EA014107B1 - Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae - Google Patents

Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae Download PDF

Info

Publication number
EA014107B1
EA014107B1 EA200801367A EA200801367A EA014107B1 EA 014107 B1 EA014107 B1 EA 014107B1 EA 200801367 A EA200801367 A EA 200801367A EA 200801367 A EA200801367 A EA 200801367A EA 014107 B1 EA014107 B1 EA 014107B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
vaccine
immunogenic composition
saccharide
conjugated
Prior art date
Application number
EA200801367A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801367A1 (ru
Inventor
Ральф Леон Бьеман
Натали Мари-Жозеф Гаркон
Филипп Винсент Эрман
Ян Пулман
Марсель Полетт Ван Мешлен
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39133667&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA014107(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0526232A external-priority patent/GB0526232D0/en
Priority claimed from GBGB0607088.2A external-priority patent/GB0607088D0/en
Priority claimed from GB0607087A external-priority patent/GB0607087D0/en
Priority claimed from GB0609902A external-priority patent/GB0609902D0/en
Priority claimed from GBGB0620336.8A external-priority patent/GB0620336D0/en
Priority claimed from GB0620337A external-priority patent/GB0620337D0/en
Priority claimed from GB0620816A external-priority patent/GB0620816D0/en
Priority claimed from GB0620815A external-priority patent/GB0620815D0/en
Priority claimed from PCT/GB2006/004634 external-priority patent/WO2007068907A2/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200801367A1 publication Critical patent/EA200801367A1/ru
Publication of EA014107B1 publication Critical patent/EA014107B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

В настоящем изобретении раскрыта иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты капсульных сахаридов Streptococcus pneumoniae серотипов 19А и 19F, где 19А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, a 19F конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином. Также описаны вакцины, способы изготовления вакцин и применения этих вакцин.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине на основе 81гер1ососсн5 рпеитошае.
Предшествующий изобретению уровень техники
Дети в возрасте менее 2 лет не генерируют иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому требовалось сделать эти полисахариды иммуногенными путем химического конъюгирования с белком-носителем. Связывание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает этому полисахариду свойства Т-зависимости, включая переключение изотипов, созревание аффинности и индуцирование памяти.
Однако могут возникать проблемы с повторным введением конъюгатов полисахарид-белок или комбинации конъюгатов полисахарид-белок с образованием поливалентных вакцин. Например, сообщалось, что вакцину на основе полисахаридов Наеторйбик шПиепхае типа Ь (РКР (полирибозил-рибитолфосфатный капсульный полисахарид)), в которой в качестве белка-носителя использован столбнячный анатоксин (ТТ), тестировали в диапазоне доз с одновременной иммунизацией (свободным) ТТ и вакциной на основе конъюгата пневмококковый полисахарид-ТТ, следуя стандартной схеме для детей. По мере увеличения дозы пневмококковой вакцины иммунный ответ на РКР полисахаридную часть Н1Ь конъюгатной вакцины снижался, что указывает на иммунное вмешательство полисахарида, возможно через использование одного и того же белка-носителя (Бадап е1 а1., 1пГес1. 1ттип. (1998), 66: 2093-2098).
Было также доказано, что влияние дозы белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок является разносторонним. Как сообщалось, у маленьких детей увеличение дозы тетравалентного конъюгата на основе столбнячного анатоксина приводило к снижению ответа на столбнячный носитель (Бадап е1 а1., см. выше). Классический анализ таких эффектов комбинированных вакцин был описан как индуцированная носителем супрессия эпитопов, что не совсем понятно, но представляется результатом избыточного количества белка-носителя (Байот, Уассше 17: 126 (1999)). По всей вероятности, это приводит к конкуренции за Тй-клетки между В-клетками к белку-носителю и В-клетками к полисахариду. Если преобладают В-клетки к белку-носителю, то Тй-клеток, способных обеспечить необходимую помощь специфичным к данному полисахариду В-клеткам, оказывается недостаточно. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты оказались противоречивы, так как в некоторых случаях общее количество белканосителя увеличивало иммунный ответ, а в других случаях снижало иммунный ответ.
Таким образом, остаются технические трудности при комбинировании множества полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.
81гер1ососсн5 рпеитошае является грамположительной бактерией, ответственной за значительную заболеваемость и смертность (особенно среди детей и пожилых людей), вызывающей инвазивные заболевания, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, ассоциированные с колонизацией, такие как острый средний отит. Установлено, что частота заболеваемости пневмококковой пневмонией в США для людей в возрасте старше 60 лет составляет 3-8 на 100000. В 20% случаев это приводит к бактериемии и другим проявлениям, таким как менингит, с процентом смертности, близким 30% даже при лечении антибиотиками.
Пневмококк окружен капсулой из связанного химическими связями полисахарида, который придает ему серотипическую специфичность. Существует 90 известных серотипов пневмококков, и такая капсула представляет собой ключевую детерминанту вирулентности для пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерии от комплемента, но и сама проявляет слабые иммуногенные свойства. Полисахариды являются Т-независимыми антигенами и не могут процессироваться или быть представленными на молекулах МНС (главного комплекса гистосовместимости) для взаимодействия с Т-клетками. Однако они могут стимулировать иммунную систему посредством альтернативного механизма, включающего перекрестное связывание поверхностных рецепторов на В-клетках.
В некоторых экспериментах было показано, что защита от инвазивного пневмококкового заболевания коррелирует наиболее сильно с антителом, специфичным к данной капсуле, и такая защита является серотипически специфичной.
81гер1ососси5 рпеитошае представляет собой самую распространенную причину инвазивного бактериального заболевания и среднего отита у младенцев и маленьких детей. Аналогично пожилые люди генерируют слабые ответы на пневмококковые вакцины [Кодйтапп е1 а1. (1987), 1. Сегоп1о1. 42: 265-270], отсюда - возрастающая частота заболеваемости бактериальной пневмонией в этой популяции [Уегдйеке апб Вегк (1983), Мебюше (ВаШтоге) 62: 271-285].
Поэтому задача настоящего изобретения - разработать улучшенную композицию вакцины на основе конъюгатов полисахаридов 81гер1ососсн5 рпеитошае многих серотипов.
- 1 014107
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (уровни анти-Р8 1дС после двух инокуляций (ροκΐ-ΙΙ)). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность 11-валентного конъюгата у пожилых макак-резус. Более светлые столбцы представляют собой СМС (средние геометрические концентрации) после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в алюминий-фосфатном адъюванте. Более темные столбцы представляют собой СМС после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в адъюванте С.
Фиг. 2. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (частота встречаемости анти-Р83 В-клеток памяти ροκΐ-ΙΙ). Гистограмма, на которой продемонстрированы В-клетки памяти в отношении Р83 после инокуляции 11-валентного конъюгата в адъюванте С или алюминий-фосфатном адъюванте.
Фиг. 3. Р819Р-иммуногенность у Ва1Ь/с мышей (ροκΐ-ΙΙΙ уровни 1§С). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 19Р у Ва1Ь/с мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных бР1у конъюгатов.
Фиг. 4. Р822Р-иммуногенность у Ва1Ь/с мышей (ροκΐ-ΙΙΙ уровни !дС). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 22Р у Ва1Ь/с мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных Р(йЭ конъюгатов.
Фиг. 5. Уровни сывороточных анти-Р8 !§С антител. Гистограмма, на которой продемонстрирован анти-22Р [дС-ответ у Ва1Ь/с мышей.
Фиг. 6. Опсонофагоцитарные титры. Гистограмма, на которой продемонстрированы анти-22Р опсонофагоцитарные титры у Ва1Ь/с мышей.
Фиг. 7. Сравнение IдС-ответов, индуцированных при использовании новых адъювантов, по сравнению с ответом, вызываемым при использовании А1РО4. Гистограмма для сравнения IдС-ответов, индуцированных у молодых С57В1 мышей после иммунизации 13-валентной конъюгатной вакциной, приготовленной в разных адъювантах.
Фиг. 8. Защитная эффективность комбинации белков РйЮ+бР1у против легочной колонизации типом 19Р у макак-резус. Гистограмма, на которой продемонстрирована защитная эффективность разных вакцинных комбинаций в модели пневмонии у обезьян.
Фиг. 9. Сывороточный анти-РЫИ ^С-ответ. Гистограмма, на которой продемонстрированы антиРйЮ ^С-ответы у Ва1Ь/с мышей после иммунизации конъюгатами 22Б-Р1ЦО или 22Р-АН-Рй1О.
Фиг. 10. Защита против контрольного заражения пневмококками типа 4 у мышей после иммунизации 22Б-Р111О или 22Б-АН-Р111О.
Описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты капсульных сахаридов 8ΐΐΌρΙο^^ιΐ5 ρηеитοη^ае серотипов 19А и 19Р, где 19А конъюгирован с белкомносителем, представляющим собой первый бактериальный анатоксин, а 19Р конъюгирован с белкомносителем, представляющим собой второй бактериальный анатоксин.
Термин капсульный сахарид включает капсульные полисахариды и олигосахариды, производные от этого капсульного полисахарида. Олигосахарид содержит по меньшей мере 4 остатка сахара.
Термины конъюгат и конъюгированный относятся к капсульному сахариду, ковалентно соединенному с белком-носителем.
Для целей данного изобретения иммунизация человека-реципиента против обострений СОРИ, или лечение или предупреждение обострений СОРИ, или уменьшение тяжести обострений СОРИ относятся к уменьшению возникновения обострений или частоты заболеваемости обострениями СОРИ (например, уменьшение частоты заболеваемости на 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% или более), например, в группе пациентов, иммунизированных композициями или вакцинами по изобретению.
Термин бактериальный анатоксин включает в себя бактериальные токсины, которые инактивированы в результате либо генетической мутации, либо химической обработки, либо конъюгирования. Подходящие бактериальные анатоксины включают столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин (ΌΤ). коклюшный анатоксин, бактериальные цитолизины или пневмолизин. Описаны мутации пневмолизина (Р1у), снижающие токсичность пневмолизина (\УО 90/06951, \УО 99/03884). Аналогично, известны генетические мутации дифтерийного токсина, снижающие его токсичность (см. ниже). Генетически детоксифицированные аналоги дифтерийного токсина включают СЕМ 197 и другие мутанты, описанные в И8 4709017, И8 5843711, И8 5601827 и И8 5917017. СКМ197 представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически не отличим от дифтерийного токсина. СКМ197 продуцируется С.б^ρНιНе^^ае. инфицированным нетоксикогенным фагом β197ΐοχ, созданным мутагенезом в результате действия нитрозогуанидина на токсикогенный коринефаг Ь (ИсЫба с1 а1., №Шге Νο\ν Вю^ду (1971), 233, 8-11). Белок СКМ197 имеет ту же молекулярную массу, что и дифтерийный токсин, но отличается от него изменением единственного основания в структурном гене. Это приводит к замене аминокислоты глицина на глутамин в положении 52, что делает фрагмент А не способным к связыванию с ΝΑΌ (никотинамидадениндинуклеотид) и, следовательно, не токсичным (РаρρеηЬе^те^ 1977, Апп. Кеу. ВюсНет. 46, 69-94; Β3ρρπο1ΐ, АццИеб апб ЕпСготеп1а1 МюгоЬю^ду, 8еρΐ. 1983, ρ. 560-564).
- 2 014107
Первый и второй бактериальные анатоксины могут быть одинаковыми или разными. Если первый и второй бактериальные анатоксины разные, это означает, что они имеют разную аминокислотную последовательность.
Например, 19А и 19Е могут быть конъюгированы со столбнячным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и дифтерийным анатоксином; СКМ197 и СКМ197; пневмолизином и пневмолизином; столбнячным анатоксином и дифтерийным анатоксином; столбнячным анатоксином и СКМ197; столбнячным анатоксином и пневмолизином; дифтерийным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и СКМ197; дифтерийным анатоксином и пневмолизином; СКМ197 и столбнячным анатоксином; СКМ197 и дифтерийным анатоксином; СКМ197 и пневмолизином; пневмолизином и столбнячным анатоксином; пневмолизином и дифтерийным анатоксином или пневмолизином и СКМ197 соответственно.
В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов 81гер1ососси5 рпеитошае 19А и 19Е иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды 8.рпеитошае 4, 6В, 9У, 14, 18С и 23Е.
В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов 81гер1ососси8 рпеитошае 19А и 19Е иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды 8.рпеитошае 1, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С и 23Е.
В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов 81гер1ососси5 рпеитошае 19А и 19Е иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды 8.рпеитошае 1, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 22Е и 23Е.
В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов 81гер1ососси5 рпеитошае 19А и 19Е иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды 8.рпеитошае 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 22Е и 23Е.
В одном из воплощений в дополнение к конъюгатам сахаридов 81гер1ососси5 рпеитошае 19А и 19Е иммуногенная композиция дополнительно содержит капсульные полисахариды 8.рпеитошае 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 22Е и 23Е.
Обычно вакцины на основе 81гер1ососси§ рпеитошае по настоящему изобретению будут содержать капсульные сахаридные антигены (возможно, конъюгированные), при этом сахариды происходят по меньшей мере из десяти серотипов 8.рпеитошае. Количество капсульных сахаридов 8.рпеитошае может меняться от 10 разных серотипов (или V, валентностей) до 23 разных серотипов (23У). В одном воплощении имеется 10, 11, 12, 13, 14 или 15 разных серотипов. В другом воплощении изобретения вакцина может содержать конъюгированные сахариды 8 .рпеитошае и неконъюгированные сахариды 8.рпеитошае. Возможно, общее количество сахаридных серотипов меньше или равно 23. Например, данное изобретение может включать 10 конъюгированных серотипов и 13 неконъюгированных сахаридов. Аналогично, вакцина может содержать 11, 12, 13, 14 или 16 конъюгированных сахаридов и 12, 11, 10, 9 или 7 соответственно неконъюгированных сахаридов.
В одном из воплощений поливалентная пневмококковая вакцина по изобретению будет выбрана из следующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Е, 8, 9Ν, 9ν, 10А, 11 А, 12Е, 14, 15В, 17Е, 18С, 19А, 19Е, 20, 22Е, 23Е и 33Е, хотя очевидно, что один или два других серотипа могли бы быть заменены в зависимости от возраста реципиента, в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и географического места, где эту вакцину будут вводить. Например
10- валентная вакцина может содержать полисахариды из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Е, 9ν, 14, 18С, 19Е и 23Е;
11- валентная вакцина также может включать в себя сахариды из серотипа 3;
12- или 13-валентная педиатрическая (детская) вакцина также может включать в себя 11-валентную композицию, дополненную серотипами 6А и 19А, или 6А и 22Е, или 19А и 22Е, или 6А и 15В, или 19А и 15В, или 22Е и 15В, в то время как 13-валентная вакцина для пожилых людей может включать в себя 10- или 11-валентную композицию, дополненную серотипами 19А и 22Е, 8 и 12 Е, или 8 и 15В, или 8 и 19А, или 8 и 22Е, или 12Е и 15В, или 12Е и 19А, или 12Е и 22Е, или 15В и 19А, или 15В и 22Е;
14-валентная педиатрическая вакцина может включать описанную выше 10-валентную композицию, дополненную серотипами 3, 6А, 19А и 22Е; серотипами 6А, 8, 19А и 22Е; серотипами 6А, 12Е, 19А и 22Е; серотипами 6А, 15В, 19А и 22Е; серотипами 3, 8, 19А и 22Е; серотипами 3, 12Е, 19А и 22Е; серотипами 3, 15В, 19А и 22Е; серотипами 3, 6 А, 8 и 22Е; серотипами 3, 6 А, 12Е и 22Е; или серотипами 3, 6 А, 15В и 22Е.
В одном воплощении композиция включает капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Е, 9ν, 14, 18С, 19Е и 23Е (предпочтительно конъюгированные).
В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 11 сахаридных антигенов (предпочтительно конъюгированных), например капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е, 9ν, 14, 18С, 19Е и 23Е.
В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 12 или 13 сахаридных антигенов, например вакцина может содержать капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Е, 9ν, 14, 18С, 19А, 19Е и 23Е, или капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е,
- 3 014107
9У, 14, 18С, 19А, 19Ρ, 22Ρ и 23Ρ, хотя и другие сахаридные антигены, например 23-валентной вакцины (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Ρ, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11Α, 12Ρ, 14, 15В, 17С, 18С, 19А, 19Ρ, 20, 22Ρ, 23Ρ и 33Ρ), также охвачены изобретением.
Вакцина по настоящему изобретению может содержать белок Ό (ΡΌ) из НаеторЫ1и8 тПиспхас (см., например, ЕР 0594610). НаеторЫ1и§ тПиепхае представляет собой главный организм-возбудитель среднего отита, и авторы настоящего изобретения показали, что включение этого белка в вакцину на основе 81гер1ососси5 рпеитошае будет обеспечивать уровень защиты в отношении среднего отита, связанного с НаеторЫ1и8 тПиепхае (ссылка на публикацию РОЕТ). В одном из воплощений вакцинная композиция содержит белок Ό (ΡΌ). В одном аспекте ΡΌ присутствует в качестве белка-носителя одного или более сахаридов. В другом аспекте ΡΌ может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В следующем аспекте белок Ό присутствует как в качестве белка-носителя, так и в виде свободного белка. Белок Ό может быть использован в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (XVО 0056360). В следующем аспекте белок Ό представлен в качестве белка-носителя для большинства сахаридов, например 6, 7, 8, 9 или более сахаридов могут быть конъюгированы с белком Ό. В этом аспекте белок Ό также может быть представлен в виде свободного белка.
Вакцина по настоящему изобретению содержит два или более разных типов белка-носителя. Каждый тип белка-носителя может выступать в качестве носителя более чем для одного сахарида, причем сахариды могут быть одинаковыми или разными. Например, серотипы 3 и 4 могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном из воплощений два или более разных сахаридов могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя.
Каждый капсульный сахарид §1гер1ососси8 рпеитошае может быть конъюгирован с белкомносителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, ΌΤ, СЯМ197, фрагмента С из ТТ, ΡΡΐΌ, слитых конструкций Ρ111ΒΕ или ΡΡΐΌΕ (в частности, описанных в νΟ 01/98334 и νΟ 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка Ό. Более полный перечень белковых носителей, которые могут быть использованы в конъюгатах по изобретению, представлен ниже.
Белок-носитель, конъюгированный с одним или более капсульным сахаридом 8 .рпеитошае в конъюгатах, представленных в иммуногенных композициях по изобретению, возможно является членом белков полигистидинового триадного семейства (ΡΡΐ), их фрагментами или слитыми белками. Белки ΡΡίΑ, ΡΡΐΒ, ΡΡΐΌ или ΡΡΐΕ могут иметь аминокислотную последовательность, идентичную на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% с последовательностью, раскрытой в νΟ 00/37105 или νΟ 00/39299 (например, с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4 из νΟ 00/37105 для ΡΡΐΌ). Например, слитые белки состоят из полноразмерных 2-, 3- или 4-х ΡΡΐΑ, ΡΡΐΒ, ΡΡΐΌ, ΡΡΐΕ или их фрагментов. Примерами слитых белков являются ΡΡΐΑ/Β, ΡΡΐΑ/Ό, ΡΡΐΑ/Ε, ΡΡΐΒ/Α, ΡΡΐΒ/Ό, ΡΡΐΒ/Ε, ΡΡΐΌ/Α, ΡΡΐΌ/Β, ΡΡΐΌ/Ε, ΡΡΐΕ/Α, ΡΡΐΕ/Β и ΡΡΐΕ/Ό, при этом белки связаны с белком, упомянутым, первым по Ν-концу (см., например, νΟ 01/98334).
Там, где используются фрагменты ΡΡΐ белков (по отдельности или в виде части слитого белка), каждый фрагмент возможно содержит один или более гистидиновый триадный мотив и/или участок двойной спирали таких полипептидов. Гистидиновый триадный мотив представляет собой часть полипептида, имеющего последовательность НххНхН, где Н является гистидином, а х является аминокислотой, отличной от гистидина. Участок двойной спирали представляет собой участок, спрогнозированный на основании алгоритма Сойк (Ьирик, Α. еΐ а1. (1991), 8с1епсе 252: 1162-1164). В одном из воплощений этот или каждый фрагмент включает один или более гистидиновый триадный мотив, а также по меньшей мере один участок двойной спирали. В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 гистидиновых триадных мотивов (возможно, с нативной ΡΡΐ-последовательностью между 2 или более триадами либо внутритриадной последовательностью, более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентичной нативной внутритриадной ΡΡΐ-последовательности пневмококков - например, внутритриадной последовательности, показанной в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4 из νθ 00/37105 для ΡΡΐΌ). В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3 или 4 участка двойной спирали. В одном из воплощений ΡΡΐ-белок, раскрытый в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Ν-конце), существующие в природе варианты ΡΡΐ-белка и иммуногенные фрагменты ΡΡΐ-белка (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в νΟ 00/37105 или νΟ 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфический для аминокислотной последовательности, указанной в νΟ 00/37105 или νΟ 00/39299).
В частности, термин ΡΡΐΌ, как он использован в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Ν-конце), существующие в природе варианты ΡΡΐΌ и иммуногенные фрагменты ΡΡΐΌ (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, со
- 4 014107 держащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности Ρ111Ό в νθ 00/37105 или νθ 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для Ρ111Ό аминокислотной последовательности, указанной в νθ 00/37105 или νθ 00/39299 (например, ЧТ) ГО N0: 4 из νθ 00/37105 для РЫВ).
Если белковый носитель является одинаковым для 2 или более сахаридов в композиции, эти сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (при этом молекулы носителя будут иметь еще 2 разных сахарида, конъюгированных с ним) [см., например νθ 04/083251]. Альтернативно, каждый из сахаридов по отдельности может быть конъюгирован с разными молекулами белкового носителя (при этом с каждой молекулой белкового носителя конъюгирован только один тип сахарида).
Примерами белков-носителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются ΌΤ (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмент С из ТТ, ΌΤ СКМ197 (мутант ΌΤ), другие точечные мутанты ΌΤ, такие как СКМ176, СКМ228, СКМ45 (ИсЫба е! а1. 1. ΒίοΙ. СЫет. 218: 3838-3844, 1973); СКМ9, СКМ45, СРМ102, СКМ103 и СКМ107, и другие мутации, описанные в ΝίοΠοΙΙκ апб Уои1е, СепебсаПу Епдшеегеб Τοχίηκ, Еб: Егапке1, Маесе1 Эеккег 1пс., 1992; делеция или мутация О1и-148 на Акр, О1п или 8ег и/или А1а 158 на О1у и другие мутации, раскрытые в И8 4709017 или И8 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Ьук 516, Ьук 526, РЫе 530 и/или Ьук 534 и другие мутации, раскрытые в И8 5917017 или И8 6455673; или фрагмент, раскрытый в И8 5843711, пневмококковый пневмолизин (Кио е! а1. (1995) 1пГес1. 1ттип. 63: 2706-13), включая р1у, детоксифицированный каким-либо образом, например бРЬУ-ОМВ8 (ОМВ8 означает №[д-малеимидобутирилокси]сульфосукцинимидный эфир) (νθ 04081515, РСТ/ЕР2005/010258) или бРЬУ-формол, РЫХ, включая Р1ПА. РЫВ, Ρ1ΠΌ. РЫЕ, и слитые конструкции РЫ белков, например слитые конструкции РЫОЕ, слитые конструкции РЫВЕ (νθ 01/98334 и νθ 03/54007) (РП1 А-Е описаны более подробно ниже), ОМРС (менингококковый белок наружной мембраны - обычно экстрагируемый из Ктешпдй1б18 серогруппы В - ЕР 0372501), РогВ (протохлорфиллид-оксидоредуктаза В) (из Ктешпдй1б18), РЭ (белок Ό НаеторШик шПиепхае - см., например, ЕР 0594610 В) или их иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР0378881, ЕР0427347), белки теплового шока (νθ 93/17712, νθ 94/03208), коклюшные белки (νθ 98/58668, ЕР0471177), цитокины, лимфокины, ростовые факторы или гормоны (ν0 91/01146), искусственные белки, содержащие многочисленные человеческие СЭ4+ Т-клеточные эпитопы из различных антигенов, происходящих из патогенов (Еа1ид е! а1. (2001), Еиг. 1. 1ттипо1. 31: 3816-3824), такие как белок N19 (Вага1бо1 е! а1. (2004), 1пГес!. 1ттип. 72: 4884-7), пневмококковый поверхностный белок РкрА (νθ 02/091998), железосвязывающие белки (νθ 01/72337), токсин А или В из С.бгГйсйе (νθ 00/61761). В Мпкка е! а1., Реб1а(г1с 1пГес1юик Ощеаке 1оита1, 23(11): 1008-14, 2004 №г. описана 11-валентная пневмококковая вакцина со всеми серотипами, конъюгированными с РО. Однако авторы настоящего изобретения показали, что опсонофагоцитарная активность была улучшенной в отношении антител, индуцированных конъюгатами, имеющими 19Е, конъюгированный с ΌΤ, по сравнению с 19Е, конъюгированным с РО. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что более высокая перекрестная реактивность в отношении 19А наблюдается при использовании 19Е, конъюгированного с ΌΤ. Следовательно, особенностью композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19Е конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ, пневмолизином, ΌΤ или СКМ197.
В одном аспекте серотип 19Е конъюгирован с ΌΤ. Также особенностью композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19А конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ, пневмолизином, ΌΤ или СКМ197. Все остальные сахаридные серотипы иммуногенной композиции могут быть конъюгированы с одним или более белками-носителями, не являющимися ΌΤ (т.е. только 19Е конъюгирован с ΌΤ), или могут быть распределены между одним или более белками-носителями, не являющимися ΌΤ, и самим ΌΤ.
В одном воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а все остальные серотипы конъюгированы с РО.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО и ТТ, или ΌΤ, или СКМ197.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СКМ197 и не более чем один сахарид конъюгирован с ТТ.
В одном аспекте этого воплощения одним указанным сахаридом является 18С или 12Е.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СКМ197 и не более чем два сахарида конъюгированы с ТТ.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ и ΌΤ или СКМ197.
В другом воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ и пневмолизином.
В еще одном воплощении 19Е конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ и СКМ197.
- 5 014107
В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СВМ197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ, пневмолизином и возможно Ρ111Ό или слитым белком Ρ111Ό/Ε.
В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ, пневмолизином и возможно Ρ111Ό или слитым белком Ρ111Ό/Ε.
В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, еще один сахарид конъюгирован с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с Ρ111Ό или ΡΙιΐΌ/Е. а все остальные сахариды конъюгированы с ΡΌ.
В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином, еще один сахарид конъюгирован с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с пневмолизином, еще 2 других сахарида конъюгированы с Ρ111Ό или ΡΗΐΌ/Ε, а все остальные сахариды конъюгированы с ΡΌ.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит белок Ό из НаеторЫ1и8 тПиспхас. В этом воплощении, если ΡΌ не является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования с любыми сахаридами, отличными от 19Р, например 19Р конъюгирован с ΌΤ, в то время как другие серотипы конъюгированы с одним или более другими белками-носителями, не являющимися ΡΌ, тогда ΡΌ будет присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. Если ΡΌ является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования сахаридов, отличных от 19Р, тогда ΡΌ возможно, может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка.
Термин сахарид в данном описании может указывать на полисахарид или олигосахарид и включает в себя их оба. Полисахариды выделяют из бактерий, и они могут быть до некоторой степени доведены до определенного размера известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525), и возможно микрофлюидизацией. Полисахариды могут быть доведены до определенного размера с целью снижения вязкости полисахаридных образцов и/или для улучшения фильтруемости конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют небольшое количество повторяющихся единиц (обычно 5-30 повторяющихся единиц) и обычно представляют собой гидролизованные полисахариды.
Капсульные полисахариды §1гер1ососси8 рпеитошае содержат повторяющиеся олигосахаридные единицы, которые могут содержать вплоть до 8 сахарных остатков. Обзора по олигосахаридным единицам ключевых серотипов §1гер1ососси8 рпеитошае см. в 1ΟΝΕ8, СНгШорНег Уассшек Ьакей оп 1Не се11 кшТасе сагЬойубга1е8 оГ ра1одешс Ьас1епа. Ап. Асай. Вгак. С1епс, 1ипе 2005, уо1. 77, № 2, р. 293-324. Ι88Ν 0001-3765. В одном воплощении капсульный сахаридный антиген может представлять собой полноразмерный полисахарид, однако в других воплощениях это может быть одна олигосахаридная единица или более короткая, чем длина нативной цепи, сахаридная цепь из повторяющихся олигосахаридных единиц. В одном воплощении все сахариды, присутствующие в вакцине, являются полисахаридами. Полноразмерные полисахариды могут быть доведены до определенного размера, т.е. их размер может быть уменьшен различными способами, такими как обработка посредством кислотного гидролиза, обработка перекисью водорода, уменьшение размера с помощью етпЫПех® с последующей обработкой перекисью водорода для образования олигосахаридных фрагментов или микрофлюидизация.
Авторы изобретения также отмечают, что в данной области техники внимание было сфокусировано на применении олигосахаридов для облегчения получения конъюгатов. Авторы изобретения обнаружили, что в результате использования нативных или слегка уменьшенных в размере полисахаридных конъюгатов может быть реализовано одно или более из следующих преимуществ:
1) конъюгат с высокой иммуногенностью, являющийся фильтруемым;
2) соотношение полисахарида и белка в конъюгате может быть изменено таким образом, чтобы увеличить отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате (что может влиять на эффект супрессии носителем);
3) иммуногенные конъюгаты, имеющие склонность к гидролизу, могут быть стабилизированы посредством применения больших по размеру сахаридов для конъюгирования.
Применение больших по размеру полисахаридов может приводить к большему сшиванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из конъюгата. В конъюгатных вакцинах, описанных в предшествующем уровне техники, имеется тенденция к деполимеризации полисахаридов перед конъюгированием для улучшения конъюгирования. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сахаридные конъюгатные вакцины, сохраняющие больший размер сахарида, могут вызывать хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания.
Таким образом, иммуногенная композиция по изобретению может содержать один или более чем один сахаридный конъюгат, где средний размер (например, средневзвешенная молекулярная масса М„) каждого сахарида перед конъюгированием составляет более 80, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 кДа. В одном воплощении конъюгат после конъюгирования должен легко фильтроваться через фильтр 0,2 мкм, так чтобы после фильтрации получался выход более 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с образцом до фильтрации.
- 6 014107
Для целей данного изобретения нативный полисахарид относится к сахариду, который не был подвергнут обработке, целью которой является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может стать немного меньшим по размеру в ходе обычных процедур очистки. Такой сахарид все еще является нативным. Только если полисахарид был подвергнут процедурам уменьшения размера, такой полисахарид не считается нативным.
Для целей данного изобретения уменьшенный в размере вплоть до х2 раз означает, что сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого сахарида, но с сохранением размера, равного более чем половине размера нативного полисахарида. х3, х4 и т.д. следует интерпретировать таким же образом, т.е. сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого полисахарида, но с сохранением размера, равного более чем трети, четверти и т.д. размера нативного полисахарида.
В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 81тер1ососси5 рпеитошае по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид 8.рпеитошае представляет собой нативный полисахарид.
В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 81тер1ососси5 рпеитошае по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или все сахариды 8.рпеитошае уменьшены в размере вплоть до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10 раз. В одном воплощении этого аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов, уменьшены в размере вплоть до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10 раз.
Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида в данном описании относится к средневзвешенной молекулярной массе (М„) сахарида, измеренной до конъюгирования, и ее измеряют с помощью МАЬЬ8 (многоуглового рассеяния лазерного света).
Методика МАЬЬ8 хорошо известна в данной области техники, и ее обычно выполняют, как описано в примере 2. Для МАТЬ8-анализа пневмококковых сахаридов можно использовать в комбинации две колонки (Т8КС6000 и 5000Р^х1), и сахариды элюируют в воде. Сахариды детектируют, используя детектор рассеяния света (например, \Ууа11 Оа\уп Ό8Ρ, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и инферометрический рефрактометр (например, \Ууа11 ОШаЬ Ό8Ρ, оборудованный ячейкой Р100 и красным фильтром на 498 нм).
В одном из воплощений сахариды 8.рпеитошае представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, размер которых был уменьшен в процессе обычного процесса экстракции.
В одном из воплощений сахариды 8.рпеитошае уменьшены в размере посредством механического расщепления, например микрофлюидизацией или обработкой ультразвуком. Микрофлюидизация и воздействие ультразвука имеют преимущество, уменьшая размер более крупных нативных полисахаридов в степени, достаточной для получения фильтруемого конъюгата. Уменьшение в размере осуществляют не более чем в х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3 или х2 раза.
В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит конъюгаты 8.рпеитошае, которые приготовлены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые уменьшены в размере не более чем в х20 раз. В одном аспекте этого воплощения большая часть сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов, уменьшены в размере вплоть до х2, х3, х4, х5 или х6 раз.
В одном из воплощений сахарид 81гер1ососси5 рпеитошае конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Линкер, возможно, является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим, например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную карбоновокислотную группу, 2 реакционноспособные аминогруппы или две реакционноспособные карбоновокислотные группы. Линкер имеет, например, 4-20, 4-12, 5-10 атомов углерода. Возможным линкером является ΆΌΗ (дигидразид адипиновой кислоты). Другие линкеры включают В-пропионамидо (\УО 00/10599), нитрофенилэтиламин (Сеует е1 а1. (1979), Мек. М1стоЬю1. 1ттипо1. 165: 171-288), галогеноалкилгалогениды (И8 4057685), гликозидные связи (И8 4673574, И8 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (И8 4459286). В одном из воплощений в качестве линкера для конъюгирования сахарида из серотипа 18С используют ΆΌΗ.
Сахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению, могут быть получены любым известным методом сочетания. Способ конъюгирования может быть основан на активации сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (СОАР) с образованием сложного цианатного эфира. Таким образом, активированный сахарид может быть подвергнут сочетанию непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно связать с носителем через простую тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с малеимид-активированным белком-носителем (например, с использованием СМВ8) или галогеноацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида [например этилйодацетимида НС1], или Ν-сукцинимидил-бромацетата, или 81АВ (Ы-сукцинимидил-(4-йодацетат)аминобензоат), или 81А (Ν-сукцинимидил-иодацетат), или 8ВАР (№сукцинимидил-3-(бромацетатамидо)пропионат). Возможно, цианатный сложный эфир (возможно, полученный посредством СЭАР
- 7 014107 химии) подвергают сочетанию с гексан-диамином или ΆΌΗ, и аминопроизводный сахарид конъюгируют с белком-носителем, используя карбодиимидную (например, ЕЭАС или ЕЭС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид)) химию, через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке νθ 93/15760 (Ипйогтеб 8егу1се8 Ишуегайу), νθ 95/08348 и νϋ 96/29094.
В других подходящих методиках используются карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборнан, паранитробензойная кислота, Ν-гидроксисукцинимид (ΝΗ8), 8-ΝΗ8 (сульфо-ΝΗδ), ЕЭС, ΤδΤϋ (О-(№сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат). Многие методики описаны в \νϋ 98/42721. В конъюгирование может быть вовлечен карбонильный линкер, который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с СЭ1 (1,1'-карбонилдиимидазол) (Ве111е11 е! а1. 1. Вю1. СЕет. 1979, 254: 2572-4; Неагп с! а1. 1. СЕготаЮщ. 1981, 218: 509-18) и последующего взаимодействия с белком с образованием карбаматной связи. Этот способ может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможное введение защиты/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с СЭ1 с образованием СЭ1-карбаматного промежуточного соединения и сочетание СЭ1карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.
Конъюгаты также могут быть получены методами прямого восстановительного аминирования, как описано в И8 4365170 ОеппЕщО и И8 4673574 (Апйегаоп). Другие методы описаны в ЕР-0161188, ЕР-208375 и ЕР-0477508.
Другой способ включает связывание активированного бромцианом (или СЭАР) сахарида, дериватизированного с использованием дигидразида адипиновой кислоты (ΑΌΗ), с белковым носителем посредством карбодиимидной конденсации (Сйи С. е! а1. 1пГес1. 1ттипйу, 1983, 245-256), например с использованием ЕЭАС.
В одном из воплощений гидроксильную группу (возможно, активированную гидроксильную группу, например гидроксильную группу, активированную с целью получения цианатного сложного эфира [например, используя СЭАР]) на сахариде связывают с аминогруппой или карбоксильной группой на белке либо непосредственно, либо опосредовано (через линкер). Если присутствует линкер, то гидроксильную группу на сахариде предпочтительно связывают с аминогруппой на линкере, например используя СЭАР-конъюгирование. Другая аминогруппа в линкере (например, ΑΌΗ) может быть конъюгирована с карбоновокислотной группой на белке, например с использованием карбодиимидной химии, например путем использования ЕЭАС. В одном из воплощений пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы) конъюгируют с линкером до того, как линкер конъюгируют с белком-носителем. Альтернативно, линкер может быть конъюгирован с носителем до конъюгирования с сахаридом.
Также можно применять комбинацию методик, при этом некоторые конъюгаты сахарид-белок получают с использованием СЭАР, а некоторые - путем восстановительного аминирования.
В общем случае для связывания/конъюгирования могут быть использованы следующие типы химических групп на белковом носителе:
а) карбоксильная (например, через аспарагиновую или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу связывают с аминогруппами на сахаридах непосредственно или с аминогруппой на линкере, используя карбодиимидную химию, например ЕЭАС;
б) аминогруппа (например, через лизин). В одном воплощении эту группу связывают с карбоксильными группами на сахаридах непосредственно или с карбоксильной группой на линкере, используя карбодиимидную химию, например ЕЭАС. В другом воплощении эту группу связывают с гидроксильными группами, активированными СЭАР или ΕΝΒγ на сахаридах непосредственно, или с такими же группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами, имеющими сукцинимидную эфирную группу;
в) сульфгидрил (например, через цистеин). В одном воплощении эту группу связывают с бром- или хлор-ацетилированным сахаридом или линкером, используя малеимидную химию. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
г) гидроксильная группа (например, через тирозин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
д) имидазолильная группа (например, через гистидин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
е) гуанидильная группа (например, через аргинин);
ж) индолильная группа (например, через триптофан).
В общем случае для связывания на сахариде можно использовать следующие группы: ОН, СООН или ΝΗ2. Альдегидные группы могут быть образованы в результате разных обработок, известных в данной области техники, таких как обработка периодатом, кислотный гидролиз, обработка перекисью водорода и т.д.
- 8 014107
Подходы на основе прямого связывания:
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СБАР ы цианатный эфир + ПН2-белок ы конъюгат; сахарид-альдегид + NН2-белок ы основание Шиффа + ΝΟΒΗ ы конъюгат; сахарид-СООН + ΝΗ-белок + ЕБАС ы конъюгат;
сахарид-ΝΗ + СООН-белок + ЕБАС ы конъюгат.
Подходы на основе непрямого связывания через спейсер (линкер):
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СБАР ы цианатный эфир + ΝΗ2-—ΝΗ2 ы сахарид-—ΝΗ2 + СООН-белок + ЕБАС ы конъюгат;
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СБАР ы цианатный эфир + ΝΗ2-—δΗ ы сахарид-—δΗ + δΗ-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например, 8РБР (Ы-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат)) ы сахарид-8-§-белок;
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СБАР ы цианатный эфир + ΝΗ2-—δΗ ы сахарид-—δΗ + малеимид-белок (модификация аминогрупп) ы конъюгат;
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СБАР ы цианатный эфир + ΝΗ2-—δΗ ы сахарид-δΗ + галогенацетилированный белок ы конъюгат;
сахарид-СООН + ЕБАС + ΝΗ2-—ΝΗ2 ы сахарид-—ΝΗ2 + ЕБАС + СООН-белок ы конъюгат;
сахарид-СООН + ЕБАС+ ΝΗ2-—δΗ ы сахарид-—δΗ + δΗ-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например, δΓΒΓ) ы сахарид^^-белок;
сахарид-СООН + ЕБАС+ ΝΗ2-—δΗ ы сахарид-—δΗ + малеимид-белок (модификация аминогрупп) ы конъюгат;
сахарид-СООН + ЕБАС + ΝΗ2-—δΗ ы сахарид-δΗ + галогенацетилированный белок ы конъюгат; сахарид-альдегид + ΝΗ2-—ΝΗ2 ы сахарид-—ΝΗ2 + ЕБАС + СООН-белок ы конъюгат.
Примечание: вместо указанного выше ЕБАС можно использовать любой подходящий карбодиимид.
Таким образом, типами химических групп белкового носителя, которые обычно могут быть использованы для сочетания с сахаридом, являются аминогруппы (например, на остатках лизина), группы СООН (например, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и группы δΗ (если это приемлемо) (например, на остатках цистеина).
Возможно, что соотношение белка-носителя и сахарида δ.ρηеитοη^ае составляет от 1:5 до 5:1; от 1:2 до 2,5:1; от 1:1 до 2:1 (мас./мас.). В одном из воплощений большинство конъюгатов, например 6, 7, 8, 9 или более конъюгатов, имеют соотношение белка-носителя к сахариду, превышающее 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1.
В одном из воплощений по меньшей мере один сахарид δ.ρηеитοη^ае конъюгирован с белкомносителем через линкер с использованием СБАР и ЕБАС. Например, 18С может быть конъюгирован с белком через линкер (например, линкер с двумя группами гидразино на концах, такой как АБИ) с использованием СБАР и ЕБАС, как описано выше. При использовании линкера СБАР можно использовать для конъюгирования сахарида с линкером, и ЕБАС затем можно использовать для конъюгирования линкера с белком или, альтернативно, сначала ЕБАС может быть использован для конъюгирования линкера с белком, после чего СБАР может быть использован для конъюгирования линкера с сахаридом.
В общем случае иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата от 0,1 до 20 мкг, от 1 до 10 мкг или от 1 до 3 мкг сахарида.
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный сахарид δ.ρηеитοη^ае в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида. В одном из воплощений капсульные сахариды могут быть представлены в разных дозировках, например некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 1 мкг или некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 3 мкг. В одном из воплощений сахариды из серотипов 3, 18С и 19Е (или 4, 18С и 19Е) представлены в более высокой дозе, чем другие сахариды. В одном аспекте этого воплощения серотипы 3, 18С и 19Е (или 4, 18С и 19Е) представлены в дозе приблизительно или точно 3 мкг, в то время как другие сахариды в иммуногенной композиции представлены в дозе приблизительно или точно 1 мкг.
Около или приблизительно определяют как нахождение в пределах больше или меньше 10% от приведенной цифры для целей данного изобретения.
В одном из воплощений по меньшей мере один из капсульных сахаридов δ.ρηеитοη^ае непосредственно конъюгирован с белком-носителем. Возможно по меньшей мере один из капсульных сахаридов δ.ρηеитοη^ае непосредственно конъюгирован с использованием СБАР. В одном из воплощений большинство капсульных сахаридов, например 5, 6, 7, 8, 9 или более, непосредственно связаны с белкомносителем с использованием СБАР (см. НО 95/08348 и НО 96/29094).
- 9 014107
Иммуногенная композиция может содержать белки 81гер1ососси8 рпеитошае, называемые в данном описании как белки 81гер1ососси8 рпеитошае по изобретению. Такие белки могут быть использованы в качестве белков-носителей, или могут быть представлены в виде свободных белков, или могут быть представлены как в качестве белков-носителей, так и в виде свободных белков. Белки 81гер1ососси8 рпеитошае по изобретению либо экспонированы на поверхности, по меньшей мере в течение части жизненного цикла пневмококка, либо являются белками, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Белки по изобретению возможно выбраны из следующих категорий, таких как белки, имеющие мотив сигнальной последовательности II типа ЬХХС (где X представляет собой любую аминокислоту, например полигистидиновое триадное семейство (РЫ1Х)), холинсвязывающие белки (СЬрХ), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности I типа (например, 8р101), белки, имеющие мотив ЬРХТО (где X представляет собой любую аминокислоту, например 8р128, 8р130), и токсины (например, Р1у). Примерами среди этих категорий (или мотивов) являются следующие белки или их иммунологически функциональные эквиваленты.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере 1 белок, выбранный из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (РЫ1Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, Ьу1Х-семейства, укороченных Ьу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный СЬрХ-укороченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (РЙ1Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, Ьу1Х-семейства, укороченных Ьу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный СЬрХ-укороченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА и 8р128. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более чем два белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (РЫ1Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, Ьу1Х-семейства, укороченных Ьу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный СЬрХ-укороченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у) и 8р128.
РЫ (полигистидиновое триадное)-семейство включает белки РЫ1А, РЫ1В, РЫЭ и РЫ1Е. Это семейство характеризуется липидированной последовательностью, двумя доменами, разделенными пролинобогащенным участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно вовлеченными в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативную активность, (3-5)-участками двойной спирали, консервативным Ν-концом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестируемых штаммах пневмококков. Гомологичные белки также были обнаружены у других стрептококков и нейсеррий. В одном из воплощений изобретения РЫ-белок по изобретению представляет собой РЫЭ. Однако понятно, что термины РЫ А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также к их существующим в природе (и искусственным) вариантам, имеющим гомологию последовательностей, которая по меньшей мере на 90% идентична белкам из ссылок. Предпочтительно она идентична по меньшей мере на 95% или идентична по меньшей мере на 97%.
Что касается белков РЫХ, то РИА раскрыт в \УО 98/18930 и также упоминается как 8р36. Как указано выше, он является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. РЫЭ раскрыт в \УО 00/37105 и также упоминается как 8р036Э. Как указано выше, он также является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. РЫВ раскрыт в XV О 00/37105 и также упоминается как 8р036В. Другим членом РЫВ -семейства является С3-деградированный полипептид, как раскрыто в νθ 00/17370. Этот белок также принадлежит полигистидиновому триадному семейству, и он имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. Например, иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в νθ 98/18930. Укороченный РЫВ (приблизительно 79 кДа) раскрыт в νθ 99/15675 и также считается членом РЫХ-семейства. РЫЕ раскрыт в νθ 00/30299 и упоминается как ВУН-3. Когда в данном описании упоминается РЫ-белок, это означает, что могут быть использованы иммуногенные фрагменты или слитые конструкции этого РЫ-белка. Например, ссылка на РЫХ включает в себя иммуногенные фрагменты или слитые конструкции любого РЫ-белка. Ссылка на РЫЭ или РЫВ также является ссылкой на слитые конструкции РЫЭЕ или РЫВЕ, которые можно обнаружить, например, в νθ 0198334.
Пневмолизин представляет собой многофункциональный токсин с явно выраженными цитолитической (гемолитической) активностью и активностью активации комплемента (КиЬшк е! а1., Ат. Рекрг Сй. Саге Меб., 153: 1339-1346 (1996)). Этот токсин не секретируется пневмококками, но он высвобождается при лизисе пневмококков под действием аутолизина. Его эффекты включают, например, стимуляцию продуцирования воспалительных цитокинов человеческими моноцитами, ингибирование пульсации ресничек на эпителии дыхательных путей человека и уменьшение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее явным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, который включает связывание с холестерином. Поскольку он является токсином, его необходимо детоксифицировать (т.е. сделать нетоксичным для человека, получающего его в дозе, пригодной для защиты), до того как его можно будет вводить ίη угуо. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмолизина известны в данной области техники. См., например, Χνηϋ^Γ е! а1. ДЫес!. Iттиη., 55: 1184
- 10 014107
1189 (1987)), МйсЬе11 е! а1. (ВюсЫт. В1орйу8. Ас!а, 1007: 67-72 (1989)) и Мйсйе11 е! а1. (ΝΑΒ, 18: 4010 (1990)). Детоксификация Р1у может быть проведена химическим образом, например обработкой формалином или обработкой глутаровым альдегидом или комбинацией обоих (АО 04081515, РСТ/ЕР2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области для различных токсинов. Альтернативно, Р1у может быть генетически детоксифицирован. Таким образом, данное изобретение охватывает производные пневмококковых белков, которые могут быть, например, мутантными белками. Термин мутантный использован в данном описании для обозначения молекулы, подвергнутой делеции, вставке или замене одной или более аминокислоты с использованием хорошо известных методик сайтнаправленного мутагенеза или любого другого традиционного метода. Например, как описано выше, мутантный белок Р1у может быть изменен таким образом, что он будет биологически неактивен, в то же время сохраняя свои иммуногенные эпитопы (см., например, АО 90/06951, Веггу е! а1. (1п1ес1. 1ттип., 67: 981-985 (1999)) и АО 99/03884).
Очевидно, что используемый в данном описании термин Р1у относится к мутантному или детоксифицированному пневмолизину, подходящему для медицинского применения (т.е. нетоксичному).
Что касается семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), то члены этого семейства первоначально были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно было очистить холин-аффинной хроматографией. Все холинсвязывающие белки связаны нековалентными связями с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты из клеточной стенки и мембран-ассоциированной липотейхоевой кислоты. Структурно они имеют несколько участков, общих для всего семейства, хотя точная природа белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьироваться. В общем случае холинсвязывающие белки содержат Ν-концевой участок (Ν), консервативные повторяющиеся участки (КТ и/или К2), пролинобогащенный участок (Р) и консервативный холинсвязывающий участок (С), составленный из множественных повторов, который составляет приблизительно половину белка. При использовании в данном описании термин семейство холинсвязывающих белков (СЬрХ) выбран из группы, состоящей из холинсвязывающих белков, которые идентифицированы в АО 97/41151, РЬсА, 8ркА, РкрС, СЬрА, СЬрЭ и СЬрО; СЬрА раскрыт в АО 97/41151. СЬрЭ и СьрО раскрыты в АО 00/29434; РкрС раскрыт в АО 97/09994; РЬсА раскрыт в АО 98/21337. 8ркА представляет собой холинсвязывающий белок, раскрытый в АО 98/39450. Возможно холинсвязывающие белки выбраны из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС.
Одним воплощением изобретения являются укороченные СЬрХ, где СЬрХ определен выше, а термин укороченные относится к СЬрХ белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка (С) или более. Возможно, что у таких белков отсутствует весь холинсвязывающий участок. Возможно, что у таких укороченных белков отсутствует (1) холинсвязывающий участок и (2) часть Ν-концевой половины данного белка, при этом остается по меньшей мере один повторяющийся участок (К1 или К2). Возможно, что укороченная структура имеет 2 повторяющихся участка (К1 и К2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются ΝΚ1χΚ2 и К1хК2, как проиллюстрировано в АО 99/51266 или АО 99/51188, однако другие холинсвязывающие белки, у которых отсутствует аналогичный холинсвязывающий участок, также считаются входящими в объем данного изобретения.
Ьу1Х-семейство представляет собой мембран-ассоциированные белки, связанные с лизисом клеток. Ν-концевой домен содержит холинсвязывающий(е) домен(ы), однако Ьу1Х-семейство не имеет всех признаков, обнаруженных у СЬрА-семейства, как указано выше, и, таким образом, для настоящего изобретения Ьу1Х-семейство считается отличающимся от СЬрХ-семейства. В противоположность СЬрХсемейству, С-концевой домен содержит каталитический домен Ьу1Х белкового семейства. Это семейство включает в себя Ьу1А, В и С. Что касается Ьу1Х-семейства, то Ьу1А раскрыт в Копба е! а1., Еиг. 1. Вюсйет., 164: 621-624 (1987). Ьу1В раскрыт в АО 98/18930, где он также обозначен как 8р46. Ьу1С также раскрыт в АО 98/18930 и также упоминается как 8р91. Предпочтительным членом этого семейства является Ьу1С.
Другим воплощением являются укороченные Ьу1Х, где Ьу1Х определен выше, и термин укороченные относится к Ьу1Х-белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка или более. Возможно, что у таких белков отсутствует весь холинсвязывающий участок. Еще одним воплощением данного изобретения являются химерные белки (или слитые конструкции) - укороченные СЬрХукороченные Ьу1Х. Предпочтительно, чтобы они содержали ΝΚ1χΚ2 (или К1хК2) от СЬрХ и С-концевую часть (С(егт. т.е., чтобы отсутствовали холинсвязывающие домены) от Ьу1Х (например, Ьу1СС1егт или 8р91С1егт). Более предпочтительно СЬрХ выбран из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС. Возможно, он представляет собой СЬрА. Возможно, Ьу1Х представляет собой Ьу1С (также упоминаемый как 8р91). Другим воплощением настоящего изобретения является укороченный РкрА или РкаА, у которого отсутствует холинсвязывающий домен (С) и который экспрессируется в виде слитого белка с Ьу1Х. Возможно, Ьу1Х представляет собой Ьу1С.
- 11 014107
Что касается РкаА и РкрА, то оба известны в данной области. Например, РкаА и его варианты с трансмембранной делецией описаны в Веггу & Ра!оп, 1пГсс1. 1ттип., 1996, Эсс. 64(12): 5255-62; РкрА и его варианты с трансмембранной делецией раскрыты, например, в И8 5804193, XVО 92/14488 и АО 99/53940.
8р128 и 8р130 раскрыты в АО 00/76540; 8р125 является примером пневмококкового поверхностного белка с заякоренным в клеточной стенке мотивом ЬРХТО (где X представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок из этого класса пневмококковых поверхностных белков с таким мотивом полезен в контексте данного изобретения и, следовательно, считается дополнительным белком по изобретению. Сам 8р125 раскрыт в АО 98/18930 и также известен как 2трВ - цинковая металлопротеиназа. 8р101 раскрыт в АО 98/06734 (где он упоминается как #у85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью I типа. 8р133 раскрыт в АО 98/06734 (где он упоминается как #у85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью I типа.
Примерами белковых антигенов Могахе11а са1атгйа11к, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), являются следующие:
ОМР106 [АО 97/41731 (Ап!ех) и АО 96/34960 (РМС)];
ОМР21 или его фрагменты (АО 0018910);
ЬЬрА и/или ЬЬрВ [АО 98/55606 (РМС)];
ТЬрА и/или ТЬрВ [АО 97/13785 и АО 97/32980 (РМС)];
СорВ [Не1тшеп МЕ, е! а1. (1993), 1пГес1. 1ттип., 61: 2003-2010];
ИкрА1 и/или ИкрА2 [АО 93/03761 (Университет Техаса)];
ОтрСО;
НакК (РСТ/ЕР99/03824);
Р11О (РСТ/ЕР99/03823);
ОМР85 (РСТ/ЕР00/01468);
11ро06 (СВ 9917977.2);
Иро10 (СВ 9918208.1);
Иро11 (СВ 9918302.2);
Иро18 (СВ 9918038.2);
Р6 (РСТ/ЕР99/03038);
Ό15 (РСТ/ЕР99/03822);
Отр1А1 (РСТ/ЕР99/06781);
Н1у3 (РСТ/ЕР99/03257) и
ОтрЕ.
Примеры антигенов нетипируемых штаммов НаеторЫ1ик шПиепхае или их фрагментов, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), включают в себя белок фимбрин [(И8 5766608 - ОЫо 8(а1е Кекеатсй Роипбайоп)] и слитые конструкции, содержащие его пептиды [например ЬВ1(Г)-пептидные слитые конструкции; И8 5843464 (О8И) или АО 99/64067];
ОМР26 [АО 97/01638 (Сойеск)];
Р6 [ЕР 281673 (Государственный университет Нью-Йорка)];
ТЬрА и/или ТЬрВ; Н1а; НкГ; Нш47; Н1Г; НшЮ; Ншет2; Ншет3; Ншет4; Нар;
Ό15 (АО 94/12641);
Р2 и Р5 (АО 94/26304).
Кроме того, белки по изобретению могут быть с пользой скомбинированы. Под комбинированием понимается, что иммуногенная композиция включает в себя все белки из следующих комбинаций либо в качестве белков-носителей, либо в виде свободных белков, либо смесей двух белков. Например, в комбинации двух белков, как изложено ниже, оба белка могут быть использованы в качестве белковносителей, или оба белка могут быть представлены в виде свободных белков, или оба могут быть представлены в качестве носителя и в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя и свободного белка, в то время как другой представлен только в качестве белка-носителя или только в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя, а другой в виде свободного белка. Когда приведена комбинации трех белков, то существуют аналогичные возможности. Комбинации включают
Р11Ю + ΝΚ1χΚ2, химерные или слитые белки Р11Ю + ΝΚ1 хК2-8р91С1етт,
Р11Ю + Р1у,
Р11Ю + 8р128,
Р11Ю + РкаА,
Р11Ю + РкрА,
РЫЛ + ΝΚ1χΚ2, химерные или слитые белки РИА + ΝΚ1 хК2-8р91С1етт,
- 12 014107
РЫЛ + Р1у,
РЫЛ + Бр128,
РЫЛ + РкаА,
РЫЛ + РкрА,
ΝΚ1χΚ2 + Ьу1С,
ΝΚ1χΚ2 + РкрА,
ΝΚ1χΚ2 + РкаА,
ΝΚ1χΚ2 + Бр128,
Κ1χΚ2 + Ьу1С,
Κ1χΚ2 + РкрА,
Κ1χΚ2 + РкаА,
Κ1χΚ2 + Бр128,
Κ1χΚ2 + РЫЭ,
Κ1χΚ2 + РЫА, но не ограничиваются ими.
Предпочтительно ΝΚ1χΚ2 (или Κ1χΚ2) происходит из СЬрА или РкрС. Более предпочтительно он происходит из СЬрА. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как Р111Э + ΝΚ1χΚ2 + Р1у и РЙ1А + ΝΚ1χΚ2 + РНЮ. В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и Р111Э или РН(Е в качестве белков-носителей. В другом воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РйФ или РН(Е в виде свободных белков.
В независимом аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере четыре капсульных сахаридных конъюгата Б.рпеитошае, содержащих сахариды из разных серотипов Б.рпеишошае, где по меньшей мере один сахарид конъюгирован с РНЮ или его слитым белком, а иммуногенная композиция способна вызывать эффективный иммунный ответ против РЫВ.
Эффективный иммунный ответ против Р111Э или его слитого белка измеряют, например, согласно анализу иммунитета, например, описанному в примере 15. Эффективный иммунный ответ обеспечивает выживаемость по меньшей мере до 40, 50, 60, 70, 80 или 90% в течение 7 суток после контрольного заражения гетерологичным штаммом. При условии, что штамм для контрольного заражения является гетерологичным, полученная защита обусловлена иммунным ответом против Р111Э или его слитого белка.
Альтернативно, эффективный иммунный ответ против Р111Э измеряют с помощью ЕЫБА (иммуноферментный твердофазный анализ), как описано в примере 14. Эффективный иммунный ответ дает антиР111Э 1дС-ответ. составляющий по меньшей мере 250, 300, 350, 400, 500, 550 или 600 мкг/мл СМС.
Например, иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 капсульных сахаридов Б.рпеишошае разных серотипов, конъюгированных с Р111Э или его слитым белком. Например, серотип 22Р и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 серотипов, дополнительно выбранных из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11 А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 23Р и 33Р, конъюгированы с РНЮ. В одном из воплощений два или три серотипа 3, 6А и 22Р конъюгированы с РНЮ или его слитым белком.
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один капсульный сахарид Б.рпеитошае, конъюгированный с РНЮ или его слитым белком через линкер, например АЭН. В одном из воплощений используют один из вариантов химии конъюгирования, приведенный ниже.
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один капсульный сахарид Б.рпеитошае, конъюгированный с РНЮ или его слитым белком, где отношение РНЮ к сахариду в конъюгате составляет от 6:1 до 1:5, от 6:1 до 2:1, от 6:1 до 2,5:1, от 6:1 до 3:1, от 6:1 до 3,5:1 (мас./мас.) или более чем (т.е. содержит большую часть РНЮ) 2,0:1, 2,5:1, 3,0:1, 3,5:1 или 4,0:1 (мас./мас.).
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Вакцины по настоящему изобретению могут быть адъювантными, в частности, когда они предназначены для применения на пожилом населении, а также для применения в детских популяциях. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, или фосфат алюминия, или квасцы, но они также могут представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированные сахара, катионно или анионно дериватизированные сахариды или полифосфазены.
Адъювант, возможно, выбирают так, чтобы он преимущественно индуцировал Т11-тип ответа. Такие высокие уровни цитокинов Т11-типа способствуют индуцированию клеточно-опосредованных иммунных ответов на данный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов Т12-типа способствуют индуцированию гуморальных иммунных ответов на этот антиген.
- 13 014107
Разница между иммунными ответами ТЫ- и Тй2-типа не является абсолютной. В действительности индивидуум будет поддерживать иммунный ответ, который описывается как преимущественно ТЫ или преимущественно Т112. Тем не менее часто бывает удобно рассматривать семейства цитокинов в терминах, используемых в описании мышиных СЭ4+уе Т-клеточных клонов Мосманном и Коффманом (Мо8шапи, Т.К. аиб СоГГшап. К.Ь. (1989), ТН1 аиб ТН2 се1к: бШетеи! раИепъ оГ 1ушрйокше кестейои 1еаб !о бШетеи! Гиис1юиа1 рторетбек. Аиииа1 Ке\зе\\· оГ 1тшиио1о§у, 7, р. 145-173). Традиционно, ответы ТЫ-типа ассоциированы с продуцированием Т-лимфоцитами цитокинов ΙΕΝ-γ (интерферон-γ) и 1Ь-2 (интерлейкин-2). Другие цитокины, часто напрямую ассоциированные с индуцированием иммунных ответов ТЫ-типа, не продуцируются Т-клетками, как, например 1Ь-12. Напротив, ответы Тй2-типа ассоциированы с секрецией 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10. Подходящие системы адъювантов, которые стимулируют преимущественно ТЫ-ответ, включают монофосфориллипид А или его производное (или в общем случае детоксифицированный липид А - см., например, XVО 2005107798), в частности 3-де-Оацилированный монофосфориллипид А (3Ό-ΜΡΕ) (его получение см. в СВ 2220211 А); и комбинацию монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, вместе либо с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло-вводе. В таких комбинациях антиген и 3Б-МРЬ содержатся в структурах одних и тех же частиц, что позволяет осуществлять более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3Б-МРЬ способен дополнительно усиливать иммуногенность адсорбированного на квасцах антигена [Тйое1еи е! а1. Уассше (1998), 16: 708-14; ЕР 689454-В1].
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡΕ, которая раскрыта в νθ 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой 0821 погашен холестерином, как описано в νθ 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая 0821, 3Ό-ΜΡΕ и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описана в νθ 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821. Эта композиция также может содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол (νθ 95/17210). Неметилированные СрС-содержащие олигонуклеотиды (νθ 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (νθ 0226757 и νθ 03507822) также являются преимущественными индукторами ТЫ-ответа и подходят для использования в настоящем изобретении.
Конкретными адъювантами являются адъюванты, выбранные из группы солей металлов, эмульсий масло-в-воде, агониста То11-подобных рецепторов (в частности, агониста То11-подобного рецептора 2, агониста То11-подобного рецептора 3, агониста То11-подобного рецептора 4, агониста То11-подобного рецептора 7, агониста То11-подобного рецептора 8 и агониста То11-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций.
Адъювантом, который может быть использован с вакцинными композициями по изобретению, являются пузырьковые препараты или препараты везикул наружной мембраны грамотрицательных бактериальных штаммов, например, описанные в νθ 02/09746, в частности везикулы КшешидЫбщ. Адъювантные свойства везикул можно усилить путем сохранения ЬО8 (липоолигосахарида) на их поверхности (например, посредством экстракции низкими концентрациями детергентов [например, 0-0,1%-ным дезоксихолатом]). ЬО8 могут быть детоксифицированы посредством шкЬВ(-) или ЫгВ(-) мутаций, рассмотренных в νθ 02/09746. Адъювантные свойства также можно усилить путем сохранения РогВ (и, возможно, удаления РогА) из менингококковых везикул. Адъювантные свойства также можно усилить путем укорочения сахаридной структуры внешнего ядра ЬО8 на менингококковых везикулах, например посредством мутации 1д!В(-), рассмотренной в VО 2004/014417. Альтернативно, вышеупомянутые ЬО8 (например, выделенные из ш§ЬВ(-)- и/или 1д!В(-)-штамма) можно очистить и использовать в качестве адъюванта в композициях по изобретению.
Другой адъювант, который может быть использован с композициями по изобретению, может быть выбран из группы: сапонин, липид А или его производное, иммуностимулирующий олигонуклеотид, алкилглюкозаминидфосфат, эмульсия масло-в-воде или их комбинации. Другим адъювантом, который может быть использован с композициями по изобретению, является соль металла в комбинации с другим адъювантом. В одном воплощении адъювант представляет собой агонист То11-подобного рецептора 4, в частности агонист То11-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонин, в частности 0821. В одном воплощении адъювантная система содержит два или более адъюванта из приведенного выше перечня. В частности, комбинации предпочтительно содержат сапониновый (например, 0821) адъювант и/или агонист То11-подобного рецептора 9, такой как СрС-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид. Другие комбинации содержат сапонин (в частности, 0821) и агонист То11-подобного рецептора 4, такой как монофосфориллипид А или его 3-деацилированное производное, 3Ό-ΜΡΕ, или сапонин (в частности, 0821) и лиганд То11-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозаминидфосфат.
В одном из воплощений адъюванты представляют собой комбинации 3Ό-ΜΡΕ и 0821 (ЕР 0671948 В1), эмульсии масло-в-воде, содержащие 3Ό-ΜΡΕ и 0821 (^О 95/17210, VО 98/56414), или 3Ό-ΜΡΕ, приготовленный в виде препарата с другими носителями (ЕР 0689454 В1). В одном воплощении адъювантные системы содержат комбинацию 3Ό-ΜΡΕ, 0821 и СрС олигонуклеотида, которая описана в И8 6558670, И8 6544518.
- 14 014107
В одном воплощении адъювант представляет собой лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК) 4, возможно агонист, такой как производное липида А, в частности монофосфориллипид А, или более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид А (3Б-МРЙ).
3Б-МРБ может быть приобретен у С1ахо8тййК1ше Вю1одюак ЫоПй Атепса и стимулирует, главным образом, СБ4+ Т-клеточные ответы с фенотипом 1БЫ-у (Тй1). Он может быть получен способами, раскрытыми в СВ 2220211А. С химической точки зрения он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В одном воплощении в композициях по настоящему изобретению используют небольшие частицы 3Б-МРБ. Небольшие частицы 3Б-МРБ имеют такой размер частиц, что их можно подвергать стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в международной заявке на патент νθ 94/21292. Синтетические производные липида А известны и, по-видимому, являются антагонистами ТЬК 4. Они включают, без ограничения ими:
ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоно-в-Оглюкопиранозил]-2-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]- α-Б-глюкопиранозилдигидрофосфат) (νθ 95/14026);
ОМ 294 БР (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис-(дигидрофосфат) (νθ 99/64301 и νθ 00/0462);
ОМ 197 МР-Ас БР (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (νθ 01/46127).
Другими лигандами ТЬК4, которые могут быть использованы, являются алкилглюкозаминидфосфаты (АСР), например, раскрытые в νθ 9850399 или И8 6303347 (также раскрыты способы получения АСР), или фармацевтически приемлемые соли АСР, которые раскрыты в И8 6764840. Некоторые АСР являются агонистами ТЬК4, а некоторые являются антагонистами ТЬК4. Полагают, что и те, и другие полезны в качестве адъювантов.
Другим иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является Οιιί1 А и его производные. Ош1 А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южно-американского дерева Ош11а)а каропапа тойпа. и впервые был описан как обладающий адъювантной активностью Бакдаагб и др. в 1974 г. (8арошп абщуапГк, АгсЫу. Гиг б1е декатГе УниГогасйипд. Уо1. 44, 8ргшдег Уег1ад, Вегйп, р. 243-254). Очищенные фрагменты Οιιί1 А были выделены с помощью НРЬС, что сохраняет адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с Οιιί1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известными как 0А7 и 0А21). 0821 является природным сапонином, выделенным из коры 0ш11а_)а каропапа тойпа, который индуцирует СБ8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), Тй1-клетки и преимущественный 1дС2а-антительный ответ, и является сапонином в контексте настоящего изобретения.
Были описаны конкретные композиции 0821, которые являются воплощением данного изобретения, эти композиции дополнительно содержат стерин (νθ 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть отделены в форме мицелл, смешанных мицелл (возможно, с солями желчных кислот) или могут находиться в форме 18СОМ (иммуностимулирующий комплекс)-матриц (ЕР 0109942 В1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как червеобразные или кольцеобразные мультимерные комплексы либо липидные/слоевые структуры и ламеллы, когда их приготавливают вместе с холестерином или липидом, или в форме эмульсии масло-в-воде (например, как в νθ 95/17210). Сапонины могут быть ассоциированы с солью металла, например гидроксидом алюминия или фосфатом алюминия (νθ 98/15287).
Возможно, сапонин представлен в форме липосомы, 18СОМ или эмульсии масло-в-воде.
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3Б-МРЬ, которая раскрыта в νθ 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой 0821 погашен холестерином, как описано в νθ 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая в себя токоферол с 0821 и/или 3Б-МРБ в эмульсии типа масло-в-воде или без них, описана в νθ 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821.
Кроме того, могут быть использованы иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонист То11-подобного рецептора (ТЬК) 9. Оолигонуклеотиды для применения в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению возможно представляют собой СрС-содержащие олигонуклеотиды, возможно содержащие два или более динуклеотидных СрС мотивов, отделенных по меньшей мере тремя, более предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрС представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. СрС-олигонуклеотиды по настоящему изобретению обычно являются дезоксинуклеотидами. В одном воплощении межнуклеотидной структурой в олигонуклеотиде является фосфородитиоат или фосфоротиоатная связь, хотя в объем данного изобретения включены фосфодисложноэфирная и другие межнуклеотидные связи. Также в объем изобретения включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в И8 5666153,
- 15 014107
И8 5278302 и А0 95/26204.
Примеры олигонуклеотидов имеют следующие далее последовательности. Эти последовательности предпочтительно возможно содержат фосфоротиоат-модифицированные межнуклеотидные связи.
ОЛИГО 1 (8ЕО ГО N0: 1): ТСС АТС АСО ТТС СТО АСО ТТ (СрО 1826);
ОЛИГО 2 (8ЕО ГО N0: 2): ТСТ ССС АОС ОТО СОС САТ (СрО 1758);
ОЛИГО 3 (8ЕО ГО N0: 3): АСС ОАТ ОАС ОТС ОСС ООТ ОАС ООС АСС АСО;
ОЛИГО 4 (8ЕО ГО N0: 4): ТСО ТСО ТТТ ТОТ СОТ ТТТ ОТС ОТТ (СрО 2006);
ОЛИГО 5 (8ЕО ГО N0: 5): ТСС АТО АСО ТТС СТО АТО СТ (СрО 1668);
ОЛИГО 6 (8ЕО ГО N0: 6): ТСО АСО ТТТ ТСО ОСО СОС ОСС О (СрО 5456).
Альтернативные СрО-содержащие олигонуклеотиды могут содержать приведенные выше последовательности, в которых имеются незначительные делеции или вставки.
СрО-олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники (например, см. ЕР 468520). Удобно, что такие олигонуклеотиды можно синтезировать, используя автоматизированный синтезатор.
Адъювант может представлять собой эмульсию масло-в-воде или может содержать эмульсию масло-в-воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы, возможно, содержит метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в данной области техники. Метаболизируемый можно определить как который может быть превращен посредством метаболизма (Иог1апй'8 ПкМШей Ме±са1 Икйопагу, А.В. 8апйег§ Сотрапу, 25-е изд. (1974)). Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животный жир или синтетическое масло, которое не токсично для реципиента и может быть превращено посредством метаболизма. Орехи, зерна и крупа являются традиционными источниками растительных масел. Синтетические масла также составляют часть этого изобретения и могут включать имеющиеся в продаже масла, такие как №0ВЕЕ® и др. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах в оливковом масле, масле из семян пшеницы, масле из рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло ввиду того, что является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Мегск 1пйех, 10-е изд., вх. № 8619).
Токолы (например, витамин Е) также часто используют в масляных эмульсионных адъювантах (ЕР 0382271 В1; И8 5667784; А0 95/17210). Токолы, используемые в масляных эмульсиях (возможно, в эмульсиях масло-в-воде) по изобретению, могут быть приготовлены в виде препарата, как описано в ЕР 0382271 В1, где токолы могут представлять собой дисперсии токоловых капелек, возможно содержащие эмульгатор, возможно менее 1 мкм диаметром. Альтернативно, токолы можно использовать в комбинации с другим маслом с образованием масляной фазы масляной эмульсии. Примеры масляных эмульсий, которые можно использовать в комбинации с токолом, описаны в данном изобретении, например описанные выше метаболизируемые масла.
Полагают, что адъюванты в виде эмульсии масло-в-воде сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843В), кроме того, комбинации эмульсий масло-в-воде и других активных агентов описаны в качестве адъювантов для вакцин (А0 95/17210; А0 98/56414; А0 99/12565; А0 99/11241). Описаны другие адъюванты в виде масляных эмульсий, такие как эмульсии вода-в-масле (И8 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии вода-в-масле-в-воде (И8 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют масляные эмульсионные системы (в частности, при включении токолов) с образованием адъювантов и композиций по настоящему изобретению.
В одном из воплощений масляная эмульсия (например, эмульсии масло-в-воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Твин 80, и/или стерин, например холестерин.
В одном из воплощений масляная эмульсия (возможно, эмульсия масло-в-воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален, или токоферол, такой как α-токоферол (и предпочтительно и сквален, и α-токоферол), и, возможно, эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Твин 80. Также может быть включен стерин (например, холестерин).
Способ приготовления эмульсии масло-в-воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно этот способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с поверхностноактивным веществом, таким как раствор РВ8/ТАЕЕ№0™, с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники очевидно, что способ, включающий прохождение смеси дважды через иглу шприца, будет пригодным для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени процесс эмульгирования в микрофлюидизаторе (установка М1108 М|сгоПшШс5. максимум 50 прогонов, в течение периода времени 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (0,6 МПа) (давление на выходе приблизительно 850 бар (85 МПа))) может быть адаптирован специалистом в данной области техники для приготовления меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть проведена путем осуществления рутинных экспериментов, включающих определение параметров получаемой эмульсии, до тех пор, пока не будет получен препарат с необходимым
- 16 014107 диаметром капелек масла.
В эмульсии масло-в-воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водным носителем может быть, например, забуференный фосфатом физиологический раствор (ΓΒδ).
Размер капелек масла, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масло-вводе, возможно, составляет менее 1 мкм, может находиться в основном в диапазоне 30-600 нм, предпочтительно в основном составлять приблизительно 30-500 нм в диаметре и наиболее предпочтительно в основном 150-500 нм в диаметре, и в частности, приблизительно 150 нм в диаметре, как измерено с помощью фотоннокорреляционной спектроскопии (РСЪ). В этом отношении 80% капелек масла по количеству должны находиться в указанных диапазонах, возможно более 90% и возможно более 95% капелек масла по количеству находятся в диапазонах указанных размеров. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, обычно находятся в диапазоне 0,5-20% или 2-10% масла (от общего объема дозы), такого как сквален; и, если он присутствует, 2-10% α-токоферола; и 0,3-3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Возможно, соотношение масло (например, сквален):токол (например, α-токоферол) равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Эмульгатор, такой как Твин 80 или δραη 85, также может присутствовать, например, на уровне приблизительно 1%. В некоторых случаях полезно, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.
Примеры эмульсионных систем описаны в НО 95/17210, НО 99/11241 и НО 99/12565, где раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, α-токоферола и Твина 80, возможно приготовленные с иммуностимуляторами Οδ21 и/или 3Б-МРЬ.
Таким образом, в одном из воплощений по настоящему изобретению адъювант по изобретению может дополнительно содержать другие иммуностимуляторы, такие как ΡΕδ (липополисахарид) или его производные и/или сапонины. Примеры других иммуностимуляторов приведены в данном описании и в Уассте Бекщп - Т1е διιόιιηίΐ апй АйщуагИ АрргоасН. 1995, Рйагтасеийса1 Вю1сс1то1оду. Уо1. 6, Ейк. РоггеИ М.Р., апй Ые^тап, М.Р, Р1епит Ргекк, №\ν Уогк апй Ьопйоп, ΙδΒΝ 0-306-44867-Х.
В одном из воплощений адъювант и иммуногенные композиции по изобретению содержат сапонин (предпочтительно Οδ21) и/или производное ^Рδ (предпочтительно 3Б-МРЬ) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стерином (предпочтительно холестерином). В дополнение к этому масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) может содержать крап 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию масло-в-воде, стерин и сапонин, описаны в НО 99/12565.
Обычно для введения людям сапонин (предпочтительно Οδ21) и/или ^Рδ-производное (предпочтительно 3Б-МРЬ) будут присутствовать в предназначенной для человека дозе иммуногенной композиции 1-200 мкг, например 10-100 мкг, предпочтительно 10-50 мкг на дозу. Обычно масляная эмульсия (возможно, эмульсия масло-в-воде) будет содержать 2-10% метаболизируемого масла. Возможно, она будет содержать 2-10% сквалена, 2-10% α-токоферола и 0,3-3% (предпочтительно 0,4-2%) эмульгатора (предпочтительно Твина 80 [полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат]). Если присутствуют и сквален и α-токоферол, то предпочтительно, чтобы соотношение сквален:а-токоферол было равно 1 или менее, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. δρаη 85 (сорбитантриолеат) также может присутствовать на уровне 0,5-1,0% в эмульсиях, используемых в данном изобретении. В некоторых случаях может быть полезно, чтобы иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностно-активные вещества, включая каприловую кислоту (Мегск шйех, 10-е изд., номер по списку 1739), из которых особенно предпочтителным является трикаприлин.
Когда включены сквален и сапонин (возможно, Οδ21), также полезно включать в композицию стерин (возможно, холестерин), так как это позволяет уменьшить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к снижению стоимости изготовления, улучшению общего комфорта при вакцинации, а также качественным и количественным улучшениям получаемых иммунных ответов, таких как усиленное продуцирование ΙΕΝ-γ. Соответственно адъювантная система по настоящему изобретению обычно имеет соотношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в диапазоне от 200:1 до 300:1, кроме того, настоящее изобретение может быть применено в форме с низким содержанием масла, с возможным диапазоном 1:1-200:1, возможно 20:1-100:1 или главным образом 48:1; эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов со значительно сниженным профилем реактогенности. Соответственно некоторые воплощения имеют соотношение α^Γ^κ:Οδ21 (мас./мас.) в диапазоне 1:1-250:1, или 20:1-200:1, или 20:1-100:1, или главным образом 48:1. Возможно также включен стерин (например, холестерин), присутствующий в соотношении сапонин:стерин, приведенном в данном описании.
Эмульсионные системы по настоящему изобретению, возможно, имеют капельки масла небольшого размера в субмикронном диапазоне. Возможно, размеры капелек масла составляют 120-750 нм или 120-600 нм в диаметре.
- 17 014107
Особенно эффективная адъювантная композиция (для окончательной комбинации с А1РО4 в иммуногенных композициях по изобретению) включает сапонин (например, 0821), производное ЬР8 (например, 3О-МРЬ) и масляную эмульсию (например, сквален и α-токоферол в эмульсии масло-в-воде), как описано в XVО 95/17210 или в XVО 99/12565 (в частности, адъювантная композиция 11 в примере 2, табл. 1).
Примеры агониста ТЬК 2 включают пептидогликан или липопротеин. Известными агонистами ТЬК7 являются имидазохинолины, такие как имиквимод или резиквимод. Одноцепочечная РНК также является известным агонистом ТЬК (ТЬК8 у людей и ТЬК7 у мышей), в то время как двухцепочечная РНК и полиНС (полиинозиновая-полицитидиловая кислота - имеющийся в продаже синтетический миметик вирусной РНК) являются примерами агонистов ТЬК3; 3П-МРЬ является примером агониста ТЬК4, тогда как СρС является примером агониста ТЬК9.
Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированные на соль металла. Вакцинные композиции на основе алюминия, в которых антиген и иммуностимулятор 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3П-МРЬ) адсорбированы на одной и той же частице, описаны в ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1 и ЕР 0633784 В1. Тогда в этих случаях сначала адсорбируют антиген на соль алюминия с последующей адсорбцией иммуностимулятора 3П-МРЬ на тех же частицах соли алюминия. В таких процессах сначала суспензию 3П-МРЬ подвергают воздействию ультразвука на водяной бане до тех пор, пока частицы не достигнут размера 80-500 нм. Обычно антиген адсорбируют на соль алюминия в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Затем к адсорбированному антигену добавляют суспензию 3П-МРЬ и композицию инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и затем хранят при 4°С до использования.
В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах соли металла, как описано в ЕР 1126876. Улучшенный способ включает абсорбцию иммуностимулятора на частицах соли металла с последующей абсорбцией антигена на другую частицу соли металла, затем смешивание отдельных частиц соли металла с образованием вакцины. Адъювант для использования в настоящем изобретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающейся тем, что данная частица соли металла, по существу, не содержит другой антиген. Кроме того, вакцины, предложенные согласно настоящему изобретению, отличаются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, по существу, не содержащих другой антиген, и что частицы соли металла, на которых адсорбируется антиген, по существу, не содержат другой иммуностимулятор.
Соответственно согласно настоящему изобретению предложена адъювантная композиция, содержащая иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, характеризующейся в композиции как, по существу, не содержащей другой антиген. Кроме того, эта адъювантная композиция может представлять собой промежуточный продукт, который, если используют такой адъювант, требуется для изготовления вакцины. Соответственно предложен способ изготовления вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, представляющей собой один или более иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла с антигеном. Возможно, антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Указанная соль металла может быть идентичной или аналогичной соли металла, на которой адсорбирован иммуностимулятор. Возможно, соль металла представляет собой соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первые и вторые частицы соли металла являются отдельными частицами.
ЬР8 или ЬО8 производные или мутации или производные липида А, описанные в данном изобретении, сконструированы с меньшей токсичностью (например, 3П-МРЬ), чем нативные липополисахариды, и представляют собой взаимозаменяемые эквиваленты в отношении любых применений этих групировок, описанных в данном изобретении.
В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит липосомный носитель (приготовленный известными методами из фосфолипидов, таких как диолеоилфосфатидилхолин (НОРС) и, возможно, стерина, такого как холестерин). Такие липосомные носители могут нести производные липида А (такие как 3П-МРЬ - см. выше) и/или сапонины (такие как 0821 - см. выше). В одном воплощении адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,1-10,0 мг, 0,2-7,0 мг, 0,3-5,0 мг 0,4-2,0 мг или 0,5-1,0 мг (например, 0,4-0,6; 0,9-1,1; 0,5 или 1 мг) фосфолипида (например, ООРС); 0,025-2,5 мг, 0,05-1,5 мг, 0,075-0,75 мг, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3; 0,1-0,15; 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина); 5-60 мкг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15; 40-50; 10; 20; 30; 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3П-МРЬ) и 5-60 мкг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15; 4050; 10; 20; 30; 40 или 50 мкг) сапонина (например, 0821).
- 18 014107
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает в себя сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19А и 22Р), при этом СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной Троупат® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит эмульсию масло-в-воде, приготовленную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатора (такого как Твин 80) и, возможно, токола (такого как α-токоферол). В одном воплощении адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,5-15,0 мг, 1-13 мг, 2-11 мг, 4-8 или 5-6 мг (например, 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален); 0,1-10,0 мг, 0,3-8,0 мг, 0,6-6,0 мг, 0,9-5,0 мг, 1-4 или 2-3 мг (например, 0,9-1,1; 2-3 или 4-5 мг) эмульгатора (такого как Твин 80) и, возможно, 0,5-20,0 мг, 1-15 мг, 2-12 мг, 4-10 мг, 5-7 мг (например, 11-13; 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как α-токоферол).
Этот адъювант, возможно, может дополнительно содержать 5-60 мг, 10-50 мг или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Ό-ΜΡΕ).
Такие адъюванты, в частности, подходят для вакцинных композиций, предназначенных для маленьких детей или пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие по меньшей мере из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), где СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной ΡϊΌνιΚΗ'® у вакцинированных людей.
Этот адъювант, возможно, может содержать 0,025-2,5 мг, 0,05-1,5 мг, 0,075-0,75 мг, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3; 0,1-0,15; 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина); 5-60 мкг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Ό-ΜΡΕ) и 5-60 мкг, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, Р821).
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19А и 22Р), при этом СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, не является значительно более низкой чем индуцированная вакциной Ггеупаг® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как .ΙΌ-Ι^ΡΕ). Этот адъювант может содержать (на 0,5 мл дозы) 100-750, 200-500 или 300-400 мкг А1 в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3^-МΡ^).
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей или маленьких детей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), при этом СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, не является значительно более низкой, чем индуцированная вакциной ΡϊΌνιΚΗ'® у вакцинированных людей.
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, могут быть использованы для защиты или лечения восприимчивого к инфекции млекопитающего путем введения указанной вакцины системным или мукозальным путем. Такие способы введения могут включать введение посредством внутримышечной (в/м), внутрибрюшинной, внутрикожной (в/к) или подкожной инъекции или введение на слизистую оболочку в пероральный/пищеварительный, респираторный, мочеполовой тракты. Для лечения пневмонии или среднего отита возможно интраназальное (и/н) введение вакцин (так как носоглоточный перенос пневмококков может быть предупрежден с большей эффективностью, тем самым инфекция ослабляется на самой ранней ее стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты также можно совместно вводить одновременно или в разные моменты времени (например, пневмококковые сахаридные конъюгаты можно вводить по отдельности, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Для совместного введения возможный СП-адъювант может присутствовать в любом или во всех разных способах введения. В дополнение к одному способу введения можно использовать 2 разных способа введения. Например, сахариды или сахаридные конъюгаты можно вводить в/м (или в/к), а бактериальные бел
- 19 014107 ки можно вводить и/н (или в/к). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить в/м для примирующих доз и и/н для бустерных доз.
Содержание белковых антигенов в вакцине обычно будет находиться в диапазоне 1-100 мкг, возможно 5-50 мкг, наиболее типично в диапазоне 5-25 мкг. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные промежутки времени.
Изготовление вакцин в общем описано в Уассше Ие^ди (ТНе киЬипй апб асС)иуап1 арргоасН (еЙ5 Ро\ге11 М.Р. & №\гтап М.Р) (1995), Р1епит Ргекк, Νχν Уогк). Инкапсулирование в липосомы описано Ри11ег1оп в патенте США 4235877.
Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизованными. В одном из воплощений раствор лиофилизуют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротективного средства, такого как сахароза, трегалоза, глюкоза, манноза, мальтоза или лактоза. В одном из воплощений раствор лиофилизуют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротективного вещества и придающего объем агента, обеспечивающего улучшенную структуру таблетки, такого как глицин или маннит. Присутствие кристаллического придающего объем агента позволяет уменьшить продолжительность циклов лиофильной сушки в присутствии высокой концентрации соли. Примеры таких смесей для использования в лиофилизации иммуногенных композиций или вакцин по изобретению включают сахароза/глицин, трегалоза/глицин, глюкоза/глицин, манноза/глицин, мальтоза/глицин, сахароза/маннит, трегалоза/маннит, глюкоза/маннит, манноза/маннит и мальтоза/маннит. Обычно молярное соотношение двух составляющих возможно равно 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или 1:6. Иммуногенные композиции по изобретению, возможно, содержат реагенты для лиофилизации, описанные выше.
Вышеупомянутые стабилизирующие агенты и смеси стабилизирующих агентов могут дополнительно включать полимер, способный увеличивать температуру стеклования (Тд') композиции, такой как поли(винилпирролидон) (РУР), гидроксиэтилкрахмал, или декстран, или полимер, действующий в качестве кристаллического придающего объем агента, такой как полиэтиленгликоль (РЕС), например, имеющий молекулярную массу 1500-6000, и декстран.
Иммуногенные композиции по изобретению возможно лиофилизуют и разводят непосредственно перед использованием. В результате лиофилизации можно получить более стабильную композицию (вакцину) и, возможно, можно придти к более высоким титрам антител в присутствии 3П-МРЬ и в отсутствие адъюванта на основе алюминия.
В одном аспекте данного изобретения предложен вакцинный набор, содержащий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизованной форме, и дополнительно содержащий флакон, содержащий адъювант, который описан в данном изобретении. Очевидно, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для разведения лиофилизованной иммуногенной композиции.
Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описываемых вакцин в кожу (в/к) составляет одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит наружную ороговевшую кутикулу, называемую роговым слоем, которая лежит поверх эпидермиса. Под эпидермисом лежит слой, называемый дермой, который, в свою очередь, лежит поверх подкожной ткани. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, что также может быть связано с рядом дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация описанной в данном изобретении вакциной образует возможный аспект настоящего изобретения.
Традиционная методика внутрикожной инъекции, процедура манту, включает стадии, на которых очищают кожу, затем натягивают ее одной рукой и фаской иглы малого размера (размер 26-31), направленной вверх, вводят иглу под углом 10-15°. Как только фаска иглы введена, цилиндрическую часть иглы углубляют и продвигают дальше, одновременно осуществляя легкое надавливание, чтобы поднять иглу под кожей. Затем очень медленно вводят жидкость, получая, таким образом, пузырь или выпуклость на поверхности кожи, после чего медленно извлекают иглу.
Совсем недавно были рассмотрены устройства, специально разработанные для введения жидких агентов в кожу или через нее, например устройства, описанные в νϋ 99/34850 и ЕР 1092444, а также безыгольные инъекционные устройства, описанные, например, в νϋ 01/13977, И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, И8 4940460, νθ 97/37705 и νθ 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных композиций могут включать традиционные шприцы и иглы или устройства, сконструированные для баллистической доставки твердых вакцин (νϋ 99/27961), или трансдермальные пластыри (νϋ 97/48440; νθ 98/28037); или накладываемые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка, νϋ 98/20734, νϋ 98/28037).
Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или более конкретно в дерму, вакцина представлена в малом объеме жидкости, в частности в объеме от приблизительно 0,05 до 0,2 мл.
- 20 014107
Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть аналогично обычным дозам, установленным для внутримышечных вакцин (см. выше). Однако особенностью кожных или внутрикожных вакцин является то, что эти композиции могут быть низкодозовыми. Соответственно белковые антигены в низкодозовых вакцинах возможно присутствуют в таких небольших количествах, как 0,1-10 мкг, предпочтительно 0,1-5 мкг на дозу; а сахаридные (возможно, конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг и предпочтительно 0,01-0,5 мкг сахарида на дозу.
При использовании в данном описании термин внутрикожная доставка означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно будет локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный на расстоянии приблизительно от 1,0 до приблизительно 2,0 мм от поверхности кожи человека, однако существует определенное количество вариаций между индивидуумами и в разных частях тела. В общем случае можно ожидать достижения дермы, пройдя на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем, лежащим ниже. В зависимости от способа доставки вакцина может окончательно локализоваться исключительно или в основном в дерме или она может окончательно распределиться в эпидермисе и дерме.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления среднего отита, вызываемого НаеторШик тПиепхае. путем добавления белков НаеторШик шПиепхае, например белка Ό, в свободной или конъюгированной форме. В дополнение к этому, согласно настоящему изобретению также предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления пневмококковой инфекции у маленьких детей (например, среднего отита), основанная на добавлении одного или двух пневмококковых белков в виде свободного или конъюгированного белка к конъюгатным композициям ^.рпеитошае по изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут быть одинаковыми или разными по сравнению с любыми белками ^.рпеитошае, используемыми в качестве белков-носителей. Кроме того, в комбинированную вакцину могут быть включен один или более белковый антиген Могахе11а са1аггИаНк в свободной или конъюгированной форме. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа против среднего отита у маленьких детей.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа у маленьких детей (определенных как дети в возрасте 0-2 лет в контексте настоящего изобретения) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению (педиатрической вакцины). Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предложены антигенные конъюгатные композиции ^.рпеитошае по изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов ^.рпеитошае по изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения (или лечения) пневмококкового заболевания.
В еще одном другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ вызывания (защитного) иммунного ответа у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациент считается пожилым, если его возраст составляет 50 лет или старше, обычно старше 55 лет и в более общем случае старше 60 лет) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению, возможно вместе с одним или двумя белками ^.рпеитошае, присутствующими в виде свободного или конъюгированного белка, при этом свободные белки ^.рпеитошае могут быть одинаковыми или разными по сравнению с любыми белками ^.рпеитошае, используемыми в качестве белковносителей.
Другим аспектом данного изобретения является способ иммунизации человека-реципиента против заболевания, вызываемого инфекцией ^.рпеитошае и, возможно, НаеторШик тПием/ае, включающий введение реципиенту иммунологически защитной дозы иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению.
Другим аспектом данного изобретения является иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого инфекцией ^.рпеитошае и, возможно, НаеторШик тПиепхае.
Другой аспект данного изобретения заключается в применении иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией ^.рпеитошае и, возможно, НаеторШик тПиепхае.
Авторами изобретения подразумевается, что термины содержащий, содержат и содержит в данном описании можно заменять в каждом случае соответственно на термины состоящий из, состоят из и состоит из.
В данном описании изобретения воплощения, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к иммуногенным композициям по изобретению, и наоборот.
Все ссылки и патентные заявки, приведенные в данном изобретении, включены в описание посредством ссылки.
- 21 014107
Для лучшего понимания изобретения приведены примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации, и их никоим образом не следует истолковывать как каким-либо образом ограничивающие объем данного изобретения.
Примеры
Пример 1а. Экспрессия белка Ό.
Белок Ό НаеторЬ11и8 тПиепхае.
Генетическая конструкция для экспрессии белка Ό.
Исходные материалы.
ДНК, кодирующая белок Ό.
Белок Ό является высококонсервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов НПпПиепхае. Вектор рН1С348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую весь ген белка Ό, был получен от доктора Α. Ρо^5β^еη. ЭерайтеЩ о£ МеЛса1 М1сгоЫо1о§у, ИшуегШу о£ Ьипй, Ма1то Сепега1 Но§рйа1, Ма1то, 8\\'еПеп. Последовательность ДНК белка Ό была опубликована в йапхоп еΐ а1. (1991), 1п£есБ 1ттип. 59: 119-125.
Экспрессирующий вектор рМ61.
Экспрессирующий вектор рМ61 представляет собой производное рБИ322 (Сго55 еΐ а1., 1985), куда были введены элементы контроля транскрипции и трансляции чужеродных встроенных генов бактериофага λ (8Ρаΐζтаη еΐ а1., 1983). В дополнение к этому, ген устойчивости к ампициллину был заменен на ген устойчивости к канамицину.
Штамм Е.со11 ΑΚ58.
Был сконструирован штамм Е.со11 ΑΚ58 посредством трансдукции Ν99 фагом линии Р1, предварительно выращенным на производном 8Α500 (да1Е::Т№0, 1атЬПаКП- с1857 ДН1). Ν99 и 8Α500 представляют собой штаммы Е.сой К12 из лаборатории доктора МагПп ЯокепЬегд, №1Попа1 1п8111и1е о£ НеаНН.
Экспрессирующий вектор рМ61.
Для продуцирования белка Ό ДНК, кодирующую этот белок, клонировали в экспрессирующий вектор рМС1. Эта плазмида использует сигналы от ДНК фага лямбда для управления транскрипцией и трансляцией встроенных чужеродных генов. Вектор содержит промотор ГЬ, оператор ΟΕ и два сайта утилизации (КиТ и ΝπίΚ) для ослабления эффектов транскрипционной полярности при получении белка Ν (Сго55 еΐ а1., 1985). Для стабилизации плазмидной ДНК в лизогенный штамм хозяина Е.со11 введены векторы, содержащие промотор ΡΕ. Лизогенные штаммы хозяина содержат репликон-дефектную ДНК фага лямбда, интегрированную в геном (8Ρаΐζтаη еΐ а1., 1983). Хромосомальная ДНК фага лямбда направляет синтез белка-репрессора с1, который связывается с ΟΕ репрессором вектора и препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором ΡΕ и тем самым транскрипции встроенного гена. Экспрессирующий штамм ΑΚ58 представляет собой температурочувствительный мутант по гену с1, так что ΡΕ-направляемую транскрипцию можно регулировать путем изменения температуры, т.е. повышение температуры в культуре инактивирует репрессор, и инициируется синтез чужеродного белка. Эта система экспрессии позволяет регулировать синтез чужеродных белков, особенно таких, которые могут быть токсичными для клетки (81ита1ака & ЯокеиЬегд, 1981).
Штамм Е.со11 ΑΚ58.
Лизогенный штамм Е.сой ΑΚ58, используемый для продуцирования носителя - белка Ό, представляет собой производное стандартного штамма МН Е.со11 К12 Ν99 (Ρ- ки- да1К2, 1ас2- ΐΡτ). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (да1Е::ТИ10, 1атЬПаКП- с1857 ДН1). Фенотип К11- препятствует выключению синтеза макромолекул хозяина. Мутация с1857 обусловливает температурочувствительное повреждение репрессора с1. Делеция ДН1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы хозяина Ыо, иуг3 и сΡ1Α. Штамм ΑΚ58 был сконструирован посредством трансдукции Ν99 фагом линии Р1, предварительно выращенным на производном 8Α500 (да1Е::Т№0, 1атЬПаКП- с1857 ДН1). Введение дефектного лизогена в Ν99 отбирали с использованием тетрациклина на основании присутствия в соседнем гене да1Е транспозона ΤΝ10, кодирующего устойчивость к тетрациклину.
Конструирование вектора рМСМ^ΡΡ^^.
Вектор рМС1, содержащий ген, кодирующий неструктурный белок 81 вируса гриппа (рМСХ81), использовали для конструирования рМСМ^ΡΡ^^. Ген белка Ό (ΡγΌ) амплифицировали посредством ПЦР из вектора рН1С348 (Запкоп еΐ а1. 1991, 1пГес1. Iттии. 59: 119-125) с использованием ПЦР-праймеров, содержащих сайты рестрикции №о1 и ХЬа1 на 5'- и 3'-концах соответственно. Затем фрагмент №о1/ХЬа1 вводили в рМСХ81 между №о1 и ХЬа1, создавая таким образом слитый белок, содержащий Ν-концевую 81 аминокислоту белка Ν81, потом белок Ό (ΡΌ). Этот вектор помечали как рМСЖ^гЭ.
- 22 014107
На основе описанной выше конструкции создавали конечную конструкцию для экспрессии белка Ό. Фрагмент ВатН1/ВатН1 удаляли из рМС№1РгЭ. В результате такого ДНК гидролиза удаляется декодирующий участок за исключением первых трех Ν-концевых остатков. После повторного лигирования вектора был создан ген, кодирующий слитый белок со следующей Ν-концевой аминокислотной последовательностью:
-----МЭР 38Η88ΝΜΑΝΤ----N81 Белок ϋ
Белок Ό не содержит лидерного пептида или Ν-концевого цистеина, к которому обычно присоединяются липидные цепи. Следовательно, этот белок не выделяется в периплазму и не липидируется и остается в цитоплазме в растворимой форме.
Конечную конструкцию рМС-МЭРРгЭ вводили в штамм хозяина АК58 путем теплового шока при 37°С. Плазмидсодержащие бактерии отбирали в присутствии канамицина. Наличие вставки ДНК, кодирующей белок Ό, демонстрировали посредством расщепления выделенной плазмидной ДНК выбранными эндонуклеазами. Рекомбинантный штамм Е.соБ обозначают как ЕСЭ4.
Экспрессия белка Ό находится под контролем промотора Ръ/оператора О|. лямбда. Штамм хозяина АК58 содержит в геноме температурочувствительный ген с1, который блокирует экспрессию Р|. лямбда при низкой температуре посредством связывания с Оь. Как только температура повышается, с1 высвобождается от Оь и белок Ό экспрессируется.
Мелкомасштабное получение.
По окончании ферментации клетки концентрируют и замораживают.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό осуществляли следующим образом. Замороженной осадок клеточной культуры оттаивают и ресуспендируют в растворе для разрушения клеток (цитратный буфер рН 6,0) до конечной оптической плотности ОЭ650=60. Суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления при Р=1000 бар (100 МПа). Гомогенат клеточной культуры осветляют центрифугированием, и клеточный дебрис удаляют фильтрацией. На первой стадии очистки отфильтрованный лизат наносят на катионообменную хроматографическую колонку (8Р 8ерНаго5е Рай Р1о\у). РЭ связывается с матрицей геля посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (О 8ерНаго5е Рай Р1оте). РЭ не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке.
Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по ОЭ. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют ультрафильтрацией.
В конце ультрафильтрационный ретентат, содержащий белок Ό, пропускают через мембрану 0,2 мкм.
Крупномасштабное получение.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό осуществляли следующим образом. Собранный бульон охлаждают и немедленно пропускают дважды через гомогенизатор высокого давления при давлении приблизительно 800 бар (80 МПа).
На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на катионообменную хроматографическую колонку (большие гранулы 8Р 8ерЬаго§е). РЭ связывается с гелевой матрицей посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера и фильтруют.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (О 8ерНаго5е Рай Р1оте). РЭ не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке.
Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по ОЭ. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют и подвергают диафильтрации посредством ультрафильтрации.
Наконец удержанный при ультрафильтрации ретентат, содержащий белок Ό, пропускают через мембрану 0,2 мкм.
Пример 1б. Экспрессия РНЮ.
Белок Р1ЦЭ является членом пневмококкового гистидин-триадного (РШ) белкового семейства, характеризующегося присутствием гистидин-триад (мотив НХХНХН). Р111Э представляет собой молекулу из 838 аминокислотных (ак) остатков и несет 5 гистидиновых триад (см. МеШттипе \УО 00/37105 8ЕО ГО NО: 4 для аминокислотной последовательности и 8ЕЭ ГО NО:5 для последовательности ДНК). Р111Э также содержит пролин-обогащенный участок в середине (положение аминокислот 348-380). Р111Э имеет состоящую из 20 аминокислотных остатков Ν-концевую сигнальную последовательность с мотивом ЬХХС.
- 23 014107
Генетическая конструкция.
Генную последовательность зрелого белка Р111Э от МеФштипе (от ак 21 до ак 838) переносили рекомбинантным способом в Е.сой, используя собственный вектор рТСМР14, несущий промотор рХ. Штаммом хозяина Е.сой является АК58, который несет термочувствительный репрессор с1857, позволяющий осуществлять тепловую индукцию промотора.
Для амплификации гена рйЮ из плазмиды МеФттипе (несущей ген рНЮ из штамма 8йер1ососси5 рпеитошае №г\\'ау 4 (серотип 4) - 8Е0 Ш NО: 5, как описано в АО 00/37105) осуществляли полимеразную цепную реакцию. Праймеры, специфические только для гена рЫЭ. использовали для амплификации гена рЫЭ в двух фрагментах. Праймеры несут либо Ше1 и Крп1, либо Крп1 и ХЬа1 сайты рестрикции. Эти праймеры не гибридизуются ни с каким нуклеотидом из данного вектора, кроме специфических рйЮ генных последовательностей. Вставляли искусственный стартовый кодон АТС, используя первый праймер, несущий сайт рестрикции №е1. Образованные ПЦР-продукты затем вставляли в клонирующий вектор рСЕМ-Т (Рготеда) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессирующий вектор ТСМР14, используя стандартные методики, и этим вектором трансформировали Е.сой АК58.
Очистка Р11Ю.
Очистку Р111Э осуществляли следующим образом.
Рост клеток Е.сой в присутствии канамицина: рост в течение 30 ч при 30°С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5°С.
Разрушение клеток Е.сой из целой культуры при ОЭ+115 в присутствии ЕЭТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (5 мМ) и РМ8Е (фенилметилсульфонилфторид) (2 мМ) в качестве ингибиторов протеаз: Капте, 2 прохода, 1000 бар (100 МПа).
Захват антигена и удаление клеточного дебриса при 8йеатйпе О ХЬ хроматографии в рыхлом слое при комнатной температуре (20°С): колонку промывают №1С1 (150 мМ) + Етрщеп (0,25%; рН 6,5) и элюируют №1С1 (400 мМ) + Етр1деп (0,25%) в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,4.
Фильтрация на картридже 8аПоЬгап 150 (0,45+0,2 мкм).
Связывание антигена с использованием хроматографии 1МАС (аффинная хроматография на иммобилизованном металле) на Ζπ-хелатирующей 8ерйагоке ГЕ при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4°С; колонку промывают 5 мМ имидазоломом и 1% Етрфеп и элюируют 50 мМ имидазолом, все в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0.
Хроматография на слабом анионообменнике в режиме с положительным зарядом с использованием Егас1оде1 ЕМЭ ЭЕАЕ при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4°С; колонку промывают 140 мМ №1С1 и элюируют при 200 мМ №С1, при этом примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменнике.
Концентрирование и ультрафильтрация с использованием 2 мМ Nа/К-фосфата рН 7,15 на мембране 50 кДа.
Стерильная фильтрация очищенной нерасфасованной формы на фильтровальном картридже 0,2 мкм Мййрак-20.
Пример 1в. Экспрессия пневмолизина.
Пневмококковый пневмолизин получали и детоксифицировали, как описано в АО 2004/081515 и АО 2006/032499.
Пример 2. Получение конъюгатов.
В данной области хорошо известно, как приготовить очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей данных примеров полисахариды приготавливали, по существу, как описано в ЕР 072513 или с использованием близких способов. Перед конъюгированием полисахариды могут быть уменьшены в размере посредством микрофлюидизации, как описано ниже.
Условия активации и связывания специфичны для каждого полисахарида и приведены в табл. 1. Уменьшенный в размере полисахарид (исключение для Р85, 6В и 23Е) растворяли в 2 М №С1, 0,2 М №С1 или в воде для инъекций (АЕ1). Для всех серотипов оценивали оптимальную концентрацию полисахарида. Все серотипы, за исключением серотипа 18С, были конъюгированы непосредственно с белкомносителем, как подробно описано ниже. Были получены два альтернативных конъюгата серотипа 22Е; один конъюгированный непосредственно, один - через линкер АЭН.
К раствору полисахарида добавляли СПАР (соотношение СЭАР/РЗ 0,5-1,5 мг/мг Р8) из концентрированного раствора (100 мг/мл) в ацетонитриле или раствора в смеси ацетонитрил/вода (50%/50%). Через 1,5 мин добавляли 0,2-0,3 М №1ОН для получения конкретного рН активации. Активацию полисахарида проводили при этом рН в течение 3 мин при 25°С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок Ό, РйЮ, пневмолизин или ΌΤ) (количество зависит от начального соотношения Р8/белок-носитель) и реакцию сочетания проводили при конкретном рН в течение вплоть до 2 ч (в зависимости от серотипа), регулируя рН. Для гашения непрореагировавших групп цианатного эфира затем к смеси добавляли 2 М раствор глицина; рН подводили до рН гашения (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем в течение ночи при 2-8°С при постоянном медленном перемешивании.
- 24 014107
Подготовка 18С.
18С связывали с белком-носителем через линкер - дигидразид адипиновой кислоты (ΆΌΗ). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 18С подвергали микрофлюидизации.
Получение производных столбнячного анатоксина с использованием ΕΩΛΟ
Для получения производных столбнячного анатоксина очищенный ТТ разбавляли до 25 мг/мл в 0,2 М №1С1 и добавляли спейсер ΆΌΗ для достижения конечной концентрации 0,2 М. После полного растворения спейсер, рН подводили до 6,2. Затем добавляли ЕПЛС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) для достижения конечной концентрации 0,02 М и смесь перемешивали в течение 1 ч, регулируя рН. Реакцию конденсации останавливали путем увеличения рН включительно до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25°С. Затем дериватизированный ТТ подвергали диафильтрации (мембрана с СО (отсечением) 10 кДа) для удаления оставшихся ΆΌΗ и реагента ΕΩΛΟ
Наконец, весь объем ТТАН подвергали стерильной фильтрации до проведения стадии связывания и хранили при -70°С.
Химическое связывание ТТАН с Р8 18С.
Подробное указание параметров конъюгирования можно найти в табл. 1.
г подвергнутого микрофлюидизации Р8 разбавляли в определенной концентрации водой и доводили до 2 М ΝαΟΙ путем добавления порошка ΝαΟΙ.
Добавляли раствор ΟΩΑΡ (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси 50/50 (об./об.) ацетонитрилЛУП) для достижения подходящего соотношения ΟΩΑΡ/Ρ8.
рН повышали вплоть до рН активации 9,0 путем добавления 0,3 М ΝαΟΗ и стабилизировали при этом рН до добавления ТТАН.
Через 3 мин добавляли дериватизированный ТТАН (20 мг/мл в 0,2 М ΝαΟΙ) для достижения соотношения ТТЛН/Р8. равного 2, рН регулировали до рН связывания (рНс) 9,0. Раствор оставляли на 1 ч, регулируя рН.
Для гашения к смеси Р8/ТТАН/СПАР добавляли 2 М раствор глицина.
рН подводили до рН гашения (рНч) (рН 9,0).
Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем оставляли на ночь при 2-8°С при постоянном медленном перемешивании.
Конъюгат Р822БАН-РБФ.
Во втором способе конъюгирования этого сахарида (первый представляет собой способ прямого конъюгирования Р822Б-РБФ, показанный в табл. 1) 22Р связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (АЭН). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 22Р подвергали микрофлюидизации.
Получение производных Р8 22Р.
Активацию и связывание выполняли при 25°С при постоянном перемешивании в водяной бане с регулируемой температурой.
Подвергнутый микрофлюидизации Р8 22Р разбавляли до получения конечной концентрации Р8 6 мг/мл в 0,2 М №С1 и раствор подводили до рН 6,05±0,2, используя 0,1н. НС1.
Добавляли раствор СПАР (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси ацетонитрилЛУЕЕ 50/50) для достижения подходящего соотношения С'ПАР/Р8 (1,5/1 мас./мас.).
рН повышали вплоть до рН активации 9,00±0,05 путем добавления 0,5 М ЫаОН и стабилизировали при этом рН до добавления АОН.
Через 3 мин добавляли АЭН для достижения соответствующего соотношения АЭН/Р8 (8,9/1 мас./мас.); рН регулировали до рН связывания 9,0. Раствор оставляли на 1 ч, регулируя рН.
Производное Р8АН концентрировали и подвергали диафильтрации.
Связывание.
РИФ в концентрации 10 мг/мл в 0,2 М №1С1 добавляли к производному Р822РАН для достижения соотношения Р11Ю/Р822ЕЛц 4/1 (мас./мас.); рН доводили до 5,0±0,05, используя НС1. Добавляли раствор БОАС (20 мг/мл в 0,1 М Трис-НС1, рН 7,5) вручную в течение 10 мин (250 мкл/мин) для достижения 1 мг БПАС/1 мг Р822Бан. Полученный раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали 60 мин) при 25°С при перемешивании и регулировании рН. Раствор нейтрализовали путем добавления 1 М Трис-НС1, рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25°С.
Перед элюированием на 8ерБасту1 8400НК конъюгат осветляли с использованием фильтра 5 мкм МшщаП.
Полученный конъюгат имеет конечное соотношение Р11Ф/Р8 4,1 (мас./мас.), содержание свободного Р8 ниже 1% и антигенность (а-Р8/а-Р8) 36,3% и анти-РИФ антигенность 7,4%.
- 25 014107
Очистка конъюгатов.
Конъюгаты очищали гель-фильтрацией, используя колонку для гель-фильтрации Черйасгу1 Ч400НК, уравновешенную 0,15 М №1С1 (Ч500НК. для 18С) для удаления небольших молекул (включая ОМАР) и неконъюгированных РЧ и белка. Из-за разных молекулярных размеров компонентов реакционной смеси конъюгаты РЧ-РО, РЧ-ΤΤ, РЧ-РЫО, РЧ-пневмолизин или РЧ-ΌΤ элюируются первыми, затем свободный РЧ, затем свободный РО или свободный ΌΤ и, наконец, ОМАР и другие соли (№С1, глицин).
Фракции, содержащие конъюгаты, определяли по УФ280 нм. Фракции собирали в соответствии с их Кб, подвергали стерильной фильтрации (0,22 мкм) и хранили при 2-8°С. В препаратах конъюгатов определяли соотношения РЧ/белок.
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов РЧ Ч.рпеитошае-белок
0/14/0^10^.
Если в заголовке колонки появляется микрофлюид., это указывает на то, что перед конъюгированием сахарид уменьшали в размере посредством микрофлюидизации. Размеры сахаридов после микрофлюидизации приведены в табл. 2.
Таблица 1
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов РЧ Ч.рпеитошае-белок ^/ΤΤ/^Τ/Ρ1и^/ΡΙу
Серотип 1 микрофлюид. 4 микрофлюид. 5 6А 6В 7Р микрофлюид.
Конц. РЗ (мг/мл) 2,5 2,5 7,1 5,0 5,0 5,0
Растворение РЗ ννπ \Л/Н ννπ 2 М ЫаС1 2 М №С1 2 М №С1
Конц. РО (мг/мл) 10,0 10,0 5,0 5,0 5,0 10,0
Исходное соотношение Ρϋ/Ρ8 (масс./масс.) 1,5/1 1,5/1 1/1 1/1 1,1/1 1,2/1
Конц. СПАР (мг/мг РЗ) 0,50 0,50 0,79 0,83 0,83 0,75
рНа-рНс=рНч 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Серотип 9У микрофлюид. 14 микрофлюид. 18С микрофлюид. 19А микрофлюид. 19Е микрофлюид. 22Г микрофлюид. 2 ЗЕ
Конц. РЗ (мг/мл) 5,0 5,0 4,5 15,0 9,0 6,0 2,38
Растворение РЗ 2 М №С! 2 М №С1 2 М ИаС| 2 М №0) 2 М ЫаС! 0,2 М №С1 2 Μ ЫаС)
Конц, белканосителя (мг/мл) 10,0 10,0 20,0 (ТТ) 10,0 (Р1У) 20,0 (ОТ) 10,0 (РЫО) 5,0
Исходное соотношение белокноситель/РЗ (масс./масс.) 1,2/1 1,2/1 2/1 2,5/1 1,5/1 3/1 1/1
Конц. СйАР (мг/мг РЗ) 0,50 0,75 0,75 1,5 1,5 1,5 0,79
рНа=рНс=рНч 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Примечание: рНа, рНс, рНд соответствуют рН активации, связывания и гашения соответственно.
- 26 014107
Определение характеристик.
Каждый конъюгат был охарактеризован и соответствовал характеристикам, описанным в табл. 2. Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли резорциновым методом, а содержание белка (мкг/мл) - тестированием по Лоури. Конечное соотношение Р8/РЭ (мас./мас.) определяют по соотношению этих концентраций.
Содержание свободного полисахарида (%).
Содержание свободного полисахарида в конъюгатах, выдерживаемых при 4°С или хранимых в течение 7 суток при 37°С, определяли на супернатанте, полученном после инкубации с антителами на α-белок-носитель и насыщенным сульфатом аммония с последующим центрифугированием.
Для количественного определения свободного полисахарида в супернатанте использовали ЕЫ8А а-Р8/а-Р8.Отсутствие конъюгата также контролировали с использованием ЕЬ18А для α-белокноситель/а-Р8.
Антигенность.
Антигенность вышеупомянутых конъюгатов анализировали в ЕЫ8А сэндвич-типа, где антителами захвата и детекции были а-Р8 и α-белок соответственно.
Содержание свободного белка (%).
Неконъюгированный белок-носитель может быть отделен от конъюгата во время стадии очистки.
Содержание свободного остаточного белка определяли, используя эксклюзионную (гельпроникающую) хроматографию (8ЕС) (Т8К 5000-РАХЬ) с последующим УФ-детектированием (214 нм). Условия элюирования позволяли разделять свободный белок-носитель и конъюгат. Затем определяли содержание свободного белка в нерасфасованном конъюгате по калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг белка-носителя в мл). Свободный белок-носитель в % выражали следующим образом:
% свободного носителя = (свободный носитель (мкг/мл)/(общая концентрация соответствующего белка-носителя, измеренная по Лоури (мкг/мл)))х 100%.
Стабильность.
Молекулярно-массовое распределение (Кау) и стабильность определяли по результатам НРЬС-8ЕС гель-фильтрации (Т8К 5000-РАХЬ) для конъюгатов, выдерживаемых при 4°С или хранимых в течение 7 суток при 37°С.
Определение характеристик 10/11/13/14-валентных конъюгатов приведено в табл. 2 (см. примечание к таблице).
Белковые конъюгаты могут быть адсорбированы на фосфате алюминия и объединены с образованием конечной вакцины.
Вывод.
Получены иммуногенные конъюгаты, которые, как затем было показано, являются компонентами многообещающей вакцины.
Таблица 2
Характеристики конъюгатов
Конъюгаты Размер РЗ (ДахЮ3) Соотношение носитель/РЗ Свободный РЗ (ЕНва) Свободный носитель Антигенность РЗ (ЕПва) Размер конъюгата (кДа)
Р31-РО 349382* 1,5-1,6 1,0%- 1,2% 3,9%-4,8% 87%-95% 1499- 1715
Ρ34-Ρϋ 93-100* 1,5-1,6 4,7- 6,5% 3,2%-4,0% 90%-96% 1303- 1606
Р35-Р0‘“ 367-443 0,80 ΟΤ11,2% 2,2%-3,8% 93%- 108% 1998- 2352
РЗбА-Ρϋ 1100- 1540 0,61 4,5% Не определ. 45,9% Не определ.
рзвв-ро*** 10691391 0,7-0,8 1,ΟΙ,6% <2.0% 68%-75% 4778- 5235
Ρ87Ρ-Ρϋ 255264* 1,1-1,2 <1% <1,4% 58% 3907- 4452
Ρ39ν-ΡΟ 258- 280* 1,3-1,5 <1% <1,3% 67%-69% 9073- 9572
Ρ814-Ρϋ 232- 241* 1,4 <1% <1,5% 70% 3430- 3779
Р818С-ТТ 89-97* 2,2-2,4 1,5- 2,2% <4% 46%-56% 5464- 6133
Р819А-Р1У* 151 3,2 <1% 29%
Ρ319Ε-ΟΤ 133- 143* 1.4-1,5 4,1%-5,9% <1,2%- <1,3% 82%-88% 2059- 2335
Ρ322ΡΡΜϋ* 159-167 2,17 5,8 Не определ. 37% Не определ.
Ρ822ΡαηРЬЮ* 159-167 3,66-4,34 <1% Не определ. 28-31% Не определ,
Ρ323Ρ- Ρ0*** 914-980 0,5 1,4- 1,9% 3,7%-4,9% 137%- 154% 2933- 3152
* Размер Р8 после микрофлюидизации нативного Р8.
- 27 014107
Приготавливали 10-валентную вакцину путем смешивания конъюгатов серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е (например, в дозе 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида соответственно на дозу, предназначенную для человека). Приготавливали 11-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгат серотипа 3 из табл. 5 (например, 1 мкг сахарида на дозу, предназначенную для человека). Приготавливали 13-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгаты серотипов 19А и 22Е, упомянутые выше (где 22Е либо непосредственно связан с РНЮ, либо, альтернативно, через линкер АОН) [например, в дозе 3 мкг каждого сахарида на дозу, предназначенную для человека]. 14-валентная вакцина может быть приготовлена путем дополнительного добавления конъюгата серотипа 6А, упомянутого выше [например, в дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека].
Пример 3. Подтверждение того, что включение белка Ό НаеторЫ1ик тПиепхае в иммуногенную композицию по изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого среднего отита (АОМ).
Дизайн исследования.
В данном исследовании использовали вакцину ИРн-РЭ, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, каждый из которых конъюгирован с белком Ό из Н. тПиепхае (ссылка на табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали на две группы, получающие четыре дозы либо вакцины 11Рп-РО, либо Нагих, в возрасте приблизительно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты получали вакцину 1пГапих-11еха (ПТРа-НВУ-1РУ/Н1Ь) фирмы С8К Вю1ощса1к одновременно в возрасте 3, 4 и 5 месяцев. 1пГапих-11еха представляет собой комбинацию Реб1апх и Н1Ь, смешанных перед введением. Контрольное наблюдение эффективности для анализа согласно протоколу (АТР) начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до достижения возраста 24-27 месяцев. В выбранной подгруппе субъектов оценивали носоглоточный перенос Б.риеитошае и Н.тПиепхае.
Родителей приглашали на консультацию к исследователю, если их ребенок испытывал тошноту, имел боль в ушах, самопроизвольную перфорацию барабанной перепонки или самопроизвольные выделения из уха. Если у исследователя было подозрение на эпизод АОМ, ребенка немедленно отсылали к специалисту отоларингологу (ухо, нос, горло (Еаг, Ыоке и ТНгоа! (ΕΝΤ))) для подтверждения диагноза.
Клинический диагноз АОМ был основан либо на визуальной картине барабанной перепонки (т.е. покраснение, вздутие, потеря отражения света), либо на наличии выделения жидкости из среднего уха (как продемонстрировано с помощью простой или пневматической отоскопии или с помощью микроскопа). К тому же, должны были присутствовать по меньшей мере два из следующих признаков или симптомов: боль в ушах, выделения из уха, тугоухость, жар, вялость, возбудимость, анорексия, тошнота или диарея. Если специалист ΕΝΤ подтверждал клинический диагноз, отбирали посредством тимпаноцентеза пробу жидкости среднего уха для бактериологического тестирования.
Для субъектов с повторными приступами тошноты устанавливали начало нового эпизода АОМ, если от начала предыдущего эпизода проходило более 30 суток. К тому же эпизод АОМ считался новым бактериальным эпизодом, если выделенные бактерия/серотип отличались от предыдущего изолята, какой бы ни был интервал между двумя последовательными эпизодами.
Результаты испытания.
Суммарно было охвачено 4968 маленьких детей, 2489 в группе 11Рп-РЭ и 2479 в контрольной группе. Никаких больших различий в демографических характеристиках или факторах риска среди этих двух групп не имелось.
Клинические эпизоды и определение случаев АОМ.
В период контрольного наблюдения по протоколу суммарно было зарегистрировано 333 эпизода клинического АОМ в группе 11Рп-РЭ и 499 в контрольной группе.
В табл. 3 представлена защитная эффективность вакцины 11Рп-РЭ и обеих 7-валентных (7-ν) вакцин, ранее протестированных в Финляндии (Екко1а е! а1. Ν. Епд1. Б. Меб. 2001, 344: 403-409 и Кбр1 е! а1. С1ш. ПтГесБ Όίκ. 2003, 37: 1155-64) в отношении любого эпизода АОМ и АОМ, вызываемого разными пневмококковыми серотипами, Н.^ηГ1иеиζае, ΝΤ4ί и М.са!аггйа11к.
Статистически значимое и клинически релевантное уменьшение на 33,6% общей тяжести заболевания АОМ было достигнуто при использовании ИРп-РО, независимо от этиологии (табл. 3).
Общая эффективность в отношении эпизодов АОМ вследствие присутствия любых 11 пневмококковых серотипов, содержащихся в вакцине ИРп-РО, составляла 57,6% (табл. 3).
Другим важным результатом в настоящем исследовании является 35,6%-ная защита, обеспечиваемая 11Рп-РЭ вакциной против АОМ, вызываемого Н.^ηГ1иеиζае (и конкретно 35,3%-ная защита, обеспечиваемая ΝΤΉΐ). Этот результат имеет большую клиническую значимость, предполагая повышенную значимость Н.^ηГ1иеиζае в качестве основной причины АОМ в эпоху пневмококковых конъюгатных вакцин. Параллельно с защитой, которую вакцина 11Рп-РЭ обеспечивала против АОМ, она также уменьшала носоглоточный перенос Н.тПиепхае после бустерной дозы на втором году жизни. Эти результаты противоречат предыдущим наблюдениям, полученным в Финляндии, где для обеих 7-валентных пневмококковых конъюгатных вакцин наблюдалось увеличение количества эпизодов АОМ, обусловленных Н.тПиепхае (Екко1а е! а1. и К11р1 е! а1.), как свидетельство этиологического замещения.
Четкой корреляции между защитой против эпизодов АОМ, обусловленных Н1, и уровнями антител
- 28 014107 против носителя белка Ό установить не удалось, поскольку концентрации анти-ΡΌ 1дО-антител после первичной вакцинации у вакцинированных 11Рп-Рй, у которых не было Ηί АОМ эпизодов, по существу, были аналогичны уровням анти-ΡΌ 1дО антител после первичной вакцинации, измеренным у вакцинированных с примененим 11Рп-Рй, у которых развивался по меньшей мере один Ηί АОМ эпизод в течение периода контрольного наблюдения эффективности. Однако, несмотря на то что не удалось установить никакой корреляции между биологическим воздействием вакцины и 1дО анти-РО иммуногенностью после первичной вакцинации, разумно предположить, что белок-носитель РО, который является высоко консервативным среди штаммов Н.шПиепхае, внес большой вклад в индукцию защиты против Ηί.
Влияние на заболевание АОМ сопровождалось влиянием на носоглоточный перенос, которое имело аналогичную величину для пневмококков и Н лпПиепхае вакцинных серотипов (фиг. 1). Это уменьшение носоглоточного переноса НлпПиепхае у вакцинируемых РЛ-конъюгатами поддерживает гипотезу прямого защитного эффекта РО-конъюгатной вакцины против НлпПиепхае, даже если защитная эффективность не могла коррелировать с анти-РО 1дО-иммунными ответами при измерении посредством ЕЫ8А.
В следующем эксперименте использовали модель среднего отита на шиншиллах с использованием сывороточных пулов от маленьких детей, иммунизированных 11-валентной композицией из этого примера или 10-валентной вакциной из примера 2 (см. также табл. 1 и 2 и комментарии под ними). Оба пула вызывают значительное уменьшение процента животных со средним отитом по сравнению с сывороточным пулом до иммунизации. Нет никакого значимого различия между 10- и 11-валентными иммунными пулами. Это показывает, что обе вакцины имеют одинаковую эффективность в индуцированию защиты против среднего отита, вызываемого нетипируемым НлпПиепхае в данной модели.
Таблица 3
Тип эпизода АОМ 11Ρη-Ρϋ Рге7паг в ΡϊηΟΜ 7ν-ΟΜΡ в ΡίηΟΜ <И|₽'ВЯР'
η УЕ η νΕ η УЕ
11Ρη- рц Контроль % ДИ 95% 7ν- СРМ Контроль % ДИ 95% 7ν- ΟΜΡ Контроль % ДИ 95%
ίί □ί ίί υί ίί υί
N 2455 2452 786 794 805 794
Любой АОМ 333 499 33,6 20,8 44,3 1251 1345 6 -4 16 1364 1345 -1 -12 10
Любой АОМ с МЕР 322 474 32,4 19,0 43,6 1177 1267 7 -5 17 1279 1267 0 -12 10
Культурально подтвержденный пневмококк 92 189 51,5 36,8 62,9 271 414 34 21 45 314 414 25 11 37
Вакцинные пневмококковые серотипы (*) 60 141 57,6 41,4 69,3 107 250 57 44 67 110 250 56 44 66
Другие бактериальные патогены
Н. тПиепгае 44 68 35,6 3.8 57,0 315 287 -11 -34 8 315 287 -9 -32 10
Нетипируемый К тЯпепгае (ΝΤΗΐ) 41 63 35,3 1,8 57,4 ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΟ ΝΡ ΝΡ
М. са1агг6аНз 31 34 3,4 -52,5 46,1 379 381 -1 -19 15 444 381 -16 -36 2
№ = не опубликовано; N = количество субъектов в группе АТР определения эффективности; п = количество эпизодов.
* Вакцинные пневмококковые серотипы для 11 Рп-РВ = 11 серотипов, для Ргеупаг и 7у-0МР = 7 серотипов. МЕР = жидкость среднего уха.
ЬЬ = нижний предел; БЬ = верхний предел; ДИ = доверительный интервал.
νΡ = эффективность вакцины.
Пример 4. Выбор белка-носителя для серотипа 19Е.
Используемый анализ ЕЫ8А.
Метод ЕЫ8А с ингибированием 22Е, по существу, основан на анализе, предложенном в 2001 г. Сопсерсюп и Етаксй, и о котором сообщалось в Непскаейк е! а1., 2006, Сйшса1 апй νηαίικ 1ттипо1о§у, 13: 356-360. В кратком изложении, очищенные пневмококковые полисахариды смешивали с метилированным сывороточным альбумином человека и адсорбировали на микротитрационных планшетах для сильного связывания Митс Махйогр™ (Коккййе, ΌΚ) в течение ночи при 4°С. Планшеты блокировали 10%-ной фетальной сывороткой теленка (ЕВ8) в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Образцы сыворотки разбавляли РВ8, содержащим 10% ЕВ8, 10 мкг/мл полисахарида клеточной стенки (881) и 2 мкг/мл пневмококкового полисахарида серотипа 22Е (АТСС (Американская коллекция типовых культур)) и потом разбавляли в микротитрационных планшетах, используя тот же буфер. Внутренний стандарт, откалиброванный относительно стандартной сыворотки 89-8Е с использованием серотип-специфических концентраций 1дО в 89-8Е, был обработан тем же способом и включен в каждый планшет. После промывки связавшиеся антитела детектировали с использованием конъюгиро
- 29 014107 ванного с пероксидазой моноклонального антитела против ОС человека (8(га(есН 8аепцПс Ыб., 8οНат. ИК), разбавленного в 10%-ной ЕВ8 (в РВ8), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Для развития окраски использовали готовый к употреблению однокомпонентный набор для иммуноанализа на основе субстрата для фермента пероксидазы тетраметилбензидина (ВюКаб, Негси1е8, СА, И8) в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали, используя 0,18 М Н28О4, и оптическую плотность считывали при 450 нм. Концентрации серотип-специфических ОС (в мкг/мл) в образцах рассчитывали путем соотнесения значений оптической плотности в определенных пределах с кривой для внутреннего сывороточного стандарта, смоделированой с использованием 4-параметрического логистического логарифмического уравнения, рассчитанного с применением программного обеспечения 8οΠМаx Рго™ (Мο1еси1а^ ПеуОез, 8иппууа1е, СА). Порог отсечения для ЕЫ8А составлял 0,05 мкг/мл ОС для всех серотипов с учетом ограничения по детектированию и предела количественного определения.
Опсонофагоцитарный анализ (ОРА).
На совещании ВОЗ в июне 2003 г. было рекомендовано использовать анализ ОРА, изложенный в Кοте^ο-8ΐе^ηе^ е1 а1. С1ш. Э|адп. ЬаЬ. Iттипο1. 2003, 10 (6): ρ. 1019-1024. Этот протокол использовали для тестирования ОРА активности серотипов в следующих тестах.
Получение конъюгатов.
В исследования 11Рп-Р0&0|-001 и 11Рп-РЭ&0|-007 были включены три 11-валентные вакцинные композиции (табл. 4), в которых 3 мкг полисахарида 19Р были конъюгированы с дифтерийным анатоксином (19Р-ЭТ) вместо 1 мкг полисахарида, конъюгированного с белком Ό (19Е-РЭ). Параметры конъюгирования для исследований 11Рп-РЭ, 11Рп-РЭ&0|-001 и 11Рп-РЭ&0|-007 описаны в табл. 5-7 соответственно.
Антипневмококковые антительные ответы и ОРА активность против серотипа 19Е через один месяц после первичной вакцинации этими 19Е-ЭТ композициями показаны в табл. 8 и 9 соответственно. В табл. 10 приведены концентрации 22Е-ЕЫ8А-антител и проценты субъектов, достигших порога 0,2 мкг/мл до и после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной.
Показано, что опсонофагоцитарная активность антител, индуцированных этими 19Е-ЭТ композициями, явно усиливалась, что продемонстрировано более высокими уровнями серопозитивности (опсонофагоцитарные титры >1:8) и СМТ ОРА через один месяц после первичной вакцинации (табл. 9). Через 1 месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной опсонофагоцитарная активность 19Е-антител оставалась значительно лучшей у маленьких детей, примированных 19Е-ЭТ композициями (табл. 11).
В табл. 12 представлены данные по иммуногенности после бустерного введения 11Рп-РЭ начинающим ходить детям, ранее примированным конъюгатами 19Е-ЭТ или 19Е-РЭ, по сравнению с 4-й последовательной дозой Ргеупаг®. Приведенные обнаруженные случаи, отмеченные после введения Ргеупаг® в США, улучшенная опсонофагоцитарная активность против серотипа 19Е при конъюгации с белком-носителем ОТ могут быть полезны для вакцины-кандидата.
В табл. 13 приведены данные ЕЫ8А и ОРА для конъюгата 19Е-ЭТ по отношению к перекрестнореактивному серотипу 19А. Было обнаружено, что 19Е-ЭТ индуцирует низкую, но значимую ОРА активность против 19А.
Таблица 4
Пневмококковые конъюгатные вакцинные композиции, использованные в клинических исследованиях
Композиция Пневмококковый серотип мкг/белок-носитель ΑΓ* ΜΓ
1 3 4 5 6Β 7Ρ 9Х/ 14 18С 19Ρ 23Ρ
ИРп-Ρϋ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/ΡΟ 1/ΡΟ 1/ΡΟ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/Ρϋ <0,8
19Р-6Т Форма 1 3/Ρϋ з/Ρϋ з/Ρϋ 3/Ρϋ 10ЮТ 3/Ρϋ 3/ΡΟ 3/ΡΟ 3/ΡΟ з/στ 5/ϋΤ <0,35
19ΕΌΤ Форма 2 з/Ρϋ 2/Ρΰ 2/ΡΟ 3/ρσ 5ЮТ з/ρσ 2/ΡΟ 2/ΡΟ 2/ΡΟ з/στ 5/ΟΤ <0,35
19Р-0Т Форма 3 3/ΡΟ 3/Ρϋ 3/Ρϋ з/Ρϋ 3/Ρϋ 3/Ρϋ з/ρσ 3/ΡΟ 3/ΡΟ 3/ΟΤ 3/Ρϋ = 0,5
- 30 014107
Таблица 5
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Ρ8
8.риеитошае-белок Б/ТТ/БТ
Серотип Нативный 3 микрофлюид. 4 Нативный 5 Нативный 6В Нативный 7? Нативный 9ν Нативный 14 Нативный 18С Нативный 19Р Нативный 23Р Нативный
Конц. Р8 (мг/мл) 1,5 2 2,0 7,5 5,5 3,0 1,75 2,5 1.75 4,0 2,5
Растворение Р$ 150 мМ ЫаС! 2 М МаС1 ννπ ννρι 2 Μ Ν3ΟΙ 2 М ЫаС1 2 (И №С1 2 М НаС! ννρι 2 М МаС1 2 М №С1
Конц. Ρϋ (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Исх. соотн. Ρδ/Ρϋ (масс./масс.) 1/0,7 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/0,75 1/0,75 1/1,2 1/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг Р8) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рН,=рНс=рН„ 9,079,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,079,0/9,0 9,579,5/9,0 9,079,0/9,0 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,079,0 9,5/9,579,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 45 мин 30 мин 60 мин
Таблица 6
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Ρ8 8.риеитошае-белок Б/БТ для исследования 11Ρи-Ρ^&^^-001
Серотип 1 микрофлюид. 3 микрофлюид. 4 микрофлюид. 5 микрофлюид. 6В микрофлюид. 7Р Нативный 9ν Нативный 14 Нативный 18С микрофлюид. 19Р микрофлюид. 23Г микрофлюид.
Конц. Р5 (мг/мл) 4 2.0 2,5 7,5 10 3,0 1,75 2,5 5,0 9,0 10
Растворение РЗ 2 М ИаС! 2 М ЦаС1 2 М ЫаС1 2 М ИаС1 2 М ИаС! 2 М ЫаС1 2 М ЫаС! 2 М ЫаС! 2 М ЫаС1 2 М №СЕ 2 М №С1
Конц, Ρϋ (мг/мл) 10,0 5,0 5,0 . 5,0 2 М ЫаС1 20 (ОТ) 2 М №С1 5,0 5,0 5,0 5,0 20 (ОТ) 10 (ϋΤ)
Исх. соотн. Ρϋ/Ρ3 (масс./масс.) 1,2/1 1/1 1/1 1/1 1,5/1 1/1 0,75/1 0,75/1 1,2/1 1,5/1 1,5/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 1,50 0,75 1,5 2 1.5 0,75 0,75 0,75 !5 1,5 0,75
рНа=рНс=рН0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9/9/9 8,5/8,5/9,0 9,079,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 30 мин 60 мин 60 мин
Таблица 7
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Ρ8 8.риеитошае-белок Б/БТ для исследования 11Ρи-Ρ^&^^-007
Серотип Нативный 3 микрофлюид. 4 Нативный 5 Нативный Нативный 7Р микрофлюид. 9ν микрофлюид. 14 микрофлюид. 18С Нативный 19А микрофлюид. 19Р микрофлюид. 23Р микрофлюид.
Конц. РЗ (мг/мл) 1,5 2,0 2 7,5 5,5 5,0 5,0 5,0 1,75 9,0 10,0 9,5
Растворение Р8 150 мМ №С1 2 М КаО ννη ννπ 2 М №С1 2 М №С1 2 М ЫаС1 2 М №С1 ννπ 2 М №С1 2 М ЫаС1 2 М №С1
Конц. РО (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5 10 10 10,0 5,0 20 (ОТ) 5.0 (Ρϋ) 10
Исх. соотн. Ρϋ/Ρδ (масс./масс.) 0,7/1 1/1 1 1/1 1/1 1,2/1 1,2/1 1,2/1 1,2/1 1,5/1 1,2/1 1/1
Конц. ΌϋΑΡ (мг/мг Р8) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,5 0,75 0,75 1.5 0,75 0,75
рНа=рН0=рНа 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,079,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,079,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 45 мин 120 мин 120 мин 60 мин
Таблица 8
Процентное содержание субъектов с концентрацией 19Е-антител >0,20 мкг/мл и средними геометрическими концентрациями 19Е-антител (СΜС с ДИ 95%; мкг/мл) через 1 месяц после первичной вакцинации с использованием 1 мкг 19Ε-Ρβ, 3 мкг 19Е-БТ или Ггетиаг (2 мкг 19Ε-ί.’ΡΜ) (общая группа)
Группа 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-001 (22Γ-Ε1.Ι5Ά) 11Ρη-ΡΟ&ϋΙ-007 (22Γ-ΕΙ.Ι8Α)
N % > 20 мкг/мл (ДИ 95%) ОМС (мкг/мл) (ДИ 95%) Ν % г 20 мкг/мл (ДИ 95%) ОМС (мкг/мл) (ДИ 95%)
11РП-РО 152 98,7 (95,3-99,8) 1,93 (1,67-2,22) 50 100 (92,9-100) 2,78 (2,31-3,36)
1 ЭР-ОТ Форма 1* 146 99 3 (96,2-100) 2,88 (2,45-3,38) - - - '
19Р-ЭТ Форма 2* 150 96,0 (91,5-98,5) 2,43 (2,01-2,94) - - •
19Р-ОТ Форма 3* - - - 50 96,0 (86,3-99,5) 3,70 (2,58-5,30)
Ргеипаг 148 98,6 (95,2-99,8) 2,98 (2,60-3,41) 41 97,6 (87,1-99,9) 2,91 (2,15-3,94)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
- 31 014107
Таблица 9 Процентное содержание субъектов с 19Р-ОРА-титром >1:8 и 19Р-ОРА СМТ через 1 месяц после первичной вакцинации с использованием 1 мкг 19Р-РБ, 3 мкг 19Р-БТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)
Г руппа ι-ΐΡπ-ΡΜΟΐ-οοι 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-007
N %^1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%) N %> 1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%)
ИРп-РЭ 136 84,6 (77,4-90,2) 77,8 (58,1-104,4) 46 95,7 (85,2-99,5) 167,8 (118,1-238,6)
19ΡΌΤ Форма 1* 137 95,6 (90,7-98,4) 263,2 (209,4-330,7) -
19Р-0Т Форма 2* 139 92,1 (86,3-96,0) 218,9 (166,5-287,9) - -
19ΡΌΤ Форма 3* • - - 49 91,8 (80,4-97,7) 403,1 (225,7-719,9)
Ргеупаг 131 86,3 (79,2-91,6) 82,6 (61,1-111,6) 38 81,6 (65,7-92,3) 65,0 (37,7-112,2)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 10 Процентное содержание субъектов с концентрацией 19Р-антител >0,20 мкг/мл и СМС 19Р-антител (мкг/мл) до и через 1 месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной детей, примированных с использованием 1 мкг 19Р-РБ, 3 мкг 19Р-БТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)
Первичная группа 11 Ρη-Ρϋ&Οί-002 (22Е ЕЫЗА)
До бустерной вакцинации Через один месяц после бустерной иммунизации 23валентной РЗ-вакциной
N % > 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N % > 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%)
11 Ρη-Ρϋ 70 77,1 (65,6-86,3) 0,67 (0,45-0,98) 67 94,0 (85,4-98,3) 11,50 (7,76-17,03)
19Ρ-ϋΤ Форма 1* 68 91,2 (81,8-96,7) 0,71 (0,54-0,94) 69 98,6 (92,2-100) 14,50 (10,47-20,07)
19ΡΌΤ Форма 2* 74 81,1 (70,3-89,3) 0,59 (0,43-0,80) 72 95,8 (88,3-99,1) 9,90 (6,74-14,54)
Ргеупаг 65 64,6 (51,8-76,1) 0,40 (0,27-0,60) 67 100 (94,6-100) 9,40 (6,95-12,71)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 11 Процентное содержание субъектов с 19Р-ОРА-титром >1:8 и 19Р-ОРА СМТ до и через 1 месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной детей, примированных с использованием 1 мкг 19Р-РБ, 3 мкг 19Р-БТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)
Первичная группа 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-002
До бустерной вакцинации Через один месяц после бустерной иммунизации 23валентной РЗ-вакциной
N %> 1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%) N %> 1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%)
11Ρη-Ρϋ 29 27,6 (12,7-47,2) 10,9 (5,0-23,7) 28 82,1 (63,1-93,9) 408,0 (157,3-1058,3)
19ΡΌΤ Форма Г 19 47,4 (24,4-71,1) 18,1 (7,2-45,7) 18 94,4 (72,7-99,9) 1063,8 (386,6-2927,5)
19ΡΌΤ Форма 2* 27 33,3 (16,5-54,0) 8,5 (4,7-15,3) 28 100 (87,7-100) 957,6 (552,8-1659,0)
Ргеупаг 24 12,5 (2,7-32,4) 8,1 (3,4-19,6) 23 82,6 (61,2-95,0) 380,9 (133,2-1089,5)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
- 32 014107
Таблица 12 Процентное содержание субъектов с концентрациями антител >0,2 мкг/мл, ОРА >1:8 и СМС/СМΤ против пневмококков 19Р через 1 месяц после бустерной иммунизации вакциной 11ΡΠ-ΡΌ или Ггеупаг детей, примированных с использованием 1 мкг 19Ε-Ρ0, 3 мкг 19Ρ-ΌΤ или Ριόυικιγ (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)
Первичная группа 11Ρπ-Ρϋ&Οι-002
Анализ 22Р-ЕД13А Анализ ОРА
N % Υ 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N %> 1:8 (ДИ 95%) ОМТ (ДИ 95%)
11РП-РО 70 100 (94,9-100) 4,52 (3,7-5,5) 21 100 (83,9-100) 255,6 (135,5-481,9)
19Ρ-ϋΤ Форма 1* 66 98,5 (91,8-100) 3,45 (2,8-4,3) 23 95,7 (78,1-99,9) 374,0 (192,6-726,2)
19Ε-ΩΤ Форма 2* 70 98,6 (92,3-100) 3,80 (2,9-4,9) 29 96,6 (82,2-99,9) 249,1 (144,7-428,7)
Ргеупаг 69 97,1 (89,9-99,6) 2,56 (2,0-3,3) 31 96,8 (83,3-99,9) 528,7 (319,4-875,2)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 13 Процентное содержание субъектов с концентрациями антител >0,2 мкг/мл, ОРА >1:8 и СМС/СМΤ против пневмококков 19А через 1 месяц после первичной вакцинации с использованием 1 мкг 19Ε-Ρ0, 3 мкг 19Ρ-ΌΤ или ΡϊΌνικίΓ (2 мкг 19Р-СКМ) (общая группа)
Группа ιιρη-ρϋ&οϊ-οοι
Анализ 22Е-ЕИЗА Анализ ОРА
N % А 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N %>1:8 (ДИ 95%) омт (ДИ 95%)
11Ρπ-Ρϋ 45 28,9 (16,4-44,3) 0,09 (0,07-0,11) 52 7,7 (2,1-18,5) 5,2 (4,0-6,8)
19Ρ-ϋΤ Форма 2* 51 29,4 (17,5-43,8) 0,11 (0,08-0,16) 59 27,1 (16,4-40,3) 12,4 (7,6-20,3)
Рге/паг 55 18,2 (9,1-30,9) 0,10 (0,08-0,12) 61 3,3 (0,4-11,3) 4,6 (3,8-5,6)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Пример 5. Эксперименты с адъювантами в доклинических моделях: влияние на иммуногенность пневмококковых 11-валентных полисахаридных конъюгатов у пожилых макак-резус.
Для оптимизации ответа, вызываемого на конъюгатные пневмококковые вакцины у пожилого населения, С8К изготовила 11-валентную полисахаридную (Ρδ) конъюгатную вакцину с новым адъювантом адъювантом С, см. ниже.
Группы из 5 пожилых макак-резус (в возрасте 14-28 лет) иммунизировали внутримышечно (в/м) на 0- и 28-е сутки, используя 500 мкл либо 11-валентных Ρδ-конъюгатов, адсорбированных на 315 мкг Α1ΡΟ4, либо 11-валентных Ρδ-конъюгатов, смешанных с адъювантом С.
В обеих вакцинных композициях каждый из 11-валентных Ρδ-конъюгатов был составлен из следующих конъюгатов: Ρδ1-ΡΌ, Ρδ3-ΡΌ, Ρδ4-ΡΌ, Ρδ5-ΡΌ, Ρδ7Р-Ρ^, Ρδ9У-Ρ^, Ρδ14-ΡΌ, Ρδ18^ΡΌ, Ρδ19Р-Ρ^, Ρδ23Ρ-ΌΤ и Ρδ6Β-ΌΤ. Доза применяемой вакцины составляла 1/5 дозы вакцины для человека (5 мкг каждого сахарида на дозу для человека, за исключением 6В (10 мкг)), конъюгированной в соответствии с условиями табл. 6 (пример 4), за исключением того, что 19Р приготавливали в соответствии со следующими условиями способа с использованием СОА?: уменьшенный в размере сахарид 9 мг/мл, ΡΌ 5 мг/мл, начальное соотношение ΡΌ/Ρδ 1,2/1, концентрация СПАВ 0,75 мг/мг Ρδ, рНа=рНс=рНч 9,0/9,0/9,0 и время связывания 60 мин.
Уровни анти-Ρδ ЕЬША 1дС и опсонофагоцитарные титры измеряли в сыворотке, собранной на 42-е сутки. Частоту встречаемости анти-Ρδ3 В-клеток памяти измеряли с использованием ЕШро( в клетках периферической крови, собранных на 42-е сутки.
Согласно результатам, показанным в данном описании ниже, адъювант С значительно усиливал иммуногенность 11-валентных Ρδ-конъюгатов по сравнению с конъюгатами с А1₽О4 на пожилых макаках. Новый адъювант усиливал 1дС-ответы на Ρδ (фиг. 1) и опсонофагоцитарные титры антител (табл. 14). Также было доказательно очевидно, что частота встречаемости Ρδ3-специфических В-клеток памяти возрастала в результате применения адъюванта С (фиг. 2).
- 33 014107
Таблица 14
Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (опсонофагоцитарные титры после второй иммунизации (ро§1-П))
Р31 РЗЗ Р34 Р35 Р86В Р87Р Р39У Р314 Р318С Р319Р Р323Е
11-валент. До иммуниз. <3 5 <8 5 <8 16 <3 <8 <8 <8 <8
А1РО< 14-е сут ροεί Н 8 181 64 49 64 4096 42 37 169 64 <64
11-валент. До иммуниз. 5 9 <8 5 8 37 <8 <8 <8 <8 <8
Адъюа. С 14-е сут роз! II 776 1351 891 676 6208 16384 111 161 7132 2048 <64
ЕНкро! В-клеток.
Принцип данного анализа основан на том факте, что В-клетки памяти созревают в плазматические клетки ш ν 11го после культивирования с СрС в течение 5 суток. Генерированные ш ν 11го антигенспецифические плазматические клетки можно легко детектировать и, следовательно, их можно подсчитать с использованием е1щро1-анализа В-клеток. Количество специфических плазматических клеток отображает частоту встречаемости В-клеток памяти в культуре в начальный момент.
В кратком изложении образованные ш ν^(^о плазматические клетки инкубируют в культуральных планшетах, покрытых антигеном. Антигенспецифические плазматические клетки образуют пятна антитело/антиген, которые детектируют с использованием стандартной иммуноферментной методики и подсчитывают как В-клетки памяти. В настоящем исследовании для того, чтобы подсчитать соответствующие В-клетки памяти, для покрытия культуральных планшетов использовали полисахариды. Результаты выражают в виде частоты встречаемости Р8-специфических В-клеток памяти на миллион В-клеток памяти.
Это исследование показало, что адъювант С может смягчать известную проблему биостабильности Р83 (см. 5-й международный Симпозиум по пневмококкам и пневмококковым заболеваниям, 2-6 апреля 2006 г., А11се 8ргтд§, Центральная Австралия, Специфичность иммунных ответов против пневмококкового конъюгата серотипа 3. 8сйиегтап Ь., Ргути1а К., Роо1тап 1. АЬйгас! Ьоок, р. 245, РО 10.06).
Пример 6. Эффективность детоксифицированного пневмолизина (бР1у) в качестве белкового носителя для усиления иммуногенности Р8 19Б у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 4-валентного простого Р8, либо 4-валентного бР1у-конъюгированного Р8, в обоих случаях в смеси с адъювантом С.
Обе вакцинные композиции содержали по 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из следующих Р8: Р88, Р812Б, Р819Б и Р822Б.
Уровни ЕЬ18А анти-Р8 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
Анти-Р819Б-ответ, показанный в качестве примера на фиг. 3, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные бР1у-конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными простыми Р8. Аналогичное улучшение наблюдалось для анти-Р88, 12Б и 22Б 1дС-ответов (данные не показаны).
Пример 7. Эффективность пневмококкового белка Б гистидинового триадного семейства (РЫБ) в качестве белкового носителя для усиления иммуногенности Р8 22Б у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 4-валентного простого Р8, либо 4-валентного РйЕЭ-конъюгированного Р8, в обоих случаях в смеси с адъювантом С.
Обе вакцинные композиции содержали по 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из следующих Р8: Р88, Р812Б, Р819Б и Р822Б.
Уровни анти-Р8 ЕЬ18А 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
Анти-Р822Б-ответ, показанный в качестве примера на фиг. 4, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные РйФ-конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными простыми Р8. Аналогичное улучшение наблюдали для анти-Р88, 12Б и 19Б 1дС-ответов (данные не показаны).
Пример 8. Иммуногенность 13-валентных Р8-конъюгатов, содержащих 19А-бР1у и 22Б-РЫБ у старых С57В1 мышей.
Группы из 30 старых С57В1 мышей (в возрасте более 69 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 11-валентных Р8-конъюгатов, либо 13-валентных Р8-конъюгатов, в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-Валентная вакцинная композиция содержала по 0,1 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РБ, Р83-РБ, Р84-РБ, Р85-РБ, Р86В-РБ, Р87Б-РБ, Р89У-РБ, Р814-РБ, Р818С-ТТ, Р819Б-БТ и Р823Б-РБ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2). 13-валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Р819А-бР1у и Р822Б-РЫБ (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Б]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой СМВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Р8 22Б использовали РЫБ, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЫБ_Е (конструкция УР147 из νθ 03/054007). В группе 6 19А конъюгировали с дифтерийным анатоксином, а 22Б - с белком Б.
- 34 014107
Уровни анти-Р819А и 22Р ЕЬ18А 1дС измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки. ЕЬ18А 1дС-ответ, полученный на остальные Р8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
19А-СР1у и 22Р-РЫО, введенные в составе 13-валентной конъюгатной вакцинной композиции, продемонстрировали иммуногенность у старых С57В1 мышей (табл. 15). Иммунный ответ, индуцированный против остальных Р8, не оказывал негативного воздействия на мышей, получавших 13-валентную композицию, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентной композицией.
Таблица 15
Р8 иммуногенность на старых С57В1 мышах (уровни 1дС после III иммунизации (рой-Ш))
Старые С57 черные мыши
ЕБ18А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11 -вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал.
19А-с1Р!у 19А-0Р1у 19А-с1Р1у 19А-с1Р1у
дтЬз формол дтЬв формол 19ΑΌΤ
22Р-РМО 22Р-РНЮ 22Р-РпЮ-Е 22Р-Р1Ш-Е 22Ρ-Ρϋ
0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг750мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкп
Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С АДЪЮВ. С Адъюв. С
1 средний пул 19,30 20,20 24,40 12,80 12,10 13,60
3 средний пул 6,32 4,84 5,21 6,74 2,38 2,54
4 средний пул 60,9 67,1 51,4 47,4 45,5 41,1
5 средний пул 1,34 3,81 3,06 2,75 1,26 1,23
6В средний пул 4,41 4,12 5,88 1,58 2,31 5,64
7Р средний пул 0,83 0,81 1,65 1,98 0,89 0,99
ЭУ средний пул 13,8 23,7 20,0 13,1 15,5 9,6
14 средний пул 25,73 42,96 34,12 32,53 23,97 15,60
18С средний пул 13,4 20,1 11,9 9,1 8,3 8,4
19Р средний пул 57,5 90,0 63,8 36,5 47,0 69,1
23Р средний пул ΝΚ ΝΗ ΝΚ ΝΗ ΝΡ ΝΚ
СМС 0,06 0,09 0,25 0,08 0,23 0,19
19А 1С 0,04-0,1 0,05-0,14 0,15-0,41 0,06-0,12 0,14-0,38 0,09-0,3
“/•серо 33% 47% 83% 53% 80% 73%
СМС ΝΚ 5,81 3,76 0,54 0,85 2,02
22Р 1С 3,2-10,6 1,8-7,9 0,3-1,1 0,4-1,7 1,2-3,4
%серо 0% 97% 90% 77% 87% 97%
Пример 9. Иммуногенность 13-валентных Р8-конъюгатов, содержащих 19А-СР1у и 22Р-РЬ1О, у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 30 молодых Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 11-валентных Р8-конъюгатов, либо 13-валентных Р8-конъюгатов, в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-валентная вакцинная композиция содержала по 0,1 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РП, Р83-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р86В-Р1Х Р87Р-Р1Е Р89У-Р1Е Р814-РП, Р818С-ТТ, Р819РГОТ и Р823Е-РЭ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2). 13-валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Р819А-СР1у и Р822Е-РН1Э (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Р]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой СМВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Р8 22Р использовали РЫЭ, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЫЭ_Е (конструкция УР147 из νϋ 03/054007). В группе 6 конъюгировали 19А с дифтерийным анатоксином, а 22Р - с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Р ЕЬ18А 1дС измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки. ЕЬ18А 1дС-ответ, полученный на остальные Р8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
19А-СР1у и 22Р-РЫО, введенные в составе 13-валентной конъюгатной вакцинной композиции, демонстрировали иммуногенность у молодых Ва1Ь/с мышей (табл. 16). Иммунный ответ, индуцированный против остальных Р8, не оказывал негативного воздействия на мышей, получавших 13-валентную композицию, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентной композицией.
- 35 014107
Таблица 16
Р8 иммуногенность у молодых Ва1Ь/с мышей (рок!-!!! уровни !βθ)
Ва1ЬС мыши
ЕИ5А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11 -вал. 0,1мкг/50мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-с1Р1у дтЬз 22Е-РМЭ 0,1мкг/50мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-с1РГу формол 22Г-Р11Ю 0,1мкг750мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-бР!у дтЬз 22Е-РНЮ-Е 0,1мкг/50мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-бР1у формол 22Р-РЬЮ-Е 0,1мкг/50мкл Адъюв. С 11-вал. 19Α-ϋΤ 22Ρ-Ρϋ 0,1мкг/50мкл Адъюв. С
1 средний пул 131,70 101,20 83,00 82,40 67,90 85,50
- средний пул 21,85 10,38 12,53 8,83 8,73 14,98
л средний пул 147,4 127,0 104,4 95,0 113,6 114,2
5 средний пул 21,38 20,29 18,26 18,95 18,02 23,04
ев средний пул 1,97 4,76 3,72 2,35 1,43 1,05
средний пул 7,69 4,58 4,77 4,24 3,92 3,94
9ν средний пул 30,1 30,7 26,5 21,4 23,4 28,3
14 средний пул 28,78 27,67 26,23 21,54 24,34 13,73
18С средний пул 53,4 52,37 46,5 57,8 47,8 75,8
4Ог средний 19Р пул 186,6 157,7 169,3 178,9 181,9 223,2
,-с средний пул 4,98 3,9 5,11 0,57 3,13 4,57
ОМС 19А 1С %серо 0,4 0,2-0,6 93% 32,8 26,6-40,7 100% 25,1 20,6-30,6 100% 21,6 17,5-26,7 100% 18,9 15,1-23,5 100% 23,5 19,5-28,5 100%
СМС 22Е !С %серо ΝΚ 0% 3,99 1,9-8,42 93% 3,76 1,8-8 100% 6,27 3,8-10,4 100% 8,70 5,4-13,9 100% 18,76 15,2-23,1 100%
Пример 10. Иммуногенность 13-валентных Р8-конъюгатов, содержащих 19А-бР1у и 22Р-РЫП, у морских свинок.
Группы из 20 молодых морских свинок (линия Наг!1еу; в возрасте 5 недель) иммунизировали в/м на 0-, 14- и 28-е сутки, используя 125 мкл либо 11-валентных Р8-конъюгатов, либо 13-валентных Р8-конъюгатов, в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-валентная вакцинная композиция содержала по 0,25 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РП, Р83-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р86В-Р1Е Р87Р-РП, Р89У-РП, Р814-РП, Р818С-ТТ, Р819Р-ПТ и Р823Е-РЭ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2). 13-валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Р819А-бР1у и Р822Р-РЫО (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Р]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой СМВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Р8 22Р использовали РЫО, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЫО_Е (конструкция УР147 из νθ 03/054007). В группе 6 конъюгировали 19А с дифтерийным анатоксином, а 22Р - с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Р ЕЫ8А измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки. ЕЫ8А ^С-ответ, полученный на остальные Р8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
- 36 014107
Таблица 17
Р8 иммуногенность у молодых морских свинок (рой-ΙΙΙ уровни 1дС)
Морские свинки
ЕЬ18А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал.
19А-0Р1у 19А-0Р1у 19А-с1Р1у 19А-с1Р1у
дтЬз формол дтЬз формол 19Α-ϋΤ
22Г-РЙФ 22Р-РМО 22Р-РМО-Е 22Ρ-ΡΙΗΟ-Ε 22Ρ-Ρϋ
0,1мкг/50мкп 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкп 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл
Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С
1 средний пул 78,00 77,21 76,15 68,77 68,59 81,04
3 средний пул 7,75 9,31 12,73 7,94 4,75 9,59
4 средний пул 130,7 94,4 132,6 166,8 85,0 101,3
5 средний пул 109,10 117,10 110,70 158,40 74,10 100,40
6В средний пул 3,14 4,26 14,4 7,63 6,3 7,52
7Р средний пул 154,2 216,0 240,0 181,0 142,0 179,1
91/ средний пул 90,69 105,45 98,20 93,45 54,12 73,05
14 средний пул 71,19 77,18 46,53 59,67 38,47 53,69
18С средний пул 109,4 122,3 137,1 79,9 73,7 83,1
19Р средний пул 73,9 102,5 112,2 75,5 62,3 72,1
23 Р средний пул 19,19 30,74 29,44 31,52 19,13 24,94
СМС 0,4 25,58 41,49 14,25 27,49 6,74
19А 1С 0,24-0,68 12-54,5 24,4-70,5 5,9-34,6 16,6-45,4 4-11,3
%серо 75% 100% 100% 100% 100% 100%
СМС 0,12 2,51 3,67 45,74 30,68 96,38
22Р 1С 0,09-0,16 0,94-6,73 1,59-8,42 29,3-71,4 17-53,3 73,5-126,4
%серо 10% 95% 95% 100% 100% 100%
Пример 11. Приготовленные и протестированные композиции.
а) Приготавливают следующие композиции (используя 13-валентную вакцину из табл. 1 и серотип 3 из табл. 5 - см. комментарий к 14-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием напрямую конъюгированного 22Р или через линкер АЭН|). Сахариды приготавливают с фосфатом алюминия и 3О-МРЬ, как показано ниже.
14-валентная 25 мкг МРЬ Суммарное содержание алюминия (РР) в ВАС Надозу: 14-валентная 10 мкг ΜΡί Суммарное содержание алюминия (РР) в ВАС На дозу:
Р8 носитель мкг РЗ мкг МРЬ отнош. Ρ5/ΑΙ 1/х МКГ ΑΙ РЗ носитель мкг ρε ΜΚΓ МРЬ отнош. Ρ8/ΑΙ 1/х мкг ΑΙ
1 Ρϋ 1 10 10 1 Ρϋ 1 10 10
3 Ρϋ 1 10 10 3 РЭ 1 10 10
4 ρβ 3 10 30 4 Ρϋ 3 10 30
5 Ρϋ 1 10 10 5 Ρϋ 1 10 10
6А ΡΟ 1 10 10 6А Ρϋ 1 10 10
6В Ρϋ 1 10 10 6В Ρϋ 1 10 10
7Р Ρϋ 1 10 10 7Р Ρϋ 1 10 10
91/ Ρϋ 1 10 10 91/ Ρϋ 1 10 10
14 Ρϋ 1 10 10 14 Ρϋ 1 10 10
18С ТТдн 3 15 45 18С ТТдн 3 15 45
19А ЯР1у 3 10 30 19А άΡ'γ 3 10 30
19Р ОТ 3 10 30 19Р ϋΤ 3 10 30
22 Р РЬЮ 3 10 30 22 Р РЙЮ 3 10 30
23Р Ρϋ 1 10 10 23Р ΡΟ 1 10 10
ВАС МРЬ 50/200 25 4 100 ВАС МР150/200 10 4 40
Содержание алюминия в РГ Сумма = 355 Содержание алюминия в РР Сумма = 295
ВАС = бактериальный антигенный комплекс.
- 37 014107
б) В ту же сахаридную композицию добавляют каждый из следующих адъювантов (в приведенной ниже таблице показана концентрация компонентов эмульсии на 500 мкл дозы).
Адъювант А1 250 мкл водно- Адъювант А2 125 мкл водно- Адъювант АЗ 50 мкл водно-
Ингредиенты масляной масляной масляной
эмульсии эмульсии эмульсии
альфа-Т окоферол 11,88 мг 5,94 мг 2,38 мг
Сквален 10,7 мг 5,35 мг 2,14 мг
Твин 80 4,85 мг 2.43 мг 0,97 мг
Адъювант А4 Адъювант А5 Адъювант А6 Адъювант А7
250 мкл 250 мкл 125 мкл 50 мкл водно-
Ингредиенты водно- водно- водно- масляной
масляной эмульсии масляной эмульсии масляной эмульсии эмульсии
альфа- 11,88 мг 11,88 мг 5,94 мг 2,38 мг
Токоферол Сквален 10,7 мг 10,7 мг 5,35 мг 2,14 мг
Твин 80 4,85 мг 4,85 мг 2,43 мг 0,97 мг
3ϋ-ΜΡΙ 50 мкг 25 мкг 25 мкг 10 мкг
в) Сахариды также готовят в виде препарата с двумя адъювантами на основе липосом.
Состав адъюванта В1.
Качественный/количественный (на 0,5 мл дозы).
Липосомы:
ВОРС: 1мг;
холестерин: 0,25 мг;
3О-МРЬ: 50 мкг;
Р821: 50 мкг;
буфер: 3,124 мг КН2РО4;
буфер: 0,290 мг №2НРО4;
№С1: 2,922 мг (100 мМ);
АЕ1 добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,1.
1. Полная концентрация РО4=50 мМ.
Состав адъюванта В2.
Качественный/количественный (на 0,5 мл дозы).
Липосомы:
ВОРС: 0,5 мг;
холестерин: 0,125 мг;
3В-МРЙ: 25 мкг;
Р821: 25 мкг;
буфер: 3,124 мг КН2РО4;
буфер: 0,290 мг №2НРО4;
№С1: 2,922 мг (100 мМ);
АГ1 добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,1.
г) Сахариды также готовят в виде препарата с адъювантом С (см. выше для других композиций, в которых был использован этот адъювант).
Качественный/количественный состав (на 0,5 мл дозы):
эмульсия масло-в-воде: 50 мкл;
сквален: 2,136 мг;
α-токоферол: 2,372 мг;
Твин 80: 0,97 мг;
холестерин: 0,1 мг;
3В-МРЙ: 50 мкг;
Р821: 50 мкг;
буфер: 0,470 мг КН2РО4;
буфер: 0,219 мг №2НРО4;
№С1: 4,003 мг (137 мМ);
КС1, 0,101мг (2,7 мМ);
АГ1 добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,8.
- 38 014107
Пример 12. Влияние химии конъюгирования на иммуногенность конъюгата 22Е-РИФ у Ва1Ь/с мышей.
Группы из 30 самок Ва1Ь/с мышей иммунизировали внутримышечным (в/м) способом на 0-, 14- и 28-е сутки 13-валентными Р8-композициями, содержащими Р8 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р (доза: 0,3 мкг сахарида/Р8 для Р8 4, 18С, 19А, 19Р и 22Р и 0,1 мкг сахарида/Р8 для остальных Р8).
Р8 18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Р - с дифтерийным анатоксином, 19А - с детоксифицированным формолом Р1у, 22Р - с РИФ, а остальные Р8 - с РЭ.
Сравнивали две композиции, состоящие либо из 22Е-РИФ, полученного посредством прямой СОАР-химии, либо 22Р-АН-РН1Э (АОН-дериватизированный Р8). Характеристики 13-валентной вакцины, приготовленной либо с использованием 22Р, конъюгированного непосредственно, либо через спейсер АЭН, см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2. Вакцинные композиции были дополнены адъювантом С.
Уровни ЕЬ18А анти-Р822Р 1дС и опсонофагоцитарные титры измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
22Е-АН-РИФ показал себя намного более иммуногенным, чем 22Е-РИФ, в исчислении как уровней 1дС (фиг. 5), так и опсонофагоцитарных титров (фиг. 6).
Пример 13. Влияние новых адъювантов на иммуногенность конъюгатов на основе капсульных Р8 81герЮссосси5 риеишошае.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей иммунизировали в/м способом на 0-, 14- и 28-е сутки 13-валентными Р8-композициями, содержащими Р8 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р (доза: 0,3 мкг/Р8 для Р8 4, 18С, 19А, 19Р и 22Р и 0,1 мкг/Р8 для других Р8).
Р8 18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Р - с дифтерийным анатоксином, 19А - с детоксифицированным формолом Р1у, 22Р -с РИФ, а остальные Р8 - с РО. Характеристики 13-валентной вакцины, приготовленной с непосредственно конъюгированным 22Р, см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2.
Сравнивали четыре композиции, дополненные А1РО4, адъювантом А1, адъювантом А4 либо адъювантом А5.
Уровни анти-Р8, Р1у, Р11Ф и РЭ ЕЫ8А 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки и объединенных в группе. Для каждого антигена рассчитывали следующее соотношение: уровень 1дС, индуцированный новым протестированным адъювантом/уровень 1дС, индуцированный А1РО4.
Все протестированные новые адъюванты улучшали по меньшей мере в 2 раза иммунные ответы на 13-валентные конъюгаты по сравнению с классической композицией А1РО4 (фиг. 7).
Пример 14. Защитная эффективность комбинации (сотЬо) РИФ/детоксифицированный Р1у в модели пневмококковой пневмонии у обезьян.
Группы из 6 макак-резус (в возрасте от 3 до 8 лет), отобранных как имеющие самые низкие уровни анти-19Р антител до иммунизации, иммунизировали внутримышечно на 0- и 28-е сутки либо 11-валентными Р8-конъюгатами (т.е. 1 мкг Р8 1, 3, 5, 6В, 7Р, 9У, 14 и 23Р и 3 мкг Р8 4, 18С и 19Р), либо Р11Ф (10 мкг) + детоксифицированный формолом Р1у (10 мкг), либо только адъювантом.
Р8 18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Р - с дифтерийным анатоксином, а остальные Р8 - с РО. Характеристики 11-валентной вакцины см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2. Все композиции были дополнены адъювантом С.
Пневмококки типа 19Р (5-108 КОЕ (колониеобразующих единиц)) инокулировали в правое легкое на 42-е сутки. Колонии подсчитывали в бронхоальвеолярных лаважах, собранных на 1-, 3- и 7-е сутки после контрольного заражения. Результаты выражали в виде количества животных на группу либо умерших, с колонизированным легким, либо с чистым легким на 7-е сутки после контрольного заражения.
Как показано на фиг. 8, хорошая защита, близкая к статистически значимой (несмотря на небольшое количество используемых животных), была получена при использовании 11-валентных конъюгатов и РйФ+БР1у сотЬо (р<0,12, точный тест Фишера) по сравнению с группой только с одним адъювантом.
Пример 15. Влияние химии конъюгирования на анти-РИФ антительный ответ и защитную эффективность против контрольного заражения 4 типа, индуцированных конъюгатами 22Е-РИФ.
Группы из 20 самок ОЕ1 мышей иммунизировали внутримышечным способом на 0- и 14-е сутки, используя 3 мкг либо 22Е-РИФ (приготовленного с применением прямой СОАР-химии), либо 22Е-АНР11Ф (АЭН-дериватизированного Р8), либо только адъюванта. Оба моновалентных конъюгата на основе 22Е готовили способами примера 2 (см. также табл. 1 и 2). Каждая композиция была дополнена адъювантом С.
Уровни анти-РйФ ЕЬ18А 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 27-е сутки.
- 39 014107
Проводили контрольное заражение мышей, интраназально с использованием 5-106 КОЕ пневмококков 4 типа на 28-е сутки (т.е. пневмококкового серотипа, потенциально не охватываемого РЧ, присутствующим в тестируемой вакцинной композиции). Вызываемую смертность регистрировали до срока 8 суток включительно после контрольного заражения.
22Е-АН-Р111О индуцировал значительно более высокий анти-РЫЭ 1дС-ответ и лучшую защиту против контрольного заражения 4 типа по сравнению с 22Е-Р1ИО.

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты капсульных сахаридов Ч.рпеитошае серотипов 19А и 19Б, где 19А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, а 19Б конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином, и дополнительно содержащая конъюгаты капсульных сахаридов Ч.рпеитошае 4, 6В, 9У, 14, 18С, 22Б и 23Б.
  2. 2. Иммуногенная композиция по п.1, где первый бактериальный анатоксин представляет собой белок, отличающийся от второго бактериального токсина.
  3. 3. Иммуногенная композиция по пп.1, 2, дополнительно содержащая конъюгаты капсульных сахаридов Ч.рпеитошае 1, 5 и 7Б.
  4. 4. Иммуногенная композиция по пп.1-3, дополнительно содержащая конъюгат капсульного сахарида Ч.рпеитошае 3.
  5. 5. Иммуногенная композиция по пп.1-4, дополнительно содержащая конъюгат капсульного сахарида Ч.рпеитошае 6А.
  6. 6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая один или более неконъюгированный или конъюгированный белок Ч.рпеитошае.
  7. 7. Иммуногенная композиция по п.6, где указанный один или более белок Ч.рпеитошае выбран из белков полигистидинового триадного семейства (Р1Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, семейства Ьу!Х, укороченных Ьу!Х, химерных белков укороченный СЬрХукороченный Ьу1Х, детоксифицированного пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, Чр128, Чр101, Чр130, Чр125 и Чр133.
  8. 8. Иммуногенная композиция по любому п.6 или 7, содержащая белок Р1ИХ.
  9. 9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, дополнительно содержащая адъювант.
  10. 10. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
  11. 11. Способ изготовления вакцины по п.10, включающий стадию смешивания иммуногенной композиции по любому из пп.1-9 с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
  12. 12. Способ иммунизации человека-реципиента против заболевания, вызываемого инфекцией Ч(гер(ососсик рпеитошае, включающий введение реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции по любому из пп.1-9 или вакцины по п.10.
  13. 13. Применение иммуногенной композиции по пп.1-9 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией Ч1гср1ососсик рпеитошае.
  14. 14. Иммуногенная композиция по пп.1-9, содержащая сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Б, 23Б, 1, 5, 7Б, где СМС (средняя геометрическая концентрация) титра антител, индуцированных против одного или более вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Б и 23Б, не является значительно более низкой, чем концентрация антител, индуцированных вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
  15. 15. Применение вакцины по п.10 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией Ч1гср1ососсик рпеитошае.
  16. 16. Вакцина по п.10, содержащая сахаридные конъюгаты, происходящие, по меньшей мере, из всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Б, 23Б, 1, 5, 7Б, где СМС (средняя геометрическая концентрация) титра антител, индуцированных против одного или более вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Б и 23Б, не является значительно более низкой, чем концентрация антител, индуцированных вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
  17. 17. Иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере четыре конъюгата капсульных сахаридов Ч.рпеитошае, содержащих сахариды разных серотипов Ч.рпеитошае, где по меньшей мере один сахарид конъюгирован с РЫЭ или его слитым белком, и эта иммуногенная композиция способна вызывать эффективный иммунный ответ против РИО.
EA200801367A 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae EA014107B1 (ru)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0526232A GB0526232D0 (en) 2005-12-22 2005-12-22 Vaccine
GBGB0607088.2A GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0607087A GB0607087D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0609902A GB0609902D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Novel composition
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620337A GB0620337D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620816A GB0620816D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 vaccine
GB0620815A GB0620815D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 Vaccine
PCT/GB2006/004634 WO2007068907A2 (en) 2005-12-13 2006-12-12 Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
PCT/EP2006/069977 WO2007071710A2 (en) 2005-12-22 2006-12-20 Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801367A1 EA200801367A1 (ru) 2008-12-30
EA014107B1 true EA014107B1 (ru) 2010-10-29

Family

ID=39133667

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801367A EA014107B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EA200801344A EA014165B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина
EA200801374A EA014649B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801344A EA014165B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина
EA200801374A EA014649B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина

Country Status (37)

Country Link
US (10) US20090017072A1 (ru)
EP (10) EP2382986A3 (ru)
JP (7) JP5792920B2 (ru)
KR (5) KR101515078B1 (ru)
CN (6) CN101374548B (ru)
AR (3) AR058707A1 (ru)
AT (1) ATE520415T1 (ru)
AU (4) AU2006327040B2 (ru)
BR (3) BRPI0620460B8 (ru)
CA (5) CA2816182C (ru)
CL (1) CL2013002106A1 (ru)
CR (2) CR10119A (ru)
CY (5) CY1112677T1 (ru)
DK (5) DK1973564T3 (ru)
EA (3) EA014107B1 (ru)
ES (4) ES2539795T3 (ru)
HK (1) HK1120230A1 (ru)
HR (4) HRP20110685T1 (ru)
HU (3) HUE033081T2 (ru)
IL (5) IL191911A (ru)
JO (1) JO2813B1 (ru)
LT (3) LT3017827T (ru)
MA (3) MA30066B1 (ru)
MX (2) MX354843B (ru)
MY (4) MY148141A (ru)
NO (4) NO346529B1 (ru)
NZ (4) NZ596500A (ru)
PE (2) PE20071058A1 (ru)
PH (1) PH12014502544A1 (ru)
PL (5) PL1973564T3 (ru)
PT (5) PT3017827T (ru)
SG (1) SG168517A1 (ru)
SI (5) SI1962899T1 (ru)
TR (1) TR201900418T4 (ru)
TW (4) TWI465248B (ru)
UA (2) UA96934C2 (ru)
WO (3) WO2007071711A2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
RU2743793C1 (ru) * 2014-01-21 2021-02-26 Пфайзер Инк. Капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae и их конъюгаты

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY133981A (en) * 2000-06-29 2007-11-30 Smithkline Beecham Biologicals S A Vaccine composition
ATE317267T1 (de) * 2000-11-07 2006-02-15 Immunovaccine Technologies Inc Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR102220506B1 (ko) 2005-04-08 2021-03-02 와이어쓰 엘엘씨 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CN103083657B (zh) * 2005-06-27 2016-06-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
KR101515078B1 (ko) * 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
KR101523108B1 (ko) * 2006-08-17 2015-05-26 더 유에이비 리서치 파운데이션 면역원성 ｐｃｐａ 폴리펩티드 및 이의 용도
US8398985B2 (en) * 2007-04-23 2013-03-19 Serum Institute Of India Ltd. Antigenic polysaccharides and process for their preparation
BRPI0810778A2 (pt) * 2007-05-02 2011-09-13 Glaxosmithkline Biolog Sa kit, vacina combinada, e, métodos de diminuição da interferência de vizinhança de crm sobre um antìgeno sensìvel em um esquema de imunização primária de uma vacina, e de diminuição da interferência de vizinhança sobre um antìgeno sensìvel, e, uso de conjugados de sacarìdeo
ES2552366T3 (es) * 2007-06-26 2015-11-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna que comprende conjugados de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
CN106310293A (zh) 2007-09-27 2017-01-11 免疫疫苗技术有限公司 在包括连续疏水相的载体中的脂质体在体内输送多核苷酸中的应用
EP2200642B1 (en) 2007-10-19 2012-04-18 Novartis AG Meningococcal vaccine formulations
US8226959B2 (en) 2008-02-01 2012-07-24 Newcastle Innovation Pty Ltd Vaccine compositions
PT2271360E (pt) * 2008-04-16 2015-12-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina
MX2010011393A (es) * 2008-04-16 2010-11-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna.
US9125863B2 (en) * 2008-05-22 2015-09-08 Children's Medical Center Corporation Synergistic immunogenic fusion protein-polysaccharide conjugate
AU2009253780B2 (en) 2008-06-05 2014-08-14 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
MX2011006648A (es) 2008-12-17 2011-10-14 Novartis Ag Vacunas meningococales que incluyen receptor de hemoglobina.
JP5597245B2 (ja) 2009-03-24 2014-10-01 ノバルティス アーゲー アジュバント添加した髄膜炎菌ｈ因子結合タンパク質
AU2010227221B2 (en) * 2009-03-24 2015-01-22 Novartis Ag Combinations including pneumococcal serotype 14 saccharide
WO2010109324A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
WO2010125480A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
WO2010141312A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
WO2011030218A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Novartis Ag Combination vaccines against respiratory tract diseases
KR20110068831A (ko) * 2009-12-16 2011-06-22 재단법인 전라남도생물산업진흥재단 리포좀 조성물, 그 제조방법, 및 폐렴 백신으로서의 그 용도
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003924D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
EP2585106A1 (en) 2010-06-25 2013-05-01 Novartis AG Combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP2613805B1 (en) 2010-09-10 2019-10-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Meningococcus overexpressing nada and/or nhba and outer membrane vesicles derived therefrom
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
CN103533954B (zh) * 2011-03-02 2015-09-09 诺华股份有限公司 含较低剂量的抗原和/或佐剂的联合疫苗
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
US20140072622A1 (en) * 2011-05-17 2014-03-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae
SG11201401177WA (en) 2011-10-06 2014-04-28 Immunovaccine Technologies Inc Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of tlr2 and uses thereof
CA2862247A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins
SI2809349T1 (sl) * 2012-01-30 2019-03-29 Serum Institute Of India Private Limited Imunogeni sestavek
BR112014019166A2 (pt) 2012-02-02 2017-07-04 Novartis Ag promotores para expressão aumentada de proteína em meningococos
TR201908003T4 (tr) * 2012-02-07 2019-06-21 Infectious Disease Res Inst TLR4 agonistleri içeren gelişmiş adjuvan formülasyonları ve bunların kullanım metotları.
WO2013131983A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
EP2822584A1 (en) 2012-03-08 2015-01-14 Novartis AG Combination vaccines with tlr4 agonists
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
WO2014009971A2 (en) * 2012-07-07 2014-01-16 Bharat Biotech International Limited Non-alcoholic vaccine compositions free from animal- origin and process for preparation thereof
PT3421051T (pt) 2012-08-16 2020-06-26 Pfizer Processos e composições de glicoconjugação
RU2015106930A (ru) 2012-09-06 2016-10-20 Новартис Аг Комбинированные вакцины с менингококком серогруппы в и к/д/с
CN109289045A (zh) * 2012-09-19 2019-02-01 国立大学法人大阪大学 含有肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075196A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US20150320852A1 (en) 2012-12-18 2015-11-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugates for protecting against diphtheria and/or tetanus
RU2672053C2 (ru) * 2012-12-20 2018-11-09 Пфайзер Инк. Способ гликоконъюгации
RU2544168C1 (ru) * 2014-01-17 2015-03-10 Андрей Дмитриевич Протасов Способ формирования иммунологической памяти к антигенам streptococcus pneumoniae у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
NZ759686A (en) * 2014-01-21 2023-07-28 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
KR102049826B1 (ko) 2014-01-21 2019-12-03 화이자 인코포레이티드 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 및 그의 접합체
EP3443983B1 (en) * 2014-02-14 2022-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
CN103893751B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 天津康希诺生物技术有限公司 一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法
CN103936842B (zh) * 2014-04-30 2016-03-23 重庆医科大学 肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3221339A1 (en) * 2014-11-20 2017-09-27 Biological E Limited Codon optimized polynucleotide for high level expression of crm197
JP6903046B2 (ja) * 2015-03-26 2021-07-14 ジーピーエヌ ワクチン プロプライアタリー リミティド 連鎖球菌ワクチン
SG11201708242YA (en) 2015-05-04 2017-11-29 Pfizer Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
MX2017015985A (es) * 2015-06-08 2018-08-15 Serum Inst Of India Private Ltd Metodos para mejorar la adsorcion de conjugados de polisacarido-proteina y formulacion de vacuna multivalente obtenida con los mismos.
RU2600838C1 (ru) * 2015-06-08 2016-10-27 Андрей Дмитриевич Протасов Способ усиления активности факторов неспецифической защиты у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
KR20160146240A (ko) 2015-06-12 2016-12-21 전관구 염기성 계면활성제를 이용한 산화은나노 및 은나노 제조 방법
BR112017028130A2 (pt) * 2015-06-23 2018-08-28 Biological E Ltd vacina conjugada pneumocócica multivalente
TWI756893B (zh) * 2015-07-21 2022-03-01 美商輝瑞股份有限公司 包含經共軛之莢膜糖抗原的致免疫性組成物、包含該致免疫性組成物之套組及彼等之用途
GB201518684D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB201522068D0 (en) * 2015-12-15 2016-01-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Dried composition
MX2019001342A (es) 2016-08-05 2019-07-04 Sanofi Pasteur Inc Composicion de conjugado de proteina-polisacarido de neumococo multivalente.
CA3031797A1 (en) * 2016-08-05 2018-02-08 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN109890413B (zh) 2016-09-02 2024-04-16 赛诺菲巴斯德股份有限公司 脑膜炎奈瑟氏菌疫苗
CN109982715A (zh) 2016-09-27 2019-07-05 免疫疫苗技术有限公司 利用低剂量体积b细胞表位组合物以在受试人中诱导抗体免疫应答的方法
JP2019529497A (ja) 2016-09-30 2019-10-17 バイオロジカル イー リミテッド 多糖類−タンパク質コンジュゲートを含む多価肺炎球菌ワクチン組成物
JP6944946B2 (ja) * 2016-10-20 2021-10-06 Ｋｍバイオロジクス株式会社 低分子化ＰＲＰを用いたＨｉｂコンジュゲートワクチンの製造方法
KR102083973B1 (ko) * 2016-10-28 2020-04-23 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
CN108144052A (zh) * 2016-12-02 2018-06-12 武汉博沃生物科技有限公司 肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物及其制取方法和用途
EP3562838A2 (en) 2016-12-28 2019-11-06 Henriques Normark, Birgitta Microparticles from streptococcus pneumoniae as vaccine antigens
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
WO2018126229A2 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Sutrovax, Inc. Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
EP3570879B1 (en) * 2017-01-20 2022-03-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
KR102650073B1 (ko) 2017-01-31 2024-03-20 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법
US11246918B2 (en) 2017-02-03 2022-02-15 Eva Barbara Schadeck Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN107929728A (zh) * 2017-04-19 2018-04-20 武汉博沃生物科技有限公司 一种肺炎球菌蛋白疫苗及其制备方法
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
EP3634481A4 (en) 2017-06-10 2021-07-21 Inventprise, LLC. MULTIVALENT CONJUGATE VACCINES WITH BIVALENT OR MULTIVALENT CONJUGATE POLYSACCHARIDES THAT CONFIRM ENHANCED IMMUNOGENICITY AND AVIDITY
WO2019043245A1 (en) * 2017-09-04 2019-03-07 London School Of Hygiene And Tropical Medicine MICROBIAL CELLS EXPRESSING STREPTOCOCCAL SERROTYPES
CA3074714A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
CN111065387B (zh) 2017-09-07 2023-08-25 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
MX2020002557A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina.
SG11202005255PA (en) 2017-12-06 2020-07-29 Merck Sharp & Dohme Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
WO2019152921A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CA3089007A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
JP2021522213A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッド ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類及びその免疫原性接合体
US20210252125A1 (en) * 2018-04-30 2021-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates
US11896656B2 (en) 2018-04-30 2024-02-13 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
CN112074294A (zh) * 2018-04-30 2020-12-11 默沙东公司 从冻干球生产肺炎链球菌荚膜多糖载体蛋白缀合物的方法
CN108524926B (zh) * 2018-06-29 2021-06-29 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
JP7399934B2 (ja) 2018-07-04 2023-12-18 バックスサイト・インコーポレイテッド 免疫原性複合体の改良
EP3849587A4 (en) * 2018-09-12 2022-06-29 Affinivax, Inc. Multivalent pneumococcal vaccines
MX2021007496A (es) 2018-12-19 2021-08-05 Merck Sharp & Dohme Llc Composiciones que comprenden conjugados de polisacarido de streptococcus pneumoniae con proteina y sus metodos de uso.
JP7441301B2 (ja) * 2019-07-18 2024-02-29 セルトリオン， インク． 球菌多糖類－タンパク質接合体を含む免疫原性組成物
US20210070890A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Serum Institute Of India Private Limited Method for obtaining purified bacterial polysaccharides
JP7419499B2 (ja) 2019-09-18 2024-01-22 アルコン インク． 湿式充填のソフトヒドロゲル眼用インサート
KR20220146451A (ko) * 2020-01-17 2022-11-01 인벤트프라이즈 엘엘씨 다가 스트렙토코커스 백신
KR20210117663A (ko) 2020-03-20 2021-09-29 주식회사 보고 수직형 침지식 dpf 세척장치
CN116121106A (zh) * 2021-07-08 2023-05-16 成都生物制品研究所有限责任公司 肺炎链球菌无动物源冻干保护剂

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006951A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
WO2003051392A2 (en) * 2001-12-18 2003-06-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine
US20030147922A1 (en) * 1999-03-19 2003-08-07 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides
WO2006110381A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2007068907A2 (en) * 2005-12-13 2007-06-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant

Family Cites Families (175)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
EP0027888B1 (en) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Semiconductor switch
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4619828A (en) 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
AU614755B2 (en) 1987-06-05 1991-09-12 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5785973A (en) * 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
DE69015222T2 (de) 1989-02-04 1995-05-04 Akzo Nv Tocole als Impfstoffadjuvans.
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
CA2063271A1 (en) 1989-07-14 1991-01-15 Subramonia Pillai Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
IL98715A0 (en) 1990-08-13 1992-07-15 American Cyanamid Co Filamentous hemaglutinin of bodetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059693C (en) * 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
JP3215109B2 (ja) 1991-02-15 2001-10-02 ユーエイビー リサーチ ファウンデーション 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
EP0625910B1 (en) 1992-02-11 2003-07-23 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
EP0643559B1 (en) 1992-05-06 1999-04-14 The President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
JP3428646B2 (ja) 1992-06-18 2003-07-22 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバードカレッジ ジフテリア毒素ワクチン
SG49909A1 (en) 1992-06-25 1998-06-15 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition containing adjuvants
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
DE69405551T3 (de) 1993-03-23 2005-10-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
EP1300156A3 (en) 1993-05-18 2003-05-07 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
AU678613B2 (en) 1993-09-22 1997-06-05 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
SI0729473T1 (en) 1993-11-17 2001-02-28 Om Pharma Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
EP0772619B2 (en) 1994-07-15 2010-12-08 The University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5565204A (en) * 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
EP0814833B1 (en) 1995-03-22 2003-05-28 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5695768A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ATE323721T1 (de) 1996-05-01 2006-05-15 Univ Rockefeller Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
DE69719761T2 (de) 1996-06-18 2003-12-18 Alza Corp Vorrichtung zur verbesserung der transdermalen verabreichung von medikamenten oder der abnahme von körperflüssigkeiten
WO1998006734A1 (en) 1996-08-16 1998-02-19 Smithkline Beecham Corporation Novel prokaryotic polynucleotides, polypeptides and their uses
WO1998018931A2 (en) 1996-10-31 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
EP0942984A2 (en) 1996-11-12 1999-09-22 Regents Of The University Of Minnesota C3 BINDING PROTEIN OF $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
EP0957972B1 (en) 1996-12-20 2003-03-19 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal agent flux
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
CA2292838A1 (en) 1997-06-03 1998-12-10 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
US6764686B2 (en) 1997-07-21 2004-07-20 Baxter International Inc. Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
WO1999011241A1 (en) 1997-09-05 1999-03-11 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
KR20010024299A (ko) 1997-09-24 2001-03-26 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 사람 보체 ｃ3 분해단백질분해효소
US5965714A (en) * 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
CN1285753A (zh) 1997-12-02 2001-02-28 鲍德杰克特疫苗公司 透皮给药微粒疫苗组合物
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
NZ530277A (en) 1998-04-07 2005-08-26 Medimmune Inc Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
KR100638503B1 (ko) 1998-04-07 2006-10-26 세인트 쥬드 칠드런즈 리써치 호스피탈 Ｎ-말단 콜린 결합 단백질 ａ 절두물의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 이로부터 유도된 백신 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
CA2328399A1 (en) 1998-04-23 1999-10-28 University Of Alabama At Birmingham Pneumococcal surface protein c(pspc), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
AU7924598A (en) 1998-06-08 1999-12-30 Sca Emballage France Fast flattening packaging
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
DK1091928T3 (da) 1998-06-30 2007-07-23 Om Pharma Nye acylerede pseudodipeptider, fremgangsmåde til disses fremstilling og sammensætninger, som indeholder dem
CZ2001622A3 (cs) 1998-08-19 2002-01-16 North American Vaccine, Inc. Imunogenní konjugát polysacharid-protein s ß-propionamidovým spojením výhodný jako vakcina produkovaná za pouľití N-akryloylovaného polysacharidu
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
BR9914066A (pt) 1998-09-24 2002-04-23 Univ Minnesota Polipeptìdio degradador de c3 de complemento humano de streptococcus pneumoniae
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
US7357936B1 (en) 1998-10-16 2008-04-15 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Adjuvant systems and vaccines
AU1819400A (en) 1998-11-17 2000-06-05 Schlumberger Technology Corporation Transmitting information over a communication link
AU2027400A (en) 1998-11-19 2000-06-05 St. Jude Children's Research Hospital Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
CN100398653C (zh) 1998-12-23 2008-07-02 益得生物医学公司 新颖的链球菌抗原
EP1034792A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Intranasal delivery of pneumococcal polysaccharide vaccines
JP2002541808A (ja) 1999-04-09 2002-12-10 テクラブ， インコーポレイテッド ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア
IL145982A0 (en) 1999-04-19 2002-07-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
DE60045721D1 (de) 1999-06-10 2011-04-21 Medimmune Inc Streptococcus pneumoniae Proteine und Impfstoffe
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20040191834A1 (en) * 1999-10-28 2004-09-30 Laferriere Craig Antony Joseph Novel method
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
FR2806304B1 (fr) * 2000-03-17 2002-05-10 Aventis Pasteur Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
EP1303612A2 (en) 2000-06-20 2003-04-23 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
MY133981A (en) * 2000-06-29 2007-11-30 Smithkline Beecham Biologicals S A Vaccine composition
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
AU2001281001B2 (en) 2000-08-04 2005-11-03 Corixa Corporation New immunoeffector compounds
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU9475001A (en) 2000-09-26 2002-04-08 Hybridon Inc Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
WO2002078673A1 (fr) 2001-03-29 2002-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'un medicament sous forme de granules fins
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
WO2002091998A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
FR2827199B1 (fr) 2001-07-10 2004-07-09 Centre Nat Rech Scient Procede et machine de fabrication ex situ de reseaux de biopuces basse et moyennes integration
GB0123580D0 (en) 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
WO2003054007A2 (en) 2001-12-20 2003-07-03 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
CA2474398A1 (en) 2002-02-04 2003-08-14 Corixa Corporation New immunoeffector compounds
GB0213622D0 (en) * 2002-06-13 2002-07-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine Corporation
AU2003257003A1 (en) 2002-07-30 2004-02-16 Baxter Healthcare S.A. Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
SI1524993T1 (sl) 2002-08-02 2013-07-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Neisserijski vakcinski sestavki, ki obsegajo kombinacijo antigenov
GB0220198D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture
JP3754420B2 (ja) 2003-02-04 2006-03-15 三洋電機株式会社 二次電池用電極板及びその製造方法並びにこの電極板を用いた二次電池
ES2295836T3 (es) 2003-03-13 2008-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Procedimiento de purificacion de citolisina bacteriana.
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
WO2005000347A1 (en) 2003-06-23 2005-01-06 Baxter International Inc. Vaccines against group y neisseria meningitidis and meningococcal combinations thereof
US8048432B2 (en) * 2003-08-06 2011-11-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugate vaccines
GB0323103D0 (en) * 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0408977D0 (en) * 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
EP1740217B1 (en) 2004-04-30 2011-06-15 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Meningococcal conjugate vaccination
AU2005239963B2 (en) 2004-05-11 2011-01-06 De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Vws Neisseria meningitidis IgtB LOS as adjuvant
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
GB0502096D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Purification of streptococcal capsular polysaccharide
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) * 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN103083657B (zh) 2005-06-27 2016-06-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
WO2007026249A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg Multiple vaccination including serogroup c meningococcus
US20090035326A1 (en) 2005-11-01 2009-02-05 Novartis Ag Compositions with antigens adsorbed to calcium phosphate
KR101515078B1 (ko) * 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
GB0607088D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US8852625B2 (en) 2006-04-26 2014-10-07 Micell Technologies, Inc. Coatings containing multiple drugs
ES2552366T3 (es) 2007-06-26 2015-11-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna que comprende conjugados de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae
PL2385981T3 (pl) 2008-12-18 2020-01-31 Wyeth Llc Sposób kontroli masy cząsteczkowej polisacharydów streptococcus pneumoniae z zastosowaniem węgla

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006951A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
US20030147922A1 (en) * 1999-03-19 2003-08-07 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides
WO2003051392A2 (en) * 2001-12-18 2003-06-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine
WO2006110381A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2007068907A2 (en) * 2005-12-13 2007-06-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
RU2743793C1 (ru) * 2014-01-21 2021-02-26 Пфайзер Инк. Капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae и их конъюгаты

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0620193B1 (pt) 2019-12-31
EP1968631B1 (en) 2015-04-08
AU2006327041A1 (en) 2007-06-28
CY1121376T1 (el) 2020-05-29
CN103585623A (zh) 2014-02-19
AU2006327036A1 (en) 2007-06-28
EP3130348A1 (en) 2017-02-15
PT1968631E (pt) 2015-07-20
CA2634885A1 (en) 2007-06-28
KR101365001B1 (ko) 2014-02-21
CR10119A (ru) 2008-07-29
EP1962899A2 (en) 2008-09-03
SI1973564T1 (sl) 2017-02-28
ES2630759T3 (es) 2017-08-23
AU2006327041B2 (en) 2010-08-26
NO343981B1 (no) 2019-08-05
MA30062B1 (fr) 2008-12-01
BRPI0620163B1 (pt) 2019-08-13
CY1116407T1 (el) 2017-02-08
CR10122A (ru) 2008-08-21
CY1118535T1 (el) 2017-07-12
JP5579387B2 (ja) 2014-08-27
EP2402025A3 (en) 2012-03-07
TW201350129A (zh) 2013-12-16
WO2007071710A2 (en) 2007-06-28
HRP20190037T1 (hr) 2019-02-22
HRP20161682T1 (hr) 2017-01-27
WO2007071710A8 (en) 2008-09-04
HK1120230A1 (en) 2009-03-27
EP2384765B1 (en) 2016-11-23
CN110179974A (zh) 2019-08-30
EP2384765A2 (en) 2011-11-09
PE20071305A1 (es) 2007-12-14
IL211664A0 (en) 2011-05-31
NO344187B1 (no) 2019-09-30
SI1968631T1 (sl) 2015-07-31
MA30065B1 (fr) 2008-12-01
DK1968631T3 (da) 2015-06-15
CN101378779A (zh) 2009-03-04
CA2816182C (en) 2018-02-20
CA2808919A1 (en) 2007-06-28
CN101374548A (zh) 2009-02-25
CN101378778A (zh) 2009-03-04
EP2384765A3 (en) 2012-06-20
TW200738258A (en) 2007-10-16
MY147495A (en) 2012-12-14
CA2634885C (en) 2016-04-19
KR20080081061A (ko) 2008-09-05
IL192084A (en) 2013-11-28
EP1968631A2 (en) 2008-09-17
US20180207262A1 (en) 2018-07-26
CA2816182A1 (en) 2007-06-28
PT2384765T (pt) 2017-02-06
NO20082647L (no) 2008-09-18
HRP20161681T1 (hr) 2017-01-13
PL3017827T3 (pl) 2019-04-30
MY150719A (en) 2014-02-28
IL219641A (en) 2017-10-31
LT2384765T (lt) 2017-01-10
NZ569077A (en) 2011-08-26
SG168517A1 (en) 2011-02-28
NZ569168A (en) 2012-02-24
ES2614938T3 (es) 2017-06-02
AU2006327040B2 (en) 2010-08-19
KR20130103831A (ko) 2013-09-24
HUE032903T2 (hu) 2017-11-28
JP5461838B2 (ja) 2014-04-02
PE20071058A1 (es) 2007-11-27
PL1962899T3 (pl) 2011-12-30
WO2007071711A3 (en) 2007-11-08
WO2007071707A2 (en) 2007-06-28
EA014649B1 (ru) 2010-12-30
NO345368B1 (no) 2021-01-04
US9884113B2 (en) 2018-02-06
DK1962899T3 (da) 2011-10-31
PT3017827T (pt) 2019-01-28
CA2808919C (en) 2016-04-19
TR201900418T4 (tr) 2019-02-21
EP3470080A1 (en) 2019-04-17
SI1962899T1 (sl) 2011-11-30
CN110179974B (zh) 2024-01-09
JP2012232985A (ja) 2012-11-29
EP2382986A3 (en) 2012-08-22
US20090010959A1 (en) 2009-01-08
AU2010241281B2 (en) 2012-12-06
EP2382986A2 (en) 2011-11-02
PL1968631T3 (pl) 2015-08-31
LT1973564T (lt) 2016-12-27
MA30066B1 (fr) 2008-12-01
JP5849125B2 (ja) 2016-01-27
IL191913A0 (en) 2009-02-11
LT3017827T (lt) 2019-01-10
US20150265702A1 (en) 2015-09-24
SI3017827T1 (sl) 2019-01-31
JP2012229228A (ja) 2012-11-22
NO20190104A1 (no) 2008-09-18
US20220354941A1 (en) 2022-11-10
PH12014502544A1 (en) 2015-12-14
PT1962899E (pt) 2011-10-19
CA2634887C (en) 2016-01-19
DK2384765T3 (en) 2017-01-09
EP3020411A1 (en) 2016-05-18
PL2384765T3 (pl) 2017-05-31
EP1962899B1 (en) 2011-08-17
TWI487534B (zh) 2015-06-11
ATE520415T1 (de) 2011-09-15
HRP20110685T1 (hr) 2011-10-31
DK1973564T3 (da) 2017-01-16
DK3017827T3 (en) 2019-02-18
KR101367237B1 (ko) 2014-03-14
PL1973564T3 (pl) 2017-04-28
US9107872B2 (en) 2015-08-18
MX354843B (es) 2018-03-22
IL191911A (en) 2015-09-24
EP1973564A2 (en) 2008-10-01
CN101374548B (zh) 2013-05-01
BRPI0620193A2 (pt) 2011-11-01
JP5792920B2 (ja) 2015-10-14
US20190262447A1 (en) 2019-08-29
MY160199A (en) 2017-02-28
EP3017827B1 (en) 2018-11-07
EA200801344A1 (ru) 2008-12-30
HUE041979T2 (hu) 2019-06-28
IL219641A0 (en) 2012-06-28
EA200801367A1 (ru) 2008-12-30
US11400147B2 (en) 2022-08-02
CA2633772C (en) 2015-09-15
MX2008008140A (es) 2008-09-24
AR058592A1 (es) 2008-02-13
JP2009520759A (ja) 2009-05-28
IL192084A0 (en) 2008-12-29
EA014165B1 (ru) 2010-10-29
MY148141A (en) 2013-03-15
US20180250389A9 (en) 2018-09-06
EP3017827A1 (en) 2016-05-11
US20150190521A1 (en) 2015-07-09
TW200738257A (en) 2007-10-16
BRPI0620163A2 (pt) 2011-11-01
UA96934C2 (ru) 2011-12-26
AU2010241281A1 (en) 2010-11-25
AR058707A1 (es) 2008-02-20
BRPI0620460B1 (pt) 2019-08-13
NO346529B1 (no) 2022-09-26
JP2012211165A (ja) 2012-11-01
CN103251940A (zh) 2013-08-21
EA200801374A1 (ru) 2008-12-30
AU2006327040A1 (en) 2007-06-28
EP2402025A2 (en) 2012-01-04
KR101418240B1 (ko) 2014-07-16
JP5749689B2 (ja) 2015-07-15
EP1973564B1 (en) 2016-11-09
US10646564B2 (en) 2020-05-12
US10279033B2 (en) 2019-05-07
AU2006327036B2 (en) 2012-11-15
KR20140036327A (ko) 2014-03-25
US20090017072A1 (en) 2009-01-15
US20100074922A1 (en) 2010-03-25
BRPI0620163B8 (pt) 2021-05-25
JP2009520760A (ja) 2009-05-28
NO20082646L (no) 2008-09-16
CN101378778B (zh) 2013-02-06
NZ569076A (en) 2011-08-26
BRPI0620460A2 (pt) 2011-11-16
IL191913A (en) 2012-07-31
JP5600337B2 (ja) 2014-10-01
JP2009520761A (ja) 2009-05-28
AR058706A1 (es) 2008-02-20
NO20082718L (no) 2008-09-16
IL191911A0 (en) 2008-12-29
TWI415622B (zh) 2013-11-21
UA96583C2 (ru) 2011-11-25
WO2007071707A3 (en) 2007-09-13
BRPI0620460B8 (pt) 2021-05-25
WO2007071711A2 (en) 2007-06-28
NZ596500A (en) 2013-05-31
HUE033081T2 (hu) 2017-11-28
BRPI0620193B8 (pt) 2021-05-25
US20160243219A1 (en) 2016-08-25
TWI465248B (zh) 2014-12-21
JP5615323B2 (ja) 2014-10-29
CA2634887A1 (en) 2007-06-28
ES2707499T3 (es) 2019-04-03
JP2014205673A (ja) 2014-10-30
JO2813B1 (en) 2014-09-15
WO2007071710A3 (en) 2007-11-29
CN103585623B (zh) 2016-09-28
KR20080081060A (ko) 2008-09-05
KR20080081063A (ko) 2008-09-05
KR101515078B1 (ko) 2015-04-24
CY1112677T1 (el) 2016-02-10
CY1118345T1 (el) 2017-06-28
CA2633772A1 (en) 2007-06-28
ES2539795T3 (es) 2015-07-06
CN101378779B (zh) 2015-09-02
CL2013002106A1 (es) 2014-03-07
KR101441368B1 (ko) 2014-09-24
PT1973564T (pt) 2017-01-24
US20090017059A1 (en) 2009-01-15
SI2384765T1 (sl) 2017-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014107B1 (ru) Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
KR101579947B1 (ko) 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신
EA015551B1 (ru) Конъюгатные вакцины

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM