CN101015691B - 重组噬菌体流感疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学、疫苗学领域，是一种噬菌体展示的广谱流感疫苗，并进一步涉及噬菌体展示的广谱流感疫苗的制备方法。由于流感病毒高度变异，现有的流感疫苗不能提供针对不同型别的流感病毒的保护。本发明将高度保守的A型流感病毒包膜蛋白M的胞外区M2e编码基因和B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的部分编码基因插入T7噬菌体，构建成普适性的重组噬菌体流感疫苗，进一步制备成重组噬菌体流感微球疫苗。本疫苗经预防接种后，能同时提供对A型流感病毒不同亚型和B型流感病毒攻击的保护作用。

Description

重组噬菌体流感疫苗

本发明涉及一种流感疫苗，尤其涉及重组噬菌体流感疫苗，属于医学生物学技术领域。

背景技术

流感病毒具有高度的传染性，并能引起急性呼吸道疾病，它的流行特点是在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散发，发病率高并伴有一定的死亡率。造成流感反复流行的重要原因是：(1)由于流感基因的节段性，高突变率和频繁的基因重组造成免疫变异性大，特别是A型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的变异性大；(2)流感是人畜共患病，A型流感病毒在动物中存在着多种亚型，会直接引起人类流感；(3)由于微小突变使病毒表面糖蛋白产生小的变化，引起抗原漂移；(4)A型流感病毒的基因组由8个节段组成，当不同亚型同时感染时，会使病毒之间因基因重组而导致新亚型的出现。新亚型病毒出现时，会导致世界范围的大流行。

根据核蛋白和膜蛋白抗原差异，流感病毒分为A、B、C三型。A型流感病毒易感染人及禽、猪、马等多种动物，对人类威胁最大，曾引起人类历史上4次大流行。虽然A型流感病毒具有多个亚型，但是在人群中广泛流行的只有H1N1，H2N2和H3N2三个亚型；B型流感病毒主要感染人且致病力低，通常只造成局部流行；C型流感病毒仅引起人类上呼吸道轻微感染，很少造成流行。接种流感疫苗是预防流感及其并发症的主要手段。目前使用的流感疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。按WHO建议，现有国际上批准的疫苗有A型的2个亚型病毒H3N2、H1N1和1个B型病毒。

灭活疫苗主要是用鸡胚生产，在发达国家应用广泛，多年的临床应用表明，灭活疫苗的免疫效果基本上是肯定的，但存在以下几个问题：(1)通过预测生产的疫苗株与当前流行株不匹配；(2)流感疫苗的保护率与年龄相关，老年人免疫状态较低；(3)流感病毒主要侵袭呼吸道，目前普遍采用肌肉注射疫苗进行免疫，这种免疫方式不能有效诱导呼吸道粘膜的分泌，因而免疫效果不理想；(4)流感病毒在鸡胚上传代会发生抗原变异。此外，大部分鸡体内携带多种病毒，疫苗产品存在病毒污染的可能性。

流感病毒减毒活疫苗通过在25～26℃下鸡胚中连续传代得到减毒毒株，即冷适应株，这种病毒只能在25℃左右复制，不能在37℃复制，因此其感染只局限于上呼吸道，临床上无明显的流感症状。流感病毒减毒活疫苗的免疫效果优于灭活疫苗。但是冷适应株的获得需要较长时间，同时须通过实验来证实其遗传性是稳定的，不会出现返祖，加上流感病毒不断地发生抗原性变异，故常常尚未选用完冷适应株，其抗原性已过时。因此流感病毒减毒活疫苗至今仍处于研制阶段。

综上，由于目前使用的流感灭活疫苗存在的缺陷，WHO建议继续研究开发针对病毒保守蛋白(如M2)的新型疫苗。M2由流感病毒的一个RNA片段翻译而成，是一种包膜蛋白，位于病毒囊膜的表面并贯穿囊膜，其主要作用是构成氢离子通道，为病毒HA与细胞的结合提供酸性环境。M2e是M2的胞外区，长23个氨基酸残基，在不同亚型的人类A型流感病毒间高度保守(Science，2006，312：380-382)。英国的一家疫苗生产公司Acambis正在研制的广谱流感疫苗采用的主要组分就是M2e，希望通过M2e诱导抗所有A型流感病毒株的保护性免疫应答。美国专利(20060115489)将2～4个拷贝的M2e的编码基因插入乙肝核心抗原(HBc)嵌和体(chimer)编码基因的5’端，利用乙肝核心抗原形成病毒颗粒样结构的佐剂特性，增强M2e的免疫原性，提高抗M2e的抗体滴度。研究证实，M2蛋白能抵抗同一亚型或不同亚型流感病毒的攻击(Vaccine，2006，24：544-551)。

与高度变异的HA、NA抗原的作用机制不同，M2e不会诱导中和抗体的产生，针对M2e的抗体通过与感染细胞结合促进其清除，但是不会阻断病毒进入细胞，因而不会预防疾病的发生，M2e的免疫者仍然会感染流感病毒，体重会下降，但是存活率会显著提高(Nature Medicine，1999，5(10)：1157-1163)。

发明内容

为克服现有流感病毒变异率极高，流感疫苗存在的病毒污染、抗原性容易过时、免疫效果不理想等不足，本发明提供一种免疫力高，安全可靠的重组噬菌体流感疫苗。

本发明的技术方案是：一种重组噬菌体流感疫苗，其特征在于它由重组噬菌体制得，其中重组噬菌体由下列组分构建而成：将含有编码基因为atgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc的通用辅助性T细胞表位，编码基因为atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg的A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外区M2e的1～15氨基酸残基，编码基因为ggtccgggtccgggt的间隔子GPGPG以及编码基因为atgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg的B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸残基的融合蛋白插入T7噬菌体衣壳蛋白10B的C端，使融合蛋白展示在T7噬菌体的表面，融合蛋白的氨基酸序列为：

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met。

本发明提供的重组噬菌体流感疫苗通过下列方法制得：

A、构建重组噬菌体

(1)由商业公司合成一段DNA序列，DNA序列已装在pGEM-T载体上，DNA序列的5’端含有酶切位点EcoR I，3’端含有酶切位点EcoR V，各DNA序列编码如下：通用辅助性T细胞表位，编码基因为atgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc；A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外区M2e的1～15氨基酸残基，编码基因为atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg；间隔子GPGPG编码基因为ggtccgggtccgggt；B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸残基，编码基因为atgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttat cagctctccatttcatg；即该段DNA序列编码Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白；

(2)用限制性内切酶EcoR I、EcoR V将上述DNA序列从pGEM-T载体上切下后，插入T7噬菌体载体多克隆位点的EcoR I和EcoR V之间，正好位于T7噬菌体10B基因的3’端，得到重组噬菌体；

(3)用T7包装抽提物包装重组噬菌体，包装产物用平板扩增，用PCR的方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体表达10B-Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白，其中，Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白的氨基酸序列为：

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met；

B、重组噬菌体的制备

甘油冻存的E.coli BLT5403菌株在LB固体培养基(amp^r)平板上划线接种，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落，接种50ml M9TB培养基，37℃、250转/分振荡过夜；取2.5ml过夜培养物接种500ml LB液体培养基(amp^r)，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8。挑取平板上的单个噬斑，接种于OD₆₀₀＝0.6～0.8的LB液体培养基(amp^r)，37℃、50转/分培养1～3小时至菌液澄清并出现细丝状残片；按常规方法用PEG沉淀噬菌体；用噬菌体稀释液抽提沉淀，4℃、10000转/分离心15分钟，收集上清。按常规方法测定噬菌体滴度，噬菌体滴度按pfu/ml计数，数值上等于“噬斑数×稀释倍数×10”。用噬菌体稀释液调整重组噬菌体浓度为10¹⁴pfu/ml，按照1∶4000比例加入甲醛，37℃100转/分灭活4天后检测滴度为0，按1ml噬菌体溶液加入100μl NaHSO₃的比例中和残余甲醛；

C、制备重组噬菌体微球疫苗

用蒸馏水配制1％壳聚糖，110℃高压灭菌15分钟，使用时用高压灭菌的蒸馏水稀释成0.1％，在涡旋振荡下，按100μl 0.1％壳聚糖/1ml灭活重组噬菌体的比例将二者高速混合20秒～1分钟，逐滴加入柠檬酸三钠，使其成乳液状，计算噬菌体微球疫苗的浓度，用灭菌蒸馏水调整浓度为5×10¹³pfu/ml，得重组噬菌体微球疫苗。

所述编码基因为atgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc的通用辅助性T细胞表位为现有技术，发表在(J Immunol，2001，166(1)：481-489)。

所述编码基因为atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg的A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外区M2e的1～15氨基酸残基为现有技术，发表在(Journal of Virology，2005，79(11)：6644-6654)。

所述编码基因为ggtccgggtccgggt的间隔子GPGPG为现有技术，发表在(J Immunol，2002，168(11)：5499-5506)。

所述编码基因为atgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg的B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸残基为现有技术，发表在(GenBank AJ783395)。

所述限制性内切酶EcoRI、EcoR V购自大连宝生物工程公司。

所述T7噬菌体载体购自Novagen公司。

所述T7包装抽提物购自Novagen公司。

所述甘油冻存的E.coli BLT5403购自Novagen公司。

本发明解决的技术难点是：A、如何克服A型流感高突变率和因频繁的基因重组而造成免疫变异性大的难点，研制开发针对病毒保守蛋白的新型疫苗。由于A型流感病毒的包膜蛋白M的胞外区M2e具有的高度保守性，B型流感病毒之间的BM2蛋白同样具有高度保守性，并且与A型流感病毒的M2蛋白之间没有明显的同源性，两种蛋白均为跨膜蛋白，在感染细胞膜上大量存在，因此用这两种蛋白作为疫苗进行接种可有效抵抗所有流感病毒株。B、由于噬菌体展示技术具有下列独特优势：(1)噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；(2)噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；(3)噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应。(4)由于噬菌体颗粒是由感染的细菌细胞分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产疫苗用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗；(5)纯化简单、花费少；(6)噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。因此，由于应用噬菌体展示技术研究基因工程疫苗具有以上的优点，弥补了传统疫苗和其它基因工程疫苗产量不高、纯化复杂等缺陷。使M2e_(1～15)和BM2_(1～21)展示在T7噬菌体的表面，进一步制备重组噬菌体微球疫苗，利用T7噬菌体具有的病毒样颗粒的佐剂特性，有效增强M2e、BM2特异性的免疫应答。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：(1)本发明利用噬菌体具有的病毒样颗粒的佐剂特性，用T7噬菌体作载体制备的重组噬菌体流感疫苗能同时提供对人类A型流感病毒不同亚型和B型流感病毒的保护作用，具有普适性，因而应用范围更广；(2)由于T7噬菌体易于生产、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，因此，本发明制备的重组噬菌体流感疫苗便于大规模生产、成本低廉。

本发明经动物试验，其结果如下：

1、重组噬菌体微球疫苗免疫豚鼠

流感疫苗的研究多采用小鼠进行实验。但最新的研究发现(PNAS，2006，103(26)：9988-9992)，与小鼠不同，流感病毒能在豚鼠的上呼吸道以及下呼吸道复制，在豚鼠的鼻腔分泌物中检测到大量流感病毒，说明豚鼠更加敏感，是研究流感疫苗保护效果的更理想的动物模型。基于此，本发明的发明人采用豚鼠进行以下的重组噬菌体微球疫苗鼻腔免疫实验。豚鼠分组，每组5只。豚鼠经乙醚轻度麻醉后，滴鼻免疫重组噬菌体流感微球疫苗作为疫苗组，对照组滴鼻免疫T7噬菌体空载体，免疫剂量均为0.5×10¹³pfu/次，体积是400μl/只。隔周免疫1次，共免疫3次。

2、攻毒及疫苗保护效果检测

末次免疫后2周，用WHO推荐的流感疫苗组分即H1N1 A型流感病毒、H3N2A型流感病毒和1个型别B型流感病毒进行攻击。攻击途径都是滴鼻，剂量采用文献报道的豚鼠的感染剂量10³pfu(PNAS，2006，103(26)：9988-9992)。

攻击后隔天给豚鼠称重并检测豚鼠鼻腔、肺部的病毒滴度。鼻腔病毒滴度检测的具体作法是在豚鼠鼻腔中滴加1ml PBS缓冲液，用平皿收集鼻腔清洗液，转到1.5ml Eppendorf管中，4℃ 2,000g离心5分钟，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度检测。肺部病毒滴度检测的具体作法是处死豚鼠，打开胸腔，摘取全肺，分别将各小鼠肺置匀浆器中加生理盐水，肺重(g)∶生理盐水(ml)＝1∶9，研磨制成匀浆，4℃ 12,000g离心10分钟，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度检测。病毒滴度检测是通过10倍系列稀释把病毒接种于MDCK细胞，进行噬斑检测。

附图说明

图1为感染H1N1后豚鼠的体重变化。

图2为感染H1N1后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度。

图3为感染H3N2后豚鼠的体重变化。

图4为感染H3N2后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度。

图5为感染B型流感病毒后豚鼠的体重变化。

图6感染B型流感病毒后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度。

本发明解决了流感病毒变异率极高，现有流感疫苗效果不理想的问题，本发明制备的重组噬菌体流感疫苗能同时提供对人类A型流感病毒不同亚型(H1N1、H3N2)以及B型流感病毒的保护作用，其结果如下(附图中每个时间点的数据均采用几何平均值±标准差，统计分析采用SPSS11.0软件)：(一)重组噬菌体流感疫苗对感染A型流感病毒H1N1的豚鼠的保护效果

1、感染A型流感病毒H1N1后豚鼠的体重变化

从图1可以看出，感染A型流感病毒H1N1后，免疫重组噬菌体流感微球疫苗的豚鼠(疫苗组)和免疫噬菌体空载体的豚鼠(对照组)体重均逐渐上升，并且两组在同一天检测的体重没有显著差异，P＞0.05。这一结果说明，豚鼠的体重变化不受流感病毒感染的影响，该结果与文献报道的一致(PNAS，2006，103(26)：9988-9992)。

2、感染A型流感病毒H1N1后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度

从图2可以看出，感染A型流感病毒H1N1后，免疫重组噬菌体流感微球疫苗的豚鼠(疫苗组)与免疫噬菌体空载体的豚鼠(对照组)鼻腔清洗液的病毒滴度均在第3天时达到最高，分别为5.39±0.86、6.27±0.49，两组之间差异显著，P＜0.05，说明重组噬菌体流感微球疫苗有效保护了免疫豚鼠，使A型流感病毒H1N1在上呼吸道的增殖减弱。3天后鼻腔清洗液的病毒滴度逐渐下降，在第11天时两组均检测不到病毒。

感染A型流感病毒H1N1后，疫苗组肺匀浆与对照组肺匀浆的病毒滴度在第1天时分别为2.18±0.31、3.09±0.5，两组之间差异显著，P＜0.05；并且两组在第3天时均达到最高，分别为3.58±0.64、4.28±0.65，两组之间差异显著，P＜0.05，说明重组噬菌体流感微球疫苗有效保护了免疫豚鼠，使A型流感病毒H1N1在肺部的增殖减弱。在第5天时两组均检测不到病毒。

(二)重组噬菌体流感疫苗对感染A型流感病毒H3N2的豚鼠的保护效果

1、感染A型流感病毒H3N2后豚鼠的体重变化

从图3可以看出，感染A型流感病毒H3N2后，免疫重组噬菌体流感微球疫苗的豚鼠(疫苗组)和免疫噬菌体空载体的豚鼠(对照组)体重均逐渐上升，并且两组在同一天检测的体重没有显著差异，P＞0.05。

2、感染A型流感病毒H3N2后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度

从图4可以看出，感染A型流感病毒H3N2后，免疫重组噬菌体流感微球疫苗的豚鼠(疫苗组)与免疫噬菌体空载体的豚鼠(对照组)鼻腔清洗液的病毒滴度在第1天时分别为4.04±0.66、5.35±0.44，两组之间差异显著，P＜0.05；并且两组在第3天时均达到最高，分别为4.77±0.58、5.82±0.51，两组之间差异显著，P＜0.05，说明重组噬菌体流感微球疫苗有效保护了免疫豚鼠，使A型流感病毒H3N2在上呼吸道的增殖减弱。3天后鼻腔清洗液的病毒滴度逐渐下降，在第11天时两组均检测不到病毒。

感染A型流感病毒H3N2后，疫苗组肺匀浆与对照组肺匀浆的病毒滴度在第1天时分别为2.25±0.41、3.43±0.66，两组之间差异显著，P＜0.05；并且两组在第3天时均达到最高，分别为4.11±0.74、4.79±0.82，两组之间差异显著，P＜0.05，说明重组噬菌体流感微球疫苗有效保护了免疫豚鼠，使A型流感病毒H3N2在肺部的增殖减弱。在第5天时两组均检测不到病毒。

(三)重组噬菌体流感疫苗对感染B型流感病毒的豚鼠的保护效果

1、感染B型流感病毒后豚鼠的体重变化

从图5可以看出，感染B型流感病毒后，免疫重组噬菌体流感微球疫苗的豚鼠(疫苗组)和免疫噬菌体空载体的豚鼠(对照组)体重均逐渐上升，并且两组在同一天检测的体重没有显著差异，P＞0.05。

2、感染B型流感病毒后豚鼠鼻腔和肺部的病毒滴度

从图6可以看出，感染B型流感病毒后，免疫重组噬菌体流感微球疫苗的豚鼠(疫苗组)与免疫噬菌体空载体的豚鼠(对照组)鼻腔清洗液的病毒滴度在第1天时分别为4.07±0.31、4.62±0.52，两组之间差异显著，P＜0.05；并且两组在第3天时均达到最局，分别为4.94±0.46、6±0.41，两组之间差异显著，P＜0.05，说明重组噬菌体流感微球疫苗有效保护了免疫豚鼠，使B型流感病毒在上呼吸道的增殖减弱。3天后鼻腔清洗液的病毒滴度逐渐下降，在第11天时两组均检测不到病毒。

感染B型流感病毒后，疫苗组肺匀浆与对照组肺匀浆的病毒滴度在第1天时分别为2.22±0.36、3.52±0.69，两组之间差异显著，P＜0.05；并且两组在第3天时均达到最高，分别为3.66±0.62、4.89±0.44，两组之间差异显著，P＜0.05，说明重组噬菌体流感微球疫苗有效保护了免疫豚鼠，使B型流感病毒在肺部的增殖减弱。在第5天时两组均检测不到病毒。

具体实施方式

下面结合实施对本发明做进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。

实施例1

A、构建重组噬菌体

由商业公司合成一段DNA序列，DNA序列已装在pGEM-T载体上，DNA序列的5’端含有酶切位点EcoR I，3’端含有酶切位点EcoR V，DNA序列编码以下的多肽：通用辅助性T细胞表位，编码基因为atgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc；A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外区M2e的1～15氨基酸残基，编码基因为atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg；间隔子GPGPG，编码基因为ggtccgggtccgggt；以及B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸残基，编码基因为atgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg；即该段DNA序列编码Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白。

用限制性内切酶EcoR I和EcoR V处理重组的pGEM-T载体，得到含有EcoR I和EcoR V粘性末端的上述DNA序列；将DNA序列插入T7噬菌体载体T7 Select 10-3b载体多克隆位点的EcoR I和EcoR V之间，正好位于T7噬菌体10B基因的3’端，得到重组噬菌体。

重组pGEM-T载体双酶切体系：

10×H Buffer                 10μl

EcoR I                       5μl

EcoR V                    5μl

重组pGEM-T载体            80μl

总体积                    100μl

37℃水浴60分钟，1％琼脂糖凝胶电泳、用小量胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)回收目的片段。

T7噬菌体载体双酶切体系：

10×H Buffer                2μl

EcoR I                      1μl

EcoR V                      1μl

T7 Select 10-3b             5μl

ddH₂O                       11μl

总体积                      20μl

37℃水浴60分钟，用小量胶回收试剂盒，按DNA片段纯化的操作回收载体。

连接反应体系：

T7 Select 10-3b的回收产物            0.5μl

DNA片段的回收产物                    2μl

Solution I(购自大连宝生物工程公司)   2.5μl

总体积                               5μl

室温连接过夜。

重组噬菌体的包装：

连接产物                             5μl

T7 Packaging Extracts                25μl

总体积                               30μl

室温包装2小时后在反应体系中加入270μl LB培养基终止。

包装产物的平板扩增：

100μl包装反应物与250μl新鲜过夜培养的BLT5403菌液(OD₆₀₀＝1.0)混匀后，迅速与5ml融化后42℃温浴的上层琼脂混合均匀并铺平板，平板静置至上层琼脂凝固后，37℃培养至形成噬斑。

挑取噬斑，用PCR筛选阳性重组噬菌体。重组噬菌体表达10B-Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白。

B、重组噬菌体的大量制备

甘油冻存的E.coli BLT5403菌株在LB固体培养基(amp^r)平板上划线接种，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落，接种50ml M9TB培养基，37℃、250转/分振荡过夜；取2.5ml过夜培养物接种500ml LB液体培养基(amp^r)，培养至OD₆₀₀＝0.6。挑取平板上的单个噬斑，接种于OD₆₀₀＝0.6的LB液体培养基(amp^r)，37℃、50转/分培养2小时至菌液澄清并出现细丝状残片；按常规方法用PEG沉淀噬菌体；用噬菌体稀释液抽提沉淀，4℃、10000转/分离心15分钟，收集上清。按常规方法测定噬菌体滴度，噬菌体滴度按pfu/ml计数，数值上等于“噬斑数×稀释倍数×10”。用噬菌体稀释液调整重组噬菌体浓度为10¹⁴pfu/ml，按照1∶4000比例加入甲醛，37℃100转/分灭活4天后检测滴度为0，按1ml噬菌体溶液加入100μl NaHSO₃的比例中和残余甲醛。

C、制备重组噬菌体微球疫苗

用蒸馏水配制1％壳聚糖，110℃高压灭菌15分钟，使用时用高压灭菌的蒸馏水稀释成0.1％。在涡旋振荡下，按100μl 0.1％壳聚糖/1ml灭活重组噬菌体的比例将二者高速混合40秒，逐滴加入柠檬酸三钠，使其成乳液状。计算噬菌体微球疫苗的浓度，用灭菌蒸馏水调整浓度为5×10¹³pfu/ml。

D、重组噬菌体微球疫苗免疫豚鼠

豚鼠分组，每组5只。豚鼠经乙醚轻度麻醉后，取15组滴鼻免疫重组噬菌体流感微球疫苗作为疫苗组，另外15组滴鼻免疫T7噬菌体空载体作为对照组，免疫剂量均为0.5×10¹³pfu/次，体积是400μl/只。隔周免疫1次，共免疫3次。

E、攻毒及疫苗保护效果检测

末次免疫后2周，用WHO推荐的流感疫苗组分即H1N1 A型流感病毒、H3N2A型流感病毒和1个型别B型流感病毒进行攻击。所有豚鼠经乙醚轻度麻醉后，疫苗组取5组用H1N1流感病毒攻击，5组用H3N2流感病毒攻击，5组用B型流感病毒攻击；同样，对照组取5组用H1N1流感病毒攻击，5组用H3N2流感病毒攻击，5组豚鼠用B型流感病毒攻击。攻击途径都是滴鼻，剂量采用豚鼠的感染剂量10³pfu。

攻击后隔天给豚鼠称重并检测豚鼠鼻腔、肺部的病毒滴度。鼻腔病毒滴度检测的具体作法是在豚鼠鼻腔中滴加1ml PBS缓冲液，用平皿收集鼻腔清洗液，转到1.5ml Eppendorf管中，4℃2,000g离心5分钟，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度检测。肺部病毒滴度检测的具体作法是处死豚鼠，打开胸腔，摘取全肺，分别将各小鼠肺置匀浆器中加生理盐水，肺重(g)∶生理盐水(ml)＝1∶9，研磨制成匀浆，4℃12,000g离心10分钟，收集上清，保存于-80℃冰箱，用于病毒滴度检测。病毒滴度检测是通过10倍系列稀释把病毒接种于MDCK细胞，进行噬斑检测。

噬菌体展示的广谱流感疫苗表达的Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白的氨基酸序列如下：

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met

通用辅助性T细胞表位的编码基因：

atgcaataca taaaagccaa ctcgaagttc ataggaataa cggaactc

A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外区M2e的1～15氨基酸残基编码基因：

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgccg ataaggaacg ag

间隔子GPGPG编码基因：

ggtccgggtc cgggt

B型流感病毒BM2的1～21氨基酸残基编码基因：

atgctcgaac catttcagat tctttcaatt tgttctttta tcttatcagc tctccatttc  60

atg                                                                63

序列表

<110>中国医学科学院医学生物学研究所

<120>重组噬菌体流感疫苗

<130>疫苗开发

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>48

<212>DNA

<213>人工基因序列

<400>1

atgcaataca taaaagccaa ctcgaagttc ataggaataa cggaactc               48

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工基因序列

<400>2

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgccg ataaggaacg agtgg                  45

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工基因序列

<400>3

ggtccgggtc cgggt                                                   15

<210>4

<211>63

<212>DNA

<213>人工基因序列

<400>4

atgctcgaac catttcagat tctttcaatt tgttctttta tcttatcagc tctccatttc  60

atg                                                                63

<210>5

<211>171

<212>DNA

<213>人工基因序列

<400>5

atgcaataca taaaagccaa ctcgaagttc ataggaataa cggaactcat gagtcttcta  60

accgaggtcg aaacgccgat aaggaacgag tggggtccgg gtccgggtat gctcgaacca  120

tttcagattc tttcaatttg ttcttttatc ttatcagctc tccatttcat g           171

<210>6

<211>16

<212>PRT

<213>基因表达

<400>6

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1               5                   10                  15

<210>7

<211>15

<212>PRT  

<213>基因表达

<400>7

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

1               5                   10                  15

<210>8

<211>5

<212>PRT

<213>基因表达

<400>8

Gly Pro Gly Pro Gly

1               5

<210>9

<211>21

<212>PRT

<213>基因表达

<400>9

Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser

1               5                   10                  15

Ala Leu His Phe Met

            20

<210>10

<211>57

<212>PRT

<213>基因表达

<400>10

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1               5                   10                  15

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

            20                  25                  30

Pro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser

        35                  40                  45

Phe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met

    50                  55

Claims (3)

1.一种重组噬菌体流感疫苗，其特征在于它由重组噬菌体制得，其中重组噬菌体由下列组分构建而成：将含有编码基因为atgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc的通用辅助性T细胞表位，编码基因为atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg的A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外区M2e的1～15氨基酸残基，编码基因为ggtccgggtccgggt的间隔子GPGPG以及编码基因为atgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg的B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸残基的融合蛋白插入T7噬菌体衣壳蛋白10B的C端，使融合蛋白展示在T7噬菌体的表面，融合蛋白的氨基酸序列为：

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met。

2.根据权利要求1所述的重组噬菌体流感疫苗，其特征在于通过下列方法制得：

A、重组噬菌体

(1)由商业公司合成一段DNA序列，DNA序列已装在pGEM-T载体上，DNA序列的5’端含有酶切位点EcoR I，3’端含有酶切位点EcoR V，各DNA序列编码如下：通用辅助性T细胞表位，编码基因为atgcaatacataaaagccaactcgaagttcataggaataacggaactc；A型流感病毒高度保守的包膜蛋白M的胞外区M2e的1～15氨基酸残基，编码基因为atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgccgataaggaacgagtgg；间隔子GPGPG，编码基因为ggtccgggtccgggt；B型流感病毒高度保守的包膜蛋白BM2的1～21氨基酸残基，编码基因为atgctcgaaccatttcagattctttcaatttgttcttttatcttatcagctctccatttcatg；即该段DNA序列编码Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白；

(2)用限制性内切酶EcoR I、EcoR V将上述DNA序列从pGEM-T载体上切下后，插入T7噬菌体载体多克隆位点的EcoR I和EcoR V之间，正好位于T7噬菌体10B基因的3’端，得到重组噬菌体；

(3)用T7包装抽提物包装重组噬菌体，包装产物用平板扩增，用PCR的方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体表达10B-Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白，其中，Th-M2e_(1～15)-间隔子-BM2_(1～21)融合蛋白的氨基酸序列为：

Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu LeuMet Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp GlyPro Gly Pro Gly Met Leu Glu Pro Phe GlnIle Leu Ser Ile Cys SerPhe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe Met；

B、重组噬菌体的制备

甘油冻存的E.coli BLT5403菌株在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上划线接种，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落，接种50ml M9TB培养基，37℃、250转/分振荡过夜；取2.5ml过夜培养物接种500ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，挑取平板上的单个噬斑，接种于OD₆₀₀＝0.6～0.8的含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、50转/分培养1～3小时至菌液澄清并出现细丝状残片；按常规方法用PEG沉淀噬菌体；用噬菌体稀释液抽提沉淀，4℃、10000转/分离心15分钟，收集上清，按常规方法测定噬菌体滴度，噬菌体滴度按pfu/ml计数，数值上等于“噬斑数×稀释倍数×10”，用噬菌体稀释液调整重组噬菌体浓度为10¹⁴pfu/ml，按照1∶4000比例加入甲醛，37℃100转/分灭活4天后检测滴度为0，按1ml噬菌体溶液加入100μl NaHSO₃的比例中和残余甲醛；

C、制备重组噬菌体微球疫苗

用蒸馏水配制1％壳聚糖，110℃高压灭菌15分钟，使用时用高压灭菌的蒸馏水稀释成0.1％，在涡旋振荡下，按100μl 0.1％壳聚糖/1ml灭活重组噬菌体的比例将二者高速混合20秒～1分钟，逐滴加入柠檬酸三钠，使其成乳液状，计算噬菌体微球疫苗的浓度，用灭菌蒸馏水调整浓度为5×10¹³pfu/ml，得重组噬菌体微球疫苗。

3.权利要求2所述的重组噬菌体流感疫苗，其特征在于所述的T7噬菌体载体为T7 Select 10-3b。

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