WO2022086190A1 - 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2022086190A1
WO2022086190A1 PCT/KR2021/014757 KR2021014757W WO2022086190A1 WO 2022086190 A1 WO2022086190 A1 WO 2022086190A1 KR 2021014757 W KR2021014757 W KR 2021014757W WO 2022086190 A1 WO2022086190 A1 WO 2022086190A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fusion protein
flagellin
seq
variant
genus
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/014757
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조경아
Original Assignee
주식회사 메디스팬
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 메디스팬, 전남대학교산학협력단 filed Critical 주식회사 메디스팬
Publication of WO2022086190A1 publication Critical patent/WO2022086190A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a flagellin fusion protein and uses thereof, and more particularly, to a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the variant of human IgG4 Fc has a mutation preventing Fab arm exchange Fusion proteins and their uses with their toll-like receptor 5 (TLR5) stimulatory activity.
  • TLR5 toll-like receptor 5
  • the flagella is an important component that determines the motility of bacteria and is largely composed of a hook, a basal body, and a filament. It is also known that flagella has a function of determining bacterial swimming or swarming motility, bacterial taxis, and forming a biofilm to determine the ability of pathogenic microorganisms to adhere.
  • the structural unit protein constituting the filament of the flagellum is called flagellin, and the flagellin is regularly assembled to form the filament. Hayashi et al.
  • TLR5 mammalian-expressed TLR5 recognizes flagellin from gram-negative and gram-positive bacteria and activates NF- ⁇ B (Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK). , Akira S, Underhill DM, Aderem A: Nature 410:1099-1103, 2001).
  • Flagellin is a structural protein that assembles into the whip-stalk-like filaments of bacterial flagella, which extend from the cell surface and function to allow bacteria to move. Flagellin promotes the penetration and invasion of pathogenic bacteria into host cells by acting as a virulence factor. Since flagellin is found exclusively in bacteria and is one of the most abundant proteins in flagellated bacteria, flagellin is a prime target for host immune surveillance. Upon bacterial invasion, flagellin activates innate immunity, which is detected by Toll-like receptor 5 (TLR5) and NAIP5/NLRC4 in the host and contributes to the immediate clearance of pathogens from the host.
  • TLR5 Toll-like receptor 5
  • NAIP5/NLRC4 NAIP5/NLRC4
  • TLR5 is an innate immune receptor located on the cell surface and consists of an extracellular leucine-rich repeat (LRR) domain, a transmembrane domain and an intracellular domain. TLR5 recognizes flagellin as a pathogen-associated molecular pattern using an extracellular domain and activates MyD88-dependent signaling pathway and NF- ⁇ B-mediated inflammatory cytokine production.
  • LRR leucine-rich repeat
  • Flagellin has been of interest as a target for the development of vaccine carrier proteins or vaccine adjuvants because it serves as the first line of defense against flagellate-pathogenic bacteria.
  • a fusion protein of antigen and flagellin has been demonstrated to be effective as an experimental vaccine against various communicable diseases including West Nile fever, malaria, infectious diseases and tuberculosis. and has been reported to affect the survival and growth of cancer cells.
  • Flagellin contains two to four domains.
  • Bacillus subtilis Hag flagella, Pseudomonas aeruginosa type A FliC flagella, Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium FliC flagellin are 2 (D0 and D1), 3 (D0, D1 and D2), and 4 (D0, D0, D0, D1, D2, and D3) domains.
  • the D0 and D1 domains common in these are located at the center of flagellar filaments by mediating interflagular interactions and are highly conserved among bacterial species due to the functional importance of filament formation.
  • the aforementioned D0 and D1 domains may be major stimulators of TLR5.
  • the D1 domain extends to auxiliary domains (D2 and D3) on the surface of the flagellar filaments, contributing little or no to filament formation.
  • the D2 or D3 domains exhibit substantial changes in sequence and structure, and are believed to activate adaptive immunity and induce undesirable toxicity in flagellin-based therapies. Therefore, the radiation therapy biodrug CBLB502 containing D0/D1 was developed by removing the hypervariable regions (D2 and D3 domains) from Salmonella flagellin.
  • Many Gram-positive bacteria such as Bacillus subtilis and lostridium difficile , express flagellin deficient in the hypervariable region, and thus contain the minimum regions (D0 and D1 regions) required for TLR5 activation and flagellin polymerization in the flagellum filaments.
  • Flagellin-TLR5 interaction and its cellular consequences have been extensively studied using Salmonella flagellin. Structural and biochemical studies of the complex between the Salmonella enterica subspecies enterica serovar Dublin flagellin D1-D2 region (sdflagellin D1-D2) and the N-terminal fragment of zebrafish TLR5 showed that flagellin and TLR5 bind through 'primary binding' 1: It is known to form a 1 complex and then homodimerize to a 2:2 complex through 'second dimerization'.
  • the present inventors focused on the formation of a 2:2 complex structure when flagellin activates TLR5, and as a result of repeated research to develop a new type of protein with improved TLR5 activation ability, flagellin and immunoglobulin Fc It was found that a new type of fusion protein fused with , exhibits significantly superior TLR5 activation ability compared to wild-type flagellin and known flagellin fragments.
  • flagellin using Fc of human IgG4 to avoid antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement dependent cytotoxicity (CDC) induced by immunoglobulin Fc When preparing a fusion protein, it was confirmed that the half-form antibody molecule was formed according to the exchange of the Fab arm, and the TLR5 activation ability of flagellin was significantly reduced. It was confirmed that the present invention was completed.
  • an object of the present invention is flagellin, a fragment thereof or a variant thereof; and a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation preventing Fab arm exchange.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the fusion protein.
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the fusion protein.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition consisting essentially of the fusion protein.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine adjuvant comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine adjuvant comprising the fusion protein.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine adjuvant consisting essentially of the fusion protein.
  • Another object of the present invention is damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; Or to provide the use of the fusion protein for preparing an agent for the treatment of cancer.
  • Another object of the present invention is to administer an effective amount of a composition comprising the fusion protein as an active ingredient to an individual in need thereof, thereby preventing damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; or to provide a method for treating cancer.
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof or a variant thereof; and a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation preventing Fab arm exchange.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the fusion protein.
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention provides a transformant transformed with the vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the fusion protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition consisting essentially of the fusion protein.
  • the present invention provides a vaccine adjuvant comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a vaccine adjuvant comprising the fusion protein.
  • the present invention provides a vaccine adjuvant consisting essentially of the fusion protein.
  • the present invention relates to damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; or the use of the fusion protein for preparing an agent for the treatment of cancer.
  • the present invention is to administer an effective amount of a composition comprising a fusion protein as an active ingredient to an individual in need thereof, thereby preventing damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; or a method of treating cancer.
  • the present invention is flagellin (Flagellin), a fragment or variant thereof; and a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation preventing Fab arm exchange.
  • the flagellin may induce an immune response in an infected host when the flagellate bacterium is infected. More specifically, Toll-like receptor 5 (TLR5; Toll-like receptor 5) present on the cell membrane surface of the human body induces intracellular signal transduction through interaction with the flagellin, and through this, expression of the transcription factor NF-kB It can be increased not only to induce the activation of innate immune signals, but also to modulate the acquired immune response.
  • TLR5 Toll-like receptor 5
  • Flagellin proteins are described, for example, in US Pat. Nos. 6,585,980, 6,130,082; 5,888,810; 5,618,533; 4,886,748 and US Patent Publication Nos. US2003/0044429 A1; and Donnelly et al. (2002) J. Biol. Chem. 43:4045 et al.
  • Most Gram-negative bacteria express flagella, a surface structure that provides motility.
  • a flagellum consists of a basal body, a filament, and a hook connecting the two.
  • the filaments consist of a long polymer of flagellin, a single protein, with a small cap protein formed at the tip.
  • flagellin Polymerization of flagellin is mediated by regions conserved at the N- and C-terminus, whereas the hypervariable region located in the middle of flagellin protein is highly variable in sequence and length between species.
  • the flagellin may be flagellin derived from any suitable bacteria.
  • a number of flagellin genes have been cloned and sequenced in the art and may be referred to.
  • the flagellin is Salmonella enteritidis ( Salmonella enteritidis), Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), Salmonella dublin (Salmonella Dublin), Salmonella enterica (Salmonella enterica), Helicobacter pylori (Helicobacter pylori) pylori), Vibrio cholera , Vibrio vulnificus, Vibrio fibrisolvens, Serratia marcesens, Shigella flexneri, Treponema Treponema pallidum, Borrelia burgdorferei, Clostridium difficile, Agrobacterium tumefaciens, Bartonella clarridgeiae, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus halodurans, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli), Listeria monocytogenes, Yersini
  • the flagellin is Salmonella enteritidis ( Salmonella enteritidis), Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), Salmonella dublin (Salmonella Dublin), Salmonella enterica (Salmonella enterica), Vibrio cholera ( Vibrio cholera), Vibrio vulnificus, Vibrio fibrisolvens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus or It may be flagellin derived from Bacillus halodurans ,
  • it may be flagellin derived from Bacillus subtilis .
  • N-terminal and C-terminal constant regions of flagellin are well known in the art.
  • the size of the constant region may vary somewhat depending on the source of the flagellin protein.
  • an N-terminal constant domain comprises about 170 or 180 N-terminal amino acids of a protein
  • a C-terminal constant domain typically comprises about 85 to 100 C-terminal amino acids.
  • the central hypervariable region varies considerably depending on the size and order among bacteria, and most of the difference in molecular mass can be explained by the hypervariable region.
  • flagellin proteins from various bacteria are known, and flagellin from as yet unknown bacteria can also be used for determination of flagellin monomers by those skilled in the art using techniques known in the art.
  • the structure can be easily elucidated.
  • flagellin As used herein, the terms "flagellin”, “flagellin N-terminal constant region” and “flagelin C-terminal constant region” include flagellin active fragments and variants derived from any of the above exemplified bacteria. do.
  • wild-type flagellin or portions of flagellin may be modified to increase safety and/or immune response and/or as a result of cloning procedures or other laboratory manipulations and such modifications (or variants) ) are also included within the scope of the present invention.
  • the flagellin may include full-length flagellin, or an active fragment thereof.
  • terms such as “flagellin”, “flagellin N-terminal constant region” and “flagellin C-terminal constant region” contain naturally occurring amino acid sequences, or respectively, the naturally occurring flagellin, flagellin N- It may also comprise an amino acid sequence substantially identical to or similar to the amino acid sequence of the terminal constant region or flagellin C-terminal constant region.
  • an "active fragment" of flagellin, flagellin N-terminal constant region, flagellin C-terminal constant region, or any other portion of flagellin is at least about 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250 or at least 300 contiguous amino acids and/or less than about 300, 250, 200, 150, 125, 100, or 75 amino acids of contiguous amino acids, including combinations thereof as long as the lower limit is less than the upper limit.
  • the active fragment may refer to a fragment capable of activating the TLR5 pathway in a host.
  • the active fragment is capable of activating the TLR5 pathway in at least about 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% of full-length flagellin, or in combination with full-length flagellin or flagellin sites. Activate the TLR5 pathway to the same or essentially the same extent, or activate the TLR5 pathway to a higher degree compared to the full-length flagellin or flagellin site.
  • the active fragment may refer to at least one portion of flagellin exhibiting TLR5 pathway activity.
  • the "at least one portion” may refer to a portion that exhibits TLR5 pathway activity in domains 0, 1, 2, and 3 of flagellin. More specifically, the active fragment may be one in which a hypervariable region has been removed from full-length flagellin.
  • the hypervariable region may vary depending on the type of bacteria from which flagellin is derived, and a sequence corresponding to the hypervariable region among the entire sequence of a specific flagellin may be easily identified and removed by a person skilled in the art.
  • N-terminal domains 0, 1, 2; domain 3; And in the case of full-length flagellin comprising C-terminal domains 2, 1, 0, domain 3, or domains 2 and 3 may be hypervariable regions, N-terminal domains 0, 1; domain 2; In the case of full-length flagellin including C-terminal domains 1 and 0, domain 2 may be a hypervariable region.
  • flagellin in a form that does not include a hypervariable region eg, flagellin derived from many Gram-positive bacteria may not include a hypervariable region
  • folding of the flagellin protein is The sequence of the occurring hinge region may be partially removed.
  • hypervariable region used in the present invention may be expressed as a propeller domain or region, a hinge, a hypervariable region, a variable domain or region, and the like.
  • the removal of the hypervariable region may mean that the entire domain corresponding to the hypervariable region has been removed, or a part of the hypervariable region sequence may be removed.
  • the active fragment may be flagellin in a form in which the hypervariable region of wild-type flagellin is removed and an artificial sequence (ie, a hinge or linker of the artificial sequence) is inserted into the removed hypervariable region.
  • an artificial sequence ie, a hinge or linker of the artificial sequence
  • the flagellin fragment of the present invention comprises wild type flagellin C-terminal domain 0, C-terminal domain 1, C-terminal domain 2, N-terminal domain 2, N-terminal domain 1, It may refer to a fragment showing TLR5 pathway activity while including at least one selected from the group consisting of N-terminal domain 0 and a region showing 80% or more amino acid sequence homology with each of the domains.
  • the active fragment of flagellin is capable of activating the TLR5 pathway with at least about 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% of full-length flagellin, or full-length flagellin or flagellin Activate the TLR5 pathway to the same or essentially the same extent as the gelin site, or activate the TLR5 pathway to a higher degree compared to the full-length flagellin or flagellin site.
  • the present invention also includes proteins having the full-length sequence of wild-type flagellin as well as amino acid sequence variants thereof.
  • the mutant refers to a protein having a different sequence due to deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, substitution of an amino acid analog, or a combination thereof in which some amino acid residues of wild-type flagellin or a fragment thereof are deleted.
  • Amino acid exchanges that do not entirely alter the activity of the molecule (ie, the ability to activate the TLR5 pathway) are known in the art.
  • the variant of the present invention is a full-length flagellin modified with phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, etc. Or it may be a fragment thereof.
  • said variant of flagellin or fragment thereof is capable of activating the TLR5 pathway by at least about 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% of full-length flagellin or fragment thereof, or Activate the TLR5 pathway to the same or essentially the same extent as full-length flagellin or a fragment thereof, or activate the TLR5 pathway to a higher degree as compared to full-length flagellin or a fragment thereof.
  • the flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof may be in the form of a fusion protein comprising another polypeptide.
  • the flagellin may be a fusion protein comprising one or more antigens.
  • the antigen include S. pneumoniae PspA1 antigen, S. pneumoniae PspA2 antigen, S. pneumoniae PspA3 antigen, S. pneumoniae PspA4 antigen, S. pneumoniae PspA5 antigen and/or S. pneumoniae PspA6 antigen.
  • the flagellin may be in the form of a fusion protein to which one or more immunomodulatory substances are bound.
  • the immunomodulatory substance may be included without limitation as long as it is known in the art to increase an immune response, and non-limiting examples thereof include interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , Interleukin-1 ⁇ , interleukin-1 ⁇ , interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-7, interleukin-8, interleukin-9, interleukin-10, interleukin-11, interleukin- 12, interleukin-13, interleukin-14, interleukin-18, B cell growth factor, CD40 ligand, TNF- ⁇ , TNF- ⁇ , CCL25, CCL28 or an active fragment thereof.
  • percent (%) sequence identity means that after aligning sequences and introducing gaps, to achieve maximum percent sequence identity, if necessary, any conservative substitutions are not taken into account as part of sequence identity. , defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the reference polypeptide. Alignment for the purpose of determining percent amino acid homology can be accomplished by a variety of methods and methods that are within the skill of the art, for example, using publicly available computer software programs and BLAST, BLAST-2, ALIGN (ALIGN). ) or using Megaalign (DNASTAR) software. One of ordinary skill in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximal alignment over the entire length of the sequences being compared.
  • the percent (%) amino acid sequence homology of a given amino acid sequence B to or to a given amino acid sequence B is calculated as follows: 100 times the fraction X/Y; where X is the number of amino acid residue scores that are identically matched by the sequence alignment program in the program alignment of A and B, and Y is the total number of amino acid residues in B. It will be understood that a percent (%) amino acid sequence identity of A to B is not equal to a percent (%) amino acid sequence identity of B to A if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B.
  • the flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof may consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 5 or an amino acid sequence having 80% or more sequence homology thereto.
  • the IgG4 Fc is heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) except for the heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region 1 (CL1) of IgG4 means, and may include a hinge portion.
  • the IgG4 Fc has substantially the same or improved effect as the wild-type, except for only the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin, some or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or the light chain constant region 1 ( CL1), including expanded IgG4 Fc. Also, it may be a region in which some fairly long amino acid sequences corresponding to CH2 and/or CH3 have been removed.
  • IgG4 Fc when producing a protein fusion using a native IgG Fc sequence, one that can be selected among efforts to minimize the effector function by Fc is an IgG4 Fc. It is known that IgG4 exhibits a half-life similar to IgG1 in vivo and has a relatively small effector function due to a difference in amino acid sequence. However, despite the advantage that IgG4 has reduced effector function, it has been reported that there is great difficulty when using the protein fusion for therapeutic purposes because Fab arm exchange occurs between IgG4 in vivo due to a unique hinge sequence (van der Neut Kolfschoten, et at., Science, 317:1554-1557. 2007).
  • IgG4 Fc when used as a carrier of a protein fusion, the Fab arm exchange occurs with IgG4 existing in vivo to form a hybrid with native IgG4 or to change the original structure as a monomer to have low therapeutic activity.
  • IgG4 Fc fragment and a bioactive substance fusion are produced by genetic engineering or in vitro .
  • the human IgG4 Fc variant included in the fusion protein of the present invention is characterized in that it contains a mutation capable of preventing Fab arm exchange.
  • the mutation capable of preventing Fab arm exchange of the IgG4 Fc may include deletion, insertion or substitution of amino acids occurring in any one or more selected from the group consisting of the hinge, CH2 and CH3 of Fc.
  • the mutation capable of preventing Fab arm exchange of human IgG4 Fc may be characterized as a mutation conferring formation of disulfide bonds between heavy chains of human IgG4 Fc.
  • the 'disulfide bond' refers to a covalent bond formed between two sulfur atoms.
  • the mutation conferring formation of a disulfide bond between heavy chains of human IgG4 Fc may be characterized as a mutation in the hinge.
  • the hinge of human IgG4 Fc consists of a total of 12 amino acids (ESKYGPPCPSCP) (SEQ ID NO: 76), and mutation in the hinge includes deletion, insertion or substitution of amino acids occurring in the hinge sequence.
  • the mutation in the hinge includes a mutation in which a CPSC sequence is substituted with CPPC and some amino acids are deleted or inserted, or another amino acid is substituted among the 12 amino acids constituting the hinge of the human IgG4 Fc. .
  • the human IgG4 Fc may include a hinge consisting of 4 to 13 amino acids including a CPPC sequence. More specifically, the human IgG4 Fc is ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 77), SKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 78), KYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 79), YGPPCPPCP (SEQ ID NO: 80), GPPCPPCP (SEQ ID NO: 81), PPCPPCP (SEQ ID NO: 82) , PCPPCP (SEQ ID NO: 83), CPPCP (SEQ ID NO: 84), or CPPC (SEQ ID NO: 85).
  • ESKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 77
  • SKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 78
  • KYGPPCPPCP SEQ ID NO: 79
  • YGPPCPPCP SEQ ID NO: 80
  • GPPCPPCP SEQ ID NO: 81
  • PPCPPCP SEQ ID NO: 82
  • the human IgG4 Fc may be mutated in the hinge region to ensure the formation of a disulfide bond between the two hinge regions.
  • the mutation in the human IgG4 Fc hinge region may include mutation (S228P) of serine (Ser) to proline (Pro) at position 228 (according to EU numbering).
  • the human IgG4 Fc may be characterized in that some amino acids are deleted from the hinge of the wild-type IgG4 Fc to prevent Fab arm exchange.
  • Fab arm exchange is prevented by deletion of some amino acids from the hinge of IgG4 Fc are disclosed in KR20130063029 and the like.
  • the mutation capable of preventing Fab arm exchange of the IgG4 Fc may include S228P, R409K, or a combination thereof (according to EU numbering).
  • the human IgG4 Fc variant has a wild-type human IgG4 Fc wherein Ser at position 220 is substituted with Pro (S220P), Gly is substituted with Thr at position 223 (G223T), and at position 224 It may further include any one or more amino acid mutations selected from the group consisting of Pro for His substitution (P224H) and Pro for Thr substitution at position 225 (P225T). Such amino acid mutations allow them to function as charge variants that affect protein stability without affecting the activity of wild-type human IgG4 Fc.
  • the human IgG4 Fc variant capable of preventing Fab arm exchange is an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 to 11 or an amino acid sequence having 80% or more sequence homology thereto. It can be characterized as being made.
  • the human IgG4 Fc variant is a mutation that prevents Fab arm exchange, and includes a mutein of the IgG4 Fc variant.
  • the derivative of the IgG4 Fc variant means that one or more amino acid residues in the amino acid sequence have different sequences due to deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • various types of derivatives are possible, such as some amino acids at the N-terminus of the native Fc or a methionine residue added to the N-terminus of the native Fc.
  • the complement binding site eg, the C1q binding site, may be removed, or the ADCC site may be removed. Techniques for preparing a sequence derivative of such an Fc region are disclosed in International Patent Publication Nos. 97/34631 and International Patent Publication Nos. 96/32478.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not entirely alter the activity of the molecule are known in the art.
  • the most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
  • the human IgG4 Fc variant is phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amylation ( amidation), etc. may be modified.
  • the above-described human IgG4 Fc mutant derivative exhibits the same biological activity as that of the human IgG4 Fc mutant, but has increased structural stability against heat, pH, and the like.
  • a fusion protein of flagellin and a derivative in which the C-terminal 3rd amino acid of wild-type human IgG4 Fc is substituted from Leu to Pro (including amino acid mutation preventing Fab arm exchange in the hinge region) As a result of evaluating the effect, it was confirmed that there was no difference in TLR5 agonist activity with the flagellin fusion protein containing the C-terminal sequence of wild-type human IgG4 Fc as it is.
  • the derivative of the human IgG4 Fc variant may further include a mutation that improves the stability of the protein without affecting the activity of the fusion protein.
  • the C- of wild-type human IgG4 Fc It may be characterized as a derivative in which the third terminal amino acid is substituted from Leu to Pro.
  • the human IgG4 Fc variant may be in the form of a native sugar chain, an increased sugar chain compared to the native type, a decreased sugar chain compared to the native type, or a form in which the sugar chain is removed.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms may be used for the increase, decrease or removal of such sugar chains.
  • the human IgG4 Fc mutant from which the sugar chain has been removed has significantly reduced complement (c1q) binding and reduced or eliminated antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, and thus does not induce unnecessary immune responses in vivo.
  • a form more suitable for the original purpose as a drug carrier will be a human IgG4 Fc variant in which sugar chains are removed or non-glycosylated.
  • deglycosylation refers to a human IgG4 Fc mutant from which sugars have been removed with an enzyme
  • amino acid sequence preferably Escherichia coli
  • the fusion protein may be one in which the N-terminus or C-terminus of the flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof is bound to the N-terminus or the C-terminus of the human IgG4 Fc variant.
  • the N-terminus of the flagellin, a fragment or a variant thereof is bound to the C-terminus of a human IgG4 Fc variant, or the C-terminus of the flagellin, a fragment or a variant thereof is a human IgG4 Fc variant. It may be bound to the N-terminus.
  • the C-terminus of flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof may be bound to the N-terminus of a human IgG4 Fc variant.
  • each component constituting the fusion protein that is, flagellin, a fragment or a variant thereof, and a human IgG4 Fc variant may be directly linked to each other or linked through a linker.
  • linker refers to a nucleic acid, amino acid or non-peptide moiety that can be inserted between one or more molecules, eg, one or more component domains.
  • linkers can be used to provide a desired site of interest between components to facilitate manipulation.
  • Linkers may also be provided to enhance expression of the fusion protein from the transformant and reduce steric hindrance so that the components can assume their optimal tertiary structure and/or interact properly with the target molecule.
  • the linker sequence may comprise one or more amino acids naturally linked to the receptor component, or the component domain may have an optimal tertiary structure to provide the desired site of interest specifically, to enhance expression of the fusion protein. added sequences used to enable formation and/or enhance interaction of a component with its target molecule.
  • the linker can increase the flexibility of the fusion protein without interfering with the structure of each component in the fusion protein.
  • the linker moiety is a peptide linker of 2 to 100 amino acids in length.
  • Exemplary linkers include Gly-Gly (SEQ ID NO: 64), Gly-Ala-Gly (SEQ ID NO: 65), Gly-Pro-Ala (SEQ ID NO: 66), Gly (G)n (SEQ ID NO: 67) and Gly-Ser ( GS) (SEQ ID NO: 68) include a linear peptide having at least two amino acid residues as a linker.
  • the GS linkers described herein include (GS)n (SEQ ID NO: 68), (GSGSG)n (SEQ ID NO: 69), (G2S)n (SEQ ID NO: 70), G2S2G (SEQ ID NO: 71), (G2SG)n (SEQ ID NO: 69) No. 72), (G3S) n (SEQ ID NO: 73), (G4S) n (SEQ ID NO: 12), (GGSGG) nGn (SEQ ID NO: 74), GSG4SG4SG (SEQ ID NO: 75) and (GGGGS) n (SEQ ID NO: 12) includes, but is not limited to, where n is 1 or greater.
  • a (G)n linker includes a G9 linker
  • an example of a (GGGGS)n(SEQ ID NO: 12) linker includes a GGGGS (SEQ ID NO: 12) or (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 13) linker.
  • Suitable linear peptides include polyglycine, polyserine, polyproline, polyalanine and oligopeptides composed of alanyl and/or serinyl and/or prolinyl and/or glycyl amino acid residues.
  • Linker moieties can be used to link the components of the fusion proteins disclosed herein.
  • the linker may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.
  • the fusion proteins described herein may or may not contain a signal peptide that functions to secrete the fusion protein from a host cell.
  • a nucleic acid sequence encoding a signal peptide may be operably linked to a nucleic acid sequence encoding a protein of interest.
  • the fusion protein comprises a signal peptide. In some embodiments, the fusion protein does not include a signal peptide.
  • the fusion proteins described in the present invention may include modified forms of protein-binding peptides.
  • the fusion protein component may have post-translational modifications including, for example, glycosylation, sialylation, acetylation and phosphorylation to any protein binding peptide.
  • the fusion proteins of the invention are administered as a polypeptide (or nucleic acid encoding the polypeptide) that is not itself part of a live, killed or recombinant bacterial or viral vectored vaccine. Also, unless otherwise specified, the fusion proteins of the invention are not incorporated as isolated fusion proteins, eg, into flagella.
  • fusion refers to integrating two molecules with different or the same function or structure, and may be fusion by any physical, chemical, or biological method capable of binding a peptide.
  • the fusion protein or the polypeptide constituting the fusion protein is prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or the gene encoding the fusion protein is amplified by PCR (polymerase chain reaction) or synthesized by a known method. It can be prepared by cloning into an expression vector and expressing it.
  • the fusion protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 or SEQ ID NO: 63 there is.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the fusion protein.
  • the combination of bases constituting the polynucleotide is not particularly limited.
  • the polynucleotide may be provided as a single-stranded or double-stranded nucleic acid molecule including all of DNA, cDNA, and RNA sequences.
  • the polynucleotide of the present invention may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 or SEQ ID NO: 62.
  • the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the vector of the present invention includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector.
  • the vector of the present invention may be a conventional cloning vector or expression vector, and the expression vector is a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and an expression control sequence such as an enhancer (promoter) for membrane targeting or secretion. It includes a signal sequence or a leader sequence and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the polynucleotide sequence according to the present invention may be operably linked to an expression control sequence, and the operably linked gene sequence and expression control sequence are one expression including a selection marker and a replication origin. It can be included in a vector.
  • “Operably linked” means that an appropriate molecule is linked in a manner that enables gene expression when bound to an expression control sequence, wherein one nucleic acid fragment is associated with another nucleic acid fragment so that its function or expression is impaired. Affected by other nucleic acid fragments.
  • expression control sequence is meant a DNA sequence that controls the expression of an operably linked polynucleotide sequence in a particular host cell.
  • Such regulatory sequences include promoters to effect transcription, optional operator sequences to control transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences controlling the termination of transcription and translation.
  • the vector includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable vector, an origin of replication.
  • the present invention also provides a transformant transformed with the vector.
  • Transformation with the vector may be performed by transformation techniques known to those skilled in the art.
  • microprojectile bombardment, electroporation, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, PEG-mediated fusion, microinjection and a liposome-mediated method may be used.
  • 'transformant' can be used interchangeably with 'host cell', etc., and introduced into cells by any means (eg, electroshock method, calcium phosphatase precipitation method, microinjection method, transformation method, virus infection, etc.) It refers to a prokaryotic or eukaryotic cell containing heterologous DNA.
  • the transformants are all types of unicellular organisms commonly used in the cloning field, such as prokaryotic microorganisms such as various bacteria (eg, Clostridia genus, E. coli, etc.), lower eukaryotic microorganisms such as yeast, and insect cells
  • prokaryotic microorganisms such as various bacteria (eg, Clostridia genus, E. coli, etc.)
  • lower eukaryotic microorganisms such as yeast
  • insect cells Cells derived from higher eukaryotes including, but not limited to, plant cells, mammals, and the like can be used as host cells. Since the expression level and modification of the protein appear differently depending on the host cell, a person skilled in the art can select and use the most suitable host cell for the intended purpose.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the fusion protein exhibits significantly improved TLR5 pathway activation ability compared to wild-type flagellin.
  • the TLR5 pathway activation ability was significantly improved compared to the fusion protein in which wild-type IgG4 Fc and flagellin were fused.
  • the fusion protein of the present invention may exhibit a preventive, ameliorating or therapeutic effect on diseases, syndromes, etc. known to be preventable, ameliorated or treatable through activation of the TLR5 pathway.
  • Diseases and syndromes known to be preventable, ameliorated or treatable through activation of the TLR5 pathway include damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; Aging; decline in immune function; or cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for preventing or treating damage caused by radiation exposure; for preventing or treating reperfusion injury; for preventing or treating inflammatory bowel disease; for the prevention or treatment of autoimmune diseases; for the prevention or treatment of viral infections; for the prevention or treatment of aging; for enhancing immune function; Or it may be characterized as a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • the fusion protein of the present invention can be understood to exert a preventive, ameliorated or therapeutic effect on diseases to be found in the future that can be prevented, improved, or treated through TLR5 pathway activation, so the pharmaceutical composition of the present invention
  • the disease to be treated is not particularly limited in its scope.
  • KR20150049811A and the like can be referred to for the relationship between the activation of the TLR5 pathway and the disease caused by aging, and WO17031280A1 for the relationship between the activation of the TLR5 pathway and immune enhancement. For relevance, reference may be made to KR20177005615A and the like.
  • the damage caused by radiation exposure may be gastrointestinal syndrome or hematopoietic syndrome caused by radiation exposure.
  • the disease due to aging may be hair loss due to aging, cataract, hernia, colitis, osteoporosis, or osteomalacia.
  • the cancer is breast cancer, lung cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, genitourinary tract cancer, lymphatic system cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, stomach cancer, cervical cancer, thyroid cancer, skin cancer, leukemia, Acute lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, B-cell lymphoma, T-cell lymphoma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, hairy cell lymphoma, histiocytic lymphoma and Burkitt's lymphoma, acute and chronic myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome, myeloid leukemia, promyelocytic leukemia, astrocytoma, neuroblastoma, glioma, schwannoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, osteosarcom
  • composition of the present invention may be formulated in various ways according to the route of administration by a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the fusion protein.
  • “Pharmaceutically acceptable” refers to a non-toxic substance that is physiologically acceptable and does not inhibit the action of the active ingredient and does not normally cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • the carrier includes all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • the route of administration may be oral or parenteral administration.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal administration. can
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in powder, granule, tablet, pill, dragee, capsule, liquid or gel according to methods known in the art together with a suitable oral administration carrier. , syrup, suspension, wafer, and the like.
  • suitable carriers include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, and starches, including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, Cellulose, including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose, and the like, fillers such as gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like may be included. In addition, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant if necessary. Furthermore, the pharmaceutical composition may further include an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, and a preservative.
  • sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylit
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated according to methods known in the art in the form of injections, transdermal administrations, and nasal inhalants together with suitable parenteral carriers.
  • suitable parenteral carriers include, but are not limited to, water, ethanol, polyols (eg, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof, and/or a solvent or dispersion medium containing vegetable oil.
  • suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) with triethanolamine or isotonic solutions such as sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. etc. can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • isotonic solutions such as sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. etc.
  • it may further include various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like.
  • the injection may further contain an isotonic agent such as sugar or sodium chloride.
  • transdermal administration means that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin by topically administering the pharmaceutical composition to the skin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by preparing an injectable formulation and lightly pricking the skin with a 30-gauge thin injection needle or applying it directly to the skin. These formulations are described in formulary commonly known in pharmaceutical chemistry.
  • the compounds for use according to the invention may be administered in pressurized packs or using a suitable propellant, for example, dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be conveniently delivered in the form of an aerosol spray from a nebulizer.
  • the dosage unit may be determined by providing a valve to deliver a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges used in inhalers or insufflators may be formulated to contain a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain one or more buffers (eg, saline or PBS), carbohydrates (eg, glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents (eg EDTA or glutathione), adjuvants (eg aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and/or preservatives.
  • buffers eg, saline or PBS
  • carbohydrates eg, glucose, mannose, sucrose or dextran
  • antioxidants eg, bacteriostatic agents, chelating agents (eg EDTA or glutathione), adjuvants (eg aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and/or preservatives.
  • bacteriostatic agents eg, chelating agents (eg EDTA or glutathione)
  • adjuvants eg aluminum hydroxide
  • suspending agents eg aluminum hydroxide
  • thickening agents and/or preservatives
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • composition of the present invention can be administered in combination with a known substance that is effective in preventing or treating each of the diseases listed above.
  • the present invention also provides a vaccine adjuvant comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • a vaccine adjuvant One of the most important requirements of a vaccine adjuvant is to have immunomodulatory functions such as regulation of the expression of costimulatory molecules on the surface of antigen-presenting cells and cytokine secretion by induction of antigen-specific T cells.
  • TLR5 is distributed on the cell surface or cytoplasm of host cells, induces 'innate immune response' by stimulation of various PAMPs, and further regulates 'adaptive immune response' do. Therefore, TLR5 agonists can be suitable targets for the development of various 'immune modulators', in particular 'vaccine adjuvants'.
  • the fusion protein of the present invention having the ability to activate the TLR5 pathway activates the TLR5 pathway to enhance the innate immune response and the acquired immune response, so that the host's immunity to the co-administered antigen can be significantly improved.
  • the vaccine adjuvant of the present invention may be prepared by a conventional method well known in the art, and may optionally further include various additives that can be used in the preparation of a vaccine in the art.
  • the present invention relates to damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; or the use of the fusion protein for preparing an agent for the treatment of cancer.
  • the present invention administers an effective amount of a composition comprising the fusion protein as an active ingredient to an individual in need thereof, thereby preventing damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; or a method of treating cancer.
  • the 'effective amount' of the present invention means damage caused by radiation exposure when administered to an individual; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; Or it refers to an amount exhibiting the effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or inhibiting or reducing the progression of the disease, and the 'subject' may be an animal, preferably an animal, including a mammal, particularly a human, and in the animal It may be a derived cell, tissue, organ, or the like. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention includes damage caused by radiation exposure; reperfusion injury; inflammatory bowel disease; autoimmune diseases; viral infection; metabolic diseases; Aging; boosting immune function; or ameliorating symptoms caused by cancer or the disease, which may include curing, substantially preventing, or ameliorating the disease, and may include one or most of the symptoms resulting from the disease. including, but not limited to, alleviating, curing or preventing symptoms.
  • the term “comprising” is used synonymously with “including” or “characterized by”, and in a composition or method according to the present invention, specifically Additional components or method steps that have not been excluded are not excluded. Also, the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or components not specifically described. The term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it may include substances or steps that do not substantially affect its basic properties in addition to the substances or steps described.
  • the fusion protein provided by the present invention has significantly superior toll-like receptor 5 (TLR5) pathway activation ability compared to wild-type flagellin, a fragment thereof, or a mutant thereof, and compared with a protein in which wild-type IgG4 Fc and flagellin are fused Therefore, since the toll-like receptor 5 (TLR5) pathway activation ability is remarkably excellent, it can be very usefully utilized in the development of therapeutic agents and/or vaccine adjuvants for diseases that can be prevented, improved, or treated through activation of the TLR5 pathway.
  • TLR5 pathway activation ability is remarkably excellent, it can be very usefully utilized in the development of therapeutic agents and/or vaccine adjuvants for diseases that can be prevented, improved, or treated through activation of the TLR5 pathway.
  • SEQ ID NO: 63 fusion protein prepared in Example of the present invention and wild-type Bacillus subtilis flagellin (BsFlagellin).
  • A SEQ ID NO: 63 fusion protein
  • B flagellin of wild-type Bacillus subtilis
  • a human IgG4 Fc mutant-flagellin fusion protein in which Fab arm exchange is prevented was prepared, and various types of fusion proteins were prepared to compare their effects with other types of Fc-flagellin fusion proteins.
  • the flagellin used to make the fusion protein was Bacillus subtilis flagellin (BsFlagellin).
  • composition of the human IgG4 Fc variant-flagellin fusion protein encoded by each of the plasmids 1 to 12 above is shown in Table 1 below:
  • the hinge region of human IgG4 Fc consists of a total of 12 amino acids (ESKYGPPCPSCP) (SEQ ID NO: 76).
  • the human IgG4 Fc included in the fusion proteins 1 to 3 above is a sequence included in a commercial plasmid and is a human IgG4 Fc hinge. It is a human IgG4 Fc including a hinge in which some of the amino acids are deleted (PPCPSCP) (SEQ ID NO: 86), wherein No. 5 to No. 12 is a full-length wild-type hinge sequence including all 12 amino acids or one or more amino acids It contains a full-length hinge sequence containing mutations.
  • the primers used to construct the DNA of 1 to 12 are shown in Table 2 below:
  • MSP303 Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3' (SEQ ID NO: 14) Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3' (SEQ ID NO: 15) 2.
  • pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) Forward 5'-C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC -3' (SEQ ID NO: 16) Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3' (SEQ ID NO: 17) 3.
  • pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) Forward 5'- TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ATC -3' (SEQ ID NO: 20) Reverse 5'-TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (SEQ ID NO: 21) 5.
  • pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) Forward 5' - TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ACC TTG CCC AGC ACC TGA - 3' (SEQ ID NO: 24) Reverse 5'-TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (SEQ ID NO: 25) 7.
  • the DNA base sequences and protein amino acid sequences of the fusion proteins 1 to 12 are shown in Table 3 below.
  • HEK-Blue cells were cultured in 75T-Flask using media containing DMEM (4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine), 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, and 100ug/ml Normocin. .
  • DMEM 4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine
  • FBS 4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100ug/ml
  • streptomycin 100ug/ml Normocin.
  • TLR5avitag is diluted to a concentration of 5 ⁇ g/ml and ligand proteins (CPPC, entolimod, flagellin) to a concentration of 81, 27, 9, or 3 nM.
  • ligand proteins CPPC, entolimod, flagellin
  • both the fusion protein (No. 1) and the fusion protein (No. 2) having one linker (GGGGS) (SEQ ID NO: 12) connecting Bsflagellin and hIgG4 Fc showed TLR5 activation ability, and the The degree was high in the fusion protein with three linkers.
  • both the fusion protein (No. 1) with one linker (GGGGS) (SEQ ID NO: 12) connecting Bsflagellin and hIgG4 Fc and the fusion protein without the linker (No. 3) showed TLR5 activation ability, The degree was found to be similar.
  • fusion protein 6 MSP306
  • zTLR5 fusion protein 6
  • the complex formation between the fusion protein and TLR5 was analyzed by gel-filtration chromatography.
  • the fusion protein No. 6 had very excellent binding affinity at the pM level.
  • the EC50 of the TLR5 activation ability of the fusion protein 6 was found to be very excellent as 21.44 nM.
  • step 5 After mixing the mixed solution of step 3) and the mixed solution of step 4), stand at room temperature for 30 minutes.
  • step 6 Take out the plate of step 2), remove the old culture medium, and put 1 ml of new culture medium into each well.
  • step 7) Add the mixture solution from step 5) to each well, seal the plate, and leave it in a low T incubator for 4 hours.
  • tertiary baculovirus is produced.
  • the subsequent process uses a shaking incubator.
  • the Hi5 cells are collected in a tube and centrifuged for 10 minutes at 4°C and 8000 rpm.
  • step 3 5ml of Roche Ni resin is put into the column, and then 10ml of [20mM HEPES (pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] solution is poured.
  • step 5 When the centrifugation in step 3) is finished, the supernatant is recovered and then flowed to the resin prepared in step 4).
  • BsFlagellin a comparison target of SEQ ID NO: 63 fusion protein, was purchased from Invivogen and used.
  • Labeling of substances for in vivo tracking of substances was carried out according to the following steps.
  • Flamma 774 NHS ester (pws1603, bioacts) was diluted to 1 mg.
  • BsFlagellin or the fusion protein of SEQ ID NO: 63 is mixed with Flamma 774 NHS ester.
  • mice Respiratory anesthesia of mice for in vivo imaging analysis.
  • FIG. 9 As shown in FIG. 9, as a result of intranasal administration of BsFlagellin (FIG. 9B) or the fusion protein of SEQ ID NO: 63 (FIG. 9A), fluorescence labeled with both substances in the olfactory epithelium and lymph nodes (Depp cervical, mandibular) of all mice This was detected.
  • the fusion protein provided by the present invention has significantly superior toll-like receptor 5 (TLR5) pathway activation ability as compared to wild-type flagellin, a fragment thereof, or a mutant thereof, and compared with a protein in which wild-type IgG4 Fc and flagellin are fused Therefore, since the toll-like receptor 5 (TLR5) pathway activation ability is remarkably excellent, it can be very usefully utilized in the development of therapeutic agents and/or vaccine adjuvants for diseases that can be prevented, improved, or treated through activation of the TLR5 pathway. The availability is very high.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질 및 이의 톨-유사 수용체 5(TLR5) 자극 활성을 이용한 용도에 관한 것이다.

Description

플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
본 출원은 2020년 10월 20일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0136273호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질 및 이의 톨-유사 수용체 5(TLR5) 자극 활성을 이용한 용도에 관한 것이다.
편모(flagella)는 세균의 운동성을 결정하는 중요한 구성요소이며 크게 후크(hook), 기저체(basal body) 및 필라멘트(filament)로 구성되어 있다. 편모는 세균의 유영(swimming) 혹은 유주운동(swarming motility), 세균의 주성(taxis)을 결정하고, 바이오필름(biofilm)을 형성하여, 병원성 미생물의 부착능을 결정하는 기능이 있다고도 알려져 있다. 편모의 필라멘트를 구성하는 구성 단위 단백질을 플라젤린(flagellin)이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어(assembling) 필라멘트를 형성한다. Hayashi 등은 포유류가 발현하는 TLR5가 그람 음성 및 그람 양성 세균의 플라젤린을 인지하여 NF-κB를 활성화시킨다고 보고하였다(Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A: Nature 410:1099-1103, 2001).
플라젤린은 박테리아 편모의 채찍 줄기 모양의 필라멘트로 조립되는 구조 단백질로, 세포 표면에서 연장되어 박테리아가 움직일 수 있도록 기능한다. 플라젤린은 병원성 세균의 병원성 박테리아가 독성 인자로 작용하여 숙주 세포 내로 침투하고 침입하는 것을 촉진한다. 플라젤린은 박테리아에서 독점적으로 발견되며 편모성 박테리아(flagellated bacteria)에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이기 때문에 플라젤린은 숙주 면역 감시의 주요 대상이 된다. 박테리아의 침입시, 플라젤린은 숙주에서 Toll-like receptor 5 (TLR5)와 NAIP5/NLRC4에 의해 검출되고 숙주에서 병원균의 즉각적인 제거에 기여하는 선천성 면역을 활성화시킨다.
TLR5는 세포 표면에 위치한 선천성 면역 수용체이며, 세포 외 leucine-rich repeat(LRR) 도메인, 막 횡단 도메인 및 세포 내 도메인으로 구성된다. TLR5는 플라젤린을 세포 외 도메인을 사용하는 병원체 관련 분자 패턴으로 인식하고 MyD88-의존성 신호전달 경로 및 NF-κB 매개 염증성 사이토카인 생성을 활성화시킨다.
플라젤린은 편모성-병원성 박테리아에 대한 첫 번째 방어선 역할을 하기 때문에 백신 담체 단백질 또는 백신 보조제 개발의 대상으로서 관심이 되어왔다. 항원과 플라젤린의 융합 단백질은 웨스트 나일 발열, 말라리아, 전염병 및 결핵을 비롯한 다양한 전염성 질병에 대한 실험용 백신으로 효과적임이 입증되었고, 플라젤린에 의한 TLR5 활성화는 또한 조혈 세포와 방사선으로 인한 위장 조직을 보호하고 암 세포의 생존과 성장에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다.
플라젤린은 2개 내지 4개의 도메인을 포함한다. 예를 들어, Bacillus subtilis Hag 편모, Pseudomonas aeruginosa A 형 FliC 편모, Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium FliC 플라젤린은 각각 2개 (D0 및 D1), 3개 (D0, D1 및 D2) 및 4개 (D0, D1, D2, 및 D3) 도메인을 포함한다. 이들에서 공통적인 D0 및 D1 도메인은 편모간 상호작용을 중재하여 편모 필라멘트의 중심에 위치해 있으며 필라멘트 형성의 기능적 중요성으로 인해 박테리아 종 사이에서 매우 높게 보존되어 있다. 플라젤린이 폴리머화 된 필라멘트가 아니라 플라젤린 단량체(monomer)가 TLR5를 활성화하기 때문에, 전술한 D0 및 D1 도메인이 TLR5의 주요한 자극제일 것이라고 생각되고 있다. 3 및 4-도메인의 플라렐린에서 D1 도메인은 편모 필라멘트의 표면에 있는 보조 도메인(D2 및 D3)으로 확장되어 필라멘트 형성에 거의 또는 전혀 기여하지 않는다. D0 및 D1 도메인과 달리, D2 또는 D3 도메인은 서열 및 구조에서 실질적인 변화를 나타내고, 적응성 면역을 활성화시키고 플라젤린 기반의 치료법에서 바람직하지 않은 독성을 유발하는 것으로 여겨지고 있다. 따라서 D0/D1을 함유한 방사선 치료 바이오 약물 CBLB502는 Salmonella flagellin에서 초가변영역(D2 및 D3 도메인)을 제거함으로써 개발되었다.
Bacillus subtilis 및 lostridium difficile과 같은 많은 그람-양성균은 초가변영역이 결핍된 플라젤린을 발현하므로 TLR5 활성화 및 플라젤린 중합에 필요한 최소영역(D0 및 D1 영역)을 편모성 필라멘트에 포함하기도 한다.
플라젤린-TLR5 상호작용 및 이의 세포성 결과는 살모넬라 플라젤린을 사용하여 광범위하게 연구되었다. Salmonella enterica subspecies enterica serovar Dublin flagellin D1-D2 영역(sdflagellin D1-D2)과 zebrafish TLR5의 N-말단 단편 사이의 복합체에 대한 구조적 및 생화학적 연구는 플라겔린과 TLR5가 '1 차 결합'을 통해서 1:1 복합체를 형성하고, 이후 '2 차 이량체화'를 통해 2:2 복합체로 동종이형화(homodimerize)되는 것으로 알려져 있다.
플라젤린과 TLR5의 상호작용에 대한 많은 연구 결과들을 토대로, 플라젤린의 변형을 통해 TLR5 활성화를 증대시키기 위한 연구들 또한 다양하게 진행되고 있으나, 플라젤린-TLR5 2:2 복합체 구조를 타겟으로 한 새로운 형태의 플라젤린 단백질에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자는 플라젤린이 TLR5를 활성화시킴에 있어서 2:2 복합체 구조가 형성된다는 것에 주목하여 TLR5 활성화능이 향상된 새로운 형태의 단백질을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 플라젤린과 면역글로불린 Fc가 융합된 새로운 형태의 융합단백질이 야생형(wild-type) 플라젤린, 공지된 플라젤린 단편 등과 비교하여 현저히 우수한 TLR5 활성화능을 나타낸다는 것을 발견하였다.
특히, 면역글로불린 Fc가 유발하는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존성 세포 독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 회피하기 위해 사람 IgG4의 Fc를 이용하여 플라젤린 융합단백질을 제작할 경우, Fab 암(arm) 교환에 따라 1/2 형태의 항체 분자가 형성되어 플라젤린의 TLR5 활성화능이 현격히 저하되는 것을 확인하였고 인간 IgG4 Fc의 mutant를 이용하여 이와 같은 문제를 해결할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질로 이루어지는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질로 필수적으로 이루어지는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질로 이루어지는 백신 보조제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질로 필수적으로 이루어지는 백신 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 융합 단백질의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하여 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질로 이루어지는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질로 필수적으로 이루어지는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질로 이루어지는 백신 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질로 필수적으로 이루어지는 백신 보조제를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하여 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 편모성 세균이 감염된 경우에 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로 인체의 세포막 표면에 존재하는 톨-유사수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)는 상기 플라젤린과 상호작용을 통하여 세포 내 신호 전달을 유발하고, 이를 통하여 전사인자인 NF-kB의 발현이 증가되어 선천성 면역신호 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 획득 면역 반응을 조절할 수 있다.
플라젤린 단백질은 예를 들어, 미국 특허 제6,585,980호, 제6,130,082호; 5,888,810; 5,618,533; 4,886,748 및 미국 특허 공개 번호 US2003/0044429 A1; 및 Donnelly등 (2002) J. Biol. Chem. 43:4045 등을 통해서 잘 공지되어 있다. 대부분의 그람-음성 박테리아는 편모를 발현하는데, 이는 운동성을 제공하는 표면 구조이다. 편모는 기초 몸체, 필라멘트 및 이 둘을 연결하는 갈고리로 구성된다. 필라멘트는 단일 단백질인 플라젤린의 긴 중합체로 이루어지며 끝에 작은 캡 단백질이 형성되어 있다.
플라젤린의 중합은 N-및 C-말단에서 보존된 영역에 의해 매개되는 반면, 플라젤린 단백질의 중간에 위치한 초가변영역(hypervariable region)은 종간의 서열 및 길이가 매우 다양하다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 임의의 적합한 박테리아로부터 유래된 플라젤린일 수 있다. 당업계에서는 다수의 플라젤린 유전자가 클로닝되고 서열화되어 있어 이들이 참고될 수도 있다. 본 발명에서 상기 플라젤린의 비제한적인 공급원으로는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 또는 마리노박터(Marinobacter) 속 미생물을 들 수 있으며, 바람직하게는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속 또는 비브리오(Vibrio) 속 미생물을 들 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 또는 마리노박터(Marinobacter spp) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 플라젤린일 수 있다.
플라젤린의 N-말단 및 C-말단 불변 영역은 당해 기술 분야에서 그 특징이 잘 공지되어 있다. 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이, 불변 영역의 크기는 플라젤린 단백질의 공급원에 따라 다소 변할 수 있다. 일반적으로, N-말단 불변 도메인은 단백질의 약 170 개 또는 180 개의 N-말단 아미노산을 포함하는 반면, C-말단 불변 도메인은 전형적으로 약 85 내지 100 개의 C-말단 아미노산을 포함한다. 중심의 초가변영역은 박테리아 사이의 크기와 순서에 따라 상당히 다양하며, 분자 질량의 차이 대부분이 상기 초가변영역에 의해서 설명될 수 있다. 다양한 박테리아로부터 유래된 플라젤린 단백질의 N- 및 C-말단 불변 영역은 공지되어 있고, 아직 공지되지 않은 박테리아 유래의 플라젤린 또한 통상의 기술자가 당업계에 공지된 테크닉을 이용하여 플라젤린 단량체의 결정 구조를 쉽게 규명할 수 있다.
본 발명에서 "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"이란 용어는 상기 예를 든 박테리아 중 임의의 것으로부터 유래한 플라젤린 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 또한, 야생형(wild-type)의 플라젤린 또는 플라젤린의 일 부분은 안전성 및/또는 면역 반응을 증가시키기 위해 및/또는 클로닝 절차 또는 다른 실험실 조작의 결과로서 변형될 수 있으며 이러한 변형들(또는 변이체) 또한 본원발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서, 상기 플라젤린은 전장(full-length) 플레젤린을 포함하거나, 또는 이의 활성 단편(active fragment)을 포함할 수 있다. 또한, "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"등의 용어는 자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나, 각각 자연적으로 발생하는 플라젤린, 플라젤린 N- 말단 불변 영역 또는 플라젤린 C- 말단 불변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에서 플라젤린, 플라젤린 N-말단 불변 영역, 플라젤린 C-말단 불변 영역 또는 플라젤린의 다른 어떤 부분의 "활성 단편"은 적어도 약 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250 또는 300개 이상의 인접 아미노산 및/또는 인접한 아미노산의 약 300, 250, 200, 150, 125, 100 또는 75 개 미만의 아미노산을 포함하며, 하한이 상한보다 작은 한 이들의 조합도 포함할 수 있다. 상기 활성 단편은 숙주 내에서 TLR5 경로를 활성화시키는 작용을 나타낼 수 있는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편은 TLR5 경로 활성능을 나타내는 플라젤린의 적어도 한 부분을 의미하는 것일 수 있다. 상기 "적어도 한 부분"이란 플라젤린의 도메인 0, 1, 2 및 3에서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 부분을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 활성 단편이란 전장 플라젤린에서 초가변영역(hypervariable region)이 제거된 것일 수 있다. 상기 초가변영역이란 플라젤린의 유래가 되는 박테리아의 종류에 따라서 달라질 수 있으며, 특정 플라젤린의 전체 서열 중 초가변영역에 해당하는 서열은 통상의 기술자가 용이하게 파악하여 제거할 수 있다. 예를 들어, N-말단 도메인 0, 1, 2; 도메인 3; 및 C-말단 도메인 2, 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 3, 또는 도메인 2 및 3이 초가변영역일 수 있으며, N-말단 도메인 0, 1; 도메인 2; C-말단 도메인 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 2가 초가변영역일 수 있다. 또는, 초가변영역이 포함되지 않은 형태의 플라젤린의 경우(예를 들어, 많은 그람-양성균 유래의 플라젤린은 초가변영역이 포함되지 않을 수 있다.)에는 플라젤린 단백질의 접힘(folding)이 일어나는 힌지(hinge) 영역의 서열이 일부 제거된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "초가변영역"은 프로펠러(propeller) 도메인 또는 부위(region), 힌지(hinge), 초가변부위, 가변(variable) 도메인 또는 부위 등으로 표현될 수도 있다.
본 발명에서, 상기 초가변영역에 제거되었다는 것은 초가변영역에 해당되는 도메인 전체가 제거된 것일 수 있으며, 또는 초가변영역의 서열 중 일부가 제거된 것일 수도 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편이란 야생형 플라젤린의 초가변영역이 제거되고, 제거된 초가변영역에 인공의 서열(즉, 인공서열의 힌지 또는 링커)이 삽입된 형태의 플라젤린일 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 상기 플라젤린 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 부분(region)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하면서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린의 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 플라젤린의 전장 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 변이체란 야생형의 플라젤린 또는 이의 단편 단백질의 일부 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성(즉, TLR5 경로 활성화능)을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다.
경우에 따라서, 본 발명의 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)된 전장 플라젤린 또는 이의 단편일 수도 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린 또는 이의 단편의 변이체는 전장 플라젤린 또는 이의 단편의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 항원의 비제한적인 예시로는 S. pneumoniae PspA1 항원, S. pneumoniae PspA2 항원, S. pneumoniae PspA3 항원, S. pneumoniae PspA4 항원, S. pneumoniae PspA5 항원 및/또는 S. pneumoniae PspA6 항원을 들 수 있다. 또는, 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 면역 조절성 물질이 결합된 융합 단백질의 형태일 수 있다. 상기 면역 조절성 물질은 당업계에서 면역반응을 증가시키는 것으로 알려진 것이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-ω, 인터페론-τ, 인터류킨-1α, 인터류킨-1β, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-18, B세포 성장 인자, CD40 리간드, TNF- α, TNF- β, CCL25, CCL28 또는 이의 활성 단편 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퍼센트(%) 서열 상동성"은 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의한다. 퍼센트 아미노산 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법 및 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 명세서에서의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 다음과 같이 계산된다: 분율(fraction) X/Y의 100 배, 여기서 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 아미노산 잔기 점수의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 B 대 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성과 같지 않음을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 IgG4의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역 1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 야생형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함한 확장된 IgG4 Fc일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
한편, 천연형 IgG Fc 서열을 이용한 단백질 융합체를 생산시 Fc에 의한 이펙터 기능을 최소화하기 위한 노력 중 선택될 수 있는 것은 IgG4 Fc이다. IgG4는 IgG1과 유사한 생체내 반감기를 보이면서 아미노산 서열의 차이로 인해 이펙터 기능이 상대적으로 작은 것으로 알려져 있다. 그러나 IgG4는 감소된 이펙터 기능이 있다는 장점에도 불구하고, 독특한 힌지 서열에 의해 생체내에서 IgG4 간의 Fab 암(arm) 교환이 일어나 단백질 융합체를 치료용 목적으로 사용시 큰 어려움이 있는 것으로 보고되었다 (van der Neut Kolfschoten, et at., Science, 317:1554-1557. 2007). 즉, IgG4 Fc를 단백질 융합체의 캐리어로 사용시 생체내에 존재하는 IgG4와 Fab 암(arm) 교환이 일어나 천연형 IgG4와 하이브리드를 형성하거나 단량체로 존재하여 원래의 구조를 변경시켜 치료학적으로 낮은 활성을 갖는 구조를 갖게 되는 문제가 발생한다. 이는 IgG4 Fc 단편과 생리활성 물질 융합체를 유전공학 방법으로 생산하든, in vitro에서 생산하든 공통의 문제점으로 작용한다.
따라서, 본 발명의 상기 융합 단백질에 포함되는 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 Fc의 힌지, CH2 및 CH3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 '이황화 결합'은 2개의 황 원자 사이에 형성되는 공유 결합을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이는 힌지에서의 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다. 인간 IgG4 Fc의 힌지는 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)(서열번호 76)으로 이루어져 있으며, 상기 힌지에서의 돌연변이란 상기 힌지 서열에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 힌지에서의 돌연변이는 상기 인간 IgG4 Fc의 힌지를 구성하는 12개의 아미노산 중 CPSC 서열이 CPPC로 치환되고 일부 아미노산이 결실되거나 삽입된 돌연변이, 또는 또 다른 아미노산이 치환된 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 CPPC 서열을 포함하는 4개 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 힌지를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인간 IgG4 Fc는 ESKYGPPCPPCP(서열번호 77), SKYGPPCPPCP(서열번호 78), KYGPPCPPCP(서열번호 79), YGPPCPPCP(서열번호 80), GPPCPPCP(서열번호 81), PPCPPCP(서열번호 82), PCPPCP(서열번호 83), CPPCP(서열번호 84), 또는 CPPC(서열번호 85)의 서열로 이루어진 힌지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 힌지 영역에서 돌연변이되어, 2개의 힌지 영역 사이에 이황화 결합 형성을 보장하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc 힌지 영역에서의 돌연변이는 위치 228(EU 넘버링에 따름)에서 세린(Ser)이 프롤린(Pro)으로 돌연변이(S228P) 된 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 야생형의 IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 것을 특징으로 할 수 있다. IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 구체적인 예시는 KR20130063029호 등에 개시되어 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 S228P, R409K 또는 이의 조합(EU 넘버링에 따름)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 아미노산 변이는 야생형 인간 IgG4 Fc의 활성에는 영향을 주지 않으면서 단백질의 안정성 등에 영향을 주는 전하 변이체(charge variants)로서 기능할 수 있도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 인간 IgG4 Fc 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이로서, IgG4 Fc 변이체의 유도체(mutein)도 포함한다. 본 발명에 있어서 IgG4 Fc 변이체의 유도체란 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 또한, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 인간 IgG4 Fc 변이체와 동일한 생물학적 활성을 나타내나 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
본 발명의 일 실시예에서는, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체(힌지 영역에서 Fab 암 교환을 방지하는 아미노산 변이도 포함)와 플라젤린의 융합단백질을 제작하여 그 효과를 평가한 결과, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 서열을 그대로 포함하는 플라젤린의 융합단백질과 TLR5 agonist activity에 차이가 없는 것으로 확인되었다.
즉, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 융합단백질의 활성에는 영향을 주지 않으면서, 단백질의 안정성을 향상시키는 변이가 추가로 포함된 것일 수 있으며, 구체적으로는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 인간 IgG4 Fc 변이체는 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 당쇄가 제거된 인간 IgG4 Fc 변이체는 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 인간 IgG4 Fc 변이체라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 인간 IgG4 Fc 변이체를 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 C-말단에 결합된 것이거나, 또는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 융합 단백질을 구성하는 각 구성요소, 즉 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체, 및 인간 IgG4 Fc 변이체는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 용어 "링커"는 하나 이상의 분자, 예를 들면, 하나 이상의 성분 도메인 사이에 삽입될 수 있는 핵산, 아미노산 또는 비-펩타이드 잔기를 의미한다. 예를 들어, 링커는 조작을 용이하게 하기 위해 성분간에 관심있는 바람직한 부위를 제공하는데 사용될 수 있다. 링커는 또한 형질전환체로부터 융합 단백질의 발현을 증진시키고, 성분이 이의 최적의 3차 구조를 취하고/취하거나 표적 분자와 적절하게 상호 작용할 수 있도록 입체 장애를 감소시키기 위해 제공될 수 있다. 링커 서열은, 수용체 성분에 자연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위해, 특이적으로 관심있는 바람직한 부위를 제공하기 위해, 성분 도메인이 최적의 3 차 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해, 및/또는 성분과 이의 표적 분자와의 상호 작용을 증진시키기 위해 사용되는 첨가된 서열일 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 융합 단백질 내의 각각의 구성요소의 구조를 간섭하지 않고 융합 단백질의 유연성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 잔기는 2 내지 100 개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커이다. 예시적인 링커는 Gly-Gly(서열번호 64), Gly-Ala-Gly(서열번호 65), Gly-Pro-Ala(서열번호 66), Gly (G)n(서열번호 67)및 Gly-Ser (GS)(서열번호 68) 링커와 같은 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 갖는 선형 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 GS 링커는 (GS)n(서열번호 68), (GSGSG)n(서열번호 69), (G2S)n(서열번호 70), G2S2G(서열번호 71), (G2SG)n(서열번호 72), (G3S)n(서열번호 73), (G4S)n(서열번호 12), (GGSGG)nGn(서열번호 74), GSG4SG4SG(서열번호 75) 및 (GGGGS)n(서열번호 12)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1 이상이다. (G)n 링커의 하나의 예는 G9 링커를 포함하며, (GGGGS)n(서열번호 12) 링커의 예시는 GGGGS(서열번호 12) 또는 (GGGGS)3(서열번호 13) 링커를 포함한다. 적합한 선형 펩타이드는 알라닐 및/또는 세리닐 및/또는 프롤리닐 및/또는 글리실 아미노산 잔기로 구성된 폴리글리신, 폴리세린, 폴리프롤린, 폴리알라닌 및 올리고펩타이드를 포함한다. 링커 잔기는 본 발명에 개시된 융합 단백질의 구성성분을 연결시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 링커는 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 기재된 융합 단백질은 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분비하기 위해 기능하는 신호 펩타이드를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명에서 기술된 융합 단백질은 단백질 결합 펩타이드의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 성분은 예를 들어 임의의 단백질 결합 펩타이드에 대한 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 번역 후 변형을 가질 수 있다.
다른 언급이 없는 한, 본 발명의 융합 단백질은 그 자체로 생균, 사멸 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스 벡터화 백신의 일부가 아닌 폴리펩타이드 (또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)로서 투여된다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 융합 단백질은 분리된 융합 단백질로서, 예를 들어, 편모에 혼입되지 않는다.
본 발명에 있어서 "융합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60 또는 서열번호 62의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것으로, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)을 이용할 수 있다.
상기 용어 '형질전환체'는 '숙주세포' 등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.
본 발명에서 상기 형질전환체는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 융합 단백질은 야생형 플라젤린과 비교하여 현저히 향상된 TLR5 경로 활성화능을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 야생형의 IgG4 Fc와 플라젤린이 융합된 융합 단백질과 비교하여 현저히 향상된 TLR5 경로 활성화능을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 상기 융합 단백질은 TLR5 경로의 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료가 가능한 것으로 공지된 질환, 증후군 등에 대하여 예방, 개선 또는 치료효과를 나타낼 수 있다.
TLR5 경로의 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료가 가능한 것으로 공지된 질환, 증후군은 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 노화; 면역기능 감퇴; 또는 암일 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 방사선 노출에 의한 손상 예방 또는 치료용; 재관류 손상 예방 또는 치료용; 염증성 장 질환 예방 또는 치료용; 자가면역질환 예방 또는 치료용; 바이러스 감염 예방 또는 치료용; 노화 예방 또는 치료용; 면역기능 증강용; 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 본 발명의 상기 융합 단백질은 TLR5 경로 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료가 가능한 것으로 향후 밝혀질 질환에 대해서도 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘할 것으로 이해될 수 있으므로, 본 발명의 상기 약학적 조성물의 치료 대상 질환은 그 범위가 특별히 제한되는 것은 아니다.
TLR5 경로의 활성화와 방사선 노출에 의한 손상 치료와의 관련성은 KR20067010934A 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 재관류로 인한 조직 손상 치료와의 관련성은 US8324163 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 염증성 장 질환 치료와의 관련성은 US7361733 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 자가면역질환 치료와의 관련성은 EP03010523B1 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 바이러스 감염 치료와의 관련성은 US9872895 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 노화로 인한 질환과의 관련성은 KR20150049811A 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 면역 증진과의 관련성은 WO17031280A1 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 암 치료와의 관련성은 KR20177005615A 등을 참고할 수 있다.
본 발명에서 상기 방사선 노출에 의한 손상은 방사선 노출에 의한 위장 증후군 또는 조혈 증후군일 수 있다.
본 발명에서 상기 노화에 의한 질환은 노화에 의한 탈모, 백내장, 탈장, 대장염, 골다공증 또는 골연화증일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 폐암, 결장암, 신장 암, 간암, 난소 암, 전립선 암, 고환암, 비뇨 생식관 암, 림프계 암, 직장암, 췌장암, 식도암, 위암, 자궁 경부암, 갑상선암, 피부암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발세포 림프종, 조직구 림프종 및 버킷 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상증후군, 골수성 백혈병, 전골수구백혈병, 성상세포종, 신경아세포종, 신경 교종, 신경초종, 섬유육종, 횡문근육종, 골육종, 색소성 건피증, 각질극 세포종, 정상피종, 갑상선 여포암, 기형암종, 또는 위장관의 암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피 투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 나열한 각 질환들의 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 물질과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제를 제공한다.
백신보조제(adjuvant)의 가장 중요한 요건 중의 하나가 항원제공세포 표면의 공동자극 분자 발현 조절과 항원 특이적 T 세포의 유도로 인한 사이토카인 분비조절과 같은 면역조절기능을 가지고 있는 것이다.
그런데, TLR5와 같은 PRR은 숙주세포의 세포 표면 혹은 세포질 내에 분포하며, 다양한 PAMP의 자극에 의해 '선천성 면역 반응(innate immune response)'을 유도하고 나아가 '획득 면역 반응(adaptive immune response)'을 조절한다. 따라서, TLR5 작동제(agonist)들은 다양한 '면역 조절제', 특히 '백신 보조제' 개발에 적합한 표적이 될 수 있다.
따라서, TLR5 경로 활성화능이 있는 본 발명의 융합 단백질은 TLR5 경로를 활성화하여 선천성 면역 반응 및 획득 면역 반응을 증강시킴으로써, 함께 투여된 항원에 대한 숙주의 면역능이 월등히 향상될 수 있다.
본 발명이 상기 백신 보조제는 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법으로 제조될 수 있고, 당업계에서 백신 제조 시 사용할 수 있는 여러 첨가물들을 임의로 더 포함할 수도 있다.
본 발명은 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하여 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 상기 질환 진행의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료'는 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암 또는 상기 질환으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명이 제공하는 융합 단백질은 야생형 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체와 비교하여 톨-유사 수용체 5(TLR5) 경로 활성화능이 현저히 우수할 뿐 아니라, 야생형의 IgG4 Fc와 플라젤린이 융합된 단백질과 비교하여 톨-유사 수용체 5(TLR5) 경로 활성화능이 현저히 우수하기 때문에, TLR5 경로 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환의 치료제 개발 및/또는 백신 보조제 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 4번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 2번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조된 4번 내지 7번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번, 8번 내지 11번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가하고, 이의 EC50 값을 산출한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 및 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 제조된 서열번호 63번 융합단백질과 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린(BsFlagellin)의 비강 내 투여 후 시간의 경과에 따른 약물 흡수정도를 형광 이미징으로 분석한 결과이다(A: 서열번호 63번 융합단백질, B: 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
1. 실험방법
본 발명에서는 Fab 암(arm) 교환이 방지된 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질을 제작하고, 이의 효과를 다른 형태의 Fc-플라젤린 융합단백질과 비교하고자 다양한 형태의 융합단백질을 제작하였다. 융합단백질 제작에 사용된 플라젤린은 Bacillus subtilis 플라젤린(BsFlagellin)이다.
(1) DNA 클로닝
하기 12가지 종류의 플라스미드를 제작하였다.
1. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T
12. pFUSE-hIgG4-Fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-LGK
상기 1 내지 12번의 각 플라스미드가 암호화하는 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질의 구성을 아래 표 1에 나타내었다:
Figure PCTKR2021014757-appb-img-000001
(인간 IgG4 Fc의 힌지 영역은 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)(서열번호 76)으로 이루어져 있다. 상기 1 내지 3번의 융합단백질에 포함된 인간 IgG4 Fc는 상용 플라스미드에 포함된 서열로서 인간 IgG4 Fc 힌지를 구성하는 아미노산 중 일부가 결실된 형태(PPCPSCP)(서열번호 86)의 힌지가 포함된 인간 IgG4 Fc이며, 상기 5번 내지 12번은 12개의 아미노산이 모두 포함된 full length의 야생형 힌지 서열 또는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 full length의 힌지 서열을 포함하고 있다.
상기 1 내지 12의 DNA 제작에 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다:
번호 Used Primer
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 14)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 15)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC -3'
(서열번호 16)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 17)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 18)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 19)
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) Forward 5'- TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ATC -3'
(서열번호 20)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 21)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL Forward 5' - C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 22)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 23)
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) Forward 5' - TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ACC TTG CCC AGC ACC TGA - 3'
(서열번호 24)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 25)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 26)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 27)
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA CCC AAA TAC GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 28)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 29)
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC ACT CCC CCA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 30)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (서열번호 31)
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CAC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 32)
Reverse TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 33)
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CCC ACA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 34)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 35)
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) Forward 5'- GAC AAG GAT ATC GAT GAG AAT TAA CCA CAA TAT TGC AGC ACT TAA CAC - 3'
(서열번호 36)
Reverse 5'- GAC GCT AGC TCA TTT ACC CAG AGA CAG GGA GAG GC - 3'
(서열번호 37)
다음과 같은 단계에 따라 클로닝을 수행하였다:
[PCR]
1) Solgent PCR Kit (STD16-R500)을 사용하여 제작한 ORF를 맞춘 상기 프라이머를 사용하여 pFUSE-hIgG4-Fc2-BS1을 Template DNA로 하여 CPSC와 CPPC PCR product를 제작하기 위해 클로닝을 진행했다.
2) PCR fragment DNA에 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Enzyme Restriction]
3) 2)를 수행한 PCR fragment 와 Template DNA에 제한효소(Enzyme restriction)를 처리하고, 각각의 플라스미드의 enzyme cutting 완료 후, 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기 영동을 통해 PCR fragment 와 Template DNA 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Ligation]
4) Molar Ratio를 기준으로 Vector (Template DNA): Insert (PCR fragment) = 1:5의 비율로 Ligation을 진행했다. Ligation 과정은 Takara T4 DNA Ligase Kit (2011A) 매뉴얼 대로 진행했다.
[Transformation]
5) DH5a competent cell을 얼음에서 1분동안 녹인 후에 Zeocin(+) TB plate를 37도씨 incubator에 방치한다.
6) 녹은 DH5a competent cell의 10% volume으로 Ligation Product를 넣어주고 20분동안 얼음에서 방치한다.
7) 42℃ Water Bath에서 30초 동안 열 충격을 준다.
8) Heat Shock 후에 얼음에서 5분 동안 방치한다.
9) 이후에 Zeocin(+) TB Plate에 Transformation 된 E-coli를 도말한다.
10) Overnight로 Colony를 키우고 colony를 picking한다.
11) Picking된 colony를 Zeocin (+) LB media의 3㎖ Inoculation을 18hr 동안 진행한 후에 Mini Prep을 한다.
12) 클로닝이 완료된 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위해 각각의 DNA Sequencing을 진행한다.
상기 1 내지 12번 융합단백질의 DNA 염기서열 및 단백질 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타내었다.
번호 서열정보
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) DNA 서열번호 38
단백질 서열번호 39
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) DNA 서열번호 40
단백질 서열번호 41
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL DNA 서열번호 42
단백질 서열번호 43
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) DNA 서열번호 44
단백질 서열번호 45
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL DNA 서열번호 46
단백질 서열번호 47
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) DNA 서열번호 48
단백질 서열번호 49
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL DNA 서열번호 50
단백질 서열번호 51
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P DNA 서열번호 52
단백질 서열번호 53
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T DNA 서열번호 54
단백질 서열번호 55
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H DNA 서열번호 56
단백질 서열번호 57
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T DNA 서열번호 58
단백질 서열번호 59
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) DNA 서열번호 60
단백질 서열번호 61
(2) 제작한 플라스미드의 동물 세포에서의 발현 및 단백질 정제
1) 12well plate에 well 당 poly-L-lysine 500ul 사용하여 5분간 RT에서 coating한 후 serum free DMEM으로 1회, 10% FBS DMEM으로 1회 wash 한다. Transfection 당일 cell confluency가 약 60%가 되게끔 HEK293T를 seeding한다
2) 실험 당일 serum free DEME 100ul에 DNA을 각각 1ug과 TurboFect Transfection Reagent (Thermo Scientific) 2ul을 섞은 후 20분간 RT incubation한 후 transfection 한다. Transfection volume은 1ml으로 한다.
3) 24hr 후 transfection efficiency 확인 후 0.5% FBS DMEM으로 media change 한다.
4) 24hr 후 media 400ul을 harvest 한 후 debris 제거를 위해 12300g에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 사용한다.
5) 또한, flask 배양 방식으로 CHO S cell line에서 6 X 106 cells/ml 을 200ml 배지에 DNA를 1mg/L의 농도로 일시발현한다.
6) 배양 후 원심분리와 필터링 후 친화 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피 정제 과정을 거쳐 각 단백질을 수득했다.
(3) TLR5 아고니스트 어세이
상기 방법에 따라 제조한 (i) 내지 (vi) 단백질의 TLR5 활성화능을 다음 단계에 따라 확인하였다:
1) 단백질은 정량하여 준비한다.
2) HEK-Blue cell은 75T-Flask에서 DMEM (4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine), 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 100ug/ml Normocin이 들어간 media를 사용하여 culture.
3) Cell은 thawing하고 3회 정도 Normocin (100ug/ml)이 들어간 media에서 키우다가 본 실험 전에 2회 이상 Normocin (100ug/ml), Blasticidin (15ug/ml), Zeocin (100ug/ml)을 넣은 media에서 subculture 후에 사용한다.
4) Cell은 Flask의 70~80%가 차면 media만 넣고 tapping으로 cell을 분리 centrifuge (1000rpm/5min) 후에 1:6으로 subculture.
5) 흔들어서 잘 녹여주고 foil로 감싸서 37℃에서 30min 반응 후 4℃냉장고에 보관, 사용시에는 37℃로 warming up 후에 사용한다.
6) 반응시킬 protein이나 물질들을 20ul를 기준으로 필요한 농도에 맞춰서 준비해준다. 96well plate에 물질을 넣어주고 ice올려둔다. Blank는 PBS를 20ul 넣어준다.
7) 140,000 cell/ml을 기준으로 cell을 counting 후 HEK-Blue detection solution과 잘 섞어준 다음 180ul씩 각 well에 넣어준다.
8) Cell은 소량의 PBS를 사용하여 counting해주고 96well-triplicate 기준으로 총 수량을 정한다.
9) 37℃/5% CO2 incubator에서 16h 후에 620nm에서 읽어준다.
(4) Biolayer interferometry 분석
[TLR5avitag의 biotinylation]
1) Sample preparation: BirA500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit를 이용하여 진행하였다.
2) TLR5avitag (~1 mg/ml) 300 ul + BiomixA 50 ul + BiomixB 50 ul + BirA 10 ul + buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl) = final volume 500 ul의 조건으로 sample을 섞어주었다.
3) 18℃에서 5시간동안 incubation을 실시하였다.
4) 1L Buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dialysis 3회 반복하여 남아있는 잔여물을 모두 제거한다.
5) SDS-PAGE gel loading하고 PVDF membrane transfer 후 streptavidin-HRP 이용하여 biotinylation을 확인하였다.
[BLI experiment]
6) SA biosensors를 200 μl baseline buffer에 5분이상 hydration한다.
7) Baseline buffer 로 각 sample 단백질을 희석한다. TLR5avitag은 5 μg/ml, 리간드 단백질(CPPC, entolimod, flagellin)은 81, 27, 9, 3 nM의 농도로 희석한다.
[palate 측정]
8) Octet Data Acquisition 프로그램에서 process를 설정한다.
9) late Definition: 측정할 plate well type(plate 구성 참고)을 입력한다
10) Assay Definition: 1-9 lane 순서대로 sensor가 이동하게끔 Well과 각 step을 세팅하여(위 plate 구성 및 각 step별 설정 참고) 실험을 진행시킨다.
11-1) 1~3 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-2) 4 lane에서 TLR5avitag을 sensor상에 고정
11-3) 5~7 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-4) 8 lane에서 TLR5와 ligand의 association을 확인
11-5) 9 lane에서 TLR5와 ligand의 dissociation을 확인
12) 측정이 시작되면 각 5개 sensor의 baseline이 잘 잡히는지 확인한다.
13) 측정된 결과는 Octet Data Analysis 프로그램을 이용하여 분석한다 (Association and dissociation, 1:1 binding model 설정으로 fitting).
(5) Gel filtration 실험
[Buffer & Column conditions]
1) Buffer & Column conditions
- Gel-filtration buffer: 20mM HEPES (Biobasic, HB0264) pH 7.4 150mM NaCl (Biobasic, DB0483)
- 모든 단백질은 gel-filtration buffer 조건에 있으며, 단백질간 binding 또한 gel-filtration buffer 조건 하에 진행되었음. Column 내 환경 또한 gel-filtration buffer로 하여 실험을 진행하였음.)
- Column: Superdex 200 10/300 GL
- FPLC: AKTA FPLC (GE-healthcare)
2) 각각 단독으로 단백질을 column에 inject하며 각 물질의 분자량 및 elution 위치를 파악하였다.
[Sample mixing & chromatography running]
3) Protein들의 농도를 계산해서 TLR5와 리간드 protein을 각각 1:0, 1:1, 1:2, 0:1 비율로 혼합한다. total volume은 gel-filtration buffer를 이용하여 300 μl 로 맞춰준다.
4) Column에 3 column volume (75ml) 이상의 gel-filtration buffer를 흘려주어 equilibration을 진행한다.
5) 0.5 ml/min의 속도로 1 ml equilibration 진행한다.
6) 18℃에서 30분간 incubation한 뒤 sample을 centrifuge(12000 rpm, 4℃, 10 min)하여 침전물을 가라앉힌 후 상층액을 모아 FPLC에 injection한다. (Sample은 syringe를 이용해 sample loop에 injection한다.)
7) 1 column volume(25 ml) gel-filtration buffer를 흘려주어 sample의 elution peak를 UV 280 nm로 결과를 확인한다.
2. 실험결과
(1) TLR5 아고니스트 어세이
상기 실험방법에 따라 제조한 1 내지 11번 각각의 단백질의 TLR5 활성화능을 평가하고, 이에 대한 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, hIgG4 Fc의 힌지 일부 서열이 융합된 단백질(1번)과 힌지 전체서열이 융합된 단백질(4) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 힌지 전체서열이 융합된 단백질에서 높게 나타났다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS)(서열번호 12)가 1개인 융합단백질(1번)과 3개인 융합단백질(2번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 링커가 3개인 융합단백질에서 높게 나타났다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS)(서열번호 12)가 1개인 융합단백질(1번)과 링커가 없는 융합단백질(3번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 비슷한 것으로 확인되었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형의 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(4번)과 비교해 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)의 TLR5 활성화능이 현저히 높은 것으로 확인되었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)과 추가적인 변이를 포함하는 전하 변이체들 모두 TLR5 활성화능이 나타난 것으로 확인되었다.
(2) 융합단백질과 TLR5와의 결합력 분석
상기 제조한 융합단백질 중에서 6번 융합단백질(MSP306)과 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석하였다.
이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 6번 융합단백질은 결합력이 pM 수준으로 매우 뛰어난 것으로 확인되었다.
또한, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50 값을 산출해 본 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50는 21.44nM로서 매우 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 효과가 가장 우수한 6번 융합단백질과, hIgG4 Fc의 C-말단 3번째 서열만 6번과 상이한 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 비교해 본 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 6번 및 12번 융합단백질의 활성이 거의 동일한 것으로 확인되었다.
3. 곤충세포에서의 단백질 발현 및 비강 흡수 실험
(1) 곤충세포에서의 단백질 발현
[Original Baculovirus의 제작]
1) 6 well plate에 각 well 당 100 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한다.
2) 항생제가 포함되지 않는 배양액을 2ml까지 채운 후 28℃에서 30분 동안 방치한다. 방치하는 동안 그 다음 단계를 진행한다.
3) CellfectinII solution(gibco) 8μl와 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 섞은 후 실온에서 30분 동안 방치한다.
4) 별도의 용기에 midi-prep DNA (서열번호 62, 1μg/μl concentration) 1.5μl와 linearized baculovirus DNA 1.5μl을 넣고 조심스럽게 섞은 후 실온에서 5분 동안 방치한 후 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 첨가한 후 섞어준다.
5) 단계 3)의 혼합액과 단계 4)의 혼합액을 섞은 후 실온에서 30분간 방치한다.
6) 단계 2)의 plate를 꺼내 기존의 배양액을 제거한 후 각 well에 새로운 배양액 1ml를 넣어준다.
7) 각 well에 단계 5)의 혼합액을 첨가하여 plate를 밀봉한 후 low T incubator에서 4시간동안 방치한다.
8) 배양액으로 씻어낸 후 항생제가 없는 배양액으로 바꿔준다.
9) plate를 밀봉한 후 28℃ incubator에서 5일동안 방치한다.
10) Original baculovirus를 이용하여 Primary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Primary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 75T 플라스크에 1000 x 104cells개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 1ml 넣어준 후 original baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. original baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 10ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Primary Baculovirus를 이용하여 Secondary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Secondary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 175T 플라스크에 2000 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 2ml 넣어준 후 primary baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. primary baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 20ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Secondary Baculovirus를 이용하여 Tertiary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Tertiary Baculovirus의 제작]
단백질 발현이 확인되면 Tertiary Baculovirus을 제작한다. 이후의 과정은 진탕배양기를 사용한다.
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 플라스크에 180-200 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 적정양의 Secondary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다.
[단백질 획득]
1) 60-80 x 104cells/ml의 밀도로 Hi5 cell을 seeding 한다.
2) 180-200 x 104cells/ml의 밀도까지 Hi5 cell을 배양한 후 적정양의 Tertiary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 3일 배양 후 Hi5 cell을 튜브에 모은 후 4℃, 8000rpm의 조건으로 10분동안 원심 분리한다.
4) 단계 3)이 진행되는 동안 Roche Ni resin 5ml을 column에 넣은 후, [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 10ml를 흘려보낸다.
5) 단계 3)의 원심분리가 종료되면 상층액을 회수한 후 단계 4)에서 준비한 resin에 흘려보내준다.
6) [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 150ml를 흘려보낸다.
7) resin에 protein이 확인되면 다음 세 종류의 용액을 각각 15ml씩 흘려보낸다.
- 용액 1 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 100mM Imidazole
- 용액 2 : 20 HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 300mM Imidazole
- 용액 3 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 500mM Imidazole
8) SDS-PAGE를 통해 단백질을 확인한 후 농축한다.
9) 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl 용액 9ml을 넣어 Imidazole을 1/10 희석한 후 다시 농축한다.
10) FPLC를 통해 SEC를 진행한 뒤 peak, SDS-PAGE를 확인하여 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 정제된 단백질을 수득했다 (20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl).
(2) 비강투여된 물질의 생체 내 이미징
시간에 따른 Bsflagellin 및 상기 곤충세포에서 발현한 서열번호 63의 융합단백질의 생체 내 이미징을 다음 단계에 따라 확인하였다:
[실험의 준비]
1) 8주령의 수컷 SKH1 mouse을 구입하여 순화 후 실험에 사용하였다.
2) 서열번호 63 융합단백질의 비교 대상인 BsFlagellin은 Invivogen에서 구입하여 사용하였다.
[물질의 표지]
물질의 생체 내 추적을 위한 물질의 표지는 다음 단계에 따라 진행하였다
1) Flamma 774 NHS ester (pws1603,bioacts)을 1mg으로 희석하였다.
2) BsFlagellin 혹은 서열번호 63의 융합단백질을 Flamma 774 NHS ester와 혼합한다.
3) 혼합된 물질을 4℃에서 3일동안 반응시킨다.
4) 반응 종료 후 Amicon Ultra centrifugal filter unit을 통해 표지되지 않은 물질을 분리하였다.
5) 분리된 물질은 BCA 정량법을 이용하여 농도를 결정하였다.
[생체 내 이미징 분석]
1) 이전 단계에서 준비한 물질을 SKH1 마우스(n=2)에 10ug/head로 비강으로 주입하였다.
2) SKH1 마우스(n=1)에 PBS를 같은 용량으로 주입하였다.
3) 생체 내 이미징 분석을 위해 마우스를 호흡 마취한다.
4) 마취 한 마우스를 비강 주입 후 3, 6, 24 시간 후에 IVIS™ imaging system(Perkin Elmer)을 이용하여 마우스의 목 부분까지 형광 검출 영상을 얻었다.
이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, BsFlagellin(도 9B) 혹은 서열번호 63의 융합단백질(도 9A)을 비강투여한 결과, 모든 마우스의 olfactory epithelium 및 lymph node(Depp cervical, mandibular)에서 두 물질에 표지된 형광이 검출되었다.
물질 주입 24시간 후의 형광 검출 영상에서 BsFlagellin(B)보다 서열번호 63의 융합단백질이 체내 흡수가 빠르게 진행됨을 확인할 수 있었다.
본 발명이 제공하는 융합 단백질은 야생형 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체와 비교하여 톨-유사 수용체 5(TLR5) 경로 활성화능이 현저히 우수할 뿐 아니라, 야생형의 IgG4 Fc와 플라젤린이 융합된 단백질과 비교하여 톨-유사 수용체 5(TLR5) 경로 활성화능이 현저히 우수하기 때문에, TLR5 경로 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환의 치료제 개발 및/또는 백신 보조제 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (30)

  1. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 및 마리노박터(Marinobacter) 속으로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 및 마리노박터(Marinobacter spp)로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 TLR5 (toll-like receptor 5)에 의해 인식되는 보존된 서열(conserved sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild-type) 플라젤린에서 초가변 영역(hypervariable region)이 제거된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린의 변이체는 야생형(wild-type) 플라젤린과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내며 톨-유사 수용체 5(Toll-like receptor 5, TLR5) 자극 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 힌지(hinge)를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 힌지는 CPPC 서열을 포함하는 4 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이는 상기 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 228에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S228P), 위치 409에서 Arg이 Lys으로 치환된 것(R409K), 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  18. 제15항에 있어서, 상기 링커는 상기 링커는 (GGGGS)n (서열번호 12) (n은 1 내지 5)의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  19. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  22. 제21항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 톨-유사 수용체 5(TLR5) 자극 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 방사선 노출에 의한 손상 예방 또는 치료용; 재관류 손상 예방 또는 치료용; 염증성 장 질환 예방 또는 치료용; 자가면역질환 예방 또는 치료용; 바이러스 감염 예방 또는 치료용; 대사 질환 예방 또는 치료용; 노화 예방 또는 치료용; 면역기능 증강용; 또는 암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방사선 노출에 의한 손상은 위장 증후군 또는 조혈 증후군인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 노화는 노화에 의한 탈모, 백내장, 탈장, 대장염, 골다공증 및 골연화증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  28. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제.
  29. 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암 치료용 제제를 제조하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도.
  30. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하여 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 대사 질환; 노화; 면역기능 증강; 또는 암을 치료하는 방법.
PCT/KR2021/014757 2020-10-20 2021-10-20 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도 WO2022086190A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0136273 2020-10-20
KR20200136273 2020-10-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022086190A1 true WO2022086190A1 (ko) 2022-04-28

Family

ID=81290887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/014757 WO2022086190A1 (ko) 2020-10-20 2021-10-20 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20220052300A (ko)
WO (1) WO2022086190A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080074556A (ko) * 2007-02-09 2008-08-13 전남대학교산학협력단 톨-유사 수용체-5 자극 활성이 강화된 ｐａｓ-플라젤린융합 단백질
KR101287905B1 (ko) * 2003-12-02 2013-07-23 클리블랜드 클리닉 파운데이션 플라젤린을 이용한 방사선으로부터의 보호방법
WO2014084456A1 (ko) * 2012-11-30 2014-06-05 전남대학교 산학협력단 패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체 항원 단백질의 융합 재조합 단백질을 포함하는 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물
US20160129129A1 (en) * 2013-05-31 2016-05-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Igg4 fc fragment comprising modified hinge region
KR20190095946A (ko) * 2016-12-23 2019-08-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 개선된 바이오분석 및 바이오프로세싱 성질을 위한 치료용 면역글로불린 g4의 디자인

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101287905B1 (ko) * 2003-12-02 2013-07-23 클리블랜드 클리닉 파운데이션 플라젤린을 이용한 방사선으로부터의 보호방법
KR20080074556A (ko) * 2007-02-09 2008-08-13 전남대학교산학협력단 톨-유사 수용체-5 자극 활성이 강화된 ｐａｓ-플라젤린융합 단백질
WO2014084456A1 (ko) * 2012-11-30 2014-06-05 전남대학교 산학협력단 패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체 항원 단백질의 융합 재조합 단백질을 포함하는 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물
US20160129129A1 (en) * 2013-05-31 2016-05-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Igg4 fc fragment comprising modified hinge region
KR20190095946A (ko) * 2016-12-23 2019-08-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 개선된 바이오분석 및 바이오프로세싱 성질을 위한 치료용 면역글로불린 g4의 디자인

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PROTEIN 6 April 2020 (2020-04-06), ANONYMOUS : "MULTISPECIES: flagellin Hag [Bacillus] ", XP055922816, retrieved from NCBI Database accession no. WP_003219729 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220052300A (ko) 2022-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020218829A1 (ko) 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
WO2017116205A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체
WO2020050667A1 (ko) 고형암을 위한 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t 세포
WO2022211537A1 (ko) 신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그 결합체 및 이의 제조 방법
WO2018074884A1 (ko) 재조합 단백질 및 그의 용도
WO2019066586A1 (ko) 글루카곤 유사 펩타이드-2(glp-2) 유도체의 지속형 결합체
WO2017116207A1 (ko) Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
WO2021145552A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체의 폐질환의 치료 용도
WO2020130749A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 및 인슐린을 포함하는 약학 조성물
WO2019066570A1 (ko) 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체
WO2022139493A1 (ko) TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도
WO2022015082A1 (ko) 글루카곤 유도체 또는 이의 결합체의 간질환에 대한 치료적 용도
WO2022080986A1 (ko) Glp-1/gip 이중작용제, 이의 지속형 결합체, 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2022086190A1 (ko) 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
WO2020130751A1 (ko) 인슐린 및 글루카곤을 포함하는 약학 조성물
WO2023204562A1 (ko) 플라젤린 및 면역글로불린 fc 융합 단백질을 포함하는 대장염 치료용 조성물
WO2023106845A1 (ko) 신규한 아디포넥틴 아날로그 및 결합체
WO2022015115A1 (ko) 3중 작용성 지속형 결합체 또는 3중 작용제를 포함하는 조합물의 치료학적 용도
WO2022119380A1 (ko) 신규한 ace2 변이체 및 그의 이용
WO2021133087A1 (ko) Glp-2 또는 이의 결합체를 포함하는 골 대사성 질환에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022035200A1 (ko) Il-12 및 항-cd20 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2022216129A1 (ko) 글루카곤 유도체를 포함하는 만성 신장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2021235913A1 (ko) Glp-2의 지속형 결합체의 액상 제제
WO2020138868A1 (ko) 타입 1 인터페론 중화 fc-융합 단백질 및 이의 용도
WO2021235907A1 (ko) 글루카곤 유도체의 지속형 결합체의 액상 제제

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21883258

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21883258

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1