、０．１ｍＬの容量で腹腔内注入によって投与した。抗菌性ペプチドは、等モル量（０．２３８ｘ１０２０分子及び２．３８ｘ１０２０分子）で投与した。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳで免疫化したマウス
群２：５μｇ／動物の用量のＯＶＡで免疫化したマウス
群３：ＯＶＡ５μｇ／動物＋０．１μｇ／動物（０．２３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩで免疫化したマウス
群４：ＯＶＡ５μｇ／動物＋１μｇ／動物（２．３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩで免疫化したマウス
群５：ＯＶＡ５μｇ／動物＋０．１２μｇ／動物（０．２３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩで免疫化したマウス
群６：ＯＶＡ５μｇ／動物＋１．２μｇ／動物（２．３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩで免疫化したマウス
群７：ＯＶＡ５μｇ／動物＋０．１４μｇ／動物（０．２３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩＩで免疫化したマウス
群８：ＯＶＡ５μｇ／動物＋１．４μｇ／動物（２．３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩＩで免疫化したマウス
６週齢の６４匹のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを選択して、これらを各８匹のマウスの８実験群に分けた。免疫原は、０．１ｍＬの容量で腹腔内注入によって投与した。抗菌性ペプチドは、等モル量（０．２３８ｘ１０２０分子及び２．３８ｘ１０２０分子）で投与した。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳで免疫化したマウス
群２：５μｇ／動物の用量のＯＶＡで免疫化したマウス
群３：ＯＶＡ５μｇ／動物＋０．１μｇ／動物（０．２３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩで免疫化したマウス
群４：ＯＶＡ５μｇ／動物＋１μｇ／動物（２．３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩで免疫化したマウス
群５：ＯＶＡ５μｇ／動物＋０．１２μｇ／動物（０．２３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩで免疫化したマウス
群６：ＯＶＡ５μｇ／動物＋１．２μｇ／動物（２．３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩで免疫化したマウス
群７：ＯＶＡ５μｇ／動物＋０．１４μｇ／動物（０．２３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩＩで免疫化したマウス
群８：ＯＶＡ５μｇ／動物＋１．４μｇ／動物（２．３８ｘ１０２０分子／動物に相当）の用量のオレオクロマイシンＩＩＩで免疫化したマウス
０及び１４日目に動物を免疫化し、０、１４及び２１日目に採血した。動物の血清を使用して、特異的な抗体価（ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの合計）を測定した。実験を開始してから５９日に、マウスから脾臓を抽出して、ＯＶＡ抗原に対する細胞性免疫応答を測定した。脾臓を無菌条件下で抽出し、脾細胞を単離し、２．５ｘ１０５の細胞を、２ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で９６ウェル丸底プレートに播種した。細胞をコンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌ）又はＯＶＡ（１０μｇ／ｍＬ）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。培養上清を回収し、これを使用して、インターロイキン−４及びインターフェロン−γのレベルをＥＬＩＳＡによって解析した。
図７Ａ及びＢは、ペプチドのオレオクロマイシンＩ、ＩＩ及びＩＩＩと共に同時投与したＯＶＡによるマウスの免疫化によって誘導される、全ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの力価を示す。ＰＢＳ／ＯＶＡ＋１μｇ／動物の用量のオレオクロマイシンＩ群の動物は、ＯＶＡに対して特異的な全ＩｇＧ力価を示し、陰性対照群より統計的に優れていた（ｐ＜０．００１）（図７Ａ）。ＰＢＳ／ＯＶＡ及びＰＢＳ／ＯＶＡ＋１．４μｇ／動物の用量のオレオクロマイシンＩＩＩ群の動物も、陰性対照群と比較して、全ＩｇＧ力価において統計的に有意差を示した（ｐ＜０．０５）。同様に、第一免疫化から２１日後に、ＰＢＳ／ＯＶＡ＋１μｇ／動物の用量のオレオクロマイシンＩで免疫化した群のＯＶＡに対する特異的なＩｇＧ２ａの力価が、ＯＶＡ単独で免疫化した群で観察されたものよりも有意に大きいことが観察された（ｐ＜０．０５）（図７Ｂ）。
ＯＶＡで刺激した、免疫化した動物由来の脾細胞の培養上清を、ＥＬＩＳＡによって解析して、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の濃度を計測した。図８に示すように、最高レベルのＩＦＮ−γは、オレオクロマイシンＩＩＩペプチドと共に同時投与したＯＶＡで免疫化した動物において用量依存的に得られた。これらのレベルは、ＯＶＡ又はＰＢＳ単独で免疫化した動物の脾細胞で得られたレベルよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。さらに、１．２μｇ／動物の用量のオレオクロマイシンＩＩペプチドと共に同時投与したＯＶＡで免疫化した動物のＩＦＮ−γの分泌レベルは、ＯＶＡ又はＰＢＳ単独で免疫化した動物の脾細胞で得られたレベルよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図８）。いずれの群においても、用いた実験条件下ではＩＬ−４の分泌はなかった。
（例１０）
ティラピアにおける、ＭＹ３２抗原とオレオクロマイシンＩペプチドの同時免疫化の液性免疫応答に対する効果
ティラピアにおける、ＭＹ３２抗原とオレオクロマイシンＩペプチドの同時免疫化の液性免疫応答に対する効果
分子アジュバントとしてのオレオクロマイシンＩペプチドの能力をティラピアで評価するために、以前に知られている（Ｃａｒｐｉｏら（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：２８１０〜２８２０）ＭＹ３２タンパク質をワクチン抗原として使用した。
６実験群を、平均体重が４５ｇの各１０匹のティラピア（ナイルティラピア）から形成した。投与経路は腹腔内とし、免疫原は、０．３ｍＬの注入量で与えた。実験群は以下のようにした。
群１：ＰＢＳで免疫化した魚
群２：１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚
群３：１０μｇ／魚の用量のオレオクロマイシンＩペプチドと共に同時投与した１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚
群４：１μｇ／魚の用量のオレオクロマイシンＩペプチドと共に同時投与した１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ８８８中で全て免疫増強した）
群５：１０μｇ／魚の用量のオレオクロマイシンＩペプチドと共に同時投与した１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ８８８中で全て免疫増強した）
群６：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ８８８中で免疫賦活化した、１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚
群１：ＰＢＳで免疫化した魚
群２：１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚
群３：１０μｇ／魚の用量のオレオクロマイシンＩペプチドと共に同時投与した１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚
群４：１μｇ／魚の用量のオレオクロマイシンＩペプチドと共に同時投与した１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ８８８中で全て免疫増強した）
群５：１０μｇ／魚の用量のオレオクロマイシンＩペプチドと共に同時投与した１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ８８８中で全て免疫増強した）
群６：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ８８８中で免疫賦活化した、１μｇ／ｇ体重の用量のＭＹ３２タンパク質で免疫化した魚
動物を０及び１４日目に免疫化し、０、１４、２１及び２８日目に採血した。この動物の血清を使用して、ＩｇＭ特異的抗体価を測定した。
図９は、オレオクロマイシンＩペプチドと共に同時投与したＭＹ３２抗原による魚の免疫化によって誘導されるＩｇＭ力価を示す。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ８８８中で免疫賦活化したＭＹ３２＋１０μｇ／動物の用量のオレオクロマイシンＩの群の動物は、ＭＹ３２に対する特異的ＩｇＭ力価を示し、これは、ＰＢＳ免疫化群、ＭＹ３２免疫化群、並びにＭＹ３２及び同時投与した１０μｇ／魚の用量のオレオクロマイシナＩペプチドで免疫化した群より統計的に優れていた（ｐ＜０．０５）（図９）。残りの実験群間で有意差は観察されなかった。
Claims (17)
- 配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は前記配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、アミノ酸配列。
- その天然源からの単離、化学合成又は組換えＤＮＡ技術によって得られる、請求項１に記載のアミノ酸配列。
- 細菌、酵母又は高等生物の細胞での発現によって得られる、請求項２に記載のアミノ酸配列。
- 配列番号４、配列番号５及び配列番号６から成る群から選択される核酸配列を含むことを特徴とする、核酸。
- 配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３として識別される配列を含むアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、核酸。
- 配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３として識別される配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含むことを特徴とする、病原体防除のための組成物。
- 前記ペプチドが、その天然源からの単離、化学合成又は組換えＤＮＡ技術によって得られる、請求項６に記載の組成物。
- 哺乳動物及び水生生物に影響を及ぼす細菌性、ウイルス性及び真菌性病原体を防除するために使用され、予防的に又は治療的に投与される、請求項６に記載の組成物。
- 経口経路、非経口経路又は薬浴によって投与される、請求項６に記載の組成物。
- 病原体防除のための組成物を製造するための、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドの使用。
- 生物において病原体を防除するための方法であって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む有効量のペプチドを前記生物へ投与することを特徴とする、上記方法。
- 前記ペプチドが予防的に又は治療的に投与される、請求項１１に記載の方法。
- 前記ペプチドが哺乳動物及び水生生物に投与される、請求項１１に記載の方法。
- 前記ペプチドが、好ましくは、０．１から１０μｇの間のペプチド／魚の濃度で定期的な注入によって、０．０１から０．１ｍｇの間のペプチド／水１リットルの濃度で薬浴によって、又は約５０〜７５０μｇのペプチド／ｋｇ飼料の濃度で飼料添加物として魚に投与される、請求項１３に記載の方法。
- 配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む分子アジュバントとしてのペプチドとワクチン抗原とを含む、ワクチン組成物。
- ワクチンアジュバントとして使用されるペプチド及び抗原が、同一の免疫化計画間に、同時に、別々に又は連続して投与される、請求項１５に記載のワクチン組成物。
- 配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを、ワクチン中の分子アジュバントとして用いることを特徴とする、ワクチン抗原に対する免疫応答を増強するための方法。
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