CN105399802B - A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白及疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，其特征在于：所述复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。本发明还提供含有上述A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白的疫苗。应用本发明的疫苗免疫动物，一周后就可检测到A型口蹄疫病毒特异性抗体，抗体效价不断升高，免疫四周时抗体效价最高。用A型口蹄疫流行毒攻毒后，疫苗免疫组猪均可完全抵抗强毒攻击，能够作为一种新型A型口蹄疫基因工程疫苗使用。

Description

A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白及疫苗

技术领域

本发明属于口蹄疫免疫技术领域，具体涉及一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白及疫苗。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus, FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染率高而著称。该病一旦暴发将会造成巨大的经济损失。FMDV有七个血清型，分别为O、A、C、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3。

我国口蹄疫流行由来已久，目前流行的血清型主要有O型和A型。Asia 1型处于基本控制状态（自2009年5月以后至今近6年时间内亚洲I型在我国再未发生）。O型的流行有所缓和，A型流行增加，猪发病病例增多。2009年A型 东南亚拓扑型（A/SEA-97/G1）引发牛口蹄疫，2012年2月至2013年1月无临床病例、但病原广泛存在。2013 年2月A型东南亚拓扑型病毒的另一分支（A/SEA-97/G2）引起广东茂名猪发生FMD，截止同年8月A型在全国发生16起，波及广州、云南、青海、西藏和新疆5个省（自治区）。同时，东南亚地区国家还存在A/IRAN/05等较多谱系的A型口蹄疫病毒，疫情形势复杂，时刻威胁着我国畜牧养殖业的健康发展。不同谱系A型口蹄疫病毒的抗原性变异较大，交叉免疫保护作用较差，给疫苗研究带来了困难。研究抗原谱广的疫苗产品，将为我国口蹄疫防控提供重要的技术支撑。

在FMD流行的国家，疫情的控制仍然依赖于现有的传统灭活疫苗以及当地兽医工作者的辛勤劳动，通过强制性高强度的免疫，逐步减少疫情的发生。但是由于口蹄疫病毒本身免疫原性弱，以及灭活疫苗生产成本的限制等因素，造成疫苗的免疫持续期较短，保护水平较低，而且个体差异较大，保护性抗体产生的水平不整齐；同时灭活疫苗的生产需要高级别的防护措施以消除病毒逃逸等安全隐患；而且，非纯化的灭活疫苗多次免疫会产生非结构蛋白抗体，给感染动物与免疫动物的鉴别诊断带来困难。另外，接种全病毒灭活疫苗不能阻断病毒的持续感染状态。由于这些因素，促使人们研制更加高效安全的新型FMD疫苗。随着国内外免疫学研究的深入、以及抗原递呈机理与方法的研究进展，在疫苗分子设计、复合表位疫苗与免疫佐剂等方面都取得了明显进展。

与传统灭活疫苗相比，口蹄疫复合表位蛋白疫苗具有以下的优点：生产过程不涉及感染性的FMDV，不存在散毒的危险；在同一种表位蛋白中引入多个谱系的保护性抗原表位，拓展表位蛋白的抗原谱，从而使表位蛋白疫苗所诱导产生的免疫应答更具有广谱性；通过与通用的T细胞表位融合设计，形成复合表位蛋白，刺激产生更全面的体液免疫与细胞免疫应答；利用非疫苗用病毒蛋白建立的诊断方法可对疫苗免疫动物和自然感染动物进行有效区分，从而可准确评估动物的感染状况，为疫病防控提供准确的监测技术支撑。口蹄疫表位蛋白疫苗弥补了目前传统疫苗所存在的诸多不足，成为口蹄疫新型疫苗发展的主要趋势之一。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的疫苗缺陷，提供一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和疫苗，利用该疫苗免疫动物，能够产生很好的保护性免疫效果，是一种安全、高效的口蹄疫新型分子疫苗。

本发明的第一个目的是提供一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，所述复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。

本发明的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白包含由A/SEA/97, A/IRA/05, A22三个谱系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位区、通用T细胞表位以及表位间的间隔序列串联组成，表位间的间隔序列有助于蛋白形成稳定的空间结构，提高蛋白的免疫原性；并在重组蛋白末端融合的6个组氨酸标签，以便于表位蛋白的分离纯化。

本发明的第二个目的是提供一种核苷酸序列，编码权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白；

作为优选，所述核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。

本发明的第三个目的是提供一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白疫苗，所述疫苗包含权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白，和药学上可接受的媒介物；

作为优选，所述疫苗包括权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG。

作为优选，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制备而成；所述水相的溶质为权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG；所述油相为Montanide ISA-201油佐剂。

作为优选，所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白与Toll样受体9的配体CpG的重量比为5:（2-4）。

作为优选，所述水相和油相的体积比为1:（0.95-1.05）。

作为优选，所述疫苗的主要组分含量为复合表位蛋白250 μg/mL，CpG佐剂150 μg/mL；

作为优选，免疫有效量为成年动物每头份2 mL，幼年动物每头份1 mL。

本发明的第四个目的是提供上述疫苗的制备方法，将权利要求1所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG溶于磷酸盐缓冲液中，得到水相；将水相与油相等温度充分混合，乳化，得疫苗。

本发明的第五个目的是提供上述疫苗在制备预防和/或控制A型口蹄疫病毒的药物中的应用。

作为优选，所述疫苗在制备预防和/或控制猪、牛或羊A型口蹄疫的药物中的应用。

经实验，应用本发明的疫苗免疫动物，一周后就可检测到A型FMDV特异性抗体，抗体效价不断升高，免疫四周时抗体效价最高。用A型口蹄疫流行毒攻毒后，疫苗免疫组猪均可完全抵抗强毒攻击。疫苗效力试验结果表明，该疫苗每头份的效力为10.81 PD50，能够作为一种新型A型口蹄疫基因工程疫苗使用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为重组菌A8抗原表达产物SDS-PAGE；其中，M为蛋白分子量Marker；1为未诱导的重组菌pET28a-A8对照；2为重组菌pET28a-A8诱导3小时产物；3为重组菌pET28a-A8诱导5小时产物；

图2为重组菌A8抗原Western Blotting检测结果图；其中，M为预染的蛋白分子量Marker；1为未诱导的重组菌pET28a-A8对照；2为诱导的pET28a载体对照；4，5为重组菌pET28a-A8诱导表达产物；

图3为A8抗原表达纯化后SDS-PAGE分析图。M蛋白分子量Marker；1为pH值为5.9的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白；2为pH值为4.5的洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

试剂

1、 1× IB Wash Buffer：EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L， pH 7.5，TritonX-100 1%。

实施例1

1、A8免疫原的设计与表达

本申请人根据国内外A型口蹄疫流行病学信息，设计并合成了免疫原基因A8。其中A8包含A/SEA/97，A/IRA/05，A22三个谱系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位区以及通用T细胞表位，各表位之间以linker相连，以形成稳定的蛋白空间结构，最后加6组氨酸标签序列，以有利于表达蛋白的纯化。设计好的序列交由南京GenScript公司进行编码序列的优化与合成，两端分别加入Nco I酶切位点/启始密码子与终止密码子Hind III酶切位点，合成序列经Nco I/Hind III酶切位点插入pET28a载体中，用于复合表位蛋白A8的表达。编码复合表位蛋白的核苷酸序列如下，为序列表中SEQ ID No.1，其蛋白序列为序列表中SEQ IDNo.2。

SEQ ID No.1

ATGGCTAAGT TCGTGGCTGC ATGGACGCTG AAAGCAGCAG CCGGTGGTTG CGTGTACAGCGGTACATCCA AATATTCTGC CCCTCAAAAT CGTCGCGGCG ATAGCGGACC ACTGGCAGCA CGTCTGGCAGCTCAGCTGCC GGCATCCTTC AACTTTGGTG GTGCCGTGGA AGTCAGCTCC CAGGACCGCC ACAAACAAAAGATCATTGCA CCAGCCAAAC AAGGCGGAGT GTACTCAGGT ACTAGTAAGT ATAGTGCGTC GCAGAATCGTCGCGGCGATC TGGGCCCTCT GGCTGCTCGC CTGGCTGCTC AGCTGCCAGC TAGCTTCAAC TTTGGACCTGGTCCCGGCTG CGTCTACAAT GGCGTTTCGA AGTATAGCAC CACTGGAAAT GGTCGTCGCG GAGATCTGGGTTCTCTGGCA GCACGTGTCG CAGCTCAGCT GCCTTCTTCA TTCAACTTTG GTGGCGCAGT TGAGGTGCTGTCACAGGACC GCCATAAACA AAAGATCATT GCCCCCACCA AACAGGGTGG TGTGTACTCC GGTACTTCTAAGTATTCAGC ACCACAGAAC CGTCGCGGCG ACCTGGGTCC GCTGGCTGCT CGCCTGGCCG CTCAGCTGCCTGCGTCCTTC AACTTTGGCC CGGGACCAGG TTGCGTTTAC AATGGCACGA CAAAATATTC TACGGGTAACGCAGGACGTC GCGGCGATTT AGGCTCACTG GCAGCACGTG TGGCAGCTCA ACTGCCAGCG AGCTTCAATTTTGGCGGAGC TGTCAAGGTT ACCAGCCAGG ACCGTCACAA ACAACGCATC ATTGCGCCGG CTAAGCAGGGTGGCGTGTAC AACGGCACGA GTAAGTATTC GGCACCAGCA ACACGTCGCG GCGATCTTGG CAGTCTGGCTGCTCGTCTGG CTGCCCAGCT GCCAGCATCG TTCAACTATT GCGGTGGCAC CGCCAAATCT AAAAAGTTCCCATCCTACAC CGCCACCTAT CAGTTCCACC ACCACCATCA CCACTAA

SEQ ID No.2

MAKFVAAWTLKAAAGGCVYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASFNFGGAVEVSSQDRHKQKIIAPAKQGGVYSGTSKYSASQNRRGDLGPLAARLAAQLPASFNFGPGPGCVYNGVSKYSTTGNGRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGGAVEVLSQDRHKQKIIAPTKQGGVYSGTSKYSAPQNRRGDLGPLAARLAAQLPASFNFGPGPGCVYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASFNFGGAVKVTSQDRHKQRIIAPAKQGGVYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASFNYCGGTAKSKKFPSYTATYQFHHHHHH.

上述序列中各段核苷酸编码氨基酸序列的来源与功能如下表1所示。

表1. A8复合表位蛋白编码序列中各段氨基酸来源与功能

序列名称	位置	长度（bp）	功能
				PADRE T cell epitope	1-42	42	通用T细胞表位
linker 1	43-51	9	间隔序列1
				A/GDMM/CHA/2013 FMDV VP1 129-163	52-156	105	A/SEA/97/G2谱系中和表位
linker 2	157-162	6	间隔序列2
				A/GDMM/CHA/2013 FMDV VP1 191-210	163-222	60	A/SEA/97/G2谱系中和表位
linker 3	223-228	6	间隔序列3
				A/HNLY4/2014 VP1 129-163	229-333	105	A/SEA/97/G2谱系中和表位
linker 4	334-351	18	间隔序列4
				A TUR 32 2008 VP1 129-164	352-459	108	A/IRA/05谱系中和表位
linker 5	460-465	6	间隔序列5
				A/IRA/1/05 VP1 192-211	466-525	60	A/IRA/05谱系中和表位
linker 6	526-531	6	间隔序列6
				A/QH/2013 VP1 129-163	532-636	105	A/SEA/97/G2谱系中和表位
linker 7	637-654	18	间隔序列7
				AF72 VP1 129-164	655-762	108	A22系中和表位
linker 8	763-768	6	间隔序列8
				AF72 VP1 192-211	769-828	60	A22系中和表位
linker 9	829-834	6	间隔序列9
				A/HuBWH/2009 VP1 129-163	835-939	105	A/SEA/97/G1谱系中和表位
linker 10	940-948	9	间隔序列10
				Invasin	949-996	48	通用T细胞表位
6×His	997-1014	18	组氨酸标签

各表位间的间隔氨基酸序列不同时，会得到不同的蛋白空间结构；经实验证实，当氨基酸序列为本专利中A8蛋白的序列时，能够得到一种稳定的蛋白空间结构，使得最终得到的A8复合表位蛋白的免疫原性和免疫效果最佳。

2、A8蛋白的表达与Western Blotting检测

将步骤1中构建的表达A8复合表位蛋白的载体，命名为pET28a-A8，将此重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞，将鉴定阳性的重组菌在卡拉霉素抗性的LB液体培养基中培养过夜，然后按1%量转接到含0.075mg/mL卡拉霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期(OD₆₀₀为0.5～1.0)，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃振荡培养3 h、5 h后，收集1mL表达菌，裂解菌体后进行SDS-PAGE分析。结果，表达的A8蛋白大小介于35～40kD之间，与预期的37kD大小相符，诱导5 h时A8蛋白表达量大，如图1所示。

表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至硝酸纤维素膜与猪FMDV阳性血清反应，诱导的重组菌pET28a-A8出现特异性条带，而诱导的pET-28a载体与未诱导的重组菌pET28a-A8对照未见任何反应带（图2）。说明表达蛋白具有很好的反应活性。

3、A8蛋白包涵体的大量制备与溶解

取过夜培养的转化菌5 mL接种于500 mL LB培养液（含75µg/mL卡那霉素）中，37℃，250 r/min培养至OD₆₀₀为0.5～1.0时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导表达5 h，得诱导表达后的重组A8蛋白。

将诱导表达后的重组A8蛋白于4℃ 10000 r/min离心15 min，收集菌体，弃上清，每100 mL培养物加10 mL冰浴的1× IB Wash Buffer重悬沉淀，加入终浓度为100 μg/mL的溶菌酶，30℃温育15 min后，置于冰浴中超声波裂解至细胞完全裂解，溶液不再黏稠。12000r/min离心10 min，弃上清，每100 mL菌液的沉淀加10 mL冰浴的1×IB Wash Buffer重复洗涤一次，重悬后转移至已知重量的离心管中，12000 r/min离心10 min收集包涵体，用卷纸吸干管底部微量液体。计算出包涵体的湿重，标准的包涵体重量为1~4 mg/mL培养物；

室温下准备含有0.3%的N-十二烷基肌氨酸钠的1×IB Solubilization Buffer（50 mM CAPS，pH 11.0）（即49.5mL 1×IB Solubilization Buffer中加入0.5mL 30% N-十二烷基肌氨酸钠），按照包涵体湿重计算所要加入的1×IB Solubilization Buffer用量，将包涵体的量调整到10~20 mg/mL。向包涵体中加入计算量的1×IB SolubilizationBuffer，轻轻混匀，反复吹打，破碎大量细胞碎片，室温孵育15 min，可适当延长时间至蛋白完全溶解，12000 r/min离心30 min弃去不可溶物质，上清即为粗提的包涵体。

4、重组A8蛋白的亲和层析纯化

在每4 mL 包涵体裂解液中加入1 mL 50%的Ni-NTA His·Bind Resin，轻柔混合均匀后，室温条件下以200 r/min摇晃2 h，使目的蛋白与Ni-NTA His·Bind Resin发生完全的特异性结合；待液体流干，用Washing Buffer（100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris·Cl，8Murea；pH 6.3）洗净未结合杂蛋白，洗涤2次，每次洗2个柱体积。最后用不同pH值（5.9和4.5）洗脱缓冲液（100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris·Cl，8M urea）洗脱柱体，洗脱4次，每次洗脱1个柱体积。收集洗脱下的溶液为纯化后的A8蛋白，取部分蛋白溶液SDS-PAGE电泳分析，结果pH值为5.9的洗脱液中A8蛋白含量少，而pH值为4.5的洗脱液中A8蛋白含量大，目的蛋白纯度达95%以上（图3）。目的蛋白纯化达到制苗要求。

5、纯化后的重组A8蛋白复性及浓度测定

将纯化后的重组A8蛋白装入透析袋。先用50倍体积的含0.1 mmol/ L DTT的复性液( 20 mmol/ L Tris-HCl，pH 8. 5) 4℃透析3h以上，并换液1次，继续透析3h以上；用不含DTT的复性液再透析3h以上，并换液1 次，以除去DTT。

用Bradford蛋白质定量试剂盒（碧云天公司）测定纯化复性后重组A8蛋白的浓度，纯化蛋白的浓度为1.2 mg/mL。

6、疫苗配制

水相的制备：将步骤4纯化后的重组A8蛋白与Toll样受体9的配体CpG分别按终浓度为500μg/mL和300μg/mL配制于pH为7.2~7.6的磷酸盐缓冲液；

油相的准备：Montanide ISA-201油佐剂，购自法国Seppic。

将水相和油相分别平衡至室温，再按体积比（水相︰油相=1︰1）真空进料到乳化罐中，循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双向油乳剂（W/O/W）疫苗。

7、动物免疫

用体重40kg左右的健康易感猪（健康易感猪标准：乳鼠中和抗体滴度不高于1︰4或细胞中和抗体滴度不高于1︰8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1︰8且3ABC抗体检测为阴性）10头，分为2组，每组5头。将疫苗于耳根后肌肉注射5头猪，每头注射2 mL或1mL（成年猪2mL每头份，仔猪1 mL每头份）。另一组每头注射2 mL PBS。接种后每周采血一次，用间接ELISA测抗体，接种后28日，每头猪耳根后肌肉注射A/SEA/97系HNXX株乳鼠毒2 mL（含1000ID₅₀）。连续观察10日，对照猪均应至少有一蹄出现口蹄疫症状。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。

试验结果显示，疫苗免疫猪第7天就可检测到FMDV特异性抗体，抗体效价不断升高，免疫第28天时抗体效价最高。而PBS免疫猪一直没检测到FMDV特异性抗体。用1000个猪半数感染量（PID₅₀）的A/SEA/97系HNXX株猪体适应毒攻击后，疫苗免疫组猪均可完全抵抗强毒攻击，攻毒后10天内无一头猪表现出临床症状。对照组（PBS免疫组）五头猪于攻毒后3天内全部发病（结果见表2）。说明重组A8抗原是一种很好的免疫原，添加CpG能够诱导免疫猪产生保护性的免疫应答，是一种新型的免疫增强型口蹄疫疫苗。

表2. 动物免疫试验结果

8、疫苗效力试验

根据OIE推荐疫苗效力试验标准，对18头健康大白猪（健康易感猪标准：乳鼠中和抗体滴度不高于1:4或细胞中和抗体滴度不高于1:8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8且3ABC抗体检测为阴性）随机分为4组，其中3组每组5头猪，分别接种不同剂量（全剂量、1/3剂量和1/9剂量）的疫苗。剩余1组3头猪接种PBS，作为对照。接种28天后，采血测液湘阻断ELISA抗体效价，并将每头猪耳根后肌肉注射A/SEA/97系HNXX株乳鼠毒2 mL（含1000ID50）。连续观察10日，对照猪均应至少有一蹄出现口蹄疫症状。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。根据免疫猪保护数，按Reed-Muench法计算PD50。

结果表明（表3），免疫28天后，全剂量和1/3剂量组的猪均产生较高水平的液湘阻断ELISA抗体，1/9剂量组抗体效价相对较低，而PBS对照组动物均未产生抗体。攻毒后，全剂量和1/3剂量组的猪均完全保护，1/9剂量组有2头猪未保护，PBS对照组动物全部发病。根据攻毒保护结果，计算该疫苗每头份的效力为10.81 PD50，远远高于OIE对于猪口蹄疫疫苗不低于3 PD50/头份的标准，也高于我国的口蹄疫疫苗效力不低于6 PD50/头份的规定，显示该疫苗具有较好免疫效力。

表3. 疫苗效力试验结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白及疫苗

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctaagt tcgtggctgc atggacgctg aaagcagcag ccggtggttg cgtgtacagc 60

ggtacatcca aatattctgc ccctcaaaat cgtcgcggcg atagcggacc actggcagca 120

cgtctggcag ctcagctgcc ggcatccttc aactttggtg gtgccgtgga agtcagctcc 180

caggaccgcc acaaacaaaa gatcattgca ccagccaaac aaggcggagt gtactcaggt 240

actagtaagt atagtgcgtc gcagaatcgt cgcggcgatc tgggccctct ggctgctcgc 300

ctggctgctc agctgccagc tagcttcaac tttggacctg gtcccggctg cgtctacaat 360

ggcgtttcga agtatagcac cactggaaat ggtcgtcgcg gagatctggg ttctctggca 420

gcacgtgtcg cagctcagct gccttcttca ttcaactttg gtggcgcagt tgaggtgctg 480

tcacaggacc gccataaaca aaagatcatt gcccccacca aacagggtgg tgtgtactcc 540

ggtacttcta agtattcagc accacagaac cgtcgcggcg acctgggtcc gctggctgct 600

cgcctggccg ctcagctgcc tgcgtccttc aactttggcc cgggaccagg ttgcgtttac 660

aatggcacga caaaatattc tacgggtaac gcaggacgtc gcggcgattt aggctcactg 720

gcagcacgtg tggcagctca actgccagcg agcttcaatt ttggcggagc tgtcaaggtt 780

accagccagg accgtcacaa acaacgcatc attgcgccgg ctaagcaggg tggcgtgtac 840

aacggcacga gtaagtattc ggcaccagca acacgtcgcg gcgatcttgg cagtctggct 900

gctcgtctgg ctgcccagct gccagcatcg ttcaactatt gcggtggcac cgccaaatct 960

aaaaagttcc catcctacac cgccacctat cagttccacc accaccatca ccactaa 1017

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Cys Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg

20 25 30

Gly Asp Ser Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala

35 40 45

Ser Phe Asn Phe Gly Gly Ala Val Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His

50 55 60

Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Gly Gly Val Tyr Ser Gly

65 70 75 80

Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Ser Gln Asn Arg Arg Gly Asp Leu Gly Pro

85 90 95

Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly

100 105 110

Pro Gly Pro Gly Cys Val Tyr Asn Gly Val Ser Lys Tyr Ser Thr Thr

115 120 125

Gly Asn Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala

130 135 140

Ala Gln Leu Pro Ser Ser Phe Asn Phe Gly Gly Ala Val Glu Val Leu

145 150 155 160

Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Thr Lys Gln Gly

165 170 175

Gly Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg

180 185 190

Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala

195 200 205

Ser Phe Asn Phe Gly Pro Gly Pro Gly Cys Val Tyr Asn Gly Thr Thr

210 215 220

Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu

225 230 235 240

Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Gly

245 250 255

Ala Val Lys Val Thr Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Arg Ile Ile Ala

260 265 270

Pro Ala Lys Gln Gly Gly Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala

275 280 285

Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala

290 295 300

Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Ala Lys Ser

305 310 315 320

Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe His His His His

325 330 335

His His

Claims (4)

1.一种A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白疫苗，其特征在于：所述疫苗由水相和油相按比例混合后制备而成；所述水相的溶质为A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG；所述油相为Montanide ISA-201油佐剂；所述A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2；

所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白与Toll样受体9的配体CpG的重量比为5:（2-4）；所述水相和油相的体积比为1:（0.95-1.05）。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的主要组分含量为复合表位蛋白250 μg/mL，CpG佐剂150 μg/mL。

3.权利要求1或2所述的疫苗的制备方法，其特征在于：将权利要求1中所述的A型口蹄疫基因工程复合表位蛋白和Toll样受体9的配体CpG溶于磷酸盐缓冲液中，得到水相；将水相与油相等温度充分混合，乳化，得疫苗。

4.权利要求1或2所述的疫苗在制备预防猪A型口蹄疫的药物中的应用。

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