KR100854594B1

KR100854594B1 - 톨-유사 수용체-5 자극 활성이 강화된 ｐａｓ-플라젤린융합 단백질

Info

Publication number: KR100854594B1
Application number: KR1020070013845A
Authority: KR
Inventors: 이준행; 이시은; 김수영
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-08-27
Also published as: KR20080074556A

Abstract

본 발명은 톨-유사 수용체-5(이하 TLR5) 자극 활성이 강화된 플라젤린 변형체인 PAS-플라젤린 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 TLR5 작동제인 플라젤린에 패혈증 비브리오균의 생체내 분비 인자(secretion factor)인 PAS를 융합시킨 PAS-플라젤린 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 의한 PAS-플라젤린 융합 단백질은 플라젤린 분자의 중합(polymerization)을 억제함으로써 TLR5 자극 활성을 향상시켜 플라젤린 고유의 활성을 강화시킨 것이다.

플라젤린, PAS 인자, 톨-유사 수용체-5, NF-κB

Description

톨-유사 수용체-5 자극 활성이 강화된 ＰＡＳ-플라젤린 융합 단백질{PAS-flagellin fusion protein with improved Toll-like receptor 5 stimulating activity}

도 1은 재조합 PAS-플라젤린 융합단백질을 발현시키는 플라스미드의 개열지도이다.

도 2는 과발현(overexpression)된 PAS-플라젤린 융합 단백질의 전기영동 후 사진을 보여준다.

도 3은 본 발명에 따른 재조합 PAS-플라젤린 융합 단백질이 재조합 플라젤린에 비해서 TLR5 자극 활성이 증가함을 보여준다.

도 4는 본 발명에 따른 재조합 PAS-플라젤린 융합 단백질은 재조합 플라젤린에 비해서 수용액 상태에서 플라젤린 중합(polymerization)이 현저히 감소함을 보여준다.

편모(flagella)는 세균의 운동성을 결정하는 중요한 구성요소이며 크게 후크(hook), 기저체(basal body) 및 필라멘트(filament)로 구성되어 있다. 편모는 세균의 유영(swimming) 혹은 유주운동(swarming motility), 세균의 주성(taxis)을 결정하고, 바이오필름(biofilm)을 형성하여, 병원성 미생물의 부착능을 결정하는 기능이 있다고도 알려져 있다. 편모의 필라멘트를 구성하는 구성 단위 단백질을 플라젤린(flagellin)이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어(assembling) 필라멘트를 형성한다. Hayashi 등은 포유류가 발현하는 TLR5가 그람 음성 및 그람 양성 세균의 플라젤린을 인지하여 NF-κB를 활성화시킨다고 보고하였다(Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A: Nature 410:1099-1103, 2001).

톨-유사수용체(TLR)는 대표적인 '패턴인식수용체(Pattern Recognition Receptor; 이하 ‘PRR’이라 한다)'로서 이는 병원체에 존재하는 ‘병원체와 관련된 분자구조(Pathogen Associated Molecular Pattern; 이하 ‘PAMP’이라 한다)'를 인식하는 수용체이며 포유동물뿐만 아니라 곤충, 식물세포의 표면에도 존재한다. 지금까지 모두 13 종류의 TLR이 밝혀져 있으며 각 TLR의 작동제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. : Cell 124(4):783-801, 2006).

TLR과 같은 PRR은 숙주세포의 세포 표면 혹은 세포질 내에 분포하며, 다양한 PAMP의 자극에 의해 '선천성 면역 반응(innate immune response)'을 유도하고 나아가 '획득 면역 반응(adaptive immune response)'을 조절한다. 따라서, TLR 작동제(agonist)들은 다양한 ‘면역 조절제’, 특히 ‘백신 보조제’ 개발에 적합한 표적이 될 수 있다.

백신 보조제란 백신과 함께 투여할 경우(coadministration) 백신 항원에 의해 유도되는 항원 특이적 면역 반응(Ag-specific immune response)을 향상(enhance), 지속(prolong) 또는 촉진(accelerate)시킬 수 있는 물질을 칭한다. 현재까지 사람에게 사용할 수 있도록 승인된 백신 보조제에는 'alum (알루미늄 포스페이트(aluminium phosphate) 및 알루미늄 히드록시드(aluminium hydroxide))' 및 '스쿠알렌 에멀젼(squalene emulsion)' 등이 있다. 백신 보조제는 다음 5가지의 조건 중 1가지 이상을 충족해야만 한다: 1) 항원제공세포(antigen presenting cell) 표면의 공동자극 분자(co-stimulatory molecule) 발현 조절, 항원 특이적 T 림프구 반응 유도 혹은 사이토카인(cytokine) 분비 조절과 같은 면역조절(immunomodulation), 2) 항원 제공(presentation), 3) CD8+ T 림프구 반응, 4) 표적(targeting), 5) 항원 축적능(depot generation).

이상적인 백신보조제는 1) 안전해야하고, 2) 체내에서 생분해되어야하며, 3) 항원 단독으로 투여했을 경우보다 높은 방어면역 혹은 치료면역능을 보여야하고, 4) 화학적 혹은 생물학적으로 확인된 물질이어야 하며, 5) 항원보다 낮은 농도에서 작용하는 것이 좋고, 6) 상업적 혹은 임상적으로 쉽게 적용할 수 있도록 반감기가 길어야한다.

현재 백신 보조제로 사용되고 있거나 사용이 고려되고 있는 것으로는 1) 수산화 알루미늄 젤 등과 같은 미네랄 염(mineral salt), 2) 계면활성 물질, 3) 세균 유래 물질, 4) 사이토카인 혹은 호르몬, 6) 다가음이온(polyanion), 7) 폴리아크릴(polyacryl), 8) 담체(carrier), 9) 바이러스를 이용한 생 벡터(living vector), 10) 미네랄 오일(mineral oil)이나 리포좀(liposome)과 같은 운반제(vehicle) 등이 있다. 이 중에서 현재 활발한 연구가 진행되고 있으며 크게 주목받고 있는 단백질 유래 백신보조제로는 Vibrio cholerae에서 유래한 콜레라 독소(cholera toxin, CT)와 대장균 유래의 이열성 독소(heat-labile toxin, LT)가 있다. 이들 백신보조제는 점막 부위(mucosal area) 및 혈청(serum) 중에서 항원 특이적 항체(antigen-specific antibody) 생산을 유도하며, 항원제공세포(antigen presenting cell; APC) 표면의 B7-2 발현을 유도하여 CD4+ 세포의 공동자극 신호(co-stimulatory signaling)를 촉진하는 기전에 의한다는 보고가 있다. 그러나 이들은 장독성(enterotoxicity)이 높은 외독소이므로 독성(toxicity)은 줄이고 보조제적 특성(adjuvaticity)은 높이는 방향으로 연구가 진행 중이다.

PCT 국제특허공개공보 제WO 2005/070455호에서 본 발명자들은 최근 패혈증 비브리오균의 숙주 부착 및 침습인자(adhesion/invasion factor)를 스크리닝하기 위하여 ‘전위자 돌연변이 라이브러리(transposon mutant library)’를 제작하여 숙주 세포에 대한 부착능(adhesion)과 운동성(motility)이 상실된 3 클론의 Tn-플랭킹 영역(Tn-flanking region)을 분석하는 과정 중에 56개의 유전자로 구성된 2개의 편모 관련 오페론(flagella operon)을 동정하였다. 이 과정에서 패혈증 비브리오균은 총 여섯 개의 플라젤린 유전자를 가지고 있으며(flaA, flaB , flaF , flaC , flaD , flaE) 이 중 flaB 유전자가 플라젤린을 구성하는 주요 인자임을 확인하였다. 본 발명자는 패혈증 비브리오균 극성 플라젤린(polar flagellin)을 구성하는 성분인 플라젤린 재조합 단백질(FlaB)을 패혈증 비브리오균에 대한 ‘성분 백신(component vaccine)’으로서 응용 가능성을 추진하던 중에, 플라젤린 백신 보조제 효능이 있음을 알게 되었고 이를 규명하고자 연구를 진행하였다. 그 결과, 백신 항원인 테타누스 유독소를 플라젤린과 함께 실험동물의 비강에 투여하면 플라젤린이 숙주의 TLR5에 신호를 보내어 면역체계를 활성화시킴으로써 백신의 효능을 증폭시키며, 테타누스 유독소와 플라젤린을 함께 투여하여 면역한 마우스에 치사량의 테타누스 독소를 주사할 경우에 100% 방어 면역능을 유도함으로써 탁월한 ‘점막 백신 보조제’ 효능이 있음을 증명하였다(Lee SE, Kim SY, Jeong BC, Kim YR, Bae SJ, Ahn OS, Lee JJ, Song HC, Kim JM, Choy HE, Chung SS, Kweon MN, Rhee JH.: Infect. Immun. 74: 694-702, 2006).

다양한 TLR 작동제 중에서 TLR5를 자극하는 플라젤린은 다른 TLR 작동제(CpG-DNA, MALP (mycoplasmal lipopeptide)와는 달리 단백질 성분이기 때문에 재조합 단백질을 합성하여 지속적인 품질 관리(quality control)가 가능할 뿐만 아니 라 TLR5 자극 활성이 강화된 다양한 재조합 융합 단백질을 제작할 수 있다.

본 발명자들은 한국등록특허 제10-0591478호에서 시험관 내(in vitro)에서 배양한 패혈증 비브리오균에서는 발현하지 않고 생체 내(in vivo) 감염된 패혈증 비브리오균에서만 선택적으로 발현되는 항원 유전자를 찾는 연구를 수행하는 과정에서 분비 인자(secretin factor)로 알려진 ‘PAS 인자 유전자’를 발견하였다. PAS 인자의 특성을 심층적으로 구명하는 연구를 진행한 결과, PAS 단백질이 세포질 내에서 합성되면 신속하게 세포 밖으로 분비되는 성질을 가지고 있을 것으로 추정하고 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산에 비브리오 패혈증균 PAS 인자를 응용할 수 있음을 증명하였다(Lee JH, Yang ST, Rho SH, Im YJ, Kim SY, Kim YR, Kim MK, Kang GB, Kim JI, Rhee JH, Eom SH. J Mol Biol. 355(3):491-500, 2006; Kim YR, Lee SE, Kim CM, Kim SY, Shin EK, Shin DH, Chung SS, Choy HE, Progulske-Fox A, Hillman JD, Handfield M, Rhee JH.Infect Immun. 71(10):5461-71, 2003).

현재 임상에서 사용되고 있는 ‘예방 및 치료 백신제제들’(감염질환, 자가면역 질환, 알러지 질환, 암 백신) 에서 관찰되는 공통적인 문제점은 해당 반응을 증폭시켜 주는 목적으로 사용되는 백신보조제로부터 유래한다는 것이다. 즉, 좀 더 안전하고, 효율이 좋은 백신보조제의 개발이 강력하게 요망되고 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 패혈증 비브리오균 플라젤린 유전자 flaB의 N'-말단에 패혈증 비브리오균의 생체 내(in vivo) 발 현 분비인자인 PAS 인자의 유전자 서열을 삽입한 플라스미드를 제조하고 재조합단백질을 제작함으로써 기존의 플라젤린에 비해 TLR5 자극 활성이 월등히 향상된 ‘PAS-플라젤린 융합단백질’을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 TLR5 자극 활성이 향상된 플라젤린 변형체인 PAS-플라젤린 융합단백질을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 PAS-플라젤린 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 백신보조제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 통상의 TLR5 작동제인 플라젤린의 N' 말단에 생체내 분비인자인 PAS 인자를 융합하여 기존의 플라젤린에 비해 TLR5 자극 활성이 월등히 강화된 플라젤린 변형체로서 아미노산 서열번호 6으로 표시되는 PAS-플라젤린 재조합 융합 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 서열번호 6으로 표시되는 PAS-플라젤린 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 백신 보조제를 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 명세서에서 언급하는 백신보조제 플라젤린은 세균의 운동성을 결정하는 섬모인 플라젤라를 구성하는 단위 분자이다.

또한, 본 명세서에서 언급하는 PAS 인자는 시험관 내(in vitro)에서 성장한 비브리오 패혈증균에서는 발현하지 않았으며, 플라스미드에 PAS 인자 유전자를 클로닝한 후 비브리오 패혈증균 내에서 과발현(overexpression)하였을 때만 시험관 내(in vitro)에서 발현되었고, 발현된 대부분의 PAS 인자는 주변세포질 분획에서만 관찰되었다. 패혈증 비브리오균에서 PAS 인자 단백질을 융합 파트너로 사용하여 재조합 단백질을 제작할 경우 대조군에 비해 고효율로 융합 단백질이 유도되며, 단백질 생산 즉시 대부분의 PAS-융합단백질은 주변세포질(periplasm)로 이동할 뿐만 아니라 배양 상청액으로도 유리됨을 알 수 있었다. 또한 이들 PAS-융합단백질은 공히 강력한 생물활성을 유지하고 있음을 알 수 있었다(한국등록특허 제10-0591478호).

본 발명에서 제공하는 플라젤린의 N'-말단에 PAS인자가 융합된 PAS-플라젤린 융합단백질은 대장균에서 고효율로 유도되며, 생산된 PAS-플라젤린 융합단백질은 TLR5 자극 활성이 월등히 향상되었음을 알 수 있었으며, 이러한 현상은 수용액 상에서 PAS-플라젤린이 기존의 플라젤린에 비해서 다량체화(multimerization) 혹은 중합화(polymerization)가 현저히 감소되어 플라젤린 중합이 억제되어 나타남을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의해 제조된 TLR5 자극활성이 월등히 향상된 PAS-플라젤린은 기존의 플라젤린을 대체하여 보다 강력한 TLR5 작동제를 제공함으로써 기존의 플라젤린이 갖는 효율보다 강화된 백신 보조제를 제공할 수 있다.

본 발명에 의한 PAS-플라젤린를 이용한 TLR5 자극 활성 강화를 증명하는 과 정은 다음과 같다.

1) 서열번호 1의 PAS 인자 유전자와 플라젤린을 인코딩하는 서열번호 3의 flaB 유전자가 융합된 유전자를 플라스미드에 클로닝하여 재조합 PAS-플라젤린 융합 단백질의 생산 효율을 확인하는 단계;

2) 대장균에서 유도된 재조합 PAS-플라젤린 단백질(서열번호 6)의 TLR5 활성화를 확인하는 단계; 및

3) 재조합 PAS-플라젤린 융합 단백질이 수용액 상에서 플라젤린 중합이 억제됨을 확인하는 단계;

를 포함한다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 또는 시험예들은 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이지, 이러한 실시예 또는 시험예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 균주 및 플라스미드의 특성은 표 1에 정리하였다. 각각의 제조방법과 자세한 특성은 해당 실시예 및 시험예에서 적시하였다.

균주 혹은 플라스미드	특 징	출 처
*Escherichia* *coli*
BL21(DE3)	F-ompT hsdSB ( rB - mB -) gal dcm (DE3)	Novagen
*Plasmid*
pET30a	His-tag 발현 벡터, KanR, 5,422 bp	Novagen

<각 균주의 배양 및 보관>

하기 실시예 및 시험예에서 사용한 대장균 균주들은 Luria Bertani 배지(Difco Co.)에서 배양하였다. 사용한 균주들은 배양 후 글리세롤을 30% 되게 첨가하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.

[실시예 1] 재조합 PAS-플라젤린 융합 단백질의 제조

PAS 발현 플라스미드를 제작하기 위하여, PAS 유전자의 ORF를 함유하고 있는 서열번호 1의 유전자를 클로닝하였다. 먼저 서열번호 7의 프라이머(PAS-S3: 5'-agatctaaagccctcatttatgaaacgcttgtaaac-3'; 클로닝을 위해 삽입한 제한효소 Bgl II 인식부위를 밑줄로 그어 표시하였음)와 서열번호 8의 프라이머(PAS-tb: 5'- ggatcc acgcggaaccaggtgttcaagaatttctaataattg-3'; 클로닝을 위해 삽입한 제한 효소 BamHI 인식부위는 밑줄로 그어 표시하였고 단백질 정제를 위해 사용할 트롬빈(thrombin) 인식부위는 볼드체로 표시하였음)를 사용하여 초기변성 95℃ 30초 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 65℃ 60초, 확장 72℃ 60초 조건으로 30회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 증폭하였다. 증폭된 PAS 인자의 DNA 조각을 각각 PCR 2.1-TOPO 클로닝 벡터(cloning vector; Invitrogen Co.)에 클로닝한 후 이 재조합 DNA를 Bgl II와 B amHI으로 자른 다음 His-tag 발현 벡터이며 항생제 마커로 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자를 포함하고 있는 플라스미드인 pET30a(Novagen)에 각각 클로닝하여 pCMM2004 플라스미드를 제작하였다.

패혈증 비브리오균 flaB 유전자의 ORF를 함유하고 있는 서열번호 3의 유전자를 클로닝하기 위하여 서열번호 9의 프라이머(FlaB-P1: 5'-ggatccatggcagtgaatgtaaatacaaac-3'; 클로닝을 위해 삽입한 제한효소 BamHI 인식부위를 밑줄로 그어 표시하였음)와 서열번호 10의 프라이머(FlaB-P2: 5'-ctcgaggcctagtagacttagcgctg-3'; 클로닝을 위해 삽입한 제한효소 XhoI 인식부위를 밑줄로 그어 표시하였음)를 사용하여 초기변성 95℃ 30초 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 70℃ 30초 및 확장 72℃ 60초 조건으로 30회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 증폭하였다. 증폭된 PAS 인자의 DNA 조각을 각각 PCR 2.1-TOPO 클로닝 벡터(cloning vector; Invitrogen Co.)에 클로닝한 후 이 재조합 DNA를 BamHI과 XhoI으로 자른 다음 상기한 pCMM2004 플라스미드에 클로닝하여 PAS-플라젤린 융합단백질 발현용 플라스미드 pCMM2004-5를 제작하였다(도 1). 이들 플라스미드는 고효율의 발현을 위해 BL21 대장균(Novagen)에 형질 전환한 후 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5mM을 가하여 재조합 융합단백질 발현을 유도하였다. 제조사(Qiagen)의 지침에 따라 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 His-tag PAS-플라젤린 융합 단백질을 분리하였다.

대조군으로 사용하는 재조합 플라젤린을 분리하기 위하여 패혈증 비브리오균 flaB 유전자의 ORF을 함유하고 있는 DNA 조각을 인테인(intein) 융합 발현 벡터인 pTYB12(New England Biolabs Inc.)에 클로닝하여 pCMM250 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드를 ER2566 대장균에 일렉트로포레이션 방법으로 넣어 주고 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴 비드 칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합 단백질로부터 FlaB 단백질만을 얻었다. 분리된 FlaB 및 PAS-FlaB 단백질중에 함유되어 있는 내독소(endotoxin)는 AffinityPakTM Detoxi GelTM Endotoxin Removing gel(Pirece 사)을 이용하여 제거하여 사용하였다. 이렇게 분리한 재조합 단백질은 Superdex120 (Amersham 사) 컬럼을 이용하여 젤-여과(Gel-filtration; Amersham사의 AKTA-Prime을 이용)을 실시하여 고순도의 재조합 단백질을 분리 정제하였다.

[시험예 1] PAS-플라젤린 융합단백질 생산

PAS-플라젤린 융합단백질의 생산 효율을 확인하기 위하여 BL21 대장균에 형질전환된 PAS-flaB 유전자를 각각 0.3mM IPTG(Isopropyl-β-D-1-thiogalactoside)로 유도한 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 실시하여 재조합 단백질을 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2을 살펴보면, 0.3mM IPTG로 16℃에서 24시간 이상 유도한 경우 고효율로 PAS-플라젤린 단백이 합성되었다.

[시험예 2] PAS-플라젤린 융합단백질의 TLR5 자극 활성

각 플라젤린 재조합 단백질의 TLR5 자극 활성을 측정하기 위해 TLR5 매개 신호전달에 관여하는 주요 인자인 NF-κB의 전사 활성을 측정하였다. 상기 NF-κB의 전사 활성을 측정하기 위하여, 24-웰 평판 배양기에 293T 세포를 1x105 세포씩 분주하여 하룻저녁 배양한 후 FuGENE6(Roche 사)을 이용하여 NF-κB 전사활성을 관찰할 수 있는 리포터 플라스미드인 NF-κB-Luc(한양대학교 의과대학 미생물학 교실의 김정목 교수로부터 획득)와 TLR5 유전자가 클로닝된 p3xFlag-hTLR5 플라스미드(미국 Wake Forest University School of Medicine, Departments of Microbiology and Immunology의 Steven B. Mizel로부터 획득) 및 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase) 발현 대조군 플라스미드(Clontech 사)를 동시에 세포내로 도입시켰다. 24시간 추가 배양 후 새로운 배지를 교체하고, 실시예 1에서 분리한 PAS-FlaB 및 대조군 FlaB 재조합 단백질을 18-24 시간 처리한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 측정하여 NF-κB 전사정도를 발광분석기(luminometer, Berthold사)를 이용해 측정하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3을 살펴보면 5 ng/ml, 10 ng/ml 및 50 ng/ml의 FlaB 재조합 단백질을 처리한 군은 인상완충액으로만 처리한 대조군에 비해 TLR5 매개 NF-κB 전사 활성이 각각 약 1.8배, 2.5배 및 8.5배 증가하였다. 반면 5 ng/ml, 10 ng/ml 및 50 ng/ml의 PAS-플라젤린(PAS_FlaB) 재조합 융합단백질을 처리한 군은 인상완충액으로만 처리한 대조군에 비해 TLR5 매개 NF-κB 전사 활성이 각각 약 19배, 22배 및 22배 증가하였으며, 10 ng/ml 이상의 농도에서 천정치(Plateau)를 나타내었다. 이 결과는 5 ng/ml 및 10 ng/ml 기준으로 했을 때 동량의 재조합 단백질을 처리했을 때 PAS-FlaB가 FlaB에 비해 10배 강력한 TLR5 자극 활성을 보임을 알 수 있다.

[시험예 3] PAS-플라젤린 융합단백질의 수용액 내에서의 생화학적 특성

Smith 등에 의하면(Smith KD, Andersen-Nissen E, Hayashi F, Strobe K, Bergman MA, Barrett SL, Cookson BT, Aderem A.Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility. Nat Immunol. 2003 Dec;4(12):1247-53.) TLR5 자극 활성에 있어서 단량체(monomer) 형태로 작용하는 플라젤린이 중합된(multimerization 혹은 polymerization) 형태로 존재하는 플라젤린에 비해 강한 활성을 보인다는 사실을 제시하였다.

본 발명자는 PAS-플라젤린 융합 단백질이 기존의 재조합 플라젤린에 비해 TLR5 자극 활성이 10배 이상 강화시키는 기전이 플라젤린 중합을 억제함으로써 유도되는지 알아보기 위해 재조합 FlaB 및 PAS-FlaB의 4차원 구조를 예견하기 위하여 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)법으로 분리한 동량의 FlaB 및 PAS-FlaB을 이용하여 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법(이하 SDS-PAGE)과 네이티브(native)-젤 전기영동을 실시하였으며 그 결과를 도 4에 적시하였다. 도 4를 살펴보면 FlaB와 PAS-FlaB를 SDS-PAGE한 결과 각각 41.5KDa와 50KDa에서 주요 밴드를 나타내었다. 네이티브-젤 전기영동 결과 FlaB는 매우 큰 다량체를 형성하여 대부분의 단백질은 퇴적용 젤(stacking gel)에 그대로 남아 있으며 분해 젤(resolving gel) 내로 진입한 일부의 FlaB 단백질은 66Kda과 140 KDa 사이에서 흐릿하게 분포하고 있음을 관찰하였다. 반면 대부분의 PAS-FlaB 단백질은 140KDa 근처에서 다량체를 형성하였으며 일부는 젤 하단에서 관찰되었다. 이상의 결과는 FlaB 단백질은 수용액 상태에서 매우 큰 다량체(huge multimer)를 이루지만 PAS-FlaB 단백질은 이 보다 규모가 작은 다량체(multimer)로 존재함을 알 수 있었다. 즉 PAS-플라젤린은 플라젤린의 중합을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 PCT 국제특허공개공보 제WO 2005/070455호에 의해 플라젤린이 TLR5를 자극하여 강력한 점막백신 보조제 효능이 있는 것으로 밝혀진 플라젤린의 TLR5 자극 활성을 더욱 향상시킨 플라젤린 변형체인 PAS-플라젤린 융합단백질’를 제공함으로써 보다 업그레이드된 플라젤린 백신 보조제를 개발하였다. 이는 새로운 패러다임의 ‘감염질환’, ‘자가 면역 질환’ 및 ‘알러지 질환’ 등의 치료와 나아가 ‘항암면역 치료’와 같은 응용 연구(Applied Science research)는 차세대의 주목 받는 연구 테마이며, 기초 연구와 베드-사이드(bed-side)의 임상연구를 연결해 주는 중요한 고리를 제공할 것이다. 따라서, 본 발명에 의한 결과를 각종 백신제제에 적용한다면 엄청난 부가가치를 창출할 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 PAS 유전자 및 서열번호 3의 플라젤린 유전자를 포함하고, 도 1에 도시된 개열지도를 가지는 PAS-플라젤린 재조합 융합 단백질 생산을 위한 벡터.
제 1항에 의한 벡터를 대장균에 일렉트로포레이션시켜 형질전환한 후 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필-β-D-갈락토피라노시드를 가하여 단백질 발현을 유도한 다음 정제하는 과정을 거쳐 생산된 서열번호 6의 PAS-플라젤린 재조합 융합단백질.
제 2항에 의한 PAS-플라젤린 재조합 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제.