ES2241352T3 - Proteinas superficiales externas, sus genes, y su utilizacion. - Google Patents

Proteinas superficiales externas, sus genes, y su utilizacion.

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Joseph D. Microscience Limited SANTANGELO
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Robert Microscience Limited FELDMAN
Joanne C. Microscience Limited MOORE
Paul Everest
Richard J. Microscience Limited DOBSON
Caroline Joanne Henwood
Gordon ICSTM Dept. of Biochemistry DOUGAN
Rebecca Kerry Wilson
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Abstract

Péptido que comprende la secuencia aminoácida que se identifica en la presente memoria como SEC ID nº 12, que puede obtenerse a partir del Streptococcus del Grupo B, o un homólogo del mismo con una similitud superior al 80% al nivel de aminoácido, o un fragmento funcional del mismo que conserva la capacidad de provocar una respuesta inmune contra el péptido entero, para utilización terapéutica.

Description

Proteínas superficiales externas, sus genes, y su utilización.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la identificación de una proteína superficial externa y su gen, que resulta útil en terapia, en la inmunización y en el rastreo de fármacos.
Antecedentes de la invención
El Streptococcus del grupo B (GBS), también conocido como Streptococcus agalactiae, es el agente que causa varias afecciones patológicas, en particular:
Infección neonatal precoz
Esta infección empieza habitualmente in utero y provoca ssepticemia grave y neumonía en los lactantes, que resulta letal si no se trata y que incluso con tratamiento, se asocia con un porcentaje de mortalidad de entre el 10 y el 20%.
Infección neonatal tardía
Esta infección tiene lugar en el corto período de tiempo que transcurre desde después del nacimiento hasta los 3 meses de edad. Provoca una septicemia, que se complica con meningitis en el 90% de los casos. Asimismo, tienen lugar otras infecciones focalizadas, que incluyen osteomielitis, artritis séptica, abscesos y endoftalmitis.
Infecciones del adulto
Parecen ser habituales "in crescendo" y tienen lugar muy frecuentemente en mujeres que acaban de dar a luz, en las personas mayores y en los inmunodeprimidos. Se caracterizan por septicemia e infecciones focales que incluyen osteomielitis, artritis séptica, abscesos y endoftalmitis.
Infecciones del tracto urinario
GBS es una causa de infecciones del tracto urinario y en el embarazo representa el 10% aproximadamente de todas las infecciones.
Infecciones veterinarias
GBS causa mastitis crónica en las vacas. Esto, a su vez, conduce a una producción reducida de leche y es por tanto de una importancia económica considerable.
Las infecciones por GBS pueden tratarse con antibióticos. Sin embargo, es preferible la inmunización. Es por tanto deseable desarrollar un inmunógeno que pueda utilizarse en una vacuna terapéuticamente efectiva.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en la identificación de un gen en GBS y también en organismos relacionados, cuyos productos están asociados con la superficie externa del organismo y son por tanto útiles como dianas para inmunoterapia.
Según un aspecto de la invención, un péptido es codificado por el gen que se identifica en la presente memoria como MS10, que puede obtenerse a partir del Streptococcus del grupo B, o de un fragmento homólogo o funcional suyo. Dicho péptido resulta apropiado para su utilización terapéutica, por ejemplo, cuando se aísla.
El término "fragmentos funcionales" se utiliza en la presente memoria para definir una parte del gen o del péptido que conserva la actividad del gen o péptido enteros. Por ejemplo, un fragmento funcional del péptido puede utilizarse como un determinante antigénico, útil en una vacuna o en la producción de anticuerpos.
Un fragmento génico puede utilizarse para codificar el péptido activo. Alternativamente, el fragmento génico puede tener utilidad en la terapia génica, dirigiendo el gen de tipo salvaje in vivo para ejercer un efecto terapéutico.
Un péptido según la presente invención comprende la secuencia aminoácida que se identifica en la presente memoria como SEC ID nº 12, o un fragmento funcional de la misma.
A causa de la localización extracelular o superficial celular, los péptidos de la presente invención constituyen candidatos apropiados para la producción de vacunas terapéuticamente efectivas contra GBS. El término "terapéuticamente efectivas" tiene el propósito de incluir el efecto profiláctico de las vacunas. Por ejemplo, una vacuna comprende un péptido según la invención, o los medios para su expresión, para el tratamiento de la infección.
Esta vacuna puede administrarse a hembras, bien antes del embarazo, o durante el mismo, para proteger a la madre y al recién nacido contra la infección por GBS.
Según otro aspecto de la invención, el péptido o gen puede utilizarse para el rastreo de medicamentos antimicrobianos potenciales o para la detección de la virulencia.
Otro aspecto de la presente invención es la utilización de cualquiera de los productos que se identifican en la presente memoria, para el tratamiento o prevención de una afección asociada con la infección por una cepa Estreptocócica del Grupo B.
Aunque la proteína se ha descrito para su utilización en el tratamiento de los pacientes, también se considera que está dentro del alcance de la presente invención la utilización veterinaria de los productos de ésta. En particular, los péptidos o las vacunas pueden utilizarse en el tratamiento de la mastitis crónica, especialmente en las vacas.
Descripción de la invención
La presente invención se describe haciendo referencia a la cepa Estreptocócica M732 del grupo B. Sin embargo, es probable que todas las cepas GBS y muchas otras cepas bacterianas incluyan péptidos o proteínas relacionados que poseen una homología secuencial aminoácida con el péptido de M732. Organismos que es probable que contengan los péptidos incluyen, pero no se limitan a S. pneumoniae, S. pyogenes, S. suis, S. milleri, Estreptococos del Grupo C y Grupo G y Enterococos. Las vacunas para cada uno de estos pueden desarrollarse de la misma manera que se describió para GBS.
Preferentemente, los péptidos que pueden resultar útiles para la producción de vacunas presentan una similitud secuencial superior al 80% con el péptido que se identifica en la presente memoria, por ejemplo, una similitud del 95%.
Habiéndose caracterizado el gen según la invención, es posible utilizar la secuencia génica para establecer homologías en otros microorganismos. De esta forma es posible determinar si otros microorganismos tienen productos superficiales externos similares. Las homologías secuenciales pueden establecerse investigando en las bases de datos que existen, por ejemplo, EMBL o Genbank.
Los péptidos o proteínas según la invención pueden purificarse y aislarse mediante procedimientos que se conocen en la técnica. En particular, habiendo identificado la secuencia génica, se podrán utilizar las técnicas recombinantes para expresar los genes en un huésped apropiado. Fragmentos activos y homólogos pueden ser identificados y pueden resultar útiles en la terapia. Por ejemplo, los péptidos o sus fragmentos activos pueden utilizarse como determinantes antigénicos en una vacuna, para provocar una respuesta inmunitaria. Asimismo, pueden utilizarse en la preparación de anticuerpos, para inmunización pasiva o aplicaciones diagnósticas. Los anticuerpos apropiados incluyen anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, incluyendo fragmentos fv de cadena única. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos resultarán evidentes para los expertos en la materia.
La preparación de vacunas basadas en microorganismos atenuados es conocida por los expertos en la materia. Las composiciones vacunales pueden formularse con transportadores o adyuvantes apropiados, por ejemplo alumbre, si es necesario o se desea, y ser utilizadas terapéuticamente, para proporcionar una inmunización efectiva contra Estreptococos del grupo B u otros microorganismos relacionados. La preparación de formulaciones vacunales resultará evidente para el experto en la materia.
Más generalmente, y como es bien conocido por los expertos en la materia, puede seleccionarse una cantidad apropiada de un componente activo de la invención, para su utilización terapéutica, así como transportadores o excipientes apropiados y vías de administración. Estos factores serán seleccionados o determinados según criterios conocidos tales como la naturaleza/gravedad de la afección que vaya a ser tratada, el tipo o salud del individuo, etc.
Los productos de la presente invención se identificaron de la forma siguiente:
El caldo de cultivo Todd-Hewitt se inoculó con GBS y se dejó que éste se desarrollara durante la noche a 37ºC. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron con solución salina de tampón fosfato (PBS). Las células se volvieron a suspender en un tampón osmótico (20% (peso/vol) sacarosa, 20 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM MgCl_{2}) que contenía inhibidores de la proteasa (1 mM PMSF, 10 \muM ácido yodoacético, 10 mM 1,10-Fenantrolina, 1 \muM Pepstatina A) y Mutanolisina con una concentración final de 4 Unidades por microlitro. Se sometió a incubación (agitación) a 37ºC durante 2 horas.
Las células y los desechos se eliminaron primero mediante centrifugación a gran velocidad, y a continuación mediante ultracentrifugación durante 1 hora. El sobrenadante resultante que contenía proteínas de la pared celular se concentró bajo presión utilizando un dispositivo de ultrafiltración (límite de peso molecular 10.000).
La muestra se dializó contra agua de calidad ultra alta y se liofilizó. Después de la resuspensión en tampón de carga, las proteínas se separaron mediante electroforesis preparativa en gel bidimensional. Después de la electroforesis, se escogió una mancha individual para estudio. La mancha se sometió a digestión tríptica en el interior del gel. Los péptidos resultantes se extrajeron del gel y se purificaron utilizando RP-HPLC ("microbore"). Las fracciones se recuperaron cada 45 segundos y una parte de estas, de acuerdo con las regiones de absorbancia UV, se analizaron mediante el Tiempo de desabsorción asistido por láser, de la matriz de extracción retardada de la espectrometría de masas (DE-MALDI-TOF-MS). Los péptidos que no se observaron en una preparación en blanco, se sometieron entonces a secuenciación utilizando Nanospray-MS/MS.
Utilizando esta información secuencial peptídica, se diseñaron oligonucleótidos degenerados para utilizarlos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el segmento de ADN que se encontraba entre las secuencias peptídicas identificadas.
La amplificación PCR condujo a la producción de varios fragmentos polinucleótidos, cada uno de los cuales se clonó en el vector pCR 2.1-TOPO (Invitrogen BV Holanda) según el protocolo de los fabricantes.
El fragmento de ADN en cada plásmido se identificó mediante secuenciación y se utilizó a continuación para obtener la secuencia entera del gen, de la manera siguiente:
Utilizando el fragmento identificado de ADN, se diseñaron iniciadores oligonucleótidos para la secuenciación del ADN genómico. Estos iniciadores se diseñaron de forma que llevaran a cabo la secuenciación en una dirección hacia fuera a partir de la secuencia obtenida. Una vez leída, la secuencia obtenida se sometió a chequeo para ver si los extremos 5' y 3' del gen se habían alcanzado. La presencia de estas características se identificó sometiendo a chequeo secuencias homólogas, y para el extremo 5', la presencia de un codón de iniciación AUG (o una alternativa aceptada) precedido por una secuencia de consenso Shine-Dalgarno, y para el extremo 3', la presencia de un codón de finalización (Stop) de la traducción.
Después de la identificación del gen completo, se diseñaron iniciadores para la amplificación del producto entero a partir del ADN genómico de GBS. Los iniciadores utilizados incluían sitios de reconocimiento de la enzima de restricción (NcoI en el extremo 5' y EcoO109I en el extremo 3') para permitir la clonación subsiguiente del producto en el sistema de expresión Lactocócico utilizado.
La PCR se llevó a cabo utilizando los iniciadores, y los productos se clonaron en un vector de clonación pCR 2.1 (In Vitrogen). Después de la confirmación de la presencia del fragmento clonado, el ADN se extirpó utilizando los enzimas de restricción NcoI y EcoO109I.
El vector en el cual este fragmento se insertó fue una versión modificada de pNZ8048 (Kuipers, O. P. et al. (1998) J. Biotech 64: 15-21). Este vector, que alberga un origen lactocócico de replicación, un marcador de resistencia del cloranfenicol, un promotor nisina inducible y un sitio de multiclonación, fue alterado por el reemplazamiento del sitio de multiclonación con dos marcadores 10X His, franqueados en el extremo 5-más con un sitio NcoI, dividido en el medio con un sitio de multiclonación (que incluye un sitio EcoO109I), y un codón Stop (de finalización) en el extremo 3' de los marcadores His.
El gen de interés se insertó de forma que un marcador 10X His se encontraba en la posición 3' respecto a la región codificante. Después de la transformación del plásmido recombinante en L. lactis (cepa NZ9000 - Kuipers, O.P. et al. (1998) supra), se estableció un cultivo líquido de 400 ml y se indujo la traducción de la proteína añadiendo nisina al cultivo. Después de una incubación de 2 horas, las células se recogieron y lisaron golpeando las perlas. El lisado resultante se clarificó mediante centrifugación, y se hizo pasar entonces sobre una columna con afinidad metálica (Talon, Clonetech). La columna se lavó repetidamente antes de que las proteínas unidas se eluyeran con
imidazol.
Para identificar las fracciones que contenían la proteína recombinante marcada His, se analizó una alícuota de cada fracción mediante SDS-PAGE, transferencia Western y sondeo con anticuerpos anti-His.
La proteína recombinante obtenida se utilizó a continuación para inmunizar conejos blancos New Zealand, recuperándose suero preinmune antes de la inmunización. Después de una revacunación, los conejos se sacrificaron y se recogió el suero. Este suero se utilizó en transferencias Western, ELISA y modelos de protección animal.
Utilizando los sueros obtenidos de los estudios con animales, se llevaron a cabo estudios de inmunosorción.
Se hicieron crecer Streptococcus del Grupo B en 20 ml de caldo de cultivo Todd Hewitt (THB) durante 8 horas, recogiéndose y volviéndose a suspender en 5 ml de PBS. Alícuotas de 50 \mul de éste se utilizaron para cubrir los pocillos en una placa con 96 pocillos (Nunc Immuno-Sorb). Ésta se dejó a 4ºC por la noche para permitir la absorbancia de las bacterias en la placa. Las placas se lavaron dos veces con PBS, bloqueándose entonces con BSA al 3% en PBS durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron otra vez. Se llevaron a cabo diluciones décuples seriadas de los sueros en PBS, y 50 \mul de estas diluciones se añadieron a los pocillos de la placa, por duplicado. La placa se cubrió y se incubó durante 1 hora a 37ºC. La placa se lavó, añadiéndose entonces a cada pocillo 50 \mul del anticuerpo secundario conjugado con la fosfatasa alcalina anti-conejo a una concentración de 1:5000. Después de la incubación a 37ºC durante una hora, la placa se lavó otra vez. 50 \mul de substrato (PNPP) se añadieron a cada pocillo, y se dejó que la reacción prosiguiera durante 30 minutos, antes de que la absorbancia fuera leída a 405 nm.
Estudios de protección animal se llevaron a cabo asimismo para ensayar la efectividad de protección sobre los conejos inmunizados.
GBS M732 se hizo crecer en THB hasta que se alcanzó la fase logarítmica media, aproximadamente en 5 horas. Las células se contaron en una cámara de contaje, y las bacterias se diluyeron para dar lugar a una concentración de 2 x 10^{7} bacterias por ml en los sueros preinmunes o de ensayo. 50 \mul de éste se inyectaron mediante la vía intraperitoneal en ratones de entre 0 y 1 día de edad. Los ratones se observaron respecto a la supervivencia durante 48 horas.
El siguiente Ejemplo ilustra la invención.
Ejemplo 1
Un plásmido se denominó pMS10. El fragmento de ADN clonado se secuenció. La secuencia nucleótida y la aminoácida deducida (SEC ID nº 11 y nº 12) se utilizaron para investigar bases de datos de proteínas.
Homólogos para el producto del gen MS10 de GBS pueden identificarse en Streptococcus mutans, Nicotiana plumb, Pisum sativum y Zea mays. En todos los casos los homólogos son los genes para la Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa NADP dependiente, no fosforilizante (NPGAP-3-DH). Se ha informado que NPGAP-3-DH constituye un medio importante de generar NADPH para las reacciones biosintéticas en S. mutans (opuesto al GAP-3-DH NAD específico que satisface los requerimientos de la vía glicolítica) (Boyd, D.A., Cvitkovitch, D. G. y Hamilton, I.R. 1995 J. Bacteriol. 177:2622-2727).
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<212> ADN
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(516)
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<400> 5
11
12 
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<210> 6
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<211> 172
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<212> PRT
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<400> 6
13
14 
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<210> 7
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<211> 318
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<212> ADN
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(318)
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<400> 7
15
16 
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<210> 8
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<211> 105
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<212> PRT
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<400> 8
17 
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<210> 9
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<211> 804
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<212> ADN
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(804)
\newpage
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<400> 9
18
19 
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<210> 10
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<211> 268
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<212> PRT
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<400> 10
20
21 
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<210> 11
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<211> 1428
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<212> ADN
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(1428)
\newpage
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<400> 11
22
23
24 
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<210> 12
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<211> 475
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<212> PRT
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<213> Streptococcus del grupo B 
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<400> 12
25
26
27

Claims (10)

1. Péptido que comprende la secuencia aminoácida que se identifica en la presente memoria como SEC ID nº 12, que puede obtenerse a partir del Streptococcus del Grupo B, o un homólogo del mismo con una similitud superior al 80% al nivel de aminoácido, o un fragmento funcional del mismo que conserva la capacidad de provocar una respuesta inmune contra el péptido entero, para utilización terapéutica.
2. Polinucleótido que codifica un péptido según la reivindicación 1, para utilización terapéutica.
3. Vacuna que comprende un péptido según la reivindicación 1.
4. Utilización de un producto según la reivindicación 1 ó 2, para el rastreo de fármacos antimicrobianos potenciales.
5. Utilización de un producto según la reivindicación 1 ó 2, destinado a la preparación de un medicamento para su utilización en el tratamiento o prevención de una afección asociada a una infección bacteriana.
6. Utilización según la reivindicación 5, en la que la infección es una infección estreptocócica del Grupo B.
7. Utilización según la reivindicación 5 ó 6, en la que la infección es una infección focal.
8. Utilización según la reivindicación 5 ó 6, en la que la infección es una infección del tracto urinario.
9. Anticuerpo que se une específicamente a la secuencia identificada en la presente memoria como SEC ID nº 12.
10. Utilización del péptido definido en la reivindicación 1, para aumentar los anticuerpos.
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