BR112014007491B1

BR112014007491B1 - Composição de vacina e usos de um peptídeo

Info

Publication number: BR112014007491B1
Application number: BR112014007491-7A
Authority: BR
Inventors: Jannel Acosta Alba; Mario Pablo Estrada Garcia
Original assignee: Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-10-01
Publication date: 2022-03-03
Also published as: BR112014007491A2; CA2849040A1; CN103874502B; MX348934B; US9549978B2; CU20110181A7; AU2012315083A1; CN103874502A; JP2014533931A; US20140294871A1; EP2767290A1; CU24076B1; EP2767290B1; ZA201402171B; CL2014000760A1; AR088176A1; KR20140070597A; WO2013044890A1; CA2849040C; JP6034385B2

Abstract

SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA O CONTROLE DE PATÓGENOS. A presente invenção se refere a peptídios antimicrobianos, isolados e purificados a partir de extratos de brânquias de tilápia (Oreochromis niloticus). Os referidos peptídios podem ser produzidos por síntese química ou em sistemas de expressão heterólogos, como bactérias e leveduras, por técnicas convencionais de biologia molecular. Esses peptídios mostram atividade antimicrobiana contra diversos organismos, entre eles bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, fungos e vírus. A invenção também inclui composições para o controle de agentes patogênicos que compreendem esses peptídios antimicrobianos. O uso dos referidos peptídios em preparações vacinais, como adjuvante molecular, também faz parte da invenção.

Description

Campo da técnica

[001] A presente invenção está relacionada com o campo da biotecnologia, especificamente com a obtenção de peptídios antimicrobianos e sua utilização para o controle de agentes patogênicos. Com a aplicação de peptídios antimicrobianos é possível controlar efetivamente as doenças produzidas por agentes patogênicos. Além disso, esses peptídios contribuem para potencializar a resposta imunológica induzida por diversos antígenos compreendidos nas vacinas.

Estado da técnica anterior

[002] Os peixes possuem um sistema imunológico inato potente que age como primeira linha de defesa contra um amplo espectro de patógenos (Subramanian et al. (2008) Fish and Shellfish Immunol. 25:625-632), e um sistema adaptativo pouco desenvolvido (Magnadottir, (2010) Mar Biotechnol.12:361-379). Uma das formas pelas quais os peixes combatem os agentes patogênicos é mediante a secreção de peptídios antimicrobianos (do inglês Antimicrobial Peptide, abreviado AMP) como mecanismo de defesa inato. Os AMPs têm um papel fundamental no sistema imunológico inato, e protegem contra uma grande variedade de bactérias, fungos, vírus e outros patógenos causadores de infecções (Solomon, (2008) Lancet Neurol. 7:1 16-118). Em geral, os AMPs são secretados na saliva, ou muco, ou sistema circulatório e outras áreas que são brancos para patógenos (Noga et al. (2010) Comp Biochem Physiol D: Genom Proteom. 6:44-54).

[003] Os AMPs dividem-se em cinco categorias, com base em sua composição aminoacídica e estrutura. Essas categorias incluem os peptídios aniônicos, peptídios lineares com estrutura a-hélice anfipática, peptídios catiônicos enriquecidos com aminoácidos específicos, fragmentos peptídicos e peptídios com cisternas que formam ligações intramoleculares (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50; Boman (2000) Immunol Rev.173:5-16). Os peptídios aniônicos são produzidos em concentrações milimolares, requerem zinco como cofator, e mostram atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Os peptídios lineares e catiônicos com estrutura α- hélice antipática têm menos de 40 aminoácidos e possuem uma estrutura tridimensional com uma região dobradiça na porção média. Ainda que sua estrutura seja desordenada em solução, estas moléculas adotam uma estrutura secundária de a-hélice quando estão em contato com as membranas (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). O outro grupo, formado por peptídios lineares catiônicos enriquecidos com aminoácidos específicos, não possuem resíduos de cisteína, por isso os referidos peptídios têm uma estrutura muito flexível em solução (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). O quarto grupo compreende peptídios carregados que são fragmentos provenientes de proteínas maiores. Esses peptídios têm atividade antimicrobiana e estrutura similares a os outros grupos de peptídios (Bellamy et al. (1992) J Appl Bacteriol. 73:472-9; Zanetti et al. (1995) FEBS Lett. 374:1-5). O quinto grupo de peptídios é composto por 380 membros aproximadamente, que contêm 6 resíduos de cisteínas conservados que formam ligações intramoleculares e uma estrutura em folha β (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). Neste grupo encontram- se as defensinas e a hepcidina (Boman et al. (2000) Immunol Rev. 173:5-16).

[004] Embora os AMPs sejam comumente classificados por variações nas características estruturais, existem alguns traços que são comuns a maioria desses peptídios. Por exemplo, eles geralmente possuem menos de 60 aminoácidos, têm um amplo espectro de atividade antimicrobiana em condições fisiológicas, e têm carga positiva (Zasloff (2002) Nature 415:389-395). A maioria dos AMPs adotam uma estrutura anfipática que contribui para o mecanismo de ação desses peptídios, com base em sua interação com a membrana celular lipídica de patógenos como as bactérias e os vírus com envoltório (Shai (2002) Biopolymers 66: 236-48; Jelinek and Kolusheva (2005) Curr. Protein Pept. Sci. 6: 103-14). Esta interação causa uma rápida desestabilização/permeabilização da membrana lipídica do patógeno. Várias observações sugerem que, além do mecanismo de formação de poros, os AMPs podem inibir a síntese da parede celular, ácidos nucleicos, proteínas e inclusive inibir a atividade enzimática (Brogden et al. (2005) Nat. Immunol. 6: 558-64; Campagna et al. (2007) Biochemistry 46: 1771-8).

[005] Devido à capacidade dos micro-organismos de criar resistência aos antibióticos, e à existência de doenças causadas por agentes patogênicos para as quais não existem tratamentos adequados, faz-se necessária a busca de novas moléculas com capacidade antimicrobiana.

[006] Portanto, um importante problema a ser solucionado é conseguir novos produtos antimicrobianos, de caráter proteico, capazes de controlar eficientemente uma ampla gama de patógenos e que tenham ainda impacto na imunidade inata e adaptativa, aspectos de muita importância na medicina e na veterinária, incluindo a aquicultura. Explicação da invenção

[007] A presente invenção resolve o problema mencionado acima, oferecendo uma nova alternativa para o controle e o tratamento de infecções por patógenos, entre elas aquelas causadas por bactérias, vírus ou fungos. Na presente invenção apresentamos, por primeira vez, os peptídios antimicrobianos que são identificados como SEQ ID N° 1, 2 e 3. Constitui também o objetivo da invenção as sequências aminoacídicas que compreendem em sua sequência de aminoácidos aquelas que são identificadas como SEQ ID N° 1, 2 e 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com os peptídios identificados como SEQ ID N° 1, 2 ou 3.

[008] A partir de extratos proteicos de brânquias de tilápia (Oreochromis niloticus) foram isolados e sequenciados três peptídios, que foram denominados Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III, os quais aind não haviam sido reportados na literatura e que na invenção são denotados como SEQ ID N° 1, 2 e 3. Esses peptídios têm efeito antimicrobiano contra bactérias Gram- positivas, Gram-negativas, vírus e fungos. Além de serem obtidos por isolamento a partir de sua fonte natural, os peptídios da invenção podem ser obtidos por síntese química ou por via do ácido desoxirribonucleico (DNA) recombinante.

[009] Em uma materialização da invenção, os peptídios antimicrobianos da mesma são obtidos a partir da expressão em bactérias, leveduras ou células de organismos superiores. Os referidos peptídios antimicrobianos podem ser expressos em diferentes sistemas hospedeiros, e ser isolados a partir dos mesmos. Em uma realização particular, os peptídios antimicrobianos podem ser expressos em leveduras. Em uma realização preferida, a expressão por via do DNA recombinante é realizada em Pichia pastoris, de preferência no sobrenadante de cultura. Os peptídios antimicrobianos da invenção também podem ser expressos em bactérias. Em outra realização preferida, a expressão por via do DNA recombinante é realizada em Escherichia coli. A partir dos hospedeiros, os peptídios da invenção podem ser obtidos mediante técnicas de isolamento de proteínas que são amplamente conhecidas pelos especialistas neste campo da técnica, como técnicas cromatográficas, lavagem do precipitado celular, e outras.

[0010] O uso dos peptídios antimicrobianos oferece vantagens, em comparação com outros agentes antimicrobianos, por serem menores de 5 KDa, com isso sendo melhor absorvidos através da pele e mucosas dos organismos aquáticos ao serem aplicados por imersão, que é uma via de administração com vantagens de custo e de manipulação para a aquicultura, e com baixos índices de contaminação. Outra das vantagens é a de estimular a atividade imunológica inata e adaptativa, e aumentar a resistência a infecções por agentes patogênicos.

[0011] Levando em conta a sequência aminoacídica de cada um dos peptídios, foram desenhados oligonucleotídeos degenerados para amplificar, mediante reação em cadeia da polimerase (do inglês polymerase chain reaction, abreviado PCR), a sequência nucleotídica codificadora para cada um dos peptídios maduros. Portanto, constitui um objetivo desta invenção um ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6.

[0012] Constitui outro objeto da presente invenção um ácido nucleico que codifica para peptídios que compreendem as sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID N° 1, 2 e 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com os peptídios identificados como SEQ ID N° 1, 2 ou 3.

[0013] A invenção também oferece uma composição para o controle de agentes patogênicos que compreende os peptídios identificados como SEQ ID N° 1,2 e 3 ou peptídios com uma 80% de identidade com os peptídios identificados como SEQ ID N° 1,2 ou 3.

[0014] Em uma materialização da invenção, os peptídios antimicrobianos cujas sequências são reivindicadas (e as composições que os compreendem) podem ser utilizados para o controle de uma ampla variedade de patógenos como: patógenos bacterianos (Aeromonas, Pseudomonas, Corynebacteria, Enterobacteria, Haemophilus, Mycobacteria, Nocardia, Myxobacteria, Streptomyces e Vibrio, entre outras); patógenos virais (vírus da necrose hematopoiética infecciosa, vírus da necrose pancreática infecciosa, vírus da septicemia hemorrágica, iridovírus, vírus hemorrágico da carpa, vírus da viremia primaveril da carpa, o rabdovírus "hirame" ou o rabdovírus da cabeça- de-cobra, vírus da linfociste, vírus da anemia infecciosa do salmão, entre outros); fungos (Saprolegnia, Achlya, Ychthyosporidium hoferi, entre outros).

[0015] Em uma realização da invenção, os peptídios Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III, assim como os peptídios que têm pelo menos 80% de identidade de sequência com os mesmos, são formulados em composições que são utilizadas para o controle de agentes patogênicos em diferentes organismos vivos, entre eles os organismos aquáticos e os mamíferos. As referidas composições são administradas tanto de forma preventiva como de forma terapêutica no controle de patógenos. As vias de administração compreendem todas aquelas vias que são utilizadas na administração de fármacos em humanos, e de medicamentos ou aditivos no caso dos animais, e que são bastante conhecidas pelos especialistas neste campo da técnica. Em uma materialização, as composições para o controle de patógenos da invenção são administradas por via oral, por via parenteral, ou por banhos de imersão.

[0016] Constitui também um aspecto da invenção, o uso de um peptídio que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 para fabricar uma composição para o controle de patógenos.

[0017] Outro aspecto da mesma é fornecer um método para o controle de patógenos em organismos vivos caracterizado pelo fato de que se administra uma quantidade eficaz de um peptídio que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 ao referido organismo.

[0018] Em uma realização particular, os peptídios da invenção são aplicados aos peixes mediante injeções periódicas, a concentrações entre 0,1 e 10 pg/peixe, por banhos de imersão com intervalos de 1-15 dias (em dias alternados ou consecutivos) em água doce ou água do mar, a uma concentração do peptídio entre 0,01 e 0,1 mg/L de água. Eles também podem ser aplicados aos peixes como aditivo na ração, a uma concentração aproximada de 50-750 pg de peptídio/Kg de ração. Em todos os casos obtém-se um aumento significativo na resistência a doenças causadas por agentes patogênicos, sejam aquelas causadas por vírus, bactérias ou fungos, entre outros.

[0019] Além disso, os peptídios oferecidos por esta invenção são úteis como adjuvantes moleculares para vacinas. No contexto desta invenção o termo "adjuvante molecular" refere-se a uma molécula de natureza proteica capaz de modular a resposta imunológica contra um antígeno vacinal, produzindo um aumento da mesma.

[0020] Portanto, a invenção também contempla uma composição vacinal caracterizada pelo fato de que compreende um peptídio que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3, como adjuvante molecular, e um antígeno vacinal.

[0021] Outro aspecto da mesma é oferecer um método para aumentar a resposta imunológica contra um antígeno vacinal caracterizada pelo fato de ser utilizado um peptídio que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3, como adjuvante molecular em uma vacina. Breve descrição das figuras

[0022] Figura 1. Estratégia de clonagem dos peptídios antimicrobianos da invenção nos vetores de expressão em E. coli (Fig. 1A) e na levedura P. pastoris (Fig. 1B).

[0023] Figura 2. Purificação dos peptídios antimicrobianos a partir do sobrenadante de cultura de P. pastoris (Fig. 2A) e sobrenadante de ruptura de E. coli (Fig. 2B). Faixa 1 : Oreochromicina I; Faixa 2: Oreochromicina II; Faixa 3: Oreochromicina III.

[0024] Figura 3. Atividade antiviral dos peptídios antimicrobianos Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III. Células EPC (epitelioma papuloso ciprinídeo) são semeadas em placas de 24 poços com 1 μg de pTargeT-Oreochromicina I, pTargeT-Oreochromicina II e pTargeT-Oreochromicina III ou pTargeT como controle. 24 horas depois da transfecção foram adicionadas várias concentrações de vírus Rana gryiio (RGV) (105 Dose Infecciosa 50% do vírus (TCID50)/ml, 104 TCID50/ml, 103 TCID50/ml e 102 TCID50/ml) e 48 horas depois os sobrenadantes de cultura foram coletados e os títulos virais foram determinados.

[0025] Figura 4. Curva de saturação da união dos peptídios antimicrobianos Oreochromicina I, Oreochromicina II, Oreochromicina III ao lipopolissacarídeo (LPS). As concentrações que produzem 50% da união (EC50) dos peptídios Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III foram de 1,23 μM; 1,41 μM e 2,99 μM, respectivamente.

[0026] Figura 5. Títulos de anticorpos aglutinantes contra Aeromonas hidrófila em tilápias (n=12). Os valores representam a média ± desvio padrão (ES).

[0027] Figura 6. Títulos de imunoglobulinas (IgG) totais induzidos pela imunização de ratos com ovoalbumina (OVA) coadministrada com os peptídios Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III. Foram estabelecidos 4 grupos de ensaio, de 6 animais cada um. O Grupo controle negativo (tampão fosfato salino (PBS)/OVA) foi inoculado por via intraperitoneal, nos dias 0 e 7 com uma dose de 6 g de OVA em 0,2 ml de PBS. Os grupos que receberam ainda os peptídios (PBS/OVA+peptídio) foram inoculados por via intraperitoneal, nos dias 0 e 7 com uma dose de 6 g de OVA + 0,5 pg de cada peptídio em 0,2 mL de PBS. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas. Os valores representam a média ± ES (n=6).

[0028] Figura 7. Títulos de IgG totais (A), lgG1 e lgG2a (B) induzidos pela imunização de ratos com OVA coadministrada com os peptídios antimicrobianos Oreochromicina I, II e III. Os ratos machos Balb/c (8/grupo) foram imunizados por injeção intraperitoneal nos dias 0 e 14 com OVA apenas (5 μg/animal) ou em combinação com os peptídios nas doses de 0,238x1020 moléculas/animal (equivalente a 0,1, 0,12 e 0,14 μg/animal para Oreochromicina I, II e III, respectivamente) e 2,38x1020 moléculas/animal (equivalente a 1, 1,2 e 1,4 μg/animal para Oreochromicina I, II e III, respectivamente). O grupo controle negativo foi injetado com 0,1 mL de PBS 1X. A resposta imunológica humoral específica para OVA (IgG totais) foi analisadas nos 14 e 21 dias depois da primeira imunização. Os títulos de anticorpos específicos de lgG1 e lgG2a foram analisados nos 21 dias depois da primeira imunização. Os títulos de anticorpos específicos para OVA foram determinados por ELISA. (A) Títulos de IgG totais. As barras representam o título de IgG + desvio padrão (n=8). A análise estatística foi efetuada pelo teste de Kruskal-Wallis e pelo teste de comparações múltiplas de Dunn. Os asteriscos representam diferenças significativas com o grupo PBS (* indica p<0,05; *** indicam p<0,001). (B) Títulos de lgG1 e lgG2a. As barras representam o título de anticorpos + desvio padrão (n=8). A análise estatística foi efetuada pelo teste de Mann Whitney (* indica p<0,05).

[0029] Figura 8. Secreção de IFN-y por células do baço isoladas de animais imunizados. No eixo Y está representada a concentração de IFN-y no sobrenadante de cultura de esplenócitos estimulados com OVA (10 μg/mL). As barras representam a concentração de IFN-y + desvio padrão (n=5). A análise estatística dos dados foi efetuada por ANOVA e pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni (*: p<0,05; ***: p<0,001).

[0030] Figura 9. Títulos de IgM induzidos pela imunização de tilápias (O. niloticus) com a proteína MY32 coadministrada com o peptídio antimicrobiano Oreochromicina I. Os peixes (10 peixes/grupo) foram imunizados por injeção intraperitoneal nos dias 0 e 14. O grupo controle negativo foi injetado com 0,3 mL de PBS 1X. A resposta imunológica humoral específica para MY32 foi analisada nos 14, 21 e 28 dias depois da primeira imunização. Os títulos de anticorpos de IgM específicos para MY32 foram determinados por ELISA. As barras representam o título de IgM + desvio padrão (n=10). A análise estatística dos dados foi efetuada por ANOVA e pelo teste de comparações múltiplas de Newman-Keuls (* indica p<0,05). Descrição detalhada de modos de realização / Exemplos de realização Exemplo 1. Isolamento e purificação de peptídios antimicrobianos a partir de extratos de brânquias de tilápia.

[0031] Os filamentos de brânquias de tilápia (Oreochromis niloticus) foram macerados em nitrogênio líquido e o pó resultante foi aquecido a 100°C em um banho com termostato durante 10 minutos e foi deixado esfriar. A extração das proteínas foi efetuada pela adição de 150 mL de uma solução composta por 2M de HCI, 10% (v/v) de ácido fórmico, 2% (w/v) de NaCI e 1 % (v/v) de ácido tricloroacético, seguido por homogeneização durante 1 -2 minutos. O homogeneizado foi centrifugado a 20 000 x g durante 30 minutos, o sobrenadante teve o pH ajustado em 4,0 e foi filtrado. O filtrado resultante foi utilizado como extrato ácido e foi aplicado a uma coluna Sep-Pak C18 (Waters, Milford, MA, USA). Depois de lavagem com 0,1 % de ácido trifluoracético, a fração correspondente aos peptídios foi eluída com 80% de acetonitrila/0,1 % de ácido trifluoracético. O eluato foi secado e dissolvido em 1 M de ácido acético e foi adsorvido em uma matriz de SP-Sephadex C-25. Sucessivas etapas de eluição com 1 M de ácido acético, 2M de piridina e 2M de piridina/ácido acético (pH 5,0) produziram cinco frações. Cada fração foi analisada quanto à atividade antimicrobiana e a fração 2 foi escolhida para etapas de purificação posteriores.

[0032] A fração selecionada foi liofilizada e dissolvida em 40% de acetonitrila contendo 0,1% de ácido trifluoracético. Uma alíquota da solução foi aplicada a uma coluna TSKgel G2000SW (filtração em gel, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)) e foi eluída com 40% de acetonitrila contendo 0,1 % de ácido trifluoracético. A mesma fração foi repetidamente injetada na coluna, e a fração resultante com um peso molecular inferior a 5 kDa e com atividade antimicrobiana foi liofilizada e submetida a uma cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) e espectrometria de massa (ESI-MS). O peso molecular da referida fração foi determinado por eletroforese em gel de tricina-dodecil sulfato de sódio (16.5% T/3% C) (do inglês Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis, abreviado Tricina-SDS-PAGE). A separação das proteínas por HPLC foi efetuada em um sistema Hewlett- Packard HP1 100. O solvente A foi 5% de acetonitrila contendo 0,1 % de ácido trifluoracético e o solvente B foi 80% de acetonitrila contendo 0,085% de ácido trifluoracético. A fração A foi reconstituída com o solvente A e submetida a RP-HPLC em uma coluna C8-3 (4,6x150 mm). O gradiente foi 0-2 min 0% de solvente B, 2-5 min 0-20% de solvente B, 5-55 min de 20-47% solvente B, e 55-80 min 47-100% de solvente B. As frações resultantes que mostraram atividade antimicrobiana foram liofilizadas, reconstituídas em 5mM KH2PO4/H3PO4 (pH 3,0) contendo 25% de acetonitrila e carregadas em uma coluna PolySulfoethyl Aspartamide (4,6 x 200 mm). As frações foram eluídas com um gradiente linear de KCI. Os pesos moleculares das frações que mostraram a maior atividade antimicrobiana foram: 2527.3, 2981.9 e 3654.6 Da. Esses peptídios foram denominados Oreochromicina I, II e III, respectivamente. As sequências aminoacídicas de cada um dos peptídios com atividade antimicrobiana foram determinadas, e são doravante identificadas como SEQ ID N° 1, 2 e 3, respectivamente. Além disso, foi feita uma análise das sequências mediante o uso dos programas BlastX e constatou-se que esses peptídios não haviam sido reportados anteriormente. Exemplo 2. Construção de vetores para a expressão dos peptídios antimicrobianos de forma intracelular em E. coli e extracelular na levedura P. pastoris.

[0033] Mediante reações de transcrição reversa, a partir de ácido ribonucleico (ARN) total de brânquias de tilápia (O. niloticus) foram obtidos DNAs complementares. As reações foram realizadas seguindo- se as instruções descritas no kit "Reverse Transcription System" (Promega, Estados Unidos). Em resumo, 4 pg de RNA total foram colocados em um tubo de microcentrífuga livre de nucleases e foram incubados durante 10 minutos a 70°C. Em seguida foram adicionados os outros componentes da reação (4 pL de MgCI2 25mM, 2 pL da mistura de desoxinucleotidos trifosfatos (dNTPs) 10mM, 2 pL de tampão de transcrição reversa 10X, 0,5 iL de inibidor de ribonucleases, 1 μL de oligo (dT) 500 Mg/mL, 20 unidades de transcriptase reversa e água previamente tratada com dietil-pirocarbonato) até um volume final de 20 μl). A reação foi incubada durante 15 minutos a 42°C e mantida a 95°C por 5 minutos.

[0034] A partir dos DNAs complementares obtidos, foram amplificadas (mediante PCR) as sequências de nucleotídeos que codificam a região madura dos peptídios antimicrobianos, utilizando oligonucleotídeos sintéticos degenerados, desenhados a partir da sequência aminoacídica de cada peptídio. Em todos os casos foi obtida uma banda de DNA do tamanho esperado. As bandas foram purificadas a partir do gel de agarose e foram inseridas no vetor comercial pGEM-TEasy (Promega) para sequenciamento. As sequências de DNA que codificam os peptídios foram identificadas como SEQ ID N° 4, 5 e 6.

[0035] As sequências de DNA que codificam os peptídios antimicrobianos foram inseridas no vetor de expressão em E. coli pAR 3040, utilizando os sítios de restrição Ndel / BamHI (Figura 1A). Para amplificar a banda correspondente a cada uno dos peptídios, foram utilizados oligonucleotídeos específicos que reconhecem as sequências 5' e 3' de cada um deles, e que possuem sítios de reconhecimento de enzimas de restrição que facilitam a clonagem no vetor de expressão. Para cada peptídio, um dos clones recombinantes foi selecionado para transformar a cepa de E. coli BL21D3 e induzir a expressão do gene sob a regulação do promotor T7, utilizando como indutor isopropil- -D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) 1 mM. A expressão do gene foi efetuada a 37°C durante 6 horas. A expressão dos peptídios recombinantes foi verificada mediante Tricina-SDS-PAGE e ESI-MS.

[0036] Para a construção do vetor de expressão dos peptídios antimicrobianos em P. pastoris, foram utilizados os vetores pPS9 ou pPS10 e oligonucleotídeos específicos que reconhecem as sequências 5' e 3' de cada um dos peptídios e que possuem sítios de reconhecimento de enzimas de restrição. Para a clonagem no vetor pPS9 foram utilizados os sítios Ncol e Spel, e para a clonagem no vetor pPS10 foram utilizados os sítios Nael e Spel. Estas estratégias de clonagem não adicionam aminoácidos à proteína de interesse (Figura 1 B).

[0037] Os plasmídios foram linearizados antes de transformar a cepa de MP36 de P. pastoris. A transformação foi efetuada por eletroporação. A cepa MP36 é um mutante auxotrófico his3, o qual adquire um fenótipo His+ depois da transformação.

[0038] Os clones transformantes foram identificados por Dot Blot. Utilizando a técnica de Southern Blot foram determinados em quais desses clones a integração havia ocorrido por substituição do gene AOX1 de P. pastoris pelo cassete de expressão do plasmídio recombinante, o qual corresponde a um fenótipo Muts (baixa utilização de metanol) e His+. A levedura P. pastoris secreta baixos níveis de proteínas próprias e seu meio de cultura não precisa de suplementos proteicos, por isso podemos esperar que uma proteína heterológa que é secretada para o meio extracelular, constitua a maioria do total de proteínas no meio de cultura (mais de 80%) (Tschopp and col. (1987) Bio/Technology, 5: 1305-1308).

[0039] A expressão dos peptídios em P. pastoris foi efetuada em fermentadores de 5 litros, mediante a adição de metanol ao meio de cultura. A expressão dos peptídios recombinantes e sua integridade foram verificadas por Tricina-SDS-PAGE e ESI-MS. Exemplo 3. Purificação e ensaio da atividade biológica dos peptídios antimicrobianos.

[0040] Os peptídios antimicrobianos obtidos de maneira recombinante foram purificados a partir do sobrenadante de ruptura de E. coli ou do sobrenadante do cultura de P. pastoris. Primeiro, foi realizada uma diálise em 25 mM de acetato de sódio a pH 4,5, com uma membrana com um tamanho de poros de 1 kDa. O produto da diálise foi passado através de uma resina de troca catiônica CM-Sepharosa Fastflow, equilibrada com 25 mM de acetato de sódio (pH 4,5); e as proteínas foram eluídas com 1 M de cloreto de sódio, 50 mM de Tris (pH 7,6). As fracões que continham os peptídios foram coletadas e concentradas, utilizando um sistema de ultracentrifugação com uma membrana com um tamanho de poros de 1 kDa. Para a detecção, foi utilizado um comprimento de onda de 254 nm. A purificação foi verificado por Tricina- SDS-PAGE e as proteínas foram visualização por coloração com Azul de Coomassie (Figura 2).

[0041] Os peptídios da invenção também foram obtidos por síntese química, utilizando os procedimentos conhecidos pelos especialistas neste campo da técnica. A atividade antimicrobiana dos peptídios obtidos foi determinada pelo método de microdiluição. Para determinar a concentração inibitória mínima (do inglês minimal inhibitory concentration, abreviado MIC), diluições seriadas 1:2 foram feitas com cada um dos peptídios. Dez microlitros de cada peptídio diluído foram incubados com 90 microlitros da suspensão de bactéria ou levedura (5x 05 unidades formadoras de colônias (do inglês colony forming units, abreviado CFU) por mL) em meio Mueller Hinton (bactérias) ou meio Sabouraund (fungos) e foram incubados durante 18 horas a 28°C (para patógenos de peixes e fungos) ou 37°C (para patógenos de mamíferos). A MIC é definida como a mínima concentração de peptídio à qual ocorre inibição do crescimento bacteriano. Todos os ensaios foram realizados em triplicata, e foram utilizados como controles meio de cultura (sem micro-organismo) e micro-organismos aos quais o peptídio não foi adicionado. Os resultados estão mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Atividade antimicrobiana dos peptídios Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III.

*IC50: Concentração do peptídio que produz 50% da inibição do crescimento bacteriano Exemplo 4. Determinação da resistência à infecção por Aeromonas hidrópila em tilápias previamente tratadas com os peptídios antimicrobianos. Administração dos peptídeos por injeção intraperitoneal.

[0042] Foi feita a avaliação da utilidade dos peptídios antimicrobianos para aumentar a resistência a doenças in vivo. Em um primeiro ensaio, foram utilizadas 130 tilápias (O. niloticus) de massa corporal de aproximadamente 10 g, que foram distribuídas aleatoriamente em treze grupos experimentais de dez animais cada um. Este ensaio foi realizado com o objetivo de determinar o tempo mínimo de tratamento requerido para aumentar a sobrevida dos peixes frente a um desafio com A. hidrófila. Cada peptídio foi administrado a uma concentração de 1 μg por peixe, por injeção por via intraperitoneal, durante 2, 4, 8 e 15 dias. Foi usado um grupo adicional ao qual foi administrado PBS, como controle. Os grupos experimentais foram os seguintes:

[0043] Grupo 1 : PBS.

[0044] Grupo 2: Peptídio Oreochromicina I administrado durante 2 dias consecutivos.

[0045] Grupo 3: Peptídio Oreochromicina I administrado durante 4 dias consecutivos.

[0046] Grupo 4: Peptídio Oreochromicina I administrado durante 8 dias consecutivos.

[0047] Grupo 5: Peptídio Oreochromicina I administrado durante 15 dias consecutivos.

[0048] Grupo 6: Peptídio Oreochromicina II administrado durante 2 dias consecutivos.

[0049] Grupo 7: Peptídio Oreochromicina II administrado durante 4 dias consecutivos.

[0050] Grupo 8: Peptídio Oreochromicina II administrado durante 8 dias consecutivos.

[0051] Grupo 9: Peptídio Oreochromicina II administrado durante 15 dias consecutivos.

[0052] Grupo 10: Peptídio Oreochromicina III administrado durante 2 dias consecutivos.

[0053] Grupo 11 : Peptídio Oreochromicina III administrado durante 4 dias consecutivos.

[0054] Grupo 12: Peptídio Oreochromicina III administrado durante 8 dias consecutivos.

[0055] Grupo 13: Peptídio Oreochromicina III administrado durante 15 dias consecutivos.

[0056] Transcorrido o tempo de administração dos peptídios, foi realizado um ensaio de desafio, mediante a injeção intraperitoneal da dose letal média (LD50) de A. hidrófila, e a mortalidade foi registrada durante 7 dias. A percentagem relativa de sobrevida (RPS) foi calculada como:

[0057] RPS (%)= (% de mortalidade de controles - % de mortalidade de tratados)/ (% de mortalidade de controles) x100

[0058] Como resultado, verificou-se que os peixes tratados com Oreochromicina I e Oreochromicina III, durante 15 dias, tiveram um aumento na sobrevida (medida como RPS) de 45%, em relação ao grupo que recebeu PBS. Entretanto, o grupo tratado com Oreochromicina II a partir dos 8 dias teve um aumento na sobrevida (RPS) de 48%, em relação ao grupo que recebeu PBS.

[0059] Foi feito um segundo ensaio para determinar a dose ideal de peptídio requerida para aumentar a sobrevida dos peixes depois de um desafio com A. hidrófila. Foram utilizadas 130 tilápias (O. niloticus), de massa corporal de aproximadamente 10 g, que foram distribuídas aleatoriamente em treze grupos experimentais de dez animais cada um.

[0060] Cada peptídio foi administrado a uma concentração de 0,5; 1 ; 5 e 10 μg por peixe, durante 15 dias. Os grupos experimentais foram os seguintes:

[0061] Grupo 1 : PBS.

[0062] Grupo 2: Peptídio Oreochromicina I 0,5 μg/peixe.

[0063] Grupo 3: Peptídio Oreochromicina I 1 μg/peixe.

[0064] Grupo 4: Peptídio Oreochromicina I 5 μg/peixe.

[0065] Grupo 5: Peptídio Oreochromicina 1 10 μg/peixe.

[0066] Grupo 6: Peptídio Oreochromicina II 0,5 μg/peixe.

[0067] Grupo 7: Peptídio Oreochromicina II 1 μg/peixe.

[0068] Grupo 8: Peptídio Oreochromicina II 5 μg/peixe.

[0069] Grupo 9: Peptídio Oreochromicina II 10 μg/peixe.

[0070] Grupo 10: Peptídio Oreochromicina III 0,5 μg/peixe.

[0071] Grupo 11 : Peptídio Oreochromicina III 1 μg/peixe.

[0072] Grupo 12: Peptídio Oreochromicina III 5 μg/peixe.

[0073] Grupo 13: Peptídio Oreochromicina II10 μg peixe.

[0074] Transcorridos os 15 dias de administração dos peptídios, foi realizado um ensaio de desafio, mediante a injeção intraperitoneal da LD50 de A. hidrófila, e a mortalidade foi registrada durante 7 dias. O RPS foi calculado da maneira descrita anteriormente. 7 dias depois do desafio os três peptídios mostraram um efeito dose-dependente e um RPS entre 84% e 88%, comparado com o grupo que recebeu PBS que mostrou apenas 10% de sobrevida.

Administração mediante banhos de imersão

[0075] Foi realizado um ensaio para determinar o efeito de cada peptídio, administrado mediante banhos de imersão, sobre a sobrevida dos peixes depois de um desafio com A. hidrófila. Foram utilizadas 1300 larvas de tilápias (O. niloticus) de 5 dias pós-eclosão, que foram distribuídas aleatoriamente em treze grupos experimentais de 100 larvas cada um. Cada peptídio foi administrado a uma concentração de 0,01 ; 0,05; 0,1 e 0,5 mg do peptídio por litro de água durante 5 dias. Os grupos experimentais foram os seguintes:

[0076] Grupo 1 : PBS.

[0077] Grupo 2: Peptídio Oreochromicina I 0,01 mg/L.

[0078] Grupo 3: Peptídio Oreochromicina I 0,05 mg/L.

[0079] Grupo 4: Peptídio Oreochromicina I 0,1 mg/L.

[0080] Grupo 5: Peptídio Oreochromicina I 0,5 mg/L.

[0081] Grupo 6: Peptídio Oreochromicina II 0,01 mg/L.

[0082] Grupo 7: Peptídio Oreochromicina II 0,05 mg/L.

[0083] Grupo 8: Peptídio Oreochromicina II 0, 1 mg/L.

[0084] Grupo 9: Peptídio Oreochromicina II 0,5 mg/L.

[0085] Grupo 10: Peptídio Oreochromicina III 0,01 mg/L.

[0086] Grupo 1 1 : Peptídio Oreochromicina III 0,05 mg/L.

[0087] Grupo 12: Peptídio Oreochromicina III 0, 1 mg/L.

[0088] Grupo 13: Peptídio Oreochromicina III 0,5 mg/L.

[0089] Transcorridos os 15 dias de administração dos peptídios, foi realizado um ensaio de desafio, mediante a administração por banhos de imersão da LD50 de A. hidrófila e a mortalidade foi registrada durante 10 dias. O RPS foi calculado da maneira descrita previamente. 10 dias depois do desafio, os três peptídios mostraram um efeito dose- dependente e um RPS de entre 76% e 89%, comparado com o grupo que recebeu PBS que mostrou apenas 18% de sobrevida.

Administração oral como aditivo na ração

[0090] Foi realizado um ensaio para determinar o efeito de cada peptídio, administrado oralmente, como aditivo na ração, sobre a sobrevida dos peixes depois de um desafio com A. hidrófila. Foram utilizadas 130 tilápias (O. niloticus) de massa corporal de aproximadamente 10 g, que foram distribuídas aleatoriamente em treze grupos experimentais de dez animais cada um. Cada peptídio foi administrado a uma concentração de 50, 250, 500 e 750 μg/Kg de ração durante 30 dias. Os grupos experimentais foram os seguintes:

[0091] Grupo 1 : PBS.

[0092] Grupo 2: Peptídio Oreochromicina I 50 μg/Kg.

[0093] Grupo 3: Peptídio Oreochromicina I 250 μg/Kg.

[0094] Grupo 4: Peptídio Oreochromicina I 500 μg/Kg.

[0095] Grupo 5: Peptídio Oreochromicina I 750 μg/Kg.

[0096] Grupo 6: Peptídio Oreochromicina II 50 μg/Kg.

[0097] Grupo 7: Peptídio Oreochromicina II 250 μg Kg.

[0098] Grupo 8: Peptídio Oreochromicina II 500 μg/Kg.

[0099] Grupo 9: Peptídio Oreochromicina II 750 μg/Kg.

[00100] Grupo 10: Peptídio Oreochromicina III 50 μg/Kg.

[00101] Grupo 1 1 : Peptídio Oreochromicina III 250 μg/Kg.

[00102] Grupo 12: Peptídio Oreochromicina III 500 μg/Kg.

[00103] Grupo 13: Peptídio Oreochromicina III 750 μg/Kg.

[00104] Transcorridos os 30 dias de administração dos peptídios foi realizado um ensaio de desafio, mediante a injeção intraperitoneal da LD50 de A. hidrófila, e a mortalidade foi registrada durante 10 dias. O RPS foi calculado, e 10 dias depois do desafio, os três peptídios mostraram um efeito dose-dependente e um RPS de entre 80% e 95%, comparado com o grupo que recebeu PBS que mostrou apenas 13% de sobrevida. Exemplo 5. Determinação da resistência à infecção por Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa em ratos

[00105] Foi estudada a capacidade dos peptídios antimicrobianos Oreochromicina I e Oreochromicina II para proteger ratos contra infecções com doses letais das bactérias S. aureus e P. aeruginosa. Neste ensaio foram utilizados ratos machos (ICR) de 4 semanas de idade e um peso de 25 g. As bactérias foram cultivadas em caldo triptona soja a 37°C durante 8 horas.

[00106] Os inóculos contendo a quantidade de bactéria necessária para produzir entre 90 e 100% da mortalidade foram preparados diluindo-se as culturas em PBS. O número de colônias viáveis foi estimado com base na absorvência a 550 nm e foi verificado plaqueando diluições seriadas do inóculo. Dependendo do microorganismo testado e da via de administração foi utilizada uma dose de 4,5x106 e 1,4x109 CFU/rato.

[00107] Foram infectados 15 ratos por cada dose, e a sobrevida dos mesmos foi monitorada durante 7-10 dias depois da infecção. Em um primeiro ensaio, os ratos receberam 0,5 ml de PBS (controle negativo) ou PBS contendo o peptídio antimicrobiano selecionado, por injeção intraperitoneal, imediatamente depois da administração intraperitoneal das bactérias. Em um segundo ensaio foi administrado S. aureus por via intravenosa. Imediatamente depois da administração da bactéria, os ratos receberam 0,2 ml de PBS ou PBS contendo os peptídios antimicrobianos por via i.v.

[00108] Como resultado, foi verificado que os peptídios Oreochromicina I e Oreochromicina II, administrados intraperitoneal- mente a uma dose de 0,5 mg/kg de peso, reduzem a mortalidade por S. aureus e P. aeruginosa de 90-100% no grupo controle a 5-29% nos grupos tratados com os peptídios.

[00109] No caso da infecção por via intravenosa com S. aureus, e a administração dos peptídios a uma dose de 2,5 mg/kg de peso, a mortalidade foi reduzida de 90-100% em o grupo controle a 18-40% nos grupos tratados com os peptídios.

Exemplo 6. Atividade dos peptídios antimicrobianos frente à infecção por um iridovírus

[00110] Células EPC (epitelioma papuloso ciprinídeo) foram incubadas a 28°C, 5% de C02 e umidade relativa do 95%, em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino, 1 mM de piruvato, 2mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. Os peptídios antimicrobianos da presente invenção foram aplicados por PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos que reconhecem as sequências 5' e 3' de cada um de eles, e foram inseridos no vetor pTargeT, para gerar os plasmídios pTargeT-Oreochromicina I, pTargeT- Oreochromicina II e pTargeT-Oreochromicina III. As células EPC foram deixadas crescer até 90% de confluência e foram transfectadas, de forma transitória, com os vetores que continham os genes que codificam os peptídios antimicrobianos e com o vetor pTargeT vazio, a uma concentração de DNA de 1 μg/mL, utilizando lipofectamina 2000. A expressão dos peptídios antimicrobianos nas células transfectadas foi analisada por RT-PCR. Os produtos de PCR foram visualizados em um gel de agarose a 2%, colorido com brometo de etídio. 24 horas depois da transfecção, cada poço foi lavado 3 vezes com PBS e tratado com várias concentrações de vírus Rana grylio (RGV). 48 horas depois da infecção, os sobrenadantes de cada poço foram coletados, e congelados e descongelados 3 vezes. Para determinar os títulos de RGV, foram feitas diluições seriadas dos sobrenadantes em meio livre de soro, que foram tituladas sobre células EPC. Cada diluição foi analisada em triplicata. Os dados estão representados como a média ± D.P. As diferenças entre os grupos foram analisadas por um ANOVA e o teste de comparações múltiplas de Dunnett.

[00111] Quando as células foram infectadas com 105, 104, 103 e 102 TCID50/ml de RGV foram observados efeitos citopatogênicos significativos depois de 48 horas de incubação nas células transfectadas com o vetor pTargeT vazio, em comparação com o resto das células que expressam os peptídios antimicrobianos. Os títulos virais das células que expressam os peptídios antimicrobianos foram significativamente menores que os títulos das células transfectadas com o vetor vazio (p<0,01 ) (Figura 3).

Exemplo 7. Neutralização do LPS pelos peptídios antimicrobianos

[00112] Além da atividade antimicrobiana e da possibilidade de aumentar a resistência a doenças, foi estudada a capacidade dos peptídios antimicrobianos da presente invenção para neutralizar o LPS, mediante o ensaio do lisado de amebócitos de Limulus (LAL). Este ensaio detecta a presença de LPS livre não neutralizado. Várias concentrações dos peptídios foram incubadas com 0,5 EU/ml de LPS a 37°C, durante 30 minutos. Foi utilizado apenas LPS como controle positivo do ensaio. Posteriormente, foram adicionados 100 μl da mistura a um igual volume do reagente LAL. A cinética da turbidez foi medida utilizando o equipamento Tube Reader ATi-321 (Lab Kinetics, UK). Como mostrado na Figura 4, os peptídios antimicrobianos da presente invenção têm capacidade de neutralizar o LPS de maneira dose- dependente. As EC50 dos peptídios Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III foram de 1,23 μM, 1,41 μM e 2,99 μM, respectivamente.

Exemplo 8. Uso dos peptídios antimicrobianos Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III como adjuvantes moleculares

[00113] Foram formados 5 grupos experimentais, de 12 tilápias (O. niloticus) cada um. O peso das tilápias foi de 50 g cada uma, e elas foram injetadas intraperitonealmente com PBS, células de A. hidrófila inativadas com formalina e células de A. hidrófila inativadas com formalina às quais foram adicionados cada um dos peptídios a uma dose de 1 μg/peixe. As injeções foram administradas nos dias 0 e 14. Sangue da veia caudal dos peixes foi coletado nos dias 0 e 21, e o soro foi armazenado a -20°C até o uso.

[00114] Os títulos de anticorpos aglutinantes contra A. hidrófila foram determinados pelo ensaio de aglutinação em placas de 96 poços. Com as amostras de soro (50 μl) foram feitas diluições seriadas em PBS, 50 μl de células de A. hidrófila inativadas com formalina (4x109 células/ml) foram adicionados a cada poço, e foram misturados cuidadosamente. As placas foram incubadas à temperatura ambiente, por uma noite, antes de ser examinada a aglutinação. Os títulos de anticorpos foram expressos como o recíproco da maior diluição de soro que dá positivo para a aglutinação.

[00115] O resultado da resposta de títulos de anticorpos aglutinantes contra A. hidrófila está mostrado na Figura 5. Observação da média dos títulos de anticorpos aglutinantes na semana 3 pós-vacinação mostram que os títulos dos grupos injetados com as células de bactéria inativadas mais os peptídios antimicrobianos foram superiores aos grupos injetados com bactérias apenas (p<0,001 ) ou com PBS (p<0,0001 ). Além disso, houve diferenças significativas nos títulos de anticorpos aglutinantes entre o grupo injetado com PBS e o grupo injetado com bactérias apenas (p<0, 001). Exemplo 9. Efeito da coimunização da ovoalbumina (OVA) e os peptídios Oreochromicina I, Oreochromicina II e Oreochromicina III sobre a resposta imunológica humoral e celular em ratos A) Primeiro esquema de imunização

[00116] Foram selecionados 24 ratos BALB/c fêmeas, com um peso corporal de 20 g, e estes foram separados em 4 grupos de ensaio, de 6 animais cada um. O grupo controle negativo (PBS/OVA) foi inoculado por via intraperitoneal, nos dias 0 e 7 com uma dose de 6 μg de OVA em 0,2 mL de PBS. Os grupos tratados com os peptídios (PBS/OVA+peptídio) foram inoculados por via intraperitoneal, nos dias 0 e 7 com uma dose de 6 g de OVA + 0,5 g de peptídio em 0,2 mL de PBS. No dia 15 do protocolo de imunização, sangue foi coletado dos animais e s os títulos de IgG totais foram avaliados.

[00117] Na Figura 6 estão apresentados os títulos de IgG totais, induzidos pela imunização de ratos com OVA coadministrada com cada um dos peptídios. Os animais do grupo PBS/OVA+peptídio mostraram um título de IgG totais específicas para OVA estatisticamente superior ao grupo controle. Este comportamento foi mantido para todos os peptídios. B) Segundo esquema de imunização

[00118] Foram selecionados 64 ratos BALB/c machos, de 6 semanas de idade, e este foram separados em 8 grupos experimentais, de 8 ratos cada um. A administração dos imunógenos foi feita por injeção intraperitoneal em um volume de 0, 1 mL. Os peptídios foram administrados em quantidades equimolares (0,238x1020 moléculas e 2,38x1020 moléculas). Os grupos experimentais foram os seguintes:

[00119] Grupo 1 : Ratos imunizados com PBS 1X.

[00120] Grupo 2: Ratos imunizados com OVA 5 μg/animal.

[00121] Grupo 3: Ratos imunizados com OVA 5 μg/animal + Oreochromicina I 0,1 μg/animal equivalente a 0,238x1020 moléculas/animal.

[00122] Grupo 4: Ratos imunizados com OVA 5 μg/animal + Oreochromicina moléculas/animal.

[00123] Grupo I 5: 1 μg/animal, Ratos imunizados equivalente com OVA a 5 2,38x1020 μg/animal + Oreochromicina II 0,12 μg/animal, equivalente a 0,238x1020 moléculas/animal.

[00124] Grupo 6: Ratos imunizados com OVA 5 μg/animal + Oreochromicina II 1,2 μg/animal, equivalente a 2,38x1020 moléculas/animal,

[00125] Grupo 7: Ratos imunizados com OVA 5 μg/animal + Oreochromicina III 0,14 μg/animal, equivalente a 0,238x1020 moléculas/animal.

[00126] Grupo 8: Ratos imunizados com OVA 5 μg/animal + Oreochromicina III 1,4 μg/animal, equivalente a 2,38x1020 moléculas/animal.

[00127] Os animais foram imunizados nos dias 0 e 14, e as coletas de sangue foram feitas nos dias 0, 14 e 21. O soro dos animais foi utilizado para a determinação dos títulos de anticorpos específicos IgG totais, lgG1 e lgG2a. 59 dias depois de iniciada a experiência o baço dos ratos foi removido ratos para determinar a resposta imunológica celular frente ao antígeno OVA. O baço foi removido em condições assépticas, os esplenócitos foram isolados e 2,5x105 células foram semeadas, a uma concentração celular de 2x106 células/mL, em placas de 96 poços de fundo redondo. As células foram estimuladas com Concanavalina A (5 μg/mL) ou OVA (10 μg/mL) e incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 4 dias. Os sobrenadantes de cultura foram coletados e utilizados para análise, por ELISA, dos níveis de interleuquina-4 e interferon-y.

[00128] Na Figura 7A e B estão apresentados os títulos de IgG totais, lgG1 e lgG2a induzidos pela imunização de ratos com OVA coadministrada com os peptídios Oreochromicina I, II e III. Os animais do grupo PBS/OVA+Oreochromicina I, a uma dose de 1 μg/animal, mostraram um título de IgG totais específicos para OVA estatisticamente superior ao grupo controle negativo (p<0.001) (Figura 7A). Também mostraram títulos de IgG totais estatisticamente superior ao grupo controle negativo os animais dos grupos PBS/OVA e PBS/OVA+Oreochromicina III à dose de 1,4 μg/animal (p<0.05). De mesma forma, observamos que os títulos de lgG2a específicos para OVA no grupo imunizado com PBS/OVA+Oreochromicina I, a uma dose de 1 μg/animal, foram significativamente superiores aos observados no grupo imunizado apenas com OVA 21 dias depois da primeira imunização (p<0.05) (Figura 7B).

[00129] Os sobrenadantes de cultura dos esplenócitos, estimulados com OVA, provenientes dos animais imunizados de cada grupo foram analisados por ELISA para medir a concentração de IFN-y e IL-4. Como mostrado na Figura 8, os maiores níveis de secreção de IFN-y foram obtidos nos animais imunizados com OVA coadministrada com o peptídio Oreochromicina III de maneira dose-dependente. Esses níveis foram significativamente superiores aos níveis obtidos nos esplenócitos provenientes de animais imunizados com PBS ou OVA apenas (p<0.001 ). Além disso, os níveis de secreção de IFN-y nos animais imunizados com OVA coadministrada com o peptídio Oreochromicina II a uma dose de 1,2 μg/animal foram significativamente superiores aos níveis obtidos nos esplenócitos provenientes de animais imunizados com PBS ou OVA apenas (p<0.05) (Figura 8). Não foi observada secreção de IL-4 em nenhum dos grupos nas condições experimentais utilizadas. Exemplo 10. Efeito da coimunização do antígeno MY32 e o peptídio Oreochromicina I sobre a resposta imunológica humoral em tilápia

[00130] Para avaliar a capacidade do peptídio Oreochromicina I como adjuvante molecular em tilápia foi utilizado como antígeno vacinal a proteína MY32, previamente conhecida (Carpió et al. (201 1) Vaccine 29: 2810-2820).

[00131] Foram formados 6 grupos experimentais, de 10 tilápias (O. niloticus) cada um. O peso médio das tilápias foi de 45 g. A via de administração foi intraperitoneal, o imunógeno foi aplicado em um volume de injeção de 0,3 mL. Os grupos experimentais foram:

[00132] Grupo 1 : Peixes imunizados com PBS.

[00133] Grupo 2: Peixes imunizados com a proteína MY32 a uma dose de 1 μg/g de peso corporal.

[00134] Grupo 3: Peixes imunizados com a proteína MY32 a uma dose de 1 μg/g de peso corporal coadministrada com 10 μg/peixe do peptídio Oreochromicina I.

[00135] Grupo 4: Peixes imunizados com a proteína MY32 a uma dose de 1 μg/g de peso corporal coadministrada com 1 μg/peixe do peptídio Oreochromicina I, tudo com o uso do adjuvante Montanide 888.

[00136] Grupo 5: Peixes imunizados com a proteína MY32 a uma dose de 1 μg/g de peso corporal coadministrada com 10 μg/peixe do peptídio Oreochromicina I, tudo com o uso do adjuvante Montanide 888.

[00137] Grupo 6: Peixes imunizados com a proteína My32 a uma dose de 1 μg/g de peso corporal com o adjuvante Montanide 888.

[00138] Os animais foram imunizados nos dias 0 e 14, e as coletas de sangue foram feitas nos dias 0, 14, 21 e 28. O soro dos animais foi utilizado para a determinação dos títulos de anticorpos específicos IgM.

[00139] Na Figura 9 estão apresentados os títulos de IgM induzidos por imunização dos peixes com o antígeno MY32 coadministrado com o peptídio Oreochromicina I. Os animais do grupo MY32+Oreochromicina I, a uma dose de 10 μg/anjmal, com o adjuvante Montanide 888, mostraram um título de IgM específico a MY32 estatisticamente superior aos grupos imunizados com PBS, MY32, e MY32 coadministrada com o peptídio Oreochromicina I a uma dose de 1 μg/peixe (p<0.05) (Figura 9). Não foram observadas diferenças significativas entre o resto dos grupos experimentais.

Claims

1. Uso de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição para o controle de patógenos.

2. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, como adjuvante molecular e um antígeno de vacina.

3. Uso de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um adjuvante molecular para melhorar a resposta imune contra um antígeno de vacina.