KR100795839B1

KR100795839B1 - 세균의 편모 구성인자 플라젤린을 유효성분으로 함유하는점막 백신 보조제

Info

Publication number: KR100795839B1
Application number: KR1020067009082A
Authority: KR
Inventors: 이준행; 이시은; 김수영
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2004-01-12
Filing date: 2005-01-12
Publication date: 2008-01-17
Also published as: KR20070017300A

Abstract

본 발명은 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnficus), 살모넬라균(Salmonella typhimurium) 및 리스테리아균(Listeria monocytogenes)에서 유래된 세균의 편모구성인자 플라젤린을 유효성분으로 함유하는 점막 백신 보조제(vaccine adjuvant)에 관한 것이다.

Description

세균의 편모 구성인자 플라젤린을 유효성분으로 함유하는 점막 백신 보조제{MUCOSAL VACCINE ADJUVANTS CONTAINING BACTERIAL FLAGELLINS AS AN ACTIVE COMPONENT}

비브리오 패혈증균(Vibrio vulnficus) 감염증은 역사가 비교적 짧으나 전세계적으로 임상증례가 계속 보고 되고 있으며 새로이 주목받고 있는 질환 중의 하나이다. 비록 전세계적으로 절대적인 발병례는 콜레라나 살모넬라 식중독보다 적지만 높은 치명율과 비극적인 임상증상 때문에 심각한 사회적 문제를 야기하고 있다.

비브리오 패혈증균은 1976년 미국 질병통제센터(Centers for Disease Control;이하 CDC로 약함)의 홀리스(Hollis) 등이 11년 동안 사람에서 분리된 호염성, 병원성 비브리오 균의 세균학적 성상을 처음 보고한 이후, 유당(lactose)을 분해하는 특징 때문에 유당 분해 비브리오(lactose-fermenting Vibrio 또는 Lac(+))라 명명되었다. 1979년 CDC의 블레이크(Blake) 등은 CDC에 보고된 39명의 환자들 자료를 역학적으로 분석하여 임상증상에 따라 원발성 패혈증(primary septicemia)군과 창상감염(wound infection)군으로 분류하였다(Blake, P.A., Merson, M.H., Weaver, R.E., Hollis, D.G., Heublein, P.C., N. Engl. J. Med. 300:1-6, 1979). 같은 해 파머(Farmer)는 새로운 종으로서 Vibrio Vulnificus(vulnus=wound, ficus=forming)라 명명하였으며, 오늘에 이르고 있다(Farmer, J.J. Ⅲ, Lancet 2:903, 1979).

병원성 세균 및 바이러스의 침입에 의한 감염은 흡입, 구강 섭취, 성적 접촉 등을 통하여 대부분 점막 루트(mucosal route)로 진행된다. 성인의 경우 호흡기, 소화기 및 비뇨기계를 포함하여 점막 표면(mucosal surface)으로 뒤덮여 있는 조직의 단면적을 계산하면 약 400m² 정도이며 이는 테니스 코트 면적의 1.5배에 해당한다. 상주 세균총 및 외부에서 유래한 바이러스, 세균 등의 침입에 대하여 1차 방어 시스템은 주로 점막 면역반응(mucosal immune response)이 관여한다. 점막표면에서 주로 유발되는 점막 면역반응(mucosal immunity)은 전신 면역반응(sysiemic immunity)에 비교하여 심도 있는 연구가 진행되지는 않았지만 그 중요성은 의심의 여지가 없다고 할 수 있다. 최근 일본 동경대학의 Kiyono교수 등에 의하여 이 분야의 연구가 활발히 진행되고 있다. 일반적으로 점막루트를 통해 면역할 경우 피내 혹은 피하 주사 등과 같은 전신 루트로 면역하는 경우에 비해 점막 면역반응이 더 효과적으로 유도된다고 알려져 있으며 점막면역반응은 주로 면역글로부린-A(IgA)에 의해서 매개된다.

백신을 점막 루트로 투여할 경우 전신 면역 반응(systemic immune response) 뿐만 아니라 '점막 면역 반응(mucosal immune response)'을 동시에 촉진할 수 있는 장점이 있다. 이러한 이유로 점막조직에서 효과적인 면역 반응을 유발할 수 있는 예방백신 개발에 대한 연구에 대한 관심이 증폭되고 있다. 그러나 대부분의 단백질 항원을 점막 루트로 투여할 경우 전신 투여 경로에 비해서 면역능(immunogenecity)이 감소되는 단점이 있다. 그러므로 점막 백신(mucosal vaccine) 개발에 있어서 가장 중요한 점은 백신 항원과 안전하게 같이 투여할 수 있는 효과적인 점막 백신보조제(mucosal adjuvant)의 개발이라고 할 수 있다.

백신보조제(adjuvant)의 가장 중요한 요건 중의 하나가 항원제공세포 표면의 공동자극 분자 발현 조절과 항원 특이적 T 세포의 유도로 인한 사이토카인 분비조절과 같은 면역조절기능을 가지고 있는 것이다. 현재 백신보조제로 사용되고 있거나 고려되고 있는 것으로는 수산화 알루미늄 젤 등과 같은 무기염(mineral salt), 계면활성 물질, 세균 유래 물질, 사이토카인, 호르몬, 폴리아니온(polyanion), 폴리아크릴(polyacryl), 담체(carrier) 및 바이러스를 이용한 리빙 벡터(living vector)및 광유(mineral oil) 또는 리포좀(liposome)과 같은 운반제(vehicle) 등이 있다. 이 중에서 현재 활발한 연구가 진행되고 있으며 크게 주목받고 있는 단백질 유래 점막 백신보조제로는 콜레라균(Vibrio cholerae)에서 유래한 콜레라독소(cholera toxin; CT)와 대장균 유래 이열성 독소(heat-labile toxin; LT)가 있다. 이들 백신보조제를 점막조직을 이용하여 투여하면(예, 경구 혹은 경비) 혈청 및 점막조직 중에서 항원 특이적 항체(antigen-specific antibody) 생산을 유도하며, 항 원제시세포 표면의 B7-2발현을 유도하여 T 세포의 보조-자극성 신호(co-stimulatory signaling)를 촉진한다는 사실이 보고되었다(Boyaka, P.N., Ohmura, M., Fujihashi, K., Koga, T., Yamamoto, M., Kweon, M.N., Takeda, Y., Jackson, R.J., Kiyono, H., Yuki, Y., McGhee, J.R.J. Immunol. 170:454-462, 2003; Kweon, M.N., Yamamoto, M., Watanabe, F., Tamura, S., Van Ginkel, F.W., Miyauchi, A., Takagi, H., Takeda, Y., Hamabata, T., Fujihashi, K., McGhee, J.R., Kiyono, H. J. Infect. Dis. 186:1261-1269, 2002). 그러나 이들은 장독성(enterotoxicity)이 높은 외독소이므로 사람에게 직접 응용하기가 부적절하여, 현재 세계적으로 독성을 줄이고 면역보조제 활성(adjuvaticity)을 높이는 방향으로 연구가 진행 중이다.

기술적 과제

이에 본 발명자들은 TLR-5의 작동제인 비브리오 패혈증균의 플라젤린이 상피세포로부터 인터루킨-8 생산을 자극하고, 사람 수지상 세포를 성숙(maturation)시키며, 테타누스 유독소와 혼합하여 마우스의 비강에 3차에 걸쳐 면역한 경우 테타누스 유독소에 반응하는 점막내 IgA 수치가 테타누스 유독소만을 투여한 그룹에 비해 현저히 증가하였으며, 치사량의 테타누스 독소로부터 마우스를 완벽하게 보호하는 사실을 발견하였다. 상기 플라젤린에 의한 효과는 비브리오 패혈증균의 플라젤린에만 국한되지 않고, 세균 한 마리 당 여러 개의 플라젤라를 가지고 있으며 운동성이 매우 활발한 그람음성균인 살모넬라균(Salmonella typhimurium) 및 그람양성균인 리스테리아균(Listeria monocytogenes)에서 유래한 플라젤린도 동일한 방어 면역 효과를 나타내는 것을 보고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세균의 편모구성인자인 플라젤린을 유효성분으로 함유하는 감염질환, 항암 및 피임 백신 등의 각종 유효백신 개발에 필요한 점막 백신보조제(Mucosal vaccine adjuvant)를 제공하는 것이다.

도 1은 비브리오 패혈증균의 플라젤린 유전자의 2가지 오페론 구조 중 locus 1을 보여준다.

도 2는 비브리오 패혈증균의 플라젤린 유전자의 2가지 오페론 구조 중 locus 2를 보여준다.

도 3은 1㎍, 5㎍ 및 15㎍의 재조합 FlaB를 테타누스 유독소와 혼합하여 마우스의 비강에 면역한 후 테타누스 독소를 투여한 결과 치사량의 테타누스 독소로부터 숙주를 완벽히 보호하는 것을 보여주는 결과이다.

도 4는 1㎍, 5㎍ 및 15㎍의 재조합 FlaB를 테타누스 유독소와 혼합하여 마우스의 비강에 면역한 후 마우스의 혈액 및 여러 가지 점막샘플을 채취하여 항원 특이적 면역 반응을 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.

도 5는 리스테리아균 FlaA, 비브리오 패혈증균 FlaB 및 살모넬라균 FliC를 테타누스 유독소와 혼합하여 마우스의 비강에 면역한 후 마우스의 혈액 샘플을 채취하여 항원 특이적 면역 반응을 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.

도 6은 재조합 FlaB를 상피세포에 처리하였을 때 상피세포로부터 농도 의존적으로 인터루킨-8이 분비되는 것을 보여준다.

도 7은 재조합 FlaB를 사람 TLR-5와 인터루킨-8 전사 리포터를 발현하는 세포 또는 TLR-5와 핵전사 인자 카파 B(Nuclear factor kappa B) 전사 리포터를 발현하는 세포에 처리하였을 때 인터루킨-8 및 핵전사 인자 카파 B의 전사활성을 보여준다.

도 8은 비브리오 패혈증균 편모구성인자인 6가지 플라젤린에 대한 글루타치온-S-트랜스퍼레이스 융합 단백을 사람 TLR-5와 인터루킨-8 전사 리포터를 발현하는 세포에 처리하였을 때 인터루킨-8의 전사활성을 보여준다.

도 9는 재조합 비브리오 패혈증균 FlaB 및 재조합 살모넬라균 FliC를 사람 수지상 세포에 처리하였을 때 수지상세포의 성숙을 유도하는 것을 보여준다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 발명자는 비브리오 패혈증균 플라젤린의 병인론적 의의를 확인하기 위하여 플라젤린 단백을 분리하여 마우스에 피하주사로 능동 면역시킨 후 방어 면역능을 확인하는 과정에서 플라젤린 단백을 피하 주사한 마우스의 피부조직에서 육아종성 병변(granulomatous lesion)이 형성되는 것을 관찰하였으며, 이 결과로 플라젤린이 백신보조제 효과도 나타낼 수 있음을 확인하였다.

세균의 운동성을 결정하는 중요 인자인 편모(flagella)는 크게 후크(hook), 기저체(basal body) 및 필라멘트(filament)로 구성되어 있다. 편모는 세균의 유영(swimming) 또는 유주 운동(swarming motility), 세균의 주성(taxis)을 결정하고, 바이오필름을 형성하여, 병원성 미생물의 부착능을 결정하는 기능이 있다고 알려져 있다(McCarter, L. L., Microbiol Mol Biol Rev. 65:445-62, 2001; Kim, Y. K., McCarter, L. L., J Bacteriol. 182:3693-704, 2000; McCarter, L. L., J Bacteriol. 177:1595-609, 1995; Boles, B. R., McCarter, L. L. J Bacteriol. 182:1035-45, 2000; Prouty, M. G., Correa, N, E., Klose, K. E. Mol Microbiol. 2001 Mar;39(6):1595-609, 2001). 비브리오 패혈증균은 한 개의 극성 편모(polar flagellum)를 가지고 있다(McCarter, L. L., Microbiol Mol Biol Rev. 65:445-62, 2001). 편모의 필라멘트를 구성하는 구성 단위 단백질을 플라젤린이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어(assembling) 필라멘트를 형성한다. 최근 연구 결과에 의하면 포유류 TLR-5(Toll-like receptor-5)가 그람 음성 및 그람 양성 세균의 플라젤린을 인지하여 NF-kB를 활성화시킨다는 것이 알려져 있다(Hayashi, F., Smith, K.D., Ozinsky, A., Hawn, T.R., Yi, E.C., Goodlett, D.R., Eng, J.K., Akira, S., Underhill, D.M., Aderem, A., Nature 410:1099-1103, 2001). TLR은 병원균과 관련된 분자 패턴(pathogen associated molecular pattern)을 인지하는 수용체로서 많은 감염체에 대항하는 첫 번째 선천적인 면역체계(innate immune system)의 주요구성인자로 작동하며, 효과적 적응성 면역 반응(adaptive immune response)의 자극에도 관여하는 세포 수용체이다(Akira, S., Hemmi, H., Immunol. Lett. 85:85-95, 2003). 따라서, TLR 작동제(agonist)들이 여러 가지 백신의 보조제 개발의 표적이 될 수 있다.

본 발명자들의 연구 결과에 의하면 비브리오 패혈증균의 편모를 구성하는 유전자는 DNA 서열번호 1 또는 아미노산 서열번호 2로 표시되는 flaA, DNA 서열번호 3 또는 아미노산 서열번호 4로 표시되는 flaB, DNA 서열번호 5 또는 아미노산 서열 번호 6으로 표시되는 flaF, DNA 서열번호 7 또는 아미노산 서열번호 8로 표시되는 flaC, DNA 서열번호 9 또는 아미노산 서열번호 10으로 표시되는 flaD 및 DNA 서열번호 11 또는 아미노산 서열번호 12로 표시되는 flaE로 구성되어 있으며, 각각의 유전자 구성은 Vibrio parahaemolyticus 균과 유사하며 상동성도 높다.

본 발명에 의한 세균의 편모(flagella) 구성인자인 플라젤린의 백신보조제 효과를 증명하는 과정은 다음과 같다:

1) 재조합 플라젤린을 제조, 분리하는 단계;

2) 재조합 플라젤린을 테타누스 유독소와 혼합하여 비강내 면역 후 항원 특이적 면역반응을 측정하는 단계;

3) 재조합 플라젤린을 테타누스 유독소와 혼합하여 비강내 면역 후 마우스에서 테타누스 독소에 대한 숙주 방어능력을 측정하는 단계;

4) 재조합 플라젤린이 상피세포로부터 인터루킨-8 생산 촉진을 확인하는 단계;

5) 재조합 플라젤린이 TLR-5와 결합하여 세포내 신호 전달 유도하는 것을 확인하는 단계; 및

6) 재조합 플라젤린이 사람 수지상 세포의 성숙 유도를 관찰하는 단계를 거친다.

따라서, 본 발명은 세균의 편모구성인자인 플라젤린을 유효성분으로 함유하는 백신보조제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 세균 플라젤린 구성 유전자 중 TLR-5와 결합하는데 관여하며 다양한 세균에서 비교적 보존되어 있는 염기 서열인 N-말단과 C-말단 사이에 존재하는 일부분의 염기 서열을 기타 면역 에피토프(immunogen epitope)를 인코딩하는 유전자로 치환하여, 플라젤린에 의해 유도된 보조활성(adjuva nticity)이 있는 재조합 면역원을 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 서열번호 1 내지 12의 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnifiucs)의 플라젤린 구성 유전자 중 1-191 아미노산에 해당하는 FlaA, 1-191 아미노산에 해당하는 FlaB, 1-191에 해당하는 FlaF, 1-191에 해당하는 FlaC, 1-191에 해당하는 FlaD, 1-189에 해당하는 FlaE 의 N-말단 부분; 및

277-376 아미노산에 해당하는 FlaA, 278-377 아미노산에 해당하는 FlaB, 278-377에 해당하는 FlaF, 285-385에 해당하는 FlaC, 278-377에 해당하는 FlaD, 276-375에 해당하는 FlaE의 C-말단 부분;

사이에 존재하는 부분의 염기 서열을 단백항원 에피토프를 인코딩하는 유전자로 치환하여, 플라젤린에 의해 유도되는 보조활성(adjuvanticity)을 가지는 재조합 면역원을 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 단백항원 에피토프를 인코딩하는 유전자로는 테타누스 유독소, 인플루엔자 바이러스 면역원성 에피토프, 폐렴쌍구균의 PspA(pneumococcal surface protein A) 및 정자(sperm)에 선택적인 항원 등을 인코딩하는 유전자를 들 수 있다.

본 발명에 의한 백신보조제는 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유 화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균 상태의, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태 등의 경구용 제형으로 제형화할 수도 있고, 피하주사, 정맥주사 또는 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수도 있다.

경구용 제형의 경우는 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 부형제(forming agent)를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산 가능한 가루 또는 입자, 유화액, 연질 또는 경질 캡슐, 시럽 및 일릭서와 같은 형태의 경구형 제형으로 제제화할 수 있으며, 이는 단위 투여량, 형태 등에 따라 알맞게 제조할 수 있다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 또는 무독성의 사용 가능한 희석제(diluent)나 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매로는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있으며, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 또는 현탁 용매로 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터 또는 폴리에틸렌글리콜 등과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.

본 발명에 의한 백신보조제의 구체적인 예로는 테타누스 등의 항독소 백신; 콜레라, 장티프스 등 생균 및 사균 백신; 인플루엔자, 사스(SARS) 등 항바이러스 백신; 자궁 경부암 등에 대한 항암 백신; 항정자 피임 백신; 및 단백질 또는 펩티 드 등의 재조합 백신에 대한 보조제를 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 비브리오 패혈증균의 플라젤린에만 국한되는 것이 아니며, 이와 유사한 플라젤린 유전자로 인코딩되는 플라젤린 단백질을 가지는 편모균들에서도 동일하게 적용할 수 있을 것이다.

발명의 실시를 위한 형태

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 균주 및 플라스미드의 특성은 하기 표 1에 정리하였다. 각각의 제조 방법과 자세한 특성은 해당 실시예 및 시험예에서 적시하였다.

표 1

＜각 균주의 배양 및 보관＞

하기 실시예 및 시험예에서 사용한 대장균, 살모넬라 균주 및 리스테리아 균주들은 LB(Luria Bertani) 배지(Difco Co.)에서, 비브리오 패혈증균은 HI(heart infusion) 배지(Difco Co.)에서 배양하였다. 상기 균주들을 배양한 후 글리세롤을 50%가 되도록 첨가하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.

[실시예 1] 트랜스포존 라이브러리(transposon library) 제조

V. vulnificus MO6-24/O 표준균주(미국 University of Maryland School of Medicine, Division of Hospital Epidemiology의 J. Glenn Morris로부터 획득)와 mini-Tn5 lacZ1을 포함하고 있는 E. coli SM10 λpir 균주(독일 Braunschweig 소재GBF-National Research Center for Biotechnology의 Kenneth N. Timmis로부터 획득)의 단일 집락을 10㎖의 2.5HI(2.5% NaCl heart infusion) 액체배지와 20㎖의 LB (암피실린 100㎍/㎖ 및 카나마이신 100㎍/㎖ 함유) 액체배지에 각각 접종하여 37℃, 210rpm에서 하룻밤 교반 배양하였다.

다음날 각각의 배양액을 원침한 후 항생제가 들어 있지 않은 새로운 LB 액체배지로 두 번 원심세척한 뒤 각각 100㎕의 새로운 LB 액체배지에 부유시켰다. 그리고 E. coli 와 V. vulnificus 균액을 서로 혼합하여 LB 한천배지 위에 떨어뜨렸다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후 LB 한천배지 상에 자란 세균집락에 새로운 2.5HI 액체배지 800㎕를 떨어뜨린 후 멸균된 유리봉을 이용하여 잘 긁어내었다. 이 균액을 1.5㎖ 플라스틱 시험관으로 옮긴 뒤 충분히 교반하여 균질하게 부유되도록 하였다. 이 균액을 카나마이신(kanamycin) 200㎍/㎖을 함유한 TCBS(thiosulfate citrate bile sucrose) 한천배지에 원액, 1/10, 1/100 희석액 100㎕씩을 각각 떨어뜨린 후 완전히 스며들도록 잘 도말한 뒤 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

다음날 TCBS 한천배지 상에 자란 비브리오 집락만을 이쑤시개를 이용하여 카나마이신 300㎍/㎖을 함유한 TCBS 한천배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 형성된 비브리오 집락을 200㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 100㎕의 2.5HI 액체배지가 담긴 96-웰 배양판의 각 웰에 접종하여 37℃에서 하룻밤 정체 배양하였다. 다음날 균이 자란 각 웰에 80㎕의 50% 글리세롤(in 2.5 HI)을 가한 뒤 -80℃ 초저온냉동기에 보관하다가 필요시 레플리카 플레이터(replica plater)를 사용하여 2.5HI 한천배지에 접종하여 배양한 후 각 실험에 사용하였다.

[실시예 2] 운동성 상실 트랜스포존 돌연변이 클론의 스크리닝

실시예 1에서 제조한 V. vulnificus MO6-24/O 균주의 트랜스포존 라이브러리 각 균주 클론들을 2.5HI 액체배지에서 하룻저녁 배양한 후 0.3% 한천 함유 반고형 HI(heart infusion) 한천배지에 멸균된 이쑤시개를 이용하여 균을 접종하고 약 6시간 동안 37℃에서 배양한 후 균이 증식하여 움직인 범위를 측정하여 운동성의 정도를 판단하였다.

몇 차례의 스크리닝 과정을 통하여 운동성이 거의 상실된 3개의 트랜스포존돌연변이 클론들을 선발하여 트랜스포존이 삽입된 돌연변이 유전자를 동정하는 실험을 진행하였다.

[실시예 3] 플라젤린 오페론 유전자의 동정

트랜스포존이 삽입된 주위 유전자들의 클로닝은 임의의(arbitrary) PCR법을 사용하여 증폭한 DNA 조각을 표지자로 사용하여 코스미드(cosmid) 유전체 라이브러 리를 스크리닝하여 실시하였다. 트랜스포존 삽입 주위 DNA 조각들의 증폭은 이단계(two-step) PCR 증폭 방법을 사용하였다. 첫 번째 PCR 반응에서는 서열번호 13의 임의의 프라이머 1(arbitrary primer 1;

5'-GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNACGCCC-3')와 서열번호 14의 mini-Tn5 lacZ1 특이 프라이머 1(specific primer 1; 5'-TTCTTCACGAGGCAGAC의 CTCAGCGC-3')을 사용하여, 94℃에서 30초간 변성, 30℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분 30초간 확장하는 조건으로 5 사이클 PCR 반응을 실시한 후 다시 94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 72℃에서 2분간 반응하는 PCR 반응을 30 사이클 실시하여 1차 PCR 반응을 실시하였다. 1차 PCR 반응산물을 주형으로 하여 2차 PCR 반응을 실시하였다. 2차 PCR 반응에서는 서열번호 15의 임의의 프라이머 2(5'-GGCCAAGAGTCGACTAGTCA-3')와 서열번호 16의 또다른 mini-Tn5 lacZ1특이 프라이머 2(5'-CCGCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3')를 이용하였으며,

94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분 30초간 확장하는 반응 조건으로 30 사이클 반응을 실시하였다. 이 PCR 산물을 아가로오스(agarose) 전기영동한 후 겔에서 증폭 DNA 부위를 분리하여 염기서열 결정에 사용하였다. 상기 임의의 PCR 결과 3가지의 특이적인 DNA 조각이 증폭되었다.

증폭 DNA 조각의 염기서열을 결정해 미국 국립생물정보센터(National Center for Biological Information)의 GenBank 데이터베이스에 수록되어 있는 유전자들과 BLAST 분석을 실시해본 결과, 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)의 bcr, cheR, flgG 유전자와 상동성(identity)을 나타내었다. 본 발명자들에 의해 완전 해 독한 비브리오 패혈증균 게놈 유전자 서열을 분석한 결과, 상기의 유전자들은 극성 편모 플라젤린 오페론에 위치하고 있었으며, 이를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

[실시예 4] 재조합 플라젤린의 제조 및 분리

비브리오 패혈증균 flaB 유전자, 살모넬라균의 fliC 유전자(서열번호 18) 및 리스테리아균의 flaA 유전자(서열번호 17)의 ORF을 함유하고 있는 DNA조각을 인테인(intein) 융합 발현 벡터인 pTYB12(New England Biolabs Inc.)에 클로닝하여 pCMM250, pCMM251, pCMM252, 각각의 플라스미드를 제조하였다. 각각의 플라스미드를 ER2566 대장균에 일렉트로포레이션 방법으로 넣어 주고 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필울-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)0.5mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴 비드 칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합 단백질로부터 FlaB, FliC 및 FlaA 단백질만을 분리 정제하였다. 분리된 FlaB, FliC 및 FlaA 단백질 중에 함유되어 있는 엔도톡신(endotoxin)은 AffinityPak^TM DetoxiGel^TM Endotoxin Removing gel(Pirece 사)을 이용하여 제거하여 사용하였다.

상기와 같은 방법으로 비브리오 패혈증균 flaA, flaB, flaF, flaC, flaD 및 flaE를 각 유전자의 ORF(open reading frame)을 pGEX4T-1 벡터에 클로닝하여 (pCMM244-flaB, pCMM245-flaA, pCMM246-flaC, pCMM247-flaD, pCMM248-flaE, pCMM249-flaF)제조사(Amersham Pharmacia)의 지침에 따라 글루타치온-S-트랜스퍼레이스 융합 단백질을 분리하였다.

[시험예 1] 재조합 플라젤린의 점막 면역 보조제(mucosal immune adjuvant) 효능 검사

SPF(specific pathogen free) 7주령 Balb/c 암컷 마우스의 비강내로 PBS(phosphate buffered saline), 3㎍ 테타누스 유독소 및 3㎍ 테타누스 유독소와 1㎍, 5㎍ 및 15㎍ 비브리오 패혈증균 FlaB 혼합물을 1주일 간격으로 3회에 걸쳐 면역시키고 마지막으로 면역한 날로부터 1주일 후에 마우스의 혈청, 침(saliva) 및 질세척액(vaginal wash)을 채취한 후 테타누스 유독소-특이적 전신 면역 반응(systemic immune response)과 점막 면역반응(mucosal immune response)을 ELISA(Enzyme linked immuno sorbant assay) 방법으로 측정하였고, 3회에 걸쳐 예방접종한 마우스에 최소 치사량의 200배에 해당하는 테타누스 독소를 전신으로 투여하여 7일 동안 마우스의 생존을 관찰하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3의 결과로 알 수 있듯이, PBS 만으로 면역한 대조군 마우스는 24시간 내에 100%가 사망하였고, 테타누스 유독소만을 비강으로 투여한 마우스(TT)에서는 약 17% 마우스만이 생존하였으나, 테타누스 유독소와 1㎍, 5㎍ 또는 15㎍의 비브리오 패혈증균 FlaB를 혼합 투여한 마우스(TT + Vv-FlaB)에서는 마우스가 100% 생존하였다. 테타누스 유독소만을 투여한 마우스의 경우 생존한 마우스도 전형적인 강직성 마비 현상을 보였지만 테타누스 유독소와 FlaB를 혼합 투여한 마우스의 경우 정상 마우스와 동일한 외형을 나타내었다.

또한 도 4에서 알 수 있듯이, PBS만을 투여한 대조군이나 테타누스 유독소만 을 투여한 마우스(TT)에서 보다 테타누스 유독소와 Vv-FlaB를 혼합 투여한 마우스(TT + Vv-FlaB)에서 항원 특이적 전신 면역 및 점액성 면역 반응이 높게 나타났다.

이상의 백신보조제 효과가 비브리오 패혈증 외에도 다른 편모균 유래 플라젤린에서도 나타나는 일반적인 현상인지의 여부를 확인하기 위하여, 세균 한 마리당 여러 개의 편모를 가지는 그람음성세균인 살모넬라균(Salmonella typhimurium)의 플라젤린 구성 성분인 FliC와 그람양성 세균인 리스테리아균(Listeria monocytogenes)의 플라젤린 구성 성분인 FlaA 재조합 단백질을 분리하여 동일한 실험을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 도 5에 나타내었다.

표 2

상기 표 2는 리스테리아균 FlaA, 비브리오 패혈증균 FlaB 및 살모넬라균 FliC를 테타누스 유독소와 혼합하여 마우스의 비강에 면역한 후 테타누스 독소를 투여한 결과이며, 상기 세균의 플라젤린 구성 단백질들이 치사량의 테타누스 독소로부터 숙주를 완벽히 보호해 주는 것을 알 수 있다.

표 2 및 도 5의 결과에서 상기 3가지 균주 유래 플라젤린에서 백신보조제로서의 효능이 동일하게 관찰되었다.

상기 도 3, 도 4, 도 5 및 표 2의 결과로부터 재조합 플라젤린이 효과적 백신보조제(vaccine adjuvant) 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.

[시험예 2] 상피세포에 대한 플라젤린의 반응 효과

24-웰 평판 배양기에 Caco-2 세포를 2.0x10⁵세포씩 분주하여 10% 우태혈청을 가한 DMEM 배지에서 하룻저녁 배양하였다. 그 후 우태혈청을 첨가하지 않은 DMEM 배지로 2차례 세척한 다음, 분리한 재조합 FlaB를 농도별로 처리하여 3시간 동안 배양한 후에 상청액에 유리된 인터루킨-8을 ELISA 키트 (R＆D systems Co.)로 측정하여 비교하였고, 플라젤린을 처리한 상피 세포로부터 RNA를 분리하여 인터루킨-8의 전사 활성을 실시간(real-time) RT-PCR 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서는 재조합 FlaB 가 Caco-2세포의 표면에 존재하는 수용체에 작용하여 세포내에 신호를 전달함으로써 염증 반응의 중요 매개인자를 분비하는 세포인 호중구(neutrophil)를 유인하는 것으로 알려진 인터루킨-8의 분비를 농도의존적으로 촉진하는 것을 보여준다.

[시험예 3] TLR-5 매개에 의한 플라젤린의 인터루킨-8 전사 조절

24-웰 평판 배양기에 Caco-2 세포를 2.0x10⁵세포씩 분주하여 하룻저녁 배양한 후 FuGENE6 (Roche 사)을 이용하여 IL-8-Luc 플라스미드 또는 NF-kappaB-Luc(한양대학교 의과대학 미생물학 교실의 김정목 교수로부터 획득)와 TLR-5 유전자가 클 로닝된 p3xFlag-hTLR5 플라스미드(미국 Wake Forest University School of Medicine, Departments of Microbiology and Immunology의 Steven B. Mizel로부터 획득) 및 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase)발현 대조군 플라스미드(Clontech 사)를 동시에 세포내로 도입시켰다. 24시간 추가배양 후 새로운 배지를 교체하고, IMPACT 시스템으로 분리한 비브리오 패혈증균 재조합 FlaB, 살모넬라균 재조합 FliC, 및 리스테리아균 재조합 FlaA와, 비브리오 패혈증균 FlaA, FlaB, FlaF, FlaC, FlaD 및 FlaE에 대한 글루타치온-S-트랜스퍼레이스 융합단백질을 일정 시간 처리한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 측정하여 인터루킨-8 전사정도를 발광분석기(luminometer, Berthold사)를 이용해 측정하였으며, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

재조합 FlaB 농도 의존적으로 인터루킨-8 및 NF-kappaB의 전사를 활성화하였으며, 다른 비브리오 패혈증균 편모구성 플라젤린인 FlaA, FlaF, FlaC, FlaD, FlaD및 FlaE도 정도의 차이는 있으나 공히 인터루킨-8 전사활성을 나타내었다.

[시험예 4] 사람 말초 혈액 유래 수지상 세포에 대한 재조합 FlaB의 반응 효과사람 말초혈액에서 피콜(Ficoll Paque PLUS; Amersham 사)을 이용한 원심분리방법으로 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; 이하 "PBMC"라 한다)를 분리하였다. 말초혈액 단핵세포 중에서 골수성 세포(myeloid)에 선택적으로 발현하는 CD14를 인지하는 자기 비드(magnetic bead)를 6-12℃에서 20분간 반응시키고 자기세포 분리기(magnetic cell sorter)를 이용하여 CD14 양성 세포를 분리하였다. CD14 양성세포를 10% 우태혈청을 가한 RPMI배지에 50ng/ml GM-CSF와 50ng/ml IL-4를 첨가하여 6일 동안 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시킨 후 실시 예 4에서 제조한 재조합 FlaB 및 실시예 4와 동일한 방법으로 제조한 살모넬라균의 플라젤린 FliC를 각각6nM 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하여 재조합 FlaB 및 FliC가 사람 수지상 세포의 분화에 미치는 영향을 관찰하였다. FliC를 시험한 이유는 본 발명이 다른 세균의 플라젤린의 특성을 포괄할 수 있는지, 다시 말해 범용성이 있는지를 알아보기 위해서이다.

수지상세포 표면에 선택적으로 발현하는 CD80, CD83 및 CD86를 각각 인식하고FITC(fluorescein isothicyanate) 혹은 홍조소(phycoerythrin)가 결합된 단클론 항체를 반응시켜 양성 시그날을 보이는 세포 그룹을 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 발현 정도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 도 9에 나타내었다.

사람 수지상 세포에 비브리오 패혈증균 유래 재조합 FlaB를 처리한 경우, 수지상 세포의 성숙도를 표시하는 CD80, CD83및 CD86 양성 세포군 백분율 값이 각각 67.3%, 23.57% 및 43.29% 로 FlaB를 처리하지 않은 대조군의 CD80, CD83 및 CD86 양성세포군의 각각의 백분율 값 15.29%, 0.82% 및 1.5%에 비해 현저히 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 반면 골수계 세포(myeloid)에 선택적으로 발현하는 CD14는 수지상 세포로 분화될수록 발현이 감소하였다. 살모넬라 유래 플라젤린 FliC도 FlaB와 유사한 효과를 나타내었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 비브리오 패혈증균의 플라젤린 을 구성하는 FlaA, FlaB, FlaF, FlaC, FlaD 및 FlaE와 살모넬라균의 플라젤린을 구성하는 FliC 및 리스테리아균의 플라젤린을 구성하는 FlaA는 상피세포에서 인터루킨-8의 생산을 자극하고, 수지상 세포의 성숙을 촉진하였으며, 백신으로 사용하는 면역자극제에 대한 숙주의 항원-특이적 면역 반응을 증가시켰다.

또한 본 발명에 의한 상기 플라젤린 구성 단백질을 테타누스 유독소와 혼합하여 마우스의 비강에 면역한 결과 점막조직에서 항원에 대한 IgA 수치가 플라젤린을 보조제로 첨가하지 않은 대조군에 비해 현저히 높았으며 치사량의 테타누스 독소로부터 숙주를 완벽히 보호하였다. 특히 질 세척액 내에서 IgA 수치가 월등히 높은 점으로 보아 정자를 선택적으로 작용하는 피임 백신 개발 시보조제로서 응용 가능할 것으로 생각된다.

본 발명에 의한 재조합 플라젤린 단백질은 다양한 감염 질환 및 항암 치료를 위한 효과적인 백신보조제로 사용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

비브리오 패혈증균(Vibrio vulnficus), 살모넬라균(Salmonella typhimurium) 및 리스테리아균(Listeria monocytogenes)으로 이루어진 군에서 선택된 세균에서 유래된 플라젤린을 유효성분으로 함유하는 점막 백신보조제.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 플라젤린은

DNA 서열 1 또는 아미노산 서열 2로 표시되는 flaA,

DNA 서열 3 또는 아미노산 서열 4로 표시되는 flaB,

DNA 서열 5 또는 아미노산 서열 6으로 표시되는 flaF,

DNA 서열 7 또는 아미노산 서열 8로 표시되는 flaC,

DNA 서열 9 또는 아미노산 서열 10으로 표시되는 flaD 및

DNA 서열 11 또는 아미노산 서열 12로 표시되는 flaE 유전자로 인코딩되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnifiucs)의 플라젤린 단백질 중에서 하나 이상 선택된 것임을 특징으로 하는 점막 백신보조제.
삭제
삭제
삭제
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 백신보조제는 테타누스를 포함하는 항독소 백신; 콜레라 및 장티프스를 포함하는 생균 및 사균 백신; 인플루엔자 및 사스(SARS)를 포함하는 항바이러스 백신; 자궁 경부암을 포함하는 항암 백신; 항정자 피임 백신; 및 단백질 또는 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 재조합 백신에 대한 보조제임을 특징으로 하는 점막 백신보조제.