WO2014084456A1 - 패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체 항원 단백질의 융합 재조합 단백질을 포함하는 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체 항원 단백질의 융합 재조합 단백질을 포함하는 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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recombinant protein
aging
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조경아
임재성
이준행
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Definitions

  • Aging prevention, improvement or treatment composition comprising a fusion recombinant protein of sepsis Vibrio flagellin and pathogen antigen protein
  • the present invention was made by the task number 2012- 0002472 under the support of the Korea Research Foundation of Korea, the research management specialized organization of the project is the Korea Research Foundation, the research project name is "general researcher support project / basic research", the research project name is "large Study on the mechanism of aging-related immune decline using phagocyte transplantation ”, The host institution is Chonnam National University, and the period is 2010. 05. 01 ⁇ 2013. 04. 30.
  • the present invention was made by the task number RTI-0501-01 under the support of the Ministry of Knowledge Economy of the Republic of Korea, the research and management professional organization of the task is the Ministry of Knowledge Economy, the research project name "development of new vaccines and immune diseases, research project name is” Development of aging vaccine adjuvant ", Host organization is Chonnam National University, the research period is 2011.07.01 ⁇ 2012. 06.
  • the present invention was made by the task number 2011-0030034 under the support of the Ministry of Education, Science and Technology,
  • the research and management specialized agency of the project is the Ministry of Education, Science and Technology,
  • the research project name is "Excellent overseas research institution attraction project”
  • the research project title is "Control of cell function according to aging”
  • the host institution is the Hwasun University Hospital, and the research period is 06. 30.
  • the present invention provides anti-aging including recombinant protein fused with flagellin, a flagellar component of Vibrio vulnificus, an agent of framework-like receptor -50LR-5, which is effective as a vaccine adjuvant. It relates to a composition for improvement or treatment and a method for preventing, improving or treating aging.
  • the host's defenses come from two immune systems: innate and adaptive immunity.
  • the innate immune system is an immune system that is activated immediately after infection and can be controlled quickly against infecting pathogens, and is responsible for the initial stage of infection until the acquired immune system is activated.
  • PAMPs pathogen associated molecular patterns
  • TLRs toll-like receptors
  • TLRs Thirteen types have been identified so far, and studies on agonists of each TLRs are actively conducted (Shizuo Akira et al, Cell, Pathogen Recognition and Innate Immunity, 124 (4): 783—801, 2006).
  • PRRs such as TLRs
  • TLRs are present on the cell surface or in the cytoplasm, regulate innate immune response by stimulation of various PAMPs, and further regulate adaptive immune response.
  • Agonists of TLRs may therefore be suitable targets for the development of various immune modulators and vaccine adjuvants.
  • the present inventors made diligent research efforts to develop a material capable of preventing, improving or treating a decrease in function due to aging.
  • the expression of most of the -like receptors is reduced in senescent immune cells, while the -like analogue receptor -5 is well expressed and maintains its function, flagellin, a flagellar component of Vibrio that activates it, and
  • the present invention was completed by confirming that not only the immunity of senescent mice is activated but also the external and internal functions are improved.
  • an object of the present invention is a recombinant fusion of flagellin, a flagellar component of Vibrio vulnificus, with protein antigens of pathogens. It is to provide a composition for preventing, improving or treating aging comprising a protein as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a composition for the prevention, improvement or treatment of hair-related diseases comprising the recombinant protein of the present invention as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for preventing, ameliorating or treating an eye-related disease comprising the recombinant protein of the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing, improving or treating aging.
  • the present invention provides a composition for preventing, improving or treating aging including a recombinant protein fused with flagellin, a flagellar component of Vibrio vulnificus, and a protein antigen of a pathogen as an active ingredient. to provide.
  • the present inventors made diligent research efforts to develop a material capable of preventing, improving or treating a decrease in function caused by aging.
  • the expression of most of the -like receptors is reduced in senescent immune cells, while the -like receptor -5 is well expressed and maintains its function, flagella, the flagellar component of Vibrio that activates it, and Immunization using recombinant proteins fused with antigenic proteins of pathogens confirmed that immunization of senescent mice was activated, as well as external and internal functions.
  • the biggest feature of the present invention is the use of a recombinant protein in which flagellin, a flagellar component of Vibrio vulnificus, is fused with a protein antigen of a pathogen.
  • flagellin refers to a unit molecule constituting flagella, the cilia that determine the motility of bacteria.
  • the flagellin of the present invention includes all flagellins that act as TLR-5 agonists of sepsis vibrio, and according to one embodiment of the present invention, the flagellin of the present invention is FlaB, which is sepsis vibrio and flagellin.
  • protein antigens of pathogens examples include alpha-helix domain of surface protein A (PspA) of pneumococcal (Streptococcus pneumoniae) and pneumococcal surface protein A (PsaA). A); Subunits of influenza virus (hemagglut inin) and NA (neuraminidase); And Spike (S) proteins of Severe Respiratory Syndrome Virus (SARS virus) and the like.
  • the protein antigen of the pathogen of the invention is the surface protein A (PspA) of pneumococcal.
  • the recombinant protein of the present invention is a FlaB-PspA protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 sequence.
  • the term "aging” refers to functional, structural and biochemical processes that occur continuously until an individual is born and dies. It occurs in the cells and body tissues that make up the individual, and shows a decrease in metabolic rate, increased disease, and decreased adaptability, which ultimately leads to death of cells and the whole body. For example, external changes such as increased wrinkles on the skin, reduced hair gloss, bleached hair, hair loss, reduced thickness of the dermis with hair follicles, reduced number of hair follicles, reduced spine flexion and momentum, and reduced immune function, major tissues. Internal changes, such as a decrease in the function of, and thereby the occurrence of diseases of each tissue, including, but not limited to.
  • the recombinant protein of the invention enhances immunity.
  • the term “immune potentiation” refers to maintaining the immune response or activity of the immune system in vivo relative to an unaged control or to enhancing an aged control.
  • the recombinant protein of the present invention is a hematopoietic stem cell that is important for increasing secretion-type immunoglobulin A (sIgA) antibody production, differentiation from T cells, based on an aging control group.
  • sIgA immunoglobulin A
  • Increasing frequency, preventing thymus degeneration, or preventing mesenteric lymphnodes (MLNs) or spleens from becoming enlarged enhances the function of immune-related organs than aging controls or is not reduced by aging.
  • the recombinant protein of the present invention prevents, improves or treats metabolic function, skin tissue function, intestinal tissue function, muscle tissue function, brain function or cardiovascular function deterioration. According to another embodiment of the present invention, the recombinant protein of the present invention prevents, improves or treats metabolic function, skin tissue function, intestinal tissue function, and muscle tissue deterioration. According to certain embodiments of the invention, the recombinant protein of the present invention prevents, ameliorates or treats the function of the dermal tissue in which the hair follicle is present, the function of the colon tissue or the function of the muscle tissue. According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for the prevention, improvement or treatment of metabolic disease (Metabolic Disease) comprising the recombinant proteinol active ingredient of the present invention.
  • Metabolic Disease metabolic disease
  • the term "metabolic disease” refers to a syndrome in which risk factors such as obesity, diabetes, hypertriglyceridemia, hypertension, cardiovascular disease, and hematological abnormalities are present. Its symptoms are not fatal, but it is a serious threat to modern people because of the predisposition to develop serious diseases such as diabetes and ischemic cardiovascular disease. It was recently called the Metabolic Syndrome or Insulin Resistance Syndrome through the Adult Treatment Program, which was recently established by the World Health Organization and the National Institutes of Health. According to one embodiment of the invention, the metabolic disease of the invention is obesity. According to another aspect of the invention, the recombinant protein of the invention It provides a composition for the prevention, improvement or treatment of hair-related diseases comprising as an active ingredient.
  • the hair-related diseases which can be prevented, improved or treated by the composition of the present invention include, for example, reduced hair gloss, hair bleaching, hair loss, decreased thickness of the dermis in the presence of hair follicles, and reduced number of hair follicles. It is not.
  • a composition for preventing, ameliorating or treating intestinal diseases comprising the recombinant protein of the present invention as an active ingredient.
  • the bowel diseases that the compositions of the present invention can prevent, ameliorate or treat include, for example, irritable bowel syndrome (IBS), uncontrolled diarrhea-associated irritable bowel syndrome (dIBS), Crohn's disease traveler diarrhea, ulcerative colitis, enteritis, Intestinal bacteria include overgrowth, chronic pancreatitis, pancreatic insufficiency, colitis, diverticulosis, hepatic encephalopathy and hernias.
  • the bowel disease of the invention is enteritis or hernia.
  • the bowel disease of the invention is colitis or hernia.
  • a composition for preventing, improving or treating bone disease comprising the recombinant protein of the present invention as an active ingredient.
  • the bone diseases which the composition of the present invention can prevent or treat include, for example, osteoporosis, scoliosis, osteomalacia, rickets of rickets cancer cells, bone damage caused by bone metastasis of cancer cells, bone lysis caused by bone metastasis of cancer cells, fibrous bone Dysplasia, aplastic bone disease, metabolic bone disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, degenerative arthritis and discs, and the like.
  • the bone-related diseases of the present invention are osteoporosis, osteomalacia, metabolic bone disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis or degenerative arthritis.
  • the bone disease of the present invention is osteoporosis or osteomalacia.
  • the composition for preventing, ameliorating or treating the above-mentioned diseases of the present invention Since the above-described recombinant protein is included as an active ingredient, common contents in relation to the recombinant protein are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the composition of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition.
  • the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the recombinant protein of the present invention; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the recombinant protein described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny starch, acacia rubber, phosphate chamomile, alginate, gelatin , Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose ⁇ methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil
  • the present invention is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, and preservatives in addition to the above components.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, and preservatives in addition to the above components.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered mucosally, orally or parenterally, and according to one embodiment of the present invention, it is applied in a mucosal manner of administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction in response to the patient. It may be prescribed. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are in the range of 0.001-100 rag / kg on an adult basis.
  • composition of the present invention can be easily carried out by those skilled in the art according to the present invention, Formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients may be prepared in unit dose form or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oil or aqueous media, or may be in the form of axes, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the composition of the present invention may be provided as a food composition.
  • the composition of the present invention comprises (a) a food-effective amount of the recombinant protein of the present invention; And (b) a food acceptable carrier.
  • composition of the present invention is made of a food composition, as an active ingredient, as well as a recombinant protein, it contains components commonly added during food production, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, loli sugar and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides, eg, textine, cyclodextrin, and xyl, sorbitol, and erytri.
  • natural flavoring agents [tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, bilayer extract, jujube extract, licorice extract, etc. can be used.
  • composition of the present invention may be provided as a cosmetic composition.
  • the composition of the present invention when the composition of the present invention is made of a cosmetic composition, the composition of the present invention includes not only the recombinant protein described above, but also components commonly used in cosmetic compositions, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and Conventional adjuvants such as perfumes, and carriers.
  • components commonly used in cosmetic compositions such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and Conventional adjuvants such as perfumes, and carriers.
  • purified water purified water, monohydric alcohols (ethanol or propyl alcohol), polyhydric alcohols (glycer, 1,3-butylene glycol or propylene glycol), higher fatty acids (palmitylic acid or linolenic acid), fats and oils (wheat embryo oil) , Camellia oil, jojoba oil, olive oil, squalene, sunflower oil, macadamia peanut oil, avocado oil, Soybean hydrogenated lecithin or fatty acid glycerides), and the like, but is not limited thereto.
  • surfactants, bactericides, antioxidants, ultraviolet absorbers, anti-inflammatory agents, and refreshing agents may be added.
  • Surfactants include polyoxyethylene, hardened castor oil, polyoxyethylene, oleyl ether, monooleate polyoxyethylene, polyoxyethylene, glyceryl monostearate, monostearate sorbitan, monooleic acid polyoxyethylene, sorbitan, Sucrose fatty acid ester, monolauric acid nucleated glycerin, polyoxyethylene reduced lanolin, P0E, glyceryl pyroglutamic acid, isostearic acid, diesters, N-acetyl glutamine and isostearyl ester may be optionally included.
  • Fungicides may optionally include hydroxythiol, trichromic acid, chloronucleoside gluconate, phenoxyethane from the group consisting of resorcinol, isopropylmethylphenol, azulene, salicylic acid and zinc pyrithaone. Can be.
  • Antioxidants can use any of butylhydroxyanisole, glutaric acid, molten acid propyl and erythorbic acid.
  • UV absorbers are dihydroxybenzophenones, benzophenones, ethyl melanin paraaminobenzoate, paradimethylaminobenzoic acid 2-ethylnucleic ester, synoxite, paramethoxy cinnamic acid 2-ethylnuclear ester, 2- (2-hydroxy -5-methylphenyl) benzotriazole, urokanoic acid and metal oxide fine particles can be used.
  • dipotassium glytilinate or allantoin may be used, and as the refreshing agent, capsicum tink or 1-men may be used.
  • the formulation of the composition may be any formulation that can combine the recombinant protein as an active ingredient, and in the form of hair loss prevention cosmetics, hair tonic, hair cream, hair lotion, hair shampoo, hair rinse, hair conditioner, hair spray, hair aerosol, It can be prepared in various forms such as solution, sol-gel, emulsion, oil, wax, aerosol, such as pomade and powder ⁇ gel, but is not limited thereto.
  • the invention provides a method for preventing, improving or treating aging comprising administering a composition of the invention to a subject. ⁇ Effects of the Invention ⁇
  • the present invention provides a composition for preventing, improving or treating aging comprising a recombinant protein fused with flagellin, a flagellar constituent of Vibrio vulnificus, and a protein antigen of a pathogen as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for the prevention, improvement or treatment of metabolic diseases, hair-related diseases, eye diseases, intestinal diseases or bone diseases comprising the recombinant protein of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention has the advantage of using the recombinant protein of the present invention to improve external and internal functions generated by aging and to enhance immunity.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the experimental design and experimental method for immunizing the overall aging mouse.
  • Figure 2 shows a graph of the measurement results of food intake and weight changes in aging mice according to the immunity of FlaB-PspA recombinant protein.
  • Fig. 5 shows histopathological findings on skin histological changes of senescent mice by FlaB-PspA recombinant protein immunity.
  • Figure 6 shows the changes of hematopoietic stem cells in bone marrow cells of senescent mice by FlaB-PspA recombinant protein.
  • Figure 7 shows organs showing lymphoid system changes in senescent mice by FlaB-PspA recombinant protein immunity.
  • the purified protein and recombinant protein were continuously immunized with aging mice (C57BL / 6J, 23 months or more) intranasally (Intranasal) at 2 week intervals.
  • PspA protein and FlaB-PspA recombinant protein were purchased from Prof. Lee Jun-haeng's laboratory at Chonnam National University.
  • mice During continuous immunization, morphological and behavioral changes of aging mice were observed.
  • each mouse was administered separately to measure the weight and food intake of the mice every week. After feeding 50g of food per animal, the amount of food left was eaten at a weekly interval. In addition, the weight of each mouse was accurately measured each week using an animal scale. In order to compare the morphological changes of the aging mice according to the immunity, the appearance of the mice, ie, hair condition, hair loss, and discoloration were observed weekly.
  • mice in order to compare the behavioral changes of senescent mice by immunization, we observed the behavior of mice at some time during immunization. This In order to check the behavior of the mouse in order to check the movement of the mouse for a certain time by placing the aging mice of each group in a limited space. The movements were generally compared based on the standard behavioral behavior of the mouse, the number of standing on the hind limbs, and the number of supports and nose touching using the forelimbs.
  • mice After immunization for a suitable period, several samples were taken from the mice collectively, and the overall change of senescence mice due to immunity was measured by various experimental methods.
  • mice of the immune serum and various mucosal samples from mice in order to determine the changes in the immune banung come to 'collect mucosal immune banung (mucosal i ⁇ une response) to compare all Changes in secreted immunoglobulin A (secretory IgA, slgA) antibody production were measured by ELISA method.
  • H & E Hematoxylin and Eosin staining were used to compare histopathologic findings. H & E staining of small intestine and large intestine, which were largely occupied in mucosal immunity, was compared with histopathological findings.
  • ELISA method is used to separate cellular lymphocytes from cervical lymph node and spleen and to carry out antigenic cellular immune response.
  • bone marrow cells were separated from the bones of the hind legs of aging mice and compared by using a flow cytometer (FACS: Beckman Coulter).
  • FACS flow cytometer
  • mice In order to compare the bone density of senescent mice by immunization by separating the spine of the mouse, the mouse spine was extracted and then, using a microCT (Micro Computer Tomography) Skyscan 1172 (Micro Photonics Inc., USA). BMD (Bone Mineral Density) of aging mice with persistent immunity was compared with kyphosis with aging.
  • mice in each group were measured weekly during eight immunizations at two week intervals into the nasal cavity of the aging mice.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • 2.5 Hg PspA and 6.5 ug FlaB-PspA recombinant protein were injected into the nasal cavity of the aging mice 8 times at 2 week intervals, and each group of mice was immunized each week, and each week The weight and food intake of the mice in the groups were measured. The results are shown in Figures 2a and 2b.
  • Example 2 Observing Mouse Morphological Changes Through Continuous Immunization
  • the morphological changes of the senescent mice by immunization were confirmed weekly during eight immunizations at two week intervals in the nasal cavity of the aging mice, and the results are shown in FIG. 3, and the unimmunized senescent mice were used as controls.
  • Example 2 IgA Response Changes in Aging Mice with Sustained Antigen Immunity
  • mice During continuous immunization, each group of mice was immunized after stool immunization and IgA reaction of senescent mice according to immunization was confirmed by ELISA method, and the results are shown in FIG. 4. Was used as a control.
  • Example 3 As can be seen from the result, through continuous immunity IgA response to mucosal immunity in senescent mice was confirmed.In other groups, IgA response did not show any difference or slight reaction according to immunity, whereas in group immunized with FlaB-PspA recombinant protein, IgA response according to immunity This was found to be significantly increased. In light of this result, it can be considered that mucosal immunity of senescent mouse is activated by recombinant protein.
  • Example 4 Skin Histological Changes of Aged Mice by Recombinant Protein Immunity
  • Example 2 As a result of observing that the hair condition of the aging mouse is very good in the group continuously immunized with the antigen, in particular, the recombinant protein, the result is confirmed through H & E staining to show the result in detail in FIG. 5. Young mice were used as controls.
  • Example 5 Changes in Hematopoietic Cells in Bone Marrow by Recombinant Protein Immunity
  • hematopoietic stem cell markers are used to determine the frequency of hematopoietic stem cells.
  • Example 6 Changes in Lymphatic Organs by Recombinant Protein Immunity
  • mice After continuous immunization for a proper period, organs were removed from each group of mice, and the results were shown in FIG. 7. The results are shown in FIG. 7, and young mice were used as controls.
  • the tissues were extracted from senescent mice, and then the changes in organ morphology and weight were measured. As compared with other organs, lymphocyte-related organs showed differences due to persistent immunity.
  • the group immunized with FiaB-P SP A recombinant protein was found to be very similar to the shape and weight of young mouse organs. It is common that thymus degenerates with age, and the weight of thymus is increased in the group that is constantly immunized with aging mice. In particular, immunization with FlaB-PspA recombinant protein In the group it was confirmed that the weight is significantly increased.
  • MNN mesenteric lymphnode
  • spleen which are widely used in systemic inflammation, are most frequently enlarged due to persistent infection as the aging progresses.
  • FlaB PspA in aging mice
  • Continuous immunization with recombinant protein showed that the thymus weighed more than the other groups, and the spleen weighed less than the spleen of aging mice in other groups and was similar in shape to the spleen of young mice. It was confirmed that.
  • Example 7 Changes in bone density in aging mice by recombinant protein immune
  • the spine was extracted from aging mice, and a small animal computed tomography (microCT) was used to measure the bone mineral density change of senescent mice through immunool using recombinant proteins. The results are shown in FIG. 8, and young mice were used as controls.
  • microCT computed tomography

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Abstract

본 발명은 패혈증 비브리오균(Vibrio vulnificus)의 편모 구성성분인 플라젤린과 병원체의 단백질 항원을 융합시킨 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 본 발명의 재조합 단백질을 이용하여 노화에 따라 발생하는 외적, 내적인 기능을 개선하고 면역을 강화시킬 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 점막 투여를 통하여 손쉽게 면역을 할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체 항원 단백질의 융합 재조합 단백질을 포함하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물
【기술분야】
본 발명은 대한민국 한국연구재단의 지원 하에서 과제번호 2012- 0002472 에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단， 연구사업명은 "일반연구자 지원사업 /기본연구" ， 연구과제명은 "대식세포 이식을 이용한 노화관련 면역쇠퇴의 기전 연구" ， 주관기관은 전남대학교， 연구기간은 2010. 05. 01 ~ 2013. 04. 30 이다.
또한， 본 발명은 대한민국 지식경제부의 지원 하에서 과제번호 RTI- 0501-01에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 지식경제부， 연구사업명은 "신백신 및 면역질환 치료제 개발， 연구과제명은 "노화백신 보조제 개발" ， 주관기관은 전남대학교, 연구기간은 2011.07.01 ~ 2012. 06. 30이다. - 더불어， 본 발명은 대한민국 교육과학기술부의 지원 하에서 과제번호 2011-0030034에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 교육과학기술부， 연구사업명은 "해외우수연구기관유치사업" ， 연구과제명은 "노화에 따른 세포 기능 조절" , 주관기관은 화순전대병원, 연구기간은 2011.07.01 ~ 2012. 06. 30이다.
본 특허출원은 2012년 11월 30일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0138234호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 백신 보조제로 효과가 있는 틀 -유사수용체 -50LR-5)의 작용제인 패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus)의 편모 구성성분인 플라젤린과 병원체의 항원을 융합시킨 재조합 단백을 포함하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물 및 노화 예방， 개선 또는 치료방법에 관한 것이다. 【배경기술】
인류의 평균 수명 연장으로 인해 노령화 사회의 출현으로 인류는 전에 겪지 못한 다양한 숙제에 당면해 있다. 사회 경제적으로는 노령 인구의 증가 및 생산연령층의 감소로 인한 1인당 노인인구 부양비의 증가가 예상되며， 또한 노인들의 삶의 질 향상에 대한 관심 역시 증가되는 추세이다. 이와 같이 건강하고 행복한 노년의 삶에 대한 사회적 요구가 증가하면서， 노령화에 따른 질병 양태의 변화 및 노화 관련 질환들의 예방에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.
노화가 진행되면서 나타나는 변화는 매우 다양하다. 외형적으로는 피부의 주름， 헤어의 탈색， 척추의 휨 및 움직임의 변화 등 다양한 외적 변화 외에 내적으로 각 주요 조직의 기능 감소， 음식의 섭취 및 소화 장애， 기억력 감퇴를 포함하는 뇌기능 저하 및 심혈관의 기능 감소 등 다양한 변화가 나타난다. 또한，이러한 변화는 기능 감소와 더불어 각 조직의 질환을 유도하기 때문에 노화에 따른 외적, 내적인 기능 감소에 대한 원인에 대한 이해 및 이를 조절하는 기술을 개발하는 것은 매우 충요하다. 이 외에도 노화에 따른 큰 기능 변화 중 하나가 면역기능의 감소이다. 이를 면역노화 (I隱 unosenescence)라고 한다. 병원균이 숙주에 침입했을 때 숙주 방어작용은 선천성 면역 (innate munity)과 후천성 면역 (adaptive i隱 unity)의 두 가지 면역체계가 작용한다. 이 중에서 선천성 면역체계는 감염 후 즉각적으로 활성화되어 감염 병원균에 대해 재빨리 조절할 수 있는 면역계로 후천성 면역체계가 활성화될 때까지의 감염 초기를 담당한다. 이러한 선천성 면역에서 병원균에 존재하는 '병원체 관련 분자구조 (PAMPs: pathogen associated molecular patterns)' 를 인식하는 수용체를 '패턴인식 수용체' (P Rs: pattern recognition receptors)라고 부르는데 포유동물에서는 이 수용체를 를 -유사수용체 (TLRs: Toll-like receptors)이라 한다. 지금까지 모두 13 종류의 TLRs이 밝혀져 있으며 각 TLRs의 작용제 (agonist)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Shizuo Akira et al , Cell, Pathogen Recognition and Innate Immunity, 124(4) :783—801， 2006) . TLRs과 같은 PRRs은 세포 표면 혹은 세포질 내에 존재하며， 다양한 PAMPs의 자극에 의해 선천성 면역반웅 (innate immune response)을 조절하고， 나아가 획득 면역 반웅 (adaptive immune response)을 조절한다고 알려져 있다. 따라서 TLRs의 작용제들은 다양한 면역 조절제 및 백신 보조제 개발에 적합한 표적 물질이 될 수 있다.
노화 연구 중 최근까지 가장 각광받고 있는 분야는 노화의 수명 조절 또는 노화 기능 회복에 대한 연구이다. 초파리 모델이나 선층류를 이용한 연구에서 특정 유전자의 발현을 억제하거나 과발현하여 수명이 연장되는 경우， 식이제한을 통해 수명이 연장되는 경우， 최근 라파마이신 등을 처리하여 수명이 연장되는 경우 등 다양한 방법을 통한 수명 연장에 대한 연구가 급증하고 있고 단순 수명연장이 아닌 기능유지 또는 기능 회복 등에 대한 관심도 증가하고 있는 추세이다. 그러나 하등 동물 모델에서 나타난 결과를 참고하여 특정 유전자의 발현을 조절하는 것은 다른 기능적 부작용을 야기할 수 있어 사람에게 적용하는 데에 한계가 있고 라파마이신과 같은 약물을 처리하는 경우 면역 기능에 큰 영향을 줄 수 있다는 한계가 지적되고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. [발명의 내용]
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 노화에 따른 기능 저하를 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 노화 면역 세포에서 대부분의 를 -유사 수용체들의 발현이 감소하는 반면， 를-유사체 수용체 -5는 잘 발현되어 기능이 유지됨을 확인하고, 이를 활성화시키는 비브리오균의 편모 구성성분인 플라젤린 및 병원체의 항원 단백을 융합시킨 재조합 단백을 이용하여 면역화 하는 경우 노화쥐의 면역이 활성화될 뿐만 아니라 외적, 내적인 기능이 향상됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus)의 편모 구성성분인 플라젤린과 병원체의 단백질 항원을 융합시킨 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 모발 관련 질환의 예방， 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 안 (eye) 관련 질환의 예방， 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방， 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 노화 예방， 개선 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
[과제의 해결 수단]
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus)의 편모 구성성분인 플라젤린과 병원체의 단백질 항원을 융합시킨 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 노화에 따른 기능 저하를 예방， 개선 또는 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 노화 면역 세포에서 대부분의 를 -유사 수용체들의 발현이 감소하는 반면， 를-유사체 수용체 -5는 잘 발현되어 기능이 유지됨을 확인하고， 이를 활성화시키는 비브리오균의 편모 구성성분인 플라젤린 및 병원체의 항원 단백을 융합시킨 재조합 단백을 이용하여 면역화 하는 경우 노화쥐의 면역이 활성화될 뿐만 아니라 외적， 내적인 기능이 향상됨올 확인하였다. 본 발명의 가장 큰 특징은 패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus)의 편모 구성성분인 플라젤린과 병원체의 단백질 항원을 융합시킨 재조합 단백질을 이용하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "플라젤린" 은 세균의 운동성을 결정하는 섬모인 플라젤라를 구성하는 단위 분자를 의미한다. 본 발명의 플라젤린은 패혈증 비브리오균의 TLR-5 작동제로서 작용하는 플라젤린을 모두 포함하고， 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 플라젤린은 패혈증 비브리오균와플라젤린인 FlaB이다.
본 발명에서 이용될 수 있는 병원체의 단백질 항원의 예는 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae)의 표면 단백 A(PspA)의 알파 나선 도메인 (α-helix domain) 및 폐렴구균 표면 부착인자 A(PsaA: pneumococcal surface protein A); 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 HA(hemagglut inin) 및 NA(neuraminidase); 및 중증급성 호흡기 증후군 바이러스 (SARS 바이러스)의 스파이크 (S) 단백질 등을 포함하나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 병원체의 단백질 항원은 폐렴구균의 표면 단백질 A(PspA)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 단백질은 서열목록 제 1서열의 아미노산 서열을 갖는 FlaB-PspA단백질이다.
본 명세서에서 용어 "노화 (aging)" 는 개체가 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적， 구조적 및 생화학적 과정올 의미한다. 개체를 구성하고 있는 세포와 신체조직 전체에 일어나며, 대사속도의 저하, 질병증가 및 적응력 저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 예컨대， 피부의 주름 증가， 모발의 윤기 감소， 모발의 탈색， 탈모， 모낭이 존재하는 진피층 두께 감소， 모낭 수 감소， 척추의 휨 및 운동량의 감소 등의 외적 변화, 그리고 면역 기능의 감소， 주요 조직의 기능 감소 등의 내적 변화 및 이로 인한 각 조직들의 질환의 발생을 모두 포함하고, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 단백질은 면역을 강화시킨다. 본 명세서에서 용어 "면역강화" 는 생체 내 면역시스템의 면역 반웅 또는 활성을 노화되지 않은 대조군을 기준으로 유지시키거나 노화된 대조군을 기준으로 강화시키는 것을 의미한다 . 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 재조합 단백질은 노화된 대조군을 기준으로 분비형 면역 글로블린 A(sIgA: secretory IgA) 항체 생성의 증가， T 세포와 분화에 중요하게 관련되어 있는 조혈모세포 (hematopoietic stem cells)빈도의 증가， 흉선의 퇴화 방지 또는 창자간막림프절 (MLN: mesenteric lymphnode)이나 비장 (spleen)이 비대해지지 않도록 하여 면역관련기관의 기능성을 노화에 의해 감소되지 않거나 노화된 대조군보다 강화시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 재조합 단백질은 대사 기능， 피부 조직의 기능, 장 조직의 기능， 근육 조직의 기능， 뇌 기능 또는 심혈관 기능 저하를 예방, 개선 또는 치료한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 재조합 단백질은 대사 기능， 피부 조직의 기능, 장 조직의 기능, 근육 조직의 기능 저하를 예방， 개선 또는 치료한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면， 본 발명의 재조합 단백질은 모낭이 존재하는 진피 조직의 기능， 대장 조직의 기능 또는 근육 조직의 기능 저하를 예방, 개선 또는 치료한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 재조합 단백질올 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 (Metabolic Disease)의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "대사성 질환" 은 비만， 당뇨， 고중성지방혈증， 고혈압, 심혈관질환 및 혈액웅고 이상과 같은 위험인자가 함께 나타나는 증후군을 의미한다. 그 증상 자체는 치명적이진 않지만 당뇨병이나 허혈성 심혈관계 질환과 같은 심각한 질병으로 발전할 소인이 있기 때문에 현대인을 크게 위협하는 질환으로， 한때는 그 원인을 몰라 X 증후군 (Syndrome X)을 비롯한 여러 종류의 이름으로 불렸으나， 최근 세계보건기구와 미국국립보건연구원에서 제정한 성인 치료프로그램 ΠΚΑΤΡ ΙΠ: Adult Treatment Program ΠΙ)을 통해 대사증후군 또는 인슐린저항성증후군 (Insulin resistance syndrome)이라 공식 명명되었다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 대사성 질환은 비만이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 모발 관련 질환의 예방， 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 예방， 개선 또는 치료할 수 있는 상기 모발 관련 질환으로는 예컨대， 모발의 윤기 감소， 모발의 탈색， 탈모 , 모낭이 존재하는 진피층 두께 감소 및 모낭 수 감소 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방， 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 예방， 개선 또는 치료할 수 있는 상기 장 질환으로는 예컨대, 과민성 장 증후군 (IBS), 조절되지 않는 설사 -관련 과민성 장 증후군 (dIBS), 크론병 여행자 설사， 궤양성 대장염， 장염， 소장 박테리아 과성장， 만성 췌장염, 췌장 기능부전， 결장염， 게실병， 간성 뇌병증 및 탈장 등을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 장 질환은 장염 또는 탈장이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 장 질환은 대장염 또는 탈장이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
발명의 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 상기 골 질환으로는 예컨대， 골다공증， 척추측만증， 골연화증， 구루병 암세포의 골 전이, 암세포의 골전이에 의한 골 손상， 암세포의 골전이에 의한 골 용해， 섬유성 골이형성증， 무형성 골 질환, 대사성 골 질환， 류마티스 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염 및 디스크 등을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 골 관련 질환은 골다공증， 골연화증， 대사성 골 질환, 류마티스 관절염， 골관절염 또는 퇴행성 관절염이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 골 질환은 골다공증 또는 골연화증이다. 본 발명의 상술한 질환들의 예방， 개선 또는 치료용 조성물은 상술한 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하기 때문에, 상기 재조합 단백질과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다. 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 재조합 단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 재조합 단백질의 효능 또는 활성을 달성하는 데 층분한 양을 의미한다 .
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우， 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서 , 락토스, 덱스트로스, 수크로스， 솔비를， 만니를 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슴， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피를리돈, 셀를로스， 물， 시럽, 메틸 셀를로스ᅳ 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드톡시벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다ᅳ 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제, 감미제， 향미제, 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 점막, 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며， 본 발명의 일 구현예에 따르면， 점막 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식, 환자의 연령， 체중, 성， 병적 상태， 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 rag/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제, 산제, 분말제, 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 재조합 단백질의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식품학적 조성물이다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 재조합 단백질뿐만 아니라， 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물， 지방， 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드， 예를 들어 말토스， 슈크로스, 을리고당 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 텍스트린， 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대， 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 물레나물 추출물 이외에 구연산, 액상과당， 설탕， 포도당， 초산， 사과산， 과즙， 두층 추출액， 대추 추출액， 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 화장료 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 재조합 단백질 뿐만 아니라， 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민， 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 상기 담체로서， 정제수， 일가 알코을류 (에탄올 또는 프로필 알코올)， 다가 알코올류 (글리세를, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜)， 고급 지방산류 (팔미틸산 또는 리놀렌산)， 유지류 (소맥 배아유, 동백기름， 호호바유 을리브유， 스쿠알렌， 해바라기유, 마카데미아땅콩유， 아보가드유, 대두 수첨가 레시틴 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 필요에 따라 계면활성제， 살균제, 산화방지제, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제를 첨가할 수 있다.
계면활성제는 폴리옥시에틸렌， 경화 피마자유， 폴리옥시에틸렌， 올레일에테르， 모노올레인산폴리옥시에틸렌， 폴리옥시에틸렌， 글리세릴모노스테아레이트， 모노스테아린산소르비탄, 모노을레인산폴리옥시에틸렌 , 소르비탄, 자당지방산에스테르， 모노라우린산핵사글리세린, 폴리옥시에틸렌 환원라놀린, P0E, 글리세릴피로글루타민산， 이소스테아린산, 디에스테르， N-아세틸글루타민 및 이소스테아릴에스테르로 이루어진 군에서 선택적으로 포함할 수 있다. 살균제는 히녹티올, 트리크로산， 크를핵시딘글루콘산염, 페녹시에탄을, 레조르신， 이소프로필메틸페놀， 아즐렌 (azulene), 살리실산 및 징크피리타온으로 이루어진 군에서 선택적으로 포함할 수 있다.
산화방지제는 부틸히드록시아니솔， 몰식자산, 몰식자산프로필 및 에리소르빈산 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.
자외선 흡수제는 디히드록시벤조페논 둥의 벤조페논류， 멜라닌 파라아미노벤조산에틸, 파라디메틸아미노벤조산 2-에틸핵실에스테르， 시녹사이트， 파라메록시계피산 2-에틸핵실에스테르, 2-(2-히드록시 -5- 메틸페닐) 벤조트리아졸, 우로카닌산 및 금속산화물 미립자 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.
소염제로는 글리틸리틴산디칼륨 또는 알란토인을 사용할 수 있고， 청량제로는 고추틴크 또는 1-멘를을 사용할 수 있다.
상기 조성물의 제형은 재조합 단백질을 유효 성분으로서 배합할 수 있는 임의의 제형으로서 탈모방지 화장품의 형태로는 헤어토닉, 헤어크림， 헤어로션， 헤어샴푸， 헤어린스， 헤어컨디셔너， 헤어스프레이， 헤어에어졸, 포마드, 분말ᅳ 젤 둥과 같이 용액， 솔젤, 에멀견, 오일, 왁스, 에어졸 등 다양한 형태로 제조될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 조성물을 객체 (subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 노화 예방， 개선 또는 치료방법올 제공한다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus)의 편모 구성성분인 플라젤린과 병원체의 단백질 항원을 융합시킨 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 본 발명의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환， 모발 관련 질환， 안 질환, 장 질환 또는 골 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명은 본 발명의 재조합 단백질을 이용하여 노화에 따라 발생하는 외적, 내적인 기능을 개선하고 면역을 강화시킬 수 있는 이점이 있다.
(d) 본 발명은 본 발명의 조성물의 점막 투여를 통하여 손쉽게 면역을 할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 전반적인 노화마우스에 면역을 하는 실험계획 및 실험 방법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 FlaB-PspA 재조합 단백의 면역에 따른 노화마우스에서의 먹이 섭취량 및 몸무게 변화의 측정 결과 그래프를 나타낸다.
도 3은 지속적인 항원의 면역을 통해 노화마우스의 형태학적 변화 결과를 나타낸다.
도 4는 지속적인 면역에 의한 노화마우스에서의 IgA 반웅 그래프를 나타낸다.
도 5는 FlaB-PspA 재조합 단백 면역에 의한 노화마우스의 피부 조직학적 변화에 대한 조직 ·병리학적 소견을 나타낸다 .
도 6는 FlaB-PspA 재조합 단백에 의한 노화마우스의 골수세포에서의 조혈모세포의 변화를 나타낸다.
도 7은 FlaB-PspA 재조합 단백 면역에 의한 노화마우스의 림프계 변화를 보여주는 기관을 나타낸다.
도 8은 FlaB-PspA 재조합 단백에 의한 노화마우스의 골밀도 변화를 나타낸다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험방법 및 실험재료
정제 분리된 단백과 재조합 단백을 가지고 노화마우스 (C57BL/6J, 23개월 이상) 비강 내 (Intranasal)로 단백을 2주 간격으로 지속적으로 면역을 하였다. PspA 단백 및 FlaB-PspA 재조합 단백은 전남대학교 임상백신개발사업단 이준행 교수님 연구실에서 구입하였다.
모든 면역실험은 SPF(Specific Pathogen Free)시설에서 시행하였다. 대조군은 젊은 마우스 (8-10주령)를 사용하였고, 면역 실험군은 면역을 하지 않은 노화마우스 군, PBSCL6 마우스)로 2주 간격으로 8차례 이상 노화마우스 비강내로 면역한 군， PspA(2.5 ； «g/16/«/마우스) 단백으로만 2주 간격으로 8차례 이상 노화마우스 비강내로 면역한 군 및 FlaB-PspA(6.5 «g/16^/마우스) 재조합 단백으로 2주 간격으로 8차례 이상 노화마우스 비강 내로 면역한 군을 사용하였다.
지속적으로 면역을 하는 동안 노화마우스의 형태 및 행동변화를 관찰하였다.
면역을 시작하고 난 후부터， 매주 마우스의 몸무게와 먹이 섭취량 등을 측정하는데 면역에 따른 변화를 정확히 측정하기 위해서 각 마우스들을 한 마리씩 따로 관리를 하였다. 그리고 한 마리당 먹이를 50 g씩 준 후 일주일 간격으로 먹고 남은 먹이양을 정확히 측정하였다. 또한 매주 동물용 저울을 이용하여 각 마우스의 몸무게를 정확히 측정하였다. 면역에 따른 노화마우스의 형태적 변화를 비교하기 위해 매주 마우스의 외관상 즉， 털 상태와 탈모 및 탈색을 관찰하고 항문이나 눈 또한 지속적으로 관찰하여 변화된 양상올 수집하였다.
그리고 면역에 의한 노화마우스의 행동변화를 비교하기 위해 면역하는 동안 일부 시점에서 마우스의 ᅳ행동변화를 관찰하였다. 이를 위해서 마우스의 행동능을 확인하기 위해 각 군의 노화마우스를 한정된 공간에 두어 일정시간 동안 마우스 움직임올 관찰하였다. 이 움직임을 일반적으로 마우스의 행동능의 표준항목인 움직임, 뒷다리로 일어서는 횟수， 그리고 앞다리롤 이용한 지탱 횟수 및 코 만지기 횟수를 기준으로 비교를 하였다.
지속적으로 면역을 하는 중간 시점에서 면역 횟수에 따라 면역반웅의 변화를 확인하기 위해서 일부 마우스에서 혈액 및 변을 채취를 한 후, 항체 생성의 변화를 효소면역정량법 (ELISA: enzyme- linked immunosorbent assay)으로 측정을 하였다.
적정기간 동안 면역을 한 후， 일괄적으로 마우스들에서 여러 시료를 채취한 다음 다양한 실험방법을 통해서 면역에 의한 노화마우스의 전체적인 변화를 측정하였다.
지속적인 면역에 따른 노화마우스에서 면역반웅의 변화를 확인하기 위해 마우스에서 혈청 및 여러 가지 점막 시료 (변， 침 및 질 세척액 등)올 ' 채취하여 점막 면역 반웅 (mucosal i議 une response)올 비교하기 위해 분비형 면역 글로블린 A(secretory IgA, slgA) 항체 생성의 변화를 ELISA 방법으로 측정하였다.
면역에 의한 노화마우스의 형태변화를 비교하기 위해 피부조직올 비롯한 다양한 ^직을 채취하여 포르말린 (formalin)에 고정을 한 다음 파라핀 블록 (paraffin-block)을 만든 후， 헤마록시린 및 에오신 (H&E: Hematoxylin and Eosin) 염색을 통해서 조직ᅳ병리학적 소견을 비교하였다. 그리고 점막 면역을 통한 면역의 효과와 먹이 섭취량과 관련해서 점막 면역에서 크게 차지하고 있는 소장과 대장의 조직올 H&E 염색을 하여 조직 ·병리학적 소견올 비교 관찰하였다.
면역관련 조직에서 림프구 (lymphocytes) 세포를 분리하여 항원에 의한 세포성 면역반웅을 비교하기 위해， 목 림프절 (cervical lymph node) 및 비장 (spleen)에서 림프구 분리하여 항원에 의한 세포성 면역반응을 ELISA방법으로 비교하였다. 또한 골수에서 세포를 분리하여 다양한 골수세포의 변화양상을 비교 관찰하기 위해， 노화마우스 뒷다리의 뼈에서 골수 (bone marrow)세포를 분리하여 유세포분석기 (FACS: Flow cytometry, Beckman Coulter)를 이용하여 비교하였다. 특히， T 세포의 분화에 중요하게 관련되어 있는 조혈모세포 (hematopoietic stem eel Is)빈도를 조혈모세포 표지자인 CD34를 이용하여 면역염색 (immunostain)을 통해서 비교 관찰하였다.
마우스의 척추를 분리하여 면역에 의한 노화마우스의 골밀도의 변화 비교하기 위해， 마우스 척추를 적출한 다음 소동물 컴퓨터 단증촬영기 (microCT: Micro Computer Tomography) Skyscan 1172(Micro Photonics Inc. , 미국)을 이용하여 지속적인 면역에 따른 노화마우스의 골밀도 (BMD: Bone Mineral Density)와 노화에 따른 척주후만증 (Kyphosis)을 비교 관찰하였다.
그 다음으로 현재 진행 중인 연구로， 지속적인 면역을 통해서 변화되어 있는 노화마우스의 형태 및 행동 변화를 대사와 관련하여 비교 확인하였다. 이를 위해 노호마우스에서 혈액을 채취한 한 후, 혈청 또는 혈장을 분리한 다음 호르몬 관련 대사관련 유전자의 변화를 비교하였다. 그리고 면역에 의한 점막면역의 변화를 비교 관찰하기 위해 장관련 미세환경을 정상 세균총 (microbiota) 이용하여 비교 관찰하였다. 또한 항원으로 지속적인 면역을 한 노화마우스의 혈액 및 변을 채취한 다음 미세배열 (microarray)과 같은 고급 분석방법을 통해서 유전자 발현양상을 비교 관찰하였다. 실험결과
실시예 1: 플라젤린 -PspA 재조합 단백의 면역에 따른 노화마우스에서의 먹이 섭취량 및 몸무게 변화
노화마우스의 비강 내로 2주 간격으로 8차례 면역올 하는 동안 매주 각 군의 마우스들의 몸무게와 먹이 섭취량을 측정하였고 면역을 하지 않은 노화마우스를 대조군으로 하였다.
노화마우스의 비강내로 PBS(phosphate buffered saline), 제조된 2.5 Hg PspA 및 6.5 ug FlaB-PspA 재조합 단백을 2주일 간격으로 8차례 면멱을 시켰고, 매주 각 군들의 마우스들에 각각 면역을 시켰고, 매주 각 군들의 마우스들의 무게와 먹이 섭취량을 측정올 하였다. 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
몸무게를 측정한 결과, 면역올 하지 않은 마우스군， PBS로 면역한 군 PspA 단독 및 FlaB-PspA 재조합 단백을 가지고 면역한 군에서 모두 면역에 따른 마우스의 몸무게의 변화가 없는 것으로 확인되었다 (도 2a).
면역에 의한 노화마우스의 먹이 섭취량을 비교한 결과， 면역을 하지 않은 마우스 군에서는 시간에 따른 먹이 섭취량은 큰 차이를 보이지 않았고 PBS만으로 면역을 한 군도 마찬가지로 2주 간격으로 8회 걸쳐 면역을 하여도 먹이 섭취량에는 큰 차이가 없었다. 반면에, PspA 단독 처리한 군에서는 지속적인 면역을 하는 동안 먹이 섭취량이 점차적으로 증가되는 것을 확인하였고， 특히 FlaB-PspA 재조합 단백으로 면역을 한 군에서는 지속적인 면역에 의해 먹이 섭취량이 증가됐는데 그 증가율은 PspA 단독 처리한 군보다 현저하게 증가되는 결과를 보였다 (도 2b).
실시예 1의 결과에서 알 수 있듯이， 항원으로 계속적으로 노화마우스에 면역을 하면 몸무게의 변화에는 큰 변화가 없지만 먹이 섭취량이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 특히， 백신 보조제와 병원체의 항원을 융합시킨 재조합 단백으로 면역을 하면 먹이 섭취량이 현저하게 증가되는 것을 알 수 있었다. 실시예 2: 지속적인 항원의 면역을 통한마우스 형태학적 변화 관찰
지속적으로 노화마우스의 비강내로 2주 간격으로 8차례 면역을 하는 동안 면역에 의한 노화마우스의 형태적 변화를 매주 확인하여 그 결과를 도 3에 나타내었고， 면역을 하지 않은 노화마우스를 대조군으로 하였다.
면역을 시작하기 전의 노화마우스는 외관상 이상소견이 없었다. 털의 상태 및 윤기 탈색 및 탈모， 항문에서의 이상소견 (대장염 또는 탈장) 및 눈에서의 이상소견 (백내장)들이 전혀 확인되지 않았다.
그러나 면역을 시작하고 계속적으로 노화마우스를 관찰한 결과, 전혀 면역을 하지 않은 노화마우스 군에서는 2주 간격으로 8차례 면역을 하는 군에 비해서 털의 상태가 매우 안 좋아지는 것을 확인하였고 탈색이나 탈모 등이 심하게 진행되는 등 전반적으로 외관상의 형태가 나빠지는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라， 항문에서 탈장과 같은 이상소견이 심하게 나타났으며 양쪽 눈에서도 백내장 소견으로 의심되는 이상소견이 심한 것으로 확인됐다 (으대조군). PBS로 면역한 군에서도 마찬가지로 털의 상태가 좋지 않았고 탈색 및 탈모가 심해지는 등 외관상 상태가 심하게 좋지 않았다. 또한 항문에서 약간의 대장염 또는 탈장 소견이 보였고 한쪽 눈에서 백내장으로 의심되는 소견이 심하게 관찰되었다 (0-PBS).
반면에 PspA을 가지고 8차례 면역을 한 결과， 노화마우스의 외관상 형태가 약간의 탈색은 보였으나 털의 상태가 많이 바빠지지 않았고 항문이나 눈에서 이상소견을 관찰하지 못했다 (0-PspA). 특히 FlaB-PspA 재조합 단백을 가지고 면역을 한 군에서는 노화마우스의 털 상태가 면역을 하기 전의 노화마우스와 매우 유사할 정도로 상태가 좋은 것을 확인할 수 있었고 항문이나 눈에서 전혀 이상소견을 관찰할 수 없었다 (O-FlaB-PspA).
실시예 2의 결과로 알 수 있듯이， 지속적인 면역을 통해서 노화마우스의 외관상 형태가 많이 좋아지는 것을 확인할 수 있었다. 노화가 되면 탈색이나 탈모의 진행이 심해지고 눈에서 백내장 같은 이상소견이 발생하는 것이 일반적인 현상이다. 설치류 동물에서는 근육량의 감소로 인해 항문에서 탈장과 같은 이상소견이 보이는데, 항원으로 지속적인 면역을 하면 이러한 현상이 잘 발생이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 특히， 백신보조제와 병원체의 항원을 융합시킨 재조합 단백을 면역한 군에서는 노화마우스의 외관형태가 시간이 지나도 그대로 유지되거나 상태가 좋아지는 것을 알 수 있었다. 실시예 3: 지속적인 항원 면역에 의환 노화마우스의 IgA반웅 변화
지속적으로 면역을 하는 동안 각 군에서 마우스의 변을 매 면역을 한 후 채취하여 면역에 따른 노화마우스의 IgA 반웅을 ELISA 방법으로 확인을 하여 그 결과를 도 4에 나타내었고， 면역올 하지 않은 노화마우스를 대조군으로 하였다.
면역을 하지 않은 노화마우스에서는 면역을 하는 동안 IgA 반웅에는 큰 차이가 없었다 (0-대조군). PBS로만 면역을 한 군에서는 큰 차이가 없다가 6회 면역을 하고 난 후부터 약간 반웅이 증가되었으나 큰 차이는 없는 것으로 확인하였다 (0-PBS). PspA 단독 처리한 군에서는 4회 면역을 한 후부터 IgA반웅이 나타나다가 그 뒤로는 큰 차이를 보이지 않았다 (0- PspA) . 반면에， FlaB-PspA 재조합 단백으로 면역한 군에서는 면역 횟수에 따라서 IgA 반웅이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다 (O-FlaB-PspA).
실시예 3 결과로 알 수 있듯이， 지속적인 면역을 통해서 노화마우스의 점막면역반웅에 대해 IgA 반웅을 확인한 결과， 다른 군에서는 IgA 반웅이 면역에 따라 큰 차이가 없거나 약간의 반웅이 보이는 반면에 FlaB-PspA 재조합 단백으로 면역을 한 군에서는 면역에 따라서 IgA 반응이 현저하게 증가되는 것으로 확인되었다. 이 결과로 비추어보면， 재조합 단백에 의해 노화마우스의 점막면역이 활성화 되는 것으로 생각할 수 있다. 실시예 4: 재조합 단백 면역에 의한 노화마우스의 피부 조직학적 변화
실시예 2 결과에서 항원， 특히 재조합 단백으로 지속적으로 면역을 한 군에서 노화마우스의 털 상태가 매우 양호해지는 것을 관찰한 결과， 이를 더 자세히 증명하고자 H&E 염색을 통해서 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었고， 젊은 마우스를 대조군으로 하였다.
노화마우스의 등쪽 피부조직을 채취를 하여 H&E 염색을 통해서 확인한 결과， 노화가 되면 탈모가 진행이 되고 진피층 (dermis layer)이 얇아지는 것이 일반적인 현상이다. 젊은 마우스에서는 진피층이 두껍고 털이 나고 자라는 곳， 즉 모낭 (hair follicle)수가 진피층에 많이 존재하는 것을 확인할 수 있다 (Y-대조군). 반면에 노화마우스에서는 진피층이 얇아지고 모낭수가 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있다 (0-대조군). 이 노화마우스에 항원 (0-PspA) 그리고 재조합 단백 (0-FlaB-PspA)을 가지고 지속적으로 면역을 하면 진피층도 두꺼워지고 모낭수가 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히， FlaB-PspA 재조합 단백으로 면역한 군에서는 모낭수가 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4의 결과로 알 수 있듯이 지속적인 항원으로 면역을 하면 노화 마우스의 형태적 소견이 호전이 되는 것을 (실시예 2 결과) 조직학적 분석을 통해서 확인을 하였다. 실시예 2결과에서 보여지는 노화마우스의 탈색 및 탈모의 진행이 호전되는 것이 지속적인 면역에 의해 노화마우스에 모낭아 유지되는 것을 조직학적 분석방법으로 확인할 수 있었다. 이 결과로 비추어보면， 지속적으로 재조합 단백을 가지고 면역을 하면 노화가 되면서 발생하는 탈색 및 탈모의 진행을 더디게 하거나 방지를 한다고 생각할 수 있다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 실시예 5: 재조합 단백 면역에 의한 골수에서의 조혈세포의 변화
지속적인 면역에 의한 노화마우스의 골수에서 골수세포의 변화를 확인하여 그 결과를 도 6에 나타내었고， 면역을 하지 않는 노화마우스를 대조군으로 하였다.
노화마우스 골수에서 세포를 분리하여 골수세포의 변화를 관찰한 결과, 세포층실도 (cellularity)에서는 각 군간의 차이는 없었다.
골수세포 (megakaryocyte, myeloid 및 erythroid lineages) 비율을 확인한 결과， 전반적으로 노화마우스에서 골수 세포들이 잘 유지되고 분화되고 있음을 확인하였다.
그리고 조혈모세포의 빈도를 확인하기 위해 조혈모세포 표지자인
CD34을 가지고 면역염색을 통해 확인한 결과， 노화마우스에서 FlaB-PspA 재조합 단백을 지속적으로 면역을 하면 CD34가 다른 군에 비해서 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5의 결과로 알 수 있듯이， 재조합 단백으로 자속적인 면역을 하면 노화마우스에서 단순 외관상 형태만 변화되는 것이 아니라 면역관련에서도 그 효과가 관련이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 6: 재조합 단백 면역에 의한 림프계 기관의 변화
적정기간 동안 지속적으로 면역을 한 후， 각 군의 마우스에서 기관들을 적출하여 형태 및 무게를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었고， 젊은 마우스를 대조군으로 하였다.
노화마우스에서 전체적으로 조직을 적출한 다음 기관형태 변화 및 무게를 측정한 결과， 다른 기관에 비해서 림프계관련 기관에서 지속적인 면역에 의해 차이를 볼 수 있었다. 특히， FiaB— PSPA 재조합 단백으로 면역을 한 군에서 젊은 마우스 기관의 형태 및 무게와 매우 유사한 것으로 확인하였다. 나이가 들어감에 따라 흉선 (thymus)은 퇴화가 되는 것이 일반적인 현상인데 노화마우스에 항원으로 지속적으로 면역을 한 군에서 흉선의 무게가 증가되는 것을 확인하였고， 특히 FlaB-PspA 재조합 단백을 가지고 면역을 한 군에서는 그 무게가 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 전신성 염증반웅에서 많이 사용하고 있는 창자간막림프절 (MLN: mesenteric lymphnode)이나 비장 (spleen)은 노화가 진행됨에 따라 지속적인 감염으로 대부분이 그 형태가 매우 비대해지는데, 노화마우스에 FlaB— PspA 재조합 단백으로 계속적으로 면역을 하면 흉선의 무게가 다른 군에 비해 더 나가는 것을 확인할 수 있었고 비장에서도 다른 군의 노화 마우스의 비장에 비해서 무게가 덜 나가고 형태적으로도 젊은 마우스의 비장과 비슷한 형태를 보이는 것으로 확인되었다.
실시예 6의 결과로 알 수 있듯이 , 지속적인 항원으로 노화마우스에 면역을 하면 면역관련 기관의 형태적인 특징이 호전되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, FlaB-PspA 재조합 단백을 면역한 노화마우스는 그 형태적인 특징이 젊은 마우스의 기관과 매우 유사한 형태적 소견이 관측이 되었다. ' 실시예 7. 재조합 단백 면역에 의한 노화마우스의 골밀도의 변화
노화마우스에서 척추를 적출하여 소동물 컴퓨터 단층촬영기 (microCT)을 이용하여 재조합 단백으로 면역올 통한 노화마우스의 골밀도 변화를 측정을 하여 그 결과를 도 8에 나타내었고， 젊은 마우스를 대조군으로 하였다.
지속적으로 8차례 면역을 한 후， 노화마우스 척추를 적출한 후 microCT를 이용하여 면역에 의한 골밀도 변화를 측정한 결과， 재조합 단백을 가지고 면역한 군에서 골밀도가 상당히 좋아져있다는 것을 확인할 수 있다. 이는 실시예 1과 관련해서 설명을 하자면， 면역 횟수에 따라 몸무게는 변화가 없고 먹이 섭취량이 재조합 단백을 가지고 면역한 군에서만 증가된 결과는 노화마우스의 운동량과 관련이 있다고 생각되고 이에 대한 골밀도 또한 다른 노화 마우스군에 비해서 재조합 단백으로 지속적인 면역한 군에서 현저하게 증가되었다고 같이 설명할 수 있다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus)의 편모 구성성분인 플라젤린과 병원체의 단백질 항원을 융합시킨 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 플라젤린은 패혈증 비브리오균의 플라젤린인 FlaB인 것을 특징으로 하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 병원체의 단백질 항원은 폐렴구균의 표면 단백질 A(PspA)인 것을 특징으로 하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열목록 제 1서열의 아미노산 서열을 갖는 FlaB-PspA 단백질인 것을 특징으로 하는 노화 예방， 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 5】
제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 재조합 단백질은 면역올 강화시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
상기 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 7】
상기 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 효성분으로 포함하는 모발 관련 질환의 예방， 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 8】
상기 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 안 (eye) 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 9】
상기 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방， 개선 또는 치료용 조성물.
【청구항 10】 '
상기 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방， 개선 또는 치료용 조성물. 【청구항 11】
상기 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체 (subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 노화 예방， 개선 또는 치료방법.
PCT/KR2013/002547 2012-11-30 2013-03-27 패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체 항원 단백질의 융합 재조합 단백질을 포함하는 노화 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2014084456A1 (ko)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11254714B2 (en) 2012-11-30 2022-02-22 Medispan Co., Ltd. Method for inhibiting, improving, or preventing aging using recombinant fusion protein of pathogenic antigen protein and flagellin of Vibrio vulnificus
WO2022086190A1 (ko) * 2020-10-20 2022-04-28 주식회사 메디스팬 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009248945B2 (en) 2008-05-23 2014-02-13 Siwa Corporation Methods, compositions and apparatuses for facilitating regeneration
US10358502B2 (en) 2014-12-18 2019-07-23 Siwa Corporation Product and method for treating sarcopenia
US9993535B2 (en) 2014-12-18 2018-06-12 Siwa Corporation Method and composition for treating sarcopenia
WO2017143073A1 (en) 2016-02-19 2017-08-24 Siwa Corporation Method and composition for treating cancer, killing metastatic cancer cells and preventing cancer metastasis using antibody to advanced glycation end products (age)
WO2018191718A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Siwa Corporation Humanized monoclonal advanced glycation end-product antibody
CA3057829A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Siwa Corporation Anti-age antibodies for treating neurodegenerative disorders
US11518801B1 (en) 2017-12-22 2022-12-06 Siwa Corporation Methods and compositions for treating diabetes and diabetic complications
JP2021522271A (ja) * 2018-04-24 2021-08-30 ゲノム プロテクション，インコーポレイテッド 虚弱および加齢を改善するための方法
WO2021247397A2 (en) * 2020-06-04 2021-12-09 Siwa Corporation Methods and compositions for enhancing the immune system

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060118737A (ko) * 2005-05-17 2006-11-24 프로셀주식회사 플라젤린을 포함하는 천식 및 알레르기 질환 면역치료제
KR100795839B1 (ko) * 2004-01-12 2008-01-17 전남대학교산학협력단 세균의 편모 구성인자 플라젤린을 유효성분으로 함유하는점막 백신 보조제
KR101130884B1 (ko) * 2009-04-16 2012-04-12 전남대학교산학협력단 패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체의 항원 단백질을 융합시켜 제조한 재조합 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 점막 투여용 백신

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050073865A (ko) * 2004-01-12 2005-07-18 대한민국(전남대학교총장) 비브리오 패혈증균 편모 구성인자 플라젤린을유효성분으로 함유하는 백신 보조제
WO2007098371A2 (en) * 2006-02-16 2007-08-30 Wayne State University Use of flagellin to prevent and treat gram negative bacterial infection
WO2007103048A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100795839B1 (ko) * 2004-01-12 2008-01-17 전남대학교산학협력단 세균의 편모 구성인자 플라젤린을 유효성분으로 함유하는점막 백신 보조제
KR20060118737A (ko) * 2005-05-17 2006-11-24 프로셀주식회사 플라젤린을 포함하는 천식 및 알레르기 질환 면역치료제
KR101130884B1 (ko) * 2009-04-16 2012-04-12 전남대학교산학협력단 패혈증 비브리오균의 플라젤린과 병원체의 항원 단백질을 융합시켜 제조한 재조합 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 점막 투여용 백신

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, SHEE EUN ET AL.: "A bacterial flagellin, vibrio vulnificus FlaB, has a strong mucosal adjuvant activity to induce protective immunity", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 74, no. 1, January 2006 (2006-01-01), pages 694 - 702 *
NGUYEN, CHUNG TRUONG ET AL.: "Intranasal immunization with recombinant PspA fused with a flagellin enhances cross-protective immunity against streptococcus", VACCINE, vol. 29, no. 34, 13 June 2011 (2011-06-13), pages 5731 - 5739 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11254714B2 (en) 2012-11-30 2022-02-22 Medispan Co., Ltd. Method for inhibiting, improving, or preventing aging using recombinant fusion protein of pathogenic antigen protein and flagellin of Vibrio vulnificus
WO2022086190A1 (ko) * 2020-10-20 2022-04-28 주식회사 메디스팬 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도

Also Published As

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