CN107653260A

CN107653260A - 一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用

Info

Publication number: CN107653260A
Application number: CN201711093350.7A
Authority: CN
Inventors: 刘志刚; 卢迈新; 蔡玉臻; 可小丽; 张德锋; 曹建萌
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107653260B

Abstract

本发明涉及一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用。其特征在于，在乳酸乳球菌细胞中胞内表达或分泌表达罗非鱼源无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein，Sip)，重组表达Sip蛋白所用载体分别为pNZ8124和pNZ8148，载体中插入的Sip基因片段去除了信号肽区段并添加了组氨酸序列标签，重组蛋白由乳酸链球菌素(Nisin)诱导表达，最佳诱导条件为100ng/mL Nisin诱导4h，最佳口服免疫浓度为2.24×10¹⁰CFU/mL，口服剂量为100μL。本发明所公布的重组乳酸乳球菌应用于罗非鱼无乳链球菌的乳酸菌活载体疫苗具有血清型覆盖范围广，可直接口服，安全性好，操作简便，易于大规模群体免疫，免疫效果较好等优点。

Description

一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用

技术领域：

本发明涉及一种罗非鱼源无乳链球菌的乳酸菌活载体口服疫苗的制备方法及应用，具体是利用乳酸乳球菌活细胞作为载体制备用于预防罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，GBS)感染的口服疫苗及其应用方法。

背景技术：

罗非鱼(Tilapia)是一种原产于非洲的热带性鱼类，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(亦称丽鲷科，丽鲷属)。由于它具有生长快、食性杂、繁殖力强、无肌间刺和营养丰富等特点，受到广大养殖户和消费者的喜爱。罗非鱼在我国南方的广东、海南、广西和福建等省份广泛养殖，养殖规模和养殖密度不断加大，已成为我国目前出口量最大的淡水鱼类养殖品种。2009年以来，链球菌病在我国罗非鱼的主养区大面积暴发流行，并且发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增。2011年我国90％的罗非鱼养殖场均出现链球菌病，死亡率为15％～90％。链球菌病已成为罗非鱼养殖业中最严重的病害，给渔民带来了巨大的损失，同时成为制约我国罗非鱼产业健康可持续发展的瓶颈。

罗非鱼链球菌病主要集中于高温季节爆发流行，流行水温26℃以上，其主要症状为体色发黑、眼球突出、浑浊发白、水体中打转、体表点状或斑块出血等。无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)是罗非鱼链球菌病的主要病原，2008年之前我国罗非鱼链球菌病病原以海豚链球菌为主，之后逐渐转变为以无乳链球菌为主要致病菌。无乳链球菌又称B族链球菌(group B streptococcus,GBS)，为革兰氏阳性球菌，是一种广泛分布于自然界的条件致病菌，其根据荚膜多糖抗原性的差异可分为10种分子血清型(Ⅰa、Ⅰb和Ⅱ～Ⅳ)，根据其溶血性可分为α、β和γ溶血。我国流行的罗非鱼无乳链球菌的分子血清型主要为Ⅰa型，也有Ⅰb和Ⅲ型的报道，多位点序列分型结果均主要为ST-7型，噬菌体分型可以分为A、B两类，2010年之后的菌株主要为B型。无乳链球菌除了可以感染罗非鱼，还可以感染虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Psetta maxima)、真鲷(Pagrosomus major)和眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)等多种咸水和淡水鱼类，目前已有12个国家报道了该病的暴发和流行，是全球流行的鱼类病害类型。

罗非鱼感染无乳链球菌后会引起各内脏器官的广泛充血、水肿、变性、炎性细胞浸润和严重的细胞坏死，大量无乳链球菌侵染肝脏、脾脏、肾脏和脑等重要等内脏组织，破坏细胞结构和各种细胞器，导致各组织器官的功能障碍和衰竭，最后导致鱼体死亡。研究表明，无乳链球菌中存在荚膜多糖(capsular polysaccharide synthesis，Cps)、α-相关蛋白(α-like protein，Alp)、β蛋白质、C5α肽酶(C5a peptidase，ScpB)、层粘连蛋白结合蛋白(laminin binding protein，Lmb)、溶血促进因子(cohemolysin，CAMP)、FbsA蛋白、表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein，Sip)和溶血素(hemolysin，Hly)等多种毒力相关因子。但不同血清型菌株中蛋白质表达存在差异，导致无乳链球菌的免疫原性和致病力不同。Sip蛋白是在2000年由Brodeur通过免疫学筛选获得并命名的，其存在所有血清的GBS菌株中，且高度保守，相似率高98％。通过不同血清型GBS的多基因组分析和筛查表明Sip蛋白可作为通用GBS疫苗候选抗原。Sip蛋白在多种模型动物中进行免疫实验，均发现其有较强的免疫原性。

目前针对罗非鱼链球菌病，尚无科学有效的防治方式，主要依赖抗生素类化学药物进行防治，但实际效果并不理想，且抗生素滥用导致耐药菌株的产生以及药物残留问题也越来越严重。疫苗预防是一种公认的健康无残留、高效的病害防治手段，目前关于罗非鱼无乳链球菌疫苗的研究取得了一定的进展，包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等。但由于灭活疫苗成分相对复杂、对不同个体免疫效率差异大、对细胞内寄生细菌保护效果相对较弱，减毒疫苗毒力可能恢复和贮藏运输条件高，基因工程亚单位疫苗分离纯化工艺复杂、易被降解，DNA疫苗免疫保护效果较差，以及普遍采用注射免疫方式、工作量大，大规模免疫可操作性小等问题，目前尚无可用的商业化无乳链球菌疫苗。

益生菌活载体疫苗是以益生菌为载体菌，通过基因工程技术重组病毒、细菌或寄生虫等病原基因，构建能表达外源抗原或携带外源DNA疫苗的重组益生菌，通过口服或滴鼻的途径将抗原传递至宿主黏膜系统，进而在黏膜水平刺激免疫宿主产生免疫反应。口服活载体疫苗具有生产成本低、制备简单、无需分离纯化、易于标准化、安全性好、可直接口服、无需佐剂，适合大规模群体免疫等特点，在罗非鱼链球菌疫苗的开发利用中具有广阔的应用前景。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)被公认为安全级(generally recognized assafe,GRAS)微生物，是人和动物肠道内的常见细菌，用作活载体疫苗已经相当成熟。

因此研制罗非鱼无乳链球菌的乳酸菌活载体口服疫苗能够克服已有疫苗的诸多弊端，对罗非鱼链球菌病的疫苗防控和实现罗非鱼的无抗健康养殖具有重要意义。

发明内容：

本发明目的是提供一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌是由罗非鱼无乳链球菌Sip基因去除了信号肽区段，并融合了组氨酸标签序列，通过表达载体导入乳酸乳球菌NZ9000菌株得到的重组菌。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌中表达的重组无乳链球菌Sip蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表1所示。

本发明所用乳酸菌表达载体分别为pNZ8148非分泌型载体和pNZ8124分泌型载体。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌通过乳酸链球菌素(Nisin)诱导重组Sip蛋白表达，其最佳诱导条件为100ng/mL Nisin诱导4h。

本发明所提供的一种重组乳酸乳球菌的应用；应用于一种罗非鱼源无乳链球菌的乳酸活载体口服疫苗，其活性成分为上述的重组乳酸乳球菌，最佳诱导条件下诱导后获得。该疫苗免疫罗非鱼时，在灌胃口服剂量为100μL，隔周免疫1次，一共免疫2次的条件下，其最佳免疫浓度为2.24×10¹⁰CFU/mL。

本发明所提供的罗非鱼无乳链球菌的乳酸菌活载体疫苗能够刺激罗非鱼产生无乳链球菌特异性抗体，并能够有效提高罗非鱼抗无乳链球菌感染的能力。

附图说明

图1无乳链球菌Sip基因片段的PCR产物电泳图；

M代表DNA Marker DL2000，1-4代表无乳链球菌Sip基因片段的PCR产物；

图2重组表达质粒pNZ8124-Sip的双酶切产物和PCR检测产物电泳图；

M代表DNA Marker DL5000，1代表pNZ8124质粒经KpnI单酶切产物，2代表阳性克隆中扩增的Sip基因，3代表pNZ8124-Sip质粒KpnI和HindIII双酶切产物，4代表pNZ8124-Sip经KpnI单酶切产物；

图3重组表达质粒pNZ8148-Sip的双酶切产物和PCR检测产物电泳图；

M代表DNA Marker DL5000，1代表pNZ8148质粒经KpnI单酶切产物，2代表阳性克隆中扩增的Sip基因，3代表pNZ8148-Sip质粒KpnI和HindIII双酶切产物，4代表pNZ8148-Sip经KpnI单酶切产物；

图4重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-Sip经不同浓度nisin诱导后菌体破碎后上清中表达产物的SDS-PAGE电泳图；

M代表蛋白marker，1代表未诱导重组菌，2代表诱导剂浓度为10ng/mL，3代表诱导剂浓度为100ng/mL，4代表诱导剂浓度为1000ng/mL；

图5重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-Sip诱导不同时间后菌体破碎后上清中表达产物的SDS-PAGE电泳图；

M代表蛋白marker，1代表未诱导重组菌，2代表诱导时为1h，3代表诱导时间为2h，4代表诱导时间为4h，5代表诱导时间为6h，6代表诱导时间为8h；

图6重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-Sip经不同浓度nisin诱导后菌体破碎后上清中表达产物的SDS-PAGE电泳图；

M代表蛋白marker，1代表未诱导重组菌，2代表诱导剂浓度为1ng/mL，3代表诱导剂浓度为10ng/mL，4代表诱导剂浓度为50ng/mL，5代表诱导剂浓度为100ng/mL，6代表诱导剂浓度为500ng/mL，7代表诱导剂浓度为1000ng/mL；

图7重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-Sip诱导不同时间后菌体破碎后上清中表达产物的SDS-PAGE电泳图；

图8重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-Sip中目的蛋白的表达形式与纯化产物SDS-PAGE分析；

M代表蛋白marker，1代表未诱导重组菌上清蛋白，2代表未诱导重组菌全菌蛋白，3代表重组菌诱导后全菌蛋白，4代表重组菌诱导后上清蛋白，5代表重组菌诱导后沉淀蛋白，6代表纯化后的目的蛋白，7代表培养基中的分泌蛋白；

图9重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-Sip中目的蛋白的表达形式与纯化产物SDS-PAGE分析；

M代表蛋白marker，1代表未诱导重组菌上清蛋白，2代表未诱导重组菌全菌蛋白，3代表重组菌诱导后全菌蛋白，4代表重组菌诱导后沉淀蛋白，5代表重组菌诱导后上清蛋白，6代表纯化后的目的蛋白；

图10重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-Sip诱导表达Sip蛋白的Western blotting分析；

M₁代表Western marker，M₂代表蛋白marker，1代表纯化后的胞内可溶性Sip蛋白；

图11重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-Sip诱导表达Sip蛋白的Western blotting分析；

M代表蛋白marker，1代表纯化后的胞内可溶性Sip蛋白；

图12重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-Sip口服免疫罗非鱼后血清抗体水平的变化；

*代表相同时间点各组与PBS对照组之间存在显著性差异(P<0.05)，**代表差异极显著(P<0.01)；

图13重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-Sip口服免疫罗非鱼后血清抗体水平的变化；

图14重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-Sip口服免疫罗非鱼的相对免疫保护率；

各组上方字母不同代表组间差异显著(P<0.05)，字母相同则代表组间无显著性差异(P>0.05)；

图15重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-Sip口服免疫罗非鱼的相对免疫保护率；

各组上方字母不同代表组间差异显著(P<0.05)，字母相同则代表组间无显著性差异(P>0.05)。

具体实施方式

以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。

本说明书中所提到的材料：

实验动物、菌株和试剂

(1)实验用尼罗罗非鱼取自中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质中心，全长8±1cm，体重15±2g；(2)无乳链球菌为由本实验室分离、鉴定和保存的罗非鱼源致病菌株(自编号：WC1535)；(3)大肠杆菌MC1063(Escherichia coli，MC1063)、乳酸乳球菌NZ9000、pNZ8124质粒、pNZ8148质粒和Nisin购自REBIO公司，质粒提取、胶回收试剂盒购自OMEGA公司，pMD19-T Vector、限制性内切酶、T4DNA连接酶、His Bind亲和纯化镍柱试剂盒购自TaKaRa公司；蛋白超滤管、PVDF膜购自PALL公司，鼠抗His单克隆抗体购自Abmart公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠单克隆抗体购自proteintech公司，ECL化学显色液购自Millipore公司，Easy II western marker购自北京全式金生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

实施例1无乳链球菌Sip基因的克隆

根据GenBank公布的无乳链球菌Sip基因序列(CP0001141)，设计特异性上下游引物SipF(5′-CGGGGTACCCCCAAGAAACAGATACGACG-3′)和SipR(5′CCCAAGCTTTTAGTTAAAGGATACGTGAA-3′)，SipF带有KpnⅠ酶切位点(下划线所示)，SipR带有HindⅢ酶切位点(下划线所示)和6个His的标签序列(斜体所示)，引物由广州艾基生物技术有限公司合成。以罗非鱼源无乳链球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系总体积为25μL：上下游引物SipF和SipR各0.5μL(10mmol/L)，模板DNA 0.5μL，PremixTaq^TM 12.5μL，双蒸水11μL。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃30s，52℃30s，72℃90s，共30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，目的条带与预期大小1265bp一致。切胶回收目的条带与pMD19-T载体于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于LB(Amp⁺，100μg/mL)固体培养基，阳性克隆采用通用引物M13F(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13R(5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′)进行PCR检测，并送至送广州艾基生物技术有限公司测序验证，获得DH5α-pMD19T-Sip重组菌。

实施例2重组表达Sip蛋白乳酸乳球菌的制备

将测序验证的DH5α-pMD19T-Sip菌株接种至LB(Amp⁺，100μg/mL)液体培养基中扩大培养，提取质粒pMD19T-Sip，将pMD19T-Sip质粒、pNZ8148质粒和pNZ8124质粒分别采用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切条件为37℃孵育4h。胶回收酶切后的Sip基因片段、pNZ8148质粒和pNZ8124质粒，采用T₄DNA连接酶16℃过夜连接Sip基因片段和pNZ8148质粒或pNZ8124质粒，将连接产物转化至E.coli MC1061感受态细胞，构建MC1061-pNZ8124-Sip和MC1061-pNZ8148-Sip重组大肠杆菌，阳性克隆通过PCR检测和质粒酶切鉴定后进一步进行测序验证，pNZ8124-sip重组质粒酶切图谱如图2所示，双酶切产物为1249bp的Sip基因片段和3260bp的pNZ8124质粒。pNZ8148-sip重组质粒酶切图谱如图3所示，双酶切产物为1249bp的Sip基因片段和3167bp的pNZ8148质粒。

乳酸乳球菌NZ9000电转感受态细胞的制备方法为：首先，将冷冻保存的乳酸乳球菌NZ9000菌株接种于5mL G/L-SGM17B培养基中30℃下活化培养过夜；第二天，将活化的菌株接种至培养至50mL G/L-SGM17B培养基中30℃过夜扩大培养；第三天，将上述50mL菌液接种至400mLG/L-SGM17B培养基中30℃生长至OD₆₀₀为0.2～0.3，4℃下6000×g离心20min收集菌体，用预冷的电转缓冲液洗涤细胞两次后重悬于4mL电转缓冲液中即为电转感受态细胞。电转方法为：取40μL电转感受态细胞和1μL质粒DNA置于预冷电转杯中，在2000V，25μF，200Ω条件下电击4.5～5msec，加入1mL电转复苏液(G/L-M17B+20mM MgCl₂+2mM CaCl₂)冰育5min，再置于30℃下孵育1～1.5h，将菌液涂布于含氯霉素(10μg/mL)的BHI固体培养基上，阳性克隆通过PCR、质粒酶切和测序进行验证，获得NZ9000-pNZ8124-sip和NZ9000-pNZ8148-sip重组乳酸乳球菌。

实例3Sip蛋白诱导表达及其诱导条件优化

将重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-sip和NZ9000-pNZ8148-sip分别接种至5mL的BHI液体培养基(Cm⁺，10μg/mL)中，30℃下过夜静置培养；第二天以1:50比例扩大培养，培养至OD600≈0.4时开始诱导表达。诱导剂诱导浓度优化实验为加入不同浓度梯度(0ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL)的nisin诱导剂，在30℃下诱导4h；诱导时间优化实验为在最佳诱导浓度条件下设定诱导时间梯度为0h、1h、2h、4h、6h和8h；诱导后8000g离心10min收集菌体，按菌体重量比为1:1的加入等体积的PBS缓冲液，液氮研磨破碎菌体，离心分别保存菌体上清和沉淀，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-sip和NZ9000-pNZ8148-sip均在nisin诱导浓度为100ng/mL下诱导4h获得最大表达量，如图4-7所示。

实例4Sip重组蛋白的表达形式检测与纯化

将活化后的重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-sip和NZ9000-pNZ8148-sip分别在nisin诱导浓度为100ng/mL、30℃下诱导4h。诱导后8000×g离心10min分离菌体和培养基，按菌体重量比为1:1加入等体积的PBS缓冲液，液氮研磨破碎，离心后分离菌液上清液和沉淀；培养基中分泌蛋白通过30KDa超滤管浓缩，6000×g离心10min，保存超滤管中浓缩的培养基，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结果如图8-9所示，NZ9000-pNZ8124-sip重组菌能够分泌表达目的蛋白，但表达效率较低，主要以胞内可溶性蛋白形式存在；NZ9000-pNZ8148-sip重组菌诱导表达目的蛋白同样主要以胞内可溶性蛋白形式存在。

采用His标签蛋白纯化试剂盒对重组乳酸乳球菌诱导Sip蛋白进行纯化，具体步骤为：将重组乳酸菌诱导后离心收集菌体并称重，然后按菌体重量比为1:1的比例加入Tractor Buffer混匀，液氮研磨破碎细胞，然后按1g菌体加入20mL的Tractor Buffer的比例补齐Tractor Buffer，在小型摇床上4℃孵育10min；然后在4℃下10000×g离心20min，收集菌液上清。将上一步所获得的菌液上清通过活化过的离心柱型镍柱进行挂柱，在11000×g下离心1min，然后加入300μL的Wash Buffer洗涤两遍，加入300μL的Elution Buffer洗脱目的蛋白，最后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图8-9所示，纯化后目的蛋白大小与预期大小一致，分别为45KDa和48KDa。

实例5Sip重组蛋白的Western Blotting检测

取纯化后的Sip蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后用湿转法将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上，使用含5％脱脂奶粉的PBST溶液在小型摇床上4℃封闭1h，PBST洗涤三次后将PVDF膜置于鼠抗His单克隆抗体(1：5000)溶液中，4℃孵育过夜。次日，将PVDF膜经PBST清洗3次，每次5min；再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(1：10000)室温孵育2h，TBST洗涤3次后采用ECL化学发光法显影并采集图像，结果见图10-11，重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-sip和NZ9000-pNZ8148-sip表达目的蛋白均能与鼠抗His标签抗体特异性结合，显示单一明亮条带，且大小与预期大小一致，说明重组Sip蛋白表达成功。

实例6重组乳酸乳球菌口服免疫实验及其免疫保护效果评价

将尼罗罗非鱼(15.0±2g)随机分为6组，每组160条，暂养2周后进行免疫实验。用5L的螺口瓶大量培养NZ9000-pNZ8124-Sip、NZ9000-pNZ8148-Sip、NZ9000-pNZ8124、NZ9000-pNZ8148和NZ9000菌株，其中重组乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8124-Sip和NZ9000-pNZ8148-Sip在最佳诱导条件下(100ng/mL nisin条件下诱导4h)进行诱导表达，其它菌株不诱导。5000×g离心10min收集上述菌体后采用PBS溶液进行重悬，通过比浊计测定菌液浓度。NZ9000-pNZ8124-Sip和NZ9000-pNZ8148-Sip分别用PBS稀释成3个浓度梯度(2.24×10⁹CFU/mL、2.24×10¹⁰CFU/mL和2.24×10¹¹CFU/mL)，NZ9000-pNZ8124、NZ9000-pNZ8148和NZ9000菌株稀释浓度为2.24×10¹⁰CFU/mL，采用上述菌液进行灌胃口服免疫罗非鱼(100μL/尾)，空白对照组灌胃口服等量的PBS，每组3个重复，每个重复50尾。隔周免疫1次，共免疫2次。第1次免疫后第1d、2d、4d、8d、16d和21d分别从每组中随机挑选3尾鱼，尾静脉采血，分离血清。采用间接ELISA法测定血清抗体水平，具体操作为：包被缓冲液稀释Sip蛋白至5ng/μL，每孔100μL加至96孔酶标板，4℃过夜；PBST洗涤3次后加入封闭液，37℃封闭2h；PBST洗涤3次后加入1:50比例稀释的罗非鱼血清，37℃孵育1h；PBST洗涤3次后加入HRP标记的兔抗罗非鱼IgM抗体(1:1000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗涤3次后用TMB显色液显色30min，加入2mol/L H₂SO₄终止反应，采用酶标仪测定450nm波长下的OD值。结果表明：NZ9000、NZ9000-8124以及高浓度的NZ9000-8124-sip(2.24×10¹¹CFU/mL)并不能引起罗非鱼的特异性免疫反应从而产生相应抗体；而中浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10¹⁰CFU/mL)和低浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10⁹CFU/mL)能够显著提高血清特异性抗体水平，且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势，分别在16d和4d达到峰值，中浓度组的抗体水平要高于低浓度组(见图12)。高浓度和中浓度的重组乳酸乳球菌NZ9000-8148-sip同样能够显著提高血清特异性抗体水平，且随着时间推移呈现不断增加的趋势，而低浓度组抗体水平与PBS对照组无显著差异(见图13)。

免疫后第21天采用无乳链球菌进行人工感染实验，攻毒所用的浓度为2.25×10⁷CFU/mL(LD₅₀)。对各组实验鱼进行腹腔注射攻毒，每尾注射100μL，每组注射20尾，水温尾31±2℃，连续2周统计各组鱼死亡情况，计算各组相对免疫保护率(relative percentsurvival，RPS)。结果表明：中浓度组和低浓度组的NZ9000-8124-sip口服免疫后的相对免疫保护率较高，显著高于高浓度组的NZ9000-8124-sip和NZ9000组，中浓度组的相对免疫保护率最高，为41.0％(见图14)；重组乳酸乳球菌NZ9000-8148-sip同样是中浓度的口服免疫保护效果最好，为61.6％(见图15)。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用

<130> 2017

<141> 2017-11-07

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1365

<212> DNA

<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1365)

<223> pNZ8124-Sip载体中重组Sip基因的核酸序列

<400> 1

atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatcttaag tgctgcagcc 60

ccgttgtcag gtgtttacgc tgatatcacg gccatgggta ctgcaggcat gcggtacccc 120

caagaaacag atacgacgtg gacagcacgt actgtttcag aggtaaaggc tgatttggta 180

aaacaagaca ataaatcatc atatactgtg aaatatggtg atacactaag cgttatttca 240

gaagcaatgt caattgatat gaatgtctta gcaaaaatta ataacattgc agatatcaat 300

cttatttatc ctgagacaac actgacagta acttacgatc agaagagtca tactgctact 360

tcaatgaaaa tagaaacacc agcaacaaat gctgctggtc aaacaacagc tactgtcgat 420

ttgaaaacca atcaagtttc tgttgcagac caaaaagttt ctctcaatac aatttcggaa 480

ggtatgacac cagaagcagc aacaacgatt gtttcgccaa tgaagacata ttcttctgcg 540

ccagctttga aatcaaaaga agtattagca caagggcaag ctgttagtca agcagcagct 600

aatgaacagg tatcaccagc tcctgtgaag tcgattactt cagaagttcc agcagctaaa 660

gaggaagtta aaccaactca gacgtcagtc agtcagtcaa caacagtatc accagcttct 720

gttgccgctg aaacaccagc tccagtagct aaagtagcac cggtaagaac tgtagcagcc 780

cctagagtgg caagtgttaa agtagtcact cctaaagtag aaactggtgc atcaccagag 840

catgtatcag ctccagcagt tcctgtgact acgacttcaa cagctacaga cagtaagtta 900

caagcgactg aagttaagag cgttccggta gcacaaaaag ctccaacagc aacaccggta 960

gcacaaccag cttcaacaac aaatgcagta gctgcacatc ctgaaaatgc aaggctccaa 1020

cctcatgttg cagcttataa agaaaaagta gcgtcaactt atggagttaa tgaattcagt 1080

acataccgtg cgggagatcc aggtgatcat ggtaaaggtt tagcagttga ctttattgta 1140

ggtaaaaacc aagcacttgg taatgaagtt gcacagtact ctacacaaaa tatggcagca 1200

aataacattt catatgttat ctggcaacaa aagttttact caaatacaaa tagtatttat 1260

ggacctgcta atacttggaa tgcaatgcca gatcgtggtg gcgttactgc caaccactat 1320

gaccacgttc acgtatcctt taaccatcac catcaccatc actaa 1365

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(454)

<223> pNZ8124-Sip载体中重组Sip蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Asp Ile Thr Ala Met

20 25 30

Gly Thr Ala Gly Met Arg Tyr Pro Gln Glu Thr Asp Thr Thr Trp Thr

35 40 45

Ala Arg Thr Val Ser Glu Val Lys Ala Asp Leu Val Lys Gln Asp Asn

50 55 60

Lys Ser Ser Tyr Thr Val Lys Tyr Gly Asp Thr Leu Ser Val Ile Ser

65 70 75 80

Glu Ala Met Ser Ile Asp Met Asn Val Leu Ala Lys Ile Asn Asn Ile

85 90 95

Ala Asp Ile Asn Leu Ile Tyr Pro Glu Thr Thr Leu Thr Val Thr Tyr

100 105 110

Asp Gln Lys Ser His Thr Ala Thr Ser Met Lys Ile Glu Thr Pro Ala

115 120 125

Thr Asn Ala Ala Gly Gln Thr Thr Ala Thr Val Asp Leu Lys Thr Asn

130 135 140

Gln Val Ser Val Ala Asp Gln Lys Val Ser Leu Asn Thr Ile Ser Glu

145 150 155 160

Gly Met Thr Pro Glu Ala Ala Thr Thr Ile Val Ser Pro Met Lys Thr

165 170 175

Tyr Ser Ser Ala Pro Ala Leu Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Gln Gly

180 185 190

Gln Ala Val Ser Gln Ala Ala Ala Asn Glu Gln Val Ser Pro Ala Pro

195 200 205

Val Lys Ser Ile Thr Ser Glu Val Pro Ala Ala Lys Glu Glu Val Lys

210 215 220

Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Gln Ser Thr Thr Val Ser Pro Ala Ser

225 230 235 240

Val Ala Ala Glu Thr Pro Ala Pro Val Ala Lys Val Ala Pro Val Arg

245 250 255

Thr Val Ala Ala Pro Arg Val Ala Ser Val Lys Val Val Thr Pro Lys

260 265 270

Val Glu Thr Gly Ala Ser Pro Glu His Val Ser Ala Pro Ala Val Pro

275 280 285

Val Thr Thr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ser Lys Leu Gln Ala Thr Glu

290 295 300

Val Lys Ser Val Pro Val Ala Gln Lys Ala Pro Thr Ala Thr Pro Val

305 310 315 320

Ala Gln Pro Ala Ser Thr Thr Asn Ala Val Ala Ala His Pro Glu Asn

325 330 335

Ala Arg Leu Gln Pro His Val Ala Ala Tyr Lys Glu Lys Val Ala Ser

340 345 350

Thr Tyr Gly Val Asn Glu Phe Ser Thr Tyr Arg Ala Gly Asp Pro Gly

355 360 365

Asp His Gly Lys Gly Leu Ala Val Asp Phe Ile Val Gly Lys Asn Gln

370 375 380

Ala Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln Tyr Ser Thr Gln Asn Met Ala Ala

385 390 395 400

Asn Asn Ile Ser Tyr Val Ile Trp Gln Gln Lys Phe Tyr Ser Asn Thr

405 410 415

Asn Ser Ile Tyr Gly Pro Ala Asn Thr Trp Asn Ala Met Pro Asp Arg

420 425 430

Gly Gly Val Thr Ala Asn His Tyr Asp His Val His Val Ser Phe Asn

435 440 445

His His His His His His

450

<210> 3

<211> 1272

<212> DNA

<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1272)

<223> pNZ8148-Sip载体中重组Sip基因的核酸序列

<400> 3

atgggtactg caggcatgcg gtacccccaa gaaacagata cgacgtggac agcacgtact 60

gtttcagagg taaaggctga tttggtaaaa caagacaata aatcatcata tactgtgaaa 120

tatggtgata cactaagcgt tatttcagaa gcaatgtcaa ttgatatgaa tgtcttagca 180

aaaattaata acattgcaga tatcaatctt atttatcctg agacaacact gacagtaact 240

tacgatcaga agagtcatac tgctacttca atgaaaatag aaacaccagc aacaaatgct 300

gctggtcaaa caacagctac tgtcgatttg aaaaccaatc aagtttctgt tgcagaccaa 360

aaagtttctc tcaatacaat ttcggaaggt atgacaccag aagcagcaac aacgattgtt 420

tcgccaatga agacatattc ttctgcgcca gctttgaaat caaaagaagt attagcacaa 480

gggcaagctg ttagtcaagc agcagctaat gaacaggtat caccagctcc tgtgaagtcg 540

attacttcag aagttccagc agctaaagag gaagttaaac caactcagac gtcagtcagt 600

cagtcaacaa cagtatcacc agcttctgtt gccgctgaaa caccagctcc agtagctaaa 660

gtagcaccgg taagaactgt agcagcccct agagtggcaa gtgttaaagt agtcactcct 720

aaagtagaaa ctggtgcatc accagagcat gtatcagctc cagcagttcc tgtgactacg 780

acttcaacag ctacagacag taagttacaa gcgactgaag ttaagagcgt tccggtagca 840

caaaaagctc caacagcaac accggtagca caaccagctt caacaacaaa tgcagtagct 900

gcacatcctg aaaatgcaag gctccaacct catgttgcag cttataaaga aaaagtagcg 960

tcaacttatg gagttaatga attcagtaca taccgtgcgg gagatccagg tgatcatggt 1020

aaaggtttag cagttgactt tattgtaggt aaaaaccaag cacttggtaa tgaagttgca 1080

cagtactcta cacaaaatat ggcagcaaat aacatttcat atgttatctg gcaacaaaag 1140

ttttactcaa atacaaatag tatttatgga cctgctaata cttggaatgc aatgccagat 1200

cgtggtggcg ttactgccaa ccactatgac cacgttcacg tatcctttaa ccatcaccat 1260

caccatcact aa 1272

<210> 4

<211> 423

<212> PRT

<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(423)

<223> pNZ8148-Sip载体中重组Sip蛋白的氨基酸序列

<400> 4

Met Gly Thr Ala Gly Met Arg Tyr Pro Gln Glu Thr Asp Thr Thr Trp

1 5 10 15

Thr Ala Arg Thr Val Ser Glu Val Lys Ala Asp Leu Val Lys Gln Asp

20 25 30

Asn Lys Ser Ser Tyr Thr Val Lys Tyr Gly Asp Thr Leu Ser Val Ile

35 40 45

Ser Glu Ala Met Ser Ile Asp Met Asn Val Leu Ala Lys Ile Asn Asn

50 55 60

Ile Ala Asp Ile Asn Leu Ile Tyr Pro Glu Thr Thr Leu Thr Val Thr

65 70 75 80

Tyr Asp Gln Lys Ser His Thr Ala Thr Ser Met Lys Ile Glu Thr Pro

85 90 95

Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Thr Thr Ala Thr Val Asp Leu Lys Thr

100 105 110

Asn Gln Val Ser Val Ala Asp Gln Lys Val Ser Leu Asn Thr Ile Ser

115 120 125

Glu Gly Met Thr Pro Glu Ala Ala Thr Thr Ile Val Ser Pro Met Lys

130 135 140

Thr Tyr Ser Ser Ala Pro Ala Leu Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Gln

145 150 155 160

Gly Gln Ala Val Ser Gln Ala Ala Ala Asn Glu Gln Val Ser Pro Ala

165 170 175

Pro Val Lys Ser Ile Thr Ser Glu Val Pro Ala Ala Lys Glu Glu Val

180 185 190

Lys Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Gln Ser Thr Thr Val Ser Pro Ala

195 200 205

Ser Val Ala Ala Glu Thr Pro Ala Pro Val Ala Lys Val Ala Pro Val

210 215 220

Arg Thr Val Ala Ala Pro Arg Val Ala Ser Val Lys Val Val Thr Pro

225 230 235 240

Lys Val Glu Thr Gly Ala Ser Pro Glu His Val Ser Ala Pro Ala Val

245 250 255

Pro Val Thr Thr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ser Lys Leu Gln Ala Thr

260 265 270

Glu Val Lys Ser Val Pro Val Ala Gln Lys Ala Pro Thr Ala Thr Pro

275 280 285

Val Ala Gln Pro Ala Ser Thr Thr Asn Ala Val Ala Ala His Pro Glu

290 295 300

Asn Ala Arg Leu Gln Pro His Val Ala Ala Tyr Lys Glu Lys Val Ala

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Gly Val Asn Glu Phe Ser Thr Tyr Arg Ala Gly Asp Pro

325 330 335

Gly Asp His Gly Lys Gly Leu Ala Val Asp Phe Ile Val Gly Lys Asn

340 345 350

Gln Ala Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln Tyr Ser Thr Gln Asn Met Ala

355 360 365

Ala Asn Asn Ile Ser Tyr Val Ile Trp Gln Gln Lys Phe Tyr Ser Asn

370 375 380

Thr Asn Ser Ile Tyr Gly Pro Ala Asn Thr Trp Asn Ala Met Pro Asp

385 390 395 400

Arg Gly Gly Val Thr Ala Asn His Tyr Asp His Val His Val Ser Phe

405 410 415

Asn His His His His His His

420

Claims

1.一种重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌在细胞内表达或分泌表达罗非鱼无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)；所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000菌株；所述罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白去除了信号肽区段并添加了组氨酸标签序列，重组Sip蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表中的表1所示。

2.根据权利要求1所述一种重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白分别通过插入pNZ8148非分泌型载体和pNZ8124分泌型载体导入乳酸乳球菌。

3.根据权利要求1所述一种重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述重组Sip蛋白由乳酸链球菌素(Nisin)诱导表达，最佳诱导条件为100ng/mLNisin诱导4h。

4.一种重组乳酸乳球菌的应用，其特征是应用于一种罗非鱼源无乳链球菌的乳酸活载体口服疫苗，其活性成分为权利要求1—3中任一所述的重组乳酸乳球菌，在权利要求3中所述最佳诱导条件下诱导后获得。

5.根据权利要求4所述一种重组乳酸乳球菌的应用，其特征在于所述乳酸菌活载体疫苗最佳口服免疫浓度为2.24×10¹⁰CFU/mL，口服剂量为100μL。

6.根据权利要求4所述一种重组乳酸乳球菌的应用，其特征是所述乳酸菌活载体疫苗能够刺激罗非鱼产生无乳链球菌特异性抗体，并能够有效提高罗非鱼抗无乳链球菌感染的能力。