DE60020366T2

DE60020366T2 - Strukturiertes peptidgerüst zur ausstellung von drehung-bibliotheken auf phage

Info

Publication number: DE60020366T2
Application number: DE60020366T
Authority: DE
Inventors: G. Andrea CHOCHRAN; J. Nicholas SKELTON; A. Melissa STAROVASNIK
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-06-14
Filing date: 2000-06-13
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-06-14
Also published as: CA2376232A1; ES2242620T3; AU782755B2; US7235626B1; IL146798A0; EP1187914B1; AU5611900A; AU782755C; US20060110777A1; JP2003502304A; DE60020366D1; ATE296350T1; WO2000077194A1; EP1187914A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Untersuchungen bezüglich der Beziehung zwischen Struktur und Aktivität von Proteinen und insbesondere kombinatorische Bibliotheken von konformationseingeschränkten Peptiden und Verfahren zur Bildung und zum Screenen solcher Bibliotheken für biologische und pharmazeutische Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Untersuchungen der Beziehung zwischen Struktur und Aktivität (Structure-Activity Relationship, SAR) liefern wertvolle Einblicke, die das Verstehen intermolekularer Wechselwirkungen zwischen einem Protein oder einem Peptid und anderen biologisch aktiven Molekülen erleichtern. In ihrer natürlichen Umgebung nehmen Peptide oder Proteine einmalige, konformationseingeschränkte Strukturen an, um ihre Bindungspartner zu erkennen und sich an sie zu binden und um molekulare Komplexe mit diesen zu bilden, was wiederum besondere Aktivitäten hervorruft. Beispiele für Protein-Protein-Bindungspartner umfassen Enzym-Substrat, Ligand-Rezeptor und Antigen-Antikörper. Die Bestimmung der Konformation eines Peptids in seiner nativen Form ist daher essentiell, um seine In-vivo-Aktivität nachzuahmen und seine Analoga, die als Arzneimittel nützlich sein können, rational zu entwerfen.
Die meisten kleinen Peptide sind äußerst flexibel und nehmen nicht typischerweise einmalige Lösungskonformationen an: Insbesondere behalten sie nicht die Struktur bei, die dieselbe Sequenz im nativen Protein annimmt. Diese fehlende fixierte Struktur reduziert die Affinität, die das Peptid zu einem Target (aus entropischen Gründen) haben kann, und macht das Bestimmen der aktiven Konformation des Moleküls äußerst schwierig. Daher wurden zahlreiche Verfahren beschrieben, wie Einschränkungen in Peptide eingeführt werden können (wie beispielsweise D-Aminosäuren, Disulfid oder andere Vernetzungen) oder wie Teile des Peptids mit starreren Nicht-Peptidgerüsten ersetzt werden können. Tatsächlich wurden solche Peptidomimetika umfassend eingesetzt, um Struktur-Aktivitäts-Untersuchungen auf systematische Weise durchzuführen, um Informationen über die spezifischen Aminosäurereste oder funktionellen Gruppen in einem Peptid, die an eine bestimmte Konformation angepasst werden können und für biologische Aktivitäten wichtig sind, bereitzustellen.
Mehrere eingeschränkte Proteingerüste, die in der Lage sind, ein Protein von Interesse als eine konformationseingeschränkte Domäne darzustellen, wurden identifiziert, einschließlich Minikörperstrukturen (Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236, 649–659 (1994)), Schleifen auf β-Faltblattkehren, superspiralisierter α-Helix-Stammstrukturen (Myszka & Chaiken, Biochem. 33, 2363–2372 (1994)), Zinkfinger-Domänen, Cystein-gebundener (Disulfid-) Strukturen, Transglutaminase-gebundener Strukturen, zyklischer Peptide, helikaler Tonnen oder Bündel, Leucin-Zippermotive (Martin et al., EMBO J 13, 5303–5309 (1994)) usw. Von den identifizierten Proteingerüsten wurden β-Kehren als eine wichtige Stelle für molekulare Erkennung in zahlreiche biologisch aktive Peptide eingebunden. Smith & Pease, CRC Crit. Rev. Biochem. 8, 315–300 (1980). Folglich sind Peptide, die konformationseingeschränkte β-Kehren aufweisen, besonders wünschenswert. Die große Mehrheit der identifizierten Peptide mit β-Kehren stellen Cyclopeptide dar, die durch das Zyklisieren eines Peptids hergestellt wurden, das einer Sequenz im natürlichen Substrat ähnlich ist. Milner-White, Trends Pharmacol. Sci. 10, 70–74 (1989). Diese Cyclopeptide können jedoch immer noch bedeutende Flexibilität beibehalten. Aus diesem Grund wurde in zahlreichen Studien versucht, starre Nichtpeptid-Verbindungen einzuführen, die die β-Kehre nachahmen. Peptide mit solch einem Nichtpeptid-β-Kehren-Mimetikum liefern nützliche Leitstrukturen für die Entdeckung von Arzneimitteln. Ball & Alewood, J. Mol. Recog. 3, 55–64 (1990); WO 94/03494 (Kahn).
Einer der revolutionären Fortschritte im Bereich der Arzneimittelforschung ist die Entwicklung von kombinatorischen Bibliotheken. Kombinatorische Bibliotheken sind eine Sammlung verschiedener Moleküle, wie beispielsweise Peptide, die synthetisch oder rekombinant hergestellt werden können. Kombinatorische Peptidbibliotheken enthalten Peptide, in denen alle Aminosäuren nach dem Zufallsprinzip in bestimmte oder alle Positionen der Peptidsequenz eingebunden wurden. Solche Bibliotheken wurden hergestellt und auf verschiedene Weisen verwendet, um auf Peptidsequenzen zu screenen, die sich wirksam an Targetmoleküle binden, und um solche Sequenzen zu identifizieren.
Zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Peptidbibliotheken wurden entwickelt und beschrieben. Beispielsweise können Teile der Peptidbibliothek durch Splitsynthese geschaffen werden, die an einem festen Träger wie beispielsweise Polystyrol oder Polyacrylamidharz durchgeführt wird, wie in Lam et al., Nature 354, 82 (1991), und der PCT-Veröffentlichung WO 92/00091 beschrieben wird. Ein anderes Verfahren, das von Geysen et al., US-Patent Nr. 4.833.092 offenbart wurde, bindet die Synthese von Peptiden auf solch eine methodische und vorbestimmte Weise ein, dass das Anordnen jedes einzelnen Bibliotheksteilpeptids Information bezüglich der synthetischen Struktur dieses Peptids liefert.
Beachtliche Anstrengungen wurden dem Einführen struktureller Einschränkungen in kombinatorische Peptidbibliotheken gewidmet, sodass die Teilpeptide ihre nativen Gegenstücke noch besser darstellen. Houston et al., US-Patent Nr. 5.824.483, beschreiben eine synthetische Peptidbibliothek, die Peptide mit α-Helix-Konformation enthält, die somit in der Lage sind, untereinander superspiralisierte Dimere zu bilden. McBride et al., J. Mol. Biol. 259, 819–827 (1996), beschreiben eine synthetische Bibliothek zyklischer Peptide, die die anti-tryptische Schleifenregion eines identifizierten Proteinase-Inhibitors nachahmen.
Ein komplementäres Verfahren für Peptidbibliotheks-basierte Entdeckung von Leitstrukturen ist die Darbietung von Bibliotheken auf filamentösen Bakteriophagen. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung von Bibliotheken in einer Größe von 10¹⁰–10¹² einmaligen Peptidteilen, die um einige Größenordnungen größer sind als Bibliotheken, die synthetisch hergestellt werden können. Zusätzlich zu großen Bibliotheksgrößen umfassen die Vorteile von Phagendisplay: einfachen Bibliotheksaufbau (Kunkel-Mutagenese), das Kuppeln der Bindungseinheit (dargestelltes Peptid) an einen einmaligen Identifikator (seine DNA-Sequenz), ein Selektionsprotokoll zur Amplifikation seltener Bindungsklone in einem Pool und die hohe Zuverlässigkeit von Biosyn these (im Vergleich zu synthetischen Verfahren). Weiters sind rasche und günstige Selektionsprotokolle zur Identifikation dieser Bibliotheksteile, die sich an ein Target von Interesse binden, erhältlich. Es können jedoch nur natürliche Peptide, die aus L-Aminosäuren bestehen, an Phagen dargestellt werden, wodurch das Problem des Definierens von dreidimensionalen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen schwieriger ist als es beispielsweise für ein eingeschränktes Peptidomimetikum sein könnte, das nicht in der Natur vorkommende Peptide oder Nichtpeptid-Verbindungen enthält. Eine mögliche Lösung für dieses Problem ist, die strukturellen Einschränkungen eines gefalteten Proteins zu verwenden, um kleine variable Peptidsegmente darzustellen. Tatsächlich wurden mehrere kleine, stabile Proteine als Peptiddisplay-Gerüste vorgeschlagen. Nygren & Uhlen, Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 463–469 (1997); Vita et al., Biopolymers 47, 93–100 (1998); Vita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13091–13096 (1999); Smith et al., J. Mol. Biol. 277, 317–332 (1998); Christmann et al., Protein Engng. 12, 797–806 (1999). Leider ist es nicht eindeutig, ob Proteinliganden, die durch diesen Ansatz gewonnen werden, zu Arzneimittel-Leitstrukturen mit kleinen Molekülen transformiert werden können. Epitoptransfer von Proteinen zu kleinen Peptiden oder kleinen Nichtpeptid-Molekülen bleibt ein äußerst schwieriges Problem. Cochran, Chem. Biol. 7, R85–R94 (2000).
Daher mangelt es trotz ausführlicher Studien der Regeln, die Konformationspräferenzen in natürlichen Peptiden zugrunde liegen, und der Existenz von mehreren Peptidbibliothekssystemen an einem grundlegenden Verständnis dieser Eigenschaften, die für strukturelle Stabilität von natürlichen Peptiden erforderlich sind. Insbesondere gab es bisher nur sehr wenig systematische oder quantitative Bewertungen der Wirkung von Restsubstitutionen und von nicht kovalenten Wechselwirkungen auf die Struktur.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Modellsystem zur Bewertung der Beiträge einzelner Reste zur Stabilität eines definierten Peptidgerüst und zur Bewertung einer Reihe von Substitutionen, die in einer kombinatorischen Peptidsequenz vorhanden sind, bereit. Die Peptide der Erfindung werden über Disulfidbrücken zwischen zwei Cysteinen innerhalb der Peptidsequenz zyklisiert. Aminosäuresubstitutionen an verschiedenen definierten Reststellen beeinflussen die Konformation der zyklischen Peptide und deren Energiestabilitäten. Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Screenen auf und Analysieren von zyklischen Peptiden mit einer spezifischen Sekundärstruktur, der β-Kehre, bereit, die den Peptiden weitere strukturelle Einschränkungen auferlegt. Die betreffende Peptidbibliothek, die eine Sammlung von zyklischen Peptiden mit β-Kehren umfasst, kann zum Screenen auf biologisch aktive Kandidatenmoleküle mittels molekularer Bindungstests verwendet werden. Verfahren für solche Screenings werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung können zum Analysieren der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von Peptiden von Interesse verwendet werden, wodurch sehr hilfreiche Informationen für Untersuchungen von molekularen Wechselwirkungen, die in bestimmte biologische Prozesse eingebunden sind, sowie für das rationale Design von therapeutischen Wirkstoffen gewonnen werden können.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt das Design von bhp, einem 10-Aminosäure-Modell-β-Haarnadelpeptid, dar. (A) Übereinander gelagerte Strukturen veranschaulichen das Packen zwischen Disulfiden und Seitenketten der am nächsten zusammenliegenden, nicht Wasserstoffgebundenen Reste; (B) Schematische Darstellung des bhp-Modell-β-Haarnadelpeptids mit den Seitenketten der dargestellten nicht Wasserstoff-gebundenen Reste 1, 3, 8 und 10. X steht für den variablen Rest, der aus 19 von den 20 natürlichen L-Aminosäuren (ausschließlich Cys) ausgewählt sein kann.
2 zeigt die relative Haarnadelstabilität für Substitution X in der bhp-Peptidsequenz. (A) Effektive Cystein-Konzentrationen (C_eff) in Bezug auf Glutathion. Fehlerbalken stehen für ± eine Standardabweichung; (B) Freie Gleichgewichtsenergie-Differenzen in Bezug auf Alaninpeptid.
3 zeigt NMR-Struktur (minimiertes Mittel) von Disulfid-zyklisierten Haarnadel-bhpW. Seitenkette W3 und die zentralen Kehrenreste G5 und N6 sind in Schwarz dargestellt. Seitenkette L8 und das Disulfid sind in Grau dargestellt. Seitenketten für die Wasserstoff-gebundenen Reste (T2, E4, K7, T9) wurden zum besseren Verständnis weggelassen.
4(A–B) zeigt NMR-Analyse von CD4-Peptiden. (A) Überlagerung der Fingerprint-Region der COSY-Spektren für cd1 und cd2. (B) NMR-Strukturensemble für cd2 (20 Modelle; zwei orthogonale Ansichten), überlagert auf CD4-Resten 37–46 aus der Kristallstruktur von gp120-gebundenem CD4 (PDB-Eintritt 1GC1) dargestellt.
5 zeigt Zirkular-Dichroismusspektren von drei Peptidpaaren aus Beispiel 2.
6 zeigt effektive Konzentrations- (C_eff-) Werte für Substitutionen X in den Peptiden aus Beispiel 3. Die Strangsubstitutionen X sind über dem Diagramm gezeigt, und die Hauptreste der Kehren sind rechts angegeben.
7 zeigt minimierte Hauptstrukturen der Tryptophananaloga der Peptiden aus Beispiel 3, überlagert an den Hauptkettenatomen von Resten 1–3 und 8–10 (RMSD von 0,36 und 0,30 Å für 1 bezüglich 2 bzw. 3). Peptid 1 ist in Grau; Peptid 2 ist in Schwarz; und Peptid 3 ist in Weiß. Für ein besseres Verständnis sind Nicht-Prolin-Seitenkettenatome für die vier Kehrenreste nicht dargestellt.
8(A–B) zeigt effektive Konzentrations- (C_eff-) Werte für Peptide mit hydrophoben Paaren in nicht Wasserstoff-gebundenen (NHB-) Strangpositionen, wie in Beispiel 4 beschrieben wird. Werte für Substitutionen, die mit einem Kreuzstrang-Leucin gepaart sind, sind in (A) gezeigt; jene für Tryptophanpaare sind in (B) gezeigt.
9 zeigt ein Hammett-Diagramm, das freie Substitufsonsenergie-Differenzen zwischen den Peptiden aus Beispiel 4 vergleicht.
10 zeigt Doppelmutanten-Analyse der Stabilität von W3Y8 in Bezug auf L3L8.
Ausführungsform(en) der Erfindung
I. Definitionen
Die Bezeichnung "β-Schleife" bezieht sich auf eine Protein-Sekundärstruktur, die aus einer Tetrapeptidsequenz besteht, die die Peptidkette veranlasst, ihre Ausrichtung umzukehren, und die oft eine 4'-zu-1'-Wasserstoffbindung enthält und so einen pseudo-10-gliedrigen Ring bildet. Die am weitesten akzeptierte Klassifikation der verschiedenen Konformationen der β-Kehre ist in Chou & Fasman, J. Mol. Biol. 115, 135–175 (1977), beschrieben, deren Offenbarung durch Verweis hierin ausdrücklich aufgenommen ist. Verschiedene Typen von β-Kehren wurden bereits definiert, einschließlich beispielsweise des Typs I, I', II und II'. Für den Zweck dieser Erfindung wird die Bezeichnung "Umkehr-Kehre" allgemein verwendet, um bekannte Protein-Sekundärstrukturen einschließlich β-Kehren, γ-Kehren, β-Haarnadeln und β-Wülste zu benennen.
"Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" werden hierin synonym verwendet, und solche Bezeichnungen umfassen die gesamte Nachkommenschaft einer Zelle oder Zelllinie. Somit umfassen beispielsweise Bezeichnungen wie "Transformanten" und "transformierte Zellen" die primär vorliegende Zelle sowie Kulturen, die von dieser abgeleitet sind, unabhängig von der Anzahl der Transfers. Es gilt auch zu verstehen, dass die gesamte Nachkommenschaft bezüglich des DNA-Gehalts aufgrund von beabsichtigen oder unbeabsichtigten Mutationen nicht exakt identisch sein kann. Mutierte Nachkommenschaft, die dieselbe Funktion oder biologische Aktivität aufweist, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, sind eingebunden. Sind bestimmte Bezeichnungen beabsichtigt, so wird dies aus dem Kontext eindeutig hervorgehen.
Die Bezeichnungen "kompetente Zellen" und "Elektroporations-kompetente Zellen" benennen Zellen, die sich in einem Kompetenzzustand befinden und in der Lage sind, DNAs aus zahlreichen verschiedenen Quellen aufzunehmen. Der Zustand kann vorübergehend oder permanent sein. Elektroporations-kompetente Zellen sind in der Lage, DNA während der Elektroporation aufzunehmen.
"Kontrollsequenzen" in Bezug auf Expression bezeichnen DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen Codiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosom-Bindungsstelle und möglicherweise andere Sequenzen, von denen bisher nicht viel bekannt ist. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Die Bezeichnung "Hüllprotein" bezieht sich auf ein Protein, von dem zumindest ein Teil an der Oberfläche des Viruspartikels liegt. Aus einer funktionellen Sichtweise ist ein Hüllprotein jedes beliebige Protein, das sich während des Virus-Assemblierungsprozesses in einer Wirtszelle mit einem Viruspartikel assoziiert und mit dem assemblierten Virus assoziiert bleibt, bis es eine andere Wirtszelle infiziert. Das Hüllprotein kann das Haupthüllprotein oder ein Nebenhüllprotein sein. Ein "Haupt-"Hüllprotein ist ein Hüllprotein, das in der viralen Hülle bei 10 Kopien des Proteins oder mehr vorhanden ist. Ein Haupthüllprotein kann in Duzenden, Hunderten oder Tausenden von Kopien pro Virion vorhanden sein.
Die Bezeichnungen "Elektroporation" und "Elektroporieren" beziehen sich auf ein Verfahren, in dem Fremdmaterial (Protein, Nucleinsäure usw.) durch Anlegen von Spannung an die Zelle unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Aufnahme des Fremdmaterials in die Zelle zu ermöglichen, in eine Zelle eingeführt wird. Das Fremdmaterial ist typischerweise DNA.
Ein "Fusionsprotein" ist ein Polypeptid, das zwei kovalent aneinander gebundene Abschnitte aufweist, worin jeder der beiden Abschnitte ein Polypeptid mit einer unterschiedlichen Eigenschaft ist. Die Eigenschaft kann eine biologische Eigenschaft sein, wie beispielsweise Aktivität in vitro oder in vivo. Die Eigenschaft kann auch eine einfache chemische oder physikalische Eigenschaft sein, wie beispielsweise Bindung an ein Targetmolekül, Katalyse einer Reaktion usw. Die zwei Abschnitte können direkt über eine einzelne Peptidbindung oder über einen Peptidlinker, der einen oder mehrere Aminosäurereste enthält, verbunden sein. Im Allgemeinen sind die zwei Abschnitte und der Linker gemeinsam im Leseraster.
"Heterologe DNA" ist DNA, die in eine Wirtszelle eingeführt wird. Die DNA kann von einer Vielzahl an Quellen abgeleitet sein, einschließlich genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA und Fusionen oder Kombinationen von diesen. Die DNA kann DNA von derselben Zelle oder demselben Zelltyp wie die Wirts- oder Empfängerzelle oder DNA von einem unterschiedlichen Zelltyp, beispielsweise von einem Säugetier oder einer Pflanze, einbinden. Die DNA kann gegebenenfalls Selektionsgene, beispielsweise Antibiotikaresistenzgene, Temperaturresistenzgene usw., einschließen.
"Ligation" ist das Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nucleinsäurefragmenten. Zur Ligation der zwei Fragmente müssen die Enden der Fragmente miteinander kompatibel sein. In manchen Fällen sind die Enden nach Endonucleaseverdau direkt kompatibel. Es kann jedoch erforderlich sein, die versetzten Enden, die üblicherweise nach Endonucleaseverdau produziert werden, zu stumpfen Enden umzusetzen, um sie für Ligation kompatibel zu machen. Zum Glätten der Enden kann DNA in einem geeigneten Puffer zumindest 15 min lang bei 15°C mit etwa 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxyribonucleotidtriphosphate behandelt werden. Die DNA kann dann durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt werden. Die DNA-Fragmente, die aneinander ligiert werden, werden in etwa äquimolaren Mengen in Lösung gegeben. Die Lösung enthält im Allgemeinen auch ATP, Ligasepuffer und eine Ligase wie beispielsweise T4-DNA-Ligase mit etwa 10 Einheiten pro 0,5 μg DNA. Sofern die DNA in einen Vektor zu ligieren ist, wird der Vektor zuerst durch Verdau mit der/den geeigneten Restriktionsnuclease(n) linearisiert. Das linearisierte Fragment wird dann mit bakterieller Alkalischer Phosphatase oder Kalbsintestinalphosphatase behandelt, um Selbstligation während des Ligationsschrittes zu vermeiden.
Eine "Mutation" ist eine Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide, in Bezug auf eine Vergleichs-Nucleotidsequenz wie beispielsweise einer Wildtyp-Sequenz.
"Operabel gebunden" in Bezug auf Nucleinsäuren bedeutet, dass die Nucleinsäuren in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise wird DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, sofern es als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Codiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosom-Bindungsstelle ist operabel an eine Codiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Fall eines Sekretionsleaders zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung erfolgt durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Bestehen solche Steilen nicht, so werden synthetische Oligonucleotid-Adapter oder -Linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
"Phagendisplay" ist ein Verfahren, durch das verschiedene Polypeptide als Fusionsproteine mit einem Hüllprotein an der Oberfläche von Phagen, z.B. an filamentösen Phagenpartikeln, dargestellt werden. Eine Nützlichkeit von Phagendisplay liegt in der Tatsache, dass große Bibliotheken randomisierter Proteinvarianten rasch und effizient auf jene Sequenzen aussortiert werden können, die sich mit hoher Affinität an ein Targetmolekül binden. Die Darbietung von Peptid- und Proteinbibliotheken an Phagen wurde zum Screenen von Millionen von Polypeptiden auf jene mit spezifischen Bindungseigenschaften verwendet. Mehrwertige Phagendisplay-Verfahren wurden zur Darbietung von kleinen zufällig ausgewählten Peptiden und kleinen Proteinen durch Fusion entweder an Gen III oder Gen VIII des filamentösen Phagen verwendet. Wells & Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. B, 355–362 (1992), und die darin zitierten Verweise. Bei einwertigem Phagendisplay wird eine Protein- oder Peptidbibliothek an ein Gen III oder einen Abschnitt davon fusioniert und in geringen Konzentrationen in Gegenwart von Wildtyp-Gen-III-Protein exprimiert, sodass Phagenpartikel eine Kopie oder keine der Fusionsproteine darbieten. Aviditätswirkungen sind bezüglich mehrwertigen Phagen reduziert, sodass das Aussortieren auf der Grundlage von intrinsischer Ligandenaffinität erfolgt, und Phagemidvektoren werden verwendet, die DNA-Manipulationen vereinfachen. Lowman & Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology 3, 205–216 (1991). Bei Phagendisplay entspricht der Phänotyp des Phagenpartikels, einschließlich des dargebotenen Polypeptids, dem Genotyp innerhalb des Phagenpartikels, wobei die DNA durch die Phagen-Hüllproteine eingeschlossenen ist.
Ein "Phagemid" ist ein Plasmidvektor mit einem bakteriellen Replikationsstartpunkt, z.B. ColE1, und einer Kopie einer intergenischen Region eines Bakteriophagen. Das Phagemid kann auf jedem bekannten Bakteriophagen einschließlich filamentöser Bakteriophagen aufbauen. Das Plasmid enthält im Allgemeinen auch einen selektierbaren Marker für antibiotische Resistenz. DNA-Segmente, die in diese Vektoren kloniert werden, können wie Plasmide vermehrt werden. Werden Zellen, die diese Vektoren in sich tragen, mit allen Genen versorgt, die zur Produktion von Phagenpartikeln erforderlich sind, ändert sich die Replikationsart des Plasmids zum Replikationsmechanismus des rollenden Kreises, um Kopien eines Strangs der Plasmid-DNA zu bilden und Phagenpartikel zu verpacken. Das Phagemid kann infektiöse und nicht infektiöse Phagenpartikel bilden. Diese Bezeichnung umfasst Phagemide, die ein Phagen-Hüllproteingen oder ein Fragment davon enthalten, das an ein heterologes Polypeptidgen als eine Genfusion gebunden ist, sodass das heterologe Polypeptid an der Oberfläche des Phagenpartikels dargeboten ist. Sambrook et al., 4.17.
Die Bezeichnung "Phagenvektor" bezeichnet eine doppelsträngige replikative Form eines Bakteriophagen, der ein heterologes Gen enthält und zu Replikation fähig ist. Der Phagenvektor hat einen Phagen-Replikationsstartpunkt, der Phagenreplikation und Phagen-Partikelbildung ermöglicht. Der Phage ist vorzugsweise ein filamentöser Bakteriophage, wie beispielsweise ein M13-, fl-, fd-, Pf3-Phage oder ein Derivat davon, ein Lambdoid-Phage, wie beispielsweise Lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424 usw., oder ein Derivat davon, Ein Baculovirus oder ein derivat davon, ein T4-Phage oder ein Derivat davon, ein T7-Phagenvirus oder ein Derivat davon.
"Herstellung" von DNA aus Zellen bedeutet das Isolieren der Plasmid-DNA von einer Kultur der Wirtszellen. Üblicherweise verwendete Verfahren zur DNA-Herstellung sind die großtechnischen und kleintechnischen Plasmidherstellungen, wie in den Abschnitten 1.25–1.33 von Sambrook et al. beschrieben wird. Nach Herstellung der DNA kann diese mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren, wie beispielsweise in Abschnitt 1.40 von Sambrook et al. beschrieben wird, gereinigt werden.
"Oligonucleotide" sind kurze, einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die mittels bekannter Verfahren (wie beispielsweise Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramiditchemie, unter Verwendung von Festphase-Verfahren, wie beispielsweise in EP 266.032 , veröffentlicht am 4. Mai 1988, beschrieben wird, oder über Desoxynucleosid-H-Phosphonat-Zwischenprodukte, wie von Froehler et al., Nucl. Acids. Res. 14, 5399–5407 (1986), beschrieben wird) chemisch synthetisiert werden. Weitere Verfahren umfassen die Polymerasekettenreaktion, die nachstehend definiert wird, und andere Autoprimer-Verfahren und Oligonucleotidsynthesen an festen Trägern. Alle diese Verfahren sind in Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716–734 (1989), beschrieben. Diese Verfahren werden verwendet, sofern die gesamte Nucleinsäuresequenz des Gens bekannt ist oder die Sequenz der Nucleinsäure, die komplementär zum Codierstrang ist, erhältlich ist. Alternativ dazu kann, sofern die Target-Aminosäuresequenz bekannt ist, auf mögliche Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung bekannter und bevorzugter Codierreste für jeden Aminosäurerest geschlossen werden. Die Oligonucleotide werden dann auf Polyacrylamidgelen gereinigt.
"Polymerasekettenreaktion" oder "PCR" bezieht sich auf ein Verfahren oder eine Technik, in dem/der geringe Mengen eines spezifischen Teils von Nucleinsäure, RNA und/oder DNA, wie im US-Patent Nr. 4.683.195, ausgegeben am 28. Juli 1987, beschrieben, amplifiziert werden. Im Allgemeinen muss Sequenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus zugänglich sein, sodass Oligonucleotidprimer entworfen werden können; diese Primer weisen eine identische oder ähnliche Sequenz wie gegenüberliegende Stränge der zu amplifizierenden Matrize auf. Die 5'-terminalen Nucleotide der zwei Primer können mit den Enden des amplifizierten Materials übereinstimmen. PCR kann verwendet werden, um spezifische RNA-Sequenzen, spezifische DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA sowie cDNA, die aus zellulärer Gesamt-RNA transkribiert ist, Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen usw. zu amplifizieren. Siehe im Allgemeinen Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987); Erlich (Hrsg.), PCR Technology (Stockton Press, NY (1989)). Wie hierin verwendet wird PCR als ein, jedoch nicht als das einzige, Beispiel eines Nucleinsäure-Polymerasereaktionsverfahrens zur Amplifikation einer Nucleinsäure-Testprobe erachtet, umfassend die Verwendung einer bekannten Nucleinsäure als Primer und einer Nucleinsäurepolymerase, um einen spezifischen Teil von Nucleinsäure zu amplifizieren oder zu bilden.
DNA ist "gereinigt", wenn die DNA von Nicht-Nucleinsäure-Verunreinigungen befreit ist. Die Verunreinigungen können polar, unpolar, ionisch usw. sein.
"Gewinnung" oder "Isolation" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsverdau bedeutet die Trennung des Verdaus auf Polyacrylamid- oder Agarosegel mittels Elektrophorese, die Identifikation des Fragments von Interesse durch Vergleichen seiner Mobilität gegenüber jener von Marker-DNA-Fragmenten bekannten Molekulargewichts, das Entfernen des Gelabschnitts, der das erwünschte Fragment enthält, und das Trennen des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist im Allgemeinen bekannt. Siehe beispielsweise Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103–6114 (1981), und Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).
Ein "Transkriptionsregulationselement" enthält eine oder mehrere der folgenden Komponenten: ein Enhancerelement, einen Promotor, eine Operatorsequenz, ein Repressorgen und eine Transkriptionsterminationssequenz. Diese Komponenten sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. US 5.667.780 .
Ein "Transformant" ist eine Zelle, die DNA aufgenommen und beibehalten hat, wie die Expression eines Phänotyps beweist, der mit der DNA assoziiert ist (z.B. antibiotische Resistenz, die durch ein durch die DNA kodiertes Protein verliehen wird).
"Transformation" oder "Transformieren" bezeichnet ein Verfahren, durch das eine Zelle DNA aufnimmt und zu einem "Transformant" wird. Die DNA-Aufnahme kann permanent oder vorübergehend sein.
Eine "Variante" oder "Mutante" eines Ausgangspolypeptids, wie beispielsweise ein Fusionsprotein oder ein heterologes Polypeptid (heterolog zu einem Phagen), ist ein Polypeptid, das 1) eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von jener des Ausgangspolypeptids unterscheidet, und 2) vom Ausgangspolypeptid entweder durch natürliche oder durch künstliche (synthetische) Mutagenese abgeleitet wurde. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen von und/oder Insertionen in und/oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids von Interesse. Jede beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann verwendet werden, um das endgültige Varianten- oder Mutantenkonstrukt zu erhalten, vorausgesetzt, das Endkonstrukt besitzt die erwünschten funktionellen Eigenschaften. Die Aminosäureänderungen können auch post-translationale Prozesse des Polypeptids verändern, wie beispielsweise die Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen. Verfahren zur Bildung von Aminosäuresequenzvarianten von Polypeptiden sind um US-Patent Nr. 5.534.615 beschrieben, das hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen ist.
Die Bezeichnung "Peptidanalogon" bezieht sich auf ein Molekül oder einen Teil davon, das aus Aminosäuren besteht und hinsichtlich seiner Bindungsfähigkeit und/oder -spezifität einem spezifischen Molekül wie zuvor definiert ähnelt. Solche Peptidanaloga können durch Protein-Bearbeitungsverfahren, die Fachleuten bekannt sind, gefunden oder konstruiert werden. Alternativ dazu können solche Peptidanaloga durch ein sich wiederholendes Screening-Verfahren gefunden werden, beispielsweise in einem Verfahren, in dem ein natürlicher Bindungspartner des spezifischen Moleküls (wobei dieses spezifische Molekül nicht notwendigerweise ein Protein oder ein Peptid ist) oder ein Teil davon wie hierin beschrieben verwendet wird (d.h. in einem chimären Protein), um Peptidverbindungen auf ihre Fähigkeit zu screenen, es zu binden. In einem zweiten Screening-Schritt kann die neu gefundene Peptidverbindung (oder ein Teil davon) selbst als ein Peptidanalogon des spezifischen Moleküls in einem chimären Protein verwendet werden, um auf Analoga des natürlichen Bindungspartners zu screenen. Andere Verfahren zum Finden oder Herstellen von Peptidanaloga sind Fachleuten bekannt.
Die Bezeichnung "Epitop" bezeichnet ein Antigen oder einen Teil davon, das in der Lage ist, sich als eine antigene Determinante an einen Antikörper zu binden.
Unter "Bindungspartnerkomplex" wird die Assoziierung von zwei oder mehr Molekülen verstanden, die auf eine spezifische, nachweisbare Weise aneinander gebunden sind: also die Assoziation von Ligand und Rezeptor, von Antikörper und Antigen sowie von chimärem Protein und der Verbindung, an die es sich bindet.
Die Bezeichnung "direkt oder indirekt markiert" bezieht sich auf ein Molekül, das eine Markierungsgruppierung enthalten kann, wobei diese Gruppierung ein Signal emittiert, das nachgewiesen werden kann, wie beispielsweise ein Radioisotop, ein Farbstoff oder eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Gruppierung, oder das eine Gruppierung wie beispielsweise ein gebundenes Enzym, einen Liganden wie Biotin, ein Enzymsubstrat, ein Epitop oder eine Nucleotidsequenz enthalten kann, die nicht selbst nachgewiesen wird, die jedoch mittels einer zusätzlichen Reaktion in der Lage ist, auf die Gegenwart der Verbindung hinzuweisen.
Unter "Ligand" wird ein Molekül oder ein multimerer molekularer Komplex verstanden, das/der in der Lage ist, sich spezifisch an ein anderes bestimmtes Molekül oder einen anderen bestimmten molekularen Komplex zu binden. Häufig, jedoch nicht notwendigerweise, ist ein Ligand löslich, während sein Target, beispielsweise durch eine Ankerdomäne, die in eine Zellmembran eingebettet ist, immobilisiert ist.
Die Bezeichnung "Rezeptor" bezieht sich auf zumindest einen Abschnitt eines Moleküls oder eines multimeren molekularen Komplexes, das/der eine Ankerdomäne aufweist, die in eine Zellmembran eingebettet ist, und das/der in der Lage ist, sich an ein bestimmtes Molekül oder einen bestimmten molekularen Komplex zu binden. Zahlreiche Rezeptoren weisen besonders hohe Affinität zu einem Liganden auf, wenn einer oder beide von Rezeptor und Ligand in einer homo- oder heteromultimeren Form, wie beispielsweise in der Form eines Dimers, vorliegen.
Die Bezeichnung "fester Träger" bezieht sich auf eine unlösliche Matrize entweder biologischer Natur, wie beispielsweise, ohne darauf eingeschränkt zu sein, eine Zelle oder ein Bakteriophagenpartikel, oder synthetischer Natur, wie beispielsweise, ohne darauf eingeschränkt zu sein, ein Acrylamidderivat, Zellulose, Nylon, Siliciumdioxid und magnetisierte Teilchen, an die lösliche Moleküle gebunden oder mit denen sie verbunden werden können.
Unter "natürlich vorkommend" wird verstanden, dass Verbindungen normalerweise in der Natur gefunden wird. Obwohl eine chemische Einheit im Allgemeinen natürlich vorkommend sein kann, muss es nicht in jeder spezifischen Situation aus natürlichen Quellen hergestellt oder gewonnen sein.
Unter "nicht in der Natur vorkommend" werden Verbindungen verstanden, die selten oder nie in der Natur vorkommen und/oder unter Verwendung organischer synthetischer Verfahren hergestellt werden.
"Modifiziert" bedeutet nicht in der Natur vorkommend oder auf eine Weise verändert, die von natürlich vorkommenden Verbindungen abweicht.
II. Allgemeines
Die vorliegende Erfindung betrifft konformationseingeschränkte Peptide und Peptidbibliotheken, die zur Struktur-Aktivitäts-Analyse von bioaktiven Molekülen und zur Entdeckung von Arzneimittel-Leitstrukturen nützlich sind. Das Peptid der Erfindung umfasst zwei Cysteinreste, die in der Lage sind, Disulfidbindungen miteinander zu bilden. Somit nimmt das Peptid eine zyklische Form in Lösung an, die die Bildung eines β-Haarnadelgerüsts erleichtert. Disulfidzyklisierung ist hilfreich, obwohl sie in vielen Fällen nicht ausreichend ist, um die Struktur von Peptiden einzuschränken. Die übrigen Reste des Peptids werden weiter dafür ausgewählt, dass sie eine deutliche Neigung zur Bildung der Haarnadelstruktur zeigen. Darüber hinaus wird eine Teilmenge der Reste innerhalb des Peptids der Erfindung variiert, um relative Diversität zur Nachahmung verschiedener bioaktiver Peptide bereitzustellen, die eine identifizierte Sekundärstruktur, wie beispielsweise eine β-Kehre, aufweisen, die sich bereits als maßgeblich für biologische Prozesse erwiesen hat.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Peptidbibliothek, die eine Sammlung von strukturell eingeschränkten zyklischen Peptiden umfasst. Jeder Peptidteil der Bibliothek umfasst die Aminosäuresequenz C1-A1-A2-(A3)_n-A4-A5-C2 [Seq.-ID Nr. 1], worin
A1, A2, A3, A4 und A5 natürlich vorkommende L-Aminosäuren sind;
der Amino-Terminus von Cystein C1 gegebenenfalls mit einer Amino-Schutzgruppe geschützt ist;
der Carboxy-Terminus von Cystein C2 gegebenenfalls mit einer Carboxy-Schutzgruppe geschützt ist;
A1 und A5 aus der aus den Aminosäuren W, Y, F, H, I, V und T bestehenden Gruppe ausgewählt sind;
A2 und A4 aus der aus den Aminosäuren W, Y, F, L, M, I und V bestehenden Gruppe ausgewählt sind;
A3 jede beliebige, natürlich vorkommende L-Aminosäure ist und n eine ganze Zahl ist, die aus der aus 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und
C1 und C2 miteinander über eine Disulfidbindung verbunden sind, wodurch ein zyklisches Peptid gebildet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide der Erfindung einen β-verzweigten Rest mit zwei Nichtwasserstoffsubstituenten am β-Kohlenstoff des Aminosäurerests an Position A1 oder A5 oder an beiden auf. Noch bevorzugter ist A1 oder A5 Threonin (T). Und sogar noch bevorzugter sind sowohl A1 als auch A5 Threoninreste.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide einen aromatischen Rest W, Y, F oder H an Position A1 oder A5 oder an beiden auf. Noch bevorzugter ist A1 oder A5 W. Zusätzlich bevorzugte Peptide der Erfindung haben einen verzweigten aliphatischen Rest I, V oder T an A1, A5 oder an beiden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide der Erfindung einen aromatischen Rest W, Y oder F an Position A2 oder A4 oder an beiden auf. Noch bevorzugter ist A2 oder A4 W; und sogar noch bevorzugter sind A2 und A4 beide W. Eine andere bevorzugte Ausführungsform bindet Peptide ein, die einen unverzweigten aliphatischen Rest L oder M an Position A2 oder A4 oder an beiden aufweisen; noch bevorzugter ist A2 oder A4 Leucin. Wiederum andere bevorzugte Peptide weisen einen verzweigten aliphatischen Rest I oder V an Position A2 oder A4 oder an beiden auf.
In den Peptiden der Erfindung kann die Anzahl der A3-Reste n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 betragen; vorzugsweise 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; und noch bevorzugter 4, 5 oder 6. In einer Ausführungsform ist n = 4, und die resultierenden Peptide sind Decamere. In diesen Decameren stammen die Reststellen A1, A2, A4 und A5 jeweils aus einer ausgewählten Gruppe der zuvor beschriebenen Aminosäurereste, worin die mittlere (A3)₄ eine Tetrapeptidsequenz mit variierenden Aminosäuren ist. In einem Aspekt der Erfindung ist die (A3)₄-Tetrapeptidsequenz aus jenen ausgewählt, die dazu neigen, eine β-Kehren-Struktur zu bilden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, EGNK, ENGK, QGSF, VWQL und GPLT.
In einem Aspekt enthält die Bibliothek der vorliegenden Erfindung zumindest etwa 10² Mitgliedpeptide, wovon jedes zumindest eine Aminosäurevariation im Vergleich zu den anderen aufweist. Vorzugsweise enthält die Bibliothek zumindest etwa 10⁴ Peptide, noch bevorzugter etwa 10¹⁰ Peptide und sogar noch bevorzugter zumindest etwa 10² Peptide. Gemäß verschiedenen Ausführungsformen tritt die Aminosäurevariation an definierten Positionen innerhalb der Peptide auf. Beispielsweise können Variationen an nicht Wasserstoff-gebundenen (NHB-) Strangstellen (z.B. A1/A5) oder an Wasserstoff-gebundenen Strangstellen (z.B. A2/A4) auftreten; ein Rest und sein Kreuzstrang-Gegenstück (z.B. A1/A5 oder A2/A4) können dieselben oder unterschiedliche Aminosäuren aufweisen. Variationen können auch an den Mittel- ((A3)_n-) Stellen auftreten, worin A3 jede beliebige der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren sein kann.
Das Carboxy-terminale Ende und das Amino-terminale Ende des zyklischen Peptids können mit jeder beliebigen bekannten Schutzgruppe geschützt sein oder können an andere Aminosäurereste (im Allgemeinen natürlich vorkommende Reste) sowohl in der (L)- als auch in der (D)-Form über herkömmliche Amidpeptidbindungen gebunden sein. Die Schutzgruppen und zusätzlichen Reste können unter Verwendung herkömmlicher Peptidsyntheseverfahren hinzugefügt werden. Im Allgmeinen können von 1 bis etwa 50, vorzugsweise von 1 bis etwa 20, Aminosäurereste an jeder der Carboxy- und Amino-terminalen Positionen unabhängig voneinander vorhanden sein. Diese zusätzlichen Reste können Teil eines bekannten Proteins sein, das eine β-Kehre von Interesse enthält, oder können jede andere erwünschte Sequenz von Resten sein. Diese zusätzlichen Reste können hinzugefügt werden, um die Wirkung der β-Kehren-Struktur auf die Struktur des gesamten Peptids zu bestimmen oder um die Wirkung der zusätzlichen Reste auf die Bindung des zyklischen β-Kehren-Peptids mit einem Protein von Interesse zu bestimmen.
Alternativ dazu kann eine Bibliothek von zyklischen Peptiden der Erfindung hergestellt werden, in der ein oder mehrere Reste A1, A2, A4 und/oder A5 unabhängig voneinander fixiert sind und Reste A3 unter Verwendung bekannter Verfahren zur Herstellung von Peptidbibliotheken variiert werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek ist Phagendisplay. Jedes bekannte Phagendisplay-Verfahren, wie jene, die nachstehend näher erläutert werden, können im Verfahren der Erfindung verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das zyklische Peptid der Erfindung an zumindest einen Abschnitt eines Phagen-Hüllproteins fusioniert, um ein Fusionsprotein zu bilden, das das zyklische Peptid der Erfindung enthält. Das Fusionsprotein kann durch Exprimieren einer Genfusion, die für das Fusionsprotein kodiert, unter Verwendung bekannter Phagendisplay-Verfahren, wie jene, die nachstehend beschrieben werden, hergestellt werden. Das Fusionsprotein kann einen Teil eines Phagen- oder Phagemidpartikels bilden, in dem eine oder mehrere Kopien des zyklischen Peptids an der Oberfläche des Partikels dargeboten ist/sind. Ein Gen, das eine Nucleinsäure umfasst, die für das zyklische Peptid oder das Fusionsprotein kodiert, liegt im Schutzumfang der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zum Screenen auf Peptide, die ein β-Haarnadelgerüst aufweisen, das konformationsstabilisiert ist, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer kombinatorischen Bibliothek der Erfindung wie zuvor beschrieben; b) Selektieren von zumindest zwei Peptiden aus der kombinatorischen Bibliothek, worin sich diese zumindest zwei Peptide durch eine Aminosäure an einer bestimmten Position A1, A2, A3, A4 oder A5 unterscheiden; c) Bestimmen der Konformationen der Peptide; d) Messen und Vergleichen der relativen Stabilitäten der Peptide; und e) Auswählen des Peptids mit einem konformationsstabilisierten β- Haarnadel-Gerüst. Konformation und Stabilität der Peptide können unter Verwendung zahlreicher Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie beispielsweise durch NMR, Molekülmodellierung, Kristallographie und Berechnung der freien Energie, bestimmt werden. Siehe beispielsweise Cavanagh et al., Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practices (Academic Press, San Diego (1995)). Bestimmte Verfahren zur Bestimmung von Peptidkonformation und -stabilität sind nachstehend durch die Beispiele näher beschrieben. Die Peptide mit β-Kehre der Erfindung können zum Nachahmen nativer bioaktiver Proteine in ihren Bindungsaktivitäten nützlich sein.
Die Identität der β-Kehrenreste A3 kann durch Untersuchungen bekannter Proteinstrukturen und durch anschließendes Substituieren der bekannten strukturellen Sequenz zur strukturieren β-Haarnadel-Verbindung der Erfindung bestimmt werden. In dieser Ausführungsform werden Reste A3 aus dem bekannten Protein genommen, während die Reste A1, A2, A4 und A5 wie für die Erfindung beschrieben beschaffen sind. Auf diese Weise können die fixierten Reste der Erfindung verwendet werden, um bestimmte Kehren aus Proteinen von Interesse zu strukturieren und dadurch das Testen zu ermöglichen, ob die Proteinkehre für das Binden an einen bekannten Proteinbindungspartner oder zum Entgegenwirken gegen die relevante Protein-Protein-Wechselwirkung ausreichend ist.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Identifizieren eines Peptids, das in der Lage ist, sich an einen spezifischen Bindungspartner zu binden, folgende Schritte umfassend: a) das Bereitstellen einer kombinatorischen Bibliothek wie zuvor beschrieben; b) das Kontaktieren der kombinatorischen Bibliothek mit einem Bindungspartner; c) das Auswählen von Peptiden aus der Bibliothek, die in der Lage sind, einen nicht kovalenten Komplex mit dem Bindungspartner zu bilden; und d) gegebenenfalls das Isolieren dieser Peptide aus Schritt. Verfahren und Methodiken zur Bewertung von Peptid-Bindungsaktivität und zum Isolieren von Peptiden von Interesse sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind nachstehend näher beschrieben.
Bindungspartner der Peptide der Erfindung können zumindest einen Teil jedes beliebigen Moleküls einschließlich jeglicher bekannter und unbekannter Peptide, Proteine, anderer Makromoleküle oder chemischer Verbindungen sein, die in der Lage sind, sich an Peptide zu binden und gegebenenfalls Bioaktivitäten auszuüben. Proteinmoleküle wie beispielsweise Rezeptoren, Liganden, Antigene, Antikörper, Enzyme und Enzymsubstrate und Fragmente oder Abschnitte davon sind durch die Bezeichnung "Bindungspartner" auch abgedeckt. Andere chemische Verbindungen, die keine Proteine sind, organische oder anorganische, können auch die Bindungspartner der Peptide sein.
III. β-Haarnadel-Peptide
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bindet kurze Peptide ein, die β-Haarnadel-Konformationen in Lösung einnehmen. Die einzelnen Teile der β-Haarnadel-Struktur umfassen gepaarte antiparallele β-Stränge und vorzugsweise β-Kehren. Die bevorzugte Platzierung von Disulfid-gebundenen Cysteinpaaren an nicht Wasserstoff-gebundenen Stellen in den β-Strängen wurde bereits untersucht, wie auch spezifische Paare von Kreuzstrang-Resten, die statistisch bevorzugt sind (sowohl in Wasserstoff-gebundenen als auch nicht Wasserstoff-gebundenen Stellen), zumindest in Proteinen. Eine Untersuchung beschreibt experimentelle Stabilitätsmessungen von mutierten Proteinen, in denen verschiedene Restepaare in Wasserstoff-gebundene Stellen an benachbarten antiparallelen Strängen eingeführt wurden. Smith & Regan, Science 270, 980–982 (1995). Versuche wurden unternommen, um intrinsische Präferenzen für einzelne Aminosäuren, Konformationen einzunehmen, die für die Geometrie eines β-Strangs geeignet sind, entweder durch Analysieren des Restgehalts von β-Strängen (Chou & Fassman, Annu. Rev. Biochem. 47, 251–276 (1987)) oder durch Substituieren verschiedener Aminosäuren in einen β-Strang eines Proteins und durch Messen der relativen Stabilitäten der Mutanten (Kim & Berg, Nature 362, 267–270 (1993); Minor & Kim, Nature 367, 660–663 (1994); Minor & Kim, Nature 371, 264–267 (1993); Smith et al., Biochemistry 33, 5510–5517 (1994)) zu bestimmen. Ein überarbeitetes statistisches Verfahren zur Bewertung von Restkon formationen weist verbesserte Korrelation mit den unterschiedlichen experimentellen Neigungsskalen auf (Munoz & Serrano, Proteins 20, 301–311 (1994)). Die Neigung, die Tryptophan zugeschrieben wird, ist in allen berichteten Skalen mäßig.
Erst jüngst wurde gezeigt, dass bei manchen kurzen, linearen Peptiden (4–16 Aminosäuren) die Haarnadelkonformation in wässriger Lösung teilweise besetzt ist. Sowohl modellierte Peptide als auch Peptide, die aus Proteinsequenzen genommen würden, zeigten dieses Verhalten. Im Allgemeinen binden diese Untersuchungen Peptide mit statistisch starken Kehrensequenzen (z.B. asn-gly an i + 1, i + 2) ein. Nichtsdestotrotz übersteigen Haarnadelpopulationen selten 40–50% in wässriger Lösung.
Ein 16-mer-Peptid, das vom Protein Ubiquitin abgeleitet ist, das jedoch eine statistisch gewöhnlichere Kehrensequenz (MQIGVKNPDGTITLEV) aufweist, bildete eine stark bevölkerte Haarnadel in Wasser (ca. 80%), wobei jedoch die Haarnadel nicht dasselbe Strangregister aufwies wie im nativen Protein (Searle et al., Nat. Struct. Biol. 2, 999–1006 (1995)). Eine andere Forschergruppe untersuchte ein ähnliches Peptid, in dem die Kehrenregion durch mehrere Sequenzen ersetzt war (MQIGVKSXXKTITLKV, worin XX = pro-ala oder pro-gly; Haque & Gellman, J. Am. Chem. Soc. 119, 2303–2304 (1997)). Hinweise auf die Haarnadelstruktur mit nativem Strangregister wurden bei den Kehren beobachtet, die D-Aminosäuren enthielten, jedoch nicht bei L-Aminosäuresequenzen. In dieser Studie wurden keine Populationsschätzungen angegeben.
Mehrere Gruppen untersuchten Modellpeptide, die ursprünglich auf einer Sequenz aus dem Protein Tendamistat basierten. Das Peptid YQNPDGSQA zeigt NMR-Beweis einer kleinen Population von Haarnadel in Wasser (Blanco et al., J. Am. Chem. Soc. 115, 5887–5888 (1993); de Alba et al., Eur. J. Biochem. 233, 283–292 (1995); Constantine et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 10841–10854 (1995); Friedrichs et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 10855–10864 (1995)). Eine Variante dieses Peptids mit Strangresten von höher erwarteter β-Neigung (IYSNPDGTWT) wurde mit einem zweiten Peptid mit einer unterschiedlichen Kehrensequenz (IYSNSDGTWT) verglichen. Beide Peptide wurden durch NMR als 30% Haarnadel in Wasser geschätzt (de Alba et al., Fold. Des. 1, 133–144 (1996)). Weitere Variation dieses Peptids, vorzugsweise in der Kehrensequenz, ergab Haarnadeln verschiedener Strukturen und gemischte Populationen. Im Allgemeinen überstieg keine Konformerpopulation 50% (de Alba et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 175–183 (1997)). In einer letzten Studie wurden die drei N-terminalen Reste in Peptid ITSNSDGTWT durch verschiedene Sequenzen ersetzt. Wiederum wurden gemischte Konformere häufig beobachtet, und Populationen eines bestimmten Haarnadel-Konformers beliefen sich im Allgemeinen auf weniger als 50%: ein Peptid (YITNSDGTWT) bildete eine Register-verschobene Haarnadel, die hoch besetzt war (80%; de Alba et al., Protein Sci. 6, 2548–2560 (1997)). Die Autoren dieser Studien schlossen, dass Konformationspräferenzen der Kehrenreste Kreuzstrang-Wechselwirkungen beim Bestimmen der Stabilität von Haarnadeln zumindest in diesen kurzen Modellpeptiden dominieren.
Die Analyse von Haarnadelsequenzen in Kristallstrukturen ermöglichte den Entwurf einer anderen Serie an β-Haarnadelpeptiden. Die Targetstruktur war eine Kehre vom Typ I', flankiert durch Dreirest-Stränge. arg-gly-Sequenzen wurden an den Enden hinzugefügt, um die Löslichkeit zu verbessern. Das Peptid RGITVNGKTYGR ist teilweise zu einer Haarnadelkonformation (etwa 30%) gefaltet, wie durch NMR bestimmt wurde (Ramirez-Alvarado et al., Nat. Struct. Biol. 3, 604–612 (1996)). Die Bedeutung von Strangresten wird durch Ersetzen des ile und val, des lys und tyr oder aller vier Reste durch Alanin aufgezeigt. Keines der Alanin-substituierten Peptide zeigte eine Tendenz, eine Haarnadel zu bilden. Dieselben Autoren berichteten von einer zweiten Serie an Versuchen, in denen Position i + 1 der Kehre variiert wurde (asn zu asp, ala, gly oder ser). Kein Peptid war stärker strukturiert als die ursprüngliche Sequenz mit asn in der Kehre (Ramirez-Alvarado et al., J. Mol. Biol. 273, 898–912 (1997)). Ein Bericht, der diese Arbeit beschrieb, hielt fest, dass das Hinzufügen von glu-lys-Paaren an die Termini des Modellpeptids die Haarnadel stabilisierte, gab jedoch keine weiteren Details an (Ramirez-Alvarado et al., Bioorg. Med. Chem. 7, 93–103 (1999)).
Eine andere Modellpeptid-Reihe (RYVEVXGOrnKILQ) brachte Hinweise auf Haarnadelbildung in Wasser. Rest X als D-pro oder L-asn ergibt charakteristische NOEs- und α-H-Verschiebungen, wobei jedoch das L-pro-Peptid nicht gefaltet ist. Keine Populationsschätzungen werden angegeben, doch D-pro scheint die stabilere Haarnadel zu ergeben (Stanger & Gellman, J. Am. Chem. Soc. 120, 4236–4237 (1998)).
Ein modelliertes 16-Rest-Peptid (KKYTVSINGKKITVSI), basierend auf der met-Repressor-DNA-Bindungsregion, bildete eine Haarnadelstruktur in Wasser mit einer geschätzten Population von 50% bei 303 K. Trunkieren eines Strangs zeigte, dass die Kehre ohne Strangwechselwirkungen bevölkert war, dies jedoch zu einem geringeren Grad (35%). Eine Analyse der thermodynamischen Parameter für Haarnadelbildung zeigte, dass Faltung enthalpisch nicht begünstigt und entropisch gesteuert wird, bei ΔG = 0,08 kcal/mol bei 298 K (Maynard & Searle, Chem. Commun., 1297–1298 (1997); Griffiths-Jones et al., Chem. Commun., 789–790 (1998); Maynard et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 1996–2007 (1998)).
Ein letztes Haarnadelpeptid (GEWTYDDATKTFTVTE), abgeleitet von der B1-Domäne von Protein G (GB1), weist manche Eigenschaften auf, die für die Peptide der Erfindung von Bedeutung sind. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Modellhaarnadeln weist die GB1-Haarnadel vier Threoninreste an Wasserstoff-gebundene Stellen in den Strängen auf, einschließlich eines thr-thr-Kreuzstrangpaares. Im Allgemeinen wird angenommen, dass dies eine ungünstige Paarungskonstellation ist. Darüber hinaus gibt es trp-val- und tyr-phe-Paare an benachbarten nicht Wasserstoff-gebundenen Stellen, die wechselwirken könnten, um einen kleinen hydrophoben Kern zu bilden. Die berichteten Daten weisen darauf hin, dass das GB1-Peptid eine gut bevölkerte Haarnadel (etwa 50%) in Wasser bildete. Die Daten stimmen mit nativer Strangpaarung überein (Blanco et al., Nat. Struct. Biol. 1, 584–590 (1994)). Eine Denaturierungsstudie des GB1-Peptids ermöglichte eine Schätzung von 80% Haarnadel bei 273 K, und eine Analyse der Daten (unter der Annahme ΔCp = 0) ergab ΔH = –11,6 kcal/mol, ΔS = –39 cal/mol K: d.h. dass Faltung enthalpisch gesteuert und entropisch nicht begünstigt wird (Munoz et al., Nature 390, 196–199 (1998)). Die relativen Rollen von Enthalpie und Entropie waren umgekehrt im Vergleich zum zuvor beschriebenen met-Repressorpeptid.
Mehrere modellierte dreisträngige Blätter wurden untersucht: eines dieser enthält nur die üblichen 20 Aminosäuren, die in Proteinen auftreten, und faltet sich in Wasser (Kortemme et al., Science 281, 253–256 (1998)). Ein Aspekt des Designs ist das Hinzufügen eines trp an einer nicht Wasserstoff-gebundenen Position (durch Analogie zu WW-Domänen), wobei auch zwei nicht Wasserstoff-gebundene Reste am nächsten Strang zu nicht verzweigten Aminosäuren getauscht werden. Die Autoren weisen darauf hin, dass die verzweigten Reste nicht ermöglichen würden, dass die trp-Seitenkette über den nächsten Strang gepackt wird. Thermodynamische Analyse von Denaturierungsdaten ergibt eine freie Faltungsenergie von –0,6 kcal/mol bei 278 K (geschätzte gefaltete Population = 80–90%).
Zahlreiche Beispiele wurden in Bezug auf Disulfid-eingeschränkte Peptide erörtert, die Proteinhaarnadeln nachahmen oder selbst de-novo-modellierte Haarnadeln darstellen sollen. In vielen Fällen binden die Designs D-Cysteine an einem oder an beiden Enden ein, da anfänglich angenommen wurde, dass Disulfidbindungs-Geometrie mit der Kreuzstrang-Geometrie von Haarnadeln nicht vereinbar war. Es gibt jedoch einige Beispiele, die L-cys verwenden.
Hinweise auf die Struktur fehlen in den meisten Studien von Disulfid-zyklisierten Peptiden. Die hierin aufgelisteten Beispiele sind jene, die in Versuchen bestimmt wurden, oder jene, die keine ungewöhnlichen Aminosäuren verwenden und in einem biologischen Test eine Wirksamkeit aufweisen, die jener eines größeren, eine Haarnadel aufweisenden Proteins nahe kommt.
Die Struktur eines Hexapeptids (Boc-CL-Aib-AVC-NMe) wurde kristallographisch bestimmt und als eine Kehre vom Typ II' mit β-Faltblatt-Geometrie erkannt (Karle et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 1958–1963 (1998)). Ein Octapeptid mit demselben Cysteinabstand (ACSPGHCE) wurde mittels NMR untersucht und weist eine ähnliche Struktur mit einer Kehre auf, die auf pro-gly zentriert ist (Walse et al., J. Comput.-Aided Mol. Des 10, 11–22 (1996)). Peptide der Form Ac-CXPGXC-NHMe wurden durch Messung von Disulfidaustausch-Gleichgewichten bewertet, die auf Kehrenpräferen zen zwischen Peptiden in einer Größenordnung von 1 kcal/mol hinwiesen (Milburn et al., J. Am. Chem. Soc. 109, 4486–4496 (1987)).
Ein zyklisches Peptid mit elf Resten (CGVSRQGKPYC), basierend auf dem Gen-S-Protein aus M13, ist in wässriger Lösung stabil strukturiert, wie durch NMR-Analyse gezeigt wurde. Das zyklische Peptid nimmt eine Struktur an, die der entsprechenden Proteinschleife sehr ähnlich ist. Die Autoren beanspruchen, dass über gut definierte β-Haarnadelstruktur für irgendeinen ungeschützten, Disulfid-eingeschränkten Zyklus vorher nicht berichtet wurde (Rietman et al., Eur. J. Biochem. 238, 706–713 (1996)). Dieses Peptid weist ein val-pro-Paar an den nicht Wasserstoff-gebundenen Stellen so nahe wie möglich an den Cysteinen auf.
Zyklisieren von Peptiden entsprechend den Schleifen aus Limulus-Anti-Lipopolysaccharid-Faktor (LALF), basierend auf Röntgenstruktur, ergab potente Lipid-A-Binder. Auf die Struktur in diesen Peptiden gibt es keine Hinweise. Mehrere Peptide weisen aromatisch-aromatische Paare an den nicht Wasserstoff-gebundenen Stellen am nächsten zu den Cysteinen auf; das potenteste jedoch (GCKPTFRRLKWKYKCG) hat ein pro-tyr-Paar (Ried et al., J. Biol. Chem. 271, 28120–28127 (1996)).
Disulfid-zyklisierte Peptide aus der Haarnadelregion eines Kaninchen-Defensins weisen antibakterielle Aktivität auf, die (um das 5- bis 10fache) über die der linearen Analoga hinausgeht. Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie weist auf eine gewisse, nicht zufällige Struktur in Phosphatpuffer hin. Das potentere Peptid (CAGFMRIRGRIHPLCMRR) weist ein gly-pro-Paar an den nicht Wasserstoff-gebundenen Stellen nahe der Cysteine auf (Thennarasu & Nagaraj, Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 281–283 (1999)).
Eine letzte Studie beschreibt mehrere Peptide aus den Schleifen von Domäne 1 aus menschlicher CD4. Zusätzlich zu einer Disulfid-Einschränkung fügten die Autoren exozyklische aromatische Aminosäuren an die Peptidtermini hinzu. Ein Peptid, das CD4-Reste 39–44 abdeckt, wurde beispielsweise als FCNQGSFLCY eingeschränkt.
Auf die Struktur wurde kein Hinweis gegeben, doch von einem zyklischen Peptid (FCYICEVEDQCY) wurde berichtet, dass es sowohl normalen CD4-Wechselwirkungen als auch jenen, die in CD4-vermittelten Zelleintritt durch HIV eingebunden sind, entgegenwirkt (Zhang et al., Nature Biotechnology 14, 472–475 (1996); Zhang et al., Nature Biotechnology 15, 150–154 (1997)).
IV. Peptidbibliotheken
Zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Peptidbibliotheken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet werden, um die Bibliotheken der Erfindung herzustellen. In einer Ausführungsform können Teile der Peptidbibliothek durch Split-Synthese geschaffen werden, die an einem festen Träger wie beispielsweise Polystyrol oder Polyacrylamidharz durchgeführt wird, wie von Lam et al., Nature 354, 82 (1991), und in der PCT-Veröffentlichung WO 92/00091 beschrieben wird. In einem Aspekt der Erfindung kann die Bibliothek von zyklischen Peptiden hergestellt werden, in der ein oder mehrere Reste A1, A2, A4 und/oder A5 unabhängig voneinander fixiert und Reste A3 variiert werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung der Bibliothek der vorliegenden Erfindung ist Phagendisplay. In einer Phagendisplay-Bibliothek wird das zyklische Peptid der Erfindung an zumindest einen Abschnitt eines Phagen-Hüllproteins fusioniert, um ein Fusionsprotein zu bilden. Das Fusionsprotein kann durch Expression einer Genfusion, die für das Fusionsprotein kodiert, unter Verwendung bekannter Phagendisplay-Verfahren, wie jenen, die nachstehend beschrieben werden, hergestellt werden. Das Fusionsprotein kann einen Teil eines Phagen- oder Phagemidpartikels darstellen, in dem eine oder mehrere Kopien des zyklischen Peptids an der Oberfläche des Partikels dargeboten wird/werden. Ein Gen, das eine Nucleinsäure umfasst, die für das zyklische Peptid oder das Fusionsprotein kodiert, liegt im Schutzumfang der Erfindung.
In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung ein Verfahren, das den Schritt des Konstruierens einer Bibliothek umfasst, die eine Vielzahl an replizierbaren Ex pressionsvektoren enthält, wobei jeder Expressionsvektor ein Transkriptionsregulationselement umfasst, das operabel an eine Genfusion gebunden ist, die für ein Fusionsprotein kodiert, worin die Genfusion ein erstes Gen, das für ein zyklisches Peptid der Erfindung kodiert, und ein zweites Gen, das für zumindest einen Abschnitt eines Phagen-Hüllproteins kodiert, umfasst, worin die Bibliothek eine Vielzahl an Genen umfasst, die für zyklische Peptidfusionsprotein-Varianten kodieren. Erste Gen-Varianten und Bibliotheken davon, die für zyklische Peptid-Varianten kodieren, werden unter Verwendung bekannter Mutageneseverfahren, die nachstehend näher beschrieben werden, hergestellt.
Die Erfindung bindet auch Expressionsvektoren ein, die die zuvor erwähnten Fusionsgene umfassen, sowie eine Bibliothek dieser Vektoren. Die Vektorenbibliothek kann in Form einer DNA-Bibliothek, einer Bibliothek von Virus- (Phagen- oder Phagemid-) Partikeln, die die Bibliothek von Fusionsgenen enthält, oder in Form einer Bibliothek von Wirtszellen, die eine Bibliothek der Expressionsvektoren oder Viruspartikel enthält, vorliegen.
Auch im Schutzumfang der Erfindung liegt ein Verfahren zum Selektieren neuer Bindungspolypeptide, umfassend (a) das Konstruieren einer Bibliothek replizierbarer Expressionsvektor-Varianten, umfassend ein Transkriptionsregulationselement, das operabel an eine Genfusion gebunden ist, die für ein Fusionsprotein kodiert, worin die Genfusion ein erstes Gen, das für das zyklische Peptid der Erfindung kodiert, und ein zweites Gen, das für zumindest einen Abschnitt eines Phagen-Hüllproteins kodiert, umfasst, worin die Expressionsvektor-Varianten erste Gen-Varianten umfassen; (b) das Transformieren geeigneter Wirtszellen mit den Vektoren; (c) das Kultivieren der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die zum Bilden von rekombinanten Phagen- oder Phagemid-Viruspartikeln, die zumindest einen Abschnitt des Expressionsvektors enthalten und in der Lage sind, den Wirt zu transformieren, geeignet sind, sodass die Partikel eine oder mehrere Kopien des Fusionsproteins an der Oberfläche des Partikels darbieten; (d) das Kontaktieren der Partikel mit einem Targetmolekül, sodass sich zumindest ein Teil der Partikel an das Targetmolekül bindet; und (e) das Trennen der Partikel, die sich binden, von jenen, die sich nicht binden.
Im Verfahren der Erfindung ist das Phagen-Hüllprotein vorzugsweise das Gen-III- oder Gen-VIII-Hüllprotein eines filamentösen Phagen wie beispielsweise M13. Weiters erfolgt das Kultivieren der transformierten Wirtszellen vorzugsweise unter Bedingungen, die für die Bildung rekombinanter Phagen- oder Phagemidpartikel geeignet sind, worin die Bedingungen so angepasst werden, dass nicht mehr als eine geringe Menge an Phagen- oder Phagemidpartikel eine oder mehrere Kopien des Fusionsproteins an der Oberfläche des Partikels darbieten (einwertiges Display).
Die Erfindung bindet auch ein Verfahren zum Einführen struktureller Neigung in eine Phagen-dargebotene Bibliothek ein, das die oben beschriebenen Schritte (a) bis (e) verwendet. Die Erfindung umfasst weiters ein Verfahren zum Selektieren von β-Haarnadel bildenden Paptidstrukturen aus einer Phagen-dargebotenen Bibliothek, das die oben beschriebenen Schritte (a) bis (e) verwendet, worin das Target dafür bekannt ist, β-Haarnadel-Peptidstrukturen zu binden, vorzugsweise ein Protein-Target, das für solche Bindung bekannt ist.
Bakteriophagen- (Phagen-) Display ist ein bekanntes Verfahren, durch das Polypeptid-Varianten als Fusionsproteine zum Hüllprotein an der Oberfläche von Bakteriophagenpartikeln dargeboten werden (J. K. Scott & G. P. Smith, Science 249, 386 (1990)). Die Nützlichkeit von Phagendisplay liegt in der Tatsache, dass große Bibliotheken von selektiv randomisierten Proteinvarianten (oder zufällig klonierte cDNAs) rasch und effizient auf jene Sequenzen aussortiert werden können, die sich an das Targetmolekül mit hoher Affinität binden. Display von Peptid- (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378 (1990)) oder Protein- (Lowman et al., Biochemistry 30, 10832 (1991); Clackson et al., Nature 352, 624 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991); Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8363 (1991)) Bibliotheken an Phagen wurden verwendet, um Millionen an Polypeptiden auf jene mit spezifischen Bindungseigenschaften zu screenen (G. P. Smith, Current Opin. Biotechnol. 2, 668 (1991)). Das Sortieren von Phagenbibliotheken auf zufällige Mutanten erfordert eine Strategie zur Konstruktion und Fortpflanzung einer großen Zahl an Varianten, ein Verfahren zur Affinitätsreinigung unter Verwendung des Target-Rezeptors und ein Mittel zur Bewertung der Resultate von Bindungsbereicherungen. US 5.223.409 ; US 5.403.484 ; US 5.571.689 ; US 5.663.143 .
Typischerweise werden Polypeptid-Varianten, wie beispielsweise die zyklischen Verbindungen der Erfindung, an ein Gen-III-Protein fusioniert, das an einem Ende des Virions dargeboten ist. Alternativ dazu können die Polypeptid-Varianten an das Gen-VIII-Protein fusioniert werden, das das Haupt-Hüllprotein des Virions ist. Solche mehrwertigen Display-Bibliotheken werden durch Ersetzen des Phagengens III durch eine cDNA, die für die fremde Sequenz kodiert, die an den Amino-Terminus des Gen-III-Proteins fusioniert ist, konstruiert.
Einwertiges Phagendisplay ist ein Verfahren, in dem eine Protein- oder Peptidsequenz an einen Abschnitt eines Gen-III-Proteins fusioniert und bei geringen Konzentrationen in Gegenwart von Wildtyp-Gen-III-Protein exprimiert wird, sodass Partikel hauptsächlich Wildtyp-Gen-III-Protein und eine Kopie oder keine des Fusionsproteins darbieten (Bass et al., Proteins 8, 309 (1990); H. B. Lowman und J. A. Wells, Methods: a Companion to Methods in Enzymology 3, 205 (1991)). Einwertiges Display hat den Vorteil gegenüber mehrwertigem Phagendisplay, dass Nachkommenschafts-Phagemidpartikel die gesamte Infektiosität beibehalten. Aviditätseffekte werden reduziert, sodass das Aussortieren auf der Grundlage intrinsischer Ligandenaffinität erfolgt, und Phagemid-Vektoren, die DNA-Manipulationen erleichtern, werden verwendet. Siehe auch US 5.750.373 und US 5.780.279 . Andere verwendeten auch Phagemide, um Proteine, insbesondere Antikörper, darzubieten. US 5.667.988 ; US 5.759.817 ; US 5.770.356 ; und US 5.658.727 .
Verfahren zur Herstellung von Peptidbibliotheken und zum Screenen dieser Bibliotheken sind auch in US 5.723.286 ; US 5.432.018 ; US 5.580.717 ; US 5.427.908 ; und US 5.498.530 offenbart. Siehe auch US 5.770.434 ; US 5.734.018 ; US 5.698.426 ; US 5.763.192 und US 5.723.323 .
Ein zweistufiger Ansatz kann verwendet werden, um hohe Affinitätsliganden aus Peptidbibliotheken zu selektieren, die an M13-Phagen dargeboten sind. Geringe Affi nitäts-Leitstrukturen werden zuerst aus naiven, mehrwertigen Bibliotheken selektiert, die an den Haupt-Hüllproteinen (Protein VIII) dargeboten sind. Die Selektanten mit niedriger Affinität werden in weiterer Folge auf das Gen-III-Nebenhüllprotein transferiert und zu hoher Affinität in einem mehrwertigen Format gereift.
Obwohl die meisten Phagendisplay-Verfahren bisher filamentöse Phagen verwendeten, sind auch Lambdoid-Phagendisplay-Systeme (WO 95/34683; US 5.627.024 ), T4-Phagendisplay-Systeme (Ren et al., Gene 215, 439 (1998); Zhu, CAN 33, 534 (1997); Jiang et al., CAN 128, 44380 (1997); Ren et al., CAN 127, 215644 (1997); Ren, Protein Sci. 5, 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes 10, 173 (1995)) und T7-Phagendisplay-Systeme (Smith & Scott, Methods in Enzymology 217, 228–257 (1993); US 5.766.905 ) bekannt und können verwendet werden, um eine Bibliothek der zyklischen Peptide der Erfindung zu schaffen.
Geeignete Gen-III-Vektoren zum Display von zyklischen Peptiden der Erfindung umfassen fUSE5 (J. K. Scott & G. P. Smith, Science 249, 386–390 (1990)); fAFF1 (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378–6382 (1990)); fd-CAT1 (McCafferty et al., Nature (London) 348, 552–554 (1990)); m663 (Fowlkes et al., Biotechniques 13, 422–427 (1992)); fdtetDOG, pHEN1 (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19, 4133–4137 (1991)); pComb3 (Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3576–3580 (1992)); pCANTAB 5E (Pharmacia); und LamdaSurfZap (Hogrefe, Gene 137, 85–91 (1993)).
Phagendisplay-Verfahren für Proteine, Peptide und mutierte Varianten davon, die das Konstruieren einer Familie replizierbarer Vektor-Varianten, die ein Transkriptionsregulationselement enthalten, das operabel an eine Genfusion gebunden ist, die für ein Fusionspolypeptid kodiert, das Transformieren geeigneter Wirtszellen, das Kultivieren der transformierten Zellen, um Phagenpartikel zu bilden, die das Fusionspolypeptid an der Oberfläche des Phagenpartikels darbieten, das Kontaktieren der rekombinanten Phagenpartikel mit einem Targetmolekül, sodass sich zumindest ein Abschnitt des Partikels an das Target bindet, das Trennen der Partikel, die sich bin den, von jenen, die sich nicht binden, einbinden, sind bekannt und können zusammen mit dem Verfahren der Erfindung verwendet werden.
Siehe U.S. 5.750.373; WO.97/09446; U.S. 5.514.548; U.S. 5,498.538; U.S. 5.516.637; U.S. 5.432,018; WO 96/22393; U.S. 5.658,727; U.S. 5.627,024; WO 97/29185; O'Boyle et al. (1997) Virology 236: 338–347; Soumillion et al. (1994) Appl. Biochem. Biotech. 47: 175–190; O'Neil and Hoess. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 443–449; Makowski (1993) Gene 128: 5–11; Dunn (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 547–553; Choo and Klug (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 431–436; Bradbury & Cattaneo (1995) TINS 18: 242–249; Cortese et al., (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 73–80; Allen et al. (1995) TIBS 20: 509–516; Lindquist & Naderi (1995) FEMS Micro. Rev. 17: 33–39; Clarkson & Wells (1994) Tibtech. 12: 173–184; Barbas (1993) Curr. Opin. Biol. 4: 526–530; McGregor (1996) Mol. Biotech. 6: 155–162; Cortese et al. (1996) Curr. Opin. Biol. 7: 616–621; McLafferty et al. (1993) Gene 128: 29–36.
Das für das Hüllprotein des Phagen kodierende Gen und das für den erwünschten zyklischen Polypeptidabschnitt des Fusionsproteins der Erfindung (d.h. des zyklischen Peptids der Erfindung, das an zumindest einen Abschnitt eines Phagen-Hüllproteins fusioniert ist) kodierende Gen können mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren erhalten werden (siehe im Allgemeinen Sambrook et al.). Die für das Gen kodierende DNA kann chemisch synthetisiert (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)) und dann mutiert werden, um eine wie nachstehend beschriebene Bibliothek von Varianten zu bilden.
Um DNA-Fragmente zu ligieren, um einen funktionellen Vektor zu bilden, der die Genfusion enthält, müssen die Enden der DNA-Fragmente untereinander kompatibel sein. In manchen Fällen sind die Enden nach Endonucleaseverdau direkt kompatibel. Es kann jedoch erforderlich sein, zuerst die klebrigen Enden, die üblicherweise durch Endonucleaseverdau produziert werden, zu glatten Enden umzusetzen, um sie für Ligation kompatibel zu machen. Um die Enden zu glätten, wird die DNA in einem geeigneten Puffer mindestens 15 min lang bei 15°C mit 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate behandelt. Die DNA wird dann durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung oder ein anderes DNA-Reinigungsverfahren gereinigt.
Die gespalteten DNA-Fragmente können nach ihrer Größe getrennt und unter Verwendung von DNA-Gelelektrophorese ausgewählt werden. Die DNA kann entweder durch eine Agarose oder eine Polyacrylamid-Matrize Elektrophorese unterzogen werden. Die Auswahl der Matrize hängt von der Größe der zu trennenden DNA-Fragmente ab. Nach Elektrophorese wird die DNA aus der Matrize mittels Elektroelution oder, sofern niedrig-schmelzende Agarose als Matrize verwendet wurde, durch Schmelzen der Agarose und Extrahieren der DNA daraus, wie in den Abschnitten 6.30–6.33 von Sambrook et al. beschrieben wird, extrahiert.
Die DNA-Fragmente, die aneinander ligiert werden sollen (die davor mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut wurden, sodass die Enden jedes zu ligierenden Fragments kompatibel sind), werden in etwa äquimolaren Mengen in Lösung gegeben. Die Lösung enthält auch ATP, Ligasepuffer und eine Ligase wie beispielsweise T4-DNA-Ligase zu etwa 10 Einheiten pro 0,5 μg DNA. Sofern das DNA-Fragment in einen Vektor zu ligieren ist, wird der Vektor durch Schneiden mit der/den geeigneten Restriktionsendonuclease(n) zuerst linearisiert. Der linearisierte Vektor wird dann mit alkalischer Phosphatase oder Kalbsintestinalphosphatase behandelt. Das Phosphatisieren unterbindet Selbstligation des Vektors während des Ligationsschrittes.
Nach der Ligation wird der Vektor mit dem nun insertierten Fremdgen gereinigt und in eine geeignete Wirtszelle transformiert. Ein bevorzugtes Transformationsverfahren ist Elektroporation. Elektroporation kann unter Verwendung auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren, wie sie beispielsweise in US 4.910.140 ; US 5.186.800 ; US 4.849.355 ; US 5.173.158 ; US 5.098.843 ; US 5.422.272 ; US 5.232.856 ; US 5.283.194 ; US 5.128.257 ; US 5.750.373 ; US 4.956.288 beschrieben werden, oder unter Einsatz jedes beliebigen Chargen- oder kontinuierlichen Elektroporationsverfahrens durchgeführt werden. Mehr als eine (eine Vielzahl an) Elektroporation kann durchgeführt werden, um die Menge an DNA zu steigern, die in die Wirtszellen transformiert wird. Wiederholte Elektroporationen werden wie auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben durchgeführt. Siehe Vaughan et al., Nature Biotechnology 14, 309–314 (1996). Die Anzahl an zusätzlichen Elektroporationen kann je nach Bedarf von mehreren (2, 3, 4, ..., 10) bis zu mehreren Dutzend (20, 30, ..., 100) und sogar Hun derten (100, 200, 300, ..., 1000) variieren. Wiederholte Elektroporationen können erwünscht sein, um die Größe einer kombinatorischen Bibliothek, z.B. einer Antikörperbibliothek, die in die Wirtszellen transformiert wird, zu steigern.
Vorzugsweise ist zur Bibliothekskonstruktion die DNA in einer Konzentration von 25 μg/ml oder mehr vorhanden. Noch bevorzugter ist die DNA in einer Konzentration von etwa 30 μg/ml oder mehr, noch bevorzugter in einer Konzentration von etwa 70 μg/ml oder mehr und noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von etwa 100 μg/ml oder mehr bis hin zu mehreren Hunderten an μg/ml vorhanden. Im Allgemeinen werden bei Elektroporation DNA-Konzentrationen von etwa 50 bis etwa 500 μg/ml verwendet. Eine Zeitkonstante während. Elektroporation von mehr als 3,0 Millisekunden (ms) resultiert in einer hohen Transformationseffzienz.
Die DNA wird vorzugsweise gereinigt, um Kontaminanten zu entfernen. Die DNA kann durch jedes bekannte Verfahren gereinigt werden, wobei jedoch ein bevorzugtes Reinigungsverfahren die Verwendung von DNA-Affinitätsreinigung ist. Die Reinigung von DNA, z.B. rekombinanter Plasmid-DNA, unter Verwendung von DNA-Bindungsharzen und Affinitätsreagenzien ist bekannt, und jedes der bekannten Verfahren kann im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden (B. Vogelstein & D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615 (1979); W. Callen, Strategies 6, 52–53 (1993)). Im Handel erhältliche DNA-Isolations- und -Reinigungssets sind auch bei diversen Quellen erhältlich, einschließlich Stratagene (CLEARCUT Miniprep Kit) und Life Technologies (GLASSMAX DNA Isolation Systems). Geeignete, nicht einschränkende Verfahren zur DNA-Reinigung umfassen Säulenchromatographie ( US 5.707.812 ), die Verwendung von hydroxylierten Silical-Polymeren ( US 5.693.785 ), rehydriertem Kieselgel ( US 4.923.978 ), borierten Silicaten ( US 5.674.997 ), modifizierten Glasfasermembranen ( US 5.650.506 ; US 5.438.127 ), fluorierten Adsorptionsmitteln ( US 5.625.054 ; US 5.438.129 ), Diatomeenerde ( US 5.075.430 ), Dialyse ( US 4.921.952 ), Gelpolymeren ( US 5.106.966 ) und die Verwendung von chaotropen Verbindungen mit DNA-Bindungsmittel ( US 5.234.809 ). Nach der Reinigung wird die DNA eluiert oder anders in Wasser, vorzugsweise in destilliertem oder entionisiertem Wasser, zur Verwendung bei Elektroporation zu den Konzentrationen der Erfindung resuspendiert. Die Verwendung von gering salzhältigen Pufferlösungen wird auch erwogen.
Jede beliebigen geeigneten Zellen, die mittels Elektroporation transformiert werden können, können als Wirtszellen im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Wirtszellen, die transformiert werden können, umfassen gramnegative Bakterienzellen wie beispielsweise E. coli. Geeignete E.-coli-Stämme umfassen JM101, E. coli K12 Stamm 294 (ATCC-Nummer 31.446), E.-coli-Stamm W3110 (ATCC-Nummer 27.325), E. coli X1776 (ATCC-Nummer 31.537), E. coli XL-1 Blue (Stratagene) und E. coli B; es können jedoch andere Stämme von E. coli, wie beispielsweise XL1-Blue MRF', SURE, ABLE C, ABLE K, WM1100, MC1061, HB101, CJ136, MV1190, JS4, JS5, NM522, NM538 und NM539 ebenso verwendet werden. Zellen werden unter Verwendung bekannter Verfahren kompetent gemacht. Sambrook et al., s.o., 1.76–1.81, 16.30.
Zellkonzentrationen von etwa 10¹⁰ koloniebildenden Einheiten (KBE/ml) lebensfähiger lebender Zellen und mehr werden vorzugsweise zur Elektroporation verwendet. Noch bevorzugter sind die lebensfähigen Zellen zu etwa 1 × 10¹¹ bis etwa 4 × 10¹¹ KBE/ml konzentriert. Bevorzugte Zellen, die zu diesem Bereich konzentriert werden können, sind die SS320-Zellen, die nachstehend beschrieben werden. Zellen werden vorzugsweise in Kultur in Standard-Kulturmedium gezüchtet, gegebenenfalls etwa 6 bis 48 h lang (oder bis zu OD₆₀₀ = 0,6–0,8) bei etwa 37°C, und das Medium wird zentrifugiert und der Überstand entfernt (z.B. dekantiert). Anfängliche Reinigung erfolgt vorzugsweise durch Resuspendieren des Zellpellets in einer Pufferlösung (z.B. HEPES pH 7,4), gefolgt von neuerlichem Zentrifugieren und Entfernen von Überstand. Das resultierende Zellpellet wird in verdünntem Glycerin (z.B. 5–20 Vol.-%) resuspendiert und wiederum zentrifugiert, um ein Zellpellet zu bilden, und der Überstand wird entfernt. Die End-Zellkonzentration wird durch Resuspendieren des Zellpellets in Wasser oder verdünntem Glycerin zur erwünschten Konzentration erhalten.
Eine besonders bevorzugte Rezipientenzelle zur Elektroporation ist ein kompetenter E.-coli-Stamm, der ein Phagen-F'-Episom enthält. Jedes F'-Episom, das Phagen replikation im Stamm ermöglicht, kann im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Geeignete Episome sind aus Stämmen erhältlich, die bei der ATCC hinterlegt oder im Handel erhältlich sind (CJ236, CSH18, DH5alphaF', JM101, JM103, JM105, JM107, JM109, JM110, KS1000, XL1-BLUE, 71–18 und andere). Der Stamm SS320 wurde durch Paarung von MC1061-Zellen mit XL1-BLUE-Zellen unter ausreichenden Bedingungen, um das Fertilitäts-Episom (F'-Plasmid) von XL1-BLUE in die MC1061-Zellen zu übertragen, hergestellt. Im Allgemeinen ist das Vermischen von Kulturen der zwei Zelltypen und das etwa einstündige Wachsenlassen des Gemisches in Kulturmedium bei 37°C ausreichend, um das Auftreten von Paarung und Episomtransfer zu ermöglichen. Der neue resultierende E.-coli-Stamm weist den Genotyp von MC1061, der einen Streptomycinresistenz-Chromosomenmarker trägt, und den Genotyp des F'-Plasmids, der Tetracyclinresistenz verleiht, auf. Die Nachkommenschaft dieser Paarung ist gegenüber beiden Antibiotika resistent und kann selektiv in der Gegenwart von Streptomycin und Tetracyclin gezüchtet werden. Stamm SS320 wurde bei der Amercian Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA, am 18. Juni 1998 hinterlegt und bekam die Hinterlegungs-Zugriffsnummer 98795 zugeteilt.
Diese Hinterlegung von Stamm SS320 erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur über 30 Jahre hinweg vom Datum der Hinterlegung an. Die Organismen werden durch ATCC unter Berücksichtigung der Bestimmungen des Budapester Vertrages zugänglich gemacht und unterliegen einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC, das die permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft dieser Kulturen für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung einer jeden US- oder fremdländischen Patentanmeldung, je nachdem was zuerst erfolgt, sicherstellt und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsidenten des Patentamtes der Vereinigten Staaten bestimmt wird, hierzu gemäß 35 USC § 122 und den demgemäßen Vorschriften des Präsidenten (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Hinweis auf 886 OG 638) befähigt zu sein, garantiert.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung erklärte sich bereit, die hinterlegten Kulturen, sollten sie trotz Kultivierens bei geeigneten Bedingungen sterben oder verloren gehen oder zerstört werden, unverzüglich nach Kenntnisnahme durch ein lebensfähiges Muster derselben Kultur zu ersetzen. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Kulturen ist nicht als eine Genehmigung zu verstehen, die Erfindung unter Verstoß gegen die Rechte, die unter der behördlichen Autorität einer jeden Regierung gemäß ihren Patentgesetzen garantiert werden, zu praktizieren.
Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Substitution, Deletion und Insertion von Varianten der Erfindung. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet der Erfindung, wie von Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10, 6487–6504 (1987), beschrieben, bekannt. Kurz zusammengefasst wird ein Gen, das für eine Proteinfusion oder ein heterologes Polypeptid kodiert, durch Hybridisieren eines Oligonucleotids, das für die erwünschte Mutation kodiert, an eine DNA-Matrize verändert, worin die Matrize die einzelsträngige Form des Plasmids ist, das die unveränderte oder native DNA-Sequenz des Gens enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen gesamten zweiten komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren, der somit den Oligonucleotid-Primer einbindet und für die ausgewählte Veränderung im Gen kodieren wird. Im Allgemeinen werden Oligonucleotide mit einer Länge von zumindest 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid umfasst 12 bis 15 Nucleotide, die an jeder Seite des/der Nucleotids/Nucleotide, das/die für die Mutation kodiert/kodieren, völlig komplementär zur Matrize sind. Dies garantiert, dass das Oligonucleotid korrekt an das einzelsträngige DNA-Matrizenmolekül hybridisiert. Die Oligonucleotide können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise jenen, die von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 5765 (1978), beschrieben werden, leicht synthetisiert werden.
Die DNA-Matrize wird durch jene Vektoren erzeugt, die vom Bakteriophagen abgeleitet sind, die im Phagendisplay-System verwendet werden, z.B. Bakteriophagen-M13-Vektoren (die im Handel erhältlichen M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind geeignet), oder durch jene Vektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten; Beispiele sind von Viera et al. in Meth. Enzymol. 153, 3 (1987), beschrieben. Somit kann die DNA, die es zu mutieren gilt, in einen dieser Vektoren insertiert werden, um eine einzelsträngige Matrize zu bilden. Die Herstellung der einzelsträngigen Matrize ist in den Abschnitten 4.21–4.41 von Sambrook et al. beschrieben.
Um die native DNA-Sequenz zu ändern, wird das Oligonucleotid an die einzelsträngige Matrize unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, üblicherweise T7-DNA-Polymerase oder das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird dann hinzugefügt, um den komplementären Strang der Matrize unter Verwendung des Oligonucleotids als einen Primer für die Synthese zu synthetisieren. Ein Heteroduplex-Molekül wird somit gebildet, sodass ein Strang der DNA für die mutierte Form des Gens kodiert und der andere Strang (die ursprüngliche Matrize) für die native, unveränderte. Sequenz des Gens kodiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle, üblicherweise einen Prokaryoten wie beispielsweise E. coli JM101, transformiert. Nach dem Züchten der Zellen werden diese auf Agarose-Platten ausplattiert und unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers, der mit 32-Phosphat radioaktiv markiert ist, um die bakteriellen Kolonien zu identifizieren, die die mutierte DNA enthalten, gescreent.
Das oben beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, dass ein Homoduplex-Molekül geschaffen wird, in dem beide Stränge des Plasmids die Mutation(en) enthalten. Die Modifikationen sind wie folgt: Das einzelsträngige Oligonucleotid wird an die einzelsträngige Matrize wie zuvor beschrieben anelliert. Ein Gemisch von drei Desoxyribonucleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP), wird mit einem modifizierten Thiodesoxyribocytosin, das die Bezeichnung dCTP-(aS) trägt (erhalten bei Amersham), kombiniert. Dieses Gemisch wird dem Matrizen-Oligonucleotid-Komplex hinzugefügt. Beim Zusetzen von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wird ein Strang von DNA, der mit der Matrize unter Ausnahme der mutierten Basen identisch ist, hergestellt. Darüber hinaus enthält der neue DNA-Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP, was dazu dient, ihn vor Restriktionsendonuclease-Verdau zu schützen. Nachdem der Matrizenstrang des doppelsträngigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym genickt wurde, kann der Matrizenstrang mit ExoIII-Nuclease oder einer anderen geeigneten Nuclease nach der Region, die die einer Mutagenese zu unterziehenden Stelle(n) enthält, verdaut werden. Die Reaktion wird dann gestoppt, um ein Molekül zurückzulassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein kompletter doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird dann unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleotid-Triphosphate, ATP und DNA-Ligase gebildet. Dieses Homoduplexmolekül kann dann in eine geeignete Wirtszelle wie beispielsweise E. coli JM101 wie zuvor beschrieben transformiert werden.
Mutanten mit mehr als einer zu substituierenden Aminosäure können auf eine von mehreren verschiedenen Arten hergestellt werden. Sofern die Aminosäuren in der Polypeptidkette eng aneinander angeordnet sind, können sie unter Verwendung eines Oligonucleotids, das für alle der erwünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert, gleichzeitig mutiert werden. Sind die Aminosäuren jedoch in einer bestimmten Distanz zueinander (durch mehr als etwa zehn Aminosäuren getrennt) angeordnet, so ist es schwieriger, ein einzelnes Oligonucleotid zu bilden, das für alle erwünschten Änderungen kodiert. Anstelle dessen können ein oder zwei alternative Verfahren verwendet werden.
Beim ersten Verfahren wird für jede zu substituierende Aminosäure ein eigenes Oligonucleotid gebildet. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Matrizen-DNA anelliert, und der zweite Strang der DNA, der aus der Matrize synthetisiert wird, kodiert für alle der erwünschten Aminosäuresubstitutionen. Das alternative Verfahren bindet zwei oder mehrere Mutagenese-Durchgänge ein, um die erwünschte Mutante zu bilden. Der erste Durchgang wird für die einzelnen Mutanten beschrieben: Wildtyp-DNA wird für die Matrize verwendet, ein Oligonucleotid, das für die erste(n) erwünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodiert, wird an diese Matrize anelliert, und dann wird das Heteroduplex-DNA-Molekül gebildet. Im zweiten Mutagenese-Durchgang wird die mutierte DNA, die im ersten Mutagenese-Durchgang gebildet wurde, als Matrize verwendet. Somit enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutationen. Das Oligonucleotid, das für die zusätzliche(n) erwünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodiert, wird dann an diese Matrize anelliert, und der resultierende DNA-Strang kodiert nun für Mutationen sowohl aus dem ersten als auch dem zweiten Mutagenese-Durchgang. Diese resultierende DNA kann als Matrize in einem dritten Mutagenese-Durchgang verwendet werden usw.
Kassetten-Mutagenese ist auch ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten der Erfindung. Das Verfahren basiert auf jenem, das von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), beschrieben wurde. Das Ausgangsmaterial ist ein Plasmid (oder ein anderer Vektor), der das zu mutierende Gen enthält. Das/Die Codon(s) im zu mutierenden Gen werden identifiziert. An jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) muss es eine einmalige Restriktionsendonuclease-Stelle geben. Bestehen keine solchen Restriktionsstellen, so können sie unter Verwendung des zuvor beschriebenen, Oligonucleotid-vermittelten Mutageneseverfahrens, durch das sie an geeigneten Stellen im Gen eingeführt werden, gebildet werden. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden waren, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, das jedoch die erwünschte(n) Mutation(en) enthält, wird unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren synthetisiert. Die zwei Stränge werden getrennt synthetisiert und dann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren aneinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als die Kassette bezeichnet. Diese Kassette wird so modelliert, dass sie 3'- und 5'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, sodass sie direkt an das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte DNA-Sequenz des Gens. Vektoren, die die mutierten Varianten enthalten, können zu geeigneten Wirtszellen wie zuvor beschrieben transformiert werden.
Die transformierten Zellen werden im Allgemeinen durch Züchten auf einem Antibiotikum, üblicherweise auf Tetracyclin (tet) oder Ampicillin (amp), dem gegenüber sie durch die Gegenwart von tet- und/oder amp-Resistenzgenen im Vektor resistent gemacht werden, selektiert.
Geeignete Phagen- und Phagemid-Vektoren zur Verwendung in dieser Erfindung umfassen alle bekannten Vektoren zum Phagendisplay. Zusätzliche Beispiele umfassen pComb8 (Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576–3580); pC89 (Felici et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 310–310); pIF4 (Bianchi et al. (1995) J. Mol. Biol. 247: 154–160); PM48, PM52, and PM54 (Iannolo. (1995) J. Mol. Biol 248: 835–844); fdH (Greenwood et al. (1991) J. Mol. Biol. 220: 821–827); pfd8SHU, pfd8SU, ptd8SY, and fdISPLAY8 (Malik & Perham (1996) Gene 171: 49–51); "88" (Smith (1993) Gene 128: 1–2); f88.4 (Zhong et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 24183–24188); p8V5 (Affymax); MB1, MB20, MB26, MB27, MB28, MB42, MB48, MB49, MB56; (Markland et al. (1991) Gene 109: 13–19).
Dem ähnlich können jegliche bekannten Helfer-Phagen verwendet werden, wenn ein Phagemid-Vektor im Phagendisplay-System verwendet wird. Beispiele für geeignete Helfer-Phagen schließen M13-KO7 (Pharmacia), M13-VCS (Stratagene) und R408 (Stratagene) ein.
Nach der Selektion der transformierten Zellen werden diese Zellen in Kultur gezüchtet, und die Vektor-DNA kann dann isoliert werden. Phagen- oder Phagemid-Vektor-DNA kann unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, beispielsweise wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), beschrieben, isoliert werden.
Die isolierte DNA kann mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren, die beispielsweise in Abschnitt 1.40 von Sambrook et al., s.o., beschrieben werden bzw. zuvor bereits beschrieben wurden, gereinigt werden. Diese gereinigte DNA kann dann mittels DNA-Sequenzieren analysiert werden. DNA-Sequenzieren kann durch das von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), beschriebene Verfahren, das von Maxam et al., Meth. Enzymol. 65, 499 (1980), beschriebene Verfahren oder durch jedes andere bekannte Verfahren erfolgen.
V. Anwendungen
Die verschiedenen Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zeigen die Vorteile eines neuen Modellsystems zum rationalen Design und Analysieren von Peptiden mit definierten strukturellen Eigenschaften auf. Die kombinatorischen Bibliotheken, die solche Peptide umfassen, und Verfahren zur Verwendung dieser liefern nützliche Informationen und Werkzeuge zur Untersuchung der grundlegenden Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität, die in beinahe alle biologischen molekularen Wechselwirkungen eingebunden sind. Die hierin offenbarten oder gemäß der Offenbarung der Erfindung gebildeten Peptide können Kandidaten für verschiedene biologische oder therapeutische Wirkstoffe sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Enzym-Inhibitoren, Liganden-Antagonisten, Liganden-Agonisten, Toxine und Immunogene.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung der Erfindung bereitgestellt. Alle Offenbarungen der hierin zitierten Verweise sind in ihrer Gesamtheit hierin ausdrücklich durch Verweis eingebunden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Design eines strukturierten, Disulfid-eingeschränkten β-Haarnadel-Peptidgerüsts
In diesem Beispiel befassten sich die Erfinder mit der Untersuchung von Disulfid-eingeschränkten β-Haarnadeln der Decamere in Form von CX₈C als Gerüste für β-Kehren-Display. Für diesen Zweck ist es wesentlich, eine Struktur zu modellieren, die mit zahlreichen Kehrensequenzen kompatibel ist. Das bedeutet, dass Reste, die sich von jenen in den Kehren unterscheiden, dem Peptid eine deutliche Neigung zur Haarnadelstruktur verleihen müssen. Disulfid-Zyklisierung ist hilfreich, obwohl sie in zahlreichen Fällen nicht ausreichend ist, um Peptide zu strukturieren. Das anfängliche Ziel der Erfinder war es, zu bestimmen, ob die Disulfid-Bindung nicht nur als eine kovalente Einschränkung verwendet werden könnte, sondern auch dafür, Nukleation einer ausführlicheren Wechselwirkung der β-Stränge zu vermitteln.
Materialien und Verfahren
Peptidsynthese. Peptide wurden unter Verwendung von Fmoc-Chemie an einem Pioneer-Synthesegerät (PE Biosystems) synthetisiert, vom Harz mit 5% Triisopropylsilan in Trifluoressigsäure (TFA) gespaltet und durch Umkehrphasen-HPLC (Acetonitril/H₂O/0,1% TFA) gereinigt. Peptididentität wurde durch Massenspektrometrie bestätigt. Die Peptide wurden zu zyklischen Disulfiden durch Zutropfen einer gesättigten Lösung von I₂ in Essigsäure umgesetzt und durch HPLC neuerlich gereinigt. Die gereinigten Peptide eluierten als einzelne symmetrische Peaks an analytischen C18-Säulen (0–40% Acetonitril in 40 Minuten).
Messungen effektiver Cystein-Konzentrationen. Glutathion-Stammlösungen wurden durch Vermischen von 3 Volumina von 0,2 M reduziertem Glutathion (GSH) mit 1 Volumen von 0,1 M oxidiertem Glutathion (GSSG) hergestellt. Aliquoten wurden bei –80°C gelagert und waren über mehrere Monate hinweg stabil; die Verwendung einer einzelnen Charge räumte jeglichen Fehler in den ΔΔG-Werten aus, die aus der Variabilität der Gesamt-Glutathionkonzentrationen hervorgehen könnten. Thiol-Disulfid-Gleichgewichte wurden durch Vermischen von 50 μl Peptidmaterial (etwa 3 mM in Wasser) mit 50 μl Glutathionmaterial, Desoxidieren der sauren Lösung mit Vakuum/Argon-Zyklen aus einem Firestone-Ventil, anschließendes Zusetzen von 300 μl desoxidiertem Puffer mittels Spritze (0,2 M Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA; 67 mM Tris-Base zum Titrieren von Glutathion), gefolgt von weiterer Desoxidation des Gemisches erstellt. Der End-pH von allen Reaktionsgemischen betrug 8,10 ± 0,05. Lösungen wurden unter Argon gerührt und auf 20°C in einem Wasserbad gehalten. Nach anschließenden 1,5 h wurden Aliquoten (100 μl) mit einer gasdichten Spritze entfernt, sofort durch Abgabe in 400 μl 3,1 mM HCl gequencht und mittels HPLC bei minimaler Zeitverzögerung analysiert. C_eff-Werte wurden aus den Molverhältnissen der reduzierten und oxidierten Formen von Peptid und Glutathion (Peakbereich- Verhältnisse korrigiert für Absorptionsdifferenzen, die durch HPLC gemessen wurden) berechnet, unter der Annahme von 0,025 M Gesamtglutathionmonomer (d.h. unter Vernachlässigung der geringfügigen Menge (< 1%) von Glutathion, die in gemischten Disulfiden mit Peptid vorhanden ist): Ceff = ([PeptidOX]/[Peptidred]) × ([GSH]2/(GSSG]) [GSH] + 2[GSSG] = 0,025 M [GSSG] = 0,025 M/{2 + 3,26 (GSH-Peakbereich/GSSG-Peakbereich)} [PeptidOX]/[Peptidred] = Gleichgewichts-Peakbereich-Verhältnis/Absorptionsverhältnis
Zwei oder drei Proben aus jedem Reaktionsgemisch wurden analysiert: es gab im Laufe der Zeit keine Verschiebungen der Populationen, und berechnete C_eff-Werte schwankten typischerweise um weniger als 5% (äquivalent zu 30 cal/mol Unsicherheit in ΔΔG).
NMR-Spektroskopie. NMR-Proben enthielten 5–10 mM Peptid in 92% H₂O/8% D₂O pH 5,1 und 0,1 mM 1,4-Dioxan als Bezugswert für chemische Verschiebungen. Alle Spektren wurden an einem Bruker-DRX-500 oder einem Varian-Unity-400-Spektrometer bei 15°C erhalten. 2QF-COSY-, TOCSY- und ROESY-Spektren wurden wie beschrieben (Cavanagh et al., Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practices, Academic Press, San Diego (1995)) mittels Gradientenkohärenz-Selektion (van Zijl et al., J. Magn. Reson. 113A, 265–270 (1995)) oder mittels Anregungsformen (Hwang & Shaka, J. Magn. Reson. 112A, 275–279 (1995)) zur Wasserunterdrückung erhalten. Protonenresonanzen wurden mittels herkömmlicher Verfahren (Wüthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, John Wiley and Sons, New York (1986)) zugeordnet. ³J-H^N-H^α wurden durch Anpassen von Lorentzlinien an die Antiphasen-Dubletts von H^N-H^α-Peaks in 2QF-COSY-Spektren erhalten, die zu hoher digitaler Auflösung in F₂ verarbeitet wurden. ³J-H^N-H^α wurden aus COSY-35-Spektren erhalten, die aus D₂O-Lösungen der Peptide erhalten wurden. Distanz- und Diederwinkeleinschränkungen wurden wie beschrieben (Skelton et al., Biochemistry 33, 13581–13592, (1994)) gebildet. 100 anfängliche Strukturen wurden unter Verwendung des Hybriddistanzgeometrie/simulierten Annealing-Programms DGII (Havel et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 56, 43–78 (1991)) berechnet; 80 von diesen wurden durch eingeschränkte Molekulardynamik unter Verwendung des AMBER-Ganzatom-Kraftfeldes, das in DISCOVER wie zuvor beschrieben (Skelton et al., Biochemistry 33, 13581–13592, (1994)) implementiert wurde, weiter verfeinert. 20 Konformationen mit geringster Einschränkungsverletzungsenergie wurden ausgewählt, um die Lösungskonformation von jedem Peptid darzustellen.
Strukturberechnung. Strukturen wurden mit 78 ROE-abgeleiteten Distanzeinschränkungen (10 mittlere und 28 lange Einschränkungen; höhere Bindungen von 5,4, 4,3, 3,4 oder 3,0 Å) und 12 Diederwinkeleinschränkungen berechnet. Die 20 Endstrukturen wiesen eine mittlere maximale Verletzung von Distanz- und Diederwinkeleinschränkungen von 0,05 ± 0,02 Å bzw. 0,7 ± 0,2° auf. RMS-Abweichung von den experimentellen Distanz- und Diederwinkeleinschränkungen betrugen 0,007 ± 0,002 Å bzw. 0,29 ± 0,08°. Die mittlere RMSD der mittleren Struktur beträgt 0,28 ± 0,04 Å für N-, C^α- und C-Atome der Reste Cys1-Cys10, während 75% der Reste ϕ,ψ-Werte innerhalb der am meisten bevorzugten Abschnitte des Ramachandran-Diagramms aufwiesen (und keine in der nicht gestatteten oder mit Nachsicht gestatteten Region) (Laskowski et al., J. Appl. Crystallogr. 26, 283–291 (1993)).
NMR-Analyse. NMR-Proben von CD4-Peptiden enthielten ~2 mM Peptid in 92% H₂O/8% D₂O, pH 3,5, mit 50 μM 3-(Trimethylsilyl)-1-propan-1,1,2,2,3,3,-d₆-sulfonsäure (DSS) als Bezugswert für chemische Verschiebungen. Spektren wurden wie zuvor beschrieben erhalten und analysiert. Die Struktur von cd2 wurde aus 84 (einschließlich 13 mittleren und 23 langen) ROE-abgeleiteten Distanzeinschränkungen und 13 Diederwinkeleinschränkungen berechnet. Die durchschnittlichen maximalen Verletzungen von Distanz- und Diederwinkeleinschränkungen betragen 0,05 ± 0,01 Å bzw. 0,6 ± 0,4°; die RMSDs aus den experimentellen Distanz- und Diederwinkeleinschränkungen betragen 0,009 ± 0,002 Å bzw. 0,2 ± 0,1°. Die kovalente Geometrie ist gut, mit 74% der ϕψ-Winkel innerhalb der am meisten bevorzugten und keine in den nicht gestatteten oder mit Nachsicht gestatteten Regionen des Ramachandran-Diagramms (Laskowski et al., J. Appl. Crystallogr. 26, 283–291 (1993)).
Analyse von Seitenketten-Rotameren. Beobachtung von sowohl ³J_Hα-_Hβ¹ als auch ³J_Hα-_Hβ² Bereich von 6–9 Hz weist darauf hin, dass eine Seitenkette kein einziges klassisches Rotamer besetzt (χ¹ = –60°, +60° oder 180°), was höchstwahrscheinlich für alle drei gestaffelte, Rotamer-Wells gilt. Dies ist der Fall für Trp3 und Leu8 von bhpW und Gln4, Phe7 und Leu8 von cd2. ROE-Peaks, die bezüglich dieser Seitenketten beobachtet wurden, stellen einen Zeitdurchschnitt über dem Bereich von als Proben genommenen χ¹-Werten dar. Nicht alle dieser Konformationen lassen leicht zu beobachtende ROE-Peaks entstehen, wodurch das Strukturberechnungsverfahren zu jenen Rotameren hin verschoben ist, bei denen Einschränkungen erreicht werden konnten. Beispielsweise werden ROEs aus Phe7 von cd2 bei Protonen im gegenüberliegenden Strang beobachtet, wodurch Phe7 gezwungen wird, im +60°-Rotamerwell zu liegen. Angesichts der großen Anzahl an Hauptketten-Hauptketten-Distanz- und ϕ-Diederwinkeleinschränkungen stellen die für bhpW und cd2 berechneten Strukturen exakt die Lösungskonformation dieser Peptide dar, unter Ausnahme der Überbestimmungen bestimmter Seitenkettenausrichtungen.
Ergebnisse
In den Beobachtungen der Erfinder von β-Faltblättern aus einer Reihe von 928 nicht-redundanten Proteinstrukturen betrugen die mittleren C^β-C^β-Distanzen zwischen Wasserstoff-gebunden und nicht Wasserstoff-gebundenen Restepaaren in benachbarten Strängen 4,82 ± 0,58 bzw. 5,37 ± 0,56 Å, während die mittlere C^β-C^β-Distanz in Disulfid-gebundenen Cysteinen 3,84 Å betrug. Daher sind die C^β-Atome von gegenüberliegenden Resten auf antiparallelen Strängen normalerweise für Disulfid-Bindungsbildung zu weit voneinander entfernt. Nichtsdestotrotz werden Disulfid-Vernetzungen manchmal zwischen Cysteinen im Nicht-Wasserstoff-Bindungsregister in β-Faltblättern gefunden. Die Erfinder fanden 23 Disulfid-gebundene Cysteinpaare, die sich an benachbarte antiparallele Stränge anschlossen. In 14 von 23 Fällen packt sich das Disulfid dicht gegen die zwei hydrophoben Seitenkettenreste vor einem (oder beide der) Cystein(e) (1a). In 5 zusätzlichen Fällen war diese hydrophobe Stelle durch einen polaren oder geladenen Rest mit β- und γ-Methylenen (E, Q oder R) besetzt. Insbesondere stellten die Seitenketten entweder von Leucin oder einer aromatischen Aminosäure gute Formkomplementarität zu dieser charakteristischen Disulfidkonformation bereit. Demgemäß wählten die Erfinder Leucin als Rest 8 in ihrem Modellpeptid (1b), banden Threonine an den Positionen 2 und 9 ein, um eine verlängerte Hauptkettenkonformation zu fördern, und wählten die Kehrensequenz EGNK als eine repräsentative, aber nicht allzu starke β-Kehre vom Typ II'. Um die beste Kreuzstrang-Paarung mit Leucin zu bestimmen, wurde Position 3 variiert.
Die Gegenwart eines Disulfids stellt eine gute Sonde für Haarnadelstabilität bereit. Thioldisulfid-Gleichgewichte wurden relativ zum Bezug Thiolglutathion gemessen, wobei wirksame Konzentrationen (C_eff) für die Cysteinpaare erhalten wurden. Größere Werte für C_eff weisen im Durchschnitt auf eine gesteigerte Nähe der Cysteinthiole hin, was mit der Bildung der Haarnadelstruktur übereinstimmt. Peptid-C_eff-Werte variierten signifikant bei verschiedenen Resten an Position 3 (2a). Erstaunlicherweise verschob Tryptophan an Position 3 das Peptidgleichgewicht stark in Richtung der oxidierten Form: dieses Verhaften wurde nicht durch Peptidaggregation verursacht. Das Vergleichen der C_eff-Werte mit jenen des Alaninanalogons (–RTIn{C_eff,x/C_eff,ala}) ergab Differenzen der freien Energie von > 0,8 kcal/mol (2b), die als die relativen Tendenzen der Peptide, sich zu falten, interpretiert werden können. Diese Daten unterscheiden jedoch nicht zwischen Wirkungen auf gefaltete und nicht gefaltete Zustände des Peptids. Beispielsweise kann eine bestimmte Substitution günstige Seitenkettenpackung im oxidierten Peptid fördern oder einfach eine Neigung zur verlängerten Hauptkettenkonformation im reduzierten Peptid verleihen.
Um zu bewerten, ob die Peptide tatsächlich β-Haarnadeln bildeten, wurden mehrere von ihnen durch ¹H-NMR-Spektroskopie ausgewertet (Tabelle 1). Das Tryptophanpeptid (bhpW) zeigte alle Merkmale einer stark bevölkerten β-Haarnadel, wie beispielsweise intensive aufeinander folgende H^α-H^N-NOEs, zahlreiche Hauptketten- Kreuzstrang-NOEs und große Hauptkettenskalarkopplungskonstanten (³J-H^N-H^α > 8,0 Hz) für Strangreste. Die chemischen H^α-Verschiebungen von Cys1 und Cys10 lagen in Bezug auf die in unstrukturierten Peptiden beobachteten Werte im Tieffeld, was darauf hinweist, dass die antiparallelen Stränge diese Terminusreste umfassen. für die anderen untersuchten Peptide wurde erkannt, dass sie eine geringere Population der Haarnadelstruktur aufwiesen (siehe Tabelle 1). Interessanterweise korrelieren die NMR-Daten gut mit C_eff (Tabelle 1); somit liefert der Disulfidaustauschtest eine nützliche Quantifizierung des Grades an Haarnadelstruktur in den oxidierten Peptiden.
Tabelle 1. Vergleich von Cystein-wirksamen Konzentrationen (C_eff) und ¹H-NMR-Daten für ausgewählte Modell-Haarnadelpeptide
Die maximale Anzahl an Strangresten mit ³J-H^N-H^α > 8 Hz ist 8; für das Tryptophanpeptid (bhpW) beträgt die Leu8-Kopplungskonstante 7,9 Hz. Zufallsknäuel-Kopplungskonstanten sind aus Smith et al. (Smith et al., J. Mol. Biol. 225, 494–506 (1996)) entnommen. Chemische Zufallsknäuel-H^α-Verschiebungen sind aus Wishart et al. (Wishart et al., Biochemistry 31, 1647–1651 (1992)) entnommen.
Beispiel 2: Transfer von alternativen Tetrapeptid-Kehrensequenzen auf das Haarnadelgerüst
Strukturen, die aus bhpW gemäß Beispiel 1 berechnet wurden, zeigten eine gut geformte antiparallele Haarnadel mit einer Kehre vom Typ II' (Gly5-Asn6) und hydrophoben Kontakten zwischen den Seitenketten von Cys1, Trp3, Leu8 und Cys10 (3). Thermodynamische Analyse von bhp-Stabilität wurde durch das Versagen des oxidierten Peptids entweder bei hoher Temperatur oder in Gegenwart chemischer Denaturierungsmittel, sich gänzlich aufzufalten, verkompliziert. Nichtsdestotrotz schätzen die Erfinder, dass die Haarnadelkonformation stark bevölkert ist, höchstwahrscheinlich zu > 80% bei 15°C. Aufgrund seiner strukturellen Stabilität wählten die Erfinder für die Untersuchung bhpW als ein Kehrendisplay-Gerüst. Demgemäß testeten sie, ob eine andere Kehrensequenz durch die bhpW-Strangsequenzen strukturiert werden könnte.
Eine erst jüngst entdeckte Struktur von HIV gp120, gebunden an einen neutralisierenden Antikörper und an menschliches CD4, deckte Details der Kontaktoberflächen auf (Kwong et al., Nature 393, 648–659 (1998)). Wie aus zahlreichen Mutagenese-Studien abgeleitet wurde, ist die CD4-Region, die am meisten Bedeutung für gp120-Bindung trägt, die C'-C''-Haarnadelschleife (Reste 37–46), in der sich die maßgebliche Phe43-Seitenkette von der Proteinoberfläche ausgehend erstreckt. Tatsächlich tragen die CD4-Reste 40–48 63% zur Oberfläche bei, die in die Grenzfläche inkorporiert ist, wobei 23% des Ganzen durch Phe43 beigesteuert werden (Kwong et al., Nature 393, 648–659 (1998)). Überraschenderweise gibt es einen großen Hohlraum in gp120, hinter der Phe43-Bindungsstelle, der mit hydrophoben Resten ausgelegt ist. Es schien möglich, dass sich ein strukturiertes Peptid, das auf der C'-C''-Kehre basiert, an gp120 binden kann, und sofern dies möglich ist, dass es einen Startpunkt zum Entwerfen von Liganden darstellen kann, die sich in den in der Kristallstruktur erkannten Hohlraum ausdehnen.
Die Erfinder synthetisierten ein Disulfid-eingeschränktes Peptid, das auf der nativen Sequenz der CD4-Haarnadel (Reste 38–45, cd1 in Tabelle 2) basierte, und erkann ten, dass es im Wesentlichen in Lösung unstrukturiert war (4a). Sie bildeten dann die Substitutionen G2T und N3W, um sie mit den entsprechenden Resten in bhpW (cd2, Tabelle 2) übereinzustimmen; die Reste L8 und T9 sind bereits in der nativen CD4-Sequenz vorhanden. Peptid cd2 ist gut geordnet und nimmt eine Haarnadelstruktur mit einer Kehre vom Typ II' ein (4). In 4A sind Peak-Zuordnungen für cd2 gezeigt; Pfeife bezeichnen die Position des entsprechenden Crosspeaks in cd1. Jene cd2-Reste mit ³J-H^N-H^☐ > 8,3 Hz sind unterstrichen: alle cd1-Reste weisen Hauptketten-Kopplungskonstanten zwischen 5,9 und 7,7 Hz auf. Die gemessenen C_eff-Werte zeigen, dass die CD4-Kehre (QGSF) die Modell-Haarnadel (EGNK-Kehre) um 0,5 kcal/mol destabilisiert, und die Erfinder erkannten, dass sowohl T2- als auch W3-Substitutionen für eine stabile Haarnadelstruktur erforderlich waren (Tabelle 2). Es ist wichtig anzumerken, dass ein Vergleich der Peptidstruktur mit jener von CD4 darauf hinweist, dass die Hauptketten-Konformationen im Wesentlichen dieselben sind und innerhalb der Ungenauigkeiten der Strukturbestimmungen liegen (0,93 Å RMSD; 4B). 4B zeigt das NMR-Strukturensemble für cd2 (20 Modelle; zwei orthogonale Ansichten), überlagert an den Resten 37–46 (rot) aus der Kristallstruktur von gp120-gebundener CD4 dargestellt. Die RMSD für die 20 Modelle, unter Berücksichtigung der mittleren Koordinaten für die Hauptkettenatome der Reste 1–10, ist 0,50 ± 0,09 Å: ein Vergleich der mittleren Koordinaten der Reste 1–10 mit den Resten 37–46 von CD4 aus der Kristallstruktur ergibt eine RMSD von 0,93 Å. Es gilt anzumerken, dass ³J-H-H-Kopplungskonstanten für Phe7 von cd2 darauf hinweisen, dass diese Seitenkette nicht im Rotamer fixiert ist, das im Ensemble zu erkennen ist; die Phe7-Seitenkette nimmt zahlreiche Konformationen in Lösung an, was zweifellos jene widergibt, die in der Co-Kristallstruktur beobachtet wurden. Dies zeigt, dass das Peptidgerüst die CD4-β-Kehre korrekt darstellt.
Tabelle 2. Vergleich von bhpW und Peptiden, basierend auf der CD4-C'-C''-Schleife
Terminale Serin- und Lysinreste wurden hinzugefügt, um die Löslichkeit mancher Varianten des CD4-Peptids zu verbessern, die sonst ungeladen sind. Eine ähnliche Modifikation wurde als eine Kontrolle an bhpW vorgenommen. Nicht-Kehren-Reste, die in der bhpW- und CD4-Schleife unterschiedlich sind, sind unterstrichen. Co-Elution von reduzierten und oxidierten Peptiden vermeidet Messungen von C_eff für die T2, N3-Variante des CD4-Peptids. Zirkular-Dichroismusspektren wurden bei 10°C mit einem Spektralphotometer Modell 202 von Aviv Instruments, Inc., erhalten; die Peptidkonzentrationen betrugen 20 μM in 20 mM Kaliumphosphat, pH 7,0. [n.b.: nicht bestimmt: Cys_N-H^α: chemische H^α-Verschiebung für das stärker N-terminale Cystein (Cys1 oder Cys2): Cys_C-H^α: chemische H^α-Verschiebung für das stärker C-terminate Cystein (Cys10 oder Cys11)]
Zwei andere ausgewertete Kehrensequenzen waren VWQL aus der F-G-Schleife der Domäne 2 von menschlichem Fc-epsilon-RI und GPLT aus dem EPO-Agonistenpeptid EMP1. Alle drei Kehren wurden im trp-Peptidgerüst und in zyklisierten Peptiden, deren Sequenzen mit den nativen verwandten Haarnadelschleifen näher übereinstimmten, bewertet:
Zirkular-Dichroismusspektren zeigen, dass in jedem Fall das modellierte trp-Haarnadelgerüst ein starker strukturiertes Peptid ergibt (5a–c). NMR-Daten stimmen mit gesteigerter Haarnadelstruktur in den Peptiden überein, was darauf hinweist, dass das Gerüst zahlreichen "schwierigen" Kehren eine Neigung zu strukturierten Zuständen verleihen kann.
Andere gewöhnliche Kehren, die am Haarnadelgerüst vorhanden sein können, schließen γ-Kehren (3 Aminosäuren), ausgebuchtete Kehren (5 oder 6 Aminosäuren) und längere Haarnadeln (8 Aminosäuren) ein. Andere Kehrenlängen sind bekannt und sind auch mit dem Gerüst kompatibel.
Die Ergebnisse aus Beispiel 1 und 2 zeigen, dass Optimierung einer einzelnen Strangposition in einer kleinen, Disulfid-eingeschränkten Haarnadel ausreichend ist, um ein sehr schwach strukturiertes Molekül zu einem umzusetzen, das hochstruktu riert ist (–ΔΔG > 0,8 kcal/mol). Der Stammabschnitt der strukturierten Haarnadel, -CTW ----LTC-, erfordert keine optimierte Kehrensequenz; so ist er ein geeignetes Gerüst zum Display von β-Kehrenbibliotheken und zur Untersuchung bestimmter Kehren, die sonst nicht stark bevölkert sein könnten. Es ist wichtig, dass nur natürliche Aminosäuren gebraucht werden; Kehrenbibliotheken können also am Phagen dargeboten werden.
Es ist interessant, die Substitutionsenergien, die hierin beschrieben werden, mit früheren Studien von β-Faltblattsystemen zu vergleichen. Obwohl das Ausmaß der Energiedifferenzen ähnlich ist, stimmt die Rangordnung, die die Erfinder erhalten, nicht mit experimentellen β-Neigungsskalen oder mit beobachteten Restepaarhäufigkeiten in bekannten β-Faltblättern überein (Hutchinson et al., Protein Sci. 7, 2287–2300 (1998); M. A. Wouters & P. M. G. Curmi, Proteins 22, 119–131 (1995)). Insbesondere Tryptophan ist in solchen Skalen nicht ungewöhnlich. Diese Unterschiede betonen, dass sich durchschnittliche Neigungen in typischen Proteindomänen nicht direkt auf kleine Peptide umlegen lassen, in denen die meisten Reste stark Lösungsmittel ausgesetzt sind, was die Verwendung solcher Information im De-novo-Design verkompliziert. Weiters korreliert die ΔΔG-Rangordnung nicht gut mit steigender, nicht polarer Oberfläche der Seitenketten, obwohl die bevorzugten Reste hydrophob sind.
Schließlich ist der Haarnadelstamm sehr klein, und dennoch verleiht die Kombination von Disulfid und Kreuzstrang-Tertiärkontakt eine strukturelle Neigung, die jene eines Disulfids alleine übertrifft, z.B. CX₄C. Obwohl es bekannt ist, dass manche bestimmte Sequenzen (z.B. VVVV) (Milburn et al., Int. J. Peptide Protein Res. 31, 311–321 (1988)) Kehrenkonformationen, die mit der Haarnadel der Erfinder kompatibel sind, nicht annehmen können, gilt genauso, dass von sehr wenigen der Kehrensequenzen, die in Proteinen beobachtet wurden, gezeigt wurde, dass sie in isolierten Peptiden gut definierte Kehrenkonformationen einnehmen. Die Erfinder veranschaulichten eine einfache Strategie zur Erhöhung dieser Anzahl. Sie erwägen, dass Haarnadelbibliotheken mit randomisierten Kehrensequenzen (z.B. XCTWX₄LTCX) strukturierte Liganden ergeben könnten, deren Bindungsdeterminanten leicht auf kleine synthetische Kehrenmimetika transferiert werden könnten oder sogar direkt verwendet werden könnten, um niedermolekulare Leitstrukturen zur Affinitätsoptimierung mit hohem Durchsatz zu identifizieren (Rohrer et al., Science 282, 737–740 (1998)).
Beispiel 3: Quantifizierung der relativen Beiträge von Kehren und Kreuzstrang-Wechselwirkungen
Zuvor in Beispiel 1 wurden Substitutionen in Position 3 (X) des Modellpeptids bhp (Peptid 1) eingeführt. Diese Gaststelle ist von der Kehre vom Typ II' nur sehr knapp beabstandet (gly-asn, 1). Um weiter zu untersuchen, ob Haarnadeln mit unterschiedlichen Kehrensequenzen und Geometrien unterschiedliche Restepräferenzen an der NHB-Gaststelle aufweisen würden, wird die zentrale gly-asn-Sequenz im Modellpeptid 1 durch die Kehre asn-gly vom Typ I' (Peptid 2) und die Kehren D-pro-asn und D-pro-gly vom Typ II' (Peptide 3 und 4) ersetzt. Substitutionen an Positionen 3 (X) wurden ausgewählt, um den Bereich von Haarnadelstabilitäten, die die Erfinder in den gly-asn-Reihen beobachten konnten, abzumessen. C_eff wurde wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Die für die verschiedenen Kehren erhaltenen Werte werden in 6 verglichen.
Ac-CTXEGNKLTC-NH₂ 1 II'
Ac-CTXENGKLTC-NH₂ 2 I'
Ac-CTXEpNKLTC-NH₂ 3 II'
Ac-CTXEpGKLTC-NH₂ 4 II'
X = W, Y, L, V, T, D
p ≡ D·pro
In allen Fällen ergibt Tryptophan an Position 3 für eine jeweilige Kehre den größten C_eff-Wert, was beweist, dass sein stabilisierender Einfluss allgemein ist. Die großen Veränderungen des Wertes C_eff für die verschiedenen Kreuzstrang-Wechselwirkungen (Horizontalachse) und Kehrensequenzen (Vertikalachse) zeigen, dass beide signifikant dazu beitragen können, diesen zyklischen Haarnadelpeptiden Stabilität zu verleihen, Schließlich bestehen erstaunliche lineare Korrelationen zwischen den Datenserien, was darauf hinweist, dass Substitutionen an Strangposition 3 und die Kehrenersetzungen voneinander unabhängige Beiträge zur Stabilität der zyklischen Haarnadel leisten. Diese Daten lassen darauf schließen, dass die Haarnadelfaltung stark modular sein kann, was das Haarnadeldesign maßgeblich vereinfachen würde.
Relative Kehrenenergien können durch Vergleichen von C_eff der geeigneten Peptidpaare berechnet werden. Die Korrelation in 6 ermöglicht nun also die Berechnung relativer Kehrenenergien aus den Anstiegen, die weniger anfällig auf experimentellen Fehler sein sollten. Diese Werte sind in Tabelle 3 aufgelistet. Verglichen mit asn-gly (Typ I') ist gly-asn (Typ II') weniger stabilisierend, während die D-prohältigen Kehren (ebenfalls vom Typ II') Haarnadelstabilität erhöhen. In dem einen Fall, in dem ein Vergleich asn-gly vs. D-pro-gly angestellt werden kann, stimmt der hier erhaltene ΔΔG-Wert ausreichend gut mit jenem Wert überein, der mittels NMR erhalten wurde. Dies lässt darauf schließen, dass die von Syud et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 11577 (1999), festgesetzten Vergleichszustände und deren Annahme einer Zweiphasen-Faltung für ihr Modellsystem geeignet sind; das Festsetzen solcher Vergleichszustände ist jedoch nicht immer durchführbar.
Tabelle 3. Kehrenenergien in Bezug auf Asn-Gly in Peptiden 1–4
Alternativ dazu können Substitutionsenergien für die Strangposition erhalten werden indem dieselben Daten gruppiert anstelle durch den Rest X aufgetragen werden (nicht dargestellt). Die Korrelationen sind wiederum ausgezeichnet, und die Anstiege liefern die Änderungen der freien Energie (Tabelle 4). Der Bereich der Energien ist größer als jener, der in Beispiel 1 für Peptid 1 angegeben wurde (1,42 vs. 0,85 kcal mol^–1). Ein großer Teil dieser Differenz wird jenen Substitutionen am unteren Ende der Stabilitätsskala (insbesondere asp) zugesprochen. Die weniger stabilen gly-asn-Kehrenpeptide sind nicht nachweisbar strukturiert, und C_eff-Tests verzeichnen keinen Unterschied zwischen diesen. Somit liefern die Daten, die für Peptide mit den stärkeren Kehrensequenzen erhalten wurden, einen kompletteren Überblick über die Strangsubstitutionsenergien.
Tabelle 4. Relative Energiebeiträge von Strangrest X
Um zu bewerten, wie die Kehrentypen die Haarnadelstruktur beeinflussen, wurden die Tryptophananaloga von 2 und 3 durch NMR-Spektroskopie charakterisiert, und Strukturen wurden wie in Beispiel 1 für Peptid 1 beschrieben berechnet. Der Vergleich von minimierten mittleren Strukturen in 7 zeigt auf, dass die Hauptketten- und die Seitenkettenkonformationen für die Nicht-Kehren-Reste (RMSD ~0,3 Å), ungeachtet des vorhandenen Kehrentyps, sehr ähnlich sind. Somit üben in Übereinstimmung mit den linearen Korrelationen von C_eff (6) diese drei Kehren keinerlei strukturellen Einfluss auf die benachbarten Stränge aus.
Die Bedeutung der Kehrensequenz und guter Kreuzstrang-Paarung für Haarnadelstrukturen wurde in zahlreichen Modellstudien untersucht. Es gibt jedoch nur wenig quantitative Daten oder systematische Bewertungen von Restesubstitutionen. Die Daten der vorliegenden Erfindung zeigen, dass sich bei diesen einfachen zyklischen Peptiden Substitutionen in einer Strangstelle und in der Kehre zu einfachen linearen Beziehungen freier Energie führen und unabhängige sowie additive Effekte auf die Haarnadelstabilität haben. Dies stellt angesichts ihrer strukturellen Ähnlichkeit (3 und 7) und ihrer erwähnten Empfindlichkeit berechneter Kehrenenergien auf Eigenschaften der Proteinverankerung ein unerwartetes Ergebnis dar (R. M. Freidinger, Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 395–406 (1999)). Nichtsdestoweniger mag es erscheinen, dass Bindung zwischen diesen Kehren und den Strängen im Vergleich zum großen Einfluss, den jedes einzeln ausübt, vernachlässigbar ist. Dies lässt darauf schließen, dass β-Haarnadelstabilität durch getrennte Analyse dieser Komponenten verstanden werden kann.
Beispiel 4. Quantifizierung energetischer Beiträge von Kreuzstrang-Resten
Die Resultate der obigen Beispiele stellen Tryptophan als ein relativ stark stabilisierendes Element in der nicht Wasserstoff-gebundenen (NHB) Strangstelle X von Peptid 1 dar, wenn es mit einem Kreuzstrang-Leucin gepaart wird. Das Tryptophanpeptid (bhpW) war in Wasser hoch strukturiert, wodurch es die beabsichtigte Haarnadelkonformation annahm (3). Hierbei untersuchten die Erfinder die Beziehung zwischen den NHB-Kreuzstrang-Resten. Bemerkenswerterweise erkannten sie, dass Restepräferenzen für zwei strukturell nicht äquivalente Stellen dieselben sind und dass spezifische Paarwechselwirkungen nur geringfügige Abweichungen von den Beiträgen der einzelnen Stellen hervorriefen. Demgemäß scheint ein Tryptophan-Tryptophan-Kreuzstrangpaar für Haarnadelstabilität optimal zu sein.
Die Beobachtung der Erfinder einer stabilisierenden Wirkung von Tryptophan warf unmittelbar die Frage auf, wie umfassend diese Wirkung sein kann. Das Tryptophan in Peptid bhpW (3) ist räumlich sowohl dem Kreuzstrang-Leucin als auch den Seitenketten von Resten in der Typ-II'-Kehre nahe. Daher scheint es möglich, dass die Wirkung von Tryptophan von stabilisierenden Kontakten mit diesen anderen Resten abhängt. Um dieser Frage nachzugehen, kehrten die Erfinder hydrophobe Paare (Peptid 5) um, indem sie die Aminosäure an Position 8 (am nächstem zum Disulfid, 3) mit Leucin, das an Position 3 fixiert war, variierten. Effektive Konzentrationen C_eff) der Cysteinthiole wurden wie in den vorangehenden Untersuchungen der Erfinder bestimmt.
Ac-CTXEGNKLTC-NH₂ 1
Ac-CTLEGNKXTC-NH₂ 5
Ac-CTXEGNKWTC-NH₂ 6
Ac-CTWEGNKXTC-NH₂ 7
X = W, Y, F, L, M, I, V, A
Die Erfinder erkannten, dass Tryptophan an Position 8 das am stärksten stabilisierende dieser getesteten Reste ist (8A). Bezeichnenderweise sind die C_eff-Werte für die trp-leu- und leu-trp-Paare sehr ähnlich, was darauf hinweist, dass die zwei Anordnungen energetisch etwa gleichwertig sind. Dieses Resultat scheint für andere Restepaare mit Leucin ebenso zu gelten; die Rangordnung und Zahlenwerte von C_eff sind in den zwei Serien ähnlich, jedoch nicht exakt dieselben (8A).
Um zu testen, ob die Äquivalenz umgekehrter hydrophober Paare umfassender sein kann, untersuchten die Erfinder Peptidserien 6 und 7, in denen Reste anstelle dessen mit einem Kreuzstrang-Tryptophan gepaart sind (8B). Wie im Falle der Leucin-Paare kann ein enger Zusammenhang zwischen den zwei Tryptophanserien festgestellt werden, sowohl bezüglich der Rangordnung als auch des Wertes von C_eff. Die Erfinder schließen daraus, dass die zwei Kreuzstrang-Stellen trotz der Differenzen der Seitenkettenposition in Bezug auf die Kehre und Disulfid im Wesentlichen äquivalent sind.
Die zwei Leucinserien (1 und 5) können mit den Tryptophanserien (6 und 7) verglichen werden. Die Neigungen in den zwei Datenreihen sind beachtlich ähnlich (8A und B), was darauf schließen lässt, dass die Kreuzstrang-Reste auf eine unab hängige Weise zur Stabilität beitragen. Um dieser Idee nachzugehen, berechneten die Erfinder Differenzen der freien Energien für Substitutionen in jeder der Peptidserien in Bezug auf ein Vergleichspeptid in diesen Serien (ΔΔG = –RT In (C_eff,X/C_eff,ref)). Repräsentative Vergleiche sind in 9 in Form eines Diagramms dargestellt.
Lineare Beziehungen freier Energie bestehen in den vier Datenreihen. Dies ist aus Vergleichen bestimmter Kreuzstrang-Paare, die zwischen NHB-Stellen 3 und 8 gewechselt werden, und auch aus Vergleichen von trp-Paaren mit leu-Paaren in derselben Ausrichtung (3) ersichtlich. (In den letztgenannten Korrelationen gibt es mehr Streuung.) Die Anstiege (ρ) wurden unter Verwendung von ΔΔG-Werten bestimmt, die auf zwei unterschiedliche Vergleichspeptide in jeder Serie (X = ala und trp) skaliert wurden. Die erhaltenen ρρ-Werte unterschieden sich nicht sehr stark (Tabelle 5).
Tabelle 5. Anstiege (ρ) von Hammett-Diagrammen für die Peptidserien 1–4
In Übereinstimmung mit der Vorstellung, dass Positionen 3 und 8 äquivalent sind, beträgt ρ etwa 1 in den Diagrammen, die diese Daten vergleichen. Im Gegensatz dazu beträgt ρ etwa 0,4, wenn leu-Paare mit trp-Paaren verglichen werden. Dies bedeutet, dass in einem bestimmten Paar von Resten X die erwartete Differenz in der Haarnadelstabilität ~2,5fach größer mit trp als Kreuzstrangpartner ist. In Anbetracht dieser einfachen Beziehungen könnte ΔΔG für jede beliebige Substitution in Bezug auf ein Vergleichspaar durch Multiplizieren einer Substituentenenergie σ_X mit ρ für den Kreuzstrangpartner berechnet werden (siehe unten). Dies ist überraschend, da diese Reste innerhalb der Kontaktdistanz liegen, und hat wichtige Auswirkungen auf β-Haarnadeldesign.
Statistische Analysen von HB- und NHB-Kreuzstrangpaaren in β-Faltblattproteinen zeigen auf, dass zahlreiche Restepaare mit hoher Konfidenz positiv oder negativ in Wechselbeziehung stehen. Durchwegs im Einklang mit den statistischen Präferenzen konnten mittels Proteinmutagenese-Untersuchungen Wechselwirkungsenergien in der Größenordnung von 1 kcal mol^–1 zwischen HB-Paaren identifiziert werden. Es wurde erwogen, dass das Einbinden von bevorzugten Kreuzstrang-Paaren in Proteine die Stabilität verbessern oder das Strangregister in isolierten β-Haarnadeln fixieren könnte.
Um diese Wirkungen näher zu betrachten, berechneten die Erfinder Paar-Wechselwirkungsenergien (10). C_eff-Verhältnisse ergeben ΔΔG für die einzelnen oder doppelten Substitutionen. Typischerweise wird die Differenz zwischen ΔΔG für die doppelte Substitution und ΣΔΔG für die einzelnen Substitutionen als eine Wechselwirkungsenergie angenommen. In dem gezeigten Beispiel würde dies –136 cal mol^–1 für das trp-tyr-Paar in Bezug auf einen leu-leu-Vergleichszustand ergeben. Werden die einzelnen Substitutionsenergien nacheinander berechnet und in einem zweiten Schritt auf ρ skaliert, so beträgt die Diskrepanz nur +32 cal mol^–1 (in diesen Versuchen insignifikant). Für das phe-trp-Paar (vergleiche 2, oben und unten) ergibt eine ähnlich Analyse ΔΔΔG = –253 cal mol^–1, sofern ρ eingebunden ist. Dieses Diskrepanz ist signifikant und lässt darauf schließen, dass das Paaren von phe und trp (abgesehen von der allgemeinen Überlegenheit von trp) eventuell einen gewissen spezifischen strukturellen Vorteil bergen kann. Es ist interessant, dass die Diskrepanz verglichen mit dem gesamten Bereich von Energien, die bei Einzelstellensubstitutionen zu verzeichnen sind, gering ist (9); die Erfinder nehmen an, dass solche paarspezifischen Wirkungen (und experimentelle Fehler) die Streuung der erkannten Korrelationen erklären können.
Die Versuche der Erfinder zeigen eindeutig, dass Kreuzstrang-Tertiärkontakte Haarnadelstabilität steigern. Vor allem die Einführung des trp-trp-Paares resultiert in einer umfassenden Stabilisierung im Vergleich zum ursprünglichen Peptid bhpW (3 und 8), und die Erfinder glauben, dass trotz seiner Seltenheit in Proteinen trp-trp das optimale NHB-Paar für isolierte Haarnadeln darstellt. In den meisten Fällen lassen sich die Paar-Wechselwirkungsenergien, die die Erfinder mittels herkömmlicher Doppelmutantenanalyse feststellen, adäquat durch die Unterschiede von ρ erklären. Das bedeutet, dass diese Energien nicht für ein einzelnes Paar spezifisch sind, sondern anstelle dessen mehr oder weniger Empfindlichkeit für alle Restesubstitutionen gegenüber einem bestimmten Kreuzstrangpartner widerspiegeln. Daraus schließen die Erfinder, dass die kombinierte Einzelstellenpräferenz (σ und ρ) äußerst wichtig für die Vorhersage der Haarnadelstabilität sind. Maßgeblich ist, dass es möglich sein sollte, diese Vorhersagen auf Grundlage eines limitierten Ausgangssets experimenteller Daten zu tätigen.
Beispiel 5: Konstruktion von Phagendisplay-Bibliotheken auf der Basis des trp-Peptidgerüsts
Bibliotheken von zufällig ausgewählten Peptiden, die an das Gen-8-Protein des filamentösen Bakteriophagen M13 fusioniert sind, wurden durch Kunkel-Mutagenese von Plasmid pS1302b, eines Derivats von pS349, hergestellt (US-Patentanmeldung Nr. 60/103.514 und 60/134.870, hierin durch Verweis aufgenommen). Plasmid pS1302B bindet den tac-Promotor und die malE-Leadersequenz von pS349 ein. Die hGH-Sequenz und die Gly/Ser-reiche Linkersequenz von pS349 wurden durch die folgende Sequenz ersetzt:
Die insertierte Sequenz kodiert für drei Stoppcodons, die GD-Epitopmarkierung und einen Linker, der für sein Display von hGH auf hohem Niveau ausgewählt wird. Das Plasmid umfasst auch den lac-Repressor (lacl^q) und das Ampicillin-Resistenzgen aus pS349. Das zur Konstruktion der Bibliothek verwendete Oligonucleotid war:
Die Form der zufälligen Peptide war daher XCTWX₄LTCX. Eine Bibliothek von 10⁹ bis 10¹⁰ einzelnen Transformanten wurde mittels bereits beschriebener Verfahren (US-Patentanmeldungen Nr. 60/103.514 und 60/134.870). hergestellt. Etwa ein Drittel der einzelnen Klone kodierte für eine funktionelle Peptidsequenz. Die restlichen waren Ausgangsmatrize, enthielten Stoppcodons oder enthielten einzelne Nucleotiddeletionen. Die Bibliotheksgröße ist somit passend, um mehrere Kopien von jeder möglichen zufälligen Sequenz einzubinden.
Beispiel 6: Selektion von Bindungspeptiden aus der strukturell-beeinflussten Bibliothek
Nunc-MaxiSorp-Platten wurden über Nacht mit 2 μg/ml rhuFc-epsilon-RI-IgG-Fusion in PBS beschichtet. Die Platten wurden dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 0,5% BSA (Sigma A-7638) in PBS blockiert. Negative Wells wurden durch Beschichten nur mit 0,5% BSA vorbereitet. Phagen (10¹¹ ifu pro Well) wurden zu jeweils zehn positiven und negativen Wells zugesetzt und unter Schütteln 20 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach ausführlichem Waschen zum Entfernen von nicht spezifisch gebundenen Phagen wurden die Bindemittel durch 5-minütige Behandlung mit 0,2 M Glycin, pH 2, eluiert. Die eluierten Phagen wurden dann durch Zusatz von TRIS-Base neutralisiert und verwendet, um eine Kultur von E. coli (XL1-Blue, Stratagene) zu infizieren. Mehrer Zyklen von Binden, Elution und Amplifikation (3–5 insgesamt) wurden unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt. 192 einzelne Klone wurden auf Bindung an den Target-Rezeptor durch Inkubation von Phagenüberstand mit Platten, die wie beschrieben zum Phagensortieren vorbereitet wurden, gescreent. Nach dem Waschen wurden die Wells mit alpha-M13-HRP-Konjugat (Pharmacia Biotech 27-9421-01) behandelt, und gebundener Antikörper wurde mit OPD-Substrat (Sigma P-9187) nachgewiesen. Plattenabsorption (A₄₉₂-A₄₀₅) wurde zwischen positiven und negativen Platten verglichen, um jene Klone zu identifizieren, die positive Ergebnisse bezüglich Rezeptorbindung lieferten. Zwölf solche Klone wurden identifiziert.
Die Sequenz positiver Klone wird durch Sequenzieren der kodierenden DNA identifiziert. Peptide, die den dargebotenen Sequenzen (d.h. 12-meren) entsprechen, werden mittels herkömmlicher Festphasen-Verfahren synthetisiert. Die Peptide werden dann unter Verwendung eines geeigneten biologischen Tests oder Bindungstests getestet, um ihre Wirksamkeit zu bestimmen. Peptide können unter Verwendung jedes beliebigen der zuvor erwähnten Verfahren auf Haarnadelstruktur bewertet werden: Zirkular-Dichroismus, NMR oder Disulfidgleichgewicht. Substitutionen können in den Peptiden durchgeführt werden, um die relativen Beiträge der ausgewählten Kehrenreste zur Bindung zu bestimmen. Idealerweise zerstören diese Substitutionen die Gerüststruktur nicht. Nachdem die Beschaffenheit des Bindungsmotivs verstanden wurde, kann die Kehrensequenz zur weiteren Optimierung auf ein geeignetes organisches Gerüst transferiert werden.

Claims

Bibliothek von strukturell eingeschränkten Peptiden, die mehrere zyklische Peptide umfassen, worin jedes der zyklischen Peptide eine Aminosäuresequenz C1-A1-A2-(A3)_n-A4-A5-C2 [Seq.-ID Nr. 1] umfasst, worin A1, A2, A3, A4 und A5 natürlich vorkommende L-Aminosäuren sind; der Aminoterminus des Cysteins C1 gegebenenfalls mit einer Amino-Schutzgruppe geschützt ist; der Carboxyterminus des Cysteins C2 gegebenenfalls mit einer Carboxy-Schutzgruppe geschützt ist; A1 und A5 aus der aus den Aminosäuren W, Y, F, H, I, V und T bestehenden Gruppe ausgewählt sind; A2 und A4 aus der aus den Aminosäuren W, Y, F, L, M, I und V bestehenden Gruppe ausgewählt sind; A3 eine beliebige natürlich vorkommende L-Aminosäure ist und n eine ganze Zahl ist, die 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 ist; und C1 und C2 durch eine Disulfidbindung verbunden sind, wodurch ein zyklisches Peptid gebildet wird.
Bibliothek nach Anspruch 1, worin A1 oder A5 ein β-verzweigter Rest mit zwei Nichtwasserstoffsubstituenten auf dem β-Kohlenstoff des Aminosäurerests ist.
Bibliothek nach Anspruch 1, worin A1 oder A5 T ist.
Bibliothek nach Anspruch 1, worin A1 oder A5 die Aminosäure W, F, H oder Y ist.
Bibliothek nach Anspruch 1, worin A2 oder A4 die Aminosäure W, F oder Y ist.
Bibliothek nach Anspruch 5, worin A2 oder A4 W ist.
Bibliothek nach Anspruch 6, worin A2 und A4 W sind.
Bibliothek nach Anspruch 1, worin n zumindest 4 ist.
Bibliothek nach Anspruch 8, worin n nicht größer als 10 ist.
Bibliothek nach Anspruch 9, worin n = 4 ist.
Bibliothek nach Anspruch 10, worin (A3)₄ EGNK, ENGK, QGSF oder VWQL ist.
Bibliothek nach Anspruch 11, worin A1 T ist und A5 T ist.
Bibliothek nach Anspruch 12, worin A2 W oder L ist.
Bibliothek nach Anspruch 13, worin A4 W oder L ist.
Bibliothek nach Anspruch 1, worin das zyklische Peptid an ein Phagen-Hüllenprotein fusioniert ist und das zyklische Peptid auf der Oberfläche eines Phagen- oder Phagemidpartikels präsentiert ist.
Verfahren zum Screenen auf Peptide mit einem β-Haarnadelgerüst, das konformationsstabilisiert ist, folgende Schritte umfassend: a) Bereitstellung einer Bibliothek nach Anspruch 1; b) Selektion von zumindest zwei Peptiden aus der Bibliothek aus Schritt a), worin sich die zumindest zwei Peptide durch eine Aminosäure an einer bestimmten Position A1, A2, A3, A4 oder A5 unterscheiden; c) Bestimmung der Konformationen der Peptide aus Schritt b); d) Messung und Vergleich der relativen freien Energie der Peptide aus Schritt b); e) Selektion von Peptiden mit konformationsstabilisiertem β-Haarnadelgerüst.
Verfahren zur Identifikation eines Peptids, das zur Bindung an einen spezifischen Bindungspartner fähig ist, folgende Schritte umfassend: a) Bereitstellung einer Bibliothek nach Anspruch 1; b) Kontaktierung der Bibliothek aus Schritt a) mit einem Bindungspartner; c) Selektion von Peptiden aus der Bibliothek, die zur Bildung eines nichtkovalenten Komplexes mit dem Bindungspartner fähig sind; und d) gegebenenfalls Isolierung der Peptide aus Schritt c).
Verfahren nach Anspruch 17, worin der Bindungspartner aus der aus einem Antigen, einem Antikörper, einem Enzymsubstrat, einem Rezeptor und einem Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist.