CN101402687B - 一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用。该融合蛋白，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白质；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(a)衍生的蛋白质。动物实验表明，融合蛋白S1-M2e3能有效的刺激针对M2e的特异性免疫应答，仅加强免疫一次，IgG1/IgG2a GMT值就可达到1：100,000/1：4525，S1-M2e3可用于制备禽流感疫苗。

Description

一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用。

背景技术

表位肽研究已经在疫苗学领域得到了越来越广泛的应用。但其免疫原性低，免疫效果差也是亟待解决的问题。使用适当的佐剂是最有效的解决办法。对于蛋白类佐剂效应分子来说，一种解决方法就是构建表位肽-佐剂分子的融合蛋白。James WH将TLR(Toll样受体)5配体鞭毛蛋白基因(STF2)融合于OVA蛋白基因5’端在大肠杆菌中表达为STF2-OVA融合蛋白，这种新型蛋白使OVA蛋白的免疫原性得到明显增强。

活化相关的分泌蛋白-1(ASP-1)是一种来源于盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)的蛋白。来自禽流感病毒H5N1的膜蛋白M2的外膜区M2e，由24个氨基酸组成，其免疫原性非常低。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较高免疫原性的融合蛋白。

本发明所提供的融合蛋白，名称为S1-M2e3，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白质；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白质；

所述抗原表位肽(名称为M2e3)是如下(c)或(d)的蛋白质：

(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(c)衍生的蛋白质。

所述融合蛋白具体可为如下(1)或(2)的蛋白质：

(1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(1)衍生的蛋白质。

为了使(a)和(1)中的蛋白便于纯化，可在其N末端或C末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

 

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)和(2)中的S1的编码基因可通过将(a)和(1)中的蛋白编码基因的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述蛋白的氨基末端添加上信号肽序列。

上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

其中，所述S1的编码基因，具体可为如下3)或4)的基因：

3)其编码序列是序列表中的序列4；

4)在严格条件下可与3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。

所述抗原表位肽(名称为M2e3)的编码基因，具体可为如下5)或6)的基因：

5)其编码序列是序列表中的序列5。

6)在严格条件下可与5)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。

所述融合蛋白的编码基因，具体可为如下7)或8)的基因：

7)其编码序列是序列表中的序列6。

8)在严格条件下可与7)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。

含有上述任一种融合蛋白的编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为在pQE30的多克隆位点间插入上述任一种融合蛋白的编码基因得到的pQE30-S1-M2e3。

所述重组菌具体可为将所述pQE30-S1-M2e3转入大肠杆菌M15得到的重组大肠杆菌。

本发明还提供了一种表达所述S1-M2e3的方法。

本发明所提供的表达所述S1-M2e3的方法，是将含有所述S1-M2e3编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到所述蛋白。

所述重组表达载体具体可为上述pQE30-S1-M2e3，所述宿主细胞具体可为将所述pQE30-S1-M2e3转入大肠杆菌M15得到的重组大肠杆菌细胞。

本发明还优化了S1-M2e3的纯化方法。

本发明通过分子生物学的方法构建了N端融合串联有3个M2e肽的融合蛋白S1-M2e3。动物实验表明，S1-M2e3能有效地刺激针对M2e的特异性免疫应答，仅加强免疫一次，IgG1/IgG2a GMT值就可达到1：100,000/1：4525。所以S1-M2e3可作为禽流感疫苗的活性成分，在禽流感的预防和治疗中将发挥重要作用。

附图说明

图1为pQE30-S1的酶切鉴定图谱

图2为pQE30空载体对照的SDS-PAGE鉴定图

图3为S1-M2e3的SDS-PAGE鉴定图

图4为纯化S1-M2e3蛋白Ni-FF吸附洗脱与复性图

1.Marker

2.过柱纯化前原液

3.10mM咪唑缓冲液洗脱

4.20mM咪唑缓冲液洗脱

5.50mM咪唑缓冲液洗脱

6.100mM咪唑缓冲液洗脱

7.200mM咪唑缓冲液洗脱

8.复性后

图5为加强免疫后第8天，各组免疫血清中抗M2e特异性IgG1产生情况

图6为加强免疫后第8天，各组免疫血清中抗M2e特异性IgG2a产生情况

具体实施方式

实施例1、融合蛋白S1-M2e3的表达及鉴定

一、融合蛋白S1-M2e3的表达载体pQE30-S1-M2e3的构建

1、S1表达载体pQE30-S1的构建

根据大肠杆菌的偏爱密码子，人工合成序列表中序列4所示的S1(其氨基酸序列是序列表中的序列1)的编码基因(序列4的自5′末端第17-610位(共594个核苷酸)为S1的编码序列，序列1的自5′末端第11-16位为BamHI的识别位点，序列1的自5′末端第611-616位为HindIII的识别位点。

以BamHI和HindIII双酶切S1的编码基因，与经相同酶切的pQE30(QIAGEN)连接，并转化大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene公司)感受态细胞，挑选氨苄青霉素抗性克隆，经菌落PCR及提取质粒双酶切(BamHI和HindIII)鉴定，将鉴定正确的该重组质粒命名为pQE30-S1。pQE30-S1的酶切鉴定图谱如图1所示，得到3.4kb的载体带和594bp的S1条带(箭头示)。图1中，1为pQE30-S1，2为DL Marker 2,000。

2、pQE30-S1-M2e3的构建

人工合成序列表中序列5所示的M2e3(其氨基酸序列是序列表中的序列2)的编码基因(序列5的自5′末端第15-275位(共261个核苷酸)为M2e3的编码序列，序列5的自5′末端第9-14位为限制性内切酶BglII的识别位点，序列5的自5′末端第270-275位为限制性内切酶BamHI的识别位点。

以BglII和BamHI双酶切M2e3的编码基因，回收261bp片段与BamHI单酶切的pQE30-S1载体连接，转化XL1-Blue感受态细胞，得到重组质粒。对重组质粒进行PCR鉴定和序列测定，将含有核苷酸序列是序列表中的序列6的S1-M2e3基因的重组质粒命名为pQE30-S1-M2e3。该S1-M2e3基因编码氨基酸序列是序列表中的序列3的融合蛋白S1-M2e3。

3、融合蛋白S1-M2e3在原核表达系统中的表达和纯化及复性。

1)S1-M2e3的诱导表达

将pQE30-S1-M2e3转入大肠杆菌M15(QIAGEN公司)，得到重组大肠杆菌pQE30-S1-M2e3/M15。将pQE30(空质粒)转入大肠杆菌M15得到重组大肠杆菌pQE30/M15，作为阴性对照组。从阳性重组质粒表达菌(pQE30-S1-M2e3/M15)及阴性对照菌(pQE30/M15)挑取若干转化子分别接种3ml LB培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素及50μg/ml卡那霉素)，37℃振荡培养过夜，将菌液以1：100的体积比转接于LB培养基中，37℃震荡培养3h，至0D₆₀₀在0.5-1.0之间。加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃诱导5小时取样；同时设置未用IPTG进行诱导表达的对照。同时收集菌体，以超声缓冲液悬浮后超声破碎，以8M尿素溶解包涵体，对超声上清及包涵体分别取样，SDS-PAGE鉴定。

2)S1-M2e3表达的SDS-PAGE鉴定

取pQE30-S1-M2e3/M15的诱导表达菌液及未诱导表达菌液各1.5ml，pQE30/M15的诱导表达菌液及未诱导表达菌液各1.5ml。分别移入1.5ml EP管，12000rpm，离心1min，弃上清，用生理盐水洗涤后，加入100μl 1×SDS上样缓冲液，混匀，100℃煮沸10min，自然冷却后，12000rpm，离心1min，取10μl上清(约40μg)上样于凝胶加样孔内。分离胶浓度为12％，积层胶浓度为5％。按积层胶100mA及分离胶150mA的条件进行电泳，溴酚蓝移动至胶底部终止电泳。电泳完毕后，考马斯亮蓝染色观察。结果如图2和图3所示，图2中，1泳道为pQE30/M15诱导表达组；2泳道为pQE30/M15未诱导组；3泳道为蛋白Marker。图3中，1泳道为pQE30-S1-M2e3/M15诱导表达组；2泳道为pQE30-S1-M2e3/M15未诱导组；3泳道为蛋白Marker。表明pQE30-S1-M2e3/M15表达得到了大小为31kDa的S1-M2e3，而pQE30/M15不表达大小为31kDa的S1-M2e3。

3)S1-M2e3表达形式的鉴定

A、细菌包涵体的分离和洗涤

将pQE30-S1-M2e3/M15诱导表达的菌液于4℃以5000g离心15min后，收集菌体，将菌体用含30％蔗糖、50mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA pH8.0的溶液重悬，冰浴30min。然后于4℃5000rpm离心10min，沉淀用含100mmol/LTris-HCl、2mmol/LEDTA pH8.0的超声缓冲液重悬，超声破碎仪冰浴破碎(功率100W，超声时间8s，间歇10s，总程10min)，4℃12000rpm离心10min，获得超声上清液和粗制包涵体沉淀。将分离得到的包涵体依次用包涵体洗液I(TritonX-1000.5％，EDTA 10mmol/L)，II(TritonX-10010％，EDTA 10mmol/L)，III(EDTA 10mmol/L，尿素2M)分别重悬，4℃ 12000rpm离心20min，最后剩下的沉淀进一步进行变性处理。

将超声上清液进行电泳鉴定，电泳结果如图3中4泳道所示，表明S1-M2e3不是可溶性表达，不存在于菌体超声上清中。

B、包涵体的变性

将洗涤完毕的包涵体用含8M尿素的缓冲液B(每升中含NaH₂PO₄·2H₂O 15.6g，Tris碱1.2g，尿素480.5g，用NaOH调至pH8.0)重悬，磁力搅拌器搅拌2h，4℃ 12000rpm离心20min，保留上清，取样处理后，电泳鉴定。包涵体的电泳结果如图3中5泳道所示，表明S1-M2e3以包涵体形式表达。

4)S1-M2e3的纯化

pQE载体表达蛋白带有组氨酸标签，利用这一特性可以采用Ni亲和层析的方法进行纯化，具体操作按照Ni-FF说明书进行，简述如下：镍琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积为2ml，用缓冲液1平衡2-5个床体积，上样，流速为1ml/min，用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2ml/min，再分别用含10、20、50、100、200、300mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱液，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度，最后用纯水流洗5个柱床体积，再用20％的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4℃环境中保存。

其中，镍亲和层析缓冲液组成：

缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄81ml，NaCl 29.3g，加适量水溶解后定容到1000ml。

缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄ 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g，加适量水溶解后定容到1000ml。

不同咪唑浓度的缓冲液3的组成如表2所示：

表2、缓冲液3的组成

 

咪唑浓度	缓冲液1量(ml)	缓冲液2量(ml)
			10mM	98	2
20mM	96	4
			50mM	90	10
100mM	80	20
			200mM	60	40
300mM	40	60

S1-M2e3蛋白经过Ni-FF时大部分被吸附至柱上，经过含低浓度的洗涤缓冲液洗涤(20mM，50mM)，自100mM洗脱缓冲液后即获得较纯的S1-M2e3蛋白(图4中的6-7泳道)。

5)抗M2e兔多克隆抗血清的制备

用人工合成的多肽M2e(MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD)进行抗体制备：多肽100μg/只/次，初次免疫与弗氏完全佐剂等体积混匀，充分乳化，总体积2ml，背部皮下多点注射免疫兔子。每1个月加强一次，共加强两次，加强时换用弗氏不完全佐剂。末次免疫后2周静脉采血，ELISA法测定血清中抗体产生效价。其中，以5μg/ml的多肽M2e包被酶标板。效价达到1：200,000以上则可采用颈动脉放血的方式收集兔血，分离血清，-20℃保存。

6)表达蛋白的ELISA鉴定：用纯化的S1-M2e3蛋白包被(5μg/ml)，用常规间接ELISA检测抗M2e多抗血清(1：20000、1：40000和1：100000稀释)，对照用正常兔血清，结果该重组蛋白只与M2e多抗血清反应。

7)表达蛋白S1-M2e3的复性

采用透析法进行复性：配制含梯度尿素浓度(6M，4M)及5％甘油，0.1M Tris，2mMEDTA，1％甘氨酸的复性液，进行梯度透析；然后透析至laemmli buffer(25mMTris，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3)，最后透析至0.01M、pH7.4的PBS溶液中。每种浓度的透析时间6h，全部过程在4℃进行。透析结束后，蛋白溶液12000rpm离心10min，收集上清，取样电泳鉴定，结果如图4中的8泳道，表明复性后获得了高纯度的S1-M2e3。

包涵体一般含有50％以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、膜蛋白、质粒DNA，以及磷脂、脂多糖等。可以通过洗涤等方法提高包涵体中重组蛋白的纯度，从而方便后续的变复性操作，提高复性率。根据《分子克隆》及参考崔建武等提供的菌体破碎及包涵体洗涤收集方案，结合实际操作经验，对S1-M2e3表达系统摸索出如下的分离洗涤方案：先以30％蔗糖高渗溶液对菌体预处理，在进行超声破碎，与直接进行超声破碎相比，前者的破碎效果较好。对包涵体先用含10mM EDTA和分别含0.5％/10％的Triton-X-100的包涵体洗液I和II洗涤，温和去垢剂TritonX-100洗涤能去除膜碎片和膜蛋白。再以含2M尿素的包涵体洗液III洗涤，这种方案能洗去较多杂质，提高包涵体的纯度，洗涤过程中包涵体蛋白也能保持稳定，未见降解。在包涵体中，重组蛋白处于错误折叠的状态，二硫键大部分也是错搭的。要获得正确折叠的蛋白首先是溶解包涵体，使蛋白变性。变性即破坏非共价键。常用5-6M的盐酸胍或6-8的尿素。本实验采用8M尿素溶解包涵体，溶解性良好，无需加入还原剂等其他成分助溶。

获得较高纯度的包涵体后再经过镍亲和层析纯化，得到纯度>85％的目的蛋白。在摸索纯化的条件时，表达的S1-M2e3虽然带有His标签，亲和能力并不强，经过Ni-FF柱时吸附比例较少，用50mM洗涤缓冲液洗涤时就有部分目的蛋白连同杂蛋白被洗脱下来，因此会造成最后获得纯品的损失。最终目的蛋白在100-200mM咪唑浓度下被洗脱。

变性蛋白纯度越高越有利于复性，在通过上述方法获得高纯度目的蛋白后，开始摸索复性条件。蛋白复性过程是除去变性剂及还原剂，给变性的蛋白分子提供正确的再折叠及恢复活性的环境，重新获得天然的活性蛋白的过程。透析是实验室最常用的方法。透析复性最关键的是低浓度和平缓梯度。待复性蛋白的起始浓度一般为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定；变性剂浓度(比如尿素)要平缓降低，逐步透析到正常，使蛋白质能够正确折叠。复性液的成分也很重要，一定浓度的Tris和金属离子螯合剂EDTA，以抑制某些蛋白酶的作用减少降解，增加目的蛋白的稳定性；一定浓度的甘油能增加黏度，减少分子碰撞机会；一定浓度的甘氨酸也有助于蛋白的复性。在摸索复性条件时，发现虽然添加了上述多种有助于复性的成分，在尿素浓度从4M降至2M时，蛋白极易产生大量沉淀，复性未获成功。将包涵体蛋白从4M尿素浓度直接透析至含有0.1％的SDS的laemmili buffer中，再透析至PBS，在此过程中，蛋白虽然还是有沉淀析出，但上清中尚能保留较多可溶性成分。低浓度的SDS也有助于蛋白的复性，但由于SDS具有一定的毒性，而在此后的透析过程中很难被除去，因此并不推荐使用，然而这样获得的蛋白制品用于动物实验还是可行的。

实施例2、S1-M2e3的免疫实验

材料

RPMI-1640培养基、胎牛血清为Gibco/BRL公司产品；羊抗鼠IgG-HPR酶标抗体购自北京中杉公司，羊抗鼠HPR-IgG1，HPR-IgG2a(1mg/ml)酶标抗体购自BETHYL公司，3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine(TMB)显色液购自Sigma公司。

免疫用抗原肽：M2e：MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD，由人工合成(北京赛百胜公司)

免疫用蛋白：复性的S1-M2e3。

蛋白的定量及内毒素的检测

蛋白定量：测定蛋白溶液在280nm和260nm波长下的吸光度，用以下的公式计算蛋白浓度：蛋白浓度(mg/ml)＝1.55XA₂₈₀-0.74XA₂₆₀

大肠杆菌表达蛋白往往有内毒素污染，而内毒素(LPS)本身是有一定的免疫激活作用的，因此对每一批试验性S1-M2e3必须检测内毒素含量范围，确保低于一个限值，才能应用于动物实验。对制备的佐剂蛋白制品采用鲎试剂法进行了内毒素的检测，样品中内毒素含量均低于0.01EU/μg，符合动物实验要求。

内毒素的检测；按照鲎试剂使用说明书进行。简述如下：在分装有100μl鲎试剂溶液的试管中加入100μl复性的S1-M2e3蛋白，设立阴性对照(无内毒素水)，阳性对照(内毒素标准品)。封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的恒温器中孵育60min，然后取出观察结果，孵育期间严格避免震动。根据是否出现凝胶判断是否阳性。结果表明当测试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，阳性对照管内容物呈坚实凝胶，不变型，不从管壁滑脱；供试品(制备蛋白样品)虽生成凝胶，但不能保持完整，并从管壁滑脱，也为阴性。阴性对照管内容物未出现凝胶。

根据使用的鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml，复性的S1-M2e3蛋白浓度为5.0μg/μ1，由于测试呈阴性，则最终内毒素含量低于0.01EU/μg。

具体的实验方法和实验结果如下：

5周龄的BALB/c雌性小鼠(由中国人民解放军军事医学科学院动物中心提供，所用实验动物均为清洁级)随机分组，每组6只，分组情况如下：S1-M2e3免疫组(S1-M2e3)、M2e免疫组(M2e)。

S1-M2e3免疫组和M2e免疫组共免疫两次，在第一次免疫后的3周，加强免疫一次；免疫时，以0.01M、pH7.4的PBS溶液稀释M2e或复性的S1-M2e3至所需浓度，100μl/只，使M2e或复性的S1-M2e3的免疫剂量为25μg/只/次。

分别加强免疫后第8天断尾法采血，收集于EP管中，置37℃温箱放置1h，待血清析出后，4000rpm离心10min，吸出血清—20℃冻存备用。

M2e用包被液(Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加水至1000ml)稀释(5μg/ml)，4℃包被96孔板过夜，加入200μl封闭液，37℃孵育1h，加入100μl稀释的一抗(免疫血清)，同时设阴性对照孔(免疫前正常小鼠血清)和空白孔，37℃孵育1h，PBST洗四遍，加入100μl 1:10,000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG1或IgG2a亚型抗体，37℃孵育1h，PBST洗四遍，加入3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine(TMB)显色液，37℃避光显色，在每一孔中加入100μl 2M硫酸终止反应。在450nm波长读取每一孔的吸光度。其中，2×ELISA封闭和样品稀释液：每1000ml含Tris.Cl(pH6.8)12g，NaCl 16.5g，Tween-20 0.05％；临用前稀释一倍，并加入2％BSA。10×PBS缓冲液(pH7.2)：NaH₂PO₄ 20.5g，Na₂HPO₄ 179.9g，用4升去离子水溶解后加入701.3gNaCl，补至8升。ELISA洗涤缓冲液PBST：1×PBS加入0.2％(v/v)Tween-20。

结果的判断：OD₄₅₀大于等于2.1倍阴性对照OD₄₅₀的平均值判断为阳性。

结果如图5和6所示，表明S1-M2e3加强免疫一次，IgG1/IgG2a几何平均滴度(Geomean titer，GMT)值就可分别达到1：100,000/1：4525，S1-M2e3组免疫效果明显高于M2e免疫组(p<0.01)。设立的M2e免疫对照组显示，IgG1/IgG2a值多数都低于检测水平。(图5和6中的结果为6只小鼠的平均值。)

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用

<130>PCGNA81912

<160>6

<210>1

<211>198

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>87

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

<210>3

<211>285

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

<210>4

<211>628

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(17)..(610)

<223>

<400>2

<210>5

<211>284

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(15)..(275)

<223>

<400>5

<210>6

<211>855

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Claims (10)

1.一种融合蛋白，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白质；所述S1是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述抗原表位肽是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述S1的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列4。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述抗原表位肽的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列5。

6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列6。

7.含有权利要求3-6中任一项所述融合蛋白的编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

8.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备疫苗中的应用。

9.一种禽流感疫苗，它的活性成分为权利要求1或2所述的融合蛋白。

10.权利要求1或2所述的融合蛋白的制备方法，是将所述融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达得到融合蛋白。

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