MX2011003674A - Composicion que comprende proteinas sortasas ancladas a lasuperficie de streptococcus uberis. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una o más proteínas de superficie ancladas con sortasa de Streptococcus uberis, o una parte inmunogénica de la misma, en donde la composición es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se administra a un sujeto.

Description

COMPOSICION QUE COMPRENDE PROTEÍNAS SORTASAS ANCLADAS A LA SUPERFICIE DE STREPTOCOCCUS UBERIS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a una composición inmunogénica para uso en la inducción de una respuesta inmune a Streptococcus uberis y, en particular, a composiciones inmunogénicas capaces de inducir una respuesta inmune protectora.

Streptococcus uberis (S. uberis) actualmente es responsable de aproximadamente 20-30% de todos los casos de mastitis clínica en el Reino Unido y se presenta con una incidencia similar en todo el mundo. La mastitis sigue siendo la enfermedad infecciosa de mayor importancia económica en el ganado lechero de todo el mundo. La pérdida anual debida a la mastitis clínica en el Reino Unido se ha estimado de aproximadamente 170 millones de libras y entre $1.5-2.0 miles de millones de dólares en los E.UA Estas pérdidas se pueden atribuir a una reducción en la producción de leche, los costos asociados al tratamiento y el sacrificio de las vacas persistente y repetidamente infectadas. Los microorganismos que causan mastitis se pueden dividir en aquellos que muestran una ruta de transmisión contagiosa, tales como Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae, y aquellos que además infectan la ubre frecuentemente a partir de un depósito del medio ambiente, tales como Escherichia coli y Streptococcus uberis. La aplicación de diversas medidas de control en las últimas dos décadas, basadas en mejoras en las prácticas de ordeño, desinfección de pezones post-ordeño y el tratamiento de rutina antí-microbiano intra-mama después de cada lactancia, han demostrado su eficacia contra los patógenos con una ruta de transmisión exclusivamente contagiosa, pero ha tenido poco o ningún impacto sobre la incidencia de infección de la glándula mamaria a partir de los depósitos del medio ambiente. La falta de control de la mastitis bovina causada por S. uberis se atribuye principalmente a la insuficiente información sobre la patogénesis de la infección.

La mastitis bovina, que provoca la inflamación de la glándula mamaria (ubre), usualmente se produce como resultado de la infección intramamaria por bacterias. Los signos de mastitis varían de conformidad con los factores en el hospedero y el patógeno invasor y la infección intramamaria puede resultar en la enfermedad subclínica o clínica. La mastitis subclínica, por definición, no muestra signos evidentes de enfermedad. La infección asociada a la enfermedad clínica puede tener un intervalo desde anormalidades visibles en la leche (agregados de proteínas o coágulos) acompañada por dolor e inflamación de la glándula afectada, hasta la producción de una secreción que se compone exclusivamente de proteínas agregadas en un líquido seroso. En casos severos, puede haber signos sistémicos tales como temperatura elevada y pérdida de apetito, que pueden desarrollar bacteriemia, septicemia y llevar a la muerte del animal.

La leche de una glándula mamaria no infectada contiene leucocitos, incluyendo macrófagos, neutrófilos y linfocitos típicamente por debajo de 150,000 células/ml. La infección usualmente resulta en una respuesta inflamatoria localizada, caracterizada por el influjo de neutrófilos en el cuarto infectado de la glándula mamaria y en la leche. El recuento de células de la leche resultante se utiliza internacionalmente como una medida sustituta de la infección de la glándula mamaria y como una medida de la calidad de la leche y la salud de la ubre. La leche de los cuartos sub-clínicamente infectados usualmente tiene un recuento de células de más de 250,000 células/ml, pero esta cifra puede variar ampliamente. La leche de cuartos clínicamente infectados usualmente contiene de más de 2,000,000 de células/ml. La interacción entre las bacterias y/o sus productos y el gran número de neutrófilos en la secreción ha sido considerada como la principal causa subyacente de la disminución de la tasa de producción de leche, la degradación de la secreción y la inducción de cambios inflamatorios generalizados característicos de la mastitis.

Uno de los objetivos de esta invención es proporcionar una o varias composiciones que puedan ser utilizadas para inducir una respuesta inmune protectora a Streptococcus uberis, y para prevenir o reducir, de ese modo, la incidencia de mastitis.

De conformidad con un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una o más proteínas de Streptococcus uberis, o una parte inmunogénico de la misma, en donde la composición es capaz de inducir una respuesta inmune, cuando se administra a un sujeto.

Preferiblemente una o más proteínas de Streptococcus uberís son proteínas ancladas a sortasa, o una parte inmunogénica de la misma.

Una proteína anclada a sortasa de Streptococcus uberís se refiere a cualquier proteína la cual en Streptococcus uberís de tipo silvestre está anclada a la superficie de la bacteria por la acción de la enzima sortasa.

Las una o más proteínas ancladas a sortasa, o la una o más proteínas de Streptococcus uberís, se pueden seleccionar del grupo que comprende las proteínas SUB0145, SUB1095 y SUB1154 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más, homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

La composición inmunogénica puede comprender dos o más proteínas de Streptococcus uberís, o una parte inmunogénica de la misma.

Las dos o más proteínas ancladas a sortasa, o las dos o más proteínas de Streptococcus uberís, se pueden seleccionar del grupo que comprende las proteínas SUB0145, SUB1095 y SUB1 154 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más, homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

La composición inmunogénica puede comprender las proteínas SUB0145, SUB1095 y SUB1 154 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más, homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

La composición inmunogénica puede comprender las proteínas SUB1095 y SUB1 154 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más, homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

La una o más proteínas ancladas a sortasa, o la una o más proteínas de Streptococcus uberis, se puede seleccionar del grupo que comprende las proteínas SUB0135, SUB0145, SUB0207, SUB0826, SUB0888, SUB1095, SUB1154, SUB1370, SUB1730 y SUB0241 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más, homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

La una o más proteínas ancladas a sortasa, o la una o más proteínas de Streptococcus uberis, se puede seleccionar del grupo que comprende las proteínas SUB0135, SUB0207, SUB0826, SUB0888, SUB1095, SUB1154, SUB1370, SUB1730 y SUB0241 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más, homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

La referencia al porcentaje de homología se refiere al porcentaje de identidad entre dos secuencias alineadas. El porcentaje de identidad se refiere a los residuos en dos proteínas que son las mismas, cuando las secuencias de proteína se alinean para una correspondencia máxima y cuando las inversiones y las translocaciones se tienen en cuenta. Preferiblemente, el porcentaje de identidad ignora cualesquiera diferencias conservativas entre las secuencias alineadas que no afectan la función. El porcentaje de identidad entre las secuencias alineadas se puede establecer mediante el uso de herramientas bien establecidas (tal como el algoritmo BLAST - Herramienta de Búsqueda por Alineamiento Local Básico (Basic Local Alignment Search Tool); Altschul et al., (1990) J Mol Biol. 215: 403-10).

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB0135. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0135.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB0145. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0145.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB0207. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0207.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB0826.

En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0826.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB0888. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0888.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB1095. En otra modalidad una o más de proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB1095.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es BUB1 154. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB1 154.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB1370. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB1370.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB1730. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB1730.

En una modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, es SUB0241. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0241.

En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0164. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0348. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB1739. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0206. En otra modalidad una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberis, no es SUB0337.

Una parte inmunogénica de una proteína se refiere a una parte de una proteína más grande que es capaz de inducir una respuesta inmune. Preferiblemente, la respuesta inmune inducida reconocerá la parte de la proteína y la proteína entera. Preferiblemente, la parte inmunogénica incluye al menos un epítope de la proteína de longitud total.

Una composición inmunogénica es una composición que es capaz de inducir una respuesta inmune a un antígeno en la composición cuando la composición se administra a un sujeto. Preferiblemente, la respuesta inmune inducida es protectiva. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, más preferiblemente un rumiante, tal como una vaca, oveja o cabra. El antígeno en la composición inmunogénica de la invención puede ser una o más proteínas que están ancladas a la superficie de Streptococcus uberis por la enzima sortasa.

Preferiblemente, la respuesta inmune inducida por una composición de la invención se dirige al antígeno en la composición y actúa para prevenir o reducir la infección por Streptococcus uberis en un sujeto al que se le administró una composición inmunogénica. La respuesta inmune puede reconocer y destruir a Streptococcus uberis. Alternativamente, o además, la respuesta inmune inducida puede obstaculizar o prevenir la replicación de Streptococcus uberis. Alternativamente, o además, la respuesta inmune inducida puede obstaculizar o prevenir que Streptococcus uberis cause enfermedad, tal como la mastitis, en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta inmune inducida por la composición también es capaz de ser dirigida a las cepas de Streptococcus uberis distintas a aquéllas a partir de las que se derivan las proteínas en la composición.

La respuesta inmune generada puede ser una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpo. Usualmente, una respuesta inmune incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos, la producción de anticuerpos, células B, células T ayudadoras, células T supresoras y/o células T citotóxicas, dirigidas a una o más proteínas inmunogénicas en la composición.

La composición también puede comprender uno o más antígenos adicionales, además de una o más proteínas ancladas a sortasa de S. uberis, o una o más proteínas de S. uberís. Los antígenos adicionales también pueden ser capaces de inducir una respuesta inmune dirigida al organismo patógeno del que se derivan. Los antígenos adicionales se pueden derivar de S. uberís o se puede derivar de un organismo patógeno diferente.

La composición se puede utilizar para inducir/producir una respuesta inmune protectora cuando se administra a un sujeto. La respuesta inmune protectora puede causar la muerte de S. uberis después de infectar a un sujeto, o puede prevenir o inhibir la replicación del S. uberis y/o puede prevenir o inhibir que se ocasione la enfermedad en un sujeto.

La composición se puede utilizar como una vacuna profiláctica o terapéutica contra S. uberis.

De conformidad con un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas ancladas a sortasa de S. uberis, o una o más proteínas de S. uberis, o parte de la misma, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende una composición de conformidad con cualquier aspecto de la invención.

Preferiblemente la composición farmacéutica es capaz de producir una respuesta inmune protectora a S. uberis.

La frase "que produce una respuesta inmune protectora" como se utiliza en la presente invención, significa que la composición es capaz de generar una respuesta protectora en un organismo hospedero, tal como una vaca, a la que se le administra. Preferiblemente una respuesta inmune protectora protege contra posteriores infecciones por S. uberís. La respuesta inmune protectora puede eliminar o reducir el nivel de infección mediante la reducción de la replicación de S. uberís afectando el modo de acción de S. uberís. Preferiblemente, la respuesta inmune protectora reduce o previene la enfermedad causada por S. uberís.

Los excipientes y vehículos adecuados aceptables para uso en una composición farmacéutica se conocerán bien por aquellos expertos en la técnica. Estos pueden incluir vehículos sólidos o líquidos. Los vehículos líquidos adecuados incluyen agua y solución salina. Las proteínas de la composición se pueden formular en una emulsión o que se pueden formular en microesferas biodegradables o liposomas.

La composición puede comprender además un adyuvante. Los adyuvantes adecuados serán bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y pueden incluir Adyuvante Incompleto de Freund (para uso en animales), y sales de metal, tales como sales de aluminio o de calcio.

La composición también puede comprender polímeros u otros agentes para el control de la consistencia de la composición, y/o para controlar la liberación de las proteínas a partir de la composición.

La composición también puede comprender otros agentes, tales como diluyentes, que pueden incluir agua, solución salina, glicerol u otros alcoholes adecuados, etc; agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH, agentes espesantes por ejemplo celulosa o derivados de celulosa, conservadores, detergentes, agentes antimicrobianos, y los similares.

Preferiblemente, los ingredientes activos en la composición tienen más de 50% de pureza, usualmente más de 80% de pureza, frecuentemente más de 90% de pureza y más preferiblemente más de 95%, 98% o 99% de pureza. Con ingredientes activos aproximándose al 100% de pureza, por ejemplo, de aproximadamente 99.5% o aproximadamente de aproximadamente 99.9% de pureza, se utilizan más frecuentemente.

La composición de la presente invención se puede utilizar como vacuna contra las infecciones causadas por S. uberis. La vacuna se puede administrar profilácticamente a los animales en riesgo de exposición a S. uberis, y/o terapéuticamente a los animales que ya han sido expuestos a S. uberis.

Preferiblemente, si la composición se utiliza como una vacuna, la composición comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de antígeno (compuesto de las proteínas de S. uberis). Una "cantidad inmunológicamente efectiva" de un antígeno es una cantidad que cuando se administra a un individuo, ya sea en una sola dosis o en una serie de dosis, es eficaz para el tratamiento o la prevención de la infección por S. uberis. Esta cantidad variará dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado y del antígeno. Se espera que la cantidad se sitúe en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar por los ensayos de rutina.

La ruta de administración de la composición puede variar dependiendo de la formulación de las proteínas en la composición. La composición se puede arreglar para ser administrada por ruta intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o ¡ntramamaria. Alternativamente, la composición se puede arreglar para ser administrada por ruta parenteral, tal como por ruta intranasal, oral, bucal, por inhalación, epidermal, transcutánea, tópica, vaginal o administración rectal.

La composición se puede arreglar para ser administrada como una dosis única o como parte de un programa de dosis múltiples. Las dosis múltiples se pueden administrar como una inmunización primaria, seguida por una o más inmunizaciones de refuerzo. El tiempo adecuado entre las inmunizaciones de cebado y de refuerzo se pueden determinar de manera rutinaria.

Las composiciones de la invención pueden ser capaces de inducir una respuesta de anticuerpos bactericidas séricos después de ser administrados a un sujeto. Estas respuestas se miden convenientemente en ratones y los resultados son un indicador estándar de eficacia de la vacuna.

Las composiciones de la invención también pueden, o alternativamente, son capaces de inducir una respuesta inmune que afecta a las proteínas en las células hospedero para defenderse en contra de la infección por S. uberis, sin necesidad de destruir las bacterias.

De conformidad con un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una o más proteínas ancladas a sortasa de S. uberís en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune. El medicamento puede ser utilizado para la vacunación profiláctica o terapéutica de sujetos en contra de S. uberis. El medicamento puede ser una vacuna profiláctica o terapéutica.

De conformidad con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para proteger a un humano o animal no humano, preferiblemente una vaca, a partir de los efectos de infección por S. uberís que comprende administrar al humano o animal no humano una composición de conformidad con cualquier otro aspecto de la invención.

De conformidad con otro aspecto, la invención proporciona un método para aumentar una respuesta inmune en un humano o animal no humano, preferiblemente una vaca, que comprende administrar una composición de conformidad con la invención al humano o animal no humano. La respuesta inmune es preferiblemente protectiva. El método puede generar una respuesta de refuerzo en un sujeto que ya se había cebado. La respuesta inmune puede ser profiláctica o terapéutica.

Los usos, métodos y composiciones de la invención son preferiblemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por S. uberis.

El experto en la técnica apreciará que cualquiera de las características anteriormente discutidas se puede aplicar a cualquiera de los aspectos de la invención.

Las modalidades preferidas de la presente invención se describirán a continuación, simplemente a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.

Las figuras 1A, 1B y 1C - muestran los resultados del aislamiento bacteriano, recuento de células somáticas y respuesta clínica después de la exposición con la cepa silvestre de S. uberis 0140J y S. uberis Srt muíante en el ganado lechero. La figura 1A muestra la recuperación bacteriana de S. uberis después de la exposición. Los datos se representan como la media geométrica del número de bacterias obtenidas de la leche de animales expuestos ya sea con la cepa 0140J (cuadrados, n = 4) o con el mutante SrtA (triángulos, n = 8). La Figura 1 B ilustra la respuesta inflamatoria después de la exposición con el tipo silvestre y mutante Srt de S. uberis. Los datos están representados por las medias geométricas del número de células somáticas obtenidas de la leche de animales expuestos ya sea con la cepa 0140J (cuadrados, n = 4) o con el mutante SrtA (triángulos, n = 8). La figura 1C ilustra los resultados clínicos combinados a partir de las manifestaciones clínicas después de la exposición con el tipo silvestre y con el mutante Srt de S. uberis. Los datos están representados por la media de las puntuaciones clínicas, dadas por la aparición del cuarto y la aparición de la leche, como se indica en la cuadro A, ya sea con la cepa 0140J (cuadrados, n = 4) o la SrtA mutante (triángulos, n = 8); Las Figuras 2A y 2B - muestran la identificación de Subí 154 y Subí 370 a partir de los extractos de Streptococcus uberis 0140J y srtA mutante. La Figura 2A - el antisuero de conejo a Subí 154 se utilizó para investigar las manchas en immunoblots de extractos de detergente proteico a partir de 0140J (línea 2) y SrtA mutante (línea 3), concentrados, de medio precipitado a partir de 0140J (línea 4), SrtA mutante (línea 5) y Subí 154 mutante (línea 6). Los estándares de peso molecular se muestran en la línea 1. La Figura 2B - El antisuero de conejo a Subí 370 se utilizó para investigar las manchas en immunoblots de extractos de detergente protéico de 0140J (línea 1 ) y SrtA mutante (Línea 2), concentrados, de medio precipitado de 0140J (línea 3), SrtA mutante (línea 4) y Subí 370 mutante (línea 5). Los estándares de peso molecular se muestran en la línea 6; Las Figuras 3A a 30 - son las secuencias de aminoácidos de proteínas ancladas a sortasa de S. uberis; La Figura 3A es la secuencia de SUB1370 (SEQ ID NO: 1) una carboxipeptidasa de zinc; La Figura 3B es la secuencia de SUB0145 (SEQ ID NO: 2) una proteína de unión a lactoferrina; La Figura 3C es la secuencia de SUB0135 (SEQ ID NO: 3) un precursor de trucan beta fructosidasa; La Figura 3D es la secuencia de SUB1730 (SEQ ID NO: 4); La Figura 3E es la secuencia de SUB0888 (SEQ ID NO: 5); La Figura 3F es la secuencia de SUB0207 (SEQ ID NO: 6); La Figura 3G es la secuencia de SUB1154 (SEQ ID NO: 7) una serina proteasa semejante a subtilina; La Figura 3H es la secuencia de SUB1095 (SEQ ID NO: 8) una proteína semejante a colágena; La Figura 31 es la secuencia de SUB0826 (SEQ ID NO: 9) una subtilasa putativa anclada a la superficie; La Figura 3J es la secuencia de SUB0164 (SEQ ID NO: 10) una proteína de unión a fibronectina putativa truncada anclada a la superficie (pero es codificada por un pseudogen); La Figura 3K es la secuencia de SUB0348 (SEQ ID NO: 11) una proteína semejante a colágena putativa (pero es codificada por un pseudogen); La Figura 3L es la secuencia de SUB1739 (SEQ ID NO: 12) una proteína putativa anclada a la superficie (pero es codificada por un pseudogen); La Figura 3M es la secuencia de SUB0206 (SEQ ID NO: 13) una proteína exportada putativa de función desconocida; La Figura 3N es la secuencia de SUB0241 (SEQ ID NO: 14) una proteína putativa anclada a la superficie de función desconocida; La Figura 30 es la secuencia de SUB0337 (SEQ ID NO: 15) una proteína de unión a glutamina localizada en la superficie; La Figura 4 muestra la colonización bacteriana después de la exposición con la cepa de tipo silvestre (0140J) y las cepas mutantes atenuadas que carecen de sub0145, subí 095 o subí 154. Los datos se expresan como medias geométricas de Log-?? ufc/ml detectadas en muestras de leche obtenidas en cada ordeño después de la exposición experimental.

Los datos que se presentan a continuación demuestran que las proteínas ancladas a la superficie de S. uberis por la sortasa, un transamidasa, son importantes en la virulencia y además describen que algunas de dichas proteínas (por ejemplo, sub1095, subí 154 y sub0145) son esenciales para la virulencia, y por lo tanto se requieren para ser funcionales a fin de que esta bacteria cause la enfermedad. Las proteínas son buenos inmunógenos. Las respuestas inmunes a estas proteínas en forma de anticuerpos probablemente eliminen su función, por tanto, la proteína identificada podría ser útil en inclusiones dentro de composiciones inmunogénicas destinadas a reducir o prevenir la infección o las enfermedades causadas por S. uberis.

EJEMPLO 1 Producción y evaluación de un mu tan te SrtA de S. uberis Métodos y Materiales Cepas bacterianas y Reactivos.

La cepa 0140J de Streptococcus uberís, originalmente aislada partir de un caso clínico de mastitis bovina en el Reino Unido, se utiliza en todo este estudio. La bacteria se cultivó de forma rutinaria en caldo Todd Hewitt o caldo de infusión de cerebro corazón.

La leche desnatada se produjo a partir de leche cruda de bovino asépticamente recolectada de varias vacas dentro del hato lechero del Institute for Animal Health (Instituto de Salud Animal). La leche se recolectó de animales que estaban libres de infección intramamaria. Después de la centrifugación (3,000 x g, 10 minutos), la leche desnatada se retiró cuidadosamente de la capa de grasa superior y del concentrado de las células sedimentadas. La esterilidad de la leche desnatada se determinó mediante siembra de 500 µ? de la leche directamente sobre agar sangre que contenía esculina (1.0% p/v; ABA) y por el enriquecimiento del cultivo de 5 mi de leche y en un volumen igual de caldo de Todd Hewitt seguido por el aislamiento de las colonias individuales sobre ABA. En ambos casos, las placas se incubaron a 37°C durante 18 horas. La leche desnatada se almacenó a 41 C y se utilizó dentro de las 72 horas.

Otras cepas bacterianas y reactivos se utilizaron como se describe en el texto.

Aislamiento de srtA mutante mediante selección qenotípica.

El srtA (SUB0881 ) mutante fue aislado después del examen de PCR de una cepa mutante 0140J pGhost9::ISS1 de S. uberis siguiendo un protocolo similar al descrito anteriormente (Taylor, D. L. et al, 2003. J. Bacteriol. 185: 5210-5219; Ward, P. N. et al 2001 Infect. Immun. 69: 392-399). Brevemente, los cultivos dejados durante toda la noche de placas individuales de 96 pozos se combinaron y el ADN genómico se preparó para su uso como molde en las reacciones de amplificación por PCR que contenían un iniciador específico del locus, P261 (srtA) y un iniciador específico de ISS1 , P247 o P250. La amplificación se realizó utilizando treinta y cinco ciclos (95°C durante 20 s, 54°C por 1 minuto y 72°C por 3 minutos) y se realizó con AmpliTaq Gold master mix (ABI). Los productos se visualizaron después de la electroforesis en gel, la tinción con bromuro de etidio y transiluminación con luz UV. Después de la identificación de la placa, se identificó de manera similar una ubicación en un pozo utilizando ADN genómico combinado a partir de las columnas y filas de la placa blanco. Después del aislamiento de la clona muíante, la escisión del vector plasmídico se promovió mediante crecimiento a la temperatura permisiva (28°C) sin selección del antibiótico. La pérdida del vector pGhost9 y la retención de ISS1 fueron confirmadas por Southern blot como se describió anteriormente (Ward, P. N. et al 2001 Infect. Immun. 69: 392-399). La presencia de la inserción en srtA se confirmó mediante amplificación por PCR del marco de lectura abierto y secuenciación del producto resultante a través de la unión entre ISS1 y el ORF interrumpido. Los iniciadores para PCR utilizados son como se muestra en el Cuadro 1 a continuación.

CUADRO 1 Iniciadores de PCR. P247 \SS1 hacia adelante ÍSEQ ID NO: 16); P250 ISSf reverso fSEQ ID NO: 17): P261 (SEQ ID NO: 18): P409 (SEQ ID NO: 19): P410 ÍSEQ ID NO: 20); P615 (SEQ ID NO: 21); P630 (SEQ ID NO: 22); P480 (SEQ ID NO: 23): P481 (SEQ ID NO: 24): P621 (SEQ ID NO: 25) P630 AGCCACAAACA Selección Agrupamien 59 CCATTCACA para \SS1 tos de ADN dentro del genómico ORF de de 0140J:: Subí 154 pGhost9- contra ISS7 de S.

P247 uberís P480 GAAGAAGTGGT Amplifica ADN 60 AACTGCTACAA ción de genómico AC ORF de de 0140J Sub1370 de S. uberís P481 TACTAACTTCTT Amplifica ADN 64 GTCATCTTGGTA ción de la genómico CC I I I I selección de 0140J del ORF de S. uberís de Subí 370 para ISS7 dentro del ORF de Subí 370 P621 CAACGAATCAAC Selección Agrupamien 59 AAACTGAAAGC- para ISSí tos de ADN 3' dentro de genómico Sub1370 de 0140J:: contra pGhost9- P250 ISS7 de S. uberís Extracción de ADN cromosomal a partir de S. uberís El ADN genómico se preparó utilizando una variación del método de Hill y Leigh como se describió previamente (Hill, A. W. et al 1994 FEMS Immunol Med Microbiol 8: 109-1 17). Brevemente, 1.5 mi de un cultivo durante toda la noche se centrifugó a 10,000 x g durante 2 minutos y el concentrado celular se lavó con 500 µ? de Tris-CI 10 mM, EDTA 5 mM, pH 7.8. Las paredes celulares bacterianas fueron interrumpidas mediante cesuspenslón en 3?s µ? de Tris-CI 10 mM, EDTA 5 mM, pH 7.8 que contenía 30 unidades/ml de mutanolisina y 10 mg/ml de lisozima (ambos de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, E.U.A.) y la subsecuente incubación a 37°C durante 30 minutos. La lisis celular total se logró mediante la adición de 20 µ? de solución de SDS (20% p/v en Tris-CI 50 mM, EDTA 20 mM, pH 7.8) y Proteinasa K (Sigma) a una concentración final de 150 Mg/ml y una incubación adicional a 37°C durante 1 hora. El material de la pared celular se removió por la precipitación después de la adición de 200 µ? de NaCI saturado y la centrifugación subsecuente a 12,000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se extrajo con fenol cloroformo y el ADN se precipitó por la adición de 2 volúmenes de etanol absoluto. Los concentrados de ADN se lavaron con 70% de etanol acuoso y se secaron al aire antes de la resuspensión en regulador de pH TE que contenía 20 pg/ml de ARNasa A (Sigma).

Exposición de vacas lecheras lactantes con la cepa 0140J de S. uberis y SrtA mutante El papel de SrtA en la patogénesis de la infección se determinó mediante la comparación de la virulencia de la cepa 0140J y el mutante que carece de SrtA (srtA mutante) en un modelo de infección intramamaria en la vaca lechera. Las bacterias se cultivaron durante 18 horas a 37°C en caldo de Todd Hewitt. Las células fueron recuperadas por centrifugación (10,000 x g, 10 minutos), se suspendieron en una solución salina libre de pirógenos (Sigma) y se diluyeron en la misma para proporcionar la densidad celular requerida. Las suspensiones de cada cepa se mantuvieron sobre hielo antes de ser utilizadas para exponer a los animales. El número de bacterias viables en alícuotas idénticas de cada suspensión se enumeró tanto antes como después de la exposición. Seis vacas lecheras, 2-10 semanas después de su primera lactación, fueron seleccionadas del hato lechero del Instituto para exposición. Los criterios para la selección fueron: ausencia de signos de mastitis, ausencia de bacterias en muestras de leche antes de la exposición, sin antecedentes de mastitis durante la lactancia en curso y sin evidencia de infección intramamaria en las muestras de leche tomadas a los 7 y 14 días después del parto. Los animales fueron expuestos en cuartos mamarios mediante infusión de 1 mi de solución salina libre de pirógenos (Sigma), que contenía S. uberis. Dos animales fueron expuestos en un total de cuatro cuartos con 6.0 x 102 ufe de la cepa 0140J y otros cuatro animales, se expusieron en un total de ocho cuartos, con una dosis similar de srtA muíante. Después de la exposición, los animales fueron ordeñadas e inspeccionados dos veces al día (07:00 h y 15:30 h) y aquellos en las que se han alcanzado los criterios predeterminados para los puntos finales clínicos (leche coagulada y decolorada y/o hinchazón del cuarto de la ubre o malestar a la palpación) y fueron tratados con antibióticos de marca propia de conformidad con los criterios establecidos descritos en el cuadro A. Las muestras de leche fueron tomadas y analizadas para las bacterias y células somáticas, como se describe a continuación.

El cuadro A ilustra en forma tabular la manifestación de una respuesta clínica a la infección por Streptococcus uberís. Todos los cuartos y las muestras de leche fueron analizados en contra de estos criterios en cada ordeño siguiente a la exposición CUADRO A Análisis de las muestras de leche El número de bacterias viables presentes se estimó mediante siembra directa de 1 mi y 100 µ? de cada muestra de leche sobre ABA. Las muestras también se diluyeron en solución salina y 50 µ? de cada dilución se sembraron directamente sobre ABA. En cada caso, se determinó la presencia y/o el número de S. uberís y el genotipo de los aislamientos recuperados se determinó mediante la comparación del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del ADN cromosómico y la amplificación del locus srtA, como se describe a continuación. El número de células somáticas presentes en las muestras de leche se determinó mediante un contador Coulter (Beckman Coulter, Ltd).

Preparación de proteínas a partir de los medios de crecimiento bacteriano mediante precipitación con metanol cloroformo Las bacterias se cultivaron en BHI (200 mi) con los cultivos creciendo a aproximadamente una D06oo nm de 0.5 y cosechadas por centrifugación (16,000 x g, 20 minutos, 4°C) y los medios de crecimiento bacteriano se esterilizaron por filtración a través de un filtro de 0.22 µ? (Millipore). Después de la adición del inhibidor completo de proteasa (Roche) a una concentración 1X, el medio de crecimiento bacteriano se concentró aproximadamente 100 veces utilizando dispositivos para filtración centrífuga Amicon (Millipore) con una exclusión de peso molecular de 10 kDa. Para precipitar las proteínas, se añadieron 600 µ? de metanol y 150 µ? de cloroformo (ambos a partir de BDH) a 200 µ? de un medio de crecimiento bacteriano concentrado. La preparación se agitó y se añadieron 450 µ? de agua MilliQ antes de la centrifugación (16,000 x g, 1 minuto). La fase superior se retiró cuidadosamente y se desechó y se añadieron 450 µ? de metanol al resto del material que se agitó y se centrifugó (16,000 x g, 2 minutos). Se desechó el sobrenadante y el concentrado se secó al aire antes de resuspender en regulador de pH para carga SDS.

Extracción de las proteínas no ancladas con detergente Los concentrados bacterianas a partir de los cultivos anteriores se lavaron 3 veces en 40 mi de PBS y se resuspendieron en 500 µ? de PBS que contiene hialuronidasa (100 U/ml, Sigma-Aldrich). Las células fueron incubadas durante 2 horas a 37°C y el material capsular hidrolizado se removió por centrifugación (8000 x g, 6 minutos, 4°C). Las células se lavaron 3 veces en 40 mi de PBS y se resuspendieron en 200 µ? de 0.1 % (v/v) Nonldet P-40 (NP-40) en PBS. El extracto con detergente se cosechó después de la remoción de las células bacterianas por centrifugación (16,000 x g, 10 minutos, 4°C).

Producción y purificación de las proteínas recombinantes Subí 154 y Sub1370 Los iniciadores p409 y p410 (véase el cuadro anteriormente presentado) fueron diseñados para amplificar a partir del ADN genómico 0140J de S. uberis la secuencia de codificación madura pronosticada (es decir, que carece de la secuencia señal N-terminal) de Subí 154, un sustrato putativo de srtA con homología a la serina proteasa semejante a subtilasa. Un amplicón de 3.4 kb se generó utilizando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (New England Biolabs), purificado mediante un Kit de Purificación por PCR MinElute (Qiagen) y se trató con Kpnl (New England Biolabs) para facilitar la clonación direccional. El plásmido pQEI (Qiagen) se preparó mediante el uso de Pvull, Kpnl y fosfatasa Antártica (todos de New England Biolabs) y la construcción se ligó (ADN ligasa T4, New England Biolabs) durante toda la noche a 20°C de conformidad con las instrucciones del fabricante. Veinte microlitros de la mezcla de ligación se desaló mediante el método de Atrazhev y Elliott (Atrazhev, A. M., y J. F. Elliott 1996 Biotechniques 21 : 1024). Aproximadamente 10 ng de la mezcla de ligación desalada se transformaron dentro de Escherichia coli M 5 pREP4 (Qiagen) y las clonas recombinantes se seleccionaron sobre placas de agar LB con Kan 25 pg/ml y Amp 50 pg/ml. La proteína recombinante Sub1 154 (marcada con 6 x His) que inicia en el residuo Asp34 se purifica por dilución (1/30) del cultivo durante toda la noche en 1600 mi de caldo LB que contenía 50 ^g/m\ de ampicilina y 25 pg/ml de canamicina y se dejó crecer a 20°C sin agitación durante 2 horas. Subí 370 recombinante se preparó de manera similar, pero usando los iniciadores P480 y P481 , y se dejó crecer de manera similar en 800 mi de medio de cultivo. La expresión de la proteína se indujo por la adición de IPTG a una concentración final de 0.2 mM. Los cultivos se incubaron durante 2-4 horas adicionales y luego se centrifugaron a 8,000 g durante 20 minutos para cosechar las células bacterianas. Se purificaron Aproximadamente 1 mg y 0.3 mg de las proteínas Subí 154 y Subí 370 marcadas con 6 x His soluble, respectivamente, se purificó en la presencia de los inhibidores de proteasa (Completo-libre de EDTA, Roche) utilizando cartuchos de alto flujo CelLytic y HisSelect (ambos de Sigma) de conformidad con las instrucciones de los fabricantes.

Producción de antisuero de Subí 154 y Subí 370 en conejos e inmunotransferencia Cinco alícuotas de aproximadamente 50 g de las proteínas Subí 154 y Subí 370 recombinantes purificadas liofilizadas fueron suministradas a Davids Biotechnologie (Alemania) para la producción de suero en conejos. El anti-suero (50 mi) se suministró esterilizado por filtración y con 0.02% de azida de sodio como un conservador.

Los extractos de detergente y de medios a partir de los cultivos de S. uberís de tipo silvestre y un SrtA muíante se separaron en geles de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE) y luego se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa (Amersham) para la inmuno-detección, o alternativamente se tiñeron con Coomassie utilizando InstantBIue (Novexin). La transferencia se realizó a 170 mA durante 1 hora en un aparato Transblot (Biorad) en regulador de pH de transferencia que consistía de Tris-base 25 mM, glicina 192 mM y 20% (v/v) de metanol, pH 8.1-8.4. Después de la transferencia, las membranas se incubaron en una solución de bloqueo de leche desnatada en polvo al 1 % en PBS a 4°C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces durante 5 minutos en PBS que contenía Tween 20 al 0.1 % (PBST), luego se incubaron con antisuero de conejo a dilución de 1/12,000 para el antisuero Subí 154 y a dilución de 1/16,000 para el antisuero Subí 370 en solución de bloqueo durante 1 hora. Las membranas se lavaron tres veces durante 5 minutos en PBST, luego se incubaron con inmunoglobulina G de cabra anti-conejo conjugada con HRP a una dilución de 1/1 ,000 (Southern Biotech) durante 1 hora. Las membranas se lavaron de nuevo como se mencionó anteriormente y se detectó la HRP conjugada utilizando una solución de 4-cloronaftol (0.5 mg/ml) en PBS que contenía 16.7% de metanol y 0.00015% (v/v) de H2O2, se incubaron durante 1 hora en la oscuridad, antes las membranas se lavaron en PBS y se dejaron secar.

Aislamiento y caracterización genética de srtA mutante El análisis del genoma completo de 0140J de S. uberis confirmó la presencia de un homólogo único de la sortasa, la sortasa A (srtA) (Ward, P. N. et al (presentado en 2008) BMC Genomics). Un clon mutante se aisló con el elemento \SS1 insertado entre las pares de bases 248 y 249 de, y en la orientación reversa a, la secuencia codificante de la sortasa. El producto de la traducción de este gen srtA mutado consistió de los primeros 82 residuos de los 252 aminoácidos codificados en el ORF de srtA junto con otros 18 residuos en el elemento \SS1 antes de alcanzar un codón de paro.

Infectividad y virulencia de S. uberis de tipo silvestre y de SrtA mutante después de la exposición experimental en la glándula mamaria de bovino La infectividad y virulencia de srtA mutante, en comparación con una cepa de tipo silvestre, se determinó por una exposición de la glándula mamaria de bovino de un número de vacas lecheras. Todos los cuartos expuestos de los animales que recibieron 600 ufe de S. uberis de tipo silvestre se infectaron y diseminaron las bacterias a aproximadamente 106 a 107 ufc/ml por 48-60 horas después de la exposición (Figura 1A). Después de la exposición de ocho cuartos en cuatro animales con una dosis similar de srtA mutante, todos mostraron evidencia de infección y el srtA mutante se detectó en la leche a niveles similares a aquellos del tipo silvestre por hasta 24 horas después de la exposición. Sin embargo, la colonización bacteriana posterior se redujo, de un máximo de 104 ufc/ml de leche por 24 horas después de la exposición, de tal manera que al final del experimento (7 días post exposición) el presente número medio de bacterias fue de aproximadamente 10 ufc/ml (Figura 1B). En este momento sólo dos de los ocho cuartos siguieron diseminando las bacterias, el resto había eliminado la infección (<1 ufc/ml de leche).

La infiltración celular en la glándula mamaria en respuesta a la infección fue idéntica en ambos grupos de animales y no fue dependiente de la cepa de exposición. En cada caso, esto fue similar a lo reportado previamente en este modelo y alcanzó un máximo de aproximadamente 107 células/ml de leche por 48 a 60 horas después de la exposición. En los animales expuestos con la cepa de tipo silvestre esto coincidió con la aparición de signos clínicos agudos de mastitis (cuadro A y Figura 1C), que requiere la administración de terapia con antibióticos para eliminar la infección y aliviar los signos de la enfermedad. En contraste, los animales que habían recibido la srtA mutante mostraron pocos, si es que hubo algunos, signos de mastitis (cuadro A y Figura C).

Los resultados presentados en las Figuras 1A-1 C demostraron que S. uberis requiere la proteína sortasa, codificada por srtA, para la plena expresión de la virulencia por esta bacteria. Aunque en un principio es capaz de colonizar la glándula mamaria de bovino de manera similar a la S. uberis de tipo silvestre, el mutante que carece de SrtA no fue capaz de colonizar la glándula a niveles elevados, con los números bacterianos máximos restantes aproximadamente 1000 veces menores que aquellos detectados en la leche de los animales expuestos con la cepa de tipo silvestre. Esto se corresponde con el fracaso de srtA mutante para inducir los signos clínicos progresivos de la enfermedad.

Se entiende que los anclajes de srtA, son una o más proteínas a la superficie de la bacteria que son responsables de la virulencia, es decir, durante la colonización a alto nivel y/o la inducción de reacciones inflamatorias graves asociadas con la enfermedad clínica.

Detección de las proteínas ancladas a sortasa en S. uberis Para identificar las proteínas ancladas a la pared celular de S. uberis por la sortasa, las proteínas de la pared celular del S. uberis de tipo silvestre se compararon con aquellas de un SrtA mutante de S. uberis.

La metodología utilizada para aislar los péptidos trípticos de las proteínas ancladas a la pared celular es como sigue. Los cultivos bacterianos se crecieron ya sea en THB o en BHI para ambas fases de crecimiento exponencial y estacionaria. Los cultivos exponenciales se cultivaron en 1.5 litros de caldo hasta una densidad óptica de 0.6 a D055o nm mientras que los cultivos en fase estacionaria se crecieron en 1 litro de caldo durante la noche. Los concentrados de células bacterianas se cosecharon por centrifugación (16,000 x g, 10 minutos, 4°C) y consecutivamente se lavaron con PBS, 0.1 % (v/v) de Nonidet P40 (NP40) en PBS y PBS y se cosecharon por centrifugación como se mencionó anteriormente. Los concentrados celulares se resuspendieron en PBS que contenía inhibidores de proteasa completos 1X (Roche) y se fragmentaron mediante agitación del lecho en tubos de microcentrífuga con tapa de rosca que contenían 0.1 mm de lechos de zirconia/sílice a intervalos de 5 x 1 minutos a velocidad máxima, con períodos de descanso intercalados sobre hielo. Las células no fragmentadas y los lechos se removieron por centrifugación dos veces (8000 x g, 10 minutos, 4°C) y luego los sobrenadantes se sometieron a centrifugación de alta velocidad (125,000 x g, 30 minutos). Los concentrados resultantes se resuspendieron en 4% de SDS/PBS y se calentaron a 80°C durante 4 horas, luego se centrifugaron (200,000 x g 30 minutos). Los concentrados resultantes se lavaron 4 veces con agua MilliQ a 30°C y se centrifugaron como se mencionó anteriormente. Los concentrados se resuspendieron a continuación, en 50 mM de bicarbonato de amonio que contenía 1 pg de tripsina grado proteómica (Sigma) y se incubaron durante toda la noche con agitación a 37°C. Los péptidos se cosecharon a partir del sobrenadante después de la centrifugación (16,000 x g, 10 minutos) y la digestión se detuvo mediante la adición de ácido fórmico a una concentración final de 0.1%.

Los péptidos se separaron y analizaron por nanoLC-MS/MS utilizando un sistema de cromatografía líquida de fase reversa. La interpretación y presentación de los datos de MS/MS se realizó de conformidad con las recomendaciones publicadas, con las búsquedas realizadas utilizando el software Mascot (Matrixscience, Londres, Reino Unido), utilizando una base de datos genómica generada para 0140J de S. uberis.

El cuadro B ilustra en forma tabular las proteínas que se encuentran en un examen bioinformático del genoma de S. uberis que probablemente se anclarán por la sortasa; el genoma de S. uberis fue investigado utilizando el motivo LPXXG para supuestas proteínas ancladas a sortasa. La lista de las proteínas identificadas se redefinió mediante el uso del contexto y la posición del motivo, por ejemplo LPXXG hacia el extremo C-terminal y seguido por una región hidrófoba y residuos cargados en una posición C-terminal y la presencia de un péptido señal de secreción reconocible en el extremo N-terminal; CUADRO B Gen Motivo Comentarios adicionales putativo de anclaje SUB0145 LPXTG Proteína de unión a lactoferrina SUB0164 LPXTG Pseudogen SUB0207 LPXAG SUB0241 LPKAG 2',3'-nucleótido cíclico 2'-fosfodiesterasa SUB0337 LPATG Proteína de unión al aminoácido transportador de ABC SUB0348 LPHTG Pseudogen SUB0888 LPPTG SUB1095 LPSTG Protelna semejante a colágena SUB1730 LSPTG SUB1739 LPTTG Pseudogen Las secuencias de los péptidos trípticos se alineeron con la secuencia genómica traducida de Streptococcus uberis para identificar las proteínas presentes Las nueve proteínas listadas en el cuadro C y cuadro D se encontraron presentes en las paredes celulares preparadas a partir de 0140J de S. uberis, pero estuvieron ausentes de las preparaciones equivalentes elaboradas a partir de cultivos de la mutantes isogénicos deficientes en srtA de S. uberis, lo que demuestra que las proteínas son proteínas ancladas a sortasa.

El cuadro C lista proteínas ancladas a sortasa identificadas en los extractos de pared celular de S. uberis 0140J cultivadas en medio THB. a Gen y designación de la proteína de conformidad con la secuencia genómica de Streptococcus uberis 0140J (Ward et al 2009); b Los valores teóricos de masa molecular de los precursores de proteína obtenidos a partir de la base de datos Artemis del Wellcome Trust Sanger Institute (http://www. sanger.ac.uk/); c Número de coincidencias para péptido único para cada proteína; d Porcentaje de secuencia de proteína abarcado por los péptidos experimentalmente detectados; e 2 péptidos identificados en la fracción de pared celular de SrtA muíante. ro o en en CUADRO C Fase de crecimiento exponencial Fase en crecimiento estacionario Gen8 Designación de Anclaje Masa Evaluación No. De Cobertura Evaluación No. De Cobertura proteína putativo a molecular MASCOT péptidos (%)d MASCOT péptidos (%)d sortasa (Da)b coincidentes0 coincidentesc sub0135 Precursor putativo de la LPMTSDS 142.956 41 (1) 1.4 541 10 11.3 fuctan beta-fructosidasa sub0145 Proteina putativa de LPSTGDK 57.829 1138 15e 29.2 695 18 31.8 unión a lactoferrina sub0207 Proteina putativa de LPMAGER 53.765 39 2 5.4 117 2 5.4 anclaje a la superficie sub0826 Proteina putativa de la LPETRDS 168.468 ND ND ND 50 2 1.2 familia subtilasa de anclaje a la superficie sub0888 Proteína putativa de LPPTGSQ 29.230 105 (1) 12.9 164 2 18.0 anclaje a la superficie sub1095 Proteina putativa de LPSTGDK 47.642 59 (1) 1.7 88 2 4.3 anclaje a la superficie semejante a colágena subí 154 Precursor putativo de LPKTVDS 127.957 68 (1) 1.7 111 6 4.8 C5a peptidasa subí 370 Zinc-carboxipeptidasa LPALADG 116.563 507 7 10.6 2614 17 25.5 putativa subí 730 Proteína putativa de LPSTGED 40.439 165 2 6.8 238 4 13.6 anclaje a la superfice El cuadro D lista las proteínas ancladas a sortasa identificadas en los extractos de pared celular de S. uberis 0140J cultivadas en medio BHI. a Gen y designación de la proteína de conformidad con la secuencia genómica de Streptococcus uberis 0140J (Ward et al 2009); Los valores teóricos de masa molecular para los precursores de proteína obtenidos a partir de la base de datos Artemis del Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/);. 0 Número de coincidencias para péptido único para cada proteína; d Porcentaje de secuencia de proteína abarcado por los péptidos experimentalmente detectados; c 4 péptidos identificados en la fracción de pared celular de SrtA mutante; o n en CUADRO D Fase de crecimiento exponencial Fase en crecimiento estacionario Gen8 Designación de Anclaje Masa Evaluación No. De Cobertura Evaluación No. De Cobertur proteína putativo a molecular MASCOT péptidos (%)d MASCOT péptidos (%)d sortasa (Da)b coincidentesc coincidentesc sut>0135 Precursor putativo de LPMTSDS 142.956 286 5 5.8 1032 18 23.2 la fructan beta- fructosidasa sub0145 Proteína putativa de LPSTGDK 57.829 3047 17e 27.0 746 15 28.8 unión a lactoferrina sub0207 Proteína putativa de LPMAGER 53.765 50 (1) 2.4 163 4 11.2 anclaje a la superficie sub0888 Proteína putativa de LPPTGSQ 29.230 209 2 18.0 118 2 18.0 anclaje a la superficie subí 154 Precursor putativo de LPKTVDS 127.957 153 3 3.4 237 10 14.4 C5a peptidasa sub1370 Zinc- LPALADG 116.563 146 3 4.0 1079 12 22.3 carboxipeptidasa putativa subí 730 Proteína putativa de LPSTGED 40.439 81 O) 4.1 167 4 13.8 anclaje a la superfice La secuencia de las nueve proteínas ancladas a sortasa se proporcionan en las Figuras 3A a 31. Las Figuras 3J a 30 son las secuencias de las proteínas putativas ancladas a sortasa identificadas por la proteómica.

Detección de la proteína Subí 154 y Sub1370 en extractos de proteína de S. uberis de tipo silvestre v Srt A mutante Subí 154 recombinante y Subí 370 recombinante, dos ejemplos de proteínas ancladas a sortasa de S. uberis, se generaron a partir de ADN genómico de S. uberis amplificado y el producto se clonó en E. coli utilizando el vector pQE1 , que incorpora una marca 6 x His en el extremo N-terminal de cada proteína. La proteína recombinante se purificó utilizando la marca 6 x His y se utilizó para la producción de antisueros.

Los anti-Sub1 154 y anti-Sub1370 de conejo se utilizaron entonces para detectar las proteínas Subí 154 y Sub1370 mediante ¡nmunotransferencia de extractos de detergente y de medio de 0140J de S. uberis y SrtA mutante. Los extractos de medio a partir de los mutantes Subí 154 y Subí 370 crecidos en BHI también se probaron con los antisueros. La detección de Subí 154 se confirmó en el extracto de detergente con srtA, y también en el extracto de medio con Subí 154 mutante. En este último caso, se detectó la forma truncada pronosticada de la proteína (Figura 2A). La proteína correspondiente a Subí 370 solamente se detectó en el medio de crecimiento obtenido a partir del srtA mutante (Figura 2B). La presencia de las proteínas Subí 154 y Subí 370 solamente en los extractos a partir del srtA mutante indica que en la cepa de tipo silvestre las proteínas están ancladas a la pared celular de S. uberís por la sortasa.

EJEMPLO 2 Investigación sobre el requisito de las proteínas específicas ancladas a sortasa para la virulencia de S. uberís A raíz de la identificación de las proteínas ancladas a sortasa, cada uno de los genes que codifican estas fue mutado en la cepa de tipo silvestre. Los mutantes, cada uno careciendo de una proteína individual anclada a sortasa, fueron utilizados en un modelo de exposición en el ganado lechero para evaluar la virulencia. Las proteínas que carecen de aquellos que muestran una reducción o eliminación de virulencia están involucradas en la patogénesis/patología de la enfermedad. La inducción de una respuesta inmune neutralizante (anticuerpo) a cualquier y preferiblemente a todas estas proteínas podría resultar en una enfermedad más débil después de la infección con las cepas de tipo silvestre. Por lo tanto, las vacunas que contienen cualquiera o todas aquellas identificadas como que tienen un papel en la virulencia, serían útiles en la prevención de la mastitis en el ganado.

Metodología Producción y aislamiento de cepas mutantes de S. uberis que carecen de las proteínas ancladas a SrtA (Sub0135, Sub0145, Sub0207, Sub0241. Sub0826. Sub0888. Sub1095. subí 154. Sub1370. Sub1730) Los mutantes inactivados por inserción se encuentran dentro de un mutante de inserción al azar blanco mediante detección por PCR de un muíante blanco de 0140J pGhost9::ISS1 de S. uberis siguiendo un protocolo similar a aquel anteriormente descrito (Taylor, D. L. et al, 2003. J Bacteriol. 185: 5210-5219, Ward, P. N. et al 2001 Infecí. Immun. 69: 392-399). Brevemente, los cultivos realizados durante toda la noche a partir de placas individuales de 96 pozos se agruparon y el ADN genómico se preparó para su uso como molde en las reacciones de amplificación por PCR que contienen un iniciador específico del locus para cada gen de interés y se uíiliza en conjunción con el iniciador específico a /SS1. Después del aislamiento de la clona mutante, la escisión del vector plasmídico se promovió por el crecimienío a la temperatura permisiva (28°C) sin selección con antibiótico. La pérdida del vector pGhost9 y la retención de ISS1 fueron confirmadas por Southern bloí como se describió previamente (Ward, P. N. eí al 2001 Infect. Immun. 69: 392-399). La presencia de la inserción en el ORF apropiado se confirmó medíante amplificación por PCR del marco de lectura abierto y la secuenciación del producto resultante a través de la unión entre ISS1 y el ORF alterado.

Los intentos de aislar un muíante de inserción a partir del 0140J muíante blanco al azar con IS57 se encueníra lo suficientemente cerca del inicio de la secuencia codificanfe SUB1 154 que ha resulíado ser ineficienle. Una estrategia de deleción específica se utilizó para eliminar la producción del producto génico SUB1 154. Brevemente, dos fragmentos siíuados en cada extremo del marco de lecfura abierta de 3432 pares de bases fueron amplificados a partir del ADN genómico. Los dos fragmentos se purificaron y luego se utilizaron como molde en la misma proporción en una reacción adicional de amplificación por PCR para generar un produelo único ?1 154 que carece de 3169 pares de bases a partir de la secuencia codificante SUB1 154 de 3432 pares de bases. Este amplicón se subclonó en el sitio de clonación múltiple del plásmido sensible a temperatura pG+h9 de bajo número de copias. La construcción del plásmido se amplificó mediante la transformación de E. coli TG1 Rep A con la selección de 200 µg µl de eritromicina a 37.5°C y 10 ng del plásmido subsecuentemente purificado utilizado para transformar adicionalmente a 0140J de S. uberis con selección en 1 pg/ml de Eritromicina a 28°C. Los transformantes de S. uberis 0140J/pG+h9::A1154 se crecieron a OD5500.5 en caldo de cultivo de Todd Hewitt a 28°C, la temperatura de crecimiento se elevó a la temperatura de replicación no permisiva del plásmido 37.5°C para forzar la integración cromosómica única transversal. Los integrantes fueron seleccionados en THA que contenían Ery a 1 pg/ml a 37°C y subsecuentemente se cultivaron en THB que carecía de antibióticos a 28°C para promover la escisión del replicón pG+h9 por un segundo evento transversal. Las bacterias resultantes se sembraron sobre THA y las colonias se seleccionaron después del crecimiento durante la noche a 37°C. La deleción del locus Subí 154 se determinó mediante amplificación por PCR del locus Subí 154.

Exposición de vacas lecheras en producción con S. uberis El requisito para los sustratos SrtA individuales para la virulencia se determinó mediante la exposición experimental en un modelo de infección intramamaria bien establecido en la vaca lechera. Las bacterias se cultivaron durante 18 horas a 37°C en caldo de Todd Hewitt. Las células se recuperaron por centrifugación (10,000 x g, 10 minutos), se suspendieron en una solución salina libre de pirógenos (Sigma) y se diluyeron en la misma para proporcionar la densidad celular requerida (500-1500 ufc/ml). Las suspensiones de cada cepa se mantuvieron en hielo antes de ser utilizadas para exponer a los animales. El número de bacterias viables en alícuotas idénticas de cada suspensión se enumeró tanto antes como después de la exposición.

Las vacas lecheras, 2-10 semanas después de su primera lactación, fueron seleccionadas para la exposición. Los criterios para la selección fueron: ausencia de signos de mastitis, la ausencia de bacterias en las muestras de leche antes de la exposición, sin antecedentes de mastitis durante la lactancia en curso y sin evidencia de infección intramamaria con S. uberis en las muestras de leche tomadas a los días 7 y 14 después del parto . Los animales fueron expuestos en cuartos mamarios mediante infusión de 1 mi de solución salina libre de pirógenos (Sigma), que contenía entre 500-1500 ufe de S. uberís.

Después de la exposición, los animales se ordeñaron y se inspeccionaron dos veces al día (07:00 h y 15:30 h) por un período de 4 días. Aquellos en los cuales se alcanzaron los criterios predeterminados para los puntos terminales clínicos (leche coagulada y decolorada y/o hinchazón del cuarto de la ubre o malestar a la palpación) se trataron con antibióticos de marca propia. Las muestras de leche se tomaron en cada ordeño y se analizaron para detectar la presencia de bacterias y de células somáticas, como se describie a continuación.

Análisis de muestras de leche El número de bacterias viables presentes se estimó mediante siembra directa de 50 µ? de cada muestra de leche sobre ABA. Las muestras también se diluyeron en solución salina y 50 µ? de cada dilución se sembraron directamente sobre ABA. En cada caso, se determinó la presencia y/o el número de S. uberís y el genotipo de los aislados recuperados se determinó mediante la amplificación del locus apropiado. El número de células somáticas presentes en las muestras de leche se determinó utilizando el contador de células portátil DeLaval de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Resultados Los mutantes que carecen de uno de Sub0145, Subí 095 o Subí 154 se utilizaron para examinar los cuartos mamarios para determinar si la mutación ha resultado en una mayor atenuación de S. uberis. En todos los casos, las cepas se recuperaron a partir de leche post-exposición y cada una fue genotipificada para mostrar la presencia del gen correctamente mutado, la exposición con cepas (que carece de sub1095, sub0145 o subí 154) resultó en una colonización relativamente pobre durante la duración del experimento (Figura 4) y en contraste con la cepa de tipo silvestre, en ningún caso alguna de estas cepas fue capaz de inducir signos clínicos de la enfermedad. En consecuencia, la función de estas proteínas en la patogénesis de la infección se puede considerar esencial y no redundante. La inducción de una respuesta inmune neutralizante (anticuerpo) a cualquier y preferiblemente a todas estas proteínas se podría pronosticar que resulta en menos enfermedad después de la infección con las cepas de tipo silvestre.

Claims (32)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición inmunogénica que comprende una o más proteínas de Streptococcus uberís, o una parte inmunogénica de la misma, en donde la composición es capaz de inducir una respuesta inmune en un sujeto.

2. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las una o más proteínas de Streptococcus uberís son proteínas ancladas a sortasa, o una parte inmunogénica de las mismas.

3. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada además porque las una o más proteínas ancladas a sortasa, o las una o más proteínas de Streptococcus uberís se seleccionan del grupo que comprende las proteínas SUB0145, SUB1095 y SUB1 154 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más de homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

4. - La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque las una o más proteínas ancladas a sortasa, o las una o más proteínas de Streptococcus uberís, se seleccionan del grupo que comprende las proteínas SUB0135, SUB0145, SUB0207, SUB0826, SUB0888, SUB1095, SUB1154, SUB1370, SUB1730 y SUB0241 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más de homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

5. - La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque las una o más proteínas ancladas a sortasa, o las una o más proteínas de Streptococcus uberís, se seleccionan del grupo que comprende las proteínas SUB0135, SUB0207, SUB0826, SUB0888, SUB1095, SUB1154, SUB1370, SUB1730 y SUB0241 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más preferiblemente 80% o más de homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

6. - La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque las una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberís, es SUB 1154.

7. - La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque las una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberís, es SUB 1095.

8.- La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque las una o más de las proteínas ancladas a sortasa, o una o más de las proteínas de Streptococcus uberís, es SUB0145.

9.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición inmunogénica comprende dos o más proteínas de Streptococcus uberís, o una parte inmunogénica de las mismas.

10.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque las dos o más proteínas ancladas a sortasa, o las dos o más proteínas de Streptococcus uberís, se seleccionan del grupo que comprende las proteínas SUB0145, SUB1095 y SUB1154 o una proteína con 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, preferiblemente 80% o más de homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

1 1. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición inmunogénica comprende las proteínas SUB0145, SUB1095 y SUB1 154 o una proteína con 50% o más de homología de secuencia con una de las proteínas anteriormente mencionadas.

12. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la parte inmunogénica de la composición incluye al menos un epítope a partir de la proteína de longitud total.

13. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque el sujeto es un mamífero, opcionalmente, un rumiante.

14.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada además porque la composición inmunogénica comprende un antígeno que es una o más proteínas que están ancladas a la superficie de Streptococcus uberís por la enzima sortasa.

15.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición antigénica es capaz de inducir una respuesta inmune dirigida a un antígeno en la composición y que actúa para prevenir o reducir la infección por Streptococcus uberís en un sujeto.

16.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición comprende uno o más antígenos adicionales, además de una o más proteínas ancladas a sortasa de S. uberís, o una o más proteínas de S. uberís.

17. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición se utiliza para inducir/producir una respuesta inmune protectora en un sujeto.

18. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición se utiliza como un profiláctico o una vacuna terapéutica contra S. uberís.

19.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición comprende además un adyuvante.

20. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición comprende polímeros u otros agentes para controlar la consistencia de la composición, y/o para controlar la liberación de las proteínas a partir de la composición.

21. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque los ingredientes activos en la composición tienen más del 50% de pureza.

22. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada además porque la composición se utiliza como vacuna contra las infecciones causadas por S. uberís.

23. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la vacuna se adapta para ser administrable profilácticamente a los animales en riesgo de exposición a S. uberís, y/o terapéuticamente a los animales que ya han sido expuestos a S. uberís.

24. - La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizada además porque la composición comprende una cantidad inmunológicamente efectiva del antígeno compuesto de proteínas de S. uberís.

25. - Una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas ancladas a sortasa de S. uberís, o una o más proteínas de S. uberís, o parte de las mismas, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

26. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque comprende adicionalmente una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

27. - La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizada además porque la composición farmacéutica es capaz de producir una respuesta inmune protectora a S. uberis.

28.- El uso de una o más proteínas ancladas a sortasa de S. uberis en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune.

29. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde el medicamento es para la vacunación profiláctica o terapéutica de los sujetos contra S. uberis.

30. - El uso de una composición de las reivindicaciones 1-27, en la preparación de un medicamento para proteger a un humano o animal no humano de los efectos de la infección por S. uberis.

31. - El uso de una composición de las reivindicaciones 1 a 27, en la preparación de un medicamento para generar una respuesta inmune en un humano o animal no humano.

32.- La composición de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-27 para uso para la prevención y/o tratamiento de enfermedad causada por S. uberis.