CN110669711A - 基于pgk基因的重组乳酸乳球菌和无乳链球菌病疫苗 - Google Patents

Abstract

一种基于pgk基因的重组乳酸乳球菌，其包含无乳链球菌的pgk基因，所述pgk基因通过质粒载体被导入到乳酸乳球菌。所述pgk基因具有由SEQ No.1所示的DNA序列。所述质粒载体是pNZ8148载体。所述乳酸乳球菌是乳酸乳球菌NZ9000。本发明还提供一种罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其包括上述的重组乳酸乳球菌，所述重组乳酸乳球菌是在存在乳酸链球菌素的条件下诱导培养后的重组乳酸乳球菌。所述疫苗是口服灌胃给药的疫苗。所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗包括浓度为2×10¹⁰cfu·mL^‑1的所述重组乳酸乳球菌。所述疫苗的给药剂量是200μL。

Description

基于pgk基因的重组乳酸乳球菌和无乳链球菌病疫苗

技术领域

本发明属于水生生物疾病防控的技术领域，具体涉及基于pgk基因的重组乳酸乳球菌和包含该重组乳酸乳球菌的无乳链球菌病疫苗。

背景技术

罗非鱼(Oreochromis sp.)是我国南方主要养殖鱼类之一，有食性杂、适应性广、繁殖能力强、生长速度快等优点。近年来，罗非鱼病害的爆发对罗非鱼产业造成巨大的损失，而且趋势越发严重，阻碍了罗非鱼产业的健康发展。罗非鱼病害的主要病原有海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，其中90％以上的临床菌株为无乳链球菌。

罗非鱼无乳链球菌病发生的主要原因有养殖水质差、养殖密度大、使用低质饲料等。该病的防治方法主要有药物、生态和免疫防治。化学药物防治是最直接、便捷方便的防控手段，但是长期使用化学药品容易产生耐药性，导致药物残留引起质量安全问题。

疫苗具有无残留、不易引起耐药性、安全高效等优点，可替代化学类药物作为罗非鱼链球菌病防控的重要途径，是罗非鱼病害防控的发展趋势。相较于其他的免疫方式，口服疫苗使用更为方便，具有不受养殖时间、地点和受体大小的限制，对鱼体无损伤等优点。

发明内容

一方面，本发明的目的在于提供一种基于pgk基因的重组乳酸乳球菌，其包含无乳链球菌的pgk基因，所述pgk基因通过质粒载体被导入到乳酸乳球菌。

优选地，所述pgk基因具有由SEQ No.1所示的DNA序列。

优选地，所述质粒载体是pNZ8148载体。

优选地，所述乳酸乳球菌是乳酸乳球菌NZ9000。

优选地，所述重组乳酸乳球菌在存在乳酸菌肽的培养条件下能诱导表达分子量大小为44kDa的Pgk蛋白，所述重组乳酸乳球菌于2019年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M 2019575 NZ9000 pNZ8148-pgk Lactococcus lactis。

另一方面，本发明还提供一种罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其包括上述的重组乳酸乳球菌。

优选地，所述重组乳酸乳球菌是在存在乳酸链球菌素的条件下诱导培养后的重组乳酸乳球菌。

优选地，所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗疫苗是口服灌胃给药的疫苗。

优选地，所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗包括浓度为2×10¹⁰cfu·mL^-1的所述重组乳酸乳球菌，给药剂量优选是200μL。

本发明所提供的基于pgk基因的重组乳酸乳球菌以及利用重组乳酸乳球菌制备的疫苗能显著地提高罗非鱼血清的抗体水平，对罗非鱼的免疫保护效果优异，尤其是经三次口服灌胃免疫后的保护效果更优。这种口服灌胃疫苗更适用于罗非鱼养殖实践应用，可减少疫苗免疫的工作量，提高养殖户使用疫苗的便利程度。

附图说明

图1是pgk扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2是pNZ8148经NcoI和HindIII双酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3是重组质粒pNZ8148-pgk的PCR扩增鉴定结果，其中，M：DNA分子量标准；1：空白对照；2：pNZ8148扩增产物；3：pNZ8148质粒DNA对照；4：pNZ8148-pgk扩增产物；5：pNZ8148-pgk质粒DNA对照。

图4是重组质粒pNZ8148-pgk的HindIII酶切鉴定结果，其中，M：DNA分子量标准；1：HindIII酶切过的载体pNZ8148；2：未酶切的pNZ8148质粒；3：未酶切的重组质粒pNZ8148-pgk；4：Hind III酶切过的重组质粒pNZ8148-pgk。

图5是针对诱导表达的蛋白Pgk的Western-blot检测分析结果，其中M：蛋白质分子量标准；1：未诱导的L.lactis NZ9000 pNZ8148-pgk；2、3：诱导后的L.lactis NZ9000pNZ8148-pgk破碎上清和沉淀；4：诱导后的L.lactis NZ9000 pNZ8148；5：L.lactisNZ9000。

图6是示出重组乳酸乳球菌疫苗的相对免疫保护率结果的图。

具体实施方式

以下结合实施例以及附图对本发明的具体实施方式进行详细的说明。

磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase,gk)是无乳链球菌中表达的重要蛋白，磷酸甘油酸激酶的缺失容易引起无乳链球菌糖代谢紊乱从而使细菌无法生存。本申请通过将pgk基因插入pNZ8148载体，构建携带pgk基因的重组质粒载体，并将该质粒载体导入到乳酸乳球菌中构建重组乳酸乳球菌，利用含有pgk基因的重组乳酸乳球菌制备无乳链球菌病疫苗。

为了更进一步地理解本申请的技术方案，现提供以下实施例。

实施例1：构建携带pgk基因的重组质粒

从申请人所保存的无乳链球菌(WC1535)中扩增pgk基因，以pNZ8148质粒作为载体质粒，构建携带pgk基因的重组质粒。

扩增pgk基因的PCR引物序列见下表1，其中目的基因引物末端添加有6×His标签，选取pNZ8148的通用引物作为鉴定引物，所用引物合成于广州艾基生物技术有限公司，其中斜体标示的序列为pNZ8148载体质粒同源的15bp碱基序列，下划线标示的序列为6×His标签的碱基序列。

表1

将无乳链球菌(WC1535)在BHI培养基(购自于广州市康龙生物科技有限公司)中于37℃、180r·min^-1下培养过夜。用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA ExtractionKit提取无乳链球菌的基因组DNA。

以无乳链球菌基因组DNA为模板，PCR扩增pgk基因。扩增反应体系为：模板1μL，10×buffer 2μL，dNTP 0.2μL，上游下游引物各1μL，Ex taq酶0.2μL，ddH₂O 14.6μL。PCR扩增程序为：94℃10min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃10min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，pgk预期扩增片段大小为1245bp，电泳检测结果如图1所示。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit从电泳凝胶中回收纯化PCR产物，回收产物用于后续载体构建。

用NcoI和HindIII对pNZ8148质粒进行双酶切，酶切反应体系和反应条件为：CutSmart 2μL，NcoI 0.5μL，HindIII 0.5μL，pNZ8148质粒DNA 3μL，ddH₂O 14μL，37℃4h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小为3161bp的线性化质粒，如图2所示。用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit从电泳凝胶中回收纯化酶切后的线性化质粒DNA，酶切回收产物用于后续载体构建。

利用TaKaRa公司的In-Fusion试剂盒，将纯化的pgk片段与双酶切处理的线性化pNZ8148进行连接，50℃反应组装15min。接下来，热激法转化MC1061感受态细胞，将转化后的MC1061细胞涂布在含30ug·mL^-1氯霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，获得重组菌MC1061pNZ8148-pgk。利用引物pNZ8148-F和pNZ8148-R PCR筛选出阳性克隆菌，从阳性克隆菌中提取质粒并进一步用HindIII酶切对质粒进行初步鉴定，酶切阳性的质粒送样至广州艾基生物技术有限公司进行测序验证。

用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit从测序验证为阳性的重组菌中提取pNZ8148-pgk质粒DNA，分装并于-20℃保存备用，其中pNZ8148将作为对照质粒载体用于构建对照的重组乳酸乳球菌。

实施例2：重组乳酸乳球菌的构建和pgk基因表达的鉴定

首先，制备乳酸乳球菌(Lactococcus.lactis)NZ9000(L.lactis NZ9000)(购自于REBIO公司)感受态细胞。将乳酸乳球菌NZ9000单菌落于含0.5％葡萄糖的M17液体培养基(购自于广州市康龙生物科技有限公司)中、30℃静置培养6h。按1:10比例取上述培养物于含0.5％葡萄糖+1％甘氨酸的M17液体培养基，30℃静置培养过夜。按1:10比例取上述培养物于含0.5％葡萄糖+0.5mol·L^-1蔗糖+2％甘氨酸的M17液体培养基，继续静置培养至OD ₆₀₀＝0.5。在4℃、5000g下将培养物离心15min之后弃上清，向菌体沉淀中加入1体积预冷溶液(0.5mol·L^-1蔗糖+10％甘油)进行重悬，4℃、5000g离心15min之后弃上清，向菌体沉淀中加入0.5体积的预冷溶液(0.25体积(0.5mol·L^-1蔗糖+10％甘油)+0.25体积(0.05mol·L^{- 1}Na-EDTA(pH 7.5)))进行重悬。将菌悬液冰浴15min，在4℃、5000g下离心15min之后弃上清。向菌体沉淀中加入0.01体积预冷溶液(0.5mol·L^-1蔗糖+10％甘油)并重悬，得到乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，分装并于-80℃保存备用。

实施例1中所制备的各质粒各取1000ng，与100μL上述制备的乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞混匀，转移到预冷的2mm电击杯中进行电击，电击参数设置为2kV、200Ω、25μF。将电击后的质粒与乳酸乳球菌NZ9000混合物转移到900μL预冷的复苏液(M17+0.5％葡萄糖+0.5mol·L^-1蔗糖+0.002mol·L^-1MgCl₂+0.002mol·L^-1CaCl₂)中，先于冰上静置5min，然后30℃静置培养4h。最后将上述菌液涂布在含有终浓度为10μg·mL^-1的氯霉素的M17琼脂平板上，30℃下培养36h，相应地获得重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000 pNZ8148-pgk和L.lactis NZ9000 pNZ8148。重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000 pNZ8148-pgk于2019年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M 2019575 NZ9000 pNZ8148-pgkLactococcus lactis。

接下来，对上述重组乳酸乳球菌中基因的表达进行鉴定，重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000 pNZ8148-pgk中目的蛋白Pgk的分子量理论值分别为44kDa。

将L.lactis NZ9000 pNZ8148和L.lactis NZ9000 pNZ8148-pgk分别于终浓度为10μg·mL^-1氯霉素的M17液体培养基30℃静置过夜培养。按1:10取该过夜培养物接种于终浓度为10μg·mL^-1氯霉素的M17液体培养基，培养至OD₆₀₀＝0.5，加入乳酸菌肽(nisin，购自于广州市康龙生物科技有限公司)至终浓度为10ng·mL^-1，30℃下诱导培养4h。将培养物在4℃、5000g下离心15min后弃上清，用等体积的PBS洗菌体两次，用超声波破碎，破碎条件为：200W，每次工作时间2s，每次间隔5s，共20min。利用Capturem^TMHis-Tagged PurificationMiniprep Kit纯化Pgk蛋白，采用BCA测定纯化的蛋白浓度。

蛋白样品经处理后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白带从凝胶转移至醋酸纤维素膜上进行进一步的Western-blot检测。Western-blot检测所用的一抗是Anti-6×His

抗体(HRP)(货号是ab1187，购自于广州勤卓生物科技有限公司)，稀释浓度为1:3000。二抗是辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体(购自于广州勤卓生物科技有限公司)，稀释浓度为1:5000。

Western blot检测结果表明，在预期位置出现明显的免疫印迹，如图5所示，说明重组菌L.lactis NZ9000 pNZ8148-pgk成功表达了Pgk蛋白。纯化后的Pgk蛋白的浓度为11.54mg·mL^-1。

实施例3：重组乳酸乳球菌的免疫保护效果

从广东省罗非鱼良种场选取400尾健康罗非鱼，体长为8±1cm，体重为14±1g。

将这些罗非鱼随机分为8组，每组50尾，暂养稳定后进行免疫实验。把这8组分成2个大组，4组为在首次免疫7天后进行第二次免疫，即二次免疫(第14天)，其余4组为在二次免疫(14天)的基础上7天后进行第三次免疫即三次免疫(第21天)，免疫方式为隔周免疫。

4个实验组分别为L.lactis NZ9000 pNZ8148-pgk、L.lactis NZ9000 pNZ8148对照、L.lactis NZ9000对照和PBS对照。收集的菌体用PBS稀释成2×10¹⁰cfu·mL^-1的菌悬液，每次口服灌胃剂量为200μL，各个对照组口服灌胃等体积的相应菌液或溶液。

免疫结束后分别从每组中随机选取罗非鱼尾静脉采血，将血样在4℃下静置过夜后分离血清。采用ELISA测定血清中的IgM抗体水平：1:50稀释罗非鱼血清，无乳链球菌WC1535作为固定抗原；抗体是申请人自行制备和保存的HRP标记的兔抗尼罗罗非鱼IgM抗体(1:3000稀释)，使用酶标仪测定OD₄₅₀的值。血清抗体效价表示为平均值±标准差(Mean±SD)，运用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，分析各实验组的相对免疫保护率及其抗体水平之间差异的显著性。结果见表2，与对照组相比，重组乳酸乳球菌疫苗二次免疫(14天)和三次免疫(21天)均能显著提高血清特异性抗体的水平，而且三次免疫(21天)的抗体水平显著高于二次免疫(14天)(P＜0.05)。含有pgk基因的重组乳酸乳球菌二次免疫(14天)和三次免疫(21天)所产生的抗体水平均显著高于对照组乳酸乳球菌所产生的抗体水平(P＜0.01)。

表2

*代表相同免疫时间各组与PBS对照组之间存在显著性差异(P＜0.05)；**代表相同免疫时间各组与PBS对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01)

免疫结束后第18天采用在血平板培养基上于28℃下培养的无乳链球菌WC1535进行人工感染实验，所用的细菌浓度为3×10⁸cfu·mL^-1。对各组实验鱼进行腹腔注射攻毒，每尾的注射量为100μL，水温为(28±2)℃，连续14天对各组鱼的死亡情况进行统计。取濒死鱼的脑、脾脏、肝脏和肾脏组织并从中分离培养无乳链球菌，来检查和判断死亡鱼的症状是否为无乳链球菌感染所致。

按照以下公式计算各试验组的相对免疫保护率：RPS(％)＝(1－免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。结果如图6所示，结果显示，在所有实验组中，免疫接种了三次含有pgk基因的重组乳酸乳球菌后的实验组的相对免疫保护率最高，显著高于对照组L.lactisNZ9000 pNZ8148和L.lactis NZ9000的相对免疫保护率(P＜0.05)。也就是说，三次免疫的免疫效果更好。

在本申请中，通过同源重组法将pgk基因插入pNZ8148载体，对pNZ8148载体双酶切处理，根据线性化载体两端的序列，设计PCR上下游引物时在pgk基因扩增引物的5’端加上与线性化载体两末端同源的15bp碱基序列，即可与线性化载体两端的序列进行定向交换，从而使目的基因精确地连接到目的载体，相较于传统的克隆方法更有效地避免假阳性的出现，大大提高实验效率，节省时间。

本发明所提供的含有pgk基因的重组乳酸乳球菌以及相应的疫苗是借助乳酸乳球菌NZ9000和乳酸菌表达载体pNZ8148而构建和制备的，乳酸乳球菌对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物，诱导目的蛋白表达的诱导物nisin是一种生物安全肽，对人体无毒副作用，进入消化道后被对应的蛋白酶作用从而失活，不会影响肠道的菌群平衡。因此，本发明重组乳酸乳球菌以及基于该重组乳酸乳球菌制备的无乳链球菌疫苗，无论对于罗非鱼还是罗非鱼的消费者——人类来说都是安全的。

基于含有pgk基因的重组乳酸乳球菌制备的疫苗能更显著地提高罗非鱼血清的抗体水平，对罗非鱼的免疫保护效果优异，尤其是经三次口服灌胃免疫后的保护效果更优。这种口服灌胃疫苗更适用于罗非鱼养殖实践应用，可减少疫苗免疫的工作量，提高养殖户使用疫苗的便利程度。

以上通过实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 基于pgk基因的重组乳酸乳球菌和无乳链球菌病疫苗

<130> 461874

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> Streptococcus agalactiae

<400> 1

atgaaaatga ataaaaaggt actattgaca tcgacaatgg cagcttcgct attatcagtc 60

gcaagtgttc aagcacaaga aacagatacg acgtggacag cacgtactgt ttcagaggta 120

aaggctgatt tggtaaagca agacaataaa tcatcatata ctgtgaaata tggtgataca 180

ctaagcgtta tttcagaagc aatgtcaatt gatatgaatg tcttagcaaa aataaataac 240

attgcagata tcaatcttat ttatcctgag acaacactga cagtaactta cgatcagaag 300

agtcatactg ccacttcaat gaaaatagaa acaccagcaa caaatgctgc tggtcaaaca 360

acagctactg tggatttgaa aaccaatcaa gtttctgttg cagaccaaaa agtttctctc 420

aatacaattt cggaaggtat gacaccagaa gcagcaacaa cgattgtttc gccaatgaag 480

acatattctt ctgcgccagc tttgaaatca aaagaagtat tagcacaaga gcaagctgtt 540

agtcaagcag cagctaatga acaggtatca ccagctcctg tgaagtcgat tacttcagaa 600

gttccagcag ctaaagagga agttaaacca actcagacgt cagtcagtca gtcaacaaca 660

gtatcaccag cttctgttgc cgctgaaaca ccagctccag tagctaaagt agcaccggta 720

agaactgtag cagcccctag agtggcaagt gttaaagtag tcactcctaa agtagaaact 780

ggtgcatcac cagagcatgt atcagctcca gcagttcctg tgactacgac ttcaccagct 840

acagacagta agttacaagc gactgaagtt aagagcgttc cggtagcaca aaaagctcca 900

acagcaacac cggtagcaca accagcttca acaacaaatg cagtagctgc acatcctgaa 960

aatgcagggc tccaacctca tgttgcagct tataaagaaa aagtagcgtc aacttatgga 1020

gttaatgaat tcagtacata ccgtgcggga gatccaggtg atcatggtaa aggtttagca 1080

gttgacttta ttgtaggtac taatcaagca cttggtaata aagttgcaca gtactctaca 1140

caaaatatgg cagcaaataa catttcatat gttatctggc aacaaaagtt ttactcaaat 1200

acaaacagta tttatggacc tgctaatact tggaatgcaa tgccagatcg tggtggcgtt 1260

actgccaacc actatgacca cgttcacgta tcatttaaca aataa 1305

Claims (10)

1.一种基于pgk基因的重组乳酸乳球菌，其包含无乳链球菌的pgk基因，所述pgk基因通过质粒载体被导入到乳酸乳球菌。

2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述pgk基因具有由SEQ No.1所示的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述质粒载体是pNZ8148载体。

4.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述乳酸乳球菌是乳酸乳球菌NZ9000。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌在存在乳酸菌肽的培养条件下能诱导表达分子量大小为44kDa的Pgk蛋白，所述重组乳酸乳球菌于2019年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M 2019575NZ9000 pNZ8148-pgk Lactococcus lactis。

6.一种罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其包括权利要求1-5中任一项所述的重组乳酸乳球菌。

7.根据权利要求5所述的罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其特征在于：

所述重组乳酸乳球菌是在存在乳酸链球菌素的条件下诱导培养后的重组乳酸乳球菌。

8.根据权利要求6所述的罗非鱼无乳链球菌病疫苗，其特征在于：所述疫苗是口服灌胃给药的疫苗。

9.根据权利要求7所述的罗非鱼无乳链球菌疫苗，其特征在于：所述罗非鱼无乳链球菌病疫苗包括浓度为2×10¹⁰cfu·mL^-1的所述重组乳酸乳球菌。

10.根据权利要求9所述的罗非鱼无乳链球菌疫苗，其特征在于：所述疫苗的给药剂量是200μL。

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