KR101096577B1

KR101096577B1 - 항산균 세포벽골격의 제조 방법

Info

Publication number: KR101096577B1
Application number: KR1020100020611A
Authority: KR
Inventors: 백태현
Original assignee: 백태현
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2011-12-21
Also published as: KR20110101547A; WO2011111898A1

Abstract

본 발명은 계면활성제를 사용하여 항산균 균체로부터 탈단백, 탈지질과정을 거쳐 항산균 CWS를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, (A) 멸균된 항산균 균체에 계면활성제를 넣고 열처리하여 탈지질 및 탈단백처리하는 단계; 및 (B) 상기 탈지질 및 탈단백 처리된 항산균 균체를 세척하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산균 CWS의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 항산균의 CWS를 효소를 사용하지 않고 간단한 공정에 의해 경제적으로 대량으로 생산할 수 있을 뿐 아니라, 본 발명에 의해 제조된 항산균의 CWS는 aggregate를 형성하지 않고 균질화된 부유물로 안정하게 보관할 수 있으므로 항암면역치료나 아쥬반트로 이용 시 보다 효율적으로 사용하는 것이 가능하다.

Description

항산균 세포벽골격의 제조 방법{Preparation method for cell wall skeleton of Mycobacterium}

본 발명은 항산균의 세포벽골격을 경제적으로 대량 생산할 수 있는 항산균 세포벽골격의 제조 방법에 관한 것이다.

일반적으로 항산균 세포벽 성분은 국소 염증반응을 강력하게 자극하여 육아종(granuloma) 형성을 유도하고 효과적인 항원제시와 염증성 사이토카인 생성을 높여 면역반응을 크게 증가시킨다. 대표적인 항산균의 일종인 BCG는 약독화 생백신 균주로 1921년부터 전 세계적으로 30억명 이상에게 접종해 온 결핵백신으로 안정성이 입증되었다. 현재 BCG는 결핵백신으로서 뿐만 아니라 방광암을 포함한 다양한 악성종양의 항암면역치료제로도 많이 연구되어 왔다.

항산균의 세포벽은 건조중량의 60%정도가 복합지질성분으로 구성되어 있으며 펩티도글리칸(peptidoglycan), 아라비노갈락탄(arabinogalactan), 미콜린산(mycolic acid), 리포아라비노만난(lipoarabinomanan, LAM), 표면 지질 및 미코시드가 약 20nm의 두께로 적층된 구조로 이루어져 있다(도 1). 항산균 세포벽 성분 중에서 세포벽골격(cell wall skeleton, 이하 CWS)은 균체 중 자유 단백질, 핵산 및 지질 등의 가용성 성분을 제외한 불용성 입자로(J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)), 펩티도글리칸, 아라비노갈락탄 및 미콜린산의 복합체로 구성되어 있다.

항산균 중 특히 BCG의 CWS는 면역활성 미립자(immunoactive microparticle)로 선천면역을 자극시키는 강력한 아쥬반트로 알려져 있다. 또한 CTL의 증식과 NK 세포의 활성화를 유도하여 항암면역효과도 발휘하여, 1970년대부터 Yamamura 등(Ann N Y Acad Sci 277: 209-227)에 의하여 항암면역치료제로서의 임상적 유용성이 연구된 이래 폐암, 위암, 장암, 유방암, 혀암, 후두암, 급성 골수구백혈병, 췌장암, 난소암 등 거의 모든 암치료에 있어서 새로운 면역요법으로 소개되고 있다.

지금까지 BCG CWS 항암면역치료는 수술, 항암제 또는 방사선치료 후에 면역이 저하된 상태에서 보조적인 치료법으로만 사용되어 왔으나 최근에는 암진단 초기 단계부터 BCG CWS 항암면역요법을 실시해야 한다는 의견이 대두되고 있다. 이는 항암제나 방사선치료 시에 발생되는 광범위한 면역체계의 손상으로 심각한 면역저하상태를 초래하여 BCG CWS의 면역증강효과를 크게 기대할 수 없기 때문이다. 실제로도 항암제와 BCG CWS 면역치료를 병용했을 경우보다도 BCG CWS 단독요법이 훨씬 우수한 항암면역치료효과를 나타내었다고 보고하고 있다.

BCG CWS에 의한 면역치료를 위해서는 10~200㎍ 단위(dry wt)의 BCG CWS를 1주~1달 간격으로 수 십회 이상의 피내주사를 반복 접종해야 한다. 이러한 주사요법은 CWS의 체내 흡수율이 높아서 일정한 용량을 접종할 수 있는 장점이 있지만, 반복 접종을 요하는 경우에는 매우 번거롭고 불편하며 환자들에게 고통을 주게 된다. 또한 접종피부에 면역세포들이 집중적으로 많이 모여들기 때문에 피부발적, 피부경화(피부가 딱딱해짐), 물집 및 궤양 등의 국소 피부반응이 나타나며 심한 경우에는 국소 림프절의 종창도 일어날 수 있다. 특히 접종부위에 흉터를 남기게 되어 여러 번 반복주사를 하게 되면 환자들에게 큰 부담이 된다.

BCG CWS의 경구투여는 전술한 피내주사의 문제점을 해소할 수 있어 항암면역치료에 보다 편리하고 광범위하게 이용될 수 있다. 그러나 경구투여방법은 주사요법에 비해 CWS의 장점막을 통한 체내흡수율이 매우 낮기 때문에 1회에 경구투여되는 CWS의 용량(dry wt)을 5~10㎎ 단위(피내접종인 경우는 보통 0.05mg)까지 늘려야 하고 매일 6개월 내지 1년 이상의 경구복용이 필요하기 때문에 주사요법에 비하여 최소한 수 백배 이상의 CWS이 필요하다. 그러나 아직까지 CWS를 대량 생산할 수 있는 방법이 개발되어 있지 않기 때문에 실질적인 적용이 어렵다.

Akira 등은 BCG 균체를 단백질 분해효소인 트립신-키모트립신(trypsin-chymotrypsin)과 프로나제(pronase)로 순차적으로 처리하여 탈단백질 반응한 후 각종 유기용매를 사용한 복잡한 탈지질과정을 거쳐서 BCG CWS를 제조하는 방법을 보고하였다(US 6,593,096).

와타루 등은 상기에서 탈지질 과정을 개선하여 (A) BCG 사균을 파쇄하여 세포벽을 모은 후, (B) 벤조나제 및 프로나제를 순차적으로 처리하여 탈단백질화하고, (C) 가온하에서 계면활성제(1% Triton X-100)로 처리하여, (D) 유기용매로 세척하고 건조하는 것에 의한 BCG CWS의 제조방법을 보고하였다(JP 2008214266 A). 와타루 등은 이 방법을 통해 BCG 사균 600 g을 파쇄하여 얻은 BCG 세포벽 펠렛(pellet) 190 g으로부터 CWS를 10g 단위까지 생산하였으나, 여전히 효소처리시간에 의해 공정이 장기화되고 여러 단계를 거쳐 진행되므로 생산효율이 낮은 문제가 있다. 뿐만 아니라 아쥬반트 혹은 항암면역치료에 사용되기 위해서는 CWS의 효과적인 분산이 필요하나, 상기 방법에 의하면 최종적으로 얻어지는 CWS가 매우 딱딱하게 뭉쳐있는 덩어리이므로 이를 사용하기 위해서는 밀링에 의해 입자를 분쇄하거나 오일을 사용하여 풀어주어야 하는 문제가 있다.

이와 같이, CWS를 의약품 원료로 사용하기 위해서는 고순도의 CWS를 대량 생산할 수 있는 방법이 요구되나 현재 공지된 기술로는 이러한 목표를 달성하기는 어려운 상황이다. 따라서, 보다 단순한 공정과 저렴한 비용으로 항산균의 CWS를 대량으로 생산할 수 있는 제조방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

US, 6,593,096 JP, 2008214266, A

J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)

본 발명은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 항산균의 CWS를 경제적으로 대량 생산할 수 있는 공정을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 제조된 항산균의 CWS로부터 균질화된 부유물을 용이하게 제조할 수 있는 항산균의 CWS 제조 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 계면활성제를 사용하여 항산균 균체로부터 탈단백, 탈지질과정을 거쳐 항산균 CWS를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, (A) 멸균된 항산균 균체에 계면활성제를 넣고 열처리하여 탈지질 및 탈단백처리하는 단계; 및 (B) 상기 탈지질 및 탈단백 처리된 항산균 균체를 세척하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산균 CWS의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 항산균은 결핵균을 포함한 Mycobacterium속에 속하는 세균을 일컫는 것으로 본 발명의 실시예에서는 항산균의 일예로 Mycobacterium bovis BCG의 CWS를 제조하는 것만을 예시하였으나, 항산균은 동일한 CWS 구조를 가지므로 다른 항산균에 모두 적용될 수 있음은 당연하다.

본 발명에서 출발물질로 사용하는 멸균된 항산균 균체는 공지의 것으로 당업자라면 공지의 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 항산균을 Sauton 배지에서 배양한 후 원심분리하여 수득하고, 가열하여 멸균하는 것에 의해 얻을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다(J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)).

본 발명에서 상기 (A) 단계는 계면활성제로서 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로 비이온성 계면활성제는 탈지질에, 음이온성 계면활성제는 탈단백질에 더욱 효과적인 것으로 알려져 있으므로, 상기 (A) 단계는 비이온성 계면활성제와 음이온성 계면활성제를 함께 사용하여 열처리하는 것이 바람직하며, 순차적으로 사용하여 열처리하는 것이 더욱 바람직하다. 이때, 비이온성 계면활성제를 먼저 처리한 후 음이온성 계면활성제를 처리하는 것이 더 효율적이나, 음이온성 계면활성제를 먼저 처리한 후 비이온성 계면활성제를 처리하여도 무방하다. 즉, 계면활성제의 처리 순서는 무관한다.

또한, 계면활성제에 의해 지질 및 단백질을 보다 효율적으로 제거하기 위하여 (A) 단계의 열처리 시 초음파 처리 공정을 추가하여 수행할 수 있다. 상기 초음파 처리는 열처리 전 또는 열처리 후 어느 단계에서 추가하여도 무방하다.

이때 비이온성 계면활성제로는 Triton X-100을 비롯한 Triton X 계열의 옥틸 페놀 에톡실레이트(octyl phenol ethoxylate) 화합물 중 하나이거나 NP-40(nonyl phenoxylpolyethoxylethanol)을, 비이온성 계면활성제로는 SDS(sodium dodecyl sulfate)나 sodium lauryl ether sulfate (SLES)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 비이온성 및/또는 음이온성 계면활성제 처리 시의 농도는 사용하는 계면활성제의 종류, 처리 온도, 사용량, pH, 이온강도, 첨가제의 종류에 따라 적절히 선택하여야 함은 당연하지만, 0.5~5%(w/v) 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 계면활성제의 농도가 너무 낮으면 탈지질 및 탈단백 효과가 미흡한 것은 당연하며, 최종 계면활성제의 농도가 임계미셀농도(critical micelle concentration; CMC) 이상으로 높아도 탈지질 및 탈단백 효과가 향상되지는 못하며, 오히려 잔류 계면활성제의 농도가 높아질 우려가 있다. 상기 계면활성제 용액은 wet 상태의 항산균 균체에 대해 4~30 배(w/w)량을 사용하는 것이 바람직하다. 용액의 양이 너무 적으면 탈지질 및 탈단백이 충분히 이루어지지 않으며, 용액의 양이 너무 많으면 생산 효율이 낮아지므로 상기 범위에서 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 상기 계면활성제 처리과정에서 탈지질 및 탈단백을 보다 완벽히 하여 특히 고순도의 CWS를 제조하는 경우나, 사용 설비상의 문제로 계면활성제 용액의 사용량이 적은 경우에는 처리 회수를 반복하여도 무방하다.

상기 계면활성제의 열처리는 70℃ 이상~끓는 점까지 온도를 가온하여 처리하는 것에 의해 이루어진다. 열처리 온도가 너무 낮은 경우에 탈지질 및 탈단백 반응이 효율적으로 이루어지지 않으므로 탈지질 및 탈단백이 불완전하거나 가온 시간이 길어질 수 있다. 통상적으로 70℃ 이상~끓는 점의 온도에서 계면활성제를 처리하는 경우에는 2~5시간 가온 처리하는 것이 바람직하다.

상기 항산균 균체를 계면활성제하에서 열처리하는 것에 의해 탈지질 및 탈단백처리하여 제조한 항산균의 CWS에는 계면활성제가 잔존하므로, (B) 단계는 탈지질 및 탈단백처리에 의해 수득된 항산균의 CWS에 잔존하는 계면활성제를 세척하는 단계이다. 상기 세척 단계에서는 (1) 아세톤 세척 후, (2) 메타놀, 에타놀, 프로파놀, 부타놀 및 벤질알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알콜의 10-20%(v/v) 수용액으로 재세척하는 것이 바람직하다. 세척 용매는 (A) 단계에서 얻어진 항산균의 CWS의 wet 무게에 대해 5~30배량(v/w)을 사용하는 것이 바람직하나, CWS의 wet 정도에 따라 적절히 조절할 수 있음은 당연하다. 세척과정 역시 계면활성제 처리 공정과 마찬가지로 아세톤 혹은 알콜 수용액 세척과정을 반복할 수 있다. 또한, 아세톤 세척 전에 상기 알콜 수용액을 사용하여 전 세척과정을 거칠수도 있다.

본 발명에서 계면활성제 처리와 세척 후 항상균 균체 또는 CWS는 통상의 원심분리의 과정에 의해 수득되어 진다.

본 발명에 의해 제조된 항산균 CWS는 실시예에서와 같이 건조 후 고형물로 제조할 수도 있으나, 일단 건조하여 고형물을 형성하면 CWS의 소수성으로 인하여 수용액 또는 친수성 용액에서 서로 엉기게 되어 덩어리(aggregate)를 형성하므로 균질한 부유액을 제조하는 데 상당한 어려움이 있다. 이러한 문제를 해소하기 위하여 항산균의 CWS는 상기 세척 단계 후 건조하지 않고 메타놀, 에타놀, 프로파놀, 부타놀의 C1~C4인 알콜 또는 벤질 알콜에 부유하여 보관하며 사용하는 것이 바람직하다. 사전 실험결과 세포벽골격을 상기 알콜 중 하나에 부유한 결과 CWS의 농도가 10%(건조중량 100mg/ml) 인 경우까지도 -20℃에서 최소한 2년이상 aggregate를 형성하지 않고 안정한 상태를 유지하였다.

본 발명의 일실시예에 의해 제조된 BCG CWS를 사용하여 면역 유도시 아쥬반트로 병용한 결과, 항원의 단독 투여 시에 비교하여서는 물론 현재 아쥬반트로 사용하고 있는 alum과 유사하거나 높은 항체가를 나타내어 면역치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상과 같이 본 발명에 의하면 항산균의 CWS를 효소를 사용하지 않고 간단한 공정에 의해 경제적으로 대량으로 생산할 수 있다.

또한 본 발명에 의해 제조된 항산균의 CWS는 aggregate를 형성하지 않고 균질화된 부유물로 안정하게 보관할 수 있으므로 항암면역치료나 아쥬반트로 이용 시 보다 효율적으로 사용하는 것이 가능하다.

도 1은 항산균의 세포벽 구조를 나타내는 모식도.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

< 실시예 1>

BCG CWS의 제조

Sauton 합성배지에서 배양한 BCG 균체를 멸균 후에 2% Triton X-100과 2% SDS를 순차적으로 가하여 가온 및 초음파 파쇄(sonication)에 의한 탈지질(delipidation) 및 탈단백질반응(deproteination)을 거쳐서 BCG CWS를 정제하였다.

보다 구체적으로, Mycobacterium bovis BCG Pasteur-1173P2를 Sauton배지에서 37℃, 6주간 배양한 후에 원심분리하여(15,000 xg, 30분) BCG 균체를 수집한 후 121℃에서 15분간 고압멸균하였다. 멸균된 BCG 균체 약 3,561 g(wet 무게)에 15배량에 해당하는 2%(w/v) Triton X-100를 가하고 VCX 750 ultrasonic processor (Sonics & Materials, Inc.)을 사용하여 5분간 초음파 파쇄(35 kHz, 60W)하였다. 상기 현탁액을 100℃ 수조에서 3시간 중탕 후 원심분리하여(15,000 xg, 30분) 탈지질화된 BCG 균체 1,769.3g(wet 무게)을 수집하였다. 그 후 수집된 BCG 균체(wet weight)의 15배량에 해당하는 2% SDS를 가하여 전기와 동일한 과정으로 실온에서 5분간 초음파 파쇄(35 kHz, 60W)한 후 100℃에서 3시간 중탕 후 원심분리하여 peptidoglycan, arabinogalactan 및 mycolic acid로 구성된 BCG CWS 펠렛 881.5 g(wet 무게)을 얻었다.

상기 BCG CWS 펠렛을 15배량의 아세톤(acetone)과 20배의 10% 2-propanol로 순차적으로 세척하였다. 상기 모든 세척과정은 세척액을 가하여 진탕혼합 후에 원심분리하여(15,000 xg, 30분) BCG CWS 펠렛을 취하는 방법으로 세척하였다. 280nm에서 최종 상청액의 흡광도가 0.05이 넘는 경우, 10배의 10% 2-propanol을 사용하여 추가로 세척하여 잔존 SDS를 충분히 제거하였다.

상기 방법으로 얻어진 CWS 펠렛에 2-propanol을 가하고 충분히 교반하여 균질한 CWS 부유액로 제조하였다. CWS 부유액 중에서 1ml를 취하여 2ml microtube에 분주한 후 14,000rpm에서 10분간 microfuge하여 얻은 CWS 펠렛을 50℃에서 18시간 건조하여 건조중량(dry wt)를 측정한 후에 최종 정제된 CWS의 총 건조중량을 계산하였던 바, 107.2g의 BCG CWS를 수득하였다.

최종 정제된 BCG CWS는 건조중량 50mg/ml 농도로 2-propanol에서 부유된 상태로 -20℃에서 보관하며 사용하였다.

상기에서 제조된 BCG CWS의 순도를 종래기술에 의해 제조된 CWS와 비교, 검증하고 표준화하기 위하여 BCG-CWS에 포함되어 있는 단백질 함량을 bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit(Pierce)로 측정하였다. 1mg BCG CWS 내 단백질 함량을 5회의 제조 샘플에 대해 분석한 결과 평균 함량은 125.4㎍으로 건조 BCG CWS의 12.5%를 차지하여 Azuma 등(J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974))의 12.3%와 유사하였다.

< 실시예 2>

아쥬반트로서 BCG CWS의 효능 검정

실시예 1에서 제조된 BCG CWS를 아쥬반트로 사용하여 제조된 BCG-CWS의 효능을 검정하였다.

1) OVA 항원에 대한 아쥬반트로서의 효능 검정

6주령 BALB/c 마우스를 5마리씩 하기 표 2와 같이 6개 군으로 나누어 2주 간격으로 3회 피하주사를 통해 OVA(ovalbumin, Pierce, Rockford, Ill., USA) 항원에 대한 면역반응을 일으켰다.

면역 접종 후 2주 간격으로 혈청을 취하여 OVA-특이 IgG를 ELISA 방법으로 정량하고 표 1에 나타내었다. 표 1에서 확인할 수 있듯이, Alum 또는 BCG CWS를 OVA와 함께 투여한 제2~제6군은 OVA 단독 투여군에 비해 높은 IgG 항체가를 나타내어, 본 발명에 의해 제조된 BCG CWS가 면역원성을 크게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

2) KLH 항원에 대한 아쥬반트로서의 효능 검정

6주령 BALB/c 마우스를 5마리씩 하기 표 2와 같이 5개 군으로 나누어 2주 간격으로 3회 피하주사를 통해 KLH(keyhole limpet hemocyanin, Pierce) 항원에 대한 면역반응을 일으켰다.

면역 접종 후 2주 간격으로 혈청을 취하여 KLH-특이 IgG를 ELISA 방법으로 정량하고 표 2에 나타내었다. 표 2에서 확인할 수 있듯이, BCG CWS를 KLH와 함께 투여한 제3군~제5군의 1차 접종 시의 IgG 항체가는 alum을 아쥬반트로 사용한 제2군과 유사하거나 다소 낮았으나, 접종을 반복함에 따라 크게 증가하여 2차 면역접종 후에는 모든 군이 alum을 아쥬반트로 사용한 제2군보다 높은 IgG 항체가를 나타내었다.

3) BSA 항원에 대한 아쥬반트로서의 효능 검정

6주령 BALB/c 마우스를 5마리씩 하기 표 3과 같이 3개 군으로 나누어 2주 간격으로 3회 피하주사를 통해 BSA(bovine serum albumin, Pierce) 항원에 대한 면역반응을 일으켰다.

면역 접종 후 2주 간격으로 혈청을 취하여 BSA-특이 IgG를 ELISA 방법으로 정량하고 표 3에 나타내었다. 표 3에서 확인할 수 있듯이, BCG CWS를 BSA와 함께 투여한 제3군의 IgG 항체가는 alum을 아쥬반트로 사용한 제2군보다 높아 본 발명에 의해 제조된 BCG CWS가 면역원성을 크게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

항산균 세포벽골격의 제조 방법에 있어서,
(A) 멸균된 항산균 균체에 계면활성제를 넣고 열처리하여 탈지질 및 탈단백처리하는 단계; 및
(B) 상기 탈지질 및 탈단백 처리된 항산균 균체를 세척하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 (A) 단계는 비이온성 계면활성제와 음이온성 계면활성제를 처리 순서와 무관하게 순차적으로 사용하여 열처리하는 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (A) 단계에서 열처리 전 또는 열처리 후에 초음파 처리 공정을 추가하는 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제는 옥틸 페놀 에톡실레이트(octyl phenol ethoxylate) 화합물 중 하나이거나 NP-40(nonyl phenoxylpolyethoxylethanol)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 음이온성 계면활성제는 SDS(sodium dodecyl sulfate)나 sodium lauryl ether sulfate (SLES)인 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세척은 (1) 아세톤 세척 단계; 및 (2) 메타놀, 에타놀, 프로파놀, 부타놀 및 벤질알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 알콜의 10-20%(v/v) 수용액 세척 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산균 세포벽골격의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포벽골격은 메타놀, 에타놀, 프로파놀, 부타놀 또는 벤질알콜에 부유되어 있는 부유물의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 세포벽골격의 제조 방법.