JP2002510479A - コンパクトな構造の形成を引き起こすペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、互いに高い親和性を有し、かつ、タンパク質と結合した際に該タンパク質を折りたたんでコンパクトな構造にすることを助けるのに使用されるペプチドを含んでなる組成物および方法に向けられる。その安定性と拘束力のためにこの足場は細胞プロテアーゼおよびその他のプロテアーゼの存在下で包埋されるタンパク質配列のいずれの活性も延長することができる。該コンパクト構造はその他の機能的配列を包埋して有することができ、かつ、ライブラリースクリーニング、構造上偏りのあるペプチドライブラリーの作出、ならびに特異的細胞内および細胞外コンパートメントへの標的化のためには、直鎖状および拘束の少ないペプチドよりも好ましい。本発明の組成物は、ライブラリースクリーニング、薬剤スクリーニングおよび提示のためウイルス、古細菌、原核細胞および真核細胞の表面に提示され得る。本発明の方法はシグナル伝達経路を変調する細胞内エフェクタータンパク質のin vivoスクリーニングに、またin vitroにおける相互作用タンパク質の同定に有用である。従って、本発明は、遺伝子治療の足場として、新しい治療薬の手がかりの単離に、また生理学的液体中の治療薬としての可能性ある使用に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明の組成物および方法は自己会合する二量体化ペプチドの使用、およびコ
ンパクトな構造の形成を達成するための、他のタンパク質とそれらの併用に関す
る。

【０００２】

【発明の背景】

タンパク質は主としてコンホメーション上拘束されたドメインにより互いに相
互作用する。自由に回転するアミノ末端およびカルボキシル末端を有する直鎖状
ペプチドはそれ自体公知の有効な機能を持ち得るが、かかるペプチド構造の薬理
学的薬剤への変換は困難であることが多い。従って、コンホメーション上拘束さ
れた構造でのペプチドの提供すれば、その標的タンパク質と高い親和性を有する
医薬が作出されることとなる。拘束されたペプチドはそれらの直鎖状類似体に比
べ多くの価値ある特徴を持つ。このようなものとしては、（ｉ）アミノペプチダ
ーゼまたはカルボキシペプチダーゼに接近しやすい拘束されていないＮ末端また
はＣ末端アミノ酸残基と、エンドペプチダーゼ感受性を低下させる非伸長構造が
ないことによるタンパク質分解に対する安定性の増強[Szewczuk et al., Bioche
mistry 31:9132-9140 (1992)]；（ii）結合のコストが小さいことによる同族体 の結合タンパク質に対してより高い結合親和性が生じることとなり得る限定され
たコンホメーション空間[Hruby, Life Sci., 31:189-199 (1982); Rizo and Gie
rasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387-418 (1992)]；（iii）逆転、ループまたは その他の二次的な構造を模倣する幾何学[Rose et al., Adv. Protein Chem., 37
:1-109 (1985); Stradley et al., Biopolymers 29:263-287 (1990); Rizo et a
l., in Molecular Conformation and Biological Interactions (P. Balaram an
d S. Ramaseshan, eds.), Indian Academy of Sciences Publications (Bangalo
re, India), p469-496 (1991)]；および（iv）より簡単なファルマコホアおよび
薬剤の開発を可能とするコンホメーション上制限された足場が挙げられる。

【０００３】 このように拘束されたペプチドは新たなリガンドおよび受容体の単離のための
、またひいては薬剤として有用であり得る小分子の合理的な設計のための基礎を
なし得る。このアプローチが望ましいことは、種々の受容体の有効なリガンド [
O'Neil et al., Proteins: Structure Function and genetics 14:509-515 (199
2); Giebel et al., Biochem. 34:15430-35 (1995); Spatola and Crozet, J. M
ed. Chem. 39:3842-46 (1996); Koivunen et al., J. Biol. Chem. 268:20205-1
0 (1993); Koivune et al., J. Cell. Biol. 124:373-380 (1994)] 、酵素[McBr
ide et al., J. Mol. Biol. 259:819-27 (1996); Eichler et al., Mol. Divers
. 1:233-240 (1996)]、およびその他のタンパク質[Wang et al., J. Biol. Chem
. 270:23239-42 (1995)]を発見し、精製するために使用されてきた環状ペプチド
ライブラリーを用いて示された。

【０００４】 注目されるタンパク質をコンホメーション上制限されたドメインとして提供す
ることができる拘束されたタンパク質足場のいくつかが文献に記載されているが
、これらはミニボディー構造 [Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236(2):649-59
(1994)]、βシートターン上のループ 、コイルドコイル・ステム構造(Myszka an
d Chaiken, Biochemistry 33:2363-2372 (1994)、ジンクフィンガードメイン、 システイン結合（ジスルフィド）構造、トランスグルタミナーゼ結合構造、環状
ペプチド、ヘリカルバレル(helical barrels)またはヘリカルバンドル(helical
bundles)、ロイシンジッパーモチーフ(Martin et al., EMBO J. 13(22):5303-53
09 (1994); O'Shea et al., Science 243:538-42 (1993))などを含んでいる。

【０００５】 さらに、神経ペプチドヘッドアクチベーター[さらなる概説としては以下; Bod
enmuller et al., EMBO J. 5(8):1825-1829 81986)] 、物質Ｐ[Poujade et al.,
Biochem. Biophys. res. Commun. 114:1109-1116 (1983)]、メテンケファリン(
metenkephalin)[Mastropaolo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 134:69
8-703 (1986)]および神経ペプチドＹ[Minakata et al., J. Biol. Chem. 264:79
07-7913 (1989)]などの調節ペプチドに関しては、自己凝集が記載されている。

【０００６】 本発明の主題に直接関係するのは、淡水腔腸動物ヒドラから単離された神経ペ
プチドヘッドアクチベーター（ＨＡ）(Bodenmuller et al., 上記)に由来するペ
プチドである。Bodenmuller et al.は生理学的条件の下でＨＡペプチド（ｐＥＰ
ＰＧＧＳＫＶＩＬＦ）が二量体化して生物学的に不活性な分子を形成することを
実証した。

【０００７】 単量体形態の二量体化は、１０^-13Ｍといった低い濃度でもその単量体成分へ 解離しない安定な構造をもたらす。ＨＡ断片のさらなる解析により、ＨＡペプチ
ドのカルボキシ末端から直前６個のアミノ酸残基のみを含む断片（ｐＳＫＶＩＬ
Ｆ）の方がＨＡ自身よりより効率的に二量体化したことが明らかになった。しか
しながら、直前４個のアミノ酸残基のみを含む断片（ｐＶＩＬＦ）およびＨＡの
アミノ末端に由来する断片（ｐＥＰＰＧＧＳＫ）は二量体の形成をもたらさなか
った。より重要なことには、それらの解析は、カルボキシ末端フェニルアラニン
の置換とその改変の双方（例えば、芳香環のパラ（４）位におけるヨウ素の導入
）が二量体化を完全に無効にする、または二量体化傾向を劇的に少なくすことを
示した。

【０００８】 Aldwin et al.(US5,491,074)は「会合ペプチド」としてのＳＫＶＩＬＦをいう
場合、そのアミノ末端配列またはそのカルボキシ末端のいずれかのさらなるアミ
ノ酸残基を加え、その結果得られるタンパク質のいくつかが二量体ペプチドを形
成可能であることがわかった。しかしながら、Aldwin et al.は、注目されるあ るペプチドへの１を超える「会合ペプチド」の付加を実証または予測することは
できなかった。

【０００９】 従って、種々の適用に用いられる二量体化ペプチドを提供することが本発明の
目的である。

【００１０】

【発明の概要】

互いに対して中程度または高い親和性を有するペプチドは、タンパク質のＮ末
端およびＣ末端の双方へ延長部として付加された場合、タンパク質を折りたたん
でコンパクトな構造とする助けとするのに使用できる。同種の直鎖状タンパク質
およびジスルフィド環状タンパク質に比べ、この新たなコンパクトな構造は細胞
およびその他のプロテアーゼに対してより安定であり、しかも直鎖状ペプチドよ
りもさらに著しくコンホメーション上拘束されている。このコンパクトな構造は
その配列内に埋め込まれたその他の機能配列を有し、細胞内および細胞外ライブ
ラリーのスクリーニングに関して、また特異的細胞内限局化のための標的化に関
して、直鎖状ペプチドよりも好ましい。これをランダムペプチド配列の種々の残
基の各々の末端上の適当なフランキング残基とともに用いて、構造的に偏りのあ
るペプチドライブラリーを作出することができる。その安定性と拘束によりこの
足場は、プロテアーゼの存在下でも埋め込まれたペプチド配列のいずれもの活性
を延長することができる。

【００１１】 本明細書において自己凝集特性を有するペプチドを二量体化ペプチド（ＤＰ）
という。本発明の二量体化ペプチドは配列ＦＬＩＶＫ（アミノ末端からカルボキ
シ末端まで）を含んでなる。注目されるタンパク質の折りたたみを促す二量体化
配列の例としては、限定されるものではないが、ＦＬＩＶＫ、ＥＦＬＩＶＫＳ、
ＫＦＶＬＩＫＳ、ＶＳＩＫＦＥＬ、ＬＩＶＫＳ、ＥＦＬＩＶＫ、ＫＦＬＩＶＫ、
ＦＥＳＩＫＶＬおよびＬＫＳＩＶＥＦが挙げられる。これらの二量体化ペプチド
（ＤＰ）をいくつかの組合せで用いて、一般構造「ＤＰ−タンパク質」または「
ＤＰ−タンパク質−ＤＰ」（ここで、「ＤＰ」は二量体化ペプチドであり、「タ
ンパク質」は少なくとも２個のアミノ酸残基を含んでなる）のタンパク質を得る
ことができる。さらに一般に、限定されるものではないが、リンカー配列、タグ
配列、標的配列および安定化配列をはじめとするさらに他のアミノ酸配列が含ま
れる。

【００１２】 その他の配列としては疎水性アミノ酸が高含量で、１または２価の電荷を持つ
残基側鎖を有するものが挙げられる。一般に、少なくとも３〜４個の疎水性の高
い残基（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷおよびＹから採用）を伴って５、６、７および
８個のアミノ酸からなる二量体化ペプチドの各末端の配列がこの様式で機能する
であろう。

【００１３】 本発明の組成物は細胞内または細胞外に提示され、結合タンパク質および分子
を同定するのに、また細胞内のシグナル伝達経路を変調するのに有用である。本
発明の１つの態様において、拘束されたタンパク質のライブラリーはその生理活
性能に関してin vivoで評価される。このように本発明は生細胞内の分子または 標的を利用するものであり、この生細胞の表現型に作用する拘束タンパク質の単
離を提供する。本方法はａ）拘束タンパク質をコードするライブラリーを複数の
細胞に導入するステップ、およびｂ）該ライブラリーのメンバーによって細胞に
与えられた表現型の変化に関して複数の細胞をスクリーニングするステップを含
んでなる。本方法はまた、ｃ）変化した表現型を示す細胞を単離するステップ、
およびｄ）表現型の変化を引き起こすライブラリーのメンバーを単離するステッ
プを含んでもよい。 もう１つ態様では、本発明の組成物は結合タンパク質および拘束されたタンパ
ク質と結合できるその他の小分子をin vitroで同定するのに有用である。本方法
は、ａ）注目される拘束タンパク質を準備するステップ；ｂ）注目される拘束タ
ンパク質を固相支持体に結合させるステップ；ｃ）個々のメンバーの複数を含ん
でなる分子ライブラリーを準備するステップ；およびｄ）個々のメンバーを注目
される拘束タンパク質に結合させる条件を提供するステップを含んでなる。本方
法はまたｅ）結合したライブラリーのメンバーを単離するステップを含んでもよ
い。

【００１４】 もう１つの態様では、本発明は複数の拘束タンパク質を含んでなる分子ライブ
ラリーの構築を提供する。この拘束タンパク質のライブラリーは、注目されるタ
ンパク質と結合できる個々のメンバーを同定するためのin vitro結合アッセイで
使用される。本方法はａ）注目されるタンパク質を準備するステップ；ｂ）注目
されるタンパク質を固相支持体に結合させるステップ；ｃ）複数の拘束タンパク
質を含んでなる分子ライブラリーを準備するステップ；およびｄ）拘束タンパク
質を注目されるタンパク質と結合させる条件を提供するステップを含んでなる。
本方法はまたｅ）結合した拘束タンパク質を単離するステップを含んでもよい。

【００１５】 このように本発明の組成物は遺伝子治療のための、また生理学的流体における
治療薬としての可能性ある使用のための足場として有用である。

【００１６】 本発明のさらなる態様では、拘束タンパク質を融合パートナーと結合させるか
、または特異的な細胞下コンパートメントに対して標的化する。

【００１７】 本発明はまた、プラスミドおよびレトロウイルス成分を含んでなり、拘束タン
パク質をコードする分子ライブラリーおよびこれらの分子ライブラリーを含んで
なる宿主細胞を提供する。

【００１８】 ［発明の詳細な説明］ 環状あるいは拘束ペプチドは、タンパク質分解に対する安定性の増強および結
合のエントロピーコストが小さいことにより同種の結合タンパク質に対する結合
親和性がより高くなる限定されたコンホメーション空間をはじめ、直鎖状類似体
に比べて多くの価値ある特徴を持つ。これらの拘束ペプチドは続いての薬剤とし
て有用であり得る小分子の設計の基礎をなし得る。最も短くしたタンパク質に含
まれる拘束ペプチドもまた、タンパク質間の相互作用をブロッキングする薬剤の
設計の中間ステップとして有用であり[Cunningham and Wells, Curr. Opin. Str
uct. Biol. 7:457-462 (1997)]、これは参照により本明細書に組み入れられ、。
細胞内シグナル伝達経路を調節する新規な方法を与えるものである。ペプチドが
細胞内で発現されると、細胞内シグナル伝達経路を変調し得る[Souroujon and M
ochly-Rosen, Nat. Biotechmol. 16(10):919-24 (1998)]。ペプチドが哺乳類の 生細胞で発現されれば、それらは細胞の表現型の定義された変化に関してスクリ
ーニングされ、生じた生理活性ペプチドはそれらの結合標的の親和性単離の経路
を提供し得る。

【００１９】 従って、本発明は二量体化ペプチドを提供する。本明細書において「二量体化
ペプチド」、「ＤＰ」もしくは「会合ペプチド」または文法上の同義語は、自己
凝集するか、または別のペプチドと二量体化もしくは会合するペプチドを意味す
る。

【００２０】 本明細書において「自己凝集する」、または「二量体化する」もしくは「会合
する」とは、あるペプチドが別のペプチドと親和性を有し、かつ、それ自身この
ペプチドと非共有結合することを意味する。互いに結合できる２分子（例えば２
つのペプチド）間の相互作用は通常、これらの分子が相互作用する強度、すなわ
ちこれらの分子が互いに対して有する「親和性」の点で特徴づけられている。測
定される親和定数の範囲は、例えば、抗体−抗原結合については１０⁵リットル ｍｏｌ^-1ないし１０¹²リットルｍｏｌ^-1に及ぶ[Harlow and Lane, Anitibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]。比較と
して、その基質に対するトリプシンの親和性は約１．２５ｘ１０⁴リットルｍｏ ｌ^-1であり、ＤＮＡに対するλリプレッサーの親和性は１０¹⁰リットルｍｏｌ^-1 である(Harlow and Lane, 前記)。本発明はにより提供される二量体化ペプチド は通常、互いに対して約１０⁵リットルｍｏｌ^-1ないし約１０¹³リットルｍｏｌ^{- 1} 、より通常には約１０⁶リットルｍｏｌ^-1ないし約１０¹³リットルｍｏｌ^-1の範
囲の親和性を有し、約１０⁷リットルｍｏｌ^-1ないし約１０¹³リットルｍｏｌ^-1 であることが好ましく、約１０⁸リットルｍｏｌ^-1ないし約１０¹³リットルｍｏ ｌ^-1であることがさらに好ましく、約１０⁹リットルｍｏｌ^-1ないし約１０¹³リ ットルｍｏｌ^-1であることが最も好ましく、約１０¹⁰リットルｍｏｌ^-1ないし約
１０¹³リットルｍｏｌ^-1であることが特に好ましい。当業者に公知のように、親
和定数の測定は温度、ｐＨおよび溶媒により影響を受ける。

【００２１】 本明細書において「ペプチド」とは、少なくとも２つの共有結合アミノ酸を含
んでなる化合物を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、および
ポリペプチドが挙げられる。該ペプチドは天然に存在するアミノ酸およびペプチ
ド結合、または合成ペプチド模倣構造からなる。従って本明細書で使用される「
アミノ酸」または「アミノ酸残基」または「ペプチド残基」は、天然に存在する
アミノ酸および合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン
、シトルリンおよびノルロイシンは本発明の目的のためのアミノ酸とみなされる
。「アミノ酸」はまたプロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基を
含む。その側鎖は（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のいずれであってもよい。好まし
い具体例では、アミノ酸残基は（Ｓ）またはＬ−配置である。天然に存在しない
側鎖を用いるならば、例えばin vivo分解を妨げるまたは遅延させるために非ア ミノ酸置換を使用してもよい。

【００２２】 一般に、ＤＰおよび試験ペプチドをはじめとする本発明のペプチドは少なくと
も約３個のアミノ酸長、通常は約３個のアミノ酸長ないし約１００個のアミノ酸
長を含んでなり、約３個のアミノ酸長ないし約５０個のアミノ酸長が好ましく、
約３個のアミノ酸長ないし約１０個のアミノ酸長がさらに好ましく、約４個のア
ミノ酸長ないし約１０個のアミノ酸長が最も好ましく、約５個のアミノ酸長ない
し約９個のアミノ酸長が特に好ましく、５、６、７、８、９および１０個のアミ
ノ酸からなるペプチドが好ましい。同様に、より大きな試験タンパク質を用いる
場合は、これらは少なくとも約３個のアミノ酸長、通常は約３個のアミノ酸長な
いし約１０００個のアミノ酸長を含んでなり、約３個のアミノ酸長ないし約６０
０個のアミノ酸長が好ましく、約３個のアミノ酸長ないし約４００個のアミノ酸
長がさらに好ましく、約３個のアミノ酸長ないし約２００個のアミノ酸長が最も
好ましく、約３個のアミノ酸長ないし約１００個のアミノ酸長が特に好ましい。

【００２３】 本発明の二量体化ペプチド（ＤＰ）は配列ＮＨ₂−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−
ＣＯＯＨを含んでなり、一般には９個以下のアミノ酸長である（ここで、Ｘ₁、 Ｘ₂、Ｘ₃、およびＸ₄は一般にアミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、ＷおよびＹからなる群 より選択され、かつ、Ｘ₅は一般にＫ、Ｒ、ＤおよびＥからなる群より選択され る）。

【００２４】 好ましい具体例では、該二量体化ペプチド（ＤＰ）は配列ＮＨ₂−ＦＬＩＶＫ −ＣＯＯＨを含んでなる。先に概説したように、その他の配列としては疎水性ア
ミノ酸が高含量であり、かつ、１または２個の電荷を持つアミノ酸残基を有する
ものが挙げられる。一般に、少なくとも３、４個の高い疎水性残基を有する５、
６、７および８個のアミノ酸からなる配列（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗおよび
Ｙから採用）がこの様式で機能する。

【００２５】 好ましい具体例では、該二量体化配列はＮＨ₂−ＸＦＬＩＶＫ−ＣＯＯＨ（こ こで、ＸはＤ、Ｅ、ＫまたはＲのいずれかである）である。

【００２６】 もう１つの好ましい具体例では、該二量体化配列はＮＨ₂−ＸＦＬＩＶＫＳ− ＣＯＯＨである。

【００２７】 好ましい具体例では、該二量体化配列はＮＨ₂−ＸＦＬＩＶＫＳ−ＣＯＯＨ（ ここで、Ｘはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたはアルギニンのいずれ
かである）である。

【００２８】 もう１つの具体例では、ＤＰタンパク質は、さらに詳細には以下に概説される
ように、タンパク質の一方の末端と融合した（Ｌｙｓ）_4-8または（Ａｒｇ）_4-8 、およびタンパク質のもう一方の末端と融合した（Ａｓｐ）_4-8または（Ｇｌｕ ）_4-8を含む配列を含んでなる。かかるＤＰタンパク質は４−８残基のイオン対 により延長されるアレイを形成する末端を伴うコンパクトな構造を形成すると期
待される。

【００２９】 特に好ましい具体例としては、限定されるものではないが、配列ＥＦＬＩＶＫ
Ｓ、ＫＦＬＩＶＫＳ、ＥＥＦＬＩＶＫＫＳ、ＥＥＦＬＩＶＫＫＳ−酸、ＶＳＩＫ
ＦＥＬ、ＳＫＶＩＬＦＥ、ＡＦＬＩＶＫＳ、ＥＡＬＩＶＬＳ、ＥＦＡＩＶＫＳ，
ＥＦＬＡＶＫＳ、ＥＦＬＩＡＫＳ、ＥＦＬＩＶＡＳ、ＥＦＬＩＶＫＡ、ＥＦＬＫ
ＶＫＳ、ＳＫＶＩＬＦＥ、ＥＦＬＩＶＥＳ、ＥＫＬＫＶＫＳ、ＥＳＬＳＶＫＳ、
ＥＦＬＩＶＥＳ、ＶＳＩＫＦＥＬ、ＬＩＶＫＳ、ＦＥＳＩＫＶＬおよびＬＫＳＩ
ＶＥＦが挙げられる。

【００３０】 好ましい具体例では、本発明のＤＰは、本明細書においてしばしばその大きさ
によって「注目されるタンパク質」、「注目されるペプチド」、「試験タンパク
質」、または「試験ペプチド」と呼ばれる、注目されるタンパク質またはペプチ
ドと共有結合している。

【００３１】 本明細書において「注目されるタンパク質」、「注目されるペプチド」、「試
験タンパク質」、もしくは「試験ペプチド」、または文法上の同義語は、一般に
機能が調べられる、または試験される特定の特徴を有するタンパク質を意味する
。一般に試験タンパク質はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡから、またはランダム核酸か
ら得られる核酸によりコードされる。これらの核酸が発現して（下記に詳細に記
載）該試験タンパク質が生じる。より小さな試験タンパク質、通常試験タンパク
質もまたペプチドシンセサイザーで合成することができる。ペプチドシンセサイ
ザーでの合成は、限定されるものではないが、非天然アミノ酸、または模倣ペプ
チド結合をはじめとする合成類似体を組み込ま、試験タンパク質または試験ペプ
チドの効力または安定性を高めることができる。

【００３２】 好ましい具体例では、該試験ペプチドはランダム化される。本明細書において
「ランダム」もしくは「ランダム化」または文法上の同義語は核酸およびペプチ
ドの各々がそれぞれ必須ランダムヌクレオチドおよびランダムアミノ酸からなる
ことを意味する。一般にこれらのランダム試験ペプチドは分子ライブラリーから
発現される。好ましい具体例では、該分子ライブラリーは少なくとの２つの異な
るランダムな核酸配列を含んでなるが、複数の異なるランダム核酸配列が好まし
い。これらの核酸配列は化学的に合成されるが、いずれの位置にいずれのヌクレ
オチド組み込んでもよい。合成のプロセスは、ランダム核酸を生じ、その配列の
長さにわたって可能性のある組合せのすべてまたは大部分を形成させるよう設計
することができ、従って候補となるランダムなタンパク質性分子（例えばランダ
ムなＤＰタンパク質候補）をコードするランダム核酸のライブラリーが形成され
る。該ランダム核酸配列はこのように断片ライブラリーをなし、各々は異なるタ
ンパク質をコードし、それは本明細書で概説されるように好適なベクターに連結
され、細胞へ形質転換される。

【００３３】 ある具体例では、該ライブラリーは十分にランダム化されており、いずれの位
置でも配列の優先や一定性はない。

【００３４】 もう１つの好ましい具体例では、該ライブラリーには偏りがある。すなわち、
その配列のいくつかの位置は一定に維持されているか、またはある限られた数の
可能性から選択される。例えば、好ましい具体例では、ヌクレオチドトリプレッ
ト（ＮＮＮ）はランダム化され、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインの
ためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンもしくは
ヒスチジンなど、またはプリンなどの生成に向け、定義されたクラス内のアミノ
酸残基、例えば疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、立体位的に偏りのある（小さ
いまたは大きい）残基をコードする。

【００３５】 本明細書において「ランダムペプチドライブラリー」または「ランダムタンパ
ク質ライブラリー」とは、ランダムペプチド（またはランダムタンパク質）をコ
ードする組換えベクター、これら組換えベクターによってコードされるランダム
ペプチド（またはランダムタンパク質）、ランダムペプチド（またはランダムタ
ンパク質）を含んでなる融合タンパク質をコードする組換えベクター、およびラ
ンダムペプチド（またはランダムタンパク質）を含んでなり、これら組換えベク
ターによってコードされる融合タンパク質を含んでなる。

【００３６】 好ましい具体例では、候補となるＤＰ−タンパク質の配列を用いて、始めに単
離された候補ＤＰ−タンパク質の誘導体を作出する。例えば、候補となるＤＰ−
タンパク質の配列は２回めの（偏りのある）ランダム化に基づくものであって、
活性が増強または変化した誘導体ＤＰ−タンパク質を作出してもよい。あるいは
、この２回目のランダム化は生理活性薬剤の親和性を変化させ得る。また、同定
されたＤＰ−タンパク質のタンパク質成分は、もとの候補ＤＰ−タンパク質を単
離するのに使用するよりも、種々の二量体化配列と機能し得る形で連結すること
が望ましいであろう。この結果、多少とも拘束され、ゆえに活性が変化している
可能性がある融合タンパク質が生じることとなる。また、リガンド領域の一方の
末端を一定に維持したまま、他方の末端をランダム化してペプチド周囲の結合を
シフトさせることによる結合ポケットの突然変異誘発と同様にして、可能性のあ
る結合部位の周囲「ウォーク(walk)」するのが望ましい。

【００３７】 好ましい具体例では、該試験タンパク質は野生型または天然に存在する配列を
含んでなる。あるいは、それはその誘導体タンパク質であってもよく、すなわち
それは始めに単離されたＤＰ−タンパク質には見られないアミノ酸置換、挿入も
しくは欠失、またはその組合せを含んでもよい。これらの改変は通常、注目され
るタンパク質をコードする核酸のin vitro突然変異誘発により行われる。in vit
ro突然変異誘発法は当業者に十分公知であり、例えばSambrook et al., Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1988)およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology
(John Wiley & Sons, Inc., 1995)に見出せる。

【００３８】 本明細書において本発明のＤＰは試験ペプチドに共有結合されている。「共有
結合(covalently attached or covalently joined)」または文法上の同義語は、
シグマ結合、Ｐｉ結合、および配位結合をはじめとする少なくとも１個の結合で
２つの成分が結びついていることを意味する。以下に十分概説されるように、本
発明のＤＰは融合パートナーおよび／または試験ペプチドと共有結合している。
融合パートナーおよび試験ペプチドとの共有結合はシステイン（ジスルフィド）
結合、ペプチド結合、種々の二機能性薬剤（マレイミド安息香酸、メチルジチオ
酢酸、メルカプト安息香酸、Ｓ−ピリジルジチオポロピオネートなどのような架
橋剤）、または非ペプチド結合による結合を用いることにより達成される。非ペ
プチド結合の例としては、限定されるものではないが、逆転結合(retroinverso
bounds)、Ｎ−メチルアミン結合、ジペプチド結合(depspeptide bounds)、ヒド ロキシアミノペプチドイソテレス(isoteres)、チアミド結合、ペプトイド(pepto
ids)[Simon et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71 (1992)]、二重結
合、還元ペプチド結合、エチレン結合、ケトペプチド類似体、メチレンスルホキ
シド、およびメチレンスルフィド[Rizo and Gierasch, Annu. Rev. Biochem. 61
:387-418 (1992)]を用いることにより達成される。

【００３９】 一般に以下に詳細に示されるように、該ＤＰは、例えば該ＤＰおよび注目され
る各々のペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を発現させることにより、
ペプチド結合を用いてペプチドまたはタンパク質に連結させる。

【００４０】 好ましい具体例では、本発明のＤＰは、当業者には理解されるであろうが、多
様な方法で試験ペプチドと連結して融合タンパク質を形成する。以下にさらに十
分詳細に記載されるように、それらは１以上の内部の位置に、あるいは好ましく
はＮ末端およびＣ末端の一方または双方と連結することができる。ＤＰと融合パ
ートナーを結合させると、本明細書でＤＰ−タンパク質と呼ばれる構造が得られ
る。

【００４１】 本明細書において「ＤＰ−タンパク質」は少なくとも１つのペプチドと共有結
合した少なくとも１つの二量体化ペプチドを含んでなる化合物を意味する。ＤＰ
−タンパク質には以下に定義されるように候補ＤＰ−タンパク質が含まれる。当
業者には理解されるであろうが、１つのＤＰを用いる場合、本発明の組成物およ
び方法は２つの試験ペプチドの会合において使用が見出せる。すなわち第１のＤ
Ｐ（ＤＰ₁）を第１の試験タンパク質（タンパク質₁）に連結し、第２のＤＰ（Ｄ
Ｐ₂）を第２の試験タンパク質（タンパク質₂）に連結しさせる。２つのＤＰを用
いる場合は、該組成物は拘束された試験ペプチドの作出において使用が見出せる
。

【００４２】 好ましい具体例では、少なくとも１つのＤＰを試験タンパク質のＮ末端に連結
するが、２つのＤＰの結合が好ましい。この具体例では、２以上のＤＰを試験タ
ンパク質に連結するが、このＤＰは配列において一致していてもよいし、あるい
は異なる配列であってもよい。該ＤＰは以下にさらに概説されるようにリンカー
配列によって分断されていてもよいし、されていなくともよい。ある具体例では
、同一のＤＰまたは互いに親和性を有する２つの異なるＤＰを２つの異なる試験
タンパク質、タンパク質₁およびタンパク質₂のＮ末端に連結し、例えばＤＰ−タ
ンパク質₁およびＤＰ−タンパク質₂を形成するが、この互いに会合した２つのＤ
Ｐ、およびタンパク質₁とタンパク質₂は近接されることとなる。同一のＤＰ配列
が存在することにより、タンパク質₁：タンパク質₂ヘテロ二量体の他、タンパク
質₁：タンパク質₁ホモ二量体およびタンパク質₂：タンパク質₂ホモ二量体が作出
できる。

【００４３】 好ましい具体例では、少なくとも１つのＤＰを試験タンパク質のＣ末端に連結
するが、２つのＤＰの結合が好ましい。前記と同様、このＤＰは配列において一
致していてもよいし、あるいは異なる配列であってもよい。該ＤＰは以下にさら
に概説されるようにリンカー配列によって分断されていてもよいし、されていな
くともよい。ある具体例では、同一のＤＰまたは互いに親和性を有する２つの異
なるＤＰを２つの異なる試験タンパク質、タンパク質₁およびタンパク質₂のＣ末
端に連結し、例えばタンパク質₁−ＤＰおよびタンパク質₂−ＤＰを形成するが、
この互いに会合した２つのＤＰ、およびタンパク質₁とタンパク質₂は近接される
こととなる。同一のＤＰ配列が存在することにより、タンパク質₁：タンパク質₂ ヘテロ二量体の他、タンパク質₁：タンパク質₁ホモ二量体およびタンパク質₂： タンパク質₂ホモ二量体が形成される。

【００４４】 好ましい具体例では、少なくとも１つのＤＰを試験タンパク質の内部の位置に
連結するが、２つのＤＰの結合が好ましい。前記と同様、このＤＰは配列におい
て一致していてもよいし、あるいは異なる配列であってもよい。該ＤＰは以下に
さらに概説されるようにリンカー配列によって分断されていてよいし、されてい
なくともよい。２以上のＤＰを内部の位置に連結する場合はＤＰを並列してもよ
く、すなわち同じ内部の位置に挿入されれば、例えば_Nタンパク質_I−ＤＰ₁−Ｄ Ｐ₂−_Iタンパク質_Cが形成され、あるいはＤＰは分断して異なる内部の位置に連 結してもよく、その場合には例えば_Nタンパク質_I−ＤＰ₁−_Iタンパク質_I−ＤＰ₂ −_Iタンパク質_Cが形成される。なおここで、「Ｎ」は試験タンパク質のアミノ末
端部分であり、「Ｃ」は試験タンパク質のカルボキシ末端部分であり、「Ｉ」は
二量体化ペプチドＤＰ₁およびＤＰ₂によってフランクされた該タンパク質の内部
部分である。ある具体例では、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一の配列であるか、または
互いに親和性を有し、それらは会合し、かつ、ＤＰ₁およびＤＰ₂に囲まれた試験
タンパク質の一部（すなわち、_Iタンパク質_I）はループ構造をなす。

【００４５】 好ましい具体例では、ＤＰと試験タンパク質との結合は直接的であり、すなわ
ちＤＰ配列と試験タンパク質配列との直接的な様式が存在する。

【００４６】 好ましい具体例では、ＤＰと試験タンパク質との結合は間接的であり、すなわ
ちリンカーまたはスペーサーが用いられる。本明細書において「リンカー」もし
くは「スペーサー」もしくは「テザー(tethering)配列」または文法上の同義語 は、２つの分子を結合する分子または分子群を含んでなることを意味する。リン
カーを含むことはとしばしば２つの分子を好ましい配置にするのに役立ち、例え
ば２つの分子はより拘束された配置になるか（かかる場合にはプロリンを含むリ
ンカーが用いられる）、または２つの分子はより柔軟な配置になる（すなわち、
最小の立体障害；かかる場合にはセリンを含むリンカーが用いられる）。

【００４７】 好ましい具体例では、リンカー配列はいずれの位置にも含まれ、すなわちＤＰ
と注目されるタンパク質との間、関連のない２つのＤＰ間、または２つの融合パ
ートナーの間に含まれる。本明細書に概説されるように、該リンカー配列はタン
パク質性であっても、非タンパク質性であってもよい。化合物の個々の成分間の
リンカー配列は、例えば注目されるタンパク質が妨害されていない可能性ある標
的と相互作用を可能とすること、注目されるタンパク質を拘束すること、または
注目されるタンパク質に付与された新たな特性（例えば、細胞下の局在化）を機
能させることが望ましいと考えられる。注目されるタンパク質を拘束するには、
プロリンを含むリンカーが特に好ましい。当技術分野で公知のように、プロリン
はポリペプチド鎖に独自のコンホメーション上の拘束を付与する。有用なプロリ
ンリンカーとしては、プロリン−グリシン重合体（限定されるものではないが、
（ＰＧ）_n、（ＰＰＧＧ）_n、（ＰＰ）_nおよびその組合せ（ここで、ｎは少なく とも１の整数である）を含む）が挙げられる。ポリペプチドのいくらか柔軟にす
る好ましいリンカーとしては、グリシン−セリン重合体（限定されるものではな
いが、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎ、ならびにその組合
せ（ここで、ｎは少なくとも１の整数である）を含む）、グリシン−アラニン重
合体、アラニン−セリン重合体、ならびにシェーカー型カリウムチャンネルのテ
ザーなどのその他の可変リンカー、および当業者に理解されるような多様なその
他の可変リンカーが挙げられる。グリシン−セリン重合体が特に好ましい。

【００４８】 好ましい具体例では、該ＤＰ−タンパク質は２つのＤＰを含んでなる。この具
体例では、２つのＤＰを用いて試験タンパク質をコンホメーション上拘束する。
ＤＰは注目されるタンパク質のＮ末端およびＣ末端で共有結合される場合に（３
ないし５０個またはそれ以上のアミノ酸残基にわたる）、注目されるタンパク質
を折りたたんでコンパクトな構造（本明細書では拘束構造とも呼ばれる）とする
助けとなり、このコンパクトな構造は直鎖上タンパク質配列単独よりもタンパク
質分解耐性が高い。この具体例において、また分子の相互作用に関してスクリー
ニングする際に特に好ましいのはランダム試験タンパク質である。

【００４９】 好ましい具体例では、第１のＤＰ（ＤＰ₁）を試験タンパク質のＮ末端に融合 させ、第２のＤＰ（ＤＰ₂）を試験タンパク質のＣ末端に融合させ、例えばＤＰ₁ −_Nタンパク質_C−ＤＰ₂を形成するする。この具体例では、第１および第２のＤ Ｐは同一であっても、異なっていてもよい。自己凝集可能な２つのＤＰを用いる
場合、その２つのＤＰが会合して２つのＤＰに囲まれた試験タンパク質を拘束さ
れた構造となる。２つの異なるＤＰ（ＤＰ₁およびＤＰ₂）を試験タンパク質のＮ
末端およびＣ末端に連結する場合、その２つの異なるＤＰもやはり会合して試験
タンパク質を拘束された構造にすることができる（ただし、ＤＰ₁およびＤＰ₂は
互いに親和性を有する）。会合可能な異なるＤＰとしては、例えばＫＦＬＩＶＫ
ＳとＥＦＬＩＶＥＳがある。

【００５０】 ＤＰ−タンパク質の特に好ましい例としては、限定されるものではないが、（
ｉ）ＥＦＬＩＶＫＳ−タンパク質−ＥＦＬＩＶＫＳ；（ii）ＫＶＬＩＫＳ−タン
パク質−ＥＦＬＩＶＥＳ；（iii）ＶＳＩＫＦＥＬ−タンパク質−ＶＳＩＫＦＥ Ｌ；（iv）ＬＩＶＫＳ−タンパク質−ＬＩＶＫＳ；（ｖ）ＥＦＬＩＶＫＳ−タン
パク質−ＥＦＬＩＶＫ；（vi）ＦＥＳＩＫＶＬ−タンパク質−ＦＥＳＩＫＶＬ；
および（vii）ＬＫＳＩＶＥＦ−タンパク質−ＬＫＳＩＶＥＦが挙げられる。

【００５１】 さらに具体的には、本発明により提供されるＤＰ₁−タンパク質−ＤＰ₂様の化
合物は、（ｉ）ＥＦＬＩＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬ ＩＦＫＳ （ここで、このタンパク質配列はオオムギｃ２−キモトリプシン阻害剤
[ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ; Leatherbarrow and Salacinski, Bio
chemistry 30:10717-21 (1991)]由来のものであり、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一で ある）；（ii）ＥＦＬＩＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＳＫＶ ＩＬＦＥ （ここで、ＤＰ₂の配列はＤＰ₁の逆配列である）；（iii）ＳＫＶＩＬ ＦＥ −ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳ（ここで、ＤＰ ₁ の配列はＤＰ₂の逆配列である）；（iv）ＳＫＶＩＬＦＥ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹ
ＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＳＫＶＩＬＦＥ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一である
が、（ｉ）で示されるＤＰ₁およびＤＰ₂の逆である）；（ｖ）ＫＦＬＩＶＫＳ−
ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＫＦＬＩＶＫＳ（ここで、ＤＰ₁およ びＤＰ₂は同一である）；（vi）ＫＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲ ＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＥＳ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一である）；（vi
i）ＥＦＬＩＶＥＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＥＳ （ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一である）；（iix）ＥＫＬＫＶＫＳ−ＶＧＴ ＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＫＬＫＶＫＳ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂ は同一である）；（ix）ＥＳＬＳＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦ
Ｖ−ＥＳＬＳＶＫＳ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一である）；（ｘ）ＥＦＬ ＫＶＫＳ −ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＫＶＫＳ（ここで、
ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一である）；（xi）ＥＥＦＬＩＶＫＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭ
ＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＥＦＬＩＶＫＫＳ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同
一である）；（xii）ＭＧＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳ ＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳＧＰＰ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一であり、高い安
定性を付与するためにＤＰ₁はアミノ酸ＭＧを含んでなり、ＤＰ₂はアミノ酸ＧＰ
Ｐを含んでなる）；（xiii）ＫＫＫＫＫＫＧＧＧＧＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶ
ＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同
一であり、高い安定性を付与するためにＤＰ₁はアミノ酸ＫＫＫＫＫＫＧＧＧＧ を含んでなる）；（xiv）ＫＫＫＧＳＧＳＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹ ＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一であり
、高い安定性を付与するためにＤＰ₁はアミノ酸ＫＫＫＧＳＧＳを含んでなる） ；（xv）ＥＦＬＩＶＫＳ−ＳＴＫＳＩＰＰＱＳ−ＥＦＬＩＶＫＳ（ここで、９マ
ーの挿入はプロテアーゼ阻害剤の類似体を表す[Gariani and Leatherbarrowm J.
Peptide Res. 49:467-75 (1997)]；（xvi）ＭＧＥＦＬＩＶＫＳ−ＧＧＧＧＤＹ
ＫＤＤＤＤＫＧＧＧＧ−ＥＦＬＩＶＫＳＧＰＰ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同
一であり、高い安定性を付与するためにＤＰ₁はアミノ酸ＭＧを含んでなり、Ｄ Ｐ₂はアミノ酸ＧＰＰを含んでなり、かつこのタンパク質はグリシンスペーサー とともにフラッグエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を含んでなる）；（xvii）Ｍ
ＧＥＦＬＩＶＫＳ−ＧＧＧＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬＧＧＧＧ−ＥＦＬＩＶＫＳ ＧＰＰ（ここで、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一であり、高い安定性を付与するために
ＤＰ₁はアミノ酸ＭＧを含んでなり、ＤＰ₂はアミノ酸ＧＰＰを含んでなり、かつ
このタンパク質はグリシンスペーサーとともにインフルエンザヘマグルチニンエ
ピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ）を含んでなる）を含む。該二量体化配
列は前記のすべての例で下線が施されている。

【００５２】 好ましい具体例では、第１のＤＰ（ＤＰ₁）を試験タンパク質のＮ末端に連結 し、第２のＤＰ（ＤＰ₂）を試験タンパク質の内部の位置に連結する。ＤＰ₁−_N タンパク質_I−ＤＰ₂−_Iタンパク質_Cなどの構造が生じる。ある具体例では、ＤＰ ₁ およびＤＰ₂は同一の配列であるか、または互いに親和性を有し、それらは会合
して、ＤＰ₁とＤＰ₂に囲まれた試験タンパク質の一部（すなわち、_Nタンパク質_I ）はループを形成する。

【００５３】 好ましい具体例では、第１のＤＰ（ＤＰ₁）を試験タンパク質のＣ末端に連結 し、第２のＤＰ（ＤＰ₂）を試験タンパク質の内部の位置に連結する。_Nタンパク
質_I−ＤＰ₂−_Iタンパク質Ｃ−ＤＰ₁などの構造が生じる。ある具体例では、ＤＰ ₁ およびＤＰ₂は同一の配列であるか、または互いに親和性を有し、それらは会合
して、ＤＰ₁とＤＰ₂に囲まれた試験タンパク質の一部（すなわち、_Iタンパク質_C ）はループを形成する。

【００５４】 好ましい具体例では、第１のＤＰ（ＤＰ₁）と第２のＤＰ（ＤＰ₂）は双方とも
試験タンパク質の内部の位置に連結するが、試験タンパク質の２つの異なる内部
の位置が好ましく_Nタンパク質_I−ＤＰ₁−_Iタンパク質_I−ＤＰ₂−_Iタンパク質_Cな
どの構造が生じる。ある具体例では、ＤＰ₁およびＤＰ₂は同一の配列であるか、
または互いに親和性を有し、それらは会合して、ＤＰ₁とＤＰ₂に囲まれた試験タ
ンパク質の一部（すなわち、_Iタンパク質_I）はループを形成する。

【００５５】 好ましい具体例では、異なる二量体化ポリペプチドを互いに共有結合するであ
ろう１を超えるタンパク質と融合させる。この具体例では、個々の二量体化ペプ
チドはＤＰとタンパク質との間に、および／または個々のＤＰ間に挿入されたリ
ンカーによって分断されてもよい。例えば、ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−
ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Lys−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Glu（図２Ａを参照）（ ここで、ＤＰ_hydは主として疎水性のアミノ酸残基を含んでなるＤＰであり、Ｄ Ｐ_Lysは主としてリジン残基を含んでなるＤＰであり、ＤＰ_Gluは主としてグルタ
ミン酸残基を含んでなるＤＰであり、Ｌ_Pはプロリン残基を含んでなるリンカー であり、Ｌ_Gはグリシン残基を含んでなるリンカーであり、タンパク質₁およびタ
ンパク質₂は異なるタンパク質配列を含んでなるタンパク質である）が作出でき る。先に示した二価のＤＰ融合タンパク質は単一の融合タンパク質内で互いに共
有結合した２つの拘束構造を与え、「ダブルループ」構造を形成する。かかる構
造の中で、第１のループ（タンパク質₁を含んでなる）は第１のＤＰ_hydと第２の
ＤＰ_hydとの二量体化によって形成され、第２のループ（タンパク質₂を含んでな
る）はＤＰ_LysとＤＰ_Gluとの二量体化によって形成される。先に概説されたよう
に、該２つのループ構造はグリシンまたはセリン／グリシンリンカーなどの可変
リンカーによって分断されてもよい。

【００５６】 好ましい具体例では、異なる二量体化ペプチドを、次いで互いに非共有結合す
る１を超えるタンパク質と融合する。この具体例では、個々の二量体化ペプチド
はまたＤＰとタンパク質との間に、および／または個々のＤＰ間に挿入されるリ
ンカーによって分断されてもよい。例えば、以下のＤＰ融合タンパク質が作出で
きる：（ｉ）ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Lysおよび （ii）ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Glu（図２Ｂを参 照）（ここで、ＤＰ_hydは主として疎水性のアミノ酸残基を含んでなるＤＰであ り、ＤＰ_Lysは主としてリジン残基を含んでなるＤＰであり、ＤＰ_Gluは主として
グルタミン酸残基を含んでなるＤＰであり、Ｌ_Pはプロリン残基を含んでなるリ ンカーであり、Ｌ_Gはグリシン残基を含んでなるリンカーであり、タンパク質₁お
よびタンパク質₂は異なるタンパク質配列を含んでなるタンパク質である）。先 の例示では、個々の２つのタンパク質（タンパク質₁およびタンパク質₂）はそれ
ぞれのＤＰの会合により折りたたまれてコンパクトな構造となる。２種のＤＰ融
合タンパク質を混合する際、それらはＤＰ_LysとＤＰ_Gluとの特異的会合により非
共有結合二量体を形成し、その結果２つの異なるコンパクトタンパク質（タンパ
ク質₁およびタンパク質₂）を含んでなる二量体構造が得られる。もうい１つの具
体例では、２つのＤＰｈｙｄ間に挿入されるタンパク質配列は同一であって、す
なわち、（i）ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Lysおよび
（ii）ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Gluであり、結果 として同じタンパク質の並列された２つのコンパクトな構造を含んでなる非共有
結合性のダブルループが得られる。本明細書で示されるもの以外に複数のＤＰ融
合タンパク質が作出できることは当業者には明らかであろう。

【００５７】 好ましい具体例では、異なる二量体化ペプチドを、互いに非共有結合する１を
超えるタンパク質と融合する。この具体例では、２以上の非拘束タンパク質を非
共有結合させて拘束された構造を形成させるのに該ＤＰを用いる、ＤＰ−タンパ
ク質が生じる（図２Ｃ参照）。この具体例では、個々の二量体化ペプチドは、Ｄ
Ｐとタンパク質との間に挿入されたリンカーで便宜に分断され得る。例えば、以
下のＤＰ融合タンパク質が作出できる：ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ _Lys −Ｌ_G−ＤＰ_Lysおよび（ii）ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Glu（こ
こで、ＤＰ_hydは主として疎水性アミノ酸を含んでなるＤＰであり、、ＤＰ_Lysは
主としてリジン残基を含んでなるＤＰであり、ＤＰ_Gluは主としてグルタミン酸 残基を含んでなるＤＰであり、Ｌ_Pはプロリン残基を含んでなるリンカーであり 、Ｌ_Gはグリシン残基を含んでなるリンカーであり、タンパク質₁およびタンパク
質₂は異なるタンパク質配列を含んでなるタンパク質である）。前記の例におい ては、個々の２つのタンパク質（タンパク質₁およびタンパク質₂）は各々、それ
ぞれのＤＰの会合により、折りたたまれてコンパクトな構造となる。２つの融合
タンパク質を混合すると、それらはＤＰ_LysとＤＰ_Gluとの特異的会合により非共
有結合性の二量体を形成し、結果として２つの異なるコンパクトタンパク質（タ
ンパク質₁およびタンパク質₂）を含んでなる二量体構造が生じる。もう１つの具
体例では、２つのＤＰｈｙｄ間に挿入されたタンパク質配列は同一であって、す
なわち、（i）ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Lysおよび
（ii）ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Gluであり、結果 として同じタンパク質の２つの並列したコンパクト構造を含んでなる非共有結合
性のダブルループ構造が得られる。本明細書で示されるもの以外に複数のＤＰ融
合タンパク質が作出できることは当業者には明らかであろう。

【００５８】 その他の二量体化タンパク質配列も当技術分野で知られており、酵母ツー・ハ
イブリッド系などの公知のスクリーニング系を用いて単離し得る。

【００５９】 ある具体例では、例えば前記のＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd− Ｌ_G−ＤＰ_Lys−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Glu内の２つのタンパク質配列（タ
ンパク質₁およびタンパク質₂）は各々、特異的な生理活性を有し、これは先に概
説されたように構造体に結びついている場合、各々単独よりも高い生理活性を有
する二価のＤＰ融合タンパク質が得られることになる。例えば、両コンパクト構
造を、同じ標的タンパク質に結合してもよいが、親和性は低い。先に概説された
ように、両コンパクト構造を単一の二価ＤＰ融合タンパク質に結合させると、標
的タンパク質に対する親和性が遥かに高くなり、従って、単一のＤＰ融合タンパ
ク質は各々単独のＤＰタンパク質よりもより有効なアゴニストまたはアンタゴニ
ストとなり得る。

【００６０】 もう１つの好ましい具体例では、二価結合特異性を有するＤＰ_hyd−Ｌ_P−タン
パク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Lys−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Gluなど 、先に概説されたようなＤＰ融合タンパク質構造もまた、それらが親和性を有す
る２つのタンパク質の会合に有用である。この具体例では、タンパク質₁を含ん でなるコンパクト構造はタンパク質Ｘに対して親和性を有し、タンパク質₂を含 んでなるコンパクト構造はタンパク質Ｙに対して親和性を有する。このＤＰ融合
タンパク質を、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの両者を発現する細胞へ導入す
ると、二価のＤＰ融合タンパク質がタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙ双方に結合
することになり、それによりこれらは近接される。

【００６１】 同様に、二価の結合特異性を有するＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_{hy d} −Ｌ_G−ＤＰ_Lys−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Gluなど、先に概説されたよう なＤＰ融合タンパク質構造はまた、２つの細胞を会合させるのにも有用である。
該細胞は同一であっても、異なっていてもよい。この具体例では、タンパク質₁ を含んでなるコンパクト構造は、第１の細胞上で提示される細胞表面成分Ｘに対
して親和性を有する。タンパク質₂を含んでなるコンパクト構造は、第２の細胞 上で提示される細胞表面成分Ｙに対して親和性を有する。第１および第２の細胞
を同時培養し、この二価の融合タンパク質が供給されると、ＤＰ融合タンパク質
が細胞表面成分Ｘと細胞表面成分Ｙの双方と結合して、第１の細胞と第２にの細
胞が近接されることとなる。

【００６２】 遺伝子治療において最も積極的な態様の中に、注目される遺伝子の特異的標的
細胞への送達があり、これは遺伝子欠損を修復しようとするものである。いくつ
かの遺伝子送達系が当業者に公知であり、限定されるものではないが、裸のＤＮ
Ａ、リポソーム包埋ＤＮＡ、およびレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス
ウイルス、ＨＩＶなどを含むウイルス系が挙げられる。しかしながら、いずれの
系を利用しようとも、細胞種特異的な送達が依然、遺伝子治療の最も重要な態様
である。好ましい具体例では、二価の結合特異性を有するＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパ
ク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Lys−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Gluなど、 先に概説されたようなＤＰ融合タンパク質構造はまた、ウイルス粒子（例えば、
注目される遺伝子を送達するウイルス）と所望の標的細胞とを会合させる手段と
しても有用である。この具体例では、タンパク質₁を含んでなるコンパクト構造 は、該ウイルス上で提示される細胞表面成分Ｘに対して親和性を有し、タンパク
質₂を含んでなるコンパクト構造は、標的細胞上で提示される細胞表面成分Ｙに 対して親和性を有する。該ウイルスと標的細胞を同時培養し、二価のＤＰ融合タ
ンパク質が供給されると、その二価のＤＰ融合タンパク質と、ウイルス表面成分
Ｘおよび標的細胞表面成分Ｙの双方とが結合し、ウイルスとその標的細胞とを接
近させることとなる。従って、ウイルス粒子を所望の標的細胞と合体させ、遺伝
子送達を確実にする膜と融合させ得る。二価のＤＰ融合タンパク質を添加しない
場合にウイルスがその標的細胞と合体しないように、好適な制御が行われる。

【００６３】 もう１つの具体例では、２つのＤＰ_hyd間に、およびＤＰ_LysとＤＰ_Gluの間に 挿入されるタンパク質配列は同一であり、同じタンパク質の２つの並列したコン
パクト構造を含んでなるダブルループ構造が得られる。この具体例により同じタ
ンパク質の二量体化が可能となり、このタンパク質は細胞タンパク質または細胞
外タンパク質成分であってもよい。本明細書で示されたもの以外の複数のＤＰ融
合タンパク質が作出できることは当業者には明らかであろう。

【００６４】 本発明のＤＰまたはＤＰ−タンパク質はまた、以下に十分概説されるように、
改変してＤＰまたはＤＰ−タンパク質と、通常融合パートナーと呼ばれる別の異
種タンパク質またはアミノ酸配列とを含んでなる融合タンパク質を形成してもよ
い。

【００６５】 「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、それらの天然状態では
結合していないのが典型であるが、典型的にはペプチド結合を介してそれらのそ
れぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端によって結合して連続する単一のタ
ンパク質を形成するす、少なくとも２つのタンパク質からなるタンパク質をさす
。このタンパク質成分は直接結合することもできるし、またはペプチドリンカー
／スペーサーを介して結合することもできる。

【００６６】 本明細書において「融合パートナー」とは、ＤＰまたはＤＰ−タンパク質と会
合してＤＰまたはＤＰ−タンパク質に付加的機能または能力を付与する配列を意
味する。好適な融合パートナーとしては、限定されるものではないが、ａ）以下
に定義されるように、ＤＰもしくはＤＰ−タンパク質またはそれらをコードする
核酸のいずれかの精製または単離を可能にするタグ配列（レスキュー配列とも呼
ばれる）；ｂ）以下に定義される、ＤＰまたはＤＰ−タンパク質の細胞下または
細胞外コンパートメントへの局在化を可能にする標的配列；ｃ）分解に対する安
定性または分解からの保護をＤＰまたはＤＰ−タンパク質に付与する（例えばタ
ンパク質分解耐性）安定性配列；またはｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）ならびに要す
ればリンカー配列のいずれかの組合せが挙げられる。融合タンパク質は好ましく
はin vitro突然変異誘発および遺伝子スクリーニングにより作出され、それによ
りそれぞれの融合タンパク質をコードする核酸がしかるべく改変されることは、
当業者に十分公知である。好適な方法は、例えばSambrook et al., Molecular C
loning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 1989)およびAusbel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John
Wiley & Sons, Inc., 1995)に見出すことができる。

【００６７】 好ましい具体例では、該融合パートナーは、抗タグ抗体が選択的に結合できる
エピトープ、または精製配列を含んでなるエピトープを提供するタグペプチドを
含んでなる。該エピトープタグは一般に、必ずしも必要ではないが、ＤＰもしく
はＤＰ−タンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に置かれる。かかるエピト
ープタグ形態のＤＰまたはＤＰ−タンパク質の存在は、タグポリペプチドに対す
る抗体を用いて検出できる。また、このようなタグの使用により、該タンパク質
は、抗タグ抗体を用いるアフィニティー精製またはエピトープタグに結合する別
のタイプのアフィニティーマトリックスにより容易に精製可能となる。もう１つ
の具体例では、このキメラ分子はＤＰまたはＤＰ−タンパク質と免疫グロブリン
または免疫グロブリンの特定の領域との融合を含んでなる。該キメラ分子の二価
型については、かかる融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域またはＧＳＴ（グルタチオン
Ｓトランスフェラーゼ）に対するものであり得る。

【００６８】 種々のタグポリペプチドおよびそれら各々の抗体は当技術分野で十分公知であ
る。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジ
ン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチ
ドおよびその抗体１２ＣＡ５[Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (
1988)]；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、
Ｂ７および９Ｅ１０抗体[Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5:3610-3616 (1985)
]；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体[
paborsky et al., Protein Eng., 3(6):547-553 (1990)]が挙げられる。その他 のタグポリペプチドとしては、フラッグ−ペプチド[Hopp et al., Mol. Immunol
., 33:601-8 (1996); Brizzard et al., Biotechniques 16(4):730-735 (1994);
Knappik and Pluckthun, Biotechniques 17(4):754-61 (1994)]、ＫＴ３エピト
ープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]、タブリンエピト
ープペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:14163-14166 (1991)]、お
よびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]が挙げられる。あるいは、例えば 、ｐｏｌｙ−ｈｉｓタグを包含する融合タンパク質は金属（Ｎｉ）アフィニティ
ー樹脂上で効果的に精製される。

【００６９】 好ましい具体例では、タグ配列（レスキュー配列とも呼ばれる）を用いてＤＰ
−タンパク質をコードする核酸を単離する（以下もまた参照）。この具体例では
、該レスキュー配列は、ＰＣＲを通じての核酸構築体の迅速かつ容易な単離（以
下を参照）、ハイブリダイゼーションまたは関連の技術を可能とするため、プロ
ーブ標的部位として働く独特のオリゴヌクレオチド配列であってもよい。

【００７０】 好ましい具体例では、該融合パートナーは標的化配列である。当業者には理解
されるであろうが、有効濃度を高め、機能を同定するには、タンパク質を細胞内
に局在化することが単純な方法である。これらの機構はリガンドの検索空間の制
限という原理によるものであると考えられ、すなわちタンパク質の原形質膜への
局在化は、細胞質の三次元空間に対して膜付近の限定された方向の空間にそのリ
ガンドの検索を限定するものである。あるいは、タンパク質濃度はまた局在化の
特徴により簡便に上昇させることができ、例えば、そのタンパク質を核へ往復さ
せることは、それらをより小さな空間に限定し、それにより濃度が上昇する。

【００７１】 このように、好適な標的化配列としては、限定されるものではないが、（ｉ）
発現産物の生理活性を保持しつつ、それぞれのタンパク質を所定の分子または分
子クラスへ結合させることができる配列（例えば、酵素阻害剤または標的である
適した酵素クラスに対する基質配列を用いることによる）；（ii）それ自身のま
たは同時に結合しているタンパク質の選択的分解をシグナル伝達する配列；およ
び（iii）候補となる発現産物を、（ａ）ゴルジ体、小胞体、核、仁、核膜、ミ トコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム、および細胞膜などの細胞下の位
置；および（ｂ）分泌シグナルを介して細胞外の位置を含む所定の細胞の位置に
構成的に局在化させることができるシグナルが挙げられる[von Heijne, EXS 73:
67-76 (1995); von Heijne, Subcell. Biochem. 22:1-19 (1994)およびvon Heij
ne, Curr. Opin. Cell. Biol. 2(4):604-8 (1990)]。特に好ましいのは、細胞下
の位置かまたは分泌を介し細胞の外側のいずれかへの局在化である。

【００７２】 好ましい具体例では、該融合パートナーは核局在化シグナル（ＮＬＳ）である
。ＮＬＳは一般に、それらが細胞核に現れる全タンパク質を指示するのに働く短
い、陽電荷を帯びた（塩基性）ドメインである。多くのＮＬＳアミノ酸配列が報
告されており、（ｉ）ＳＶ４０（サルウイルス）ラージＴ抗原[Pro Lys Lys Lys
Arg Lys Val; Kalderon et al., Cell 39:499-509 (1984)]；ヒトレチノイン酸
受容体−β核局在化シグナル(ARRRRP; Hany et al., Bioconjug. Chem. 2(5):37
5-8 (1991); ＮＦ_KＢ ｐ５０[EEVQRKRQKL; Ghosh et al., Cell 62:1019-1092
(1990)]；ＮＦ_KＢ ｐ６５[EEKRKRTYE; Nolan et al., Cell 64:961-969 (1991)
]；およびその他[例えば、Boulikas, J. Cell. Biochem. 55(1):32-58 (1994)を
参照]のそれなどの一塩基ＮＬＳ（なおこれらは引用することにより本明細書に 組み入れられる）；ならびに（ii）アフリカツメガエル(Xenopus laevis)タンパ
ク質、ヌクレオプラズミン[Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly
Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp; Dingwall et al., Cell 30:449-458 (1982
)およびDingwall et al., J. Cell. Biol. 107:841-849 (1988)]が挙げられる。
多くの局在化研究では、合成ペプチドに組み込まれた、または一般的ではないが
細胞核に対して標的化されたリポータータンパク質につぎ足されたＮＬＳはこれ
らのペプチドおよびリポータータンパク質に核内での濃縮を引き起こすことを実
証している。例えば、Dingwall and Laskey, Annu. Rev. Cell. Biol., 2:367-3
90 (1986); Bonnerot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6795-6799 (19
87)およびGalileo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:458-462 (1990)を
参照。

【００７３】 好ましい具体例では、該融合パートナーは膜アンカーシグナル配列である。多
くの細胞内事象が原形質膜で始まるということに加え、多くの寄生体および病原
体が膜に結合するので、これは特に有用である。従って、膜結合ＤＰ−タンパク
質は、これらのプロセスにおける重要な要素の同定ならびに有効なインヒビター
またはアクチベーターの発見の双方に有用である。本発明はＤＰタンパク質を細
胞外に、または細胞質空間に提示する方法を提供する。細胞外提示のためには、
膜アンカー領域をＤＰ−タンパク質のカルボキシ末端に提供する。ＤＰ−タンパ
ク質は細胞表面に曝され、細胞外空間に提示され、その結果、他の表面分子（そ
れらの機能に影響を及ぼす）または細胞外媒質に存在する分子と結合することが
できる。かかる分子の結合は分子と結合するＤＰ−タンパク質を発現する細胞に
ある機能を付与することができる。細胞質領域は中立的であってもよいし、また
は細胞外ＤＰ−タンパク質に標的タンパク質または試験タンパク質が結合してい
る場合、細胞にある機能（キナーゼ、ホスファターゼの活性化、機能を果たすた
めのその他の細胞成分の結合）を付与するドメインを含んでもよい。同様に、Ｄ
Ｐ−タンパク質含有領域は細胞質領域内に含まれる可能性があり、膜貫通領域お
よび細胞外領域は不変のままであるか、または定義された機能を有する。

【００７４】 膜アンカー配列は当技術分野で十分公知であり、哺乳類膜貫通分子の遺伝的幾
何学に基づくものである。ペプチドは分泌シグナル配列に基づき膜に挿入され、
疎水性膜貫通ドメインを必要とする。もちろん膜貫通ドメインがＤＰ−タンパク
質領域のアミノ末端に置かれた場合は、それは細胞内ドメインとしてＤＰ−タン
パク質を固定する働きをし、これはいくつかの具体例において望ましいものであ
り得る。分泌シグナル配列および膜貫通ドメインは広範な膜結合タンパク質につ
いて知られており、これらの配列は、特定のタンパク質由来の対として、または
異なるタンパク質から採った各々の成分とともにしかるべく使用してもよく、あ
るいは該配列は合成であってもよく、また人工送達ドメインとして共通配列にそ
のまま由来するものであってもよい。

【００７５】 当業者には理解されるであろうが、ＳＳおよびＴＭ双方を含む膜アンカータン
パク質配列は広範なタンパク質について知られており、これらのうちいずれを用
いてもよい。特に好ましい膜アンカー配列としては、限定されるものではないが
、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−２、ＩＬ−８Ｒ、ＣＤ４およびＬＦＡ−１に由来するもの
が挙げられる。

【００７６】 有用な配列としては、（ｉ）ＩＬ−２受容体β−鎖[残基１〜２６はシグナル 配列であり、残基２４１〜２６５は膜貫通残基である；Hatakeyama et al., Sci
ence 244:551-556 (1989)およびvon Heijne and Gavel, Eur. J. Biochem. 174:
671-678 (1988)参照]およびインスリン受容体β鎖[残基１〜２７はシグナル配列
であり、残基９５７〜９５９は膜貫通ドメインであり、残基９６０〜１３８２は
細胞質ドメインである；Hatakeyama, 前記,およびEbina et al., Cell 40:747-7
58 (1985)参照]などのクラスＩ内在性膜タンパク質；（ii）中性エンドペプチダ
ーゼ[残基２９〜５１は膜貫通ドメインであり、残基２〜２８は細胞質ドメイン である；Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:59-66 (1987)]
などのクラスII 内在性膜タンパク質；（iii）ヒトシトクロムＰ４５０ ＮＦ２
５(Hatakeyama, 前記)などのタイプIIIタンパク質；および（iv）ヒトＰ−糖タ ンパク質(Hatakeyama, 前記)などのタイプIVタンパク質由来の配列が挙げられる
。特に好ましいのは、ＣＤ８およびＩＣＡＭ−２である。例えば、ＣＤ８および
ＩＣＡＭ−２由来のシグナル配列は転写物の５’最末端にある。ＣＤ８の場合、
これらの配列はアミノ酸１〜３２をコードし[MASPLTRELSLNLLLLGESILGSGEAKPQAP
; Nakauchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5126-30 (1985)]、ＩＣＡ
Ｍ−２の場合は１〜２１をコードする[MSSFGYRTLTVALETLICCPG; Staunton et al
., Nature 339:61-64 (1989)]。これらのリーダー配列は膜に該構築体を送達し 、一方、ＤＰ−タンパク質領域のカルボキシ末端に置かれた疎水性膜貫通ドメイ
ンは膜に該構築体を固定する働きをする。これらの膜貫通ドメインはＣＤ８由来
のアミノ酸１４５〜１９５(PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLIC
YHSR; Nakauchi, 前記)およびＩＣＡＭ−２由来の２２４〜２５６(MVIIVTVVSVLL
SLFVTSVLLCFIFGQHLRQQR; Staunton, 前記)により包含される。

【００７７】 あるいは、膜アンカー配列としてはＧＰＩアンカーが挙げられ、これは例えば
ＤＡＦのおいてグリコシル−ホスファチジルイノシトール結合を介して該分子と
脂質二重層の間で共有結合を形成するものである[PNKGＳGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGL
LGTLVTMGLLT, なお全角文字のセリンがアンカー部位である；Homans et al., Na
ture 333(6170):267-72 (1988),およびMoran et al., J. Biol. Chem. 266:1250
-1257 (1991)参照]。これを行うには、膜貫通配列の代わりにＴｈｙ−１由来の ＧＰＩ配列を可変領域の３’に挿入することができる。

【００７８】 ウイルス、古細菌、原核生物および真核生物起源の膜上でＤＰ−タンパク質を
展示することも本発明の範囲内にある。この具体例では、ＤＰ−タンパク質は、
膜に挿入された後にＤＰ−タンパク質領域がウイルス、古細菌、原核生物または
真核生物細胞の外側に位置して、例えば結合標的分子に関してスクリーニングし
た場合に結合標的分子に接近しやすいように膜タンパク質と融合させる。原核生
物の表面展示系としては、例えばフラジェリン[Lu et al., Biotechnology 13(4
):366-72 (1995)]および[氷核形成タンパク質[Jung et al., Nat. Biotechnol.
16(6):576-80 (1988)]などの表面タンパク質との機能的融合が挙げられる。その
他の原核生物タンパク質展示系はStahl and Uhlen, Trends Biotechnol. 15(5):
185-92 (1997)およびGeorgiou et al., Nat. Biotechnol. 15(1):29-34 (1997) によって総説されている。ウイルス展示系としては、限定されるものではないが
、（ｉ）Ｍ１３および誘導体などの糸状バクテリオファージ[総説としてはFelic
i et al., Biotechnol. Annu. Rev. 1:149-83 (1995)参照]；（ii）バクテリオ ファージＴ４[Jiang et al., Infect. Immun. 65(11):4770-7 (1997)]；（iii）
バクテリオファージλ[Stolz et al., FEBS Lett. 440(1-2):213-7 (1988)]；（
iv）トマトブッシースタントウイルス(tomato bushy stunt virus)[Joelson et
al., J. Gen. Virol. 78(Pt6):1213-7 (1997)]；および（ｖ）レトロウイルス[B
uchholz et al., Nat. Biotechnol. 16(10):951-4 (1998)]が挙げられる。酵母 展示系としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)のＡｇａ２ｐ接合接着受容体とのＣ末端融合が利用される[Boder and Wittrup
, Nat. Biotechnol.15(6):553-7 (1997)]。上に挙げた系または哺乳類膜貫通タ ンパク質（そのいくつかは本明細書に記載）のいずれかを用いるタンパク質の展
示は一般に、ＤＰ−タンパク質（または注目される他のタンパク質のいずれか）
をコードする核酸をアミノ末端分泌シグナルおよびＣ末端膜貫通アンカードメイ
ン（以下にさらに記載）とともにフレーム内に挿入することにより達成される。

【００７９】 同様に、ミリスチル化配列も膜アンカー配列として働き得る。ｃ−ｓｒｃのミ
リスチル化はそれを原形質膜へ補充することが知られている。タンパク質の最初
の１４個のアミノ酸：MGSSKSKPKDPSQR（Cross et al., Mol. Cell. Biol. 4(9):
1834-1842 (1942); Spencer et al., Science 262:1019-1024 (1993)を参照、両
者とも引用することにより本明細書に組み入れられる）が単独でこの機能にあす
かるとすれば、これは簡便かつ効果的な膜局在化法である。このモチーフはリポ
ーター遺伝子の局在化において有効であることがすでに示されており、ＴＣＲの
ゼータ鎖を固定するのに使用できる。融合タンパク質を原形質膜に局在化するに
は、このモチーフは可変領域のアミノ末端に置かれる。原形質膜に融合タンパク
質を固定するにはパルミトイル化などのその他のモチーフが使用でき、例えばＧ
タンパク質結合受容体キナーゼＧＲＫ６配列[LLQRLFSRQDＣＣGNＣSDSEEELPTRL, 全角文字のシステインがパルミトイル化されている; Stoffel et al., J. Biol.
Chem. 269:27791-4 (1994)]由来；ロドプシン[KQFRNCMLTSLＣＣGKNPLGD; Barns
table and Morabito, J. Mol. Neurosci. 5(3):207-9 (1994)]由来；およびｐ２
１ Ｈ−ｒａｓ １タンパク質[LNPPDESGPGCMSＣKCLVS; Capon et al., Nature
302:33 (1983); Cadwallader et al., Mol. Cell. Biol. 14(7):4722-30 (1994)
]由来のパルミトイル化配列がある。

【００８０】 好ましい具体例では、該融合パートナーはリソソーム標的配列であり、例えば
Ｌａｍｐ−２[KFERQ; Dice, Ann. N.Y. Acad. Sci. 674:58-64 (1992)]などのリ
ソソーム分解配列；またはＬａｍｐ−１[ＭＬＩＰＩＡＧＦＦＡＬＡＧＬＶＬＩ ＶＬＩＡＹＬＩGRKRSHAGYQTI, Uthayakumar et al., Cell. Mol. Biol. Res. 41
:405-20 (1995)]またはＬａｍｐ−２[ＬＶＰＩＡＶＧＡＡＬＡＧＶＬＩＬＶＬＬ
ＡＹＦＩＧLKHHHAGYEQF, Konecki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:
1-5 (1994)]（両者とも、膜貫通ドメインが全角文字で、細胞質標的化シグナル が下線で示されている）由来のリソソーム膜配列が挙げられる。

【００８１】 あるいは、該融合パートナーはミトコンドリア局在化配列であってもよく、ミ
トコンドリアマトリックス[例えば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼIII；MLRT
SSLFTRRVQPSLFSRNILRLQST; Schatz, Eur. J. Biochem. 165:1-6 (1987)]；ミト コンドリア内膜配列（酵母シトクロムｃオキシダーゼサブユニットIV; MLSLRQSI
RFFKPATRTLCSSRYLL; Schatz, 前記）；ミトコンドリア膜内空間配列（酵母シト クロムｃ１；MFSMLSKRWAQRTLSKSFYSTATGAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLTAE
AMTA; Schatz, 前記）またはミトコンドリア外膜配列（酵母７０ｋＤ外膜タンパ
ク質；MKSFITRNKTAILATVAATGTAIGAYYYYNQLQQQQQRGKK; Schatz, 前記）が挙げら れる。

【００８２】 該融合パートナーはまた小胞体配列に由来してもよく、カルレチクリン[KDEL;
Pelham, Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 250:1-10 (1992)]またはアデノ
ウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質[LYLSRRSFIDEKKMP; Jackson et al., EMBO J.
9:3153-62 (1990)]由来の配列が挙げられる。

【００８３】 さらにまた標的化配列としては、ペルオキシソーム配列[例えば、ルシフェラ ーゼ由来ペルオキシソームマトリックス配列; SKL; Keller et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 84:3264-8 (1987)]；ファルネシル化配列[例えば、Ｐ２１ Ｈ−ｒａｓ １; LNPPDESGPGCMSCKＣVLS,全角文字のシステインがファルネシル 化; Capon,前記; Zhang et al., Biochemistry, 35(25):8166-71 (1996)]；ゲラ
ニルゲラニル化配列[例えば、タンパク質ｒａｂ−５Ａ; LTEPTQPTRNQＣＣSN,全 角文字のシステインがゲラニルゲラニル化; Farnsworth, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 91:11963-7 (1994)]；または破壊配列[サイクリンＢ１; RTALGDIGN; Klo
tzbucher et al., EMBO J. 15(2):3053-64 (1996)]が挙げられる。

【００８４】 好ましい具体例では、該標的配列はＤＰ−タンパク質の分泌を果たし得る分泌
シグナル配列である。多数の公知の分泌シグナル配列」があり、例えばそれはＤ
Ｐ−タンパク質領域のアミノ末端に置かれた際、分泌プロセス中に個々の融合タ
ンパク質から切断される。

【００８５】 好適な分泌シグナル配列としては、ＩＬ−２[MYRMQLLSCIALSLALVTNS; Villing
er et al., J. Immunol. 155:3946-54 (1995)]、成長ホルモン[MATGSRTSLLLAFGL
LCLPWLQEGSAFPT; Roskam and Rougeon, Nucleic Acids Res. 7:305-20 (1979)] 、プレプロインスリン[MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN; Bell et al., Nature 28
4:26-32 (1980)]、およびインフルエンザＨＡタンパク質[MKAKLLVLLYAFVAGDQI;
Sekiwawa and Lai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3563-71 (1983)]由来のも のが挙げられる。なお、下線なしと下線間の結合の間で切断される。特に好まし
い分泌シグナル配列としては、分泌型サイトカインＩＬ−４由来の分泌シグナル
配列があり、これは以下：MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHGのようなＩＬ−４の最初の
２４個のアミノ酸を含んでなる。その他の分泌シグナルペプチドはvon Heinje, 前記において論じられている。

【００８６】 好ましい具体例では、該融合パートナーはＤＰもしくはＤＰ−タンパク質また
はそれらをコードする核酸に安定性を付与する安定配列である。このように、例
えばタンパク質はVarshavskyのＮ末端則[Bachmair et al., Science, 234:179-8
6 (1986); Gonda et al., J. Biol. Chem. 264:16700-12 (1989); Varshafsky,
Genes Cells, 2(1):13-28 (1997)]による偏在化に対するタンパク質の保護のた めの最初のメチオニンの後にグリシンを組み込む（ＭＧまたはＭＧＧ）ことによ
り安定化され、細胞質中で長い半減期が与えられる。同様に、ペプチドのＣ末端
に１または２個のプロリンを付加すると、カルボキシペプチダーゼ作用に対する
耐性が高まる。プロリンの前に２個のグリシンが存在すれば柔軟性が付与され、
しかも候補となるペプチド構造へと進展するジプロリンにおける事象を誘導する
構造が妨げられる。従って、好ましい安定配列は、以下のMG(X)_nGGPP、MG(X)_nGP
P、MGG(X)_nGGPPおよびMGG(X)_nGPP（ここで、Ｘはいすれかのアミノ酸であり、n は少なくとも４の整数である）である。

【００８７】 好ましい具体例では、ＤＰ−タンパク質の溶解度を高めるためにリジンをＮ末
端に付加するが、これはグリシンスペーサーを含んでも、含まなくともよい。例
えば、ＤＰ−タンパク質Ｋ₆Ｇ₄−ＥＦＬＩＶＫＳ−タンパク質−ＥＦＬＩＶＫＳ
が作出でき、これはＫ₆Ｇ₄配列を付加しないＤＰ−タンパク質とは異なった特徴
を持つ（実施例を参照）。この具体例では、リジン残基の数とリンカー配列は実
験的に決定して得られるＤＰ−タンパク質が確実に所望の特徴を有するようにす
ることができる。

【００８８】 好ましい具体例では、融合パートナーの組合せが使用される。従って、例えば
、いずれの数の融合パートナー、標的配列、レスキュー配列、および安定配列を
用いてもよく、リンカーは用いても用いなくともよい。以下にさらに十分に記載
されるように、ランダムおよび／または偏りのあるライブラリーを受け取るため
の少なくとも１つのクローニング部位を含む基本ベクターを用い、ＤＰ−タンパ
ク質をコードする核酸の５’および３’に種々の融合パートナーをコードする核
酸にカセット化することができる。

【００８９】 好ましい具体例では、本発明のＤＰ、ＤＰ−タンパク質、融合パートナーと融
合したＤＰまたは融合パートナーと融合したＤＰ−タンパク質はさらに改変する
ことができる。

【００９０】 少なくとも１つの二量体化ペプチド（ＤＰ）が注目されるタンパク質（Ｐ）と
融合している化合物、例えば得られるＤＰ−Ｐ、Ｐ−ＤＰ、ＤＰ−Ｐ−ＤＰまた
は同様の化合物（ここで、ＤＰは二量体化ペプチドであり、Ｐは注目されるタン
パク質である）は、先により十分記載されたように、ひとまとめに「ＤＰ−タン
パク質」と呼ばれる。ＤＰおよびＤＰ−タンパク質の共有結合的改変も本発明の
範囲内に含まれる。

【００９１】 共有結合的改変の１つのタイプとしては、標的化アミノ酸残基と有機誘導体化
剤とを反応させることを含み、すなわち、ＤＰまたはＤＰ−タンパク質の選択さ
れた側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基を反応させることができる。例えば、
以下にさらに十分に記載されるように、抗ＤＰもしくは抗ＤＰ−タンパク質抗体
を精製またはスクリーニングアッセイする方法において用いられる水不溶性支持
体マトリックスまたは表面に対してＤＰもしくはＤＰ−タンパク質を架橋するに
は二機能性剤による誘導体化が有用である。一般に使用される架橋剤としては、
デヒド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（例えば４−アジドサリチル
酸とのエステル）、ホモ二機能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スク
シンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含む）、ビ
ス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミド、およびメチ
ル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤が挙
げられる。

【００９２】 その他の改変としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基のそれぞれ対
応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド、プロリンおよびリジン
のヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、
アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化[T.E. Creighton, in Pr
oteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Fran
cisco, pp. 79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにＣ末端カルボ
キシル基のアミド化が挙げられる。

【００９３】 本発明の範囲内に含まれるＤＰまたはＤＰ−タンパク質のもう１つのタイプの
共有結合的改変は、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンの変更を含んで
なる。「天然のグリコシル化パターンの変更」とは、本明細書における目的では
、ＤＰまたはＤＰ−タンパク質のいずれかに見られる１以上の炭水化物部分を欠
失させること、および／またはＤＰまたはＤＰ−タンパク質のいずれかには存在
しない１以上のグリコシル化部位を付加することを意味しようとするものである
。

【００９４】 ＤＰまたはＤＰ−タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配
列を変更することにより達成され得る。該変更は、例えばＤＰまたはＤＰ−タン
パク質の天然配列に対して１以上のセリンまたはトレオニン残基を付加または置
換することによりなし得る（Ｏ結合のグリコシル化部位について）。該ＤＰまた
はＤＰ−タンパク質アミノ酸配列は、所望により、特にＤＰまたはＤＰ−タンパ
ク質をコードするＤＮＡを、所望のアミノ酸へと翻訳されるコドンを生じるよう
に予め選択した塩基において変異させることにより、ＤＮＡレベルの変化によっ
て変更してもよい。in vitro突然変異誘発によりＤＮＡへ突然変異を導入する方
法は当業者に十分公知であり、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) およびAusbel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley &
Sons, Inc., 1995)に見出せる。

【００９５】 ＤＰまたはＤＰ−タンパク質の炭水化物部分の数を増すもう１つの手段は、グ
リコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的結合によるものである。かかる
方法も例えば１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０およびAplin an
d Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 10(4):259-306 (1981)など当技術分野で
記載されている。

【００９６】 ＤＰまたはＤＰ−タンパク質に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしく
は酵素的に、またはグリコシル化の標的として働くアミノ酸残基をコードするコ
ドンの置換変異により達成され得る。化学的グリコシル化法は当技術分野で公知
であり、例えばSojar and Bahl, Arch. Biochem. Biophys., 259:52-57 (1987) により、またEdge et al., Anal.biochem., 118:131-137 (1981)により記載され
ている。ポリペプチドの炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura and Bafl, Me
th. Enzymol., 138:350-359 (1987)により記載されているように、種々のエンド
およびエキソグリコシダーゼの使用によって達成できる。

【００９７】 のもう１つにのタイプの共有結合的改変は、米国特許第４，６４０，８５３号
；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号
；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に示された方法で、Ｄ
ＰまたはＤＰ−タンパク質を種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレ
ングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの１つへ
架橋することを含んでなる。

【００９８】 当業者には理解されるであろうが、本発明のＤＰまたはＤＰ−タンパク質およ
び融合タンパク質は種々の方法で作製できる。

【００９９】 好ましい具体例では、ＤＰまたはＤＰ−タンパク質および融合タンパク質は、
当技術分野で十分公知のように系統的に作製される。

【０１００】 好ましい具体例では、ＤＰまたはＤＰ−タンパク質および融合タンパク質は、
当技術分野で十分公知のように核酸によってコードされている。

【０１０１】 好ましい具体例では、候補ＤＰ−タンパク質を含むＤＰ−タンパク質は核酸の
翻訳産物である。該候補ＤＰ−タンパク質はランダム試験タンパク質を含んでな
る。すなわち、あらゆる候補ＤＰ−タンパク質が前記で定義したようなランダム
な部分を有し、これが以下に概説されるスクリーニング法の基礎となる。さらに
、該ランダムな部分に対し、候補ＤＰ−タンパク質はまた融合パートナーを含み
得る。この具体例では、該核酸を細胞へ導入し、該細胞は該核酸を発現してＤＰ
−タンパク質（または候補ＤＰ−タンパク質）を生じる。

【０１０２】 先に概説されたように、ＤＰ−タンパク質は核酸によってコードされている。
本明細書において「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」またはその文法上の
同義語は、ともに共有結合少なくとも２つのヌクレオチド残基を意味する。本発
明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含む。標識などの付加部分の付加を助
けすため、または生理学的環境下でかかる分子の安定性および半減期を増すため
には、リボース−リン酸主鎖の改変がなされ得る。該核酸は一本鎖であっても二
本鎖であってもよく、あるいは二本鎖または一本鎖配列の両部分を含んでいても
よい。該核酸はＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび定義されたまたはランダムなリボ−オリ
ゴヌクレオチドを含んでなるＲＮＡであってもよい。該核酸はゲノムＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡおよび定義されたまたはランダムなデオキシリボ−オリゴヌクレオチドを
含んでなるＤＮＡであってもよい。該核酸はまたハイブリッドであってもよく、
ここで該核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれかの
組合せ、およびヌクレオチド塩基のいずれかの組合せを含む。

【０１０３】 該核酸はＤＰ−タンパク質および存在するならば融合パートナーをコードする
。さらに、該核酸はまた一般に必要に応じ翻訳または転写を果たすための外部配
列を含む。通常、ＤＰタンパク質をコードする該核酸はプラスミドベクターまた
はレトロウイルスベクターなどの好適なベクターへ組み込まれる。好ましい具体
例において、プラスミドベクターを用いてＤＰ−タンパク質を発現させる場合に
は、該核酸は一般にＤＮＡである。もう１つの具体例において、レトロウイルス
ベクターを用いてＤＰ−タンパク質を発現させる場合には、該核酸は一般にＲＮ
Ａである。

【０１０４】 好ましい具体例では、候補ＤＰ−タンパク質を発現させるのにベクターが使用
される。本明細書において「ベクター」とは、核酸を含んでなり、宿主細胞の形
質転換に使用できるレプリコンを意味する。該ベクターは、「プラスミド」もし
くは「プラスミドベクター」と呼ばれ、自己複製する染色体外ベクターであって
も、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれであってもよい。好まし
い具体例では、以下にさらに十分記載されるように、レトロウイルスベクターを
利用する。

【０１０５】 レトロウイルスでない具体例については、好適なベクターは、限定されるもの
ではないが、ｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)、ｐＳＩ(Promega Corporation）お
よびｐＢＩ(Clontech Laboratories, Inc.)をはじめとする多くの公知のベクタ ーのいずれかに由来するものである。基本的に、ＤＰ−タンパク質を発現するベ
クターを構築するには、ＣＭＶなどの強力なプロモーターを持つ哺乳類発現ベク
ターのいずれかを用いることができる。

【０１０６】 一般に、これらの発現ベクターは発現させる核酸に機能し得る形で連結された
転写および翻訳調節核酸を含む。本明細書において「機能し得る形で連結される
」とは、転写および翻訳調節核酸が、コード配列（例えばＤＰ−タンパク質をコ
ードする）に対して、転写が開始されてタンパク質の翻訳が確実となるように配
置されることを意味する。一般にこのことは、プロモーターおよび転写開始配列
(initial or start sequences)がコード領域の５’側に配置されることを意味す
る。当業者には理解されるであろうが、該転写および翻訳調節核酸は一般に使用
される宿主細胞に適当なものである。当技術分野では、種々の宿主細胞に対して
、多くのタイプの適当な発現ベクターおよび好適な調節配列が公知である。

【０１０７】 一般に、該転写および翻訳調節配列としては、限定されるものではないが、プ
ロモーター配列（ＣＡＴＴボックスおよびＴＡＴＡボックスを含む）、リボゾー
ム結合部位（インターナル・リボゾーム・エントリー部位(internal ribosome e
ntry site) (IRES)を含む）、転写開始および停止配列（ｍＲＮＡポリアデニル 化配列５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’を含む）、ＲＮＡスプライシング配列、翻訳開
始および停止配列（５’および３’非翻訳領域を含む）、開始コドン（ＡＧＴ）
、コザック共通配列（５’−Ａ／ＧＮＮＡＴＧＧ−３’）およびナンセンスコド
ン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）、構成エンハンサーもしくは誘導エンハンサー、
アクチベーター、またはリプレッサー配列（プロモーターに対して上流、下流に
または重複して置かれ、細胞系統依存的、組織特異的または時間依存性のもの）
、およびタンパク質標的化シグナル（小胞体保持および細胞外分泌シグナル、原
形質膜、ペルオキシソーム、核、ミトコンドリア、リソソーム、ゴルジ複合体お
よび限局性接着部への局在化シグナルを含む）が挙げられる。

【０１０８】 好ましい具体例では、該調節配列はプロモーターおよび転写開始および停止配
列を含む。プロモーター配列は構成プロモーターおよび誘導プロモーター配列を
含む[例えば、Walther and Stein, J. Mol. Med. 74(7):379-92 (1996)を参照] 。好ましい具体例では、該プロモーターは構成的であり、例えばＤＰ−タンパク
質をコードする核酸の高レベルの発現を駆動する。該プロモーターは天然に存在
するプロモーター、ハイブリッドまたは合成プロモーターのいずれであってもよ
い。ハイブリッドプロモーターは１を超えるプロモーターエレメントを組み合わ
せたものであるが、当技術分野で公知であり、本発明で使用される。

【０１０９】 哺乳類での発現に特に好ましいプロモーターとしてはＣＭＶプロモーターがあ
る。好ましいレトロウイルスプロモーターも以下で論じられる。

【０１１０】 好ましい具体例では、該プロモーターはＤＰ−タンパク質をコードする少なく
とも１コピーの核酸に関連する。二量体化タンパク質などの融合タンパク質、注
目されるタンパク質および１以上の融合パートナーの一部をコードする個々の成
分は、少なくとも好適なクローニング部位、好ましくはプロモーター配列の３’
側に含んでなる親ベクターに挿入することができる。好ましい具体例では、該融
合タンパク質をコードする核酸は、ＤＰ−Ｌ−タンパク質−Ｌ−ＤＰまたはＮ−
ＤＰ−Ｌ−タンパク質−Ｌ−ＤＰ（ここで、「Ｎ」は核局在化シグナルであり、
「ＤＰ」は二量体化ペプチドであり、「Ｌ」はリンカー配列であり、「タンパク
質」は注目されるタンパク質である）などの融合タンパク質を生じるための個々
の成分からなる。先に詳細に論じられたように、構築される融合タンパク質の個
々の成分をコードする核酸成分には多くの可能性があり得る。

【０１１１】 かかるベクターの作出は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A La
boratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)お よびAusbel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & So
ns, Inc., 1995)に記載される、当技術分野で公知の方法を用いて行う。予め構 築したベクターはキットに含めるに好適である。かかるベクターの最終使用者は
注目されるタンパク質をコードする核酸または注目されるタンパク質のライブラ
リーを便宜なクローニング部位に挿入しなければならない。

【０１１２】 もう１つの好ましい具体例では、レスキュー配列を使用してＤＰ−タンパク質
をコードする核酸を単離する。この具体例では、該レスキュー配列は、ＰＣＲ、
ハイブリダイゼーションまたは関連の技術を介して核酸構築体の迅速かつ容易な
単離を可能にするプローブ標的部位として働く特異なオリゴヌクレオチド配列で
あってよい。

【０１１３】 さらに、該ベクターは、Kriegler, in Gene Transfer and Expression: A Lab
oratory Manual, Freeman and Company, New York, (1990) およびMurray, Meth
ods in Molecular Biology, Vol 7: Gene Tranfer and Expression Protocols,
Humana Press (1991)にさらに十分に記載されているように、複製起点、選択遺 伝子などのような付加的エレメントを含んでなってもよい。

【０１１４】 注目されるタンパク質をコードする核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡから、定
義されたオリゴヌクレオチドから、またはランダムヌクレオチドから得られる。

【０１１５】 通常、該ＤＰ−タンパク質およびＤＰ−融合タンパク質は核酸によりコードさ
れ、その転写および対応するｍＲＮＡの翻訳の後に生成する。ある好ましい具体
例では、例えば先に示したもの（ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−ＤＰ_hyd− Ｌ_G−ＤＰ_Lys−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Glu）のようなＤＰ融合−ペプチド
をコードする核酸のコンカテマーを好適なクローニングベクター（以下に詳細に
記載）に挿入することができ、結果として（ＤＰ_hyd−Ｌ_P−タンパク質₁−Ｌ_P−
ＤＰ_hyd−Ｌ_G−ＤＰ_Lys−Ｌ_P−タンパク質₂−Ｌ_P−ＤＰ_Glu）_n（ここで、ｎは少
なくとも２の整数である）のようなコンカテマー化されたＤＰ−融合タンパク質
が形成する。当業者には明らかであろうが、その二価誘導体および一価誘導体を
はじめとする、ここで示したもの以外の複数のＤＰ融合タンパク質コード核酸も
好適なベクターにおいて組み合わせることができ、対応するＤＰ−タンパク質が
作出できる。

【０１１６】 ある具体例では、レトロウイルスベクターを用いて候補ＤＰ−タンパク質を発
現させるが、該候補ＤＰ−タンパク質をコードする核酸は一般にはＲＮＡである
。

【０１１７】 特によく適したレトロウイルストランスフェクション系がMann et al., Cell
33:153-159 (1983); Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(18):8392-6
(1993); Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9146-9150 (1995)
; Kinsella et al., Hum. Gene Ther. 7:1405-1413 (1996); Hofmann et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5185-5190 (1996); Choate et al., Hum. Gene
Ther. 7:2247-53 (1996);ならびにＷＯ９４／１９４７８およびＰＣＴ／ＵＳ９ ７／０１０１９ならびに本明細書に挙げられた参照文献（これらはすべて引用す
ることにより本明細書に組み入れられる）に記載されている。

【０１１８】 好適なレトロウイルスベクターのいくつかが使用され得る。好ましいレトロウ
イルス発現ベクターとしては、ネズミ幹細胞μ[MSCV; Hawley et al., Gene The
r. 1:136-8 (1994)を参照]および改変型ＭＧＦウイルス[Riviere et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-7 (1995)]およびｐＢＡＢＥ(引用することによ
り本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９参照)に基づくベク ターがある。その他の好適なレトロウイルス発現ベクターとしては、モロニーマ
ウス白血病ウイルス由来のものがあり、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＡＰＳＮ
などのベクター；ｐＳＩＲなどの自己不活性化発現ベクター；ｐＬＸＩＮなどの
二シストロン発現ベクター；ｐＲｅｖＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＲｅｖＴｅｔ−Ｏｆｆ[C
lontech Laboratories; Coffin and Varmus, in Retroviruses (Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, New York, 1996)]などの誘導発現ベクターが挙げられ る。

【０１１９】 他のベクターに関して先に記載したように、レトロウイルスベクターは誘導プ
ロモーターおよび構成プロモーターを含み得る。構成プロモーターが好ましく、
限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｓｒα、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａ、
ＵｂＣおよびＴＫが挙げられる。

【０１２０】 一般に、該レトロウイルス発現ベクターは、二シストロンオペロンを考慮し、
ゆえに一様に高レベルで融合構築体を発現する細胞の選択を大幅に助けるインタ
ーナル・リボゾーム・エントリー部位（ＩＲＥＳ）の制御下に、１以上の選択遺
伝子（選択マーカー遺伝子とも呼ばれる）と、５’ＬＴＲに対してセンスまたは
アンチセンス方向に置かれた第２の遺伝子の発現を駆動するプロモーターとを含
み得る。

【０１２１】 選択遺伝子はベクターを含む形質転換宿主細胞の選択を可能とし、特に哺乳類
細胞の場合には、ベクターを含まない細胞は通常死滅するので、ベクターの安定
性が確実なものとなる。選択遺伝子は当技術分野で十分公知であり、使用される
宿主細胞によって異なる。本明細書において「選択遺伝子」とは、選択剤に対す
る耐性を付与するか、またはそのマーカーを発現する細胞の選択を可能にするマ
ーカーをコードする遺伝子産物をコードするいずれもの遺伝子を意味する。好適
な選択剤としては、限定されるものではないが、ネオマイシン（またはその類似
体Ｇ４１８）、ブラスチシジンＳ、ヒスチニドールＤ、ブレオマイシン、ピュー
ロマイシン、ハイグロマイシンＢ、およびその他の薬剤が挙げられる。二シスト
ロン転写単位（前記参照）に挿入でき、次いで注目される遺伝子を発現する宿主
細胞の同定を可能にする好適なマーカー遺伝子としては、限定されるものではな
いが、緑色蛍光タンパク質などの自己蛍光マーカー、ｌａｃＺなどの酵素マーカ
ー、およびＣＤ８などの表面タンパク質などが挙げられる。

【０１２２】 その他のベクターについて記載したように、該レトロウイルスベクターは種々
の転写および翻訳調節配列と、少なくとも１つの組換えＤＮＡ断片のサブクロー
ニングのための少なくとも１つのクローニング部位とを含んでなり得る。

【０１２３】 本発明の組成物は宿主細胞に導入し、注目される遺伝子または注目されるタン
パク質を発現する細胞の表現型を変え得る生理活性薬剤に関してスクリーニング
する。本明細書において「〜に導入する」または文法上の同義語は、該核酸が、
その後の核酸の発現に好適なように細胞に入ることを意味する。該導入法は主と
して、以下に論じられる標的化細胞種により支配される。方法の例としては、Ｃ
ａＰＯ₄沈殿、リポソーム融合、リポフェクチン（登録商標）、エレクトロポレ ーション、ウイルス感染などが挙げられる[Kriegler, Gene Transfer and Expre
ssion: A Laboratory Manual (New York: Oxford University Press, 1991); Ro
th, Protein Expression in Animal Cells, Methods in Cell Biology Vol. 43
(San Diego: Academic Press, 1994); およびMurray, Gene Transfer and Expre
ssion Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 7 (Clifton: Humana P
ress, 1991)]。

【０１２４】 本発明の組成物は宿主細胞のゲノムへ安定して組み込まれ得るし（例えばレト
ロウイルス粒子を用いた場合）、あるいは細胞質に一時的または安定的に存在し
得る（すなわち、標準的な調節配列、選択マーカーなどを利用する従来のプラス
ミドに使用による）。医薬上重要なスクリーニングの多くはヒトまたはモデル哺
乳類細胞標的を必要とするので、かかる標的をトランスフェクトすることができ
るレトロウイルスベクターが好ましい。

【０１２５】 当業者には理解されるであろうが、本発明で使用される細胞種は広範であり得
る。基本的にいずれの細胞を使用してもよいが、哺乳類細胞が好ましく、マウス
、ラット、霊長類およびヒト細胞が特に好ましい。以下にさらに十分に記載され
るように、スクリーニングは細胞が候補ＤＰ−タンパク質の存在下で選択可能な
表現型を示すように設定される。以下にさらに十分に記載されるように、好適な
スクリーニングが候補ＤＰ−タンパク質がその細胞内に存在する結果として変化
した表現型を示す細胞の選択を可能とするよう設計される限り、広範な病状に関
与する細胞種は特に有用である。

【０１２６】 従って、好適な細胞種としては、限定されるものではないが、あらゆるタイプ
の腫瘍細胞（特にメラノーマ、骨髄性白血病、肺、乳房、卵巣、結腸、腎臓、前
立腺、膵臓および精巣の癌腫）、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（Ｔ
細胞およびＢ細胞）、マスト細胞、好酸球、脈管内膜細胞、肝細胞、単核白血球
を含む白血球、幹細胞（造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋幹細胞など
）（分化および脱分化因子のスクリーニングに用いる）、破骨細胞、軟骨細胞、
およびその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝細胞、腎細胞
、脂肪細胞が挙げられる。また好適な細胞には、限定されるものではないが、Ｊ
ｕｒｋａｔ Ｔ細胞、ＮＨ ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓなどをはじめとする公
知の研究用細胞も含まれる。引用することにより本明細書に組み入れられるＡＴ
ＣＣ細胞系統カタログを参照。

【０１２７】 ある具体例では、該細胞は遺伝子操作してもよく、すなわち本発明の組成物に
加えて外来の核酸（例えば標的分子をコードする）を含んでもよい。

【０１２８】 一度作出されれば、本発明の組成物は多くの適用における用途を見出せる。本
発明はin vivoおよびin vitro双方で第２のタンパク質と相互作用できる、それ と結合できる、またはその活性を変調することができるタンパク質を同定するの
に有用な組成物を提供する。

【０１２９】 好ましい具体例では、本発明は、シグナル伝達経路に影響を与える化合物を作
出する、有効に細胞へ導入する、およびスクリーニングするための方法ならびに
組成物を提供する。仮定されるシグナル伝達結果および標的細胞における観察可
能な生理学的変化以外に該経路についての知見はほとんどまたは全く必要とされ
ない。開示された方法は細胞内シグナル伝達機構に近づくin vivo戦略を含んで なる。本発明はまた、該経路の構成要素の単離、該経路を特徴付けるための手段
、および医薬開発のための先導化合物を提供する。

【０１３０】 本発明は、それらを含んでなる細胞の表現型を変更できる、本明細書でＤＰ−
タンパク質と呼ばれる化合物のスクリーニング方法を提供する。本明細書におい
て「候補ＤＰ−タンパク質」とは、機能、固有の特性、または第２のタンパク質
との相互作用が探求されるＤＰ−タンパク質を意味する。候補ＤＰ−タンパク質
の「ＤＰ」成分は一般に分子ライブラリー内では変化しないが、候補ＤＰ−タン
パク質の「タンパク質」成分は変化する。

【０１３１】 ある具体例では、複数の候補ＤＰ−タンパク質が分子ライブラリーの形で提供
される。本明細書において「分子ライブラリー」とは、複数の異なるＤＰ−タン
パク質、複数の異なるＤＰ−タンパク質をコードするコードする複数の異なる単
離核酸、および複数の異なるＤＰ−タンパク質をコードし、ベクターに含まれる
複数の異なる核酸を含むことを意味する。本発明の方法は多数の候補ＤＰ−タン
パク質（ここで、ＤＰ−タンパク質の「タンパク質」成分はランダムオリゴヌク
レオチド、ｃＤＮＡ断片およびゲノムＤＮＡのいずれかを含んでなる候補核酸に
よりコードされる）を含んでなる分子ライブラリーの迅速なin vivoスクリーニ ングを提供する。従って、ランダムオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ断片およびゲ
ノムＤＮＡを細胞に送達することにより、細胞機構は候補ＤＰ−タンパク質を生
成する。同細胞をスクリーニングすることにより、候補ＤＰ−タンパク質をin v
itroで回収または合成する必要なく、極めて効率的なスクリーニングが達成され
る。従って、本発明は、複数の候補ＤＰ−タンパク質を、細胞の表現型を変更し
得るエフェクターに関してスクリーニングする方法を提供する。

【０１３２】 細胞におけるシグナル伝達経路はしばしば表現型上記載できる細胞の生理学的
変化をもたらすエフェクター刺激（例えば、ケモカイン、成長因子、ホルモンな
ど）に関与する。この細胞内シグナル伝達経路が病因において鍵となる役割を果
たすにも関わらず、ほとんどの場合、最初の刺激と最終的な細胞応答以外にはシ
グナル伝達経路についてはほとんど判っていない。ペプチドが細胞内発現される
と、それらは細胞内シグナル伝達経路を変調する可能性があり[Souroujon and M
ochly-Rosen, Nat. Biotechnol. 16(10):919-24 (1988)]、従ってタンパク質間 の相互作用にあずかり得る。化学化合物またはペプチドの分子ライブラリーを、
シグナル伝達経路を変調する（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレ
ギュレーション）エフェクター分子に関してスクリーニングした。このように最
小化されたタンパク質に含まれる拘束ペプチドもまたタンパク質間相互作用を変
調する薬剤の設計において有用であり得[Cunningham and Wells, Curr. Opin. S
truct. Biol. 7:457-462 (1997)]、これは細胞内シグナル伝達経路を調節する新
規な方法を与え得る。例えばレトロウイルスベクターを用いるとことによってペ
プチドを哺乳類の生細胞で発現させれば、それらは細胞の表現型の定義された変
化に関してスクリーニングでき、得られる活性ペプチドはそれらの結合標的の親
和性単離の経路を提供し得る。

【０１３３】 コンホメーション上拘束されたペプチドのいくつかの形態は有用であり、また
哺乳類の生細胞において細胞内結合化学のためのペプチドの提示においては必要
でさえある。ファージディスプレーライブラリーのペプチドとは違い、細胞内ペ
プチドは異化を受けることがあり、従って、好ましくはこれらのペプチドは相対
的に細胞プロテアーゼに対して不活性であるべきである。細胞内ペプチド異化は
十分には特性決定されていないが、ユビキチンプロテアソーム系がタンパク質の
分解に関与すると知られており[Goldberg et al., Biol. Chem. 378:131-140(19
97)、Hilt and Wolf, Trends Biochem. Sci. 21:96-102(1996)]、カルボキシオ クタペプチダ-ゼとして作用し得る。おそらくはアミノペプチダーゼを含む、さ らなるタンパク質分解はペプチドのアミノ酸への分解をもたらし得る[Lee and G
oldberg, Trends Cell Biol. 8:397-403(1998)]。抗原提示細胞では、細胞質タ ンパク質分解に起因する短い直鎖状ペプチドはペプチド輸送体ＴＡＰ１およびＴ
ＡＰ２により小胞体へと移動され得る[Belich and Trowsdale, Mol. Biol. Rep.
21:53-56(1995)]。

【０１３４】 （ｉ）タンパク質分解に対して相対的に不活性であり、高い細胞内安定性およ
び発現タンパク質のより高い安定状態濃度をもたらし、かつ（ii）活性部位間隙
などのタンパク質上の結合部位に接触できるよう十分に小さくもある、発現ペプ
チドの細胞内提示のための足場を開発することは非常に有用であり得る。この足
場のコンパクト性は発現タンパク質の柔軟性を低下させ、またコンホメーション
のエントロピーを減少させ、効果的に個々のコンホマーの濃度を高めるはずであ
る。このことおよびタンパク質分解に対する高い安定性は、次に、これらの足場
を（例えば、ペプチドライブラリーとして使用される場合には）有効タンパク質
をより含みやすくするはずであるが、これは高濃度であるほどより弱い結合相互
作用の飽和を可能にするからである。このことは、より低い親和性ペプチドの表
現型による選択を可能にし、従ってより高い生理活性のペプチドが検出されるよ
うになることにより、生理活性ペプチドを検出するためのスクリーニングプロト
コールに利益をもたらす。また、タンパク質分解安定性が高く、コンホメーショ
ンエントロピーが低いという特徴は、よりコンパクトな構造を可能性ある治療薬
としてより魅力的なものにすると考えられる。前記の特性を高めるには、ペプチ
ドのＮおよびＣ末端へ特異的な短い配列を付加することが有用であり得る。ルー
プ構造［Leszczynski and Rose, Science 234:849-855(1986)]は特に興味深いも
のであるが、これはループが球状かつコンパクトであり、タンパク質表面におい
て共通のものであり、タンパク質機能およびタンパク質間相互作用にしばしば関
与し得るからである。

【０１３５】 好ましい具体例では、本発明の組成物を使用して候補生理活性剤に関してスク
リーニングするが、すなわちＤＰ−タンパク質（前記参照）の範囲内の試験タン
パク質が候補生理活性剤である。分子ライブラリーの一部としての候補ＤＰタン
パク質を好適な宿主細胞に導入して、かかる候補ＤＰ−タンパク質を保持してい
るかまたは発現する宿主細胞の表現型を変更できるＤＰ−タンパク質に関してス
クリーニングする。要すれば、細胞は候補ＤＰ−タンパク質をコードする遺伝子
を発現するのに好適な状態に処理して（例えば、誘導プロモーターを使用する場
合）候補発現産物を産生する。

【０１３６】 好ましい具体例では、第１の複数の細胞をスクリーニングする。すなわち、分
子ライブラリーが導入されており候補ＤＰタンパク質を提供する細胞を、変化し
た表現型に関してスクリーニングする。従って、この具体例では候補ＤＰ−タン
パク質の作用は、そこでそれが作られる同一の細胞で認められる、すなわち自己
分泌作用である。

【０１３７】 本明細書において「複数の細胞」とは、およそ約１０³個の細胞ないし１０⁸個
または１０⁹個を意味し、１０⁶個ないし１０⁸個であることが好ましい。この複 数の細胞は細胞ライブラリーを含んでなり、その中では一般にはこの細胞ライブ
ラリー内の各々の細胞は分子ライブラリーのメンバー、すなわち異なる候補ＤＰ
−タンパク質または異なるＤＰ−タンパク質をコードする核酸を含むが、当業者
には理解されるように、この細胞ライブラリー内のある細胞は分子ライブラリー
のメンバーを含まなくてよいし、またあるものは１以上を含んでもよい。レトロ
ウイルス感染以外の方法を使用して候補ＤＰ−タンパク質を複数の細胞に導入す
る場合には、一般にはエレクトロポレーションなどの際に細胞に入る核酸数を制
御することが困難であるので、細胞ライブラリーの個々の細胞メンバー内の候補
核酸の分布は極めて広範なものとなり得る。

【０１３８】 好ましい具体例では、該分子ライブラリーを第１の複数の細胞に導入し、第１
の複数の細胞とは異なる第２または第３の複数の細胞、すなわち一般には異なる
細胞種において発現された候補ＤＰ−タンパク質の作用をスクリーニングする。
すなわち、候補ＤＰ−タンパク質の作用は第２の細胞に対しては細胞外作用、す
なわち内分泌またはパラ分泌作用によるものである。これは標準技術を用いて行
われる。第１の複数の細胞はある培地内または培地上で増殖でき、この培地（「
条件培地」と呼ばれる）を第２の複数の細胞に接触させ、作用を測定する。ある
いは、細胞間の直接接触もあり得る。従って、「接触する」とは機能的接触であ
り、直接と間接の双方を含む。この具体例では、第１の複数の細胞をスクリーニ
ングしてもよいし、スクリーニングしなくともよい。

【０１３９】 従って、本発明の方法はランダム化した候補核酸の分子ライブラリーを複数の
細胞に導入して細胞ライブラリーを作出することを含んでなる。各々の核酸は異
なるＤＰ−タンパク質をコードする、異なる、一般にはランダム化ヌクレオチド
配列を含んでなる。次いで、以下でさらに十分に概説されるように、複数の細胞
を変化した表現型を示す細胞に関してスクリーニングする。変化した表現型はＤ
Ｐタンパク質の存在によるものである。

【０１４０】 本明細書おいて「変化した表現型」または「変化した生理機能」またはその他
の文法上の同義語は、細胞の表現型が何らかの方法で、好ましくは何らかの検出
可能なおよび／または測定可能な方法で変更されることを意味する。当技術分野
で認識されているように、本発明の長所は本方法を用いて試験され得る広範な種
類の細胞種およびあり得る表現型の変化にある。従って、観察、検出または測定
され得るいずれの表現型の変化も本明細書のスクリーニング方法の基礎となり得
る。好適な表現型の変化としては、限定されるものではないが、細胞形態、細胞
増殖、細胞活性、基質または他の細胞への接着および細胞密度における変化など
の全体的な物理変化、１以上のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン
、サイトカインまたはその他の分子の発現における変化、１以上のＲＮＡ、ｍＲ
ＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の平衡状
態（例えば、半減期）における変化、１以上のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、
脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の局在化における変化、１以
上のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、受容体ま
たはその他の分子の生理活性または特異的活性における変化、イオン、サイトカ
イン、ホルモン、増殖因子、タンパク質またはその他の分子の分泌における変化
、細胞膜電位、分極、結合性または輸送における変化、ウイルスおよび細菌病原
体などの感染性、感受性、潜伏期間、付着および取り込みにおける変化が挙げら
れる。

【０１４１】 本明細書において「表現型を変更できる」または文法上の同義語は、候補ＤＰ
タンパク質がいくつかの検出可能なおよび／または測定可能な方法で細胞の表現
型を変化させ得ることを意味する。

【０１４２】 以下に、またＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９にさらに十分に記載されるように
、変化した表現型は広範な種類の方法で検出でき、これは一般には変化させた表
現型に依存し、またそれに対応したものである。一般には、変化した表現型は、
例えば、細胞形態の顕微鏡解析；細胞死の増加および細胞活性の増加の双方を含
む標準的な細胞活性アッセイ（例えば、細胞はこの時、ウイルス、細菌または細
菌毒素もしくは合成毒素による細胞死に対して耐性である）；特定の細胞または
分子の存在もしくはレベルに関する、ＦＡＣＳもしくはその他の色素染色技術を
はじめとする蛍光指示薬アッセイなどの標準的な標識アッセイ；細胞を死滅させ
た後の標的化合物の発現の生化学的検出；標的細胞内の遺伝子発現の変化のモニ
タリングなどを用いて検出される。本明細書にさらに十分記載されるように、い
くつかのケースでは、変化した表現型が、ランダム化された核酸またはランダム
化されたタンパク質を含んでなる分子ライブラリーが導入された細胞において検
出され、他の具体例では、変化した表現型は、第１の細胞からのいくつかの分子
シグナルに応答している第２の細胞において検出される。

【０１４３】 好ましい具体例では、該ＤＰ−タンパク質が核へ移入された際に遺伝子発現を
調節して標的遺伝子の発現の増加または減少を引き起こす。ある具体例では、転
写活性化タンパク質がＤＰ−タンパク質に結合し、不活化されるかまたはその標
的遺伝子が活性化するのが阻害され得る。この具体例では、ＤＰ−タンパク質は
標的転写アクチベーター、例えばＨＩＶ ｔａｔタンパク質に親和性のあるタン
パク質を含んでなる。もう１つの具体例では、ＤＰ−タンパク質は、転写リプレ
ッサーに親和性のあるタンパク質成分を含んでなることにより標的遺伝子の発現
増加を引き起こし得る。転写リプレッサーはＤＰ−タンパク質へ結合すると、不
活化されるかまたはその標的遺伝子への結合を阻害され、注目される遺伝子のよ
り高い発現を引き起こし得る。

【０１４４】 好ましい具体例では、ひと度、変更された表現型を有する細胞が検出されれば
、細胞は変化した表現型を持たない多数の細胞から単離される。当技術分野で公
知のように、これはいくつかの方法のいずれで行ってもよく、いくつかの場合で
はアッセイまたはスクリーニングに依存する。好適な単離技術としては、限定さ
れるものではないが、ＦＡＣＳ、補体を用いる細胞溶解選択、細胞クローニング
、Fluorimagerによる走査、「生存」タンパク質の発現、細胞表面タンパク質ま たは物理的単離のために蛍光化または標識化可能なその他の分子の誘導発現、非
蛍光分子を蛍光分子に変化させる酵素の発現、増殖しないか増殖の遅いバックグ
ラウンドに対する過剰増殖、細胞死およびＤＮＡもしくはその他の細胞活性指示
色素の単離が挙げられる。

【０１４５】 好ましい具体例では、変化した表現型を有する細胞から候補ＤＰ−タンパク質
をコードする候補核酸および／または候補ＤＰ−タンパク質を単離する。これは
いくつかの方法で行うことができる。好ましい具体例では、ベクター、または先
に定義されたレスキュー配列などの分子ライブラリーの特異な成分に共通するＤ
ＮＡ領域に相補的なプライマーを使用して候補ＤＰ−タンパク質をコードする固
有のランダム核酸を「救出(resucue)」する。あるいは、候補ＤＰ−タンパク質 に機能しうる形で連結されたレスキュー配列を用いて候補ＤＰ−タンパク質を単
離する（前記のように）。従って、例えば、エピトープタグを含んでなるレスキ
ュー配列または精製配列を使用して、免疫沈降またはアフィニティーカラムを用
いて生理活性剤を取り出すことができる。以下に概説されるように、このことは
また、生理活性剤と標的分子の間に十分強力な結合相互作用がある場合には第１
の標的分子を取り出す場合もある。あるいは、質量分析計を用いてペプチドを検
出してもよい。

【０１４６】 ひと度救出されれば、候補ＤＰ−タンパク質をコードする候補核酸の配列およ
び／または候補ＤＰ−タンパク質の配列が決定される。次ぎにこの情報はいくつ
かの方法で使用することができる。

【０１４７】 ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーまたはそれから得たＤＮＡ断
片を本明細書に概説されるスクリーニング法に使用する場合には（例えば、それ
らを使用して候補ＤＰ−タンパク質をコードする場合には）、試験タンパク質を
コードする核酸配列は全長でないことが多く、例えば、核酸配列は完全な試験タ
ンパク質をコードしていない。本明細書において「全長」ｃＤＮＡ、遺伝子、ｍ
ＲＮＡ、ＲＮＡまたは文法上の同義語は、その対応する細胞の遺伝子座によりコ
ードされるように完全なタンパク質をコードするいずれかの核酸を意味する。完
全なタンパク質をコードする配列の他にも、全長ｃＤＮＡ、遺伝子、ｍＲＮＡま
たはＲＮＡは所望により５’および３’非翻訳核酸領域を含む。完全なタンパク
質は対応するｍＲＮＡの翻訳により組み込まれ、天然のタンパク質からはその後
排除され得るアミノ酸、例えば、分泌シグナルペプチド配列またはタンパク質ス
プライシングおよびタンパク質プロセッシングに関与する配列を含み得る。本明
細書において「全長タンパク質」または文法上の同義語は、全長ｃＤＮＡ、遺伝
子、ＲＮＡまたはｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を意味する。当業者に
は理解されるであろうが、全長タンパク質は、限定されるものではないが、シグ
ナルペプチド切断、タンパク質スプライシング、タンパク質前駆体プロセッシン
グ、グリコシル化などをはじめとする翻訳後修飾を含み得る。従って、「部分ｃ
ＤＮＡ」、「部分遺伝子」、「部分ｍＲＮＡ」、「部分ＲＮＡ」または「部分タ
ンパク質」または文法上の同義語は、全長ｃＤＮＡ、遺伝子、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ
またはタンパク質の断片に相当するｃＤＮＡ、遺伝子、ｍＲＮＡ、ＲＮＡまたは
タンパク質を指す。従って、好ましい具体例では、救出された部分タンパク質の
決定された核酸配列情報を用いてＤＰ−タンパク質の全長コード配列を単離する
。部分配列情報を用いる全長コード配列の単離および特性決定は当業界では十分
に公知である。

【０１４８】 好ましい具体例では、候補ＤＰ−タンパク質をコードする核酸またはその全長
型もしくは全長型の断片のいずれかもしくは候補ＤＰ−タンパク質の誘導体（以
下を参照）をコードする核酸を宿主細胞に再導入して、最初に観察された細胞の
変化した表現型を確認する。これらの細胞は最初のスクリーニング実験における
ものと同一であってもよいし、異なってもよい。このことはレトロウイルスを用
いて、あるいは標的細胞への非常に高レベルの取り込みを可能にするＨＩＶ−１
Ｔａｔタンパク質および類似体および関連タンパク質への融合物を用いて行うこ
とができる。例えば、Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:664-8(1
994)、Frankel and Pado, Cell 55:1189-93(1988)、Savion et al., J. Biol. C
hem. 256:1149-54(1981)、Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444-50(1994
)およびBaldin et al., EMBO J. 9:1511-7(1990)を参照、これらすべては引用す
ることにより本明細書に組み入れられる。

【０１４９】 好ましい具体例では、組換えＤＰ−タンパク質を作出し（以下にさらに概説さ
れるように）、また使用して標的細胞の表現型の変更を確実なものにする。これ
は、前記のように表現型の変更が第２または第３の複数の細胞において観察され
た場合には好ましい具体例である。すなわち、候補ＤＰ−タンパク質の作用はそ
の中でそれが作出された第１の細胞からのその分泌とそれに続く、第２の細胞（
すなわち、異なる細胞）上の細胞受容体への結合、または異なる手段による内部
移行とそれに続く第２の細胞内または細胞への作用の発揮に依存する。この具体
例では、組換えＤＰ−タンパク質またはその誘導体を第２の細胞に対して提供し
、表現型の変更をモニターする。

【０１５０】 好ましい具体例では、ＤＰ−タンパク質またはその誘導体（本明細書では注目
されるタンパク質とも呼ばれる）をコードする核酸を使用してそれぞれの組換え
タンパク質を発現させる。ウイルスおよび非ウイルス発現ベクターをはじめとす
る種々の発現ベクターを作製することができ、これらは、限定されるものではな
いが、酵母、細菌、古細菌、真菌、昆虫細胞および哺乳類細胞をはじめとする動
物細胞をはじめ、種々の系における組換えタンパク質発現に有用である。

【０１５１】 また、注目されるタンパク質は、先に概説されたような融合パートナーへの融
合またはその他のタンパク質配列への融合をはじめとする融合タンパク質として
発現され得る。注目される組換えタンパク質は、注目されるタンパク質をコード
する核酸が（一般的には発現ベクターとして）導入されている宿主細胞を組換え
タンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こす適当な条件下で培養することに
より産生される。

【０１５２】 好ましい具体例では、組換えタンパク質を発現の後に精製する。発現ベクター
の作出、融合タンパク質の作出、発現ベクターの宿主細胞への導入、宿主細胞に
おけるタンパク質発現および精製法をはじめとする組換えタンパク質発現に好適
な多くの方法が当業者に公知であり、例えば、以下のテキストに記載されている
：Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son
s, Inc., 1995)；O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Labor
atory Manual (New York: Oxford University Press, 1994)、Kriegler, Gene T
ransfer and Expression: A Laboratory Manual(New York: Oxford University
Press, 1991)およびDeutscher, Guide to Protein Purification, Methods in E
nzymology Vol. 182(San Diego: Academic Press. Inc., 1990)。

【０１５３】 好ましい具体例では、ＤＰ−タンパク質またはそれをコードする核酸のいずれ
かを使用して標的分子、すなわちＤＰ−タンパク質が相互作用する分子を同定す
る。当業者には理解されるであろうが、それにＤＰ−タンパク質が結合し直接作
用する第１の標的分子があり、またＤＰ−タンパク質から影響を受けるシグナル
伝達経路の一部である第２の標的分子があり得る。

【０１５４】 好ましい具体例では、ＤＰ−タンパク質を使用して標的分子を取り出す。例え
ば、本明細書で概説されるように、標的分子がタンパク質である場合にはＤＰ−
タンパク質に機能し得る形で結合されたエピトープタグまたは精製配列の使用に
より生化学的手段[共免疫沈降、アフィニティーカラムなど、例えばDeutscher,
Guide to Protein Purification, Methods, Enzymology Vol. 182 (San Diego:
Academic Press, Inc., 1990)、Harris and Angal, Protein Purification Meth
ods: A Practical Approach (Oxford: IRL Press at Oxford University Press,
1994)、Harris and Angal, Protein Purification Applications: A Practical
Approach (Oxford: IRL Press at Oxford University Press, 1990)を参照]に より第１の標的分子の精製を可能にすることができる。あるいは、組換えＤＰ−
タンパク質が細菌において発現され精製される場合には、標的細胞種のｍＲＮＡ
から作出されたｃＤＮＡ発現ライブラリーに対するプローブとして使用すること
ができる。または、ＤＰ−タンパク質を「おとり(bait)」タンパク質として（例
えば、定義された配列のＤＰ−タンパク質をスクリーニングに使用して未知の結
合タンパク質を同定する場合）または「試験」タンパク質として（例えば、既知
のタンパク質をおとりとして使用して候補ＤＰ−タンパク質を含んでなる分子ラ
イブラリーをスクリーニングする場合）酵母または哺乳類二ハイブリッドまたは
三ハイブリッド系のいずれかにおいて使用することができる（例えば、Fields a
nd Song, Nature 340:245-6(1989)、Vasavada et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:10686-90(1991)、Fearon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:795
8-62(1992)、Dang et al, Mol. Cell. Biol. 11:954-62(1991)、Chien et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-82(1991)、Luo et al., Bio/Techniques
22(2):350-352(1997)および米国特許第５，２８３，１７３号、第５，６６７， ９７３号、第５，４６８，６１４号、第５，５２５，４９０号および第５，６３
７，４６３号を参照）。かかる相互作用クローニングのアプローチはＤＮＡ結合
タンパク質およびその他の相互作用タンパク質成分を単離するのに非常に有用で
ある。該ＤＰ−タンパク質は問題のシグナル伝達経路の上位関係を研究するため
の他の薬理学的アクチベーターと組み合わせてもよい。標識されたＤＰ−タンパ
ク質またはその誘導体を合成で製造し、それを使用してバクテリオファージ、細
菌または真核細胞において発現されたｃＤＮＡライブラリーを、ＤＰ−タンパク
質またはその誘導体と結合するそれらのｃＤＮＡに関してスクリーニングするこ
とも可能である。さらに、レトロウイルスライブラリーによるｃＤＮＡクローニ
ングを使用してＤＰ−タンパク質により誘導される作用を「補足する」ことも可
能である。かかる方法では、ＤＰ−タンパク質は特定のシグナル伝達経路に関す
るいくつかの重要な因子を化学量論的に滴定することが必要とされるであろう。
この分子または活性がｃＤＮＡライブラリー内からのｃＤＮＡの過剰発現により
補充される場合には、次いで標的をクローニングすることができる。同様に、前
記の酵母またはバクテリオファージ系のいずれかによりクローン化されたｃＤＮ
Ａをこの方法で哺乳類細胞に再導入してペプチドが作用する系においてそれらが
確実に作用して機能を補足するようにできる。

【０１５５】 ひと度、第１の標的分子が同定および確認されれば、同様にして第１の標的を
「おとり」として使用して第２の標的分子を同定することができる。このように
して、シグナル伝達経路を解明することができる。同様に、第２の標的分子に特
異的な生理活性剤も発見でき、いくつかの生理活性剤を、例えば、組合せ治療の
ための単一経路に作用させることも可能となり得る。

【０１５６】 好ましい具体例では、組換えＤＰ−タンパク質の分子ライブラリーをin vitro
結合アッセイに使用して、分泌された標的タンパク質、例えば、受容体、リガン
ド、酵素などに結合できるメンバーを同定する。

【０１５７】 一般に、本明細書の方法の好ましい具体例では、標的タンパク質（これは組換
えタンパク質または天然のタンパク質であり得る）が単離されたサンプル受容領
域を有する不溶性の支持体（例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど）
に非拡散的に結合される。不溶性の支持体は、それに標的タンパク質が結合され
得るいずれの組成物からなってもよく、可溶性物質から容易に分離されるか、そ
うでなければスクリーニング法全体に適合するものである。かかる支持体の表面
は固体または多孔質であり、かつ、便宜ないずれの形状であってもよい。好適な
不溶性支持体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、膜およびビー
ズが挙げられる。これらは、典型的にはガラス製、プラスチック（例えば、ポリ
スチレン）製、多糖類製、ナイロン製またはニロトセルロース製、テフロン（商
標）製などである。マイクロタイタープレートおよびアレイは、少量の試薬およ
びサンプルを用いて多数のアッセイを同時に実施できるので特に便利である。本
発明の試薬および方法全体に適合し、標的タンパク質の特性を維持し、かつ非拡
散性である限りは、標的タンパク質の特定の結合様式は決定的なものではない。
標的タンパク質は不溶性支持体に直接的に（例えば、架橋形成により）または間
接的に（例えば、抗体、その他のタンパク質または核酸などにより）結合され得
る。好ましい結合方法としては抗体（これは試験タンパク質のタンパク質間相互
作用面を立体的にブロックすることなく、好ましくは組換えおとりタンパク質に
組み込み得るタグポリペプチドに向けられる）の使用、「粘着性」またはイオン
性支持体への直接結合、化学的架橋形成などが挙げられる。標的タンパク質の結
合の後、洗浄することにより過剰の非結合物質を除去する。次いで、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害のタンパク質とともにインキュベ
ーションすることによりサンプル受容領域をブロックすればよい。

【０１５８】 複数の組換えＤＰ−タンパク質を含んでなる分子ライブラリーを結合アッセイに
加える。結合アッセイは最適結合を助長するいずれの温度でも行えるが、典型的
には４℃と４０℃の間である。インキュベーション時間は最適結合に関して選択
されるが、高処理量スクリーニングを助長するようにも至適化される。典型的に
は、０．１と１時間の間で十分である。ＤＰ−タンパク質と標的タンパク質との
結合の測定は標識されたin vitroタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳
動にとる移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、タンパク質結合の免疫アッセイ、
機能アッセイ（リン酸化アッセイなど）などをはじめとする広範な種類のアッセ
イを用いて行うことができる（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Labor
atory Manual(New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)およびA
usubel et al., Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, I
nc., 1995) を参照）。

【０１５９】 本発明のスクリーニング法は広範な種類の条件下で多数の細胞種をスクリーニ
ングするのに有用であり得る。一般に、宿主細胞は病状に関与する細胞であり、
それらは通常、細胞に対して望ましくない結果をもたらす条件下で試験され、ま
たはスクリーニングされる。好適な生理活性剤が見出されると、望ましくない副
作用は軽減または排除され得る。あるいは、病状またはシグナル伝達経路に関係
する細胞機構を解明することを目的として、通常、望ましい結果が低下または排
除されてしまうことがあり得る。これらのスクリーニング法はＰＣＴ／ＵＳ９７
／０１０１９に概説されており、引用することにより本明細書に組み入れられる
。

【０１６０】 以下、実施例を示し前記の発明を使用する方法をより十分に記載するが、これ
は本発明の種々の態様を実施しようとする最良の方法を示すものである。これら
の実施例は本発明の真の範囲を何ら制限するものではなく、例示の目的で提供さ
れるものであると理解される。本明細書で引用されるすべての参照文献は引用す
ることにより本明細書に組み入れられる。

【０１６１】

【実施例】

実施例１ 過酷な条件下で認められる二量体を形成する新規なペプチド FinniganＬＣＱイオントラップ質量分析計のエレクトロスプレー供給源へのＥ
ＦＬＩＶＫＳアミドの３×１０^-4ＭｐＨ６．４溶液の注入時に、このペプチドは
自己結合して、２１０℃の入口キャピラリー温度および過酷なエレクトロスプレ
ー条件で残存した後、ガス相において単量体分子量の正確に二倍で検出される二
量体（図３Ａ）を形成すると考えられ、従って、水溶液中のかなり低い濃度で二
量体化すると予想される。また、このペプチドは約２５％アセトニトリル中のｐ
Ｈ〜２．５のＣ１８逆相カラムから溶出される場合にも二量体（これもまた質量
分析計で検出される）を形成する（図３Ｂ）。双方が連続的にエレクトロスプレ
ーインターフェースによりイオントラップ質量分析計に注入される場合に、図３
Ａにおけるその二量体化を試験ペプチドＳＫＶＩＬＦＥ（これは水溶液中で１０ ^-13 Ｍの範囲において二量体を形成する(Bodenmuller et al., 前記））のものと
の比較から両ペプチドは同程度（１０程度の因子内）二量体化するということが
示唆される。このことはＥＦＬＩＶＫＳは極めて低濃度の水溶液中で二量体化し
得るということを示唆するものである。ＳＫＶＩＬＦＥの二量体化からＥＦＬＩ
ＶＫＳの二量体化を予測することはできないが、これは逆配列が生理活性ペプチ
ドの不活性制御手段として使用されることが多いからである。

【０１６２】 ＥＦＬＩＶＫＳアミドの全単結合ｆｍｏｃ合成からの粗合成産物の、エレクト
ロスプレーイオン化後に二量体化し得る短い配列に関するＬＣ／ＭＳ実験が図４
に示されている。ＨＰＬＣ溶出は９９．９％水−０．１％ＴＦＡから９９．９％
アセトニトリル−０．１％ＴＦＡの勾配を用いた。括弧内のアセトニトリル率を
用いて質量分析計によって以下の末端切断型配列の二量体を検出した。すべてｐ
Ｈ〜２．５で、ピーク１：ＬＩＶＫＳアミド（２３．５％）、単量体ｍ／ｚ＝７
０５．３、二量体ｍ／ｚ＝１４０９．３、ピーク４：ＥＦＬＩＶＫＳアミド（２
５％）、単量体ｍ／ｚ＝８３４．４、二量体ｍ／ｚ＝１６６７．３、およびピー
ク５：ＥＦＬＩＶＫアミド（３２％）、単量体ｍ／ｚ＝７４７．４、二量体ｍ／
ｚ＝１４９３．１。これらの結果はＮ末端ＥＦおよびＣ末端Ｓは二量体化を破壊
しなくても検出できることを示唆するものである。

【０１６３】 短いβシートを形成するよう設計されたペプチド、ＶＳＩＫＥＦＬの実験によ
り、イオントラップへのエレクトロスプレー後に質量分析計検出をともなうＣ１
８逆相カラムからの溶出時に単量体型（ｍ／ｚ＝８３４．５）に加え、ペプチド
の二量体型（ｍ／ｚ＝１６６７．５）が検出されることが示される。このことは
このペプチド（これは交互になった親水性および疎水性残基を含み、従ってβシ
ートを形成し得る）はまた安定な二量体を形成することができることを示唆する
ものである。

【０１６４】 実施例２ ＥＦＬＩＶＫＳは、試験１８マーポリペプチドのＮおよびＣ末端に付加された場
合、コンパクトなタンパク質分解耐性構造を形成することができる ペプチドＥＦＬＩＶＫＳは、試験１８マーポリペプチドのＮおよびＣ末端の双
方に融合された場合、このポリペプチド（本明細書ではペプチド１とも呼ばれる
）のコンパクト構造を形成できる。１８マーポリペプチド配列はＶＧＴＩＶＴＭ
ＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶであり、オオムギｃ２−キモトリプシン阻害剤に由来す
る[Leatherbarrow and Salacinski, Biochemistry 30:10717−21(1991)]。Ｎお よびＣ末端システインを含むこのペプチドの類似体（両場合ともバリンが置換た
）は同様のコンパクト構造へ折りたたみ、オオムギキモトリプシン阻害剤−２に
存在するループとすると考えられる。かかるコンパクト構造はエラスターゼなど
のプロテアーゼの十分な基質ではないはずであり、実際、エラスターゼ、キモト
リプシンおよびサブチリシンの２つの変異体阻害剤として提案されている。本発
明者らはこのジスルフィドにより環化された類似体を合成し試験したが、実際、
それは十分なプロテアーゼ基質ではないが、それでもなお基質は阻害剤ではない
。直鎖状ペプチドＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣはエラスターゼの完全
な基質であり、３時間のインキュベーション後に約１５個のペプチド生じた（図
５Ａ）。なお、タンパク質分解は逆相ｈｐｌｃと接続した質量分析計によるタン
パク質分解断片の検出および同定によりモニターする。２個のシステイン間にジ
スルフィド結合を有する同様のペプチドもまたエラスターゼの基質であるが、２
、３個のペプチド断片しか生じず、主要な最初の切断はチロシンの後で起こる( 図５Ｂ）。二量体形成剤ＥＦＬＩＶＫＳのＮおよびＣ末端の双方での融合により
（ＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳア
ミド）、より高いタンパク質分解耐性の構築体が生じ（図５Ｃ）、約３時間後に
はタンパク質分解がほとんどなく、極めて微量のいくつかの異なる切断産物が残
るだけである。

【０１６５】 実施例３ ペプチド１の低エネルギーコンホマーの実験 ペプチド１のコンパクトな構築体の構造的性質を調べるために、Nilges et al
., Protein Engineering 2:27-38(1988)により公開されたものと同様の高温分子
力学をシミュレートしたアニーリングプロトコールにより、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ９
５において実施されたように低エネルギーコンホマーを得た。構造体を２ｐｓｅ
ｃ毎に（９００Ｋで４００ｐｓｅｃないし１４００ｐｓｅｃまで持続する種々の
軌道から）採っておき、５ｐｓにわたって３００Ｋに冷却して、距離依存性誘導
性定数（８０ナでε＝８０ないし１ナでε＝１間で直線的に変化する分離）を用い て最急降下アルゴリズムの２００工程で極小化し、次いで、結合勾配アルゴリズ
ムを用いて必要とされるだけの工程で０．００１ｋｃａｌ／Ａ未満の極大誘導体
を得た。得られる低エネルギー構造体を回収し、 ａ）ペプチド１、オオムギキモトリプシン阻害剤１に存在するそのコンホメーシ
ョンから出発し[McPhalen and James, Biochemistry 26:261-269(1987)]、次い でＤｉｓｃｏｖｅｒ２．９．５を用いて最小化し、延長コンホメーションから最
小化した２個の二量体形成剤と結合させた１８マーのポリペプチド、 ｂ）最後の構造体から出発しているが異なるdseedの使用により改変された軌道 を有する、ａ）における連続軌道から得られた構造体、 ｃ）第３のdseedを用いるｂ）における連続軌道、 ｄ）二量体形成剤が強制的に開始βシート構造となる以外はａ）同様に始まる軌
道、 ｅ）二量体形成剤が強制的に開始右回りαへリックスコンホメーションとなる以
外はａ）同様に始まる軌道、 ｆ）十分に伸長したペプチド１から始まる軌道 から始まる軌道と比較した。

【０１６６】 軌道ａ−ｆからの低エネルギー構造体のうち２０ｋｃａｌ／モル以内のすべて
の構造体を回収して比較した。図６はペプチド主鎖の最小二乗整列後のすべての
軌道からの４５個の最低エネルギー構造体全体を示す（ペプチド主鎖のみが示さ
れている）。すべての構造体は、個々に調べた場合にはコンパクトであると考え
られる。主鎖コンホメーションの実験により１８マーのポリペプチドは種々の方
法で二量体形成剤の表面に折りたたまれることが示唆される。空間充填モデルに
より得られる低エネルギー構造は十分に充填されていることが示唆される。この
ことは１８残基のようなポリペプチド長に関しては、これらの構築体のライブラ
リーは非常に小さいタンパク質またはコンパクト構造のライブラリーであり得る
ことを示唆する。相対的に小さいサイズのこれらのミニタンパク質は容易なｎｍ
ｒ構造決定、さらに、構造−活性関係の確立を可能にするはずである。また、こ
れらのコンパクトな低エネルギーコンホマーはエラスターゼに対してこの構築体
に観察された不活性と一致する。

【０１６７】 実施例４ コンパクト構造の形成を助けるのに必要な、ポリペプチドのＮおよびＣ末端と結
合した折りたたみペプチドの親和性の評価 共有結合していない第２のペプチド配列に結合するペプチドの効力に関する非
常に高い親和性の厳密な要求とは違い、ここでコンパクト構造をなすための親和
性要求はあまり要求されない。高い親和性を有するペプチドは十分に作用できる
が、必ずしも必要ではない。第１の二量体形成剤（ポリペプチドから分離された
）から一定の距離にホモ二量体ペプチドの第２コピーを結合することにより、第
２の二量体形成剤の非常に高い局在濃度がもたらされる。この局在濃度の評価は
以下のように２つを結合する８マーのポリペプチドに関して得られ、直鎖状８マ
ーは約３ナ／残基×８残基または十分に伸長されている場合には２４ナ長である。 従って、二量体形成剤の第２コピーからの距離の大まかな推定は２０ナ以下の範
囲にあるであろうが、これはすべての（または実際のところ多くの）コンホメー
ションにおいてペプチドは十分には伸長していないからである。二量体形成剤の
第２の結合コピーを２０ナずつ離して含む溶液は約０．２ｍＭの有効な濃度を有
する。従って、この濃度の１／１００すなわち２μＭおよびそれ以下でホモまた
はヘテロ二量体を形成するペプチドはかかる二量体により９９％環化される。従
って、２μＭまたはそれ以下の結合定数（それ自身またはその二量体のパートナ
ーに関する）を有するホモまたはヘテロ二量体はいずれも環化ペプチドを９９％
形成することができる。

【０１６８】 ペプチド１の最小化構造に基づき、二量体の第２コピーは、折りたたみペプチ
ドの間に挿入されるポリペプチドの折りたたみ状態によっては第１コピーに２０
ナよりも有意に接近し得る。平均で１０ナ離れているとすれば、その局在濃度はお よそ１．６ｍＭであり、また１６μＭ以下の自己結合定数を有する二量体形成剤
からは９９％の環化ペプチドが得られる。

【０１６９】 実施例５ ペプチド構築体の合成 以下の物質は示された供給源から得た。保護Ｎ−^αＦｍｏｃアミノ酸誘導体は
Advanced ChemTech(Louisville, KY)から購入し、またジイソプロピルカルボジ イミド（ＤＩＣ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、２−（１
−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウ
ムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ
，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、チオアニソー
ル、エタンジチオールおよびアニソールなどのすべてのペプチド合成試薬はSigm
a(St.Louis, MO)から入手した。プレ配合Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−Ｗａｎｇ樹脂およ びＨ−Ｐｒｏ−２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂（Ｃ末端Ｐｒｏペプチドを合成するための
）はNovabiochem(La Jolla, CA)から購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）などの有機溶媒はFisher Scientific(Santa
Clara, CA)のものであり、これらは分析等級のものであった。

【０１７０】 二量体形成剤足場ペプチドを従来のＦｍｏｃ化学に従って、Protein Technolo
gies Inc.,(Tucson, AZ)の自動化シンフォニー／マルチプレックス・マルチプル
ペプチド合成装置で合成した。カップリング(１.５時間／カップリング）および
脱保護（３×２０分）工程の継続時間を若干改変して、存在する初期設定プログ
ラムにより高い収率の所望のペプチドを得られるようにした。樹脂混合物を攪拌
するための窒素ガスの適用速度を慎重に操作して樹脂ビーズと添加試薬を確実に
完全に混合させた。Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Tｙｒのｔ−ブチル（ｔ Ｂｕ）、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｎのｔ（Ｔｒｔ）基、Ｌｙｓ、Ｔｒｐのｔ−ブチ
ルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などの標準のＦｍｏｃ適合性側鎖保護基をそれ
ぞれのアミノ酸誘導体に使用した。同様に、２，２，４，６，７−ペンタメチル
ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）基をＡｒｇの側鎖保護として
利用した[Fields and Fields, Tetrahedron Lett. 34:6661(1993)]。ＤＩＣ／Ｈ
ＯＢｔ媒介性カップリング法[Fields and Noble, Int. J. Pept. Protein Res.
35:161-214(1990)、Hudson, J. Org. Chem. 53:617-624(1988)] を用いて、ＤＭ
ＦとＤＣＭの混合物（５０％、ｖ／ｖ）中の５倍過剰のＦｍｏｃ保護αアミノ酸
を用いてカップリング反応を二度実施した。ある場合には（Ａｒｇ、Ｈｉｓおよ
びＬｙｓのカップリング）、反応を確実に完了させるためにアミノ酸の３個のカ
ップリングが実施され、また、困難な状態ではＨＢＴＵ／ＨＯＢｔカップリング
法を採用した[Knorr et al., Tetrahedron Lett. 30:1927-1930(1989)] 。未反 応のアミノ基をＤＭＦ中の５０％の無水酢酸でキャップした。自動で配列あたり
５個のアミノ酸かカップリングさせた後、合成を一次停止させ、カップリング反
応の完了をKaiser試験により確認し[Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595-59
8(1970)]、さらに続行した。合成の最後に、ＤＭＦ中の２５％ピペラジンでＮ末
端のＦｍｏｃ基を３０分脱保護し、ＤＣＭとそれに続いて無水エタノールで樹脂
を十分に洗浄した。無水エタノールで十分に洗浄した後、ＴＦＡ（８２．５％）
フェノール（５％）チオアニソール（５％）／エタンジチオール（２．５％）／
水（５％）からなるキング切断反応混液（試薬Ｋ）を用いて周囲温度で３時間処
理することにより手動でペプチドを樹脂から切り離し、その際、すべての側鎖保
護も同時に除去した[King et al., Int. J. Pept. Protein Res. 36:255-266(19
90)]。切り離した後、これまでに記載されたように冷ジエチルエーテルを用いて
粗ペプチドを沈殿させ、その後沈殿物を水／アセトニトリル溶液可溶化させ、凍
結乾燥させた[Gururaja and Levine, peptide Res. 9:283−289(1996)]。

【０１７１】 保護カラム（１０×５０ｍｍ）に接続した半分取Ｒａｉｎｉｎ(Woburn, MA)Ｄ
ｙｎａｍａｘ６０ナ逆相シアンカラム（１０×２５０ｍｍ）を用いる逆相高性能
液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）(可変波長ＤＡＤ検出器を備えるHew
lett-Packardモデル１１００シリーズＨＰＬＣシステム; San Francisco, CA, U
SA)により凍結乾燥粗ペプチド抽出物を精製して均質なものにした。移動バッフ ァーはA：水中の０．１％ＴＦＡおよびＢ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ からなる。これまでに記載されたように２３０および２８０ｎｍでの二波長検出
モードを用いながら４０分の０ないし４０％バッファーＢの直線勾配を使用して
、２．０ｍｌ分^-1の流速でペプチドを溶出した（Gururaja and Levine, 前記)。
純粋なペプチドを含有する画分をプールし凍結乾燥させた。オンラインエレクト
ロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）技術によってすべての精製合成ペ
プチドの完全性および同一性を確認したが、ここではＨＰＬＣカラム出口は、標
準のＥＳＩ源をを装備したFinniganＬＣＱ質量分析計(San Jose, CA,USA)に直接
接続した。質量分析データは予測値とよく一致していた。ＬＣ／ＭＳから判断し
て、ｎｍｒ研究に使用したペプチドＥＦＬＩＶＫＳ−ＳＴＫＳＩＰＰＱＳ−ＥＦ
ＬＩＶＫＳは９９％以上純粋であった。

【０１７２】 実施例６ 質量分析で認められたペプチドの二量化 ペプチドを凍結乾燥させた白色粉末からｐＨ５．０の水に溶解し、最も濃縮さ
れた保存液のｐＨを確認した。粗ペプチドを精製した時点でのペプチド二量体の
最初の観察の後、Finnigan(San Jose, CA)ＬＣＱ質量分析計を調整し、ｐＨ５．
０で二量体のシグナル強度を最適化した。最適パラメーターは、加熱した入口キ
ャピラリーが１３０ないし１５０Ｃ、電源ボルト数が４．０ｋＶ、キャピラリー
ボルト数が３８ｖ、チューブレンズオフセットが２４ｖ、シースガスが４０ない
し８０ｌ／分および補助ガスが２０ｌ／分であった。すべての結合の測定は５な
いし１５１０μｌ／分の連続注入速度を用いて行った。二量体ペプチドの相対イ
オン流速をＳ（すべての二量体イオンの強度）／［Ｓ（すべての二量体イオン）
＋Ｓすべての単量体イオン）］（ナトリウム付加生成イオンが観察される場合に
はこれを含める）として算出した。

【０１７３】 両末端に自己結合性ペプチドを有する足場を構築するために、発明者らは提供
された自己結合性ペプチドホルモン、ニューロペプチド頭部アクチベーター(Bod
enmuller et al., 前記)の配列の一部の変形を試験した。いくつかの予備試験の
後、ペプチドの一部の逆配列を含む類似体をさらなる研究に使用した。この類似
体、ＥＦＬＩＶＫＳ結合の化学量論を確立するために、エレクトロスプレー質量
分析法によって自己結合を調べた。結合研究のために質量分析計を二量体型のペ
プチドに対して調整した（図３を参照、データは示されていない）。三量体また
は四量体ペプチド結合の証拠は認められなかった。二量体の相対イオン流速を供
給源に注入されたペプチドの濃度に対してプロットすると、直行する双曲線によ
く一致する曲線が示された（データは示されていない）。この飽和可能な二量体
形成から７．８μＭのＥＦLＩＶＫＳの見かけの結合定数が得られる。この配列 の種々の類似体（表１）を用いてこの実験を反復した。Ｎ末端ｇｌｕのｌｙｓで
の置換は結合を大きく変化させることはなく、このことはこれらのペプチドは互
換的ｌｙｓ−ｇｌｕ相互作用の形成によって単純に二量化するのではないという
ことを示唆する。ＥＥＦＬＩＶＫＫＳを作出するためのｇｌｕおよびｌｙｓの付
加は自己結合親和性に見かけ上４倍の増加をもたらす。各残基を個々にアラニン
で置換して二量化を検討した。Ｎ末端ｇｌｕおよびＣ末端ｓｅｒの置換は見かけ
の二量化定数にほとんど変化をもたらさず、他方、Ｆ２、Ｌ３、Ｉ４、Ｖ５およ
びＫ６のａｌａ置換は結合をそれぞれ５．４倍、９．７倍、５．４倍、１０倍お
よび６倍以上弱めた。

【０１７４】 表１．質量分析法により測定された自己二量化定数

【表１】

【０１７５】 実施例７ ペプチド構築体によるエラスターゼの阻害 ４１２ｎｍで１ないし２分間の１００μＭのスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ａ
ｌａ−ｐ−ニトロアニリドの切断に、２５℃の０．１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー、
ｐＨ７．８８中で１００ｎＭのブタ脾臓エラスターゼ(Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO)の作用を続けた。アッセイ速度論はこの時間に間直線的であった。 １ないし１．５分間のエステラーゼをともなう１０μMのペプチドのプレインキ ュベーションとそれに続く基質の添加に種々のペプチド構築体による阻害を続け
た。阻害率は［１−｛アッセイ傾斜度（ペプチド＋エラスターゼ）／アッセイ傾
斜度（エラスターゼ単独）｝]×１００％として算出した。これらのアッセイ条 件はLeatrherbarrow and salacinski前記により使用されるものと同一である。

【０１７６】 試験配列を拘束するために使用される、NおよびC末端ペプチド配列ＥＦＬＩＶ
ＫＳ間へ挿入するための試験配列として、発明者らは１８マーのＣｉ２ｂプロテ
アーゼ阻害ループの配列の変形を選択した。この配列は非常に高い能力を有する
サブチリシン、キモトリプシンおよびエラスターゼの阻害剤であると報告されて
いる(Leatherbarrow and Salacinski、前記）。これを試験するために、発明者 らはジスルフィド環化型ならびにＥＦＬＩＶＫＳ拘束類似体の双方に関して報告
されたものと同一の条件下でエラスターゼの阻害をアッセイした。結果は表２に
示されている。５００ｎＭの濃度で、ジスルフィド環化ペプチド環［ＣＧＴＩＶ
ＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣ］はブタ脾臓エラスターゼのわずかな阻害しか引き
起こさない、６．２％（ｎ＝３）。その報告された３９０ｐＭの見かけの阻害定
数(Leatherbarrow and Salacinski、前記)ならびにアッセイに使用された基質の
濃度およびＫｍに基づいて、この推定阻害ペプチドが基質と拮抗的であると仮定
すると９９．９％の阻害が推定される。また、天然の配列のNおよびＣ末端ｖａ ｌがシステインで置換された同じ１８マーの配列もそのＮおよびＣ末端に結合さ
れる種々の組合せの二量体形成ペプチドを用いて試験した。いずれもエラスター
ゼの有意な阻害をもたらさなかった(表２）。

【０１７７】 表２．ブタ脾臓エラスターゼのペプチド阻害

【表２】

【表３】 ^*４１２ｎｍで観察された、基質として１００μMのスク−ａｌａ−ａｌａ−ａｌ
ａ−ｐ−ニトロアニリドを用いるｐＨ７．８８、２５℃でのアッセイ 各値は３ないし５回の繰り返しから導かれている。^** ％として推定したもの＝ペプチドが３９０ｐＭを有するＫ_iを有する阻害剤と 拮抗的であると仮定しての、１００［阻害剤］／［阻害剤］＋Ｋ_i（１＋［基質 ］／Ｋ_m）。

【０１７８】 実施例８ ペプチド構築体のエラスターゼ分解 種々のペプチドに対するエラスターゼの作用を調べるために、２５℃の０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．８８に精製合成ペプチド（１０μＭ）を溶解した。エラ
スターゼを１００ｎＭまで加えた。０、１５分、１、２、３および２４時間の時
点で、反応混合物のアリコートを０．１×２５ｃｍのＣ１８逆相ｈｐｌｃカラム
(Vydac Inc., Hesperia CA)に注入した。１００％A（９９．９％Ｈ２Ｏ、０．１
％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸）の勾配を用いて１０分間、次いで６０％ＢまでＢ
（９９．９％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）の１％／分増加勾配
で、さらに１００％までＢの５％／分勾配を用いて反応混合物を溶出した。カラ
ムからFinniganＬＣＱイオントラップ質量分析計の供給源へ直接溶出してペプチ
ドを調べた。ＭａｃＢｉｏＳｐｅｃ(PE-Sciex, Foster City, CAのはからいによ
り得た)を用いて、ペプチドを３００ないし２０００ａｍｕからスキャンし、全 長ペプチドの種々の断片の質量を用いてそれらの質量を調べること、または環状
ペプチドの場合にはそれらの質量を予想されるエラスターゼ分解断片の種々の質
量と比較することにより同定した。２ｍＭのジチオスレイトール(Sigma)の存在 下、還元ペプチドＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣのタンパク質分解を行
った。酸化ペプチドの切断産物を還元せずに直接クロマトグラフィーに付すか、
またはまずアリコートを１ｍＭのＰＭＳＦで１時間、さらに３０ｍＭのＤＴＴで
１０分間処理した後にクロマトフラフィーに付した。

【０１７９】 環化[ＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣ]の予想されるエラスターゼ阻害
活性の欠如に関して反応をさらに調べるために、および表１のいくつかのペプチ
ド構築体のエラスターゼ分解安定性を調べるために、発明者らは１００ｎＭのエ
ラスターゼとともに１０μＭの濃度で各ペプチドをｐＨ７．８、２５℃で３時間
インキュベートした。次いで、各々の反応混合物を微小口径Ｃ１８逆相カラムに
よってクロマトグラフィーに付し、質量分析計を用いてペプチド断片を同定した
。続いて還元するか、または還元せずにのいずれかで環状ペプチド反応を試験し
た(データは示されていない）。直鎖状ペプチドＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴ ＲＳＦＣはエラスターゼ分解に対し高い感受性があり、約１１の種々の同定可能
ペプチドをもたらす（表３）。主切断はＹ９の後であり、付加的な切断はＩ４、
Ｖ５、Ｔ６、Ｍ７、Ｔ１４およびＦ１７の後であった。環状［ＣＧＴＩＶＴＭＥ
ＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣ］はその直鎖状類似体よりもよりも緩慢に切断されると考
えられ、３時間後で２、３の部位で、主にはＹ９の後、またＭ７、Ｔ１４、およ
びＦ１７の後でも切断された。

【０１８０】 ＥＦＬＩＶＫＳが両端に結合したＣｉ２ｂループ１８マーはエラスターゼによ
って相当な程度までは作用されず、３時間後で、はじめに認められたＹ１６の後
で切断されただけであった。クロマトグラムにおいて認められた最も低いレベル
のピークは、エラスターゼを添加しなくても存在する主に合成夾雑物である。２
４時間後、十分なタンパク質分解が起こり、この構築体におけるさらなるエラス
ターゼ分解部位をＶ５、Ｍ１４、Ｔ２１、Ｆ２７およびＩ２９の後に割り当てた
。したがって切断は、直鎖状および環状ペプチドにおけるものと同じ残基の多く
で、しかしながらかなり減少した割合で起こった。

【０１８１】 表３．Ｃｉ２ｂループペプチドおよび類似体に由来するエラスターゼ分解ペプチ
ドの同定

【表４】

【表５】

【表６】 ^*ペプチド断片／観察された単一同位体質量／予想される単一同位体質量として 示されている。

【０１８２】 実施例９ 拘束されたループペプチドを用いる重水素置換実験 注目されるペプチドをｐＨ５の水に溶解し、このペプチドをｔ＝０のD₂Ｏに１
０倍希釈することにより重水素置換実験を行った。試験された最初の構築体に関
しては、D₂Ｏに希釈後のペプチド濃度は１０μMの範囲にあった。その他の時点 に関して、２．５倍容量以上の０℃または２５℃の１％蟻酸を含む１：１Ｈ₂Ｏ ：ＭｅＣＮの添加によってペプチド溶液のアリコートをクエンチし、直ちに質量
分析計に注入した。この酸性ｐH急変により溶媒でのアミド結合水素の置換速度 が緩和される。選択した時点に関して、はじめの２分の注入から得た質量を後の
２分ブロックのものと比較し、戻し置換の有意性を評価したが、これは通常１個
のプロトン以下であった。置換可能なプロトンの総数は１）まずペプチドをＤＭ
ＳＯに溶解し、それをD₂Ｏへ直接希釈し、次いでクエンチし、数分後にペプチド
の新規質量を測定し、２）５％ＤＭＳＯに溶解したペプチドをD₂Ｏに１０倍希釈
し、または３）D₂Ｏに希釈したペプチドの溶液を１００℃で１５分間加熱するこ
とにより得た。ＤＭＳＯを含めたが、これは予備実験において水性アリコートペ
プチドに加えた低レベルのものがプロトン置換を著しく促進すると考えられたか
らである。ＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩ
ＶＫＳを用いて３つの方法すべてを使用した場合に、それらから同様の結果が得
られた。置換された総プロトン数の算出には希釈後にＤ₂Ｏ中に存在するＨ₂Ｏの
容積により１０％の補正が必要であった。１ｍＭ範囲において可溶性のペプチド
に関しては、ｐＨ５の１０倍Ｄ₂Ｏ溶液からのサンプルをクエンチせずに質量分 析計に直接注入した。重水素置換の速度定数および振幅は十分にプロトンを加え
た形態を超える質量増加の経時変化を一次指数関数に当てはめることにより導い
た。

【０１８３】 表面露出残基に関しては、ペプチドおよびタンパク質のアミド主鎖プロトンは
、それがタンパク質の内側にかくされている（および水に接触しにくい）、また
は安定な水素結合に関与している場合にはより緩慢に重水素水に置換される[Eng
lander et al., Protein Science 6:1101-1109(1997)]。質量分析法を使用して 種々の異なるタンパク質の水素置換機能が調べられており(最近の例としては、C
hung et al., Protein Science 6:1316-24(1997)およびSmith et al., J. Mass
Spectrometry 32:135:146(1997)を参照）、置換の遅いプロトンの存在を使用し て三次構造の存在が推定されている[McKnight et al., J. Mol. Biol. 12:126-3
4(1996)]。本明細書における重水素置換研究はｐＨ５で行ったが、これは円二色
性により測定されるようにｐＨ４．５以下では拘束されたループが構造を維持し
ないと考えられるからである（下記参照）。ペプチド二量体形成剤拘束Ｃｉ２ｂ
ループペプチドのコンパクト性を調べるために、Ｄ₂Ｏへの希釈液での重水素取 り込みの速度および化学量論を調べた。種々の異なる構築体の結果が表４に要約
されている。

【０１８４】 表４．拘束されたCｉ２ｂペプチド挿入部分およびその他のペプチド挿入部分¹の
重水素置換速度および振幅

【表７】

【表８】 ¹データは二量体形成剤−挿入部分−二量体形成剤の形のペプチドに関して示さ れており、この二量体形成剤の配列は、特に断りのない限りＮおよびＣ末端で同
一である。² １８マーの標準挿入部分はCｉ２ｂ配列、−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳ
ＦＶ−である。³ 高速相振幅は最も早い置換データに関して算出されており、これはほとんど約 １時間で達成される。

【０１８５】 構築体ＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶ
ＫＳ−アミドのプロトンの重水素置換の動力学を測定した（データは示されてい
ない）。合計６６．５Ｄａを完全なプロトン置換に対するペプチドの時間０質量
として加えた。このｐＨで水に曝される場合には高速相プロトン置換では、２９
個のプロトンが置換され、およそ３３個の側鎖ＮおよびＣ末端プロトンが迅速に
置換可能になると予測される。さらに１６個のプロトンが、速度定数が０．０５
４時間−１の中速で置換された。ここではこの時間規模で観察可能なものよりも
さらにより置換が遅い推定される２１個のプロトンが残った。両クラスのプロト
ンはＥＦＬＩＶＫＳで見られるものと同一の隣接するものからとられた、表面露
出プロトンに関して測定されるよりも緩慢な速度で置換される[Bai et al., Pro
teins: Structure, Function and Genetics 67:75-86(1993)]。これらの制御プ ロトンはｐＨ５で６ないし６０時間^-1の範囲の速度定数で重水素と置換した。同
様の結果が１８マーの挿入部分の同一の末端に結合された逆向きの二量体形成剤
の配列を用いて得られた。また、この１８マーの挿入部分を用いて、挿入部分の
両末端に結合された見かけ上より有効な二量体形成剤（表３）、ＥＥＦＬＩＶＫ
ＫＳを用いて同様の結果が得られた。この場合には７０個の置換可能プロトンの
うち３９個が１時間以内に重水素で置換され、８個のプロトンがの０．１５時間
−１の速度定数で置換され、残る２３個のプロトンはこれよりも置換が遅かった
。この類似体における合計３１個の置換の遅いプロトンは親ペプチドにおける３
７個のプロトンよりも幾分少なく、このことは２個の構築体間の構造におけるい
くつかの微妙な変化を示唆する。ペプチドの可溶性を高めるよう設計された、親
ペプチドのＮ末端にｌｙｓ₆−ｇｌｙ₄−が結合したペプチド類似体に関しては、
約５個のプロトンを除くすべてが１時間以内に置換された。従って、このＮ末端
結合は構造を不安定化するか、または少なくともより動きやすくする。

【０１８６】 通常、このペプチドの４番目の位置のイソロイシンの側鎖は高温分子力学軌道
（下記参照）から得られる低エネルギーコンホマーにあり、折りたたまれたペプ
チドにかくされていると考えられた。従って、発明者らは各二量体形成剤におい
て４番目の位置での単一の点突然変異を作出し（ＥＦＬＫＶＫＳの作出）、重水
素置換によって１８マー挿入部分構造に対するこの突然変異の作用を調べた。こ
の突然変異が構造をかなり崩壊させた場合には置換の遅いプロトンの数が減るで
あろう。重水素置換速度論を調べたところ、１個を除くすべてのプロトンが１時
間以内に置換された。

【０１８７】 また、発明者らはＥＦＬＩＶＫＳまたはその類似体がそれらの挿入部分の両
末端に結合される場合のペプチド全体の置換速度論に関してＣｉ２ｂとは異なる
挿入配列の作用も調べた。１つの挿入部分ＳＴＫＳＩＰＰＱＳはプロテアーゼ阻
害剤環［ＣＴＫＳＩＰＰＱＣ］の類似体に相当した[Gariani and Leatherbarrow
, J. Peptide Res. 49:467-75(1997)]。この短い構築体は３６個の置換可能なプ
ロトンを有しており、加熱された場合にはそのうち３３個が１時間以内に置換さ
れた。従って、このペプチドが折りたたみ構造を有する場合にはわずか２、３の
置換の遅いプロトンしか含まない。第２の挿入部分は抗フラッグ抗体に対してエ
ピトープの結合が可能となるようその柔軟性を高めるために両末端を４個のグリ
シンによりフランクされたフラッグエピトープタグ、ＤＹＫＤＤＤＤＫを含んで
いた。これをＮ末端でＭＧＥＦＬＩＶＫＳ−に、またＣ末端で−ＥＦＬＩＶＫＳ
ＧＰＰに結合した。このペプチドは３６個の置換可能なプロトンを有しており、
このうち３５個が１時間以内に置換された。同様の構築体も７個のグリシンの存
在によりいくらか柔軟であると予想され、インフルエンザ血球凝集素エピトープ
タグ置換性フラッグタグを用いて合成した。すべてのプロトンが約１時間以内重
水素に置換される。従って、より短い挿入配列、または挿入部分を柔軟にさせる
両末端の多数のグリシンを有する挿入部分は置換の遅いプロトンを有していなか
った。

【０１８８】 実施例１０ ペプチド構築体のモデル 置換の遅いプロトンを有するこれまでに調べたペプチド二量体形成構築体には
ミリモル範囲で可溶性であるものはなく、従って、ｎｍｒによる構造決定は容易
には達成されなかった。円二色性から得られる二次構造含量に大まかに匹敵し得
る、選択される構造の作用モデルを得るために、発明者らは高温分子力学を使用
してコンホマーを作出し[Brooks, Chem. Scripta 29A:165-169(1989)、Bruccole
n and Karplus, Biopolymers 29:1847-62(1990)、Auffinger and Wipff, J. Com
put. Chem. 11:190(1990)]、それに次ぐ最小化により種々のコンホマーをエネル
ギー順に並べた。次いで、最も低い５ないし７ｋｃａｌ／モルエネルギーバンド
幅のコンホマーを比較する。この「クエンチした分子力学」という方法は腫瘍表
面オクタペプチドおよび種々のタンパク質のペプチド断片(Brooks,前記）、ツフ
シン(tuftsin)およびその環状類似体[O'Connor et al., J. Med. Chem. 35:2870
-81(1992)」、ならびに直鎖状および環状メラノトロピン[Al-Obeidi et al., J.
Peptide Res. 51:420-31(1998)]に適用されている。また、このアプローチは抗 体の超可変性ループ中の７０残基などのより大きな系に適用されているが[Brucc
oleri and Karplus, Biopolymers 29:1847-62(1990)]、かかる大きな系のための
完全なコンホメーションの適用範囲を提供する十分なコンホマーは作出されてい
ない[Dill, Biochemistry 24:1501-9(1985)]。従って、このアプローチは３２マ
ーに適用される場合には、２、３個の予想される低エネルギーコンホマーの試験
のみが可能で、折りたたみ全体の大まかな知見しか得られない。しかしながら、
環状１８マーまたは２つの直鎖状７マーペプチドに関しては、コンホメーション
空間のより意味のある適用範囲を与える。

【０１８９】 発明者らはこの方法論をまずジスルフィド結合拘束環状１８マーペプチド、環
状［ＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣ］に適用した（これはエラスターゼ
および他のプロテアーゼの準ｎＭ阻害剤であると考えられている）(Leatherbarr
ow and salacinski、前記）。Ｃｉ２ｂと同様の能力を有する阻害剤であろう環 状ペプチドに関しては、おそらくＣｉ２ｂの阻害剤ループと同様の構造および剛
性を有する低いエネルギーコンホマーを有しているはずである。その遊離型にお
いておよびそのサブチリシンノボとの複合体[McPhalen and James, Biochemistr
y 26:261-9(1987)]においては、阻害剤ループの主鎖全体はほぼ平面であり、Ｒ ６５、Ｒ６７およびＦ６９側鎖がループの内部を占めている。サブチリシン結合
部位に合体する端は変則的なβシートであり、Ｉ５６、Ｔ５８、Ｍ５９およびＹ
６１の側鎖は溶液または結合された複合体中のサブチリシンの中に伸びており、
Ｍ５９の側鎖はサブチリシンに合体される場合には溶液構造から著しく曲がって
いる。この環状ペプチドの天然ループの構造および極小化コンホマーのエネルギ
ー分布（２つの軌道、５．４ｎｓ、２７００構造）を測定した（データは示され
てない）。それは、これまでに環状メラノトロピン類似体に関して示されている
ように[Al-Obeidi et al.,前記）ほぼガウスのものである。環状ペプチド模倣ル
ープに関して見られる低エネルギーコンホマーは天然の阻害剤ループよりも有意
によりコンパクトで、かつ、球形であると考えられ(データは示されていない） 、それらはそれぞれ６．２２、６．１２、５．４６、６．３１、５．７２、５．
６９および５．６４ナの１８マー阻害剤ループからの主鎖原子根平均二乗変位を
有している。サブチリシン接触領域の多くを形成し、阻害剤ループの反応部位（
ｍｅｔｔないしｇｌｕ８）を取り囲む残基３ないし１０は、それぞれ５．６５、
６．４０、３．９５、５．５４、５．２０、５．０７および４．５９ナの天然ル
ープ中の同一残基からの重原子根平均二乗変位を有している。さらに、これら低
エネルギーコンホマーのいずれにおいても、Ｒ６５、Ｒ６７およびF６９の側鎖 はループ領域の内側にかくされていない。これらの結果は、Ｃｉ２ｂの阻害ルー
プと比較した場合、低エネルギーコンホマーの著しく異なる構造と一致する。こ
れらの相当な構造の違いは、この環状１８マーを用いてエラスターゼの阻害を観
察できないことと一致する。

【０１９０】 発明者らは次に二量体化した場合のＥＦＬＩＶＫＳの低エネルギーコンホマー
を見出すためにクエンチした分子力学を適用した。これらのガス相算出は質量分
析法によって認められたペプチド二量体の低エネルギー形と特に関連し得る。コ
ンホメーション研究の開始に先立って、ペプチド二量体はガス相において２つの
ペプチドをそれらの質量のほぼ中心でつなぐか、または種々の平行および非平行
開始配置（方法項を参照）をともに結合することによって構築する。５２５０個
の極小化構造および１０．５ｎｓを包含する合計７個の軌道を作動させ、（デー
タは示されていない）、また、すべての軌道からの最も低い７ｋｃａｌ／モルの
エネルギーバンド幅を包含する、１４個の最低エネルギーの二量体の主鎖オーバ
ーレイを実施した（データは示されていない）。これはペプチド二量体形成剤の
１つのすべての主鎖原子の最少平方重ね合わせにより作出した。両ペプチドとも
ターンコンホメーションに適合すると考えられるが、二量体間軸をはさんで対称
にはない。

【０１９１】 １４個の最低エネルギーのコンホマーのクラスターグラフ（これで各コンホマー
の主鎖原子をあらゆるその他のコンホマーのものと比較する）に加え、RMSD変位
（Ａ）を作出した（データは示されていない）。それらのＲＭＳＤ差が０ないし
１ナ範囲にあれば２個のコンホマーは最も類似する。低エネルギーコンホマーの
１つの主なファミリーおよびいくつかの他の独特のコンホメーションがあると考
えられる（データは示されていない）。すべてのペプチドに関して、それのシミ
ュレーションでは荷電される第１のペプチドのＮおよびＣ末端の双方は、二量体
の第２のペプチドのＮおよびＣ末端に接近していると考えられる。各ペプチドは
２個の酸性および２個の塩基性基を有するので、いくつかの異なる二量体間イオ
ン対が起こり得る。１４個の低エネルギーコンホマーのすべてにおいてすべての
あり得る二量体間イオン対の距離を調べることにより最も安定なイオン対がａ）
ペプチド１：ペプチド２のＮ末端：ｇｌｕ１：側鎖カルボン酸塩、ｂ）ペプチド
１：ペプチド２のｌｙｓ６ε−アミノ：ｇｌｕ１：側鎖カルボン酸塩、およびｃ
）ペプチド２：ペプチド１のＣ末端：ｌｙｓ６：ε−アミンであるということが
示唆される。両ペプチドともそれら自身のＮおよびＣ末端間でもいく分か安定な
分子内イオン対を形成する。

【０１９２】 また、クエンチした分子力学を使用して両端でＥＦＬＩＶＫＳが結合したＣｉ
２ｂ１８マー試験挿入部分の低エネルギー構造を調べた（データは示されていな
い）。このペプチドはエラスターゼに対して相対的に不活性であり、置換の遅い
３７個のプロトンを有しており、質量分析計により観察される場合には高次凝集
の形跡は示さない（データは示されていない）。１２．３ｎｓの力学軌道から合
計６９００個の種々の構造を集めた。これらの構造をガウス分布に分類した（デ
ータは示されていない）。２個のコンホマーは他のすべてよりも少なくとも７ｋ
ｃａｌ／モル低かった（データは示されていない）。両コンホマーはコンパクト
で、かつ、球状であると考えられ、これは前記の他の実験結果と一致する。前記
でＥＦＬＩＶＫＳ二量体を用いて模擬実験を行ったように、１８マー挿入部分に
結合した各末端ＥＦＬＩＶＫＳがターンを形成し、そのＮおよびＣ末端は３．８
ないし４．３ナ内にあると考えられる。しかしながら、ＥＦＬＩＶＫＳ二量体の
構造とは違い、ここでは１８マー挿入部分に結合されているそれらの第２末端は
分子の中心にループを描いて戻ることはなく、その代わりに２個のコンホマーに
おいて１１．５ないし１５ナ離れている。この距離は天然のＣｉ２ｂ構造におけ
る適合距離（４．１ナ）、および環状ペプチド低エネルギーコンホマーにおける
適合距離（平均で６．８８ナ）よりも有意に大きく、このことは少なくともこの
挿入部分を有する二量体形成剤ペプチドはかなり広い基部を有する「ループ」を
形成するということを示唆する。１８マーの挿入部分もかなりの割合のターン構
造を含むと考えられ、これは円二色性測定値に一致する。

【０１９３】 実施例１１ ペプチド構築体に対する円二色性研究、ＮＭＲ測定およびペプチドコンホメーシ
ョン調査 円二色性測定 ペルティエ温度制御装置を装備したＡＶＩＶ ６２Ａ ＤＳ ＣＤ分光偏光計(L
akewood, NJ, USA)にＣＤスペクトルを記録した。NeslabＣＦＴ−３３冷却再循 環水浴を用いて機器の温度を終始２０℃以下に維持した。製造業者の推奨に従い
、（＋）−１０−カンフォールスルホン酸のアンモニウム塩で装置を定期的に補
正した。２５℃で時定数１ｓを用いて２５０と１９５ｎｍの間を０．２ｎｍ間隔
でスペクトルを記録した。５個の個別スキャンからのデータを集め、ＩＢＭ Ｐ
Ｓ／２コンピューターを用いて平均した。アミノ酸解析によって決定された０．
０２ないし０．０５ｍＭの濃度のサンプルを用いるスペクトル範囲に関しては、
路長０．１ｃｍの円筒形石英セルを使用した。ペプチド保存溶液（１ｍＭ）は、
特に断りのない限りｐＨ７．５の１００ｍＭＫＦを含有する１０ｍＭＫＰＯ₄バ ッファーに作製した。ｐＨ滴定実験用には、ペプチド保存溶液に加える前に０．
１ＭＨＣｌか０．１ＭＮａＯＨのいずれかを用いて、バッファーのｐＨを所望の
値に慎重に調整した。ｄｅｇ．ｃｍ²．ｄｍｏｌ^-1での平均残基楕円率（ＭＲＥ ）を方程式から得た。 ＭＲＥ（λ）＝−（λ）／１０ｌｃｎ ｛式中、−（λ）は波長λにおける楕円度（°）、ｌは路長（ｃｍ）、ｃは濃度
（Ｍ）およびｎはペプチド／タンパク質中の残基数[Schmidt, in Protein Struc
ture:A Practical Approach, IRL Press, new York, pp251-285(1989)]である｝
。これまでに記載されるように、個々の実験から集めた生データをＡＳＣII書式
に変換しMicrosoft Excelソフトウェアパッケージを用いてプロットを作製した[
Gururaja and levine, Peptide Res. 9:283-289(1996)] 。熱変性データはｐＨ ７．５の１００ｍＭＫＦを含有する１０ｍＭＫＰＯ₄バッファー中に２０μＭの ペプチドを含有するサンプルに対して採った。２２０ｎｍで４ないし９８℃の範
囲にわたって温度刻み幅２℃および２分の平衡化時間ならびに６０ｓのシグナル
平均化時間を用いて熱変性を測定した。見かけのＴｍをＴ^-1に関する２２０ｎｍ
でのＣＤシグナルの第１誘導体の最大値として算出した。ＣＤスペクトルをプロ
グラム？を用いて脱回旋(deconvolute)した。ＣＤスペクトルをプログラムＤｉ ｃｈｒｏｐｒｏｔ ｖ．２．４を用いて脱回旋したが、これはJohnson種々の選 抜法を使用するものである。

【０１９４】 ＮＭＲ測定 ＮＭＲ実験用の、Ｄ₂Ｏ(９９．９６％D）およびＤＣｌ（９９．５％D）などのす
べての重水素を含む溶媒はCambridge Isotope Laboratories (Andover, MA)から
購入した。サンプル（〜１ｍＭ）は合成ペプチドを０．７ｍｌのＨ₂Ｏ：Ｄ₂Ｏ９
０：１０（ｖ／ｖ）または１００％Ｄ₂Ｏに溶解することにより調整した。水中 のサンプルはＨＰＬＣ精製したペプチドを溶解することにより調整し、ＨＣｌま
たはＤＣｌでｐＨ４．０に調整した。すべてのｐＨ値は室温で測定し、本明細書
で報告される値は見かけのｐＨ値であり、これは重水素同位元素作用について補
正しなかった。内部化学シフト標準としてはＴＳＰ［３（トリメチルシリル）２
，２，３，３−ｄ₄−プロピオン酸ナトリウム塩］を使用した。

【０１９５】¹ Ｈ−ＮＭＲ実験はこれまでに記載されたように、２５℃でSunsparcstation５を
装備したVarian Unity ＩＮＯＶＡ−５００スペクトロメーターで実施した[Naga
nagowda et al., J. Biomol. Struct. Dynam. 16:91-107(1998)]。二次元二倍量
子フィルター相関スペクトロスコピー（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ）[Rance et al., Bio
chem. Biophys. Res. Commun. 117:479-485(1983)]、総相関スペクトロスコピー
（ＴＯＣＳＹ）[Bax and Davis, J. Magn. Reson. 65:355-360(1985)]、回転構 造オーバーハウザー増強型スペクトロスコピー（ＲＯＥＳＹ）[Bothmer-By et a
l., J. Am. Chem. Soc. 106:811-813(1984)]および核オーバーハウザー増強型ス
ペクトロスコピー（ＮＯＥＳＹ）[Macura and Ernst, Mol. Phys. 41:95-117(19
80)]実験は多元法[States et al., J. Magn. Reson., 48:286-292(1982)]を使用
してｔ₁次元における求積検出を用いる純粋相吸着法で行った。担体を水共鳴に 置き、緩和延期（１．５ないし２．５ｓ）の際のおよびＮＯＥＳＹ実験における
混合時間の際の水の照射を可能にした。ＴＯＣＳＹスペクトルに関しては、５０
ないし８５ｍｓのスピンロック時間を用いてＭＬＥＶ−１７配列を使用した。Ｒ
ＯＥＳＹ実験に関しては、２００と２５０ｍｓのスピンロック時間を使用し、他
方ＮＯＥＳＹに関しては２００と３００ｍｓの混合時間を使用した。Ｈ₂Ｏにお ける¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは両次元で５４００Ｈｚのスペクトル幅を有してい た。Ｄ₂Ｏ溶媒では、アミドプロトンの完全な置換後に両次元においてスペクト ル幅を３０００Ｈｚに縮小させることによりスペクトルを記録した。２５６また
は５１２ｔ₁増分は１０２４または２０４８の大きさのデータ点を用いて獲得し た。サンプルをＤ₂Ｏに溶解し、直ちに１ＤおよびＴＯＣＳＹスペクトルを記録 することにより、置換の遅いアミドプロトンを同定した。アミドプロトンの温度
係数測定に関しては、２５および５０℃の間を５℃刻み幅で１ＤおよびＴＯＣＳ
Ｙ実験を実施した。典型的にはＤＱＦ−ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹスペクトルに
関しては１６個または３２個のスキャンを、ＲＯＥＳＹおよびＮＯＥＳＹスペク
トルに関しては６４個のスキャンを集めた。フーリエ変換の前に、遊離誘導崩壊
（ＦＩＤ）は両次元において一度補充されゼロであった。ＤＱＦ−ＣＯＳＹスペ
クトルの処理に関しては、両次元において９０°シフトした二乗したサインベル
電磁窓関数を使用し、他方ＴＯＣＳＹ、ＲＯＥＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトル
に関しては、９０°および４５°シフトした二乗したサインベル電磁総関数を用
いてデータを個別に処理した。

【０１９６】 構造決定のために、水における２００ｍｓの混合時間で得た２Ｄ−ＮＯＥＳＹ
スペクトルにおけるＮＯＥ交差ピーク強度から¹Ｈ−¹Ｈ距離を推定した。交差ピ
ーク容量を比較することによりプロトン間距離の範囲を算出し、距離配置計算値
に関して３つの分類、１．８ないし２．５ナ（強）、２．５ないし３．５ナ（中） 、および３．５ないし５．０ナ（弱）に類別した。ＮＭＲ研究から各残基のビシ
ナルカップリング定数³Ｊ_NH-COHを得、これを使用してKarplus関係により可能性
あるねじれ角を推定した[Karplus, J. Chem. Phys. 30:11-15(1959)]、³Ｊ_{NH-CO H} ＝Aｃｏｓ²θ―Ｂｃｏｓθ＋Ｃ（式中、θ＝１φ―６０°）。Pardi et al., J
. Mol. Biol. 180:741-751(1984)により提示される Ａ、ＢおよびＣ定数は、そ れぞれ６．４、１．４および１．９の値である。コンホメーションのデータを得
るために使用される技術は、他の場合に非常に詳細に論じられているように、も
っぱら便宜に要約される。ＮＭＲ技術に基づくコンホメーション図は単に高い磁
場強度で得られる二次元ＮＭＲデータを用いるポリペプチド鎖沿いのねじれ角の
測定を基にしている。さらに、共有結合によりカップリングされているプロトン
を割り当てるためにＴＯＣＳＹ実験を実施した。逐次割り当て、例えばＨα（ｉ
）−ＮＨ（ｉ＋１）はＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹ実験を基にしており、それで
は空間的に極めて接近したプロトン間に相関関係が認められており、それがまた
コンホメーションの指標でもある。

【０１９７】 ペプチドコンホメーション研究 種々のペプチド構築体の低エネルギーコンホマーを以下のように作出した。Ｉ
ｎｓｉｇｈｔII９５．０(Molecular Simulations Ins., San Diego, CA)および ｃｆｆ９１力場[Maple et al., J. Comp. Chem. 15:162-182(1994)]を用いてペ プチド構築体の明確な原子モデルを構築した。Ｎ末端アミンおよびＣ末端カルボ
ン酸塩に加え、十分にイオン化されたｌｙｓ、ａｒｇ、ａｓｐおよびｇｌｕを有
する双極性イオンとしてペプチドを設計した。直線距離依存性遊離体定数を使用
して水性溶媒環境および対イオン遮断の作用をシミュレートした。１ｆｓの時間
刻み幅を用いるverietアルゴリズム[Verlet, Phys. Rev. 159:98-103(1967)]を 使用して挙動の方程式を積分したが、これはＤｉｓｃｏｖｅｒ２．９．７の初期
設定互徐アルゴリズムとして実行した。非共有結合の相互作用に関しては１５Ａ
カットオフを使用した。５ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ｒａｄ²のねじれ抑制力を用いて 高温でのトランス型コンホメーションのためにペプチド結合を制限した。力学プ
ロトコールでは、Mackay et al.により書かれたプログラム[Mackey et al., in
Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformati
on,(Fasman, ed; New York, Plenum Press) pp317-358(1989)]を改変したものに
基づいて、まず３００工程の最急降下および１０００工程または必要とされる共
役勾配極小化と同数の工程を用いて、開始ペプチド構造を極小化し、その結果最
大エネルギー誘導体を０．１ｋｃａｌ／A未満として分子の構築の際に作出され る高エネルギー構造を除去した。dseed変数を用いてペプチド原子をランダムな 初速度に割り当て、ペプチドを９００Ｋまで２ｐｓにわたって加熱した。４００
ｐｓないし3ｎｓに変化する時間の間個々の軌跡を持続させ、続く極小化のため に１ないし２ｐｓ毎に個々の構築体を集めた。各々のためられた構築体を９００
Ｋで５０ｆｓ間平衡にさせ、５ｐｓにわたって３００Ｋに冷却し、３００工程の
最急降下アルゴリズムを用いて、次いで必要とされるだけの工程を用いるＦｌｅ
ｔｃｈｅｒ−Ｒｅｅｖｅｓ共役勾配極小化により極小化して最大エネルギー誘導
体を０．００１ｋｃａｌ／モル／Ａ未満とした。個々におけるコンホマー数に対
する極小化された総エネルギー、５ｋｃａｌ／モル電磁窓を各々のペプチドに関
してプロットした。極小エネルギー[O'Connor et al., J. Med. Chem. 35:2870-
81(1992)]を超える最低５ｋｃａｌ／モル電磁窓のコンホマーをさらなる解析の ために選択した。

【０１９８】 種々のペプチドの開始構造を以下のように得た。二量体化ＥＦＬＩＶＫＳに関
しては、延長構造を約７Ａ離れたｉｌｅ４のＣｙ１を有する、並行型または非平
行型に並べ、４個の異なる開始構造を得た。両ペプチドのｉｌｅ４のＣｙ１間の
距離が１．５ないし１２Ａの範囲外にある場合には２つの延長構造（平行型およ
び非平行型）は１００ｋｃａｌ／モルのエネルギー減を伴ってつながった。推定
のプロテアーゼ阻害剤である環状［ＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣ]に 関しては、最初の構造は右回りのαへリックスとβシートの混合物であり、２個
の末端システイン間にジスルフィド結合が形成できている。第２の試験は第１の
構造を部分的に極小化したものを用いて開始した。

【０１９９】 ペプチド二量体により拘束された構築体ＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹ
ＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳに関しては、いくつかの異なる開始構造を
使用した。あるものは１８マーの挿入部分であるＣｉ２ｂを基にした構造（ＰＤ
Ｂファイル２ＣＩ２）から開始し、これは結晶構造から阻害剤ループ以外のすべ
ての残基を除去し、個々の残基を変化させることにより誘導してLeatherbarrow
and Salacinski（前記）に報告された１８マーの配列を得た。延長されたコンホ
メーション中のＥＦＬＩＶＫＳをペプチドの両末端に結合させて得られる構築体
を前記のように極小化した。第２の構造はβシートとして１８マーのＣｉ２ｂ挿
入部分の両末端に結合されたＥＦＬＩＶＫＳから開始した。第３は右回りのαへ
リックスとして１８マーのＣｉ２ｂ挿入部分の両末端に結合されたＥＦＬＩＶＫ
Ｓから開始した。第４は全構築体の延長したコンホメーションから開始し、第５
は異なる部分的に延長されたコンホメーションから開始した。第６試験は全構築
体をβシートとして用いて開始した。

【０２００】 本明細書で研究されるペプチドは中性または中性付近のｐＨでｎｍｒ構造決定
に必要とされるミリモル範囲よりもかなり低いレベルで可溶性であるので、発明
者らは円二色性（ＣＤ）を用いてそれらの溶液構造を調べた。円二色性測定はペ
プチドとタンパク質双方の二次構造に対して感受性があり、双方のコンホメーシ
ョンを調べるために広く使用されている[Bloemendal and Johnson, Pharm. Biot
echnol. 7:65-100(1995)、Woody, Methods Enzymol. 246:34-71(1995)、Greenfi
eld, Anal. Biochem. 235:1-10(1996)]。本明細書ではこれらの測定値を使用し てｐH依存性の二次構造形成および安定性を調べて種々の二量体形成剤の挿入構 造の作用を比較し、二量体形成剤における変異の作用を調べ、二量体形成剤によ
り拘束されたループの構造全体に対する種々の挿入配列の作用を考察した。これ
らの測定値をタンパク質分解の感受性、重水素置換の測定値、およびコンホメー
ション研究の結果と組み合わせれば、構造全体および本明細書で調べられるミニ
ループの折りたたみに関する情報が得られる。

【０２０１】 ＥＦＬＩＶＫＳにより二量体化される９マーの挿入部分 調べた第１の挿入部分はＥＦＬＩＶＫＳ−ＳＴＫＳＩＰＰＱＳ−ＥＦＬＩＶＫ
Ｓであった。9マーの挿入部分はプロテアーゼ阻害剤、環状［ＣＴＫＳＩＰＰＱ Ｃ］(Gariani and Leatherbarrow、前記）の類似体に相当する。CDスペクトルを
ｐH３．５ないし８．５の間記録した（データは示されていない）。二次構造の ｐH依存性転移が認められた。ｐH３．５で、２０１ｎｍで顕著な極小を示す二次
構造が認められた。これは１９５ないし１９７ｎｍのランダムコイルの予測され
る極小[Greenfield and Fasman, Biochemistry 8:4108-4116(1969)]に近いもの であり、また、スペクトルの形も短いペプチドで観察される１型βターンのもの
と同様である[Perczel et al., Int. J. Peptide Protein Res. 41:223-236(199
3)]。

【０２０２】 低ｐＨ構造の¹Ｈ−ＮＭＲ実験 このＣＤスペクトルが所定の条件下でいくつかの他の挿入部分を用いて認めら
れ、またこのペプチドは低いｐＨでかなり可溶性であったので、発明者らはｎｍ
ｒを用いてこの構造を調べた。９マーの挿入部分の水における¹Ｈ−ＮＭＲスペ クトルの共鳴割り当ては標準配列割り当て法[Wuthrich, in NMR of Proteins an
d Nucleic Acids, New York, Wiley-Interscience, pp 166ff (1986)]によって 行った。¹Ｈ共鳴の割り当ては２Ｄ−ＴＯＣＳＹと２Ｄ−ＮＤＥスペクトルの組 合せ解析により達成した。また、種々の温度（２５ないし５０℃）で２Ｄ−ＴＯ
ＣＳＹスペクトルを記録して明確は割り当てのために重複結合を解き、また、こ
れを使用してＮＨ化学シフトの温度係数を決定した。水のシグナル（９０％Ｈ₂ Ｏにおける）にかくされた共鳴は１００％Ｄ₂Ｏにおけるスペクトルを記録する ことにより割り当てた。割り当てられたすべてのプロトンの化学シフトが表５に
挙げられている。ＮＨ化学シフトの温度係数、アミド基の¹Ｈ／²Ｈ置換速度、Ｊ _NH-COH 値および特有の強い、中程度のおよび弱いＮＯＥ係数のセットを基準とし
て使用してペプチドが水溶液中でいずれかの好ましい主鎖コンホメーションを有
するかどうかを調べた。

【０２０３】 すべてのアミド共鳴の温度係数は＝０．００４ｐｐｍＫ^-1であることが分かり
(データは示されていない）、このことは主鎖のＮＨ基は溶媒に曝されており、 いずれの分子内水素結合相互作用にも関与していないということを示唆する。す
べての主鎖アミド共鳴に認められた高速¹Ｈ／²Ｈ置換速度はアミド基はいずれの
分子内水素結合にも関与していないということのさらなる証拠を示す。いくつか
の観察可能なｄ_NNＮＯＥ相互作用もない中での、強いｄ_{α N(i,i-1)}および弱いｄ _{α N(i,i)} ＮＯＥが行き渡っていることおよび弱いおよび中程度のｄ_{β N(i,i)}およ
びｄ_{αβ (i,i)}ＮＯＥの連続的な広がりは、φ、φ空間[Rance et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 117:479-485(1983)、Pardi et al., J. Mol. Biol. 18
0:741-751(1984)]の折りたたまれていない延長された領域では主鎖の上反角が優
勢であるということを示す。表５に示されたＪ_NH-COH値はＳｅｒ−７を除くすべ
ての残基に関して６．５ないし８．４Ｈｚの範囲にある。規則的なβ鎖に関して
は、Ｊ_NH-COHは〜９Ｈｚであると予測され、他方αへリックスに関しては、それ
は〜４．０Ｈｚである[Rance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 117:47
9-485(1983)、Pardi et al., J. Mol. Biol. 180:741-751(1984)]。このペプチ ドに関して観察された６．５ないし８．４Ｈｚのカップリング定数は、規則的な
ヘリックス領域を越えるφ値に匹敵するコンホメーションエネルギーを有する折
りたたまれていない非水素結合で結合されたコンホメーションの集団の存在を示
唆する。ひとまとめにすると、ＮＭＲデータはＥＦＬＩＶＫＳ−ＳＴＫＳＩＰＰ
ＱＳ−ＥＦＬＩＶＫＳは水溶液においては構造的でないという証拠を示す。

【０２０４】 表５．ｐＨ４．０でのＥＦＬＩＶＫＳ−ＳＴＫＳＩＰＰＱＳ−ＥＦＬＩＶＫＳに
関する¹Ｈ化学シフト値の編集物

【表９】

【０２０５】 ｐＨ４．５で、異なる二次構造が認められ、これはｐＨ８．５まで安定に保持
された。ｐＨ４．５ないし７．５でのＣＤスペクトルは２０２ｎｍでかなり減少
したバンドを有しており、このことはランダムコイルの消失を示唆する。それら
はまた、約２１０ないし２１５ｎｍでわずかに陽性のバンドおよび２２８ないし
２３０ｎｍ付近で陰性のバンドを有しており、このことはβターンの存在[Brahm
s and Brahams, J. Mol. Biol. 138:149-178(1980)] を示唆する。ｐＨ５．０で
この構築体は置換の遅い２、３個のプロトンを有しているので（表４）、ペプチ
ドはこのｐＨで折りたたまれていない（すなわち三次構造を有していない）可能
性があるが、二次構造はいくつかのβターンおよびｐＨ３．５よりもかなり少な
いランダムコイルしか含んでいない。あるいは、折りたたまれていくつかの三次
構造を有する場合には、主鎖は十分に可動性があり、その結果アミドプロトンは
長い時間溶媒から隔離されることがない。２２５ｎｍでＣＤスペクトルを観察す
れば、ｐＨ７．５で存在する構造は３９．６±１℃のＴｍを有している（データ
は示されていない）。

【０２０６】 ＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳ ＣＤにより調べた第２の構築体はＣｉ２ｂ１８マー挿入部分、ＥＦＬＩＶＫＳ
−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳを含んでいた。この
ペプチドのｐＨ依存性のＣＤスペクトルを測定した（データは示されていない）
。前記で調べた第１のペプチドとは違って、ＣＤスペクトルはｐＨ依存的ではな
く、多量のランダムコイルは有してないと考えられた。２１０ｎｍ付近での強い
極大および２２５ないし２３０ｎｍでの強い極小はターンを調べたすべてのｐＨ
値でのかなりの量のβターン構造と一致する[Brahms and Brahms, J. Mol. Biol
. 138:149-178(1980)]。約２００ｎｍで見られるより小さな極小は少ないパーセ
ントのランダムコイル、またはII型βターンの存在[Perczel et al., Int. J. P
eptide Protein Res. 41:223-236(1993)]と一致する。２２５ｎｍでのシグナル を用いて、３９．８５±１．６℃のＴｍを有する温度でペプチドを溶解できる。

【０２０７】 Ｎ末端ＭＧ−およびＣ末端−ＧＰＰを有する構築体 生細胞におけるペプチド発現のために、いくつかのペプチド構築体のＮ末端に
ＭＧ−を加え、Ｃ末端に−ＧＰＰを加えて細胞性カルボキシペプチダーゼによる
タンパク質分解を阻害した[Vanhoof et al., FAXEB J 9:736-44(1995)]。次いで
、ｐH７．５でこれらのペプチドの変種のCDスペクトルを比較した（データは示 されていない）。ＭＧＥＦＬＩＶＫＳ−Ｃｉ２ｂ挿入部分−ＥＦＬＩＶＫＳＧＰ
ＰのCDスペクトルのｐH依存性実験を実施し（データは示されていない）、これ はＣＤスペクトルにおいて付加した５個の残基がＥＦＬＩＶＫＳ−Ｃｉ２ｂ挿入
部分−ＥＦＬＩＶＫＳと比べて重大な変化を引き起こすということを示唆する。
２０８ｎｍでの陽性バンドはもはや明瞭ではなく、また２００ｎｍでの陰性バン
ドは消失した。２２５ｎｍ付近の主要な極小（いくつかのβターン構造に特有の
）は保持されている。従って、これらの５個の残基の付加は折りたたみ構造では
なく明確なコンホメーション変化引き起こすと考えられる。

【０２０８】 その他の挿入配列の付加はむしろ異なるＣＤスペクトルをもたらした。細胞内
で発現されたペプチドをウェスタンブロットを用いて検出できるよう設計された
グリシンスペーサーを有するフラッグエピトープタグ、−Ｇ₄ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｇ₄−からなる挿入部分は約２０２ｎｍでの極小と約２２０ｎｍでの小さい極大 を含むＣＤスペクトルをもたらした（データは示されていない）。このスペクト
ルのＥＦＬＩＶＫＳ−ＳＴＫＳＩＰＰＱＳ−ＥＦＬＩＶＫＳのものに対する類似
性に基づき、このペプチドはｐＨ３．５ないし８．５の間では主にランダムコイ
ルであると考えられる。この構築体は置換の遅いプロトンを有しておらず、折り
たたまれていない構造と一致する。グリシンスペーサーを有するインフルエンザ
血球凝集素エピトープタグ、−Ｇ₄ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬＧ₃−からなる挿入部
分は２０５ないし２０７ｎｍでの極小および約２２０ｎｍでの第２の小さい極小
を有するＣＤスペクトルを示す（データは示されていない）。これは幾分か二次
構造の異なる組成による可能性があり、いくつかのαへリックス（２０５ないし
２０７ｎｍでの極小により）ならびにランダムコイルまたはβターンを含み得る
。また、この構築体は置換の遅いプロトンを有さなかったので(表４）、ＣＤス ペクトルは二次構造の存在のみを反映し得る。

【０２０９】 ＥＦＬＩＶＫＳ配列へのその他の付加 ＥＦＬＩＶＫＳ配列の変異のＣｉ２ｂペプチド挿入部分のＣＤスペクトルに対
する作用を測定した（データは示されていない）。ペプチドＥＥＦＬＩＶＫＫＳ
−Ｃｉ２ｂ挿入部分−ＥＥＦＬＩＶＫＫＳは、それが置換の遅い２３個のプロト
ンと８個の中程度に入れ替わるプロトンを有しており(表４）、従って三次構造 を有するので、ならびにこの二量体形成剤がＥＦＬＩＶＫＳよりも幾分か高い自
己親和性を有する可能性があるので特に注目される。それからは、２０２ｎｍで
の極小が消失し、２１０ｎｍでの極大（対照ペプチド）が２０７ｎｍ近くにシフ
トしているという点を除き対照ペプチドのものと同様のＣＤスペクトルが得られ
る。従って、このペプチドはβターン構造と対照ペプチドよりも少ないランダム
コイルを有していると考えられる。

【０２１０】 構造体の可溶性を高めるために、Ｎ末端にグリシンスペーサーとともにリシン
を付加した。構築体Ｋ₆Ｇ₄−ＥＦＬＩＶＫＳ−Ｃｉ２ｂ挿入部分−ＥＦＬＩＶＫ
Ｓに関しては、対照ペプチドと非常に異なるＣＤスペクトルが得られ、約２２０
ｎｍに広い極小を有していた（データは示されていない）。このスペクトルは主
な二次構造のいずれにも特有ではないと考えられたが、βシートおよびβターン
（５８％）、αへリックス（１４％）および残りのランダムコイルの混合物に脱
回旋され得る。この構造は多くて５個の置換の遅いプロトンを有するので（表４
）、Ｎ末端に付加された付加残基は対照ペプチドの三次構造を不安定化し、他方
、異なる二次構造を作り出したものと考えられる。

【０２１１】 ＥＦＬＩＶＫＳ配列における変異 二量体形成配列の３つの電荷改変をｐＨ７．０で試験した。あるペプチドでは
、１個のｌｙｓおよびｇｌｕを二量体形成剤間で入れ替え、ＫＦＬＩＶＫＳ−Ｃ
ｉ２ｂ挿入部分−ＥＦＬＩＶＥＳを得た。第２のペプチドでは、両二量体形成剤
のグルタミンをｌｙｓに変更してＫＦＬＩＶＫＳ−Ｃｉ２ｂ挿入部分−ＫＦＬＩ
ＶＫＳを得た。第３のペプチドでは、両二量体形成剤のｌｙｓをｇｌｕに変更し
てＥＦＬＩＶＥＳ−Ｃｉ２ｂ挿入部分−ＥＦＬＩＶＥＳを得た。各ペプチドはＥ
ＦＬＩＶＫＳ−Ｃｉ２ｂ挿入部分−ＥＦＬＩＶＫＳである対照ペプチドのものに
類似するＣＤスペクトルを有していた（データは示されていない）。第２の変更
セットでは、二量体形成剤の疎水性が変化した。まず、両ＥＦＬＩＶＫＳ配列中
のＦ２およびＩ４をリシンまたはセリンに変更しＣｉ２ｂ挿入部分の両末端がＥ
ＫＬＫＶＫＳまたはＥＳＬＳＶＫＳの二量体形成剤配列を得た。これはＣＤスペ
クトルに大きな変化をもたらし、２０２ないし２０５ｎｍでの大きな陰性のバン
ドが出現した。このことはランダムコイル構造の相当な増加または変性（データ
は示されていない）を示唆した。

【０２１２】 第２に、両二量体形成剤において１４のみをリシンに変更した。これもまたＣ
Ｄスペクトルを同様に変化させた（データは示されていない）。この構築体は多
くて１ないし２個の置換の遅いプロトンを有していたが、これはＥＦＬＩＶＫＳ
配列の疎水性コアにおけるこの単一の変化がペプチド構築体全体の構造を崩壊さ
せるのに十分であるということを示唆した。

【０２１３】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> Rigel Pharmaceuticals, Inc. <120> PEPTIDES CAUSING FORMATION OF COMPACT STRUCTURES <130> FP-66103-1/DJB/RMS/SJR <140> PCT/US/99/07374 <141> 1999-04-02 <150> 60/080,444 <151> 1998-04-02 <160> 150 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> coelenterate Hydra <400> 1 Glu Pro Pro Gly Gly Ser Lys Val Ile Leu Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> coelenterate Hydra <400> 2 Ser Lys Val Ile Leu Phe 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> coelenterate Hydra <400> 3 Val Ile Leu Phe 1 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> coelenterate Hydra <400> 4 Glu Pro Pro Gly Gly Ser Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 5 Phe Leu Ile Val Lys 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 6 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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<211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 14 Ser Lys Val Ile Leu Phe Glu 1 5 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 15 Cys Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser 1 5 10 15 Phe Cys <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 16 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 20 25 30 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (1)..(4) <223> X can be A, V, I, L, W, F, M, and Y. <220> <221> SITE <222> (5) <223> X can be K, R, D, or E. <400> 17 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 18 Phe Leu Ile Val Lys 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (1) <223> X can be D, E, K, or R. <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 19 Xaa Phe Leu Ile Val Lys 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 20 Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (1) <223> x can be Z, E, D, or R. <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 21 Xaa Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 22 Lys Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 23 Glu Glu Phe Leu Ile Val Lys Lys Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 24 Val Ser Ile Lys Phe Glu Leu 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 25 Ala Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 26 Glu Ala Leu Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 27 Glu Phe Ala Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 28 Glu Phe Leu Ala Val Lys Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 29 Glu Phe Leu Ile Ala Lys Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 30 Glu Phe Leu Ile Val Ala Ser 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT 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<400> 37 Leu Lys Ser Ile Val Glu Phe 1 5 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 38 Pro Pro Gly Gly 1 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 39 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 40 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (8)..(10) <223> x can be any amino acid. <400> 41 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Xaa Xaa Xaa Glu Phe Leu Ile Val Lys 1 5 10 15 Ser <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (7)..(9) <223> x can be any amino acid. <400> 42 Lys Val Leu Ile Lys Ser Xaa Xaa Xaa Glu Phe Leu Ile Val Glu Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (8)..(10) <223> x can be any amino acid. <400> 43 Val Ser Ile Lys Phe Glu Leu Xaa Xaa Xaa Val Ser Ile Lys Phe Glu 1 5 10 15 Leu <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (6)..(8) <223> x can be any amino acid. <400> 44 Leu Ile Val Lys Ser Xaa Xaa Xaa Leu Ile Val Lys Ser 1 5 10 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (7)..(9) <223> x can be any amino acid. <400> 45 Glu Phe Leu Ile Val Lys Xaa Xaa Xaa Glu Phe Leu Ile Val Lys 1 5 10 15 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (8)..(10) <223> x can be any amino acid. <400> 46 Phe Glu Ser Ile Lys Val Leu Xaa Xaa Xaa Phe Glu Ser Ile Lys Val 1 5 10 15 Leu <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (8)..(10) <223> x can be any amino acid. <400> 47 Leu Lys Ser Ile Val Glu Phe Xaa Xaa Xaa Leu Lys Ser Ile Val Glu 1 5 10 15 Phe <210> 48 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 48 Glu Phe Leu Ile Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg 1 5 10 15 Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Phe Lys Ser 20 25 30 <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Barley <400> 49 Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser 1 5 10 15 Phe Val <210> 50 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 50 Glu Phe Leu Ile Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg 1 5 10 15 Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Ser Lys Val Ile Leu Phe Glu 20 25 30 <210> 51 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 51 Ser Lys Val Ile Leu Phe Glu Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 20 25 30 <210> 52 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 52 Ser Lys Val Ile Leu Phe Glu Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Ser Lys Val Ile Leu Phe Glu 20 25 30 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 53 Lys Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Lys Phe Leu Ile Val Lys Ser 20 25 30 <210> 54 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 54 Lys Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Met Glu Tyr Arg 1 5 10 15 Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val Glu Ser 20 25 30 <210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 55 Glu Phe Leu Ile Val Glu Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val Glu Ser 20 25 30 <210> 56 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 56 Glu Lys Leu Ile Lys Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu 1 5 10 15 Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Lys Leu Lys Val Lys 20 25 30 Ser <210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 57 Glu Ser Leu Ser Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Ser Leu Ser Val Lys Ser 20 25 30 <210> 58 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 58 Glu Phe Leu Ile Lys Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu 1 5 10 15 Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Lys Val 20 25 30 Lys Ser <210> 59 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 59 Glu Glu Phe Leu Ile Val Lys Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met 1 5 10 15 Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Glu Phe Leu Ile 20 25 30 Val Lys Lys Ser 35 <210> 60 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 60 Met Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met 1 5 10 15 Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val 20 25 30 Lys Ser Gly Pro Pro 35 <210> 61 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 61 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys 1 5 10 15 Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg 20 25 30 Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 35 40 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 62 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 63 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 63 Lys Lys Lys Gly Ser Gly Ser Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly 1 5 10 15 Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val 20 25 30 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 35 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 64 Lys Lys Lys Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 65 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Ser Thr Lys Ser Ile Pro Pro Gln Ser 1 5 10 15 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 20 <210> 66 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 66 Met Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Lys 1 5 10 15 Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 20 25 30 Gly Pro Pro 35 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 67 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 68 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 68 Met Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Tyr 1 5 10 15 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Glu Phe Leu Ile 20 25 30 Val Lys Ser Gly Pro Pro 35 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 69 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu 1 5 10 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> monkey virus <400> 70 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ala Arg Arg Arg Arg Pro 1 5 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Glu Glu Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu 1 5 10 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu 1 5 <210> 74 <211> 20 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 74 Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Leu Asp 20 <210> 75 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Glu Ser Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Pro 20 25 30 <210> 76 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Ser Ser Phe Gly Tyr Arg Thr Leu Thr Val Ala Leu Phe Thr Leu 1 5 10 15 Ile Cys Cys Pro Gly 20 <210> 77 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Thr Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr 1 5 10 15 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 20 25 30 Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Tyr 35 40 45 His Ser Arg 50 <210> 78 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Val Ile Ile Val Thr Val Val Ser Val Leu Leu Ser Leu Gly Val 1 5 10 15 Thr Ser Val Leu Leu Cys Phe Ile Phe Gly Gln His Leu Arg Gln Gln 20 25 30 Arg <210> 79 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser 1 5 10 15 Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr 20 25 30 Met Gly Leu Leu Thr 35 <210> 80 <211> 14 <212> PRT <213> Chicken virus <400> 80 Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gln Arg 1 5 10 <210> 81 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Leu Leu Gln Arg Leu Phe Ser Arg Gln Asp Cys Cys Gly Asn Cys Ser 1 5 10 15 Asp Ser Glu Glu Glu Leu Pro Thr Arg Leu 20 25 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: from rhodopsin <400> 82 Glu Gln Phe Arg Asn Cys Met Leu Thr Ser Leu Cys Cys Gly Lys Asn 1 5 10 15 Pro Leu Gly Asp 20 <210> 83 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Leu Asn Pro Pro Asp Glu Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 84 <211> 36 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: lysosomal membrane sequences from Lamp-1 <400> 84 Met Leu Ile Pro Ile Ala Gly Arg Arg Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu 1 5 10 15 Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Ile Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly 20 25 30 Tyr Gln Thr Ile 35 <210> 85 <211> 35 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: lysosomal membrane sequences from Lamp-2 <400> 85 Leu Val Pro Ile Ala Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Val Leu Ile Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Gly Leu Lys His His His Ala Gly Tyr 20 25 30 Glu Gln Phe 35 <210> 86 <211> 27 <212> PRT <213> yeast <400> 86 Met Leu Arg Thr Ser Ser Leu Phe Thr Arg Arg Val Gln Pro Ser Leu 1 5 10 15 Phe Ser Arg Asn Ile Leu Arg Leu Gln Ser Thr 20 25 <210> 87 <211> 25 <212> PRT <213> yeast <400> 87 Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg 1 5 10 15 Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu 20 25 <210> 88 <211> 64 <212> PRT <213> yeast <400> 88 Met Phe Ser Met Leu Ser Lys Arg Trp Ala Gln Arg Thr Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ser Phe Tyr Ser Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ser Lys Ser Gly Lys Leu 20 25 30 Thr Gln Lys Leu Val Thr Ala Gly Val Ala Ala Ala Gly Ile Thr Ala 35 40 45 Ser Thr Leu Leu Tyr Ala Asp Ser Leu Thr Ala Glu Ala Met Thr Ala 50 55 60 <210> 89 <211> 41 <212> PRT <213> yeast <400> 89 Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Leu Ala Thr Val 1 5 10 15 Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Gln Leu 20 25 30 Gln Gln Gln Gln Gln Arg Gly Lys Lys 35 40 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: sequence derived from calreticulin <400> 90 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> adenovirus <400> 91 Leu Tyr Leu Ser Arg Arg Ser Phe Ile Asp Glu Lys Lys Met Pro 1 5 10 15 <210> 92 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Leu Asn Pro Pro Asp Glu Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: geranylgeranylation sequences <400> 93 Leu Thr Glu Pro Thr Gln Pro Thr Arg Asn Gln Cys Cys Ser Asn 1 5 10 15 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: destruction sequence <400> 94 Arg Thr Ala Leu Gly Asp Ile Gly Asn 1 5 <210> 95 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser 20 <210> 96 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr 20 25 <210> 97 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn 20 25 <210> 98 <211> 18 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 98 Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Tyr Ala Phe Val Ala Gly Asp 1 5 10 15 Gln Ile <210> 99 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Glu Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly 20 25 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (3)..(6) <223> x can be any amino acid <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 100 Met Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Pro 1 5 10 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (3)..(6) <223> x can be any amino acid <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 101 Met Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Pro 1 5 <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (4)..(7) <223> x can be any amino acid <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 102 Met Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (4)..(7) <223> x can be any amino acid <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 103 Met Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Pro 1 5 10 <210> 104 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> SITE <222> (18)..(20) <223> x can be any amino acid <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 104 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys 1 5 10 15 Ser Xaa Xaa Xaa Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 20 25 <210> 105 <211> 4 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: promoter sequence <400> 105 caat 4 <210> 106 <211> 4 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: promoter sequence <400> 106 tata 4 <210> 107 <211> 6 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: mRNA polyadenylation sequence <400> 107 aataaa 6 <210> 108 <211> 7 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> misc_difference <222> (1)..(3) <223> n can be any amino acid. <220> <223> Description of Unknown Organism: Kozak consensus sequence. <400> 108 nnnatgg 7 <210> 109 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 109 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Ser Thr Lys Ser Ile Pro Pro Gln Ser 1 5 10 15 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 20 <210> 110 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 110 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Ser Lys Val Ile Leu Phe Glu 20 25 30 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 111 Cys Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 <210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 112 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 113 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe 1 5 <210> 114 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 114 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 10 15 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 115 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Cys 1 5 <210> 116 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 116 Glu Phe Leu Ile Val 1 5 <210> 117 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 117 Val Glu Phe Leu Ile 1 5 <210> 118 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 118 Cys Gly Arg Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser 1 5 10 15 Phe <210> 119 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 119 Cys Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr 1 5 10 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 120 Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr 1 5 <210> 121 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 121 Arg Ser Phe Val Glu Phe 1 5 <210> 122 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 122 Cys Gly Thr Ile Val Thr Met 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 123 Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met 1 5 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 124 Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Cys 1 5 10 <210> 125 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 125 Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe 1 5 10 <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 126 Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Cys 1 5 10 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 127 Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr 1 5 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 128 Thr Ile Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr 1 5 10 <210> 129 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 129 Lys Lys Lys Gly Ser Gly Ser Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly 1 5 10 15 Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val 20 25 30 Gly Ser Gly Ser Lys Lys Lys 35 <210> 130 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 130 Met Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Tyr 1 5 10 15 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Gly Glu Phe Leu Ile Val 20 25 30 Lys Ser Gly Pro Pro 35 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 131 Ser Thr Lys Ser Ile Pro Pro Gln Ser 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: protease inhibitor <400> 132 Cys Thr Lys Ser Ile Pro Pro Gln Cys 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 133 Met Gly Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 134 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Gly Pro Pro 1 5 10 <210> 135 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 135 Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 136 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 136 Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Gly <210> 137 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> SITE <222> (1) <223> x can be E, D, K, or R. <220> <221> SITE <222> (6) <223> x can be E, D, K, or R. <400> 137 Xaa Phe Leu Ile Val Xaa 1 5 <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 138 Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe 1 5 10 <210> 139 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 139 Cys Gly Thr Ile Val Thr 1 5 <210> 140 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 140 Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr Arg 1 5 <210> 141 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 141 Thr Met Glu Tyr Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Cys 1 5 10 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 142 Cys Gly Thr Ile Val 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 143 Ser Val Gly Thr Ile 1 5 <210> 144 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic <400> 144 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr Arg Ser Phe Val Glu Phe 20 25 <210> 145 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 145 Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser Val Gly Thr Ile Val Thr Met Glu Tyr 1 5 10 15 Arg Ile Asp Arg Thr 20 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 146 Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val 1 5 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 147 Phe Val Glu Phe Leu Ile Val 1 5 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 148 Ser Phe Val Glu Phe 1 5 <210> 149 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 149 Ser Phe Val Glu Phe Leu Ile Val Lys Ser 1 5 10 <210> 150 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 150 Ser Val Gly Thr Ile Thr Tyr Met 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆおよび図１Ｇ】 ＤＰ
タンパク質構造のいくつかの具体例の模式図を示す。図１Ａ ２つの二量体化ペ
プチド（ＤＰ）が直鎖上タンパク質（Ｐ）と融合してＤＰ−タンパク質構造とな
っており（ここではＤＰ−タンパク質−ＤＰと示す）、これはＤＰの二量体化に
より折りたたまれてコンパクトな構造となる。図１Ｂ リンカー（Ｌ）を含んで
なるＤＰ−タンパク質構造。図１Ｃ タグ配列（Ｔａｇ）を含んでなるＤＰ−タ
ンパク質構造。Ｔａｇ₁およびＴａｇ₂は１つのＤＰ−タンパク質に融合した２つ
の異なるタグであり、これはＤＰ−タンパク質に対し多くの組合せの融合タグが
あり得ることを示している。図１Ｄ ＤＰとＰおよび２つの異なるタグの間にリ
ンカーを持つＤＰ−タンパク質。図１Ｅ ＰのＮ末端に付加された二量体化ペプ
チド（ＤＰ₁）がＰのＣ末端に付加された二量体化ペプチド（ＤＰ₂）とは異なる
ＤＰ−タンパク質。図１Ｆ Ｎ末端にＭＧ、およびＣ末端にＧＧＰＰなどの安定
配列を含んでなるＤＰ−タンパク質。図１Ｇ 複数のタンパク質Ｐ₁、Ｐ₂および
Ｐ₃が二量体化ペプチドに融合しているＤＰ−タンパク質。

【図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃ】 複合ＤＰ−タンパク質の模式図を示す。
図２Ａ 共有結合したダブルループ構造。ＤＰ_hyd：ＤＰ_hydおよびＤＰ_Lys：Ｄ Ｐ_Gluの特異的二量体化によって２つの拘束ペプチドは１つのＤＰ−タンパク質 内に形成され、ダブルループ構造が予想される。この２つのループ構造は可変グ
リシンリンカーを介して共有結合している。図２Ｂ 非共有結合ダブルループ構
造。一方はＰ₁を含み、他方はＰ₂を含む２つのＤＰ−タンパク質が作られ、各々
ＤＰ_hyd：ＤＰ_hydの二量体化によってコンパクトな構造を生じる。組み合わせた
場合にＤＰ_Lys：ＤＰ_Gluの特異的二量体化により、ダブルループ構造が得られる
２つの拘束構造の会合。２つの二量体化ペプチドＤＰ_hydとＤＰ_Lys、またはＤＰ _hyd とＤＰ_Gluは可変グリシンリンカーを介して結合している。図２Ｃ ＤＰ_hyd ：ＤＰ_hydおよびＤＰ_Lys：ＤＰ_Gluの特異的二量体化によってタンパク質Ｐ₁およ
びＰ₂が強制的にコンパクトな構造とされている非共有結合ダブルループ構造。 会合が異なるＤＰ−タンパク質に限られているが、２つのＤＰ−タンパク質を組
み合わせた場合に互いに会合する二量体化ペプチド。図２Ａ−Ｃ ＤＰ_hydはほ とんどの場合疎水性のアミノ酸を含んでなる二量体化ペプチドであり、ＤＰ_Lys はほとんどの場合リジンを含んでなる二量体化ペプチドであり、ＤＰ_Gluはほと んどの場合グルタミン酸を含んでなる二量体化ペプチドであり、Ｌ_Pはプロリン を含んでなるリンカーであり、Ｌ_Gはグリシンを含んでなるリンカーであり、Ｐ₁ およびＰ₂はタンパク質であり、これは同一であってもなくともよい。

【図３Ａおよび図３Ｂ】 新規なペプチドは注目される二量体を形成するこ
とを示す。図３Ａ ＳＫＶＩＬＦＥ−アミドとＥＦＬＩＶＫＳ−アミドの二量体
化。図３Ｂ 約２５％アセトニトリル、ｐＨ〜２．５にてのＣ１８逆相カラムか
ら溶出したＥＦＬＩＶＫＳ−アミドの二量体化。

【図４】 エレクトロスプレーイオン化後に二量体化可能な短い配列に対す
るＥＦＬＩＶＫＳ−アミドの全単結合ｆｍｏｃ合成から得られた合成粗生成物の
ＬＣ／ＭＳ測定。

【図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃ】 タンパク質分解耐性構造を示す。図５Ａ
１８量体試験タンパク質配列ＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣのエラス
ターゼ消化産物。図５Ｂ 下線の２つのシステイン間にジスルフィド結合を有す
る１８量体試験タンパク質配列ＣＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＣのエラス
ターゼ消化産物。図５Ｃ ＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳ
ＦＶ−ＥＦＬＩＶＫＳのエラスターゼ消化産物。図５Ａ〜Ｃ タンパク質分解断
片は逆相ＨＰＬＣと組質量スペクトル検出を併用してモニターし、同定する。

【図６】 ＥＦＬＩＶＫＳ−ＶＧＴＩＶＴＭＥＹＲＩＤＲＴＲＳＦＶ−ＥＦ
ＬＩＶＫＳの４５最低エネルギー構造のオーバーレイ（ペプチド主鎖のみを示す
）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA07 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QA20 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 DA20 4B065 AA26X AB01 BA02 CA24 CA44 CA60 4H045 AA10 AA30 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 EA50 FA34 FA74

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ８個以下のアミノ酸長である配列ＮＨ₂−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ ₄ −Ｘ₅−ＣＯＯＨ（ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およびＸ₄はアミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ
   、Ｗ、Ｆ、ＭおよびＹからなる群より選択され、ＹおよびＸ₅はＫ、Ｒ、Ｄおよ びＥからなる群より選択される）を含む第一の二量体化ペプチドを少なくとも含
   んでなる組成物。
2. 【請求項２】 ８個以下のアミノ酸長である配列ＮＨ₂−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ ₄ −Ｘ₅−ＣＯＯＨ（ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およびＸ₄はアミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ
   、Ｗ、Ｆ、ＭおよびＹからなる群より選択され、Ｘ₅はＫ、Ｒ、ＤおよびＥから なる群より選択される）を含む第二の二量体化ペプチドをさらに含んでなる、請
   求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 少なくとも該第一の二量体化ペプチドが配列ＮＨ₂−ＦＬＩ ＶＫ−ＣＯＯＨを含んでなる、請求項１または２に記載の組成物。
4. 【請求項４】 少なくとも該第一の二量体化ペプチドが配列ＮＨ₂−Ｘ₀ＦＬ
   ＩＶＸ₅−ＣＯＯＨ（ここで、Ｘ₀およびＸ₅はアミノ酸Ｅ、Ｄ、ＫおよびＲから なる群より選択される）を含んでなる、請求項１、２または３に記載の組成物。
5. 【請求項５】 第一のタンパク質をさらに含んでなり、少なくとも該第一の
   二量体化ペプチドが第一の融合タンパク質を形成する該第一のタンパク質と共有
   結合している、請求項１、２、３または４に記載の組成物。
6. 【請求項６】 該融合タンパク質と共有結合した第二の二量体化ペプチドを
   さらに含んでなり、該第二の二量体化ペプチドが、８個以下のアミノ酸長である
   配列ＮＨ₂−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−ＣＯＯＨ（ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およ びＸ₄はアミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｗ、Ｆ、ＭおよびＹからなる群より選択され 、Ｘ₅はＫ、Ｒ、ＤおよびＥからなる群より選択される）を含んでなる、請求項 ５に記載の組成物。
7. 【請求項７】 該第一の二量体化ペプチドが該第一のタンパク質のＮ末端と
   結合し、かつ、該第二の二量体化ペプチドが該第一のタンパク質のＣ末端に結合
   している、請求項６に記載の組成物。
8. 【請求項８】 少なくとも１つの該第一の二量体化ペプチドまたは該第二の
   二量体化ペプチドが該タンパク質の内部の位置と共有結合している、請求項６に
   記載の組成物。
9. 【請求項９】 少なくとも１つの該第一の二量体化ペプチドまたは該第二の
   二量体化ペプチドがリンカーを介して該第一のタンパク質と共有結合している、
   請求項５、６、７または８に記載の組成物。
10. 【請求項１０】 融合パートナーをさらに含んでなる、請求項１、２、３、
    ４、５、６、７、８または９に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 各々請求項５、６、７、８、９または１０に記載の組成物
    を含む複数のメンバーを含んでなり、該メンバーの各々が異なる第一のタンパク
    質を含んでなる、分子ライブラリー。
12. 【請求項１２】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または
    １１の組成物をコードする組換え核酸。
13. 【請求項１３】 請求項１２の組換え核酸を含んでなる発現ベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１２の組換え核酸を含んでなる宿主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または
    １１の組成物を製造する方法であって、 ａ）請求項１４記載の細胞を準備すること；および ｂ）該細胞をコンディショニングし、それによって該組成物を発現させること を含んでなる方法。
16. 【請求項１６】 細胞の表現型を変化させ得る組成物をスクリーニングする
    方法であって、 ａ）請求項１２に記載の組換え核酸を複数の細胞へ導入すること； ｂ）該複数の細胞をコンディショニングし、それによって該核酸によってコード
    されるタンパク質を発現させること；および ｃ）変化した表現型を示す細胞について該複数の細胞をスクリーニングすること
    を含んでなる方法。
17. 【請求項１７】 変化した表現型を示す該細胞を単離することをさらに含ん
    でなる、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 該細胞から核酸を単離することをさらに含んでなる、請求
    項１６に記載の方法。
19. 【請求項１９】 標的分子を単離することをさらに含んでなる、請求項１６
    に記載の方法。