CN103936842B - 肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用，所述的突变体的基因包括核苷酸序列为SEQ？ID？NO.2的ΔPly。本发明以肺炎链球菌溶血素突变体(ΔPly)为粘膜免疫佐剂，制备肺炎链球菌融合蛋白质疫苗，用于肺炎链球菌感染免疫预防，安全有效。

Description

肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用。

背景技术

目前，肺炎是引起儿童死亡的最主要原因，超过了HIV/AIDS，疟疾和麻疹。根据现有的病因学调查结果显示，肺炎链球菌是导致儿童致死性肺炎感染的主要细菌。市场上现有的针对肺炎链球菌的疫苗主要是针对肺炎链球菌的23价多糖疫苗和多糖结合疫苗(7价、11价、13价等)，但是它们都存在：覆盖血清型有限，可能发生荚膜血清型转换等缺点，而且由于结合疫苗价格比较昂贵，难以在发展中国家纳入国家计划免疫。因此，研制新的保护效果好、免疫原性强、持续时间长、血清型覆盖广、价格廉价的肺炎链球菌蛋白疫苗已成为预防其肺炎感染的一项重要课题。

蛋白疫苗免疫原性强、在各个血清型的菌株中高度保守，可以诱导T细胞免疫反应，产生免疫记忆，且制备简便，易于规模化生产，是一类有发展潜力的疫苗。Intercell公司开发的肺炎链球菌蛋白疫苗IC47开始一期临床研究已完成；赛诺菲-巴斯德公司的PspA蛋白疫苗也已完成一期临床研究，说明蛋白疫苗是一个很有前景的研究方向。

肺炎链球菌溶血素Pneumolysin(Ply)是肺炎链球菌保守表达的一个53KDa的表面溶血活性蛋白，大量的文献和实验证明，减毒的Ply蛋白是一种比较有效的疫苗候选蛋白，经粘膜免疫实验动物可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著的保护作用。同时也有报道提示Ply具有潜在的粘膜佐剂的功能，Ply与目的蛋白融合表达后通过粘膜途径免疫可以诱导宿主产生较高水平的特异性IgG和IgA，但是未表现出对感染肺炎链球菌小鼠的保护效果。

肺炎链球菌的定植部位为人类上呼吸道，鼻粘膜免疫接种疫苗既可有效抑制其鼻腔定植，又能对其侵袭性感染产生保护作用，因此鼻粘膜免疫接种疫苗是WHO推荐的疫苗免疫途径。CT(霍乱毒素)佐剂作为经典的黏膜佐剂，效果显著，但由于其毒性较大，无法应用于人体。无毒且有效的粘膜佐剂的研发与应用显得迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的粘膜免疫佐剂及预防肺炎链球菌感染的融合蛋白质疫苗的制备方法。

本发明采用基因工程的手段分别克隆表达ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ抗原，利用基因克隆技术分别将DnaJ及ΔPly基因片段连接到表达载体，转化入工程菌表达目的蛋白，实现DnaJ及ΔPly蛋白的融合表达，具有高效、安全、便于分离纯化等优点。

本发明一方面涉及一种肺炎链球菌溶血素突变体，其特征在于所述的突变体的基因包括核苷酸序列为SEQIDNO.2的ΔPly。

本发明另一方面涉及上述的肺炎链球菌溶血素突变体作为粘膜免疫佐剂的应用。

本发明另一方面还涉及ΔPly和DnaJ的融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.5或SEQIDNO.6。

在本发明的另一方面还涉及ΔPly和DnaJ的融合蛋白的基因，其特征在于所述的基因核苷酸序列为SEQIDNO.3或SEQIDNO.4.

本发明另一方面还涉及含有SEQIDNO.3或SEQIDNO.4序列的质粒载体。

本发明另一方面还涉及上述质粒载体在制备融合蛋白中的应用，所述的融合蛋白的分子量为93KDa。

本发明另一方面还涉及一种肺炎链球菌感染预防用的融合蛋白质疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用引物修饰法分别从S.pn基因组中扩增DnaJ及Ply基因片段；

(2)用引物修饰法获得Ply第146位氨基酸缺失的突变体基因；

(3)分别构建含有ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ基因的pET28a(+)重组质粒；

(4)将重组质粒分别转化到BL21(DE3)工程菌中，IPTG诱导可高效表达ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ蛋白，获得表达目的蛋白的工程菌BL21-pET28a(+)-ΔPly、BL21-pET28a(+)-DnaJ、BL21-pET28a(+)-DnaJ-ΔPly和BL21-pET28a(+)-ΔPly-DnaJ；

(5)分离纯化ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ目的蛋白；

(6)将ΔPly及DnaJ两种蛋白抗原按融合蛋白中的分子比例制成特定的蛋白混合物。

本发明所述的融合蛋白质疫苗通过克隆表达肺炎链球菌毒力基因制备。将DnaJ及ΔPly蛋白融合表达及按相应比例进行混合，本发明一较佳实施例中，在不同抗原组合实验中，证实DnaJ-ΔPly该融合蛋白疫苗能够显著增强抵抗肺炎链球菌感染的能力，在减少肺炎链球菌定植保护实验中，与其它单一成分蛋白疫苗的效果相比具有统计学意义。在另一较佳的实例中，采用不同的抗原组合实验，结果表明DnaJ-ΔPly免疫可以显著提高抵抗肺炎链球菌感染的免疫保护效果，进一步证实了上述的肺炎链球菌多价联合蛋白质疫苗具有良好的保护效果。

综上所述，本发明以肺炎链球菌溶血素突变体(ΔPly)为粘膜免疫佐剂，制备肺炎链球菌融合蛋白质疫苗，用于肺炎链球菌感染免疫预防，安全有效。

附图说明

图1：重组质粒pET28a(+)-DnaJ-ΔPly的PCR鉴定，其中左为DnaJ，右为ΔPly；M为DNAMarker。

图2：纯化的两种融合蛋白(分子量都是93KDa)，泳道1为纯化的DnaJ-ΔPly，泳道2为纯化的DnaJ-ΔPly。泳道3为纯化的DnaJ(38KDa),泳道4为纯化的ΔPly(50KDa)。

图3：DnaJ与ΔPly抗血清分别对DnaJ-ΔPly和DnaJ-ΔPly的识别反应。

图4：DnaJ-ΔPly蛋白抗血清对肺炎链球菌菌体蛋白的识别反应。

图5：ΔPly作为粘膜免疫佐剂对抗体的促进作用。

图6：ΔPly作为粘膜免疫佐剂对细胞因子的促进作用

图7：小鼠抗原主动免疫定植保护实验图。上图A,B为19F，下图C,D为6B。

图8：小鼠抗原主动免疫保护实验半数生存时间的统计学分析。上图A为D39，下图B为3型(436)。

具体实施方式

实施例1

重组表达质粒pET28a(+)-ΔPly、pET28a(+)-DnaJ、pET28a(+)-DnaJ-ΔPly和pET28a(+)-ΔPly-DnaJ表达载体的构建

(一)材料：

质粒pET28a(+)购自Novagen公司，PCR用PrimeStar高保真酶、dNTPs、Buffer、MgCl₂购自大连宝生物技术公司，PTC－200PCR仪为PerkinElmer产品，RG－3000为CorbettResearch产品。

(二)引物的设计合成：

以肺炎链球菌TIGR4基因组DNA为模板，参照其全序列(GeneBank编号AE005672)，使用premier5.0设计引物，由上海生工公司合成。

pET28a(+)-ΔPly重组质粒的构建参照(Lea-AnnS.Kirkham,Infect.Immun.2006,74(1):586.)、pET28a(+)-DnaJ重组质粒的构建参照(Mohd.NadeemKhan,Vaccine24(2006)6225–6231.)

DnaJ:上游引物：5’-GGAATTCCATATGAACAATACTGAATTT-3’，含NdeI位点；

下游引物：5’-CGAGCTCTTATTCTCCATCAAAGG-3’，含SacI位点；

Ply:上游引物：5’-CGGCGGCCGCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’，含NotI位点；

下游引物：5’-CCCTCGAGTTACTAGTCATTTTCTACCTTATCCTCT-3’，含XhoI位点；

构建Ply146位氨基酸突变引物：

上游引物：

5’-GGTCAGGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATGAAAAAATAAC-3’；

下游引物：

5’-GTTATTTTTTCATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACCTGACC-3’。

DnaJ-ΔPly与ΔPly-DnaJ引物：前者是DnaJ的C端与△Ply的N端相连，后者是△Ply的C端与DnaJ的N端相连。

DnaJ-ΔPly:F/R-DnaJ-N,F/R-ΔPly-C

ΔPly-DnaJ:F/R-DnaJ-C,F/R-ΔPly-N

(三)PCR扩增目的基因：

DnaJ基因的扩增，引物为(F-DnaJ–N和R-DnaJ–N)或(F-DnaJ–C和R-DnaJ–C)，扩增的DnaJ基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1

体系：

ddH₂O30.5μl

5×buffer(Mg²⁺)10.0μl

dNTP(10mM)4μl

P1(5pM)2μl

P2(5pM)2μl

DNA模板1μl

PrimeStar0.5μl

条件：98℃1min、55℃1min、72℃90s、30cycle；72℃10min,1次。

ΔPly基因的扩增，引物为(F-ΔPly–N和R-ΔPly–N)或(F-ΔPly–C和R-ΔPly–C)，扩增的ΔPly基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2

体系：

ddH₂O30.5μl

5×buffer(Mg²⁺)10.0μl

dNTP(10mM)4μl

P1(5pM)2μl

P2(5pM)2μl

DNA模板1μl

PrimeStar0.5μl

条件：98℃1min、56℃1min、72℃90s、30cycle；72℃10min,1次。

利用上述条件，扩增出了相应目的基因

(四)原核表达载体的构建

PCR产物回收按罗氏提供的试剂盒说明进行，质粒pET28a(+)按Omega小量质粒DNA抽提试剂盒说明进行，然后进行载体DNA和外源DNA进行双酶切及回收，最后连接回收产物，连接反应体系如下：

连接反应体系1：

DnaJ片段5.6μl；

pET28a(+)DNA大片段2.4μl；

连接bufferI1μl；

T4连接酶1μl

总体积：10μl

连接反应体系2：

ΔPly片段6μl；

pET28a(+)DNA大片段2μl；

连接bufferI1μl；

T4连接酶1μl

总体积：10μl

在连接反应体系1连接反应完成且鉴定正确后，连接反应体系3：

ΔPly片段5μl；

pET28a(+)-DnaJDNA大片段3μl；

连接bufferI1μl；

T4连接酶1μl

总体积：10μl

反应条件：置0.5mlEP管中，低速瞬时离心，置16℃连接过夜。

将连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞：

取E.coliDH5α菌划线接种LB平板

37℃孵育过夜(12-14h)

挑取单菌落，接种于3mlLB中

37℃200rpm过夜(12-14h),取100μl加入2mlLB37℃，300rpm3h

取1.5ml菌液加入冰预冷EP管中，冰浴10min后4000rpm,5min收集菌体

加入预冷的0.1mMCacl2150μl,重悬后9000rpm，2min收集菌体

再加入预冷的0.1mMCacl2150μl,重悬

加入10μl连接反应产物，混匀后，冰水浴30min

42℃热击5min，冰水浴2min

加入800ulLB培养基，37℃，100rpm1h复苏

取200μl菌液涂布于LK平板

37℃孵育，13h

挑取单菌落进行增菌鉴定

(五)pET28a(+)-ΔPly、pET28a(+)-DnaJ、pET28a(+)-DnaJ-ΔPly和pET28a(+)-ΔPly-DnaJ重组子的筛选及鉴定

挑取10个卡纳霉素抗性菌落，分别置2mlLK(含50ug/mlKana的LB)培养基中，180rpm3h增菌，菌液PCR鉴定；选取3个可疑阳性菌落增菌，送往北京六合华大公司作双向测序。

结果见附图1，都获得单一的PCR条带；PCR产物测序结果与预期序列比对完全吻合。

其中DnaJ的核苷酸序列为SEQIDNO.1

ΔPly的核苷酸序列为SEQIDNO.2

DnaJ-ΔPly的核苷酸序列为SEQIDNO.3

ΔPly-DnaJ的核苷酸序列为SEQIDNO.4

以上结果证实目的基因片段正确插入表达载体中，与野生Ply比对来讲，DnaJ-ΔPly和ΔPly-DnaJ中的Ply基因第435-438位碱基缺失。

实施例2

原核表达质粒pET28a(+)-ΔPly、pET28a(+)-DnaJ、pET28a(+)-DnaJ-ΔPly和pET28a(+)-ΔPly-DnaJ在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化

(一)重组质粒pET28a(+)-ΔPly、pET28a(+)-DnaJ、pET28a(+)-DnaJ-ΔPly和pET28a(+)-ΔPly-DnaJ转化至宿主菌BL21(DE3)中

(二)IPTG诱导ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ的大量表达

(三)重组蛋白的纯化：超声破菌后，取细菌破碎液上清用于纯化；4℃，10000rpm×10min，上清用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。

亲合层析纯化：吸2ml50％的Ni²⁺-NTA树脂混悬液于层析柱内，以20ml超声破碎缓冲液平衡；吸出平衡后的Ni²⁺-NTA树脂混悬液与上述滤液充分混匀，冰浴1h，其间每间隔5min轻轻混匀一次；将悬液转入层析柱内，让液体自然流出，平衡柱床；不同咪唑浓度进行梯度洗脱，分别收集洗脱液后进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果见(五)。

(四)PBS超滤除去咪唑。

(五)重组蛋白的定量(Bradford检测法)

⑴吸20mg/ml的标准品牛血清白蛋白溶液6μl以0.15mmo1/LNaCl稀释40倍至0.5mg/ml，分别在两组各4支试管中加入10μl、20μl、30μl、40μlBSA溶液，然后以0.15mmol/LNaCl补足总体积为200μl，同时取一支试管仅加200μl0.15mmol/LNaCl作为调零用；

⑵取纯化产物20μl，也以0.15mmol/LNaCl补足至总体积200μl；

⑶每管加入考马斯亮蓝G-250染液2ml，振荡混匀后室温静置30min；

⑷于-Series600全波长分光光度计中读取A590值，由仪器自动绘制标准曲线及计算样品蛋白含量。

结果显示(见附图2)：经SDS-PAGE和图像分析表明，四种重组蛋白纯度可达90％以上，经Bradford法测得纯化透析后蛋白浓度ΔPly为4.7mg/ml、DnaJ为3.94mg/ml、DnaJ-ΔPly为2.1mg/ml，ΔPly-DnaJ为2.0mg/ml。

本发明中蛋白的质量控制及使用方法为：

1.纯度分析：SDS-PAGE鉴定，纯度为90％以上.

2.鉴别实验：融合蛋白可以被DnaJ及ΔPly的抗血清识别，并且其抗血清可以识别DnaJ及ΔPly重组蛋白(见附图3、4)。

3.溶血活性：与野生肺炎球菌溶血素相比，本突变体失去溶血活性，且融合蛋白也同样没有溶血活性。

4.内毒素测定：参照《中国药典》，终点显色细菌内毒素检查法。各蛋白内毒素含量低于0.1EU/μg。

实施例3

ΔPly作为粘膜免疫佐剂的效果评价

(一)将C57小鼠随机分为6组，分为单一蛋白免疫组(共1组，为DnaJ组)，两两混合免疫组(共2组，分别为DnaJ+ΔPly组和DnaJ+GST组)和融合蛋白免疫组(2组，为DnaJ-ΔPly组和ΔPly-DnaJ组)以及CT佐剂的阳性对照组(1组，为CT+DnaJ组)。

(二)首次免疫时，用无菌PBS调整重组蛋白浓度经滴鼻免疫实验组小鼠，每只30ul，含8ugDnaJ和/或10ugΔPly重组蛋白，融合蛋白为18ug，CT佐剂为1ug；

(三)首次免疫1周后，进行第二次免疫，方法及剂量同上，CT佐剂减半。

(四)首次免疫2周后，第三次免疫，方法及剂量均同第二次。

(五)末次免疫后一周，取小鼠血液及唾液进行抗体效价分析。

结果见附图5：与DnaJ单独免疫组相比，DnaJ+ΔPly组和DnaJ-ΔPly组血清中抗DnaJ特异性IgG水平显著升高，在唾液标本检测中，DnaJ-ΔPly组唾液中抗DnaJ特异性sIgA水平显著升高。提示，ΔPly作为一种新的粘膜佐剂，无论混合或融合均可显著提高系统免疫，而在融合状态，还可以显著提高粘膜免疫抗体的产生。

ΔPly作为粘膜免疫佐剂对相关细胞因子的作用

(一)将C57小鼠随机分为7组，其中6组小鼠分别用作免疫组，分为单一蛋白免疫组(共1组，为DnaJ组)，两两混合免疫组(共2组，分别为DnaJ+ΔPly组和DnaJ+GST组)和融合蛋白免疫组(2组，为DnaJ-ΔPly组和ΔPly–DnaJ组)以及CT佐剂的阳性对照组(1组，为CT+DnaJ组)，另一组为PBS对照组。

(二)首次免疫时，用无菌PBS调整重组蛋白浓度经滴鼻免疫实验组小鼠，每只30ul，含8ugDnaJ和/或10ugΔPly重组蛋白，融合蛋白为18ug，CT佐剂为1ug；

(三)首次免疫1周后，进行第二次免疫，方法及剂量同上，CT佐剂减半。

(四)首次免疫2周后，第三次免疫，方法及剂量均同第二次。

(五)末次免疫后一周，对PBS、DnaJ、DnaJ+GST、DnaJ+ΔPly、DnaJ-ΔPly、ΔPly–DnaJ及CT+DnaJ组小鼠取脾，每组3只，无菌不锈钢筛网分离脾细胞，以RPMI1640培养基洗涤两次后，重悬于含10％FBS的RPMI1640培养基中调整浓度为5×10⁶细胞/ml。调整好的细胞悬液培养于24孔板，每孔1ml，以5μgrDnaJ蛋白刺激，分别在5％CO2，37℃环境中孵育12h、24h、48h、72h及96h，吸取上清-70℃冻存备用。以PBS为空白对照，刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)为阳性对照，按相同条件刺激脾细胞，收集上清-70℃冻存备用。

(六)采用Biolegend细胞因子检测试剂盒，对收集的细胞上清进行检测。

结果见附图6：与DnaJ单独免疫组相比，DnaJ+ΔPly组和DnaJ-ΔPly组脾细胞培养上清中IL-17A水平显著升高,且DnaJ+ΔPly组IFN-r水平也显著升高。提示，ΔPly作为一种新的粘膜佐剂，无论混合或融合使用均可显著刺激Th17型免疫反应，而且在混合时还可以促进Th1型免疫反应。

融合蛋白疫苗DnaJ-ΔPly对肺炎链球菌定植的保护实验

(一)将C57小鼠随机分为7组，其中6组小鼠分别用作免疫组，分为单一蛋白免疫组(共2组，分别为DnaJ组、ΔPly组)，两两混合免疫组(共1组，为DnaJ+ΔPly组)和融合蛋白免疫组(2组，为DnaJ-ΔPly组和ΔPly–DnaJ组)以及CT佐剂的阳性对照组(1组，为CT+DnaJ组)，另一组为PBS对照组。

(二)首次免疫时，用无菌PBS调整重组蛋白浓度经滴鼻免疫实验组小鼠，每只30ul，含8ugDnaJ和/或10ugΔPly重组蛋白，融合蛋白为18ug，CT佐剂为1ug；

(三)首次免疫1周后，进行第二次免疫，方法及剂量同上，CT佐剂减半。

(四)首次免疫2周后，第三次免疫，方法及剂量均同第二次免疫。

(五)末次免疫后两周进行攻毒实验，选择定植能力强的菌株：19F和6B,攻毒剂量均为1x108CFU滴鼻攻毒，3天后，取小鼠鼻腔灌洗液和肺组织匀浆，连续稀释后进行铺板计数。

结果见附图7：与DnaJ单独免疫组相比，DnaJ-ΔPly组可以显著降低19F及6B菌株在鼻咽部的定植，而且DnaJ+ΔPly组和DnaJ-ΔPly组均可显著减少侵入肺部的肺炎链球菌。

融合蛋白疫苗DnaJ-ΔPly的主动保护实验

小鼠末次免疫两周后进行攻毒实验，我们选择的攻毒菌有标准菌株D39，还有国内流行的菌株3型(436)。选用5×107CFU的D39和1.5×108CFU的3型(436)滴鼻攻毒。连续21天内观察小鼠的生存状态，计算小鼠的生存率。

结果见附图8：DnaJ+ΔPly组和DnaJ-ΔPly组小鼠的半数生存时间显著高于对照组，其中，DnaJ-ΔPly免疫组在2种细菌攻毒模型中，均获得最好的生存情况，同已上市的23价多糖疫苗保护效果相似，无统计学差别。

从以上的实验结果得出：本发明成功制备一种新型的粘膜佐剂ΔPly并对其佐剂效果进行评价，成功的以此为佐剂制备了肺炎链球菌的融合蛋白疫苗DnaJ-ΔPly，通过定植及主动免疫保护试验证明了该融合蛋白疫苗可以显著提高保护效果。所以本发明成功地开发了新型粘膜佐剂ΔPly及肺炎链球菌融合蛋白疫苗DnaJ-ΔPly，该疫苗成分单一、保护效果好、易大规模生产、可推广使用。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.ΔPly和DnaJ的融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.5或SEQIDNO.6。

2.权利要求1所述的ΔPly和DnaJ的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的编码核苷酸序列为SEQIDNO.3或SEQIDNO.4.

3.含有SEQIDNO.3或SEQIDNO.4序列的质粒载体。

4.权利要求3所述的质粒载体在制备融合蛋白中的应用，所述融合蛋白的分子量为93KDa。

5.一种含有如权利要求1中所述的融合蛋白的疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用引物修饰法分别从S.pn基因组中扩增DnaJ及Ply基因片段；

(2)用引物修饰法获得Ply第146位氨基酸缺失的突变体基因；

(3)分别构建含有ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ基因的pET28a(+)重组质粒；

(4)将重组质粒分别转化到BL21(DE3)工程菌中，IPTG诱导可高效表达ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ蛋白，获得表达目的蛋白的工程菌BL21-pET28a(+)-ΔPly、BL21-pET28a(+)-DnaJ、BL21-pET28a(+)-DnaJ-ΔPly和BL21-pET28a(+)-ΔPly-DnaJ；

(5)分离纯化ΔPly、DnaJ、DnaJ-ΔPly及ΔPly-DnaJ目的蛋白；

(6)将ΔPly及DnaJ两种蛋白抗原按融合蛋白中的分子比例制成蛋白混合物。