KR20110068831A

KR20110068831A - 리포좀 조성물, 그 제조방법, 및 폐렴 백신으로서의 그 용도

Info

Publication number: KR20110068831A
Application number: KR1020100106035A
Authority: KR
Inventors: 박신정; 한상인; 서국헌; 김양진; 김진남; 최명준
Original assignee: 재단법인 전라남도생물산업진흥재단; 주식회사 정필
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2011-06-22
Also published as: EP2514410A2; WO2011074782A3; EP2514410B1; EP2514410A4; WO2011074782A2

Abstract

본 발명은 폐렴 구균 협막 다당류(Pneumococcal capsular polysaccharide) 항원이 봉입된 리포좀을 포함하는 리포좀 조성물로서, 상기 리포좀을 형성하는 화합물은 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민에서 선택된 인지질; 및 콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트에서 선택된 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하고, 상기 리포좀은 운반체 단백질(carrier protein)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물, 그 조성물을 제조하는 방법, 그 조성물의 폐렴 예방 백신 용도에 관한 것이다.

Description

리포좀 조성물, 그 제조방법, 및 폐렴 백신으로서의 그 용도{A liposomal composition, a process for the preparation thereof, and a use thereof as a pneumococcal vaccine}

본 발명은 폐렴 구균 협막 다당류를 함유하는 폐렴 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폐렴 구균 협막 다당류를 운반체 단백질과 결합시키거나 혼합하지 않고 면역 증강 리포좀에 협막 다당류만을 봉입함으로써 협막 다당류만을 함유하는 폐렴 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

폐렴구균(폐구균)은 정상 소아에서 흔히 발견되는 상재균으로, 아이에게 아무런 증상을 일으키지 않기도 하고, 폐렴, 뇌수막염, 중이염, 부비동염 등을 야기하는 미생물이며, 소아폐렴을 야기시키는 대표적인 균주로 알려져 왔다. 폐렴구균은 약 90 여개의 혈청형(serotype)이 알려져 있으며, 소아폐렴에 많이 발견되는 혈청형으로는 4, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 68이 있으며 이런 7 가지 혈청형 균주가 폐렴구균의 70% 이상과 관련성이 있다. 와이어스(Wyeth) 사에서는 상기 7 개 혈청형 균주에 대한 협막 다당류를 디프테리아 CRM(197) 단백질과 결합시킨 결합 백신(conjugated vaccine) 프리베나-7(Prevenar-7)을 개발하여 시판하고 있다. 글락소스미스클라인(GSK)사는 상기 폐구균 균주에 3 가지 혈청형 균주(1, 5, 및 7F)에 대한 협막 다당류를 추가한 10 가 결합 백신인 신플로릭스(Synflorix)를 개발하여 6주-2세 소아의 침습적 폐렴구군 질환 및 급성 중이염에 대한 예방백신으로 허가되었다. 또한, 최근에 와이어스 사에서는 프리베나-7에 6 가지 혈청형 균주(1, 3, 5, 6A, 7F, 19A)에 대한 협막 다당류를 추가한 결합 백신 프리베나-13을 개발하였다.

상기 와이어스와 GSK에서 개발한 소아용 폐렴구균 백신의 경우 폐렴 구균 협막 다당류와 디프테리아 톡소이드인 CRM(197)과 결합된 형태의 백신 조성물이다. 폐렴 구균 협막 다당류에 디프테리아 톡소이드를 결합시키는 것은 협막 다당류 항원 자체만으로 T 세포를 자극하기 어렵기 때문이며, 특히 소아의 경우 T 세포가 활성화되어 있지 않아 협막 다당류 외에 T 세포를 자극시킬 수 있는 단백질과의 결합이 필요했던 것이다. 최근에는 이와 같이 폐렴 구균 협막 다당류에 운반체 단백질이 결합되어 만들어진 백신이 소아 천식(반응성 기도질환)의 발병 위험을 증가시킨다는 보고가 있었다. 따라서, 이러한 위험성이 감소된 새로운 소아용 폐렴 백신의 개발이 필요하게 되었다.

협막 다당류를 함유한 새로운 백신 개발 전략으로 리포좀 전달시스템이 각광을 받고 있다. 리포좀은 생체 내 구성성분인 인지질로 구성된 구형의 인공막으로서 약물 전달 및 항원의 전달 시스템으로 많이 사용되어 왔다. 펩타이드 및 단백질 항원을 포함하는 리포좀 백신은 많이 연구되어 있지만 (Brgles, M et al. Vaccine 2009, 27, 5435-5442; Jain, V et al. J Drug Target 2008, 16, 706-715; Alving & Rao Vaccine 2008, 26, 3036-3045; Arigita, C et al. Vaccine 2005, 23, 5091-5098; Chang, JS et al. Vaccine 2001, 19, 3608-3614; Chang, JS et al. Vaccine 1999, 17. 1540-1548; VanCott, JL et al. Vaccine 1996, 14, 392-398), 협막 다당류를 함유한 리포좀 백신에 대해서는 많은 연구가 이루어지지 않았다. 최근에는 다당류 항원을 함유한 리포좀에 단백질(alpha-toxin, haemagglutinin)을 함께 봉입하여 다당류의 면역원성을 증가시키는 연구결과가 보고되었다 (Burgeot, C et al, Vaccine 2001, 19, 2092-2099; Pietrobon, P.J.F. et al, Immunomethods 1994, 4, 236-243). 이외에도 Lipoxen 사가 운반체 단백질(Ovalbumin, Tetanus toxoid, Diphteria toxoid, diphtheria CRM197 (a genetic mutant of diphtheria toxin)과 다당류 항원을 결합시키지 않고 리포좀에 동시에 봉입해 다당류 항원의 면역원성을 높인 백신 조성물을 개발하여 특허출원하였다(WO 2007/039584 A1).

그러나, 백신의 제조 시 항원 이외에 운반체 단백질을 추가로 함유시켜 제조하면, 단백질 물질의 특성상 제조비용이 많이 소요되고 제조 시간 또한 오래 걸려 비경제적인 문제점이 있다. 또한, 단백으로 인한 알레르기 반응을 유발할 염려가 발생할 수도 있다.

이에 본 발명자들은 운반체 단백질 없이 협막 다당류 항원만을 함유시켜 충분한 면역원성을 갖는 폐렴 예방용 백신 조성물에 대해 연구한 결과, 협막 다당류의 면역원성을 높이는 리포좀 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 운반체 단백질을 포함하지 않고 폐렴 구균 협막 다당류 항원만을 포함하면서도 폐렴 예방에 충분한 효과를 갖는 리포좀 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리포좀 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포좀 조성물의 폐렴 예방용 백신 조성물을 제조하기 위한 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

폐렴 구균 협막 다당류(Pneumococcal capsular polysaccharide) 항원이 봉입된 리포좀을 포함하는 리포좀 조성물로서, 상기 리포좀을 형성하는 화합물은

포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민에서 선택된 인지질; 및

콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트에서 선택된 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하고,

상기 리포좀은 운반체 단백질(carrier protein)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물을 제공한다.

상기 본 발명에 따른 리포좀 조성물은

공 리포좀(empty liposome) 용액을 폐렴 구균 협막 다당류 항원과 혼합하여 리포좀 및 항원의 혼합 용액을 형성시키는 단계;

상기 혼합용액을 액체질소로 냉동시킨 다음 실온에서 녹이는 과정을 반복하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 폐렴 구균 협막 다당류(Pneumococcal capsular polysaccharide) 항원이 봉입된 리포좀을 포함하는 폐렴 예방용 백신 조성물로서, 상기 리포좀을 형성하는 화합물은

상기 리포좀은 운반체 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 폐렴 예방용 백신 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다.

본 발명자들은 운반체 단백질을 포함하지 않고 폐렴 구균 협막 다당류 항원만을 포함하면서도 폐렴 구균 협막 다당류 항원이 폐렴 예방에 충분한 면역원성을 갖는 백신 조성물을 개발하기 위해 연구한 결과, 특정 조성의 면역 증강 리포좀에 폐렴 구균 협막 다당류 항원을 봉입시키면 운반체 단백질을 폐렴 구균 협막 다당류 항원에 결합시키거나 함께 함유시키지 않아도 폐렴 예방에 충분한 면역원성을 얻게 되어, 운반체 단백질 없이 폐렴 구균 협막 다당류 항원만으로도 폐렴 예방용 백신을 제조할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 뿐만 아니라, 특정 조성의 면역 증강 리포좀에 폐렴 구균 협막 다당류 항원을 봉입시키면 운반체 단백질을 폐렴 구균 협막 다당류 항원에 결합시키거나 함께 함유시키는 경우에 비해 오히려 폐렴 구균 협막 다당류의 면역원성이 증가한다는 예측할 수 없었던 놀라운 효과를 발견하였다. 상기 특정 조성의 면역 증강 리포좀은 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민에서 선택된 인지질; 및 콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트에서 선택된 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함한다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서,

폐렴 구균 협막 다당류(Pneumococcal capsular polysaccharide) 항원이 리포좀 내에 봉입된 리포좀을 포함하는 리포좀 조성물로서, 상기 리포좀을 형성하는 화합물은

상기 리포좀은 운반체 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 일 측면에 따른 리포좀은 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 뮤라밀디펩티드(MDP), 폴록사머(PX)에서 선택된 하나 이상의 아주반트를 더 포함할 수 있다.

상기 리포좀은 표면전하를 음이온, 양이온, 또는 중성을 나타낼 수 있다. 상기 리포좀이 음이온 리포좀인 경우, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 및 모노포스포릴 리피드A(MPL)를 포함할 수 있으며, 각각을 6 ~ 8: 2 ~ 4 : 0.02 ~ 0.2 중량부로 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 음이온성 리포좀은 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 및 모노포스포릴 리피드A(MPL)를 약 7 : 3 : 0.035의 중량부로 포함할 수 있다.

상기 리포좀이 양이온 리포좀인 경우, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 스테아릴아민 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)을 포함할 수 있으며, 각각을 5 ~ 7: 2 ~ 4 : 0.5 ~ 2 : 0.02 ~ 0.2 중량부로 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 양이온성 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 스테아릴아민 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)를 6 : 3 : 1 : 0.03 중량부로 포함할 수 있다.

상기 리포좀이 중성 리포좀인 경우, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)를 포함할 수 있으며, 각각을 5 ~ 7: 2 ~ 4 : 0.02 ~ 0.2 중량부로 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 양이온성 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)를 6 : 3 : 0.03 중량부로 포함할 수 있다.

상기 리포좀은 폐렴 구균 협막 다당류의 인지질에 대한 비율이 1: 50~250의 중량비가 되도록 하여 제조될 수 있다. 상기 리포좀은 평균 직경의 크기가 50 ~ 2000 nm일 수 있으며, 바람직하게는 50 ~1000 nm, 보다 바람직하게는 60 ~ 700 nm, 더욱 바람직하게는 80 ~ 500 nm, 더욱 더 바람직하게는 100 ~ 300 nm일 수 있다. 평균 직경의 크기는 WO 99/65465에 개시되어 있는 바와 같이, PCS(photon correlation spectroscopy)에 의해 측정할 수 있다.

상기 리포좀 조성물은 리포좀이 수성 매질 연속상에 분산되어 있는 분산액의 형태일 수 있다. 또는, 상기 리포좀 조성물은 예를 들어 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 분말의 형태로 존재하여, 필요할 때 물 또는 수성 액체에 희석하여 수성 분산액을 형성할 수 있는 전구체로서 존재할 수도 있다.

본 발명은 다른 일 측면에 있어서,

상기 혼합용액을 액체질소로 냉동시킨 다음 실온에서 녹이는 과정을 반복하는 단계를 포함하는,

상기 본 발명에 따른 리포좀 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 공 리포좀은 바람직하게는 소형 내지 중형 크기일 수 있으며, 단층구(unilamella vesicle) 리포좀(SUV) 또는 다층구(multilamella vesicle) 리포좀(MLV)일 수 있다. 상기 다층구 리포좀 및 단층구 리포좀은 상기 특정 조성의 리포좀 구성성분을 이용하여 당해 기술분야에 공지된 리포좀 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어 유기 용매(예: 클로로포름)에 용해한 다음 질소가스를 이용해 유기 용매를 제거하여 지질이 용기의 유리벽에 얇은 필름막을 형성되도록 한 다음 인산 완충용액을 첨가해 강하게 교반함으로써 제조할 수 있다. 그리하여 형성된 다층구 리포좀을 팁 타입 소니케이터(tip type sonicator)를 이용하여 초음파 처리하면 단층구 리포좀이 형성될 수 있다. 그리하여 형성된 공 리포좀을 소정 크기, 바람직하게는 약 0.2~2 ㎛의 멤브레인 필터를 통해 통과시켜 크기를 균일하게 한 다음, 폐렴 구균 협막 다당류 항원과 혼합하여 리포좀 및 항원의 혼합 용액을 형성시키고, 그 혼합용액을 액체질소로 냉동시킨 다음 실온에서 녹이는 과정을 반복함으로서 폐렴 구균의 협막 다당류 항원이 리포좀 내에 봉입된 리포좀을 형성시킬 수 있다.

상기 본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 리포좀을 제조하기 위해서는 상기 방법(freezing-thawing)에 한정되는 것은 아니며, 압출법(extrusion method) 또는 탈수-재수화법(dehydration-rehydration method)을 이용할 수도 있다.

압출법에 따르면 리포좀을 다음과 같이 제조할 수 있다. 상기 방법(Freezing-thawing)법에서 만든 다층구 리포좀의 제조방법과 같은 방법으로 다층구 리포좀을 제조한 후에 다양한 멤브렌인 필터를 장착한 압출기(extruder)에 리포좀 용액을 넣은 후 질소가스로 고압을 작용시켜 리포좀 용액을 통과시켜 적절한 크기의 리포좀을 얻을 수 있다. 이 방법에서는 먼저 3.0 um의 멤브레인 필터를 사용하고 난 다음, 1.0, 0.4, 0.2 um의 멤브레인 필터를 차례로 통과시켜 최종의 리포좀을 얻을 수 있다. 0.1 um 멤브레인 필터를 통과시킨 리포좀을 다시 freezing-thawing과 같은 방법으로 제조할 수도 있다.

탈수-재수화법에 따르면 리포좀을 다음과 같이 제조할 수 있다. Freezing-thawing 법에서 제조한 다층구 리포좀과 이를 초음파 처리(sonication)하여 단층구 리포좀을 만든 후에 협막 다당체와 트레할로오스(trehalose)를 단층구 리포좀과 혼합하여 동결건조시킨다. 동결건조한 리포좀 상태로 보관할 수 있으며, 실험에 사용할 경우에는 증류수를 첨가하여 다시 수화시켜서 사용한다.

폐렴 구균의 협막 다당류 항원이 리포좀 내에 봉입된 다음에는, 바람직하게는 생성된 리포좀 조성물에서 봉입되지 않은 약물 및 너무 큰 크기의 리포좀을 제거하거나 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 평균 리포좀의 크기를 감소시킬 수 있다.

그리하여 형성된 폐렴 구균 협막 다당류 항원이 봉입된 리포좀은 평균 직경의 크기가 50 ~ 2000 nm일 수 있으며, 바람직하게는 50 ~1000 nm, 보다 바람직하게는 60 ~ 700 nm, 더욱 바람직하게는 80 ~ 500 nm, 더욱 더 바람직하게는 100 ~ 300 nm일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 2000 nm 보다 크거나 20 nm 보다 작은 직경의 항원 봉입 리포좀을 거의 함유하지 않도록 해야 한다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 리포좀 조성물을 폐렴 구균 협막 다당류에 대해 면역 반응을 유발하기 위해 포유류에게 투여하기 위한 폐렴 예방용 백신의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

따라서, 본 발명의 다른 일 측면은 폐렴 구균 협막 다당류(Pneumococcal capsular polysaccharide) 항원이 봉입된 리포좀을 포함하는 폐렴 예방용 백신 조성물로서, 상기 리포좀을 형성하는 화합물은

상기 본 발명의 일 측면에 따른 폐렴 예방용 백신 조성물은 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 뮤라밀디펩티드(MDP), 폴록사머(PX)에서 선택된 하나 이상의 아주반트를 더 포함할 수 있다.

상기 폐렴 예방용 백신 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 폐렴 예방용 백신 조성물은 피하 주사, 복강 주사, 근육 주사, 비강내 투여, 흡입투여, 또는 경구 투여용일 수 있으며, 이러한 투여방법에 따른 제형에 따라 폐렴 예방용 백신 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제는 당해 기술분야에 공지되어 있다.

바람직하게는 상기 면역반응은 협막 다당류 항원에 대한 IgG 반응의 생성을 포함하며, 추가적으로 폐렴 구균의 감염에 대한 차단 효과가 접종 대상으로부터 얻어지도록 IgM 및 IgA 반응을 포함한다.

본 발명에 따른 폐렴 구균 협막 다당류 항원이 봉입된 리포좀을 포함하는 폐렴 예방용 백신 조성물은 종래의 운반체 단백질의 폐렴 구균 협막 다당류 항원과의 결합체, 그 결합체가 봉입된 리포좀, 및 운반체 단백질이 폐렴 구균 협막 다당류 항원과 함께 봉입된 리포좀과 비교하여 항체 생성능을 측정한 결과(실험예 2 참조), 운반체 단백질을 포함하지 않는 본 발명에 따른 폐렴 예방용 백신 조성물이 운반체 단백질을 포함하는 경우에 비해 더 높은 항체 생성능을 나타내었으며, 이는 운반체 단백질의 항원보조제로서의 역할을 고려하면 당업자가 예측할 수 없는 정도의 현저한 효과라고 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 폐렴 예방 백신으로서 사용할 수 있을 정도로 충분한 항체 생성능을 갖는다고 할 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 특정 조성의 면역 증강 리포좀에 폐렴 구균 협막 다당류을 봉입시킴으로써, 운반체 단백질 없이 폐렴 구균 협막 다당류 만으로도 폐렴 예방을 위한 백신 조성물을 제조할 수 있다. 따라서, 백신의 제조 시 운반체 단백질을 필요로 하지 않게 되었으므로, 백신 제조 비용 및 제조 시간이 상대적으로 적게 소요되어 종래의 폐렴 구균 백신 제조에 비해 상대적으로 경제적이라고 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 운반체 단백을 포함하지 않으므로 단백으로 인한 알레르기 반응을 나타내는 환자에게도 안심하고 접종할 수 있어 유리하다.

도 1은 혈청형 14번 폐렴 구균 유래의 협막 다당류 및 그 협막 다당류와 테타누스 톡소이드의 결합체를 마우스에 2 주 간격으로 3 회 면역한 후 접종일로부터 42 일째에 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 혈청형 14 협막 다당류(PS14), 협막다당류-테타누스 톡소이드 결합체 항원(PS14-TT), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드의 혼합물이 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14+TT), 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 음이온성 리포좀(L(-)-PS)를 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종후 42일째에 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 협막 다당류가 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F)(실시예 4), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F+TT)(비교예 3), 협막 다당류가 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F)(실시예 5), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F+TT)(비교예 4), 협막 다당류가 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F)(실시예 6), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F+TT)(비교예 5)을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 42 일째에 항원 PS14에 대한 IgG의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 협막 다당류가 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F)(실시예 4), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F+TT)(비교예 3), 협막 다당류가 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F)(실시예 5), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F+TT)(비교예 4), 협막 다당류가 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F)(실시예 6), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F+TT)(비교예 5)을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 42 일째에 항원 PS23F에 대한 IgG 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 리포좀을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 14, 21, 28, 및 42 일째에 IgG1의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 리포좀을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 14, 21, 및 28일째에 IgM의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 리포좀 및 프리베나-7을 각각 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 3 주 뒤에, Streptococcus pneumoniae serotype 14를 투여한 다음 시간의 경과에 따라 각 투여군에서 생존한 마우스의 숫자를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 ~ 6: 면역 증강용 리포좀의 제조(1)

1) 협막 다당류 항원의 제조

혈청형 14번 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae (Klein) Chester ATCC 6314)을 2 리터 발효기를 이용하여 배양한 후 알코올 침전법을 이용하여 협막 다당류를 분리하였다. 분리된 협막 다당류는 페놀-황산을 이용한 발색법을 사용하여 정량하였으며, 로우리 방법을 사용하여 단백질 함유량을 확인하였다. 단백질 함량 확인 및 협막 다당류의 정량이 끝난 샘플을 PS14 협막 다당류 항원으로 사용하였다.

또한, 혈청형 23F 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae (Klein) Chester ATCC)에 대해서도 상기 PS14 협막 다당류 항원을 제조한 방법과 동일한 방식으로 하여 PS23F 협막 다당류 항원으로 사용하였다.

2) 리포좀 조성물의 제조

리포좀 표면 전하를 달리하는 PS14가 봉입된 음이온성 리포좀(negative charged liposomes)(실시예 1), 양이온성 리포좀(positive charged liposomes)(실시예 2), 및 중성 리포좀(neutral charged liposomes)(실시예 3)을 제조하였다.

음이온성 리포좀을 제조하기 위해서는 포스파티딜 에탄올아민(PE)(70 mg)/콜레스테롤 헤미숙시네이트(CHOH)(30 mg)를 사용하였으며, 양이온성 리포좀을 제조하기 위해서는 포스파티딜콜린(PC)(60 mg)/콜레스테롤(CHOL)(30 mg)/스테아릴아민(SA)(1 mg)을 사용하였으며, 중성 리포좀을 제조하기 위해서는 PC(60 mg)/ CHOL(30 mg)을 사용하였다. 또한, 각각의 리포좀을 제조하기 위해 아주반트로서 MPL(monophosphoryl lipid A)을 소량 사용하였다. 각각의 리포좀 제조에 이용된 구성성분 및 중량비를 하기 표 1에 요약하였다.

[표 1]

각각의 리포좀을 제조하기 위해, 각각 상기 조성의 성분들을 클로로포름에 용해시킨 후 질소가스를 이용해 유기용매를 완전히 제거하였다. 질소가스로 유기용매를 제거할 때에 인지질이 유리기벽에 얇게 잘 퍼지도록 하였다. 인지질이 유리기벽에 얇은 필름을 형성한 후에 인산완충용액 10 mL를 첨가해 강하게 교반시켜 주었다. 인지질 필름이 유리 기벽에서 완전히 떨어진 후 인산완충용액에 균일하게 분산된 상태로 만들었다. 이 때 생성된 용액을 다층구 리포좀(multilamellar vesicles, MLV)이라고 부르며, 만들어진 MLV의 입자 크기를 조절하기 위해 팁 타입 소니케이터(tip type sonicatior)(VC505, SONICS)를 이용해 초음파 처리하였다. 초음파 처리에 의해서 제조된 리포좀을 단층구 리포좀(small unilamellar vesicle, SUV)라 부르며, SUV 용액을 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 통과시켰다. 그런 다음, 얻어진 리포좀 용액을 상기 제조된 협막 다당류 항원(PS14)과 200:1 중량비로 혼합하여 상온에서 약하게 교반시켜주었다. 항원과 혼합된 리포좀 용액을 액체질소로 약 -178℃에서 얼리고, 상온에서 녹이는 과정을 3 회 반복하여 PS14가 봉입된 음이온성 리포좀(실시예 1, L(-)-MPL-PS14), 양이온성 리포좀(실시예 2, L(+)-MPL-PS14), 및 중성 리포좀(실시예 3, L-MPL-PS14)을 각각 제조하였다.

또한, 상기 멤브레인 필터를 통과시켜 얻어진 리포좀 용액을 상기 제조된 협막 다당류 항원(PS14) 및 PS23F 항원과 200:1:1 중량비로 혼합하여 상온에서 약하게 교반시켜주었다. 항원과 혼합된 리포좀 용액을 액체질소로 약 -178℃에서 얼리고, 상온에서 녹이는 과정을 3 회 반복하여 PS14 및 PS23F 모두가 봉입된 음이온성 리포좀(실시예 4, L(-)-MPL-PS14,23F), 양이온성 리포좀(실시예 5, L(+)-MPL-PS14,23F), 및 중성 리포좀(실시예 6, L-MPL-PS14,23F)을 각각 제조하였다.

실시예 7 ~ 8: 면역 증강용 리포좀의 제조(2)

상기 실시예 5(L(+)-MPL-PS14,23F)에서, 리포좀의 제조시 MPL(monophosphoryl lipid A) 대신 MDP(muramyl dipeptide)(실시예 7, L(+)-MDP-PS14,23F) 또는 PX(실시예 8, L(+)-PX-PS14,23F)를 사용하는 것만을 제외하고 동일한 방법으로, PS14 및 PS23F 모두가 봉입된 양이온성 리포좀을 제조하였다.

실시예 9: 면역 증강용 리포좀의 제조(3)

상기 실시예 5에서, 리포좀의 제조시 MPL(monophosphoryl lipid A)과 같은 아주반트를 사용하지 않는 것만을 제외하고 동일한 방법으로, PS14 및 PS23F 모두가 봉입된 양이온성 리포좀을 제조하였다(실시예 9, L(+)-O-PS14,23F).

비교예 1~2: 음이온성 리포좀에 항원 PS14-테타누스 톡소이드의 결합체 또는 혼합물을 봉입한 리포좀 조성물의 제조

상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방식으로, 음이온성 리포좀에 항원-테타누스 톡소이드의 결합체(비교예 1, L(-)-PS14-TT) 또는 혼합물(비교예 2, L(-)-PS14+TT)을 봉입시킨 리포좀 조성물을 제조하였다. 항원과 항원테타누스 톡소이드의 혼합 비율은 1:2로 하였다. 협막 다당류와 테타누스 톡소이드의 결합체(PS14-TT)는 Random CNBr activation Method에 따라 제조한 것을 사용하였다.

비교예 3: 음이온성 리포좀에 항원 PS14, 항원 PS23F 및 테타누스 톡소이드의 혼합물을 봉입한 리포좀 조성물의 제조

상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일한 방식으로, 음이온성 리포좀에 항원 PS14, 항원 PS23F 및 테타누스 톡소이드의 혼합물을 봉입시킨 리포좀 조성물(L(-)-PS14,PS23F+TT)을 제조하였다. 항원과 항원테타누스 톡소이드의 혼합 비율은 1:2로 하였다.

비교예 4: 양이온성 리포좀에 항원 PS14, 항원 PS23F 및 테타누스 톡소이드의 혼합물을 봉입한 리포좀 조성물의 제조

상기 실시예 5에 기재된 방법과 동일한 방식으로, 양이온성 리포좀에 항원 PS14, 항원 PS23F 및 테타누스 톡소이드의 혼합물을 봉입시킨 리포좀 조성물(L(+)-PS14,PS23F+TT)을 제조하였다.

비교예 5: 중성 리포좀에 항원 PS14, 항원 PS23F 및 테타누스 톡소이드의 혼합물을 봉입한 리포좀 조성물의 제조

상기 실시예 6에 기재된 방법과 동일한 방식으로, 음이온성 리포좀에 항원 PS14, 항원 PS23F 및 테타누스 톡소이드의 혼합물을 봉입시킨 리포좀 조성물(L-PS14,PS23F+TT)을 제조하였다.

실험예

실험 방법

1) 양성대조군 투여방법

1 차 접종은 FCA(Freund's Complete Adjuvant)(Sigma)를 이용하였으며, 2 차 접종과 3 차 접종은 FIA(Freund's Incomplete Adjuvant)(Sigma)를 이용하였다. 항원과 아주반트를 1:1의 비율로 잘 혼합한 후 사용하였다.

2) 면역스케쥴

BALB/C 12주령 암컷 마우스를 구입하여 면역에 사용하였다. 항원(협막 다당류 PS14)을 피하주사로 5 ug 접종하였으며, 접종 일정은 2주 간격으로 하여 3번 접종하였다. 그리고 마지막 접종 후 2주가 되는 날 마우스를 희생시켜 전혈을 취하였다.

3) 항체가 측정

접종을 시작한 날로부터 14 일과 28 일에 마우스 미정맥에서 채혈을 하고 4℃, 12000 rpm 에서 5 분간 원심분리를 하여 혈청을 얻었다.

첫 접종 후 42 일(마지막 3회째 접종 후 2주 후)에 에테르를 이용하여 마우스를 마취하고, 개복하여 심장에서 채혈하였다. 4℃, 12000 rpm에서 5 분간 원심분리를 하여 혈청을 얻었다.

ELISA 방법을 이용하여 각각의 혈청으로부터 항체가(IgG, IgG1, IgG2a, IgA 및 IgM)를 측정하였으며, 마우스 혈청은 PBS-T(Phosphate Buffered Saline with 0.05% Tween 20)으로 1:100으로 희석하여 ELISA에 이용하였다. ELISA 실시 후 파장 450 nm에서 결과를 확인하고, 흡광도 결과치(OD)를 비교하여 그룹간의 항체가를 비교 확인하였다.

실험예 1: 항원의 종류에 따른 항체 형성

상기 실시예에서 얻어진 혈청형 14번 폐렴 구균 유래의 협막 다당류(PS14) 및 그 협막 다당류와 테타누스 톡소이드의 결합체(PS14-TT)의 항체 생성능을 평가하였다. 1 차 접종은 FCA 아주반트와 항원을 혼합(1:1 v/v)하였고, 2차와 3차 접종은 FIA 아주반트와 항원을 혼합(1:1 v/v)하여 마우스에 3 회 면역하였으며, 첫 접종 후 42 일째에 항체가를 측정하였다. 협막 다당류와 테타누스 톡소이드의 결합체(PS14-TT)는 Random CNBr activation Method에 따라 제조한 것을 사용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 혈청형 14번 폐렴 구균 유래의 협막 다당류 및 그 협막 다당류와 테타누스 톡소이드의 결합체를 2 주 간격으로 3 회 접종한 마우스에서 첫 접종 후 42 일(마지막 3회째 접종 후 2주 후)째의 IgG 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 1의 결과에 따르면, 항원의 종류에 따라 다당류에 대한 항체가에 차이가 나지 않았으며, 면역 전후의 항체생성이 크게 향상되지 않았다.

실험예 2: 리포좀에 따른 항체가 비교 실험

상기 실시예 1에서 제조한 혈청형 14 협막 다당류(PS14) 및 상기 실험예 1에서 제조한 협막다당류-테타누스 톡소이드 결합체(PS14-TT)를 랫트에게 상기 양성 대조군 투여방법에 따라 투여하였다. 상기 비교예 1에서 제조된 협막다당류 및 테타누스 톡소이드의 결합체가 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14-TT), 상기 비교예 2에서 제조된 협막다당류 및 테타누스 톡소이드의 혼합물이 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14+TT), 상기 실시에 1에서 제조된 음이온성 리포좀(L(-)-PS14)에 대해 랫트에 2 주 간격으로 3 회 접종하여, 첫 접종 후 42 일(마지막 3회째 접종 후 2주 후)째에 혈청 중의 항체가를 측정하였으며 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

별도로, 상기 실시예 1에서 제조한 혈청형 14 협막 다당류(PS14) 및 상기 실험예 1에서 제조한 협막다당류-테타누스 톡소이드 결합체(PS14-TT)를 마우스에게 상기 양성 대조군 투여방법에 따라 투여하였다. 상기 비교예 2에서 제조된 협막다당류 및 테타누스 톡소이드의 혼합물이 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14+TT), 상기 실시에 1에서 제조된 음이온성 리포좀(L(-)-PS14)에 대해 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종하여, 첫 접종 후 42 일(마지막 3회째 접종 후 2주 후)째에 혈청 중의 항체가를 측정하였으며 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

도 2는 혈청형 14 협막 다당류(PS14), 협막다당류-테타누스 톡소이드 결합체(PS14-TT), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드의 혼합물이 봉입된 리포좀(L(-)-PS14+TT), 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 음이온성 리포좀(L(-)-PS14)를 랫트에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 42 일째에 혈청 중의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

상기 표 2 및 도 2의 결과에 따르면, 두 종류의 항원을 FCA/FIA와 혼합한 백신(PS14, PS14-TT 결합체)과 두 종류의 항원을 리포좀에 봉입한 백신(L(-)-PS14, L(-)-PS14-TT) L(-)-PS14+TT)와의 항체 생성능을 비교한 결과, FCA/FIA를 함유한 백신에 비해 리포좀에 봉입시킨 백신이 현저히 높은 항체가를 나타내었다. 또한, 항원 PS14가 단독으로 함유되어 있느냐 테타누스 톡소이드와 결합되어 있는냐에 따라 항체가가 달리 나왔다. 특히, 항원이 리포좀에 봉입될 경우 항원이 테타누스 톡소이드가 결합되거나(L-PS14-TT) 혼입된 백신(L(-)-PS14+TT)에 비해 협막 다당류 항원만이 봉입된 백신(L(-)-PS14)이 더 높은 항체가를 보였으며, 이는 일반적으로 운반체 단백질이 사용될 경우 면역원성이 증가하는 종래 지식에 비추어볼 때, 당업자가 예측할 수 없는 정도의 효과라고 할 수 있다. 이러한 결과로부터 본 발명에서 따른 리포좀 조성물은 효과적인 폐렴 백신으로서 사용하기 위해 운반체 단백질과의 결합 또는 운반체 단백질과의 공동 봉입을 필요로 하지 않다는 것을 알 수 있다.

실험예 3: 리포좀 표면전하에 따른 항체생성능 비교

리포좀 조성, 특히 표면전하에 따른 협막 다당류의 항체 생성능을 비교하기 위해 실시예 4-6에서 제조한 항원 PS14 및 항원 PS23F가 봉입된 음이온성, 양이온성, 및 중성 리포좀, 그리고 상기 비교예 3-5에 제조된 항원 PS14. 항원 PS23F, 및 테타누스 톡소이드와의 혼합물이 봉입된 리포좀을 접종하여 항체 생성능을 비교하였다.

모두 다 항원의 양과 면역스케쥴은 동일하게 적용시켰다. 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 42 일째에 항체가를 1: 100으로 희석하여 측정하였다. 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다.

도 3a는 협막 다당류가 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F)(실시예 4), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F+TT)(비교예 3), 협막 다당류가 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F)(실시예 5), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F+TT)(비교예 4), 협막 다당류가 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F)(실시예 6), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F+TT)(비교예 5)을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 42 일째에 항원 PS14에 대한 IgG의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3b는 협막 다당류가 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F)(실시예 4), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 음이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(-)-PS14,23F+TT)(비교예 3), 협막 다당류가 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F)(실시예 5), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 양이온성 리포좀에 봉입된 항원(L(+)-PS14,23F+TT)(비교예 4), 협막 다당류가 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F)(실시예 6), 협막다당류 및 테타누스 톡소이드 혼합물이 중성 리포좀에 봉입된 항원(L-PS14,23F+TT)(비교예 5)을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 42 일째에 항원 PS23F에 대한 IgG 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3a의 결과에 따르면, 리포좀 표면전하에 따른 다당류의 항체 생성능을 비교한 결과 양이온성 리포좀이 항체 생성능이 가장 높은 것으로 나타났으며, 음이온성 리포좀이 항체 생성능이 가장 낮은 것으로 나타났다.

또한, 도 3b에 따르면 혈청형 23F 협막 다당류에 대한 실험에서도 혈청형 14 협막 다당류에 대한 실험과 동일한 패턴의 결과를 나타내었다.

별도로, 리포좀 조성, 특히 표면전하에 따른 협막 다당류의 항체 생성능을 isotype 별로 측정하기 위해 제조한 항원 PS14 및 PS23F가 봉입된 양이온성 리포좀(실시예 5), 항원 PS14, 항원 PS23F, 및 테타누스 톡소이드의 혼합물이 봉입된 양이온성 리포좀(비교예 4), PS14가 봉입된 음이온성 리포좀(실시예 1), 및 항원-테타누스 톡소이드의 혼합물이 봉입된 음이온성 리포좀(비교예 2, L(-)-PS14+TT)을 별도의 마우스에 접종하여 항체 생성능을 비교하였다.

양성 대조군으로는 PS14, PS14-TT 결합체, PS23F, 또는 PS23F-TT 결합체를 FCA/FIA를 사용하여 접종하였으며, 상기 양성 대조군 투여방법에 따랐다.

모두 다 항원의 양과 면역스케쥴은 동일하게 적용시켰다. 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 14일, 21일, 28, 및 42 일째에 항체가를 1: 100으로 희석하여 측정하였으며, 아이소타입(isotype) 별로 측정하였다. 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.

도 4a는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 리포좀을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 14, 21, 28, 및 42 일째에 IgG1의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4b는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 리포좀을 마우스에 2 주 간격으로 3 회 접종한 후 첫 접종 후 14, 21, 및 28일째에 IgM의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

상기 결과로부터, 협막 다당류의 종류와는 상관없이 양이온성 리포좀이 다당류의 면역원성을 높이는 결과를 나타내었고, 운반체 단백질이 함유되어 있지 않은 상태에서 더 높은 항체 생성을 보였다. 따라서, 운반체 단백질이 함께 봉입되지 않고 협막 다당류만을 봉입시킨 본 발명에 따른 리포좀 조성물이 폐렴 백신으로 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 4: 아주반트 종류에 따른 항체 생성능 비교

리포좀 조성, 특히 아주반트의 종류에 따른 협막 다당류의 항체 생성능을 비교하기 위해 아주반트의 종류를 달리하여 제조한 실시예 5, 7-9에서 제조한 양이온성 리포좀을 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 접종하여 항체 생성능을 비교하였다.

첫 접종 후 42 일째에 항원 PS14에 대한 총IgG, IgG1, 및 IgG2의 항체가를 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었으며, 항원 PS23F에 대한 총IgG, IgG1, 및 IgG2의 항체가를 측정한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

[표 3]

[표 4]

상기 표 3 및 4의 결과에 따르면, 본 발명에 따른 리포좀 조성물은 아주반트의 종류에 따라 항체생성에 있어서 큰 차이를 보이지 않았고, 아주

반트 없이 제조된 리포좀(L(+)-O-PS14,23F)도 대조군(FCA/FIA)에 비해 높은 항체생성을 보였으며, 아쥬반트를 함유한 리포좀과 유사한 항체생성 정도를 나타내었다. 따라서 본 발명에서는 아주반트를 사용하면 좀 더 좋은 결과를 보일 수 있지만, 아주반트를 함유하지 않는 리포좀도 백신으로서 사용 가능한 것으로 확인되었다.

실험예 5: 챌린지 실험

본 발명이 일 실시예에 따른 면역 증강 리포좀을 시판되고 있는 폐렴 구균 백신인 프리베나-7(Wyeth)와 면역증강효과를 비교하기 위하여, 마우스를 대상으로 챌린지 실험(challenge test)을 수행하였다.

BALB/C 마우스 12주령 암컷 마우스를 구입하여 각 투여군당 6 마리를 배정하였다. 각 투여군에 사용된 접종항원은 음의 대조군(미투여), 양의 대조군(프리베나-7), 상기 실시예 2에서 제조된 L(+)-MPL-PS14, 상기 실시예 5에서 제조된 L(+)-MPL-PS14,23F으로 하였다. 항원 접종량은 L(+)-MPL-PS14의 경우 PS 5 ㎍/1가(serotype 14), L(+)-PS14,23FMPL의 경우 PS 5 ㎍/serotype 14, PS 5 ㎍/serotype 23F, 프리베나의 경우 0.4 ㎍/serotype 14, 총 3.2 ㎍/7가로 하였다.

3차 접종한지 3주 뒤에 challenge 실험을 실시하였다.

Streptococcus pneumoniae serotype 14(Streptococcus pneumoniae (Klein) Chester ATCC 6314)를 배양한 다음, 0.64 x 10⁸ CFU으로 마우스에게 복강주사로 1회 접종하였다. 접종한 후 매일 마우스의 생존 여부를 확인하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 따르면, 음의 대조군은 2 일 후에 마우스가 6 마리중 1 마리만이 생존하여 거의 다 사망하였다. 면역 증강 리포좀을 접종한 그룹(L(+)-MPL-PS14 투여군 및 L(+)-MPL-PS14,23F 투여군)에서는 항원의 양에 따라 생존률에 차이를 보이고 있지만 프리베나-7을 투여한 양의 대조군에서 보다 현저히 더 높은 생존율을 나타내었다. 따라서 기존에 시판되고 있는 7가 백신보다 본 발명에 따른 리포좀 백신이 더 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

Claims

폐렴 구균 협막 다당류(Pneumococcal capsular polysaccharide) 항원이 봉입된 리포좀을 포함하는 리포좀 조성물로서, 상기 리포좀을 형성하는 화합물은
포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민에서 선택된 인지질; 및
콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트에서 선택된 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하고,
상기 리포좀은 운반체 단백질(carrier protein)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 리포좀은 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 뮤라밀디펩티드(MDP), 폴록사머(PX)에서 선택된 하나 이상의 아주반트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 리포좀은 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)가 6 ~ 8: 2 ~ 4 : 0.02 ~ 0.2 중량부로 형성된 음이온성 리포좀인 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 스테아릴아민 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)가 5 ~ 7: 2 ~ 4 : 0.5 ~ 2 : 0.02 ~ 0.2 중량부로 형성된 양이온성 리포좀인 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)가 5 ~ 7: 2 ~ 4 : 0.02 ~ 0.2 중량부로 형성된 중성 리포좀인 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 협막 다당류의 인지질에 대한 비율은 1: 50~250의 비율이 함유되는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 리포좀은 수성 매질 중에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 분말형태인 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 리포좀은 50-2000 nm의 평균직경을 갖는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
공 리포좀(empty liposome) 용액을 폐렴 구균 협막 다당류 항원과 혼합하여 리포좀 및 항원의 혼합 용액을 형성시키는 단계;
상기 혼합용액을 액체질소로 냉동시킨 다음 실온에서 녹이는 과정을 반복하는 단계를 포함하는,
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 리포좀 조성물을 제조하는 방법.
폐렴 구균 협막 다당류(Pneumococcal capsular polysaccharide) 항원이 봉입된 리포좀을 포함하는 폐렴 예방용 백신 조성물로서, 상기 리포좀을 형성하는 화합물은
포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민에서 선택된 인지질; 및
콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트에서 선택된 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하고,
상기 리포좀은 운반체 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 폐렴 예방용 백신 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 리포좀은 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 뮤라밀디펩티드(MDP), 폴록사머(PX)에서 선택된 하나 이상의 아주반트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폐렴 예방용 백신 조성물.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 피하 주사, 정맥 주사, 복강 주사, 근육 주사, 비강내 투여, 흡입투여, 질내 투여, 또는 경구 투여용인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.