CN105777909B

CN105777909B - 一种猪趋化因子介导的a型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗

Info

Publication number: CN105777909B
Application number: CN201610120101.1A
Authority: CN
Inventors: 曹轶梅; 卢曾军; 刘在新; 李坤; 付元芳; 李冬; 陈应理; 包慧芳; 白兴文; 孙普; 李平花
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2016-03-03
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2036-03-03
Also published as: CN105777909A

Abstract

本发明提供一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。本发明还提供包含上述猪A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白的疫苗。应用本发明的疫苗免疫动物，一周后均可检测到FMDV特异性抗体，抗体效价不断升高，免疫四周时抗体效价最高。用1000个猪半数感染量（PID50）的A/SEA/97系HNXX株猪体适应毒攻击后，本发明的疫苗免疫组猪均可完全抵抗强毒攻击，攻毒后10天内无一头猪表现出临床症状。说明将A8抗原通过XCL1靶向XCR1受体，再用CpG激活树突状细胞能显著提高抗原的体液免疫和细胞免疫水平，因而，是一种有效的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白疫苗。

Description

一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗

技术领域

本发明属于口蹄疫免疫技术领域，具体涉及一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗。

背景技术

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染病，主要侵害对象为牛、羊和猪等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。给畜牧业发展造成巨大损失。FMDV不仅宿主范围广，传播迅速，变异快，而且血清型众多。口蹄疫病毒共分为A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型，各血清型间缺乏交叉保护性，不同血清型的亚型和分离株间抗原变异很大。目前，对于口蹄疫的防治以免疫接种灭活疫苗为主，该疫苗为FMD疫情防控做出了重大贡献。但灭活疫苗的生产和应用存在诸多的缺点。即生产该疫苗需要动用活毒，需要建设高级生物安全的实验室及生产车间以防散毒；需要纯化病毒抗原以便于区分感染动物和疫苗免疫动物；需要冷链运输和低温贮存以保证抗原稳定性；疫苗免疫不能阻断形成病毒携带状态，更为严重的是病毒灭活不完全有引发疫情的危险。为了克服这些缺点，研究者一直在寻找一种更为安全有效的口蹄疫疫苗。随着免疫学研究的深入、以及抗原递呈机理与方法的研究进展，口蹄疫病毒抗原位点定位的研究日益明朗，在疫苗分子设计、复合表位疫苗与免疫佐剂等方面都取得了明显进展。

表位蛋白疫苗与灭活疫苗相比，具有抗原稳定性好、生产及应用安全、疫苗免疫动物易与FMDV感染动物区分等诸多优点。表位疫苗的研究尽管近年来发展迅速，但存在免疫原性较弱的缺点。

树突状细胞（DC）是最重要的抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs），在启动与控制获得性免疫应答方面发挥着关键性的作用。通过DC细胞表面受体将抗原蛋白靶向到DC细胞，可以显著提高抗原递呈效率约100倍（Idoyaga et al，2011），即使较少量的抗原也能够获得很好的细胞免疫与体液免疫效果，在肿瘤免疫治疗与研究新型高效疫苗方面具有重要的应用前景。趋化因子XCL1是DC细胞表面趋化因子受体XCR1的配体，具有招募DC细胞的作用；不同动物种表达的XCL1序列有差异，因而在利用XCL1介导抗原靶向时具有种属特异性。在人与小鼠体内的研究表明，表达XCR1受体的DC细胞类型为CD8α⁺DCs，该类细胞在体内的占比较少，主要分布于外周淋巴循环与上皮组织。该类DC细胞摄取抗原分子后可以通过MHC-I与MHC-II两类分子交互递呈抗原给CD8⁺T细胞（CTL）与CD4⁺T细胞，可以产生强而持久的细胞免疫与体液免疫应答。通过趋化因子XCL1靶向抗原于该类DC表面，将有可能提高抗原递呈效果，提高对靶动物的免疫效果。研究表明，将抗原靶向于处在稳定阶段的DC表面不足以诱导免疫应答，有可能会引起免疫耐受。因此为了产生有效的免疫应答，还应该加入佐剂（如Toll样受体的配体）以激活DCs。如将抗原靶向于小鼠DC表面的XCR1受体时加入LPS（Toll样受体4的配体）、CpG（Toll样受体9的配体）可诱导产生CTLs和抗体应答。如果不加佐剂，虽然会引起短暂的T细胞增殖，但随后就会被清除或出现无应答。

发明内容

本发明的目的是克服现有表位蛋白疫苗的缺陷，提供一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗。利用本发明的XA8靶向性复合表位蛋白疫苗免疫猪，能够产生较高的细胞免疫与体液免疫，以及较好的保护性免疫效果，是一种安全、高效的口蹄疫新型疫苗。

本发明的第一个目的是提供一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白，所述复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:2。

本发明的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白由猪趋化因子XCL1与复合表位蛋白A8串联组成，其中A8包括A/SEA/97，A/IRA/05，A22三个谱系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位区、通用T细胞表位以及各表位之间的间隔序列，表位间的间隔序列有助于蛋白形成稳定的空间结构，提高蛋白的免疫原性；并在重组蛋白末端融合了6个组氨酸标签，以便于表位蛋白的分离纯化。

本发明的第二个目的是提供编码权利要求1所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白的核苷酸；

作为优选，所述核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1。

本发明的第三个目的是提供一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白疫苗，所述疫苗包含权利要求1所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白，和药学上可接受的媒介物；

作为优选，所述疫苗包括权利要求1所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG。

作为优选，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制备而成；所述水相的溶质为权利要求1所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG；所述油相为Montanide ISA-201油佐剂。

作为优选，所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白与Toll样受体9的配体CpG的重量比为5：3。

作为优选，所述水相和油相的体积比为1：（0.95-1.05）。

作为优选，所述疫苗的主要组分含量为猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白250μg/mL，CpG佐剂150μg/mL；作为优选，免疫有效量为每头份2mL。

本发明的第四个目的是提供上述疫苗的制备方法，将猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG溶于磷酸盐缓冲液中，得到水相；将水相与油相在室温下充分混合，乳化，得疫苗。

本发明的第五个目的是提供上述猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白在制备猪A型口蹄疫疫苗中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述疫苗在制备预防和/或控制猪A型口蹄疫的药物中的应用。

本发明的有益效果为：

猪体免疫试验，将PBS、A8、XA8、A8+CpG与XA8+CpG免疫猪后每周采血一次，第四周用A型FMDV流行毒攻毒。试验结果显示，PBS免疫组动物一直没有检测到抗体，其余各组猪免疫一周后均可检测到FMDV特异性抗体，抗体效价不断升高，免疫四周时抗体效价最高。且XA8+CpG免疫组动物抗体效价最高（图4）。免疫后第28天采集抗凝血分离PBMCs，体外刺激后测得IFN-γ含量，其中XA8+CpG免疫组动物最高，PBS免疫组动物没有产生IFN-γ（图5）。用1000个猪半数感染量（PID50）的A/SEA/97系HNXX株猪体适应毒攻击后，XA8+CpG免疫组猪均可完全抵抗强毒攻击，攻毒后10天内无一头猪表现出临床症状（表2）。对照组3头猪于攻毒后3天内全部发病。说明将A8抗原通过XCL1靶向XCR1受体，再用CpG激活DC能显著提高抗原的体液免疫和细胞免疫水平，因而，是一种有效的靶向性猪口蹄疫复合表位蛋白疫苗。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为A8与XA8抗原表达产物SDS-PAGE图。其中，1为诱导表达的载体pET28a对照；2为蛋白分子量Marker；3为重组菌pET28a-A8诱导表达产物；4为重组菌pET28a-XA8诱导表达产物；

图2为A8与XA8抗原WesternBlotting检测结果图。其中，1，2为诱导表达的重组菌pET28a-A8；3为预染的蛋白分子量Marker；4，5为诱导的pET28a载体对照；6，7为诱导表达的重组菌pET28a-XA8；

图3为A8与XA8抗原表达纯化后SDS-PAGE分析图。其中，1，3分别为pH值为5.9的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白A8和XA8；2，4分别为pH值为4.5的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白A8和XA8；5为蛋白分子量Marker；

图4为不同疫苗免疫动物LPBE抗体效价；

图5为不同疫苗免疫动物28天后PBMCs中IFN-γ含量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1、免疫原的设计与表达

本申请人根据国内外猪A型口蹄疫流行病学信息，设计并合成了免疫原基因A8，并将猪趋化因子XCL1与A8串联形成XA8。其中，A8包含A/SEA/97，A/IRA/05，A22三个谱系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位区以及通用T细胞表位，各表位之间用linker相连，最后加6组氨酸标签序列，有利于表达蛋白的纯化。设计好的XA8序列交由南京GenScript公司进行编码序列的优化与合成，两端分别加入NcoI酶切位点/启始密码子与终止密码子/HindIII酶切位点，合成序列经Nco I/Hind III酶切位点插入pET28a载体中，用于表达XA8融合蛋白。编码XA8蛋白的核苷酸序列如下，为序列表中SEQ ID NO:1，其蛋白序列为序列表中SEQ ID NO:2。该核苷酸序列中各段编码肽段来源与功能如下表1所示。

序列表中SEQ ID NO:1

ATGGCTTACACTGTGGAGGCTGTTGGTTCCGAGGTGCTGGAGAAGAGCATCTGCGTCTCTCTGACCACACGCCGTCTGCCGGTGAAGAACATCAAGACTTACACCATCAAAGAAGGCTCCATGAAGGCAGTTATCTTTATTACACGGCGCGGTCTGAAAGTGTGTGCCGATCCTCATGTGGAGTGGGTTAAAAAGGCTGTGCAGACCATTGACAAGAGCAACCGTGGAAATCAGGCCAAGCCGACAGGAGCAGGACCAGGTCCAGGTGCTAAGTTCGTGGCTGCATGGACGCTGAAAGCAGCAGCCGGTGGTTGCGTGTACAGCGGTACATCCAAATATTCTGCCCCTCAAAATCGTCGCGGCGATAGCGGACCACTGGCAGCACGTCTGGCAGCTCAGCTGCCGGCATCCTTCAACTTTGGTGGTGCCGTGGAAGTCAGCTCCCAGGACCGCCACAAACAAAAGATCATTGCACCAGCCAAACAAGGCGGAGTGTACTCAGGTACTAGTAAGTATAGTGCGTCGCAGAATCGTCGCGGCGATCTGGGCCCTCTGGCTGCTCGCCTGGCTGCTCAGCTGCCAGCTAGCTTCAACTTTGGACCTGGTCCCGGCTGCGTCTACAATGGCGTTTCGAAGTATAGCACCACTGGAAATGGTCGTCGCGGAGATCTGGGTTCTCTGGCAGCACGTGTCGCAGCTCAGCTGCCTTCTTCATTCAACTTTGGTGGCGCAGTTGAGGTGCTGTCACAGGACCGCCATAAACAAAAGATCATTGCCCCCACCAAACAGGGTGGTGTGTACTCCGGTACTTCTAAGTATTCAGCACCACAGAACCGTCGCGGCGACCTGGGTCCGCTGGCTGCTCGCCTGGCCGCTCAGCTGCCTGCGTCCTTCAACTTTGGCCCGGGACCAGGTTGCGTTTACAATGGCACGACAAAATATTCTACGGGTAACGCAGGACGTCGCGGCGATTTAGGCTCACTGGCAGCACGTGTGGCAGCTCAACTGCCAGCGAGCTTCAATTTTGGCGGAGCTGTCAAGGTTACCAGCCAGGACCGTCACAAACAACGCATCATTGCGCCGGCTAAGCAGGGTGGCGTGTACAACGGCACGAGTAAGTATTCGGCACCAGCAACACGTCGCGGCGATCTTGGCAGTCTGGCTGCTCGTCTGGCTGCCCAGCTGCCAGCATCGTTCAACTATTGCGGTGGCACCGCCAAATCTAAAAAGTTCCCATCCTACACCGCCACCTATCAGTTCCACCACCACCATCACCACTAA

序列表中SEQ ID NO:2

MAYTVEAVGSEVLEKSICVSLTTRRLPVKNIKTYTIKEGSMKAVIFITRRGLKVCADPHVEWVKKAVQTIDKSNRGNQAK

PTGAGPGPGAKFVAAWTLKAAAGGCVYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASFNFGGAVEVSSQDRHKQKIIAPA

KQGGVYSGTSKYSASQNRRGDLGPLAARLAAQLPASFNFGPGPGCVYNGVSKYSTTGNGRRGDLGSLAARVAAQLPSSFN

FGGAVEVLSQDRHKQKIIAPTKQGGVYSGTSKYSAPQNRRGDLGPLAARLAAQLPASFNFGPGPGCVYNGTTK YSTGNAG

RRGDLGSLAARVAAQLPASFNFGGAVKVTSQDRHKQRIIAPAKQGGVYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASFN

YCGGTAKSKKFPSYTATYQFHHHHHH.

表1.XA8融合蛋白编码序列中各段氨基酸来源与功能

2、A8与XA8蛋白的表达与WesternBlot检测

合成后的核苷酸序列插入pET28a载体中，将此重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将鉴定阳性的重组菌在卡拉霉素抗性的LB液体培养基中培养过夜，然后按1%转接到含0.075mg/mL卡拉霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期(OD₆₀₀为0.5～1.0)，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃振荡培养5h后，分别取表达产物1mL进行SDS-PAGE分析。结果，表达的A8蛋白大小介于35～40kD之间，XA8蛋白大小介于40～55kD之间，与预期的35kD与45kD大小相符，如图1所示。

表达产物经SDS-PAGE的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上与猪FMDV阳性血清反应，诱导的重组菌pET28a-A8与pET28a-XA8出现特异性条带，而pET-28a载体对照未见任何反应带（图2）。说明表达蛋白具有很好的反应活性。

3、A8与XA8蛋白包涵体的大量制备与溶解

取过夜培养的转化菌5mL接种于500mL LB培养液（含75μg/mL卡那霉素）中，37℃，250r/min培养至OD₆₀₀为0.5～1.0时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导表达5h，得诱导表达后的重组XA8蛋白。

将诱导表达后的重组XA8蛋白4℃ 10000rpm离心15min收集菌体，弃上清，每100mL培养物加10mL冰浴的1×IB Wash Buffer（EDTA 10mmol/L；Tris-HCl 20mmol/L，pH7.5；TritonX-100 1%）重悬沉淀，加入终浓度为100μg/mL的溶菌酶，30℃温育15min后，置于冰浴中超声波裂解至细胞完全裂解，溶液不再黏稠。12000rpm离心10min，弃上清，每100mL菌液的沉淀加10mL冰浴的1×IB Wash Buffer重复洗涤一次，重悬后转移至已知重量的干净管中，12000rpm离心10min收集包涵体，用卷纸吸干管底部微量液体。计算出包涵体的湿重，标准的包涵体重量为1~4mg/ml培养物。

室温下准备含有0.3%的N-十二烷基肌氨酸钠的1×IB Solubilization Buffer（50mM CAPS，pH11.0）（即49.45mL 1×IB Solubilization Buffer中加入0.5mL 30% N-lauroylsarcosine），按照包涵体湿重计算所要加入的1×IB Solubilization Buffer用量，将包涵体的量调整到10~20mg/mL。向包涵体中加入计算量的1×IB SolubilizationBuffer，轻轻混匀，反复吹打，破碎大量细胞碎片，室温孵育15min，可适当延长时间至蛋白完全溶解，12000rpm离心30min弃去不可溶物质，上清即为粗提的包涵体。

4、A8与XA8蛋白的亲和层析纯化

重组XA8蛋白通过末端融合的6-组氨酸标签进行亲合层析纯化，具体为：每4mL包涵体裂解液中加入1mL 50%的Ni-NTA His·Bind Resin，轻柔混合均匀后，室温条件下以200r/min摇晃2h，使目的蛋白与Ni-NTA His·Bind Resin发生完全的特异性结合；待液体流干，用Washing Buffer（100mM NaH₂PO₄，10mM Tris·Cl，8M urea；pH6.3）洗净未结合杂蛋白，洗涤2次，每次洗2个柱体积。最后用不同pH值（5.9和4.5）Eluting Buffer（100mMNaH₂PO₄，10mM Tris·Cl，8M urea）洗脱柱体，洗脱4次，每次洗脱1个柱体积。收集洗脱下的溶液为纯化后的目的蛋白，取部分溶液SDS-PAGE电泳分析，结果pH值为5.9的洗脱液中目的蛋白含量少，而pH值为4.5的洗脱液中目的蛋白含量大，目的蛋白纯度达95%以上（图3）。目的蛋白纯度达到制苗要求。

5、纯化A8与XA8蛋白复性及浓度测定

纯化后的蛋白质装入透析袋。先用50倍体积的含0.1mmol/L DTT的复性液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.5)4℃透析3h以上，并换液1次，继续透析3h以上；用不含DTT，含有氧化型与还原型谷胱苷肽的复性液再透析3h以上，并换液1次，以除去DTT。

用Bradford蛋白质定量试剂盒（碧云天公司）测定纯化复性后目的蛋白浓度，纯化蛋白的浓度应不低于0.8mg/mL。

6、疫苗配制

水相：（1）A8 500μg/mL；（2）XA8 500μg/mL；（3）A8 500μg/mL与CpG 300μg/mL混合液；（4）XA8 500μg/mL与CpG 300μg/mL混合液；溶剂均为磷酸盐缓冲液；

油相：ISA201 VG佐剂。

将水相和油相分别平衡至室温，再按体积比例（水相：油相=1:1）真空进料到乳化罐中，循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双向油乳剂（W/O/W）疫苗。

7、猪体免疫试验

用体重40kg左右的健康易感猪（健康易感猪标准：乳鼠中和抗体滴度不高于1:4或细胞中和抗体滴度不高于1:8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8且3ABC抗体检测为阴性）23头，动物分组及接种疫苗成份如表2。将疫苗于耳根后肌肉注射，每头注射2ml，接种后每周采血一次，用液相阻断ELISA测抗体。免疫后第28天采集抗凝血分离PBMCs，体外刺激后用Invitrogen公司SwineIFN-γELISAKit测IFN-γ含量。并将每头猪耳根后肌肉注射A/SEA/97系HNXX株乳鼠毒2ml（含1000ID50）。连续观察10日，对照猪均应至少有一蹄出现口蹄疫症状。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。

试验结果显示，PBS免疫组（对照组）动物一直没有检测到FMDV特异性抗体，其余各组猪免疫一周后均可检测到FMDV特异性抗体，抗体效价不断升高，免疫四周时抗体效价最高。且XA8+CpG免疫组动物抗体效价最高（图4）。免疫后第28天采集抗凝血分离PBMCs，体外刺激后测得IFN-γ含量，其中XA8+CpG免疫组动物最高，PBS免疫组动物没有产生IFN-γ（图5）。用1000个猪半数感染量（PID50）的A/SEA/97系HNXX株猪体适应毒攻击后，XA8+CpG免疫组猪均可完全抵抗强毒攻击，攻毒后10天内无一头猪表现出临床症状（表2）。对照组3头猪于攻毒后3天内全部发病。说明XA8靶向性抗原加CpG Toll样受体激动剂制备的疫苗具有最佳的免疫效果，诱导产生了最好的体液与细胞免疫应答，达到了抗原靶向递呈增强免疫的效果。

表2动物分组及攻毒保护结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白及疫苗

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcttaca ctgtggaggc tgttggttcc gaggtgctgg agaagagcat ctgcgtctct 60

ctgaccacac gccgtctgcc ggtgaagaac atcaagactt acaccatcaa agaaggctcc 120

atgaaggcag ttatctttat tacacggcgc ggtctgaaag tgtgtgccga tcctcatgtg 180

gagtgggtta aaaaggctgt gcagaccatt gacaagagca accgtggaaa tcaggccaag 240

ccgacaggag caggaccagg tccaggtgct aagttcgtgg ctgcatggac gctgaaagca 300

gcagccggtg gttgcgtgta cagcggtaca tccaaatatt ctgcccctca aaatcgtcgc 360

ggcgatagcg gaccactggc agcacgtctg gcagctcagc tgccggcatc cttcaacttt 420

ggtggtgccg tggaagtcag ctcccaggac cgccacaaac aaaagatcat tgcaccagcc 480

aaacaaggcg gagtgtactc aggtactagt aagtatagtg cgtcgcagaa tcgtcgcggc 540

gatctgggcc ctctggctgc tcgcctggct gctcagctgc cagctagctt caactttgga 600

cctggtcccg gctgcgtcta caatggcgtt tcgaagtata gcaccactgg aaatggtcgt 660

cgcggagatc tgggttctct ggcagcacgt gtcgcagctc agctgccttc ttcattcaac 720

tttggtggcg cagttgaggt gctgtcacag gaccgccata aacaaaagat cattgccccc 780

accaaacagg gtggtgtgta ctccggtact tctaagtatt cagcaccaca gaaccgtcgc 840

ggcgacctgg gtccgctggc tgctcgcctg gccgctcagc tgcctgcgtc cttcaacttt 900

ggcccgggac caggttgcgt ttacaatggc acgacaaaat attctacggg taacgcagga 960

cgtcgcggcg atttaggctc actggcagca cgtgtggcag ctcaactgcc agcgagcttc 1020

aattttggcg gagctgtcaa ggttaccagc caggaccgtc acaaacaacg catcattgcg 1080

ccggctaagc agggtggcgt gtacaacggc acgagtaagt attcggcacc agcaacacgt 1140

cgcggcgatc ttggcagtct ggctgctcgt ctggctgccc agctgccagc atcgttcaac 1200

tattgcggtg gcaccgccaa atctaaaaag ttcccatcct acaccgccac ctatcagttc 1260

caccaccacc atcaccacta a 1281

<210> 2

<211> 426

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Ala Tyr Thr Val Glu Ala Val Gly Ser Glu Val Leu Glu Lys Ser

1 5 10 15

Ile Cys Val Ser Leu Thr Thr Arg Arg Leu Pro Val Lys Asn Ile Lys

20 25 30

Thr Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Ser Met Lys Ala Val Ile Phe Ile Thr

35 40 45

Arg Arg Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro His Val Glu Trp Val Lys

50 55 60

Lys Ala Val Gln Thr Ile Asp Lys Ser Asn Arg Gly Asn Gln Ala Lys

65 70 75 80

Pro Thr Gly Ala Gly Pro Gly Pro Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp

85 90 95

Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys

100 105 110

Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg Gly Asp Ser Gly Pro Leu Ala Ala

115 120 125

Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Gly Ala Val

130 135 140

Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala

145 150 155 160

Lys Gln Gly Gly Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Ser Gln

165 170 175

Asn Arg Arg Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln

180 185 190

Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Pro Gly Pro Gly Cys Val Tyr Asn

195 200 205

Gly Val Ser Lys Tyr Ser Thr Thr Gly Asn Gly Arg Arg Gly Asp Leu

210 215 220

Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ser Ser Phe Asn

225 230 235 240

Phe Gly Gly Ala Val Glu Val Leu Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys

245 250 255

Ile Ile Ala Pro Thr Lys Gln Gly Gly Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys

260 265 270

Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala

275 280 285

Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Pro Gly Pro

290 295 300

Gly Cys Val Tyr Asn Gly Thr Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly

305 310 315 320

Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu

325 330 335

Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Gly Ala Val Lys Val Thr Ser Gln Asp

340 345 350

Arg His Lys Gln Arg Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Gly Gly Val Tyr

355 360 365

Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu

370 375 380

Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn

385 390 395 400

Tyr Cys Gly Gly Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala

405 410 415

Thr Tyr Gln Phe His His His His His His

420 425

Claims

1.一种猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白疫苗，其特征在于：所述复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:2；所述疫苗由水相和油相按比例混合后制备而成；所述水相的溶质为所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG；所述油相为Montanide ISA-201油佐剂；所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白与Toll样受体9的配体CpG的重量比为5:3；所述水相和油相的体积比为1:（0.95-1.05）。

2.根据权利要求1中所述的猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白疫苗，其特征在于，编码猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白的核酸序列为序列表中SEQ ID NO:1。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的主要组分含量为猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白250μg/mL，CpG佐剂150μg/mL。

4.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于：将猪趋化因子介导的A型口蹄疫靶向性复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG溶于磷酸盐缓冲液中，得到水相；将水相与油相在室温下充分混合，乳化得疫苗。

5.权利要求1所述的疫苗在制备预防猪A型口蹄疫的药物中的应用。