CN111100192A - 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用 - Google Patents

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用，包括以下制备步骤：S1、依据GeneBank已经公布的APP菌毛ApfA基因序列，设计了一对引物；S2、利用Blood&Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System提取猪胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA；S3、再利用聚合酶链式反应PCR扩增出ApfA基因；S4、将测序后的ApfA序列与NCBI基因库ApfA基因序列进行比对；S5、将测序正确的质粒转化至E.coli M15中，以IPTG进行诱导。本发明涉及动物传染病防控技术领域。该猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用，能有效抑制猪胸膜肺炎放线杆菌的生长，证明了ApfA蛋白作为抗原的免疫特性，可以对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌起到及时防控的目的。

Description

一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性 与应用
技术领域
本发明涉及动物传染病防控技术领域，具体为一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是一种革兰氏阴性菌，造成猪胸膜肺炎与肺部出血性坏死，引起猪只呼吸道的严重疾病，急性病例死亡率可达80％以上，慢性经过者生长发育受阻，易继发其他病原感染而死亡。猪场一旦感染本病就很难根除，其原因在于存在慢性感染和带菌猪只。本病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疾病之一，给各国养猪业造成了巨大的经济损失。
目前，研究人员已经从胸膜肺炎放线杆菌中鉴定到了4种RTX毒素、荚膜多糖(CP)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、转铁结合蛋白(Tbp)、溶血素(Hly)、粘附素、蛋白酶毒力因子，同时这些毒力因子免疫特性也得到研究。在猪传染性胸膜肺炎疫苗的研制上取得一些进展，研发的疫苗主要有灭火疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗。研究发现，灭活疫苗免疫猪，再攻毒发现猪仍然会出现较严重的呼吸系统症状，抗体检测表明，灭活疫苗免疫后产生的抗体效价偏低，此外，由于APP存在不同血清型且交叉保护性差，灭活疫苗只能对其相应的血清型提供保护，不同血清型之间缺少交叉保护，同血清型不同菌株之间也缺少保护。根据发现的APP毒力因子的免疫特性研制出的重组亚单位疫苗及多组分亚单位疫苗改善了传统疫苗交叉保护保护性差的不足，但由于亚单位疫苗制作工艺复杂、成本偏高，阻碍了亚单位疫苗的商品化。研究发现，基因工程疫苗具有良好的交叉保护性，具有良好的保护率并能够显著降低感染带来的损伤，同时还能够不同程度抵抗病原在肺部组织的定殖，但由于安全性问题的存在，APP基因工程疫苗仍然处在实验室研究阶段。
为了解决以上疫苗在实际应用中存在的问题，开发一种安全、高效、廉价的新型疫苗将成为APP防控的更有效手段。研究发现，微生物为了附着于宿主细胞通常会采用诸如黏膜纤毛运转的方法来避免被清除。处于粘附状态时会增加微生物对宿主的毒性作用，从而提高它们对有害因素的抵抗力，并增强它们攫取营养的能力，使它们比那些没有粘附于宿主细胞的微生物繁殖得更快，更有效率。曾有报道指出，除了脂多糖以外，一些其他的粘附素也可以使胸膜肺炎放线杆菌更容易地粘附于黏膜表面。而根据对菌毛特性及功能的研究，人们推测所谓的“其他粘附素”很可能就是菌毛。APP菌毛基因簇大小为5303bp，含有ApfA，ApfB，ApfC和ApfD等4个基因，以及部分假定的radA基因和yacE基因。其中ApfA，ApfB，ApfC和ApfD基因内均含有完整的ORF，而radA基因和yacE基因内则含有部分ORF。在APP菌毛基因簇内，最主要的基因就是ApfA，该基因编码的蛋白与流感嗜血杆菌、伴放线放线杆菌、多杀性巴氏杆菌以及睡眠嗜血杆菌的菌毛蛋白的同源性达到了81％，研究表明，菌毛在革兰氏阴性菌如淋球菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肠致病性大肠杆菌、绿脓杆菌的发病机制中发挥了重要作用，参与了粘附、定植、运动、生物膜形成、蛋白质输出和DNA摄取等作用过程。研究发现编码ApfA基因的结构蛋白在12个典型的猪胸膜肺炎放线杆菌血清型中均有存在，且每个血清型菌株ApfA的ORF长度均为447bp，其同源性则达到了95％以上，这说明ApfA蛋白在12个血清型中是高度保守的。因此，根据ApfA在不同血清型APP菌株中的高度保守性，可做如下构想：加入了菌毛ApfA蛋白的疫苗不仅有可能提供对血清型同型菌株感染的保护，而且还可能提供对异型APP菌株感染的交叉保护作用，也就是说，菌毛ApfA蛋白可作为疫苗的候选抗原蛋白开发成对不同血清型APP菌株具有交叉免疫保护力的疫苗，应用于猪传染性胸膜肺炎的防控。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种对猪感染不同血清型的传染性胸膜肺炎放线杆菌菌株均具有交叉保护的菌毛ApfA抗原。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原，包括以下制备步骤：
S1、依据GeneBank已经公布的APP菌毛ApfA基因序列，设计了一对引物：上游引物序列为：
5’-CGTACGGAATTCATGCAAAAACTAAGTCTTATTC-3’，
下游引物序列为：
5’-CGCTAGTCTAGATTAATTTGATGCGCAGAAATT-3’；
S2、利用Blood&Tissue Genomic DNAExtraction Miniprep System提取猪胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA；
S3、再利用聚合酶链式反应PCR扩增出ApfA基因，并且将ApfA基因片段连接到表达载体pQE-30中，再将连接完成的质粒转化到E.coli DH5α中，提取质粒，经由限制酶BamHI和HandⅢ双酶切后，电泳鉴定，将正确连接的质粒送去测序；
S4、将测序后的ApfA序列与NCBI基因库ApfA基因序列进行比对，将测序正确的质粒pQE-30-ApfA转化至E.coli M15中，以IPTG进行诱导，利用Ni-NTA resin，His融合标签蛋白纯化树脂，进行ApfA蛋白的纯化，再利用抗6xHis标签鼠单克隆抗体对纯化后的ApfA蛋白进行鉴定，并进行SDS-PAGE电泳和Westen bloting印迹检测验证。
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，菌毛ApfA抗原免疫特性检测包括以下步骤：
(1)、ApfA蛋白免疫原性检测，以50μg纯化ApfA蛋白溶解于200μL PBS，与等体积白油佐剂Marcol-52混合，用PBS配制为剂量浓度为25μg/ml，乳化后免疫小鼠，并以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌市售三价灭活疫苗及PBS作为对照组，进行腹腔注射免疫小鼠；
(2)攻毒保护实验，在第二次免疫后28天，对各组小鼠以1.0×108CFU，约2倍ID50的血清型为7型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒；
(3)ApfA蛋白抗血清体外抑菌实验，提取20μg/mlApfA组攻毒后存活的小鼠血清，稀释30倍与2.0×102CFU猪胸膜肺炎放线杆菌均匀涂抹于TSA+1ml 0.1g/100ml NAD+胎牛血清琼脂培养基平板上，同时设空白，即不添加抗血清平板作对照。
优选的，所述步骤(1)中每组10只小鼠，免疫剂量均为0.2ml，进行两次免疫，两次免疫间隔21天，在第二次免疫后14天，每组随机选取3只小鼠，采用尾静脉采血的方法收集血液，分离血清，ELISA酶联免疫吸附法检测血清抗体效价。
优选的，所述步骤(1)中以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌市售三价灭活疫苗，含灭活的血清1型、2型和7型胸膜肺炎放线杆菌，按活菌计数法每种菌的CFU含量均≥5×108/ml。
优选的，所述步骤(2)中攻毒后隔6小时小时观察记录一次各组小鼠感染死亡情况及存活率。
优选的，所述步骤(3)于37℃培养24小时后，观察体外抑制猪胸膜肺炎放线杆菌生长情况。
优选的，所述菌毛ApfA抗原免疫特性检测还包括体外抑菌实验箱，所述体外抑菌实验箱内侧设置有培养基放置板架，所述培养基放置板架上方放置有培养基放置板，所述培养基放置板上方的中间位置设置有隔离突起板，所述养基放置板上开设有培养基放置槽，所述体外抑菌实验箱外侧转动连接有外门板，所述外门板中部设置有玻璃观察窗。
优选的，所述外门板位于靠近玻璃观察窗下方的位置开设有透气孔，所述体外抑菌实验箱两侧壁上方的位置开设有孔槽，所述孔槽内设置有隔离网。
优选的，所述体外抑菌实验箱边侧与外门板边侧对应的位置设置有磁吸门贴，所述体外抑菌实验箱底部设置有防滑支撑脚座。
优选的，所述培养基放置板架上开设有内滑槽，所述培养基放置板底部对应内滑槽的位置设置有滑架，所述培养基放置板的滑架放置在内滑槽内。
(三)有益效果
本发明提供了一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用。具备以下有益效果：
该猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用，以纯化的ApfA蛋白作为抗原免疫小鼠，再攻毒后存活下来的小鼠血清含有ApfA抗原的抗体，且能有效抑制猪胸膜肺炎放线杆菌的生长，进一步证明了ApfA蛋白作为抗原的免疫特性，提供一种对猪感染不同血清型的传染性胸膜肺炎放线杆菌菌株均具有交叉保护的菌毛ApfA抗原，可以对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌起到及时防控的目的。
附图说明
图1为本发明的ApfA基因PCR扩增图；
M：DNA标准；1：ApfA基因PCR扩增产物；2：空白对照；
图2为本发明的重组表达质粒pQE-30-ApfA双酶切鉴定图；
M：DNA相对分子量质量标准；1：pQE-30-ApfA质粒双酶切结果；
图3为本发明的ApfA蛋白SDS-PAGE鉴定图；
M：蛋白质标准；1：纯化ApfA蛋白；
图4为本发明的ApfA蛋白Western blot鉴定图；
M：蛋白质标准；1：纯化ApfA蛋白；
图5为本发明的不同免疫组小鼠血清抗体效价柱状图；
图6为本发明的攻毒后各组小鼠的存活率折线图；
图7为本发明的pfA蛋白抗血清体外抑菌实验结果图；
图8为本发明的抑菌实验箱的结构示意图。
图中：1体外抑菌实验箱、2培养基放置板架、3培养基放置板、4隔离突起板、5培养基放置槽、6外门板、7玻璃观察窗、8磁吸门贴、9透气孔、10孔槽、11防滑支撑脚座。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原，包括以下制备步骤：
S1、依据GeneBank已经公布的APP菌毛ApfA基因序列，设计了一对引物：上游引物序列为：
5’-CGTACGGAATTCATGCAAAAACTAAGTCTTATTC-3’，
下游引物序列为：
5’-CGCTAGTCTAGATTAATTTGATGCGCAGAAATT-3’；
S2、利用Blood&Tissue Genomic DNAExtraction Miniprep System提取猪胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA；
S3、再利用聚合酶链式反应PCR扩增出ApfA基因，见图1，并且将ApfA基因片段连接到表达载体pQE-30中，再将连接完成的质粒转化到E.coli DH5α中，提取质粒，经由限制酶BamHI和HandⅢ双酶切后，电泳鉴定，将正确连接的质粒送去测序，见图2；
S4、将测序后的ApfA序列与NCBI基因库ApfA基因序列进行比对，将测序正确的质粒pQE-30-ApfA转化至E.coli M15中，以IPTG进行诱导，利用Ni-NTA resin，His融合标签蛋白纯化树脂，进行ApfA蛋白的纯化，再利用抗6×His标签鼠单克隆抗体对纯化后的ApfA蛋白进行鉴定，并进行SDS-PAGE电泳(见图3)和Westen bloting印迹(见图4)检测验证。
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，菌毛ApfA抗原免疫特性检测包括以下步骤：
(1)、ApfA蛋白免疫原性检测，以50μg纯化ApfA蛋白溶解于200μL PBS，与等体积白油佐剂Marcol-52混合，用PBS配制为剂量浓度为25μg/ml，乳化后免疫小鼠，并以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌市售三价灭活疫苗及PBS作为对照组，进行腹腔注射免疫小鼠；
(2)、攻毒保护实验，在第二次免疫后28天，对各组小鼠以1.0×108CFU，约2倍ID50的血清型为7型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒；
(3)、ApfA蛋白抗血清体外抑菌实验，提取20μg/mlApfA组攻毒后存活的小鼠血清，稀释30倍与2.0×102CFU猪胸膜肺炎放线杆菌均匀涂抹于TSA+1ml 0.1g/100ml NAD+胎牛血清琼脂培养基平板上，同时设空白，即不添加抗血清平板作对照。
步骤(1)中每组10只小鼠，免疫剂量均为0.2ml，进行两次免疫，两次免疫间隔21天，在第二次免疫后14天，每组随机选取3只小鼠，采用尾静脉采血的方法收集血液，分离血清，ELISA酶联免疫吸附法检测血清抗体效价。
步骤(1)中以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌市售三价灭活疫苗，含灭活的血清1型、2型和7型胸膜肺炎放线杆菌，按活菌计数法每种菌的CFU含量均≥5×108/ml。
步骤(2)中攻毒后隔6小时小时观察记录一次各组小鼠感染死亡情况及存活率。
步骤(3)于37℃培养24小时后，观察体外抑制猪胸膜肺炎放线杆菌生长情况。
菌毛ApfA抗原免疫特性检测还包括体外抑菌实验箱1，体外抑菌实验箱1内侧设置有培养基放置板架2，培养基放置板架2上方放置有培养基放置板3，培养基放置板3上方的中间位置设置有隔离突起板4，养基放置板3上开设有培养基放置槽5，体外抑菌实验箱1外侧转动连接有外门板6，外门板6中部设置有玻璃观察窗7。
外门板6位于靠近玻璃观察窗7下方的位置开设有透气孔9，体外抑菌实验箱1两侧壁上方的位置开设有孔槽10，孔槽10内设置有隔离网。
体外抑菌实验箱1边侧与外门板6边侧对应的位置设置有磁吸门贴8，体外抑菌实验箱1底部设置有防滑支撑脚座11。
培养基放置板架2上开设有内滑槽，培养基放置板3底部对应内滑槽的位置设置有滑架，培养基放置板3的滑架放置在内滑槽内。
步骤(1)中结果见图5，ApfA免疫组的抗体效价(Log2(titers)＝14.40)显著高于PBS对照组(Log2(titers)＝1.49)(P<0.01)，ApfA免疫组的抗体效价略低于市售疫苗免疫组(Log2(titers)＝15.26)(P＞0.05)。证明，ApfA蛋白能够诱导机体产生高水平免疫应答，具有良好的免疫原性；
步骤(2)中攻毒后隔6小时小时观察记录一次各组小鼠感染死亡情况及存活率，结果表明在攻毒72小时后，ApfA组和市售疫苗组的小鼠存活率均为40％，PBS组小鼠全部死亡，证明ApfA蛋白抗原对小鼠产生了一定程度的保护力，具体情况见表1和图6；
步骤(3)中于37℃培养24小时后，观察体外抑制猪胸膜肺炎放线杆菌生长情况，添加攻毒后存活的小鼠血清的平板未见有菌落生长，而空白对照平板见有多个菌落生长，证明以纯化的ApfA蛋白作为抗原免疫小鼠，再攻毒后存活下来的小鼠血清含有ApfA抗原的抗体，且能有效抑制猪胸膜肺炎放线杆菌的生长，进一步证明了ApfA蛋白作为抗原的免疫特性，见图7。
表1攻毒后各组小鼠感染死亡及存活率
Figure BDA0002322203910000091
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原，其特征在于，包括以下制备步骤：
S1、依据GeneBank已经公布的APP菌毛ApfA基因序列，设计了一对引物：上游引物序列为：
5’-CGTACGGAATTCATGCAAAAACTAAGTCTTATTC-3’，
下游引物序列为：
5’-CGCTAGTCTAGATTAATTTGATGCGCAGAAATT-3’；
S2、利用Blood&Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System提取猪胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA；
S3、再利用聚合酶链式反应PCR扩增出ApfA基因，并且将ApfA基因片段连接到表达载体pQE-30中，再将连接完成的质粒转化到E.coli DH5α中，提取质粒，经由限制酶BamHI和HandⅢ双酶切后，电泳鉴定，将正确连接的质粒送去测序；
S4、将测序后的ApfA序列与NCBI基因库ApfA基因序列进行比对，将ApfA基因片段连接到表达载体pQE-30中，并进行鉴定，将测序正确的质粒pQE-30-ApfA转化至E.coli M15中，以IPTG进行诱导，利用Ni-NTAresin，His融合标签蛋白纯化树脂，进行ApfA蛋白的纯化，再利用抗6xHis标签鼠单克隆抗体对纯化后的ApfA蛋白进行鉴定，并进行SDS-PAGE电泳和Westenbloting印迹检测验证。
2.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于，菌毛ApfA抗原免疫特性检测包括以下步骤：
(1)ApfA蛋白免疫原性检测，以50μg纯化ApfA蛋白溶解于200μLPBS，与等体积白油佐剂Marcol-52混合，用PBS配制为剂量浓度为25μg/ml，乳化后免疫小鼠，并以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌市售三价灭活疫苗及PBS作为对照组，进行腹腔注射免疫小鼠；
(2)攻毒保护实验，在第二次免疫后28天，对各组小鼠以1.0×108CFU，约2倍ID50的血清型为7型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒；
(3)ApfA蛋白抗血清体外抑菌实验，提取20μg/mlApfA组攻毒后存活的小鼠血清，稀释30倍与2.0×102CFU猪胸膜肺炎放线杆菌均匀涂抹于TSA+1ml 0.1g/100ml NAD+胎牛血清琼脂培养基平板上，同时设空白，即不添加抗血清平板作对照。
3.根据权利要求2所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述步骤(1)中每组10只小鼠，免疫剂量均为0.2ml，进行两次免疫，两次免疫间隔21天，在第二次免疫后14天，每组随机选取3只小鼠，采用尾静脉采血的方法收集血液，分离血清，ELISA法检测血清抗体效价。
4.根据权利要求2所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述步骤(1)中以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌市售三价灭活疫苗，含灭活的血清1型、2型和7型胸膜肺炎放线杆菌，按活菌计数法每种菌的CFU含量均≥5×108/ml。
5.根据权利要求2所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述步骤(2)中攻毒后隔6小时小时观察记录一次各组小鼠感染死亡情况及存活率。
6.根据权利要求2所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述步骤(3)于37℃培养24小时后，观察体外抑制猪胸膜肺炎放线杆菌生长情况。
7.根据权利要求2所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述菌毛ApfA抗原免疫特性检测还包括体外抑菌实验箱(1)，所述体外抑菌实验箱(1)内侧设置有培养基放置板架(2)，所述培养基放置板架(2)上方放置有培养基放置板(3)，所述培养基放置板(3)上方的中间位置设置有隔离突起板(4)，所述养基放置板(3)上开设有培养基放置槽(5)，所述体外抑菌实验箱(1)外侧转动连接有外门板(6)，所述外门板(6)中部设置有玻璃观察窗(7)。
8.根据权利要求7所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述外门板(6)位于靠近玻璃观察窗(7)下方的位置开设有透气孔(9)，所述体外抑菌实验箱(1)两侧壁上方的位置开设有孔槽(10)，所述孔槽(10)内设置有隔离网。
9.根据权利要求7所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述体外抑菌实验箱(1)边侧与外门板(6)边侧对应的位置设置有磁吸门贴(8)，所述体外抑菌实验箱(1)底部设置有防滑支撑脚座(11)。
10.根据权利要求7所述的一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原的免疫特性与应用，其特征在于：所述培养基放置板架(2)上开设有内滑槽，所述培养基放置板(3)底部对应内滑槽的位置设置有滑架，所述培养基放置板(3)的滑架放置在内滑槽内。
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