CN114053399A - 一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法，所述罗非鱼链球菌口服疫苗包括10～30％免疫组分、60～80％脂质体组分和5～10％表面活性剂，通过免疫组分、脂质体组分以及表面活性剂间的相互作用显著增强罗非鱼对无乳链球菌病的免疫效果，同时将口服疫苗制备成脂质体的形式，可以有效保护口服疫苗的免疫组分的活性，避免失活，能够有效提高制备得到的口服疫苗的生物相容性，进而提高口服疫苗在罗非鱼体内的生物利用度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法。
背景技术
罗非鱼是我国重要的养殖品种之一，在我国南方广泛养殖。2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病，链球菌病的主要病原有海豚链球菌(Streptococcusiniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施，主要依赖抗生素类化学药物进行防治，易导致菌株耐药和药物残留。疫苗具有安全、高效、无残留等优点，可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。目前，已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道，但上述疫苗普遍采用注射免疫方式，大批量免疫工作量大，具有一定的局限性，使之不能进行大面积的推广。研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。
专利文献CN103834669A，公开了一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法，公开了一种SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌。该发明还公开了无乳链球菌口服疫苗。本发明乳链球菌口服疫苗，以口服方式接种免疫，对罗非鱼的保护率高，给药方便，操作简单，免疫应激反应小，安全，应用前景优良，但具有的生物利用度较低。
专利文献CN107653260A，公开了一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用，在乳酸乳球菌细胞中胞内表达或分泌表达罗非鱼源无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surfaceimmunogenic protein，Sip)，重组表达Sip蛋白所用载体分别为pNZ8124和pNZ8148，载体中插入的Sip基因片段去除了信号肽区段并添加了组氨酸序列标签，重组蛋白由乳酸链球菌素(Nisin)诱导表达，最佳诱导条件为100ng/mL Nisin诱导4h，最佳口服免疫浓度为2.24×1010CFU/mL，口服剂量为100μL。该发明所公布的重组乳酸乳球菌应用于罗非鱼无乳链球菌的乳酸菌活载体疫苗具有血清型覆盖范围广，可直接口服，安全性好，操作简便，易于大规模群体免疫，免疫效果较好等优点，但具有的生物利用度较低。
发明内容
本发明旨在提供一种罗非鱼链球菌口服疫苗，选用C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白和霍乱毒素B作为免疫组分，通过各组分间的相互作用最终实现有效治疗罗非鱼无乳链球菌病的技术效果，同时将其制备成脂质体进一步提高了口服疫苗的生物利用度。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种罗非鱼链球菌口服疫苗，包括以下组分及重量百分含量：10～30％免疫组分、60～80％脂质体组分和5～10％表面活性剂。
优选地，所述免疫组分包括C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白和霍乱毒素B亚单位。
优选地，所述C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白和霍乱毒素B亚单位的质量比为(10～30)：(1～10)：(10～30)：1。
优选地，所述脂质体组分包括二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的质量比为1.2：(1～3)。
优选地，所述表面活性剂为双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠。
优选地，所述免疫组分、脂质体组分和表面活性剂的重量百分含量比为2：7：0.75。
另外，本发明还请求保护一种所述罗非鱼链球菌口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、将脂质体组分溶解于氯仿-乙醚-混合溶剂中，之后将混合液转移至250mL的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在60r/min和60℃条件下除去有机溶剂，在室温下将附有薄膜的圆底烧瓶于真空干燥器中干燥12～24h，得脂质体薄膜；
S2、另称取免疫组分和表面活性剂溶解于10mL磷酸盐缓冲溶液中，之后加入步骤S1制备得到的脂质体薄膜，均匀混合，并于40℃进行水浴加热旋转搅拌30～60min，形成粗脂质体；
S3、将步骤S2制备得到的粗脂质体进行超声分散，最后过0.45μm微孔滤膜，即得罗非鱼链球菌口服疫苗。
优选地，所述步骤S1中氯仿-乙醚混合溶剂的氯仿与乙醚的体积比3:2。
优选地，所述步骤S2中磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0～7.4。
优选地，所述步骤S3中超声分散的时间为5～10min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明选用C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白和霍乱毒素B亚单位作为免疫组分，通过霍乱毒素B亚单位与其他3种免疫组分间的耦联作用显著增强对罗非鱼无乳链球菌病的免疫保护效果。
(2)本发明通过加入脂质体组分以及表面活性剂将口服疫苗制备成脂质体的形式，可以有效保护口服疫苗的免疫组分的活性，避免失活，同时制备得到的口服疫苗具有较好的生物相容性，可以有效提高在罗非鱼体内的生物利用度。
(3)本发明罗非鱼链球菌口服疫苗的制备过程方便，操作简单，有利于大规模的工业化生产。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法
配方：免疫组分：C5α肽酶1mg、LrrG蛋白1mg、Sip蛋白1mg和霍乱毒素B亚单位100ug。
所述免疫组分、脂质体组分和双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠的重量百分含量比为1：6：0.5。
所述脂质体组分中二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的质量比为1.2：1。
制备方法：
S1、将二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇溶解于氯仿与乙醚体积比为3:2的混合溶剂中，之后将混合液转移至250mL的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在60r/min和60℃条件下除去有机溶剂，在室温下将附有薄膜的圆底烧瓶于真空干燥器中干燥12h，得脂质体薄膜；
S2、另称取C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白、霍乱毒素B亚单位和双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠溶解于10mL pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，之后加入步骤S1制备得到的脂质体薄膜，均匀混合，并于40℃进行水浴加热旋转搅拌30min，形成粗脂质体；
S3、将步骤S2制备得到的粗脂质体进行超声分散5min，最后过0.45μm微孔滤膜，即得罗非鱼链球菌口服疫苗。
实施例2、一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法
配方：免疫组分：C5α肽酶2mg、LrrG蛋白1mg、Sip蛋白2mg和霍乱毒素B亚单位100ug。
所述免疫组分、脂质体组分和双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠的重量百分含量比为2：7：0.75。
所述脂质体组分中二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的质量比为1.2：2。
制备方法：
S1、将二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇溶解于氯仿与乙醚体积比为3:2的混合溶剂中，之后将混合液转移至250mL的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在60r/min和60℃条件下除去有机溶剂，在室温下将附有薄膜的圆底烧瓶于真空干燥器中干燥12h，得脂质体薄膜；
S2、另称取C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白、霍乱毒素B亚单位和双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠溶解于10mL pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液中，之后加入步骤S1制备得到的脂质体薄膜，均匀混合，并于40℃进行水浴加热旋转搅拌40min，形成粗脂质体；
S3、将步骤S2制备得到的粗脂质体进行超声分散8min，最后过0.45μm微孔滤膜，即得罗非鱼链球菌口服疫苗。
实施例3、一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法
配方：免疫组分：C5α肽酶3mg、LrrG蛋白1mg、Sip蛋白3mg和霍乱毒素B亚单位100ug。
所述免疫组分、脂质体组分和双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠的重量百分含量比为3：8：1。
所述脂质体组分中二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的质量比为1.2：3。
制备方法：
S1、将二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇溶解于氯仿与乙醚体积比为3:2的混合溶剂中，之后将混合液转移至250mL的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在60r/min和60℃条件下除去有机溶剂，在室温下将附有薄膜的圆底烧瓶于真空干燥器中干燥24h，得脂质体薄膜；
S2、另称取C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白、霍乱毒素B亚单位和双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠溶解于10mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，之后加入步骤S1制备得到的脂质体薄膜，均匀混合，并于40℃进行水浴加热旋转搅拌60min，形成粗脂质体；
S3、将步骤S2制备得到的粗脂质体进行超声分散10min，最后过0.45μm微孔滤膜，即得罗非鱼链球菌口服疫苗。
对比例1、一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，不含有C5α肽酶。
制备方法参考实施例2。
对比例2、一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，不含有霍乱毒素B亚单位。
制备方法参考实施例2。
对比例3、一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，不含有双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠。
制备方法参考实施例2。
对比例4、一种罗非鱼链球菌口服疫苗及其制备方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，将双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠替换成十二烷基磺酸钠。
制备方法参考实施例2。
试验例一、对罗非鱼的免疫效力试验结果
一、实验样品
实施例1～3、对比例1～4制备得到的罗非鱼链球菌口服疫苗。
二、实验方法
采用上述制备得到的口服疫苗与罗非鱼饲养按照体积质量比为1：10进行均匀拌料后，投喂罗非鱼进行口服免疫，连续饲喂3天进行口服免疫，免疫罗非鱼14日后腹腔注射强毒菌液进行攻毒，攻毒剂量为0.1ml/尾(约含活菌数2.5×107CFU)，观察14日，记录实验组和对照组的死亡情况。
三、实验结果
实验结果如表1所示。
表1连续饲喂三天免疫罗非鱼14日后攻毒试验结果
从表1中的数据可以得知，本发明实施例1～3试制的疫苗口服免疫罗非鱼21日后用无乳链球菌强毒菌液腹腔注射攻毒，三批疫苗对免疫组分别达到43/60保护，17/60死亡；46/60保护，14/60死亡；45/60保护，15/60死亡，对罗非鱼的免疫保护效果均优于对比例1～4和对照组；对比例1～2中由于缺少C5α肽酶或霍乱毒素B亚单位免疫组分，各免疫组分间无法形成耦联效应，致使最终制备得到的口服疫苗具有的免疫保护作用差于本发明实施例1～3；从对比例3～4与实施例1～3的实验结果可以得知，对比例3～4由于缺少双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠组分，无法与脂质体组分形成协同作用，大幅降低了制备得到的口服疫苗的生物利用度，具有的罗非鱼死亡量相比本发明实施例1～3更多。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种罗非鱼链球菌口服疫苗，其特征在于，包括以下组分及重量百分含量：10～30％免疫组分、60～80％脂质体组分和5～10％表面活性剂。
2.如权利要求1所述的罗非鱼链球菌口服疫苗，其特征在于，所述免疫组分包括C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白和霍乱毒素B亚单位。
3.如权利要求2所述的罗非鱼链球菌口服疫苗，其特征在于，所述C5α肽酶、LrrG蛋白、Sip蛋白和霍乱毒素B亚单位的质量比为(10～30)：(1～10)：(10～30)：1。
4.如权利要求1所述的罗非鱼链球菌口服疫苗，其特征在于，所述脂质体组分包括二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的质量比为1.2：(1～3)。
5.如权利要求1所述的罗非鱼链球菌口服疫苗，其特征在于，所述表面活性剂为双辛酰胺乙基丁烷磺酸钠。
6.如权利要求1所述的罗非鱼链球菌口服疫苗，其特征在于，所述免疫组分、脂质体组分和表面活性剂的重量百分含量比为2：7：0.75。
7.一种如权利要求1～6任一所述罗非鱼链球菌口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将脂质体组分溶解于氯仿-乙醚混合溶剂中，之后将混合液转移至250mL的圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在60r/min和60℃条件下除去有机溶剂，在室温下将附有薄膜的圆底烧瓶于真空干燥器中干燥12～24h，得脂质体薄膜；
S2、另称取免疫组分和表面活性剂溶解于10mL磷酸盐缓冲溶液中，之后加入步骤S1制备得到的脂质体薄膜，均匀混合，并于40℃进行水浴加热旋转搅拌30～60min，形成粗脂质体；
S3、将步骤S2制备得到的粗脂质体进行超声分散，最后过0.45μm微孔滤膜，即得罗非鱼链球菌口服疫苗。
8.如权利要求7所述的罗非鱼链球菌口服疫苗制备方法，其特征在于，所述步骤S1中氯仿-乙醚混合溶剂的氯仿与乙醚的体积比3:2。
9.如权利要求7所述的罗非鱼链球菌口服疫苗制备方法，其特征在于，所述步骤S2中磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0～7.4。
10.如权利要求7所述的罗非鱼链球菌口服疫苗制备方法，其特征在于，所述步骤S3中超声分散的时间为5～10min。
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