ES2716831T3 - Composición que comprende proteínas de superficie ancladas por sortasa de Streptococcus uberis - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que comprende proteínas de superficie ancladas por sortasa de Streptococcus uberis

La presente invención se refiere a una composición inmunogénica para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria contra Streptococcus uberis y, en particular, a composiciones inmunogénicas capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora.

Streptococcus uberis (S. uberis) actualmente es responsable de aproximadamente un 20-30 % de todos los casos de mastitis en el Reino Unido y tiene una incidencia similar en todo el mundo. La mastitis sigue siendo la enfermedad infecciosa más importante desde el punto de vista económico de las vacas lecheras en todo el mundo. Se ha estimado una pérdida anual debida a la mastitis clínica en el Reino Unido de aproximadamente 170 millones de libras y de entre 1,5-2,0 billones de dólares en los Estados Unidos. Estas pérdidas pueden atribuirse a una reducción en la producción de leche, a los costes asociados de tratamiento y al sacrificio de las vacas persistentes e infectadas repetidamente. Los microorganismos que producen mastitis pueden dividirse en los que muestran una vía de transmisión contagiosa, tales como Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae y los que infectan además la ubre con frecuencia desde un depósito ambiental, tales como Escherichia coli y Streptococcus uberis. La aplicación de diversas medidas de control durante las dos últimas décadas, basadas en prácticas de ordeño mejoradas, desinfección de la ubre después del ordeño y tratamiento antimicrobiano intramamario de rutina después de cada lactación, ha resultado eficaz contra patógenos con una sola vía de transmisión contagiosa, pero tiene poco o ningún impacto sobre la incidencia de la infección de la glándula mamaria desde depósitos ambientales. El fallo del control de la mastitis bovina causada por S. uberis se atribuye en gran medida a la insuficiente información sobre la patogénesis de la infección.

La mastitis bovina, que produce inflamación de la glándula mamaria (ubre), normalmente se produce como resultado de una infección intramamaria por bacterias. Los signos de mastitis varían de acuerdo con factores en el hospedador y el patógeno invasor y la infección intramamaria puede producir una enfermedad subclínica o clínica. La mastitis subclínica, por definición, no muestra signos obvios de enfermedad. La infección asociada con la enfermedad clínica puede variar desde anomalías visibles en la leche (agregados de proteínas o coágulos) acompañadas de dolor e inflamación en la glándula afectada, hasta la producción de una secreción que está compuesta únicamente de proteína agregada en un fluido seroso. En los casos graves, puede haber signos sistémicos tales como una temperatura elevada y pérdida de apetito, que pueden evolucionar hasta bacteremia o septicemia y ocasionar la muerte del animal.

La leche de una glándula mamaria no infectada contiene leucocitos, incluyendo macrófagos, neutrófilos y linfocitos típicamente por debajo de 150.000 células/ml. La infección normalmente produce una respuesta inflamatoria localizada, caracterizada por la entrada de neutrófilos en el cuadrante infectado de la glándula mamaria y la leche. El recuento resultante de células en la leche se usa internacionalmente como medida sustituta de la infección de la glándula mamaria y como una medida de la calidad de la leche y la salud de la ubre. La leche de cuadrantes infectados subclínicamente normalmente tiene un recuento celular superior a 250.000 células/ml, pero esta cifra puede variar ampliamente. La leche de cuadrantes infectados clínicamente normalmente contiene más de 2.000.000 células/ml. La interacción entre bacterias y/o sus productos y el gran número de neutrófilos en la secreción se ha considerado la causa principal subyacente a la tasa reducida de producción de leche, degradación de la secreción y la inducción de cambios inflamatorios generalizados característicos de la mastitis.

Leigh et al. (2004) se refiere a la identificación de factores de virulencia de Streptococcus uberis que pueden ser candidatos útiles para la inclusión en una vacuna.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una o más composiciones que pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra Streptococcus uberis y, por lo tanto, prevenir o reducir la incidencia de mastitis.

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende las proteínas ancladas por sortasa de Streptococcus uberis SUB1154 que consisten en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 7, SUB1095 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 y SUB0145 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO 2, o una proteína con un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en donde la composición es capaz de inducir una respuesta inmunitaria, cuando se administra a un sujeto y en donde la composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria dirigida a un antígeno presente en la composición y actúa previniendo o reduciendo la infección por Streptococcus uberis en un sujeto al que se ha administrado la composición inmunogénica.

La referencia al porcentaje de homología se refiere al porcentaje de identidad entre dos secuencias alineadas. El porcentaje de identidad se refiere a los restos en dos proteínas que son iguales, cuando las secuencias de las proteínas están alineadas para una correspondencia máxima y cuando se tienen en cuenta inversiones y translocaciones. Preferentemente, el porcentaje de identidad ignora cualquier diferencia conservativa entre las secuencias alineadas que no afectan a la función. El porcentaje de identidad entre las secuencias alineadas puede establecerse usando herramientas bien establecidas (tales como el algoritmo BLAST - Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., (1990) J Mol Biol. 215:403-10).

Una composición inmunogénica es una composición que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno presente en la composición cuando la composición se administra a un sujeto. Preferentemente, la respuesta inmunitaria inducida es protectora. Preferentemente, el sujeto es un mamífero, más preferentemente un rumiante, tal como una vaca, oveja o cabra. El antígeno presente en la composición inmunogénica de la invención puede ser una o más proteínas que están ancladas a la superficie de Streptococcus uberis por la enzima sortasa.

La respuesta inmunitaria puede reconocer y destruir Streptococcus uberis. Como alternativa o además, la respuesta inmunitaria inducida puede impedir o prevenir la replicación de Streptococcus uberis. Como alternativa o además, la respuesta inmunitaria inducida puede impedir o prevenir la enfermedad que causa Streptococcus uberis, tal como mastitis, en el sujeto. Preferentemente, la respuesta inmunitaria inducida por la composición también es capaz de dirigirse a cepas de Streptococcus uberis distintas de las cepas de las que derivan las proteínas en la composición.

La respuesta inmunitaria generada puede ser una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos. Normalmente, una respuesta inmunitaria incluye, aunque no de forma limitativa, uno o más de los siguientes efectos, la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares, linfocitos T supresores y/o linfocitos T citotóxicos, dirigidos a dichas una o más proteínas inmunogénicas en la composición.

La composición también puede comprender uno o más antígenos adicionales, además de una o más proteínas ancladas por sortasa de S. uberis o una o más proteínas de S. uberis. Los antígenos adicionales también pueden ser capaces de inducir una respuesta inmunitaria dirigida al organismo patógeno del que derivan. Los antígenos adicionales pueden proceder de S. uberis o pueden proceder de un organismo patógeno diferente.

La composición puede usarse para inducir/producir una respuesta inmunitaria protectora cuando se administra a un sujeto. La respuesta inmunitaria protectora puede hacer que S. uberis se destruya tras la infección de un sujeto, o puede prevenir o inhibir la replicación de S. uberis y/o que produzca una enfermedad en un sujeto.

La composición puede usarse como una vacuna profiláctica o una vacuna terapéutica contra S. uberis.

También se desvela una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas ancladas por sortasa de S. uberis, o una o más proteínas de S. uberis, o parte de las mismas, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, la composición farmacéutica comprende una composición de acuerdo con cualquier aspecto de la invención.

Preferentemente, la composición farmacéutica es capaz de producir una respuesta inmunitaria protectora contra S. uberis.

La frase “producir una respuesta inmunitaria protectora”, como se usa en el presente documento, significa que la composición es capaz de generar una respuesta protectora en un organismo hospedador, tal como una vaca, a la que se administra.

Preferentemente, una respuesta inmunitaria protectora protege contra la infección posterior por S. uberis. La respuesta inmunitaria protectora puede eliminar o reducir el nivel de infección al reducir la replicación de S. uberis afectando al modo de acción de S. uberis. Preferentemente, la respuesta inmunitaria protectora reduce o previene la enfermedad causada por S. uberis.

Los excipientes y vehículos aceptables adecuados para uso en una composición farmacéutica serán bien conocidos por los expertos en la materia. Estos pueden incluir vehículos sólidos o líquidos. Los vehículos líquidos adecuados incluyen agua y solución salina. Las proteínas de la composición pueden formularse en una emulsión o pueden formularse en liposomas o microesferas biodegradables.

La composición puede comprender además un adyuvante. Los adyuvantes adecuados serán bien conocidos por los expertos en la materia y pueden incluir Adyuvante Incompleto de Freund (para uso en animales) y sales metálicas, tales como sales de aluminio o calcio.

La composición también puede comprender polímeros u otros agentes para controlar la consistencia de la composición y/o controlar la liberación de las proteínas desde la composición.

La composición también puede comprender otros agentes, tales como diluyentes, que pueden incluir agua; solución salina; glicerol u otros alcoholes adecuados, etc.; agentes humectantes o emulsionantes; agentes tamponantes; agentes espesantes, por ejemplo, celulosa o derivados de celulosa; conservantes; detergentes, agentes antimicrobianos; y similares.

Preferentemente, los principios activos en la composición tienen una pureza mayor del 50 %, normalmente una pureza mayor del 80 %, a menudo una pureza mayor del 90 % y, más preferentemente, una pureza mayor de aproximadamente el 95 %, el 98 % o el 99 %. Siendo los que se usan más a menudo los principios activos que se aproximan a una pureza del 100%, por ejemplo, una pureza de aproximadamente el 99,5% o una pureza de aproximadamente el 99,9 %.

La composición de la presente invención puede usarse como una vacuna contra infecciones causadas por S. uberis. La vacuna puede administrarse profilácticamente a animales con riesgo de exposición a S. uberis y/o terapéuticamente a animales que ya se han expuesto a S. uberis.

Preferentemente, si la composición se usa como una vacuna, la composición comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno (que comprende proteínas de S. uberis). Una “cantidad inmunológicamente eficaz” de un antígeno es una cantidad que, cuando se administra a un individuo, ya sea en una sola dosis o en una serie de dosis, es eficaz para el tratamiento o prevención de la infección por S. uberis. Esta cantidad variará dependiendo de la salud y estado físico del individuo a tratar y del antígeno. Es de esperar que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse por ensayos de rutina.

La vía de administración de la composición puede variar dependiendo de la formulación de las proteínas en la composición. La composición puede disponerse para administrarse por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramamaria. Como alternativa, la composición puede disponerse para administrarse por vía parenteral, tal como mediante administración intranasal, oral, bucal, por inhalación, epidérmica, transcutánea, tópica, vaginal o rectal.

La composición puede disponerse para administrarse como una sola dosis o como parte de un programa de múltiples dosis. Las múltiples dosis pueden administrarse como una inmunización primaria seguida de una o más inmunizaciones de refuerzo. El periodo de tiempo adecuado entre las inmunizaciones de presentación y de refuerzo puede determinarse de una manera de rutina.

Las composiciones de la invención pueden inducir una respuesta de anticuerpo bactericida en suero después de administrarse a un sujeto. Estas respuestas se miden convenientemente en ratones y los resultados son un indicador convencional de la eficacia de la vacuna.

Las composiciones de la invención pueden ser también, o como alternativa, capaces de inducir una respuesta inmunitaria que produce proteínas en las células hospedadoras para defender contra la infección por S. uberis, sin necesidad de destruir las bacterias.

De acuerdo con aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de proteínas ancladas por sortasa de Streptococcus uberis SUB1154 (que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 7), SUB1095 (que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8) y SUB0145 (que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 2), o una proteína con un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria y prevenir o reducir la infección por Streptococcus uberis en un sujeto al que se le ha administrado el medicamento, en donde el medicamento se usa para la vacunación profiláctica o terapéutica de sujetos contra S. uberis.

Los usos y composiciones de la invención preferentemente son para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por S. uberis.

El experto en la materia apreciará que cualquiera de las características preferibles analizadas anteriormente pueden aplicarse a cualquiera de los aspectos de la invención.

A continuación se describirán realizaciones preferidas de la presente invención, meramente a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.

En las figuras y ejemplos que se proporcionan más adelante, las referencias a las proteínas ancladas por sortasa de S. uberis SUB1154, SUB1095 y Su B0145 forman parte de la invención; la referencia a otras proteínas ancladas por sortasa de S. uberis se citan solo por referencia.

Las figuras 1A, B y C - muestran los resultados del aislamiento de bacterias, el recuento de células somáticas y la respuesta clínica después de la exposición a S. uberis 0140J de tipo silvestre y un mutante de S. uberis Srt en vacas lecheras. La figura 1(A) muestra la recuperación bacteriana de S. uberis después de la exposición. Los datos se representan como las medias geométricas del número de bacterias obtenidas a partir de la leche de animales expuestos a la cepa 0140J (cuadrados; n = 4) o el mutante SrtA (triángulos; n = 8). La figura 1 (B) ilustra la respuesta inflamatoria después de la exposición al tipo silvestre y al mutante Srt de S. uberis. Los datos se representan por las medias geométricas del número de células somáticas obtenidas a partir de la leche de animales expuestos a la cepa 0140J (cuadrados; n = 4) o el mutante SrtA (triángulos; n = 8). La figura 1 (C) ilustra las puntuaciones clínicas combinadas de manifestaciones clínicas después de la exposición al tipo silvestre y al mutante Srt de S. uberis. Los datos se representan por la media de puntuaciones clínicas dadas para el aspecto del cuadrante y el aspecto de la leche, como se indica en la figura 2 con la cepa 0140J (cuadrados; n = 4) o el mutante SrtA (triángulos; n = 8);

Figura 2 - ilustra en forma de tabla la manifestación de una respuesta clínica a la infección por Streptococcus uberis. Todos los cuadrantes y muestras de leche se analizaron frente a estos criterios en cada ordeño después de la exposición;

Figura 3 - ilustra en forma de tabla las proteínas encontradas mediante examen bioinformático del genoma de S. uberis que probablemente se anclan mediante sortasa; Se sometió a búsqueda el genoma de S. uberis usando el motivo LPXXG para las supuestas proteínas ancladas por sortasa. La lista de proteínas identificadas se refinó usando el contexto y la posición del motivo, es decir, LPXXG hacia el extremo C y seguido de una región hidrófoba y restos cargados en una posición C terminal y la presencia de un péptido señal de secreción reconocible en el extremo N;

La figura 4A: presenta un listado de proteínas ancladas por sortasa identificadas en extractos de la pared celular de S. uberis 0140J cultivada en medio THB. a Gen y comentario de la proteína de acuerdo con la secuencia genómica de Streptococcus uberis 0140J (Ward et al 2009); b Valores de masa molecular teórica de precursores de proteína obtenidos a partir de la base de datos de Artemis del Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/); c Número de aciertos de péptido único para cada proteína; d Porcentaje de secuencia de proteína cubierta por péptidos detectados experimentalmente; e 2 péptidos identificados en la fracción de pared celular del mutante SrtA. La figura 4B: presenta un listado de proteínas ancladas por sortasa identificadas en extractos de la pared celular de S. uberis 0140J cultivada en medio BHI. a Gen y comentario de la proteína de acuerdo con la secuencia genómica de Streptococcus uberis 0140J (Ward et al 2009); b Valores de masa molecular teórica de precursores de proteína obtenidos a partir de la base de datos de Artemis del Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/); c Número de aciertos de péptido único para cada proteína; d Porcentaje de secuencia de proteína cubierta por péptidos detectados experimentalmente; e4 péptidos identificados en la fracción de pared celular del mutante SrtA;

Las figuras 5A y 5B - muestran la identificación de Sub1154 y Sub 1370 de extractos de Streptococcus uberis 0140J y el mutante srtA. Figura 5A - se usó antisuero de conejo contra Sub1154 para sondar manchas de inmunotransferencia de extractos de proteínas con detergente de 0140J (calle 2) y el mutante SrtA (calle 3), y de medios concentrados y precipitados de 0140J (calle 4), mutante SrtA (calle 5) y mutante Sub1154 (calle 6). Los patrones del peso molecular se muestran en la calle 1. Figura 5B - se usó antisuero de conejo contra Sub1370 para sondar manchas de inmunotransferencia de extractos de proteínas con detergente de 0140J (calle 1) y el mutante SrtA (calle 2), y de medios concentrados y precipitados de 0140J (calle 3), mutante SrtA (calle 4) y mutante Sub1370 (calle 5). Los patrones del peso molecular se muestran en la calle 6;

Las figuras 6A a 6O - son las secuencias de aminoácidos de proteínas ancladas por sortasa de S. uberis;

La figura 6A es la secuencia de SUB1370 (Seq ID No: 1) una cinc carboxipeptidasa;

La figura 6B es la secuencia de SUB0145 (Seq ID No: 2) una proteína de unión a lactoferrina;

La figura 6C es la secuencia de SUB0135 (Seq ID No: 3) un precursor de frucano beta fructosidasa;

La figura 6D es la secuencia de SUB1730 (Seq ID No: 4);

La figura 6E es la secuencia de SUB0888 (Seq ID No: 5);

La figura 6F es la secuencia de SUB0207 (Seq ID No: 6);

La figura 6G es la secuencia de SUB1154 (Seq ID No: 7) una serina proteasa de tipo subtilina;

La figura 6H es la secuencia de SUB1095 (Seq ID No: 8) una proteína de tipo colágeno;

La figura 6I es la secuencia de SUB0826 (Seq ID No: 9) una supuesta subtilasa anclada a la superficie;

La figura 6J es la secuencia de SUB0164 (Seq ID No: 10) una supuesta proteína de unión a fibronectina anclada a la superficie y truncada (pero se codifica por un probable pseudogén);

La figura 6K es la secuencia de SUB0348 (Seq ID No: 11) un vestigio de una supuesta proteína de tipo colágeno (pero se codifica por un pseudogén);

La figura 6L es la secuencia de SUB1739 (Seq ID No: 12) una supuesta proteína anclada a la superficie (pero se codifica por un pseudogén);

La figura 6M es la secuencia de SUB0206 (Seq ID No: 13) una supuesta proteína exportada de función desconocida;

La figura 6N es la secuencia de SUB0241 (Seq ID No: 14) una supuesta proteína anclada a la superficie de función desconocida;

La figura 6O es la secuencia de SUB0337 (Seq ID No: 15) una supuesta proteína de unión a glutamina localizada en la superficie;

La figura 7 muestra la colonización bacteriana después de la exposición con el tipo silvestre (0140J) y cepas mutantes atenuadas que carecen de sub0145, sub1095 o sub1154. Los datos se expresan como medias geométricas de Log-iü ufc/ml detectadas en muestras de leche obtenidas en cada ordeño después de la exposición experimental.

Los datos presentados más adelante demuestran que proteínas ancladas a la superficie de S. uberis mediante sortasa, una transamidasa, son importantes en virulencia y además describen que algunas de estas proteínas (por ejemplo, sub1095, sub1154 y sub0145) son esenciales para la virulencia y, por lo tanto, es necesario que sean funcionales para que esta bacteria produzca la enfermedad. Las proteínas son buenos inmunógenos. Es probable que las respuestas inmunitarias contra estas proteínas en forma de anticuerpos anulen su función, por lo tanto, la proteína identificada podría ser útil como inclusiones dentro de composiciones inmunogénicas destinadas a reducir o prevenir la infección o enfermedades causadas por S. uberis.

Ejemplo 1: Producción y evaluación de un mutante SrtA de S. uberis.

Métodos y Materiales

Cepas Bacterianas y Reactivos.

A lo largo de todo el estudio se usó la cepa 0140J de Streptococcus uberis, aislada originalmente de un caso clínico de mastitis bovina en el Reino Unido. La bacteria se cultivó del modo de rutina en caldo Todd Hewitt o en caldo de infusión cerebro corazón.

Se produjo leche desnatada a partir de leche bovina de partida recogida asépticamente a partir de varias vacas lecheras del rebaño de vacas lecheras en el Instituto de Salud Animal. Se recogió leche de animales que estaban libres de infección intramamaria. Después de la centrifugación (3.000 x g, 10 min); se separó cuidadosamente la leche desnatada de la capa de grasa superior y del precipitado de células sedimentadas. La esterilidad de la leche desnatada se determinó mediante el cultivo en placas de 500 pl de leche directamente sobre agar sangre que contenía esculina (1,0 %, p/v; ABA) y mediante un cultivo de enriquecimiento de 5 ml de leche en un volumen igual de caldo Todd Hewitt seguido por aislamiento de colonias individuales en ABA. En ambos casos, las placas se incubaron a 37 °C durante 18 h. La leche desnatada se almacenó a 4 °C y se usó antes de que hubieran transcurrido 72 h.

Otras cepas bacterianas y reactivos se usaron como se describe en el texto.

Aislamiento del mutante srtA por selección genotípica.

El mutante srtA (Sub0881) se aisló después de la exploración por PCR de un banco de mutantes de S. uberis 0140J pGhost9::ISS1 siguiendo un protocolo similar al descrito previamente (Taylor, D. L. et al, 2003. J Bacteriol 185:5210-5219; Ward, P. N. et al 2001 Infect Immun 69:392-399). En resumen, se reunieron cultivos de una noche de placas de 96 pocillos individuales y se preparó ADN genómico para usarse como molde en reacciones de amplificación por PCR que contenían un cebador específico de locus, p261 (srtA) y un cebador específico de ISS1, P247 o P250. La amplificación se realizó usando treinta y cinco ciclos (95 °C durante 20 s, 54 °C durante 1 min y 72 °C durante 3 min) y se realizó con la mezcla maestra AmpliTaq Gold (ABI). Los productos se visualizaron después de electroforesis en gel, tinción con bromuro de etidio y transiluminación con luz UV. Después de la identificación de la placa, se identificó de manera similar un sitio del pocillo usando ADN genómico reunido de las columnas y filas de la placa diana. Después del aislamiento del clon mutante, se promovió la escisión del vector plasmídico mediante cultivo a la temperatura permisiva (28 °C) sin selección con antibiótico. La pérdida del vector pGhost9 y la retención de ISS1 se confirmaron por transferencia de Southern como se ha descrito previamente (Ward, P. N. et al 2001 Infect Immun 69:392-399). La presencia de la inserción en srtA se confirmó por amplificación por PCR del marco de lectura abierto y secuenciación del producto resultante a través de la unión entre ISS1 y el ORF alterado. Los cebadores de PCR usados se muestran en la Tabla 1 mostrada a continuación:

Tabla 1: Cebadores de PCR. P247 ISS1 dir (SEQ ID NO: 16); P250 ISS1 inv (SEQ ID NO: 17); P261 (SEQ ID NO: 18); P409 (SEQ ID NO: 19); P410 (SEQ ID NO: 20); P615 (SEQ ID NO: 21); P630 (SEQ ID NO: 22); P480 (SEQ ID NO: 23); P481 (SEQ ID NO: 24); P621 (SEQ ID NO: 25).

Extracción de ADN cromosómico de S. uberis

Se preparó ADN genómico usando una variación del método de Hill y Leigh como se ha descrito previamente (Hill, A. W. et al 1994 FEMS Immunol Med Microbiol 8:109-117). En resumen, se centrifugaron 1,5 ml de un cultivo de una noche a 10.000 x g durante 2 minutos y el sedimento celular se lavó con 500 j l de Tris-Cl 10 mM, EDTA 5 mM, pH 7,8. Las paredes de las células bacterianas se rompieron por resuspensión en 375 j l de Tris-Cl 10 mM, EDTA 5 mM pH 7,8 que contenía 30 unidades/ml de mutanolisina y 10 mg/ml de lisozima (ambas de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos) y posterior incubación a 37 °C durante 30 minutos. La lisis celular total se consiguió mediante la adición de 20 j l de solución de SDS (20 % p/v en Tris-Cl 50 mM, EDTA 20 mM, pH 7,8) y Proteinasa K (Sigma) a una concentración final de 150 μg/ml y una incubación adicional a 37 °C durante 1 h. El material de la pared celular se retiró por precipitación después de la adición de 200 j l de NaCl saturado y la posterior centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se extrajo con fenol cloroformo y el ADN se precipitó mediante la adición de 2 volúmenes de etanol absoluto. Los sedimentos de ADN se lavaron con etanol acuoso al 70 % y se secaron al aire antes de la resuspensión en tampón TE que contenía 20 μg/ml de ARNasa-A (Sigma).

Exposición de vacas lecheras en lactación a S. uberis 0140J y al mutante SrtA

El papel de SrtA en la patogénesis de la infección se determinó por comparación de la virulencia de la cepa 0140J y el mutante que carecía de SrtA (mutante srtA) en un modelo de infección intramamaria en vacas lecheras. Se cultivaron bacterias durante 18 h a 37 °C en caldo Todd Hewitt. Las células se recuperaron por centrifugación (10.000 x g, 10 min), se suspendieron en solución salina sin pirógenos (Sigma) y se diluyeron en la misma para proporcionar la densidad celular requerida. Se mantuvieron en hielo suspensiones de cada cepa antes de usarse para la exposición de los animales. Tanto antes como después de la exposición se contó el número de bacterias viables en alícuotas idénticas de cada suspensión.

Para la exposición, se seleccionaron seis vacas lecheras, en las 2-10 semanas de su primera lactación, del rebaño de vacas lecheras del instituto. Los criterios de selección fueron: ausencia de signos de mastitis, ausencia de bacterias en muestras de leche antes de la exposición, sin historia de mastitis durante la presente lactación y sin indicios de infección intramamaria en muestras de leche tomadas 7 y 14 días después del parto. Los animales se expusieron en cuadrantes mamarios por infusión de 1 ml de solución salina sin pirógenos (Sigma) que contenía S. uberis. Dos animales se expusieron en un total de cuatro cuadrantes con 6,0 x102 ufc de cepa 0140J y cuatro animales más se expusieron en un total de ocho cuadrantes con una dosis similar del mutante srtA. Después de la exposición, se ordeñó a los animales y se inspeccionaron dos veces al día (07:00 h y 15:30 h) y aquellos en los que se alcanzaron criterios predeterminados para puntos de valoración clínicos (leche coagulada y decolorada y/o cuadrante de ubre inflamado o con molestias cuando se palpa) se trataron con antibióticos de marca comercial en consonancia con los criterios prescritos indicados en la figura 2. Se tomaron muestras de leche y se analizaron con respecto a las bacterias y células somáticas, como se describe más adelante.

Análisis de muestras de leche

El número de bacterias viables presentes se estimó mediante cultivo directo en placas de 1 ml y 100 |jl de cada muestra de leche en ABA. Las muestras también se diluyeron en solución salina y se cultivaron en placas directamente 50 j l de cada dilución en ABA. En cada caso, se determinó la presencia y/o número de S. uberis y el genotipo de los aislados recuperados se determinó mediante comparación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de a Dn cromosómico y amplificación del locus de srtA, como se describe más adelante. El número de células somáticas presentes en las muestras de leche se determinó usando un contador coulter (Beckman Coulter, Ltd).

Preparación de proteínas a partir de medio de crecimiento bacteriano por precipitación con metanolcloroformo

Se dejaron crecer bacterias en BHI (200 ml) con cultivos desarrollados hasta una DO600nm de aproximadamente 0,5 y se recogieron por centrifugación (16.000 x g, 20 min, 4 °C) y el medio de crecimiento bacteriano se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 jM (Millipore). Después de la adición de inhibidor de proteasa completo (Roche) a una concentración 1X, el medio de crecimiento bacteriano se concentró aproximadamente 100 veces usando dispositivos de filtración centrífuga Amicon (Millipore) con una exclusión de peso molecular de 10 kDa. Para precipitar las proteínas, se añadieron 600 j l de metanol y 150 j l de cloroformo (ambos de BDH) a 200 j l de medio de crecimiento bacteriano concentrado. La preparación se agitó con vórtice y se añadieron 450 j l de agua MilliQ antes de la centrifugación (16.000 x g, 1 min). La fase superior se retiró cuidadosamente y se desechó y se añadieron 450 j l de metanol al material restante que agitó con vórtice y se centrifugó (16.000 x g, 2 min). El sobrenadante se desechó y el sedimento restante se secó al aire antes de la resuspensión en tampón de carga de SDS.

Extracción de proteínas no ancladas con detergente

Los sedimentos bacterianos de los cultivos anteriores se lavaron 3 veces en 40 ml de PBS y se resuspendieron en 500 j l de PBS que contenía hialuronidasa (100 U/ml, Sigma-Aldrich). Las células se incubaron durante 2 horas a 37 °C y el material capsular hidrolizado se retiró por centrifugación (8000 x g, 6 min, 4 °C). Las células se lavaron 3 veces en 40 ml de p Bs y se resuspendieron en 200 j l de NonIdet P-40 (NP-40) al 0,1 % (v/v) en PBS. El extracto de detergente se recogió después de retirar las células bacterianas por centrifugación (16.000 x g, 10 min, 4 °C).

Producción y purificación de proteínas Sub1154 y Sub 1370 recombinantes

Se diseñaron cebadores p409 y p410 (véase la tabla anterior) para amplificar a partir del ADN genómico de S. uberis 0140J la secuencia codificante madura predicha (es decir, que carece de la secuencia señal N-terminal) de Sub1154, un supuesto sustrato de srtA con homología con la serina proteasa de tipo subtilasa. Se generó un amplicón de 3,4 kb usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (New England Biolabs), se purificó usando un kit de purificación por PCR MinElute (Qiagen) y se trató con Kpnl (New England Biolabs) para facilitar la clonación direccional. El plásmido pQE1 (Qiagen) se preparó usando PvulI, Kpnl y fosfatasa Antarctic (todas de New England Biolabs) y la construcción se ligó (ADN Ligasa de T4, New England Biolabs) durante una noche a 20 °C de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se desalificaron veinte microlitros de la mezcla de ligamiento usando el método de Atrazhev y Elliott (Atrazhev, A. M., y J. F. Elliott. 1996 Biotechniques 21:1024). Se utilizaron aproximadamente 10 ng de la mezcla de ligamiento desalificada para transformar Escherichia coli M15 pREP4 (Qiagen) y se seleccionaron clones recombinantes en placas de agar LB Kan 25 μg/ml Amp 50 μg/ml. Se purificó proteína Sub1154 (etiqueta 6 x His) recombinante comenzando en el resto Asp34 por dilución (1/30) de cultivo de una noche en 1600 ml de caldo LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina y 25 μg/ml de kanamicina y se cultivó a 20 °C sin agitación durante 2 h. Se preparó Sub1370 recombinante de forma similar, pero usando los cebadores P480 y P481, y se cultivó de manera similar en 800 ml de medio de cultivo. Se indujo la expresión de proteínas añadiendo lpTG a una concentración final de 0,2 mM. Los cultivos se incubaron durante 2-4 h más y después se centrifugaron a 8.000 x g durante 20 min para recoger las células bacterianas. Se purificaron aproximadamente 0,3 mg y 1 mg de proteínas solubles Sub1370 y Sub1154 con etiqueta 6 x His, respectivamente, en presencia de inhibidores de proteasa (Complete-EDTA free; Roche) usando cartuchos de alto flujo CelLytic y HisSelect (ambos de Sigma) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Producción de antisuero de Sub1154 y Sub1370 en ratones e inmunotransferencia

Se suministraron cinco alícuotas de aproximadamente 50 jg de proteínas Sub1154 y Sub1370 recombinantes purificadas liofilizadas a Davids Biotechnologie (Alemania) para la producción de sueño en conejos. Se suministró antisuero (50 ml) esterilizado por filtración y que contenía un 0,02 % de azida sódica como conservante.

Se separaron extractos de medio y detergente de cultivos de S. uberis de tipo silvestre y un mutante SrtA en geles de dodecilsulfato sólido y poliacrilamida al 10 % (SDS-PAGE) y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham) para la inmunodetección o, como alternativa, se tiñeron con Coomassie usando InstantBlue (Novexin). La transferencia se realizó a 170 mA durante 1 h en un aparato Transblot (Biorad) en tampón de transferencia que consistía en base Tris 25 mM, glicina 192 mM y metanol al 20 % (v/v), pH 8,1-8,4. Después de la transferencia, las membranas se incubaron en una solución de bloqueo de leche desnatada en polvo al 1 % en PBS a 4 °C durante una noche. Las membranas se lavaron tres veces durante 5 min en PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % (PBST) y después se incubaron con antisuero de conejo a una dilución 1/12.000 para el antisuero de Sub1154 y una dilución de 1/16.000 para el antisuero de Sub1370 en solución de bloqueo durante 1 hora. Las membranas se lavaron tres veces durante 5 min en PBST y después se incubaron con inmunoglobulina G de cabra anti-conejo conjugada con HRP a una dilución de 1/1.000 (Southern Biotech) durante 1 hora. Las membranas se lavaron de nuevo como se ha indicado anteriormente y se detectó el conjugado con HRP usando una solución de 4-cloronaftol (0,5 mg/ml) en PBS que contenía un 16,7 % de metanol y un 0,00015 % (v/v) de H2O2, se incubó durante 1 hora en la oscuridad, antes de lavar las membranas en PBS y de dejarlas secar.

Aislamiento y caracterización genética de mutante srtA

El análisis del genoma completo de S. uberis 0140J confirmó la presencia de un solo homólogo de sortasa, sortasa A (srtA) (Ward, P.N. et al (presentado en 2008) BMC Genomics). Se aisló un clon mutante con el elemento ISSf insertado entre los pares de bases 248 y 249 de, y en orientación inversa a, la secuencia codificante de sortasa. El producto de traducción de este gen de srtA mutado consistía en los primeros 82 restos de los 252 aminoácidos codificados en el ORF de srtA junto con 18 restos más en el elemento ISSí antes de alcanzar un codón de terminación.

Infectividad y virulencia de S. uberis de tipo silvestre y mutante srtA después de la exposición experimental en la glándula mamaria bovina.

La infectividad y virulencia del mutante srtA, en comparación con la cepa de tipo silvestre, se determinó por exposición de la glándula mamaria bovina de varias vacas lecheras. Todos los cuadrantes expuestos de animales que recibieron 600 ufc de S. uberis de tipo silvestre se infectaron y propagaron las bacterias a aproximadamente 106 a 107 ufc/ml a las 48 - 60 h después de la exposición (figura 1A). Después de la exposición de ocho cuadrantes en cuatro animales con una dosis similar del mutante srtA, todos mostraron evidencia de infección y el mutante srtA se detectó en leche a niveles similares a los del tipo silvestre durante hasta 24 h después de la exposición. Sin embargo, posteriormente la colonización bacteriana se redujo, desde un máximo de 104 ufc/ml de leche a las 24 h después de la exposición, de tal manera que al final del experimento (7 días después de la exposición) el número medio de bacterias presentes era de aproximadamente 10 ufc/ml (figura 1B). En este momento solo dos de los ocho cuadrantes continuaban propagando bacterias, habiendo eliminado el resto la infección (< 1 ufc/ml de leche).

La infiltración celular en la glándula mamaria en respuesta a la infección fue idéntica en los dos grupos de animales y no fue dependiente de la cepa de exposición. En cada caso, fue similar a la notificada previamente en este modelo y alcanzó un máximo de aproximadamente 107 células/ml de leche a las 48-60 h después de la exposición. En animales expuestos con la cepa de tipo silvestre, esto coincidió con la aparición de signos clínicos agudos de mastitis (figura 2 y figura 1C) que requirieron la administración de terapia con antibióticos para eliminar la infección y aliviar los signos de la enfermedad. En un marcado contraste, los animales que recibieron el mutante srtA mostraron pocos o ningún signo de mastitis (figura 2 y figura 1C).

Los resultados presentados en la figura 1 demuestran que S. uberis requiere la proteína sortasa, codificada por srtA, para la expresión completa de virulencia por esta bacteria. Aunque inicialmente era capaz de colonizar la glándula mamaria bovina de manera similar a S. uberis de tipo silvestre, el mutante que carece de SrtA no podía colonizar la glándula a altos niveles; siendo los números máximos de bacterias aproximadamente 1000 veces menores que los detectados en leche de animales expuestos con la cepa de tipo silvestre. Esto corresponde a la incapacidad del mutante srtA de inducir signos clínicos progresivos de enfermedad.

Se entiende que srtA ancla una o más proteínas a la superficie de la bacteria que son responsables de la virulencia, es decir, del alto nivel de colonización y/o inducción de reacciones inflamatorias severas asociadas con la enfermedad clínica.

Detección de proteínas ancladas a sortasa en S. uberis

Para identificar proteínas ancladas a la pared celular de S. uberis por sortasa, se compararon las proteínas de la pared celular de S. uberis de tipo silvestre con las de un mutante SrtA de S. uberis.

La metodología usada para aislar péptidos trípticos de proteínas de la pared celular ancladas es la siguiente. Se dejaron crecer cultivos bacterianos en THB o BHI tanto hasta la fase exponencial como hasta la fase estacionaria de crecimiento. Los cultivos exponenciales se dejaron crecer en 1,5 litros de caldo hasta una densidad óptica de 0,6 a DO550nm, mientras que los cultivos de fase estacionaria se dejaron crecer en 1 litro de caldo durante una noche. Se recogieron sedimentos de células bacterianas por centrifugación (16.000 x g, 10 min, 4 °C) y se lavaron consecutivamente con PBS, Nonidet P40 (NP40) al 0,1 % (v/v) en PBS y PBS y se recogieron por centrifugación como se ha indicado anteriormente. Los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS que contenía inhibidores de proteasa IX Complete (Roche) y se rompieron mediante batido con microesferas en tubos de microcentrífuga tapados a rosca que contenían microesferas de 0,1 mm de circonio/sílice a 5 intervalos de 1 min a máxima velocidad, con periodos de reposo entre medias en hielo. Las células no rotas y las microesferas se retiraron por centrifugación dos veces (8.000 x g, 10 min, 4 °C) y los sobrenadantes después se sometieron a centrifugación de alta velocidad (125.000 x g, 30 min). Los sedimentos resultantes se resuspendieron en SDS/PBS al 4 % y se calentaron a 80 °C durante 4 horas y después se centrifugaron (200.000 x g 30 min). Los sedimentos resultantes se lavaron 4 veces con agua MilliQ a 30 °C y se centrifugaron como anteriormente. Después, los sedimentos se resuspendieron en bicarbonato amónico 50 mM que contenía 1 |jg de tripsina de calidad de proteómica (Sigma) y se incubaron con agitación durante una noche a 37 °C. Se recogieron péptidos del sobrenadante después de la centrifugación (16.000 x g, 10 min) y la digestión se detuvo mediante la adición de ácido fórmico a una concentración final del 0,1 %.

Los péptidos se separaron y se analizaron por nanoLC-MS/MS usando un sistema de cromatografía líquida de fase inversa. La interpretación y presentación de los datos de MS/MS se realizó de acuerdo con guías publicadas, realizándose las búsquedas usando el software Mascot (Matrixscience, Londres, Reino Unido) usando una base de datos genómicos generada para S. uberis 0140J.

Las secuencias de los péptidos trípticos se alinearon con la secuencia genómica traducida de Streptococcus uberis para identificar las proteínas presentes.

Se observó que las nueve proteínas presentadas en las figuras 4 y B estaban presentes en las paredes celulares preparadas a partir de S. uberis 0140J, pero estaban ausentes de preparaciones equivalentes fabricadas a partir de cultivos del mutante deficiente en srtA isogénico de S. uberis, lo que demuestra que las proteínas son proteínas ancladas por sortasa.

La secuencia de las nueve proteínas ancladas por sortasa se proporcionan en las figuras 6A a 6I. Las figuras 6J a 6O son las secuencias de las supuestas proteínas ancladas por sortasa identificadas por proteómica.

Detección de proteína Sub1154 y Sub1370 en extractos de proteína de S. uberis de tipo silvestre y mutante Srt A

Se generaron Sub1154 recombinante y Sub1370 recombinante, dos ejemplos de proteínas ancladas por sortasa de S. uberis, ambas a partir de ADN genómico amplificado de S. uberis y el producto se clonó en E. coli usando el vector pQE1, que incorporó una etiqueta de 6 x His en el extremo N de cada proteína. La proteína recombinante se purificó utilizando la etiqueta de 6 x His y se usó para la producción de antisuero.

Después se usaron anti-Sub1154 y anti-Sub1370 de conejo para detectar las proteínas Sub1154 y Sub1370 por inmunotransferencia de extractos de medio y detergente de S. uberis 0140J y el mutante srtA. También se sondaron con el antisuero extractos de medio de mutantes de Sub1154 y Sub1370 cultivados en BHI. La detección de Sub1154 se confirmó en el extracto de detergente de srtA y también en el extracto del medio del mutante de Sub1154. En este último caso se detectó la forma truncada predicha de la proteína (figura 5A). La proteína correspondiente a Sub1370 se detectó solo en el medio de crecimiento obtenido del mutante srtA (figura 5B). La presencia de las proteínas Sub1154 y Sub1370 únicamente en extractos del mutante srtA indica que, en la cepa de tipo silvestre, las proteínas se anclan a la pared celular de S. uberis por la sortasa.

Ejemplo 2: investigación del requisito de proteínas ancladas por sortasa específicas para la virulencia de S. uberis

Continuando con la identificación de proteínas ancladas por sortasa, cada uno de los genes que las codificaban se introdujo dentro de la cepa de tipo silvestre por mutación. Los mutantes, de los que cada uno carecía de una proteína anclada por sortasa individual, se usaron en un modelo de exposición en vacas lecheras para evaluar la virulencia. Las proteínas ausentes de los animales que mostraban virulencia reducida o no mostraban virulencia están implicadas en la patogénesis/patología de la enfermedad. La inducción de una respuesta inmunitaria neutralizadora (anticuerpos) contra cualquiera de, y preferentemente todas, estas proteínas, disminuiría la enfermedad después de la infección con cepas de tipo silvestre. Por lo tanto, serían útiles en la prevención de la mastitis en vacas vacunas que contuvieran cualquiera o todas las proteínas identificadas como implicadas en la virulencia.

Metodología

Producción y aislamiento de cepas mutantes de S. uberis que carecen de proteínas ancladas por SrtA (Sub 0135, Sub 0145, Sub0207, Sub0241, Sub 0826, Sub0888, Sub1095, Sub1154, Sub1370, Sub1730)

Se pusieron mutantes de inserción inactivados dentro de un banco de mutantes de inserción aleatorios por exploración por PCR de un banco de mutantes de S. uberis 0140J pGhost9::ISS1 siguiendo un protocolo similar al descrito previamente (Taylor, D. L. et al, 2003. J Bacteriol 185:5210-5219; Ward, P. N. et al 2001 Infect Immun 69:392-399). En resumen, se reunieron cultivos de una noche de placas de 96 pocillos individuales y se preparó ADN genómico para usarse como molde en reacciones de amplificación por PCR que contenían un cebador específico de locus para cada gen de interés y se usaron junto con un cebador específico para ISS1. Después del aislamiento del clon mutante, se promovió la escisión del vector plasmídico mediante cultivo a la temperatura permisiva (28 °C) sin selección con antibiótico. La pérdida del vector pGhost9 y la retención de ISS1 se confirmaron por transferencia de Southern como se ha descrito previamente (Ward, P. N. et al 2001 Infect Immun 69:392-399). La presencia de la inserción en el ORF apropiado se confirmó por amplificación por PCR del marco de lectura abierto y secuenciación del producto resultante a través de la unión entre ISS1 y el ORF alterado.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende las proteínas ancladas por sortasa de Streptococcus uberis SUB1154 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 7, SUB1095 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 y SUB0145 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 2, o una proteína con un 95 % o más identidad de secuencia con la misma, en donde la composición es capaz de inducir una respuesta inmunitaria, cuando se administra a un sujeto y en donde la composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria dirigida a un antígeno presente en la composición y actúa previniendo o reduciendo la infección por Streptococcus uberis en un sujeto al que se ha administrado la composición inmunogénica.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 en donde el sujeto es un mamífero, opcionalmente un rumiante.

3. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición comprende uno o más antígenos adicionales, además de proteínas ancladas por sortasa de S. uberis.

4. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición es una vacuna profiláctica o terapéutica contra S. uberis.

5. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición comprende además un adyuvante.

6. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición comprende polímeros u otros agentes para controlar la consistencia de la composición y/o para controlar la liberación de las proteínas de la composición.

7. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, en donde los principios activos en la composición tienen una pureza mayor del 50 %.

8. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior que es una composición farmacéutica que comprende tres proteínas ancladas por sortasa de S. uberis, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Uso de proteínas ancladas por sortasa de Streptococcus uberis SUB1154 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 7, SUB1095 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 y SUB0145 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO 2, o una proteína con un 95 % o más de identidad de secuencia con la misma, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria y prevenir o reducir la infección por Streptococcus uberis en un sujeto al que se le ha administrado el medicamento, en donde el medicamento se usa para la vacunación profiláctica o terapéutica de sujetos contra S. uberis.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por S. uberis.