JPH09500625A

JPH09500625A - 環状セミランダムペプチドライブラリー

Info

Publication number: JPH09500625A
Application number: JP7504188A
Authority: JP
Inventors: ハフマン，ウィリアム・フランシス; ムーア，マイケル・リー
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-09
Publication date: 1997-01-21
Also published as: WO1995001800A1; EP0788370A4; US6194544B1; EP0788370A1

Abstract

(57)【要約】１つ以上の公知のアミノ酸、１つ以上のランダム化アミノ酸および配座的に束縛する素子を含有する環状ペンタ−およびヘキサ−ペプチドライブラリーが記載されている。これらのペプチドライブラリーは、新しい生物活性ペプチドについてスクリーニングし、薬物設計に適切な構造情報を解明するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】環状セミランダムペプチドライブラリー発明の分野本発明は、ランダムおよびセミランダムペプチドライブラリー、かかるライブラリーの製造方法、および、関心のある標的分子または生物系への望ましい結合特性を有するペプチドを選択するためのかかるライブラリーのスクリーニング方法に関する。背景ランダムペプチドライブラリーは、一般に、全てのアミノ酸がペプチドの全ての位置にランダムに取り込まれたペプチド配列のコレクションとして構想される。したがって、該ライブラリーは、ｌ個の残基のペプチドがｎ個の異なるアミノ酸から構成される場合、ｌⁿ個の異なるペプチドを含有するであろう。混合物中の各ペプチドは、固有の配列を有しており、ｌ−残基ペプチドについての全ての可能な配列が表されるであろう。かかるライブラリーは、標的分子に有効に結合するペプチド配列についてスクリーンし、かかる配列を同定するために、種々の方法で生産および使用されてきた。１つの、ランダムライブラリーの生産方法は、繊維状ファージのようなウイルス上でランダム組成のペプチドを発現させることを含む。ペプチドは、ランダム化されたオリゴヌクレオチド（ＮＮＣ／Ｔ）_nを産生することによってコードされる（ここで、Ｎは、ランダム塩基であり、Ｔは、停止コドンを表す）。ヌクレオチドは、ファージ表面上で発現されたタンパク、典型的には、ｐVIII主要コートタンパクまたはｐIIIテールタンパクのいずれかをコードする遺伝子中に挿入される。ランダムライブラリーを製造するいくつかの化学的方法がある。全体的にランダムなライブラリーの製造方法の１つは、ラム（Lam）ら、ネイチャー(Ｎature) 、３５４、８２（１９９１）およびＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６（ＷＯ９２／０００９１）によって開示された。該方法は、ポリスチレンまたはポリアクリルアミド樹脂などの固体支持体上の線状ペプチドの合成を含む。該樹脂を、標準的な固相合成方法を使用して、各プールについて単一のアミノ酸の混合のために１８個のプールに分ける。カップリング後、樹脂のプールを再度合わせ、第２のアミノ酸のカップリングのために再度１８個のプールに再度分ける。個々のビーズは、固有のペプチド配列を含有するであろうし、充分に多くのビーズが与えられる場合、すべての可能なペプチド配列は、ペプチドライブラリーにおいて示されるであろう。該方法の本質は、樹脂様ペプチドをいくつかの可溶性レセプターまたは抗体で検出し、プローブと反応するビーズを単離し、典型的なエドマン配列決定化学を使用して個々に配列決定することができることである。さらに、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４（ＷＯ９２／０９３００）には、ある量のペプチドを樹脂から遊離させ、多少のペプチドがまだ樹脂に結合したままである間に可溶性の形態でアッセイすることができる（配列決定することができる）ように、ペプチドおよび樹脂の間の選択的に切断可能なリンカーを提供するための方法が開示されている。レブル（Ｌebl）ら、Ｉnt.Ｊ.Ｐept.Ｐrot.Ｒes. 、４１、２０１（１９９３）も参照のこと。ゲイセン（Ｇeysen）ら、Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth.、２５９、１０２（１９８７）によって開示された他の方法は、それらが、９６ウエルマイクロタイタープレート中のウエルの配置に対応するような方法でブロック上で配列する誘導ポリスチレンピン上のペプチドの合成を含む。個々の化学反応は、単一ウエル中、各ピン上で行うことができ、かくして、各ピン上で個々のペプチドを製造することができる。該ピンは、典型的には、マイクロタイターウエル中でも行われるＥＬＩＳＡタイプの二重抗体アッセイを使用して検出することができる。ミモトープ（mi motope）法では、該ピンの上でランダムペプチドを合成し、標的抗体を用いて検出する。最良のジペプチドを選択し、オリジナルのジペプチド＋もう１つの残基に基づいた一連のトリペプチドを製造し、検出する。オクタペプチドまでの最適な配列が決定されるまで、最良のトリペプチドをテトラペプチドなどの基礎として使用する。該ストラテジーにより、非天然アミノ酸またはＤ−アミノ酸をペプチド中に取り込むことができる。可溶性「レセプター」の必要性を回避するために、Ｃ末端ε−Ｌys−Ｐro配列を含むピンから［ブレイ（Ｂray）ら、テトラヘドロン・レターズ（Ｔet.Ｌett.)、３１、５８１１（１９９０）を参照］またはアンモノリシスを介して[ブレイら、テトラヘドロン・レターズ、３２、６１６３（１９９１）を参照]、ペプチドを遊離するであろう切断可能なリンカーが開示されている。可溶性ペプチドプールを含むが抗体またはレセプター結合配列の新たな測定に対する別の方法は、ホフテン（Ｈoughten）ら、ネイチャー(Ｎature)、３５４、８４（１９９１）の方法である。同時固相合成法を使用して、固有のアミノ酸を配列における２つの定義された位置でカップリングさせられるヘキサペプチドが製造され、残り４つの位置についてのカップリングのために、等モル量のアミノ酸混合物が使用される。得られたペプチドは、配列Ｏ₁−Ｏ₂−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ［配列番号１］によって表すことができる(ここで、Ｏ₁およびＯ₂は、定義されたアミノ酸であり、Ｘは、ランダム化されたアミノ酸を表す)。１８個のアミノ酸から構成されるペプチドについて、１８²または３２４個の異なるペプチド混合物またはプールがあり、各混合物は、Ｏ₁およびＯ₂についての単一の定義された残基を有する１８⁴または１０４，９７６個の個々のペプチドからなる。３２４個のプールの各々は、活性についてアッセイされ、Ｏ₁およびＯ₂についての最良の選択は、次の残基を変更するために基礎として使用される、すなわち、配列Ａ₁ −Ａ₂−Ｏ₃−Ｘ−Ｘ−Ｘ［配列番号２］のペプチドから構成される(ここで、Ａ₁ およびＡ₂は、最適化残基であり、Ｏ₃は、変更されるであろう定義されたアミノ酸であり、Ｘは、アミノ酸のランダムプールである)。この方法は、最適化配列が得られるまで、反復して繰り返される。該方法は、６×１８または１０８個のペプチドプールの合計について、変更されるべきである１個のアミノ酸のみを含有するヘキサペプチド、すなわち、１８個のペプチドＯ₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ− Ｘ[配列番号３]、１８個のペプチドＸ−Ｏ₂−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ［配列番号４］などを製造することによってかなり簡素化することができる。各プールは、アッセイされ、各位置についての最良の残基が決定される。ピニーラ（Ｐinilla）ら、バイオテクニクス(Ｂiotechniques)、１３、９０１（１９９１）およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０９３００（イテレックス・ファーマシューテイカルズ(Ｉtere x Ｐharmaceuticals)）を参照。これらの技術は、線状ペプチドに関係している。線状ペプチドは、歴史的に、薬物および医薬設計のために比較的乏しい対象を表した。線状ペプチドは、多数の配座を採用することができ、故に、単一標的分子に種々の方法で結合することができ、種々の配座の種々の標的分子に結合することができる。剛直であるか、または、限定された数の配座を採用することができる分子は、より選択的に標的分子に結合する。さらに、線状ペプチドは、薬物研究において困難さを与え、線状ペプチドの非ペプチド薬物への転換について合理的なストラテジーがなかった。組合せライブラリーにおける樹脂結合環状ペプチドおよび遊離環状ペプチドの使用は、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６（ＷＯ９２／０００９１）およびダルレイク（Ｄarlak）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・サーティーンス・アメリカン・ペプタイド・シンポジウム(Ｐroceedings of the １３th Ａmerican Ｐ eptide Ｓymposium)、２−１９３、Ｐ９０２（１９９３）に開示されている。これらの環状ペプチドは、配座的束縛素子を含有せず、環化が可能である場合、これらのペプチドは、一般的に、多数の配座を採用し、線状ペプチドと同一の多くの欠点を有する。本発明は、定義された配座的束縛を導入することによって、ペプチドの質およびランダムライブラリーから誘導された合理的な薬物設計のためのリードを改良する。本発明の鋳型から誘導されたペプチドおよびリードは、側鎖位置を最適にするだけではなく、全体的な配座も最適にし、これは、ペプチド薬物および非ペプチドリガンドを合理的に設計しようとする試みにおける有意な長所である。本発明は、従来のランダムライブラリーのいくつかの欠点である段階を追って進行するペプチド配列決定の必要性および可溶性標的分子の必要性を除去する。発明の概要本発明の目的は、生物活性分子についてのスクリーニングについて有用なペプチドライブラリーを提供することである。本発明の態様は、環状ペプチドライブラリーの調製である。本発明の他の態様は、束縛された配座を有する環状ペプチドライブラリーの調製である。さらに、本発明の態様は、生物活性系における標的分子についての結合親和性または生物活性を有する環状ペプチドを選択するためのかかる環状ペプチドライブラリーのスクリーニングである。図面の簡単な説明本発明は、１カ所以上の位置のアミノ酸および少なくとも１つの位置の定義されたアミノ酸の可変性混合物からなる環状ホモデチックペンタ−およびヘキサ− ペプチドライブラリーのセットからなる。特に、本発明は、ライブラリーのペプチド骨格がよく定義されたペプチド骨格配座を有するペプチドライブラリーのセットからなる。一般的な形態において、本発明は、式(Ｉ)：［式中、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、Ｘ⁵およびＸ⁶は、各々独立して、アミノ酸の可変性混合物である；ただし、少なくとも１個の残基は、定義されており、１個の残基は、所望により存在しない］で示される環状ペプチドライブラリーのセットである。別の具体例では、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸が不変のアミノ酸であるペプチドライブラリーのセットである。好ましい具体例では、１〜３個のアミノ酸は、不変であり、配座的束縛素子からなる。ペプチドの「ライブラリー」は、少なくとも１つの定義されたアミノ酸が存在するペプチドのコレクションを示す。典型的には、ペプチドの別の位置でアミノ酸は、それらが定義されない場合、「ランダム化」されるか、または「不変」である。各ライブラリーは、その定義されたアミノ酸残基、その不変の残基およびその可変性アミノ酸残基によって特徴付けられる。ｎが所定の位置における定義されたアミノ酸残基の数を示す場合、ライブラリーのセットは、ｎ個のライブラリーのグループを示す。２つの位置が定義されたアミノ酸を含有するライブラリーのセットは、ｎ²個のライブラリーからなるであろう。「可変性」の位置またはアミノ酸残基は、ペプチドの明記された位置に１個を超えるアミノ酸を有する。「定義された」アミノ酸残基は、ペプチドにおける同一性および位置が知られている残基である。典型的には、ライブラリーのセットにおいて、各ライブラリーは、その定義されたアミノ酸の同一性において他とは異なる(例えば、定義されたアミノ酸は、単一のライブラリー全体にわたって不変であるが、セット内ではライブラリー間で異なる)。「不変の」アミノ酸または配列は、同一性および位置がライブラリーのペプチド全体にわたって、およびライブラリーのセットの全域で不変であるものである。本明細書で使用する場合、不変および可変アミノ酸残基は、共に、「Ｏ」によって示される。上付き数字は、単に、１つの定義されたまたは不変の残基を別の残基と区別する役割をするだけである。「ランダム化された」位置またアミノ酸残基は、アミノ酸セットからなる全てのアミノ酸がライブラリーにおいて表される場合、該ペプチドにおける位置である。本明細書で使用される場合、ランダム化されたアミノ酸残基は、「Ｘ」によって示される。上付き数字は、単に、１つのランダム化された残基を別の残基と区別する役割をするだけである。ランダム化されたアミノ酸の等モル混合物は、ランダム化されたアミノ酸セットにおける各アミノ酸が同一モル量で存在する混合物である。「最適化された」アミノ酸残基は、定義されたアミノ酸を有するライブラリーが所定の標的活性についてスクリーンされる場合、最適な活性（例えば、生物学的応答、結合または生物学的応答もしくは結合の阻害）を有するアミノ酸セットのアミノ酸である。好ましくは、単一のアミノ酸だけが最適な活性を与える。最適化された残基は、ペプチド配列におけるその同一性および位置によって特徴付けられ、種々の定義されたアミノ酸がライブラリーに導入され、活性について試験される位置配列の官能基でもある。本明細書で使用する場合、最適化されたアミノ酸残基は、「Ａ」によって示される。上付き数字は、単に、１つの最適化されたアミノ酸残基を別の残基と区別する役割をするだけである。「アミノ酸セット」は、特別な位置のペプチドの範囲内で変更される全てのアミノ酸からなる。典型的には、アミノ酸セットは、２〜５０種類のアミノ酸残基からなる。該アミノ酸セットは、ペプチドにおける各位置についてのアミノ酸残基の数および残基のタイプにおいて変更されてもよいか、または、同一セットは、ペプチドにおいて全ての位置について使用されてもよい。すなわち、該セットは、ヘキサペプチドの全体にわたって全ての位置について全ての天然Ｌ−アミノ酸からなるか、または、それは、１位、３位および５位について全ての天然Ｌ− アミノ酸ならびに２位、４位および６位についてＬ−およびＤ−両方のアミノ酸からなる。アミノ酸としては、好ましくは、炭素骨格上に１,２−、１,３−または１,４ −置換パターンにおいて、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する化合物が挙げられる。α−アミノ酸が最も好ましく、タンパク中に見られる２０個の天然アミノ酸（グリシンを除いてはＬ−アミノ酸である）、対応するＤ−アミノ酸、タンパク中には見られない生合成により入手可能なアミノ酸(例えば、４−ヒドロキシ−プロリン、５−ヒドロキシ−リシン、シトルリン、オルニチン、カナバニン、ジェンコール酸、β−シアノアラニン)、および合成により誘導されるα− アミノ酸、例えば、アミノ−イソ酪酸、ノルロイシン、ノルバリン、Ｃ^αアルキル化およびＮ^αアルキル化アミノ酸、Ｄtc、Ｔpr、ホモシステインおよびホモセリンが挙げられる。β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸は、１,３−および１,４ −アミノ酸の例であり、ほかに当該技術分野においてよく知られているものが多くある。スタチン様同配体(ＣＯＮＨ連結基がＣＨＯＨに代えられる２つのアミノ酸からなるジペプチド)、ヒドロキシエチレン同配体(ＣＯＮＨ連結基がＣＨＯＨＣＨ₂に代えられる２つのアミノ酸からなるジペプチド)、還元アミド同配体（ＣＯＮＨ連結基がＣＨ₂ＮＨ連結基に代えられる２つのアミノ酸からなるジペプチド）およびチオアミド同配体（ＣＯＮＨ連結基がＣＳＮＨ連結基に代えられる２つのアミノ酸からなるジペプチド）もまた、本発明のための有用な残基である。本明細書で使用する場合、「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の配列を示す。本発明のペプチドは、各残基がアミノおよびカルボキシ末端を有することによって特徴付けられる４〜６個のアミノ酸残基のアミノ酸の配列からなる。本明細書で使用する場合、アミノ酸配列を囲む角形括弧の意味は、アミノ末端がカルボキシ末端に連結される環状ペプチドを示す。例えば、α−アミノ酸の場合、第１残基のα−アミノ基は、最後の残基のカルボキシ基に連結する。かかる方法で形成された環状ペプチドは、ホモデチックペプチドと称される。環状ペプチドにおいて、該分子の対称性のために、定義された可変性アミノ酸残基の全ての位置は、相対的である。例えば、１つのアミノ酸が定義され(Ｏによって示される)、他の全てがランダム化されている場合、[Ｏ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴ −Ｘ⁵−Ｘ⁶]［配列番号６］によって表されるコレクションは、[Ｘ¹−Ｏ²−Ｘ³ −Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶]、[Ｘ¹−Ｘ²−Ｏ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶]、[Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｏ⁴− Ｘ⁵−Ｘ⁶]、[Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｏ⁵−Ｘ⁶]および[Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵ −Ｏ⁶]と同一である。同様に、[Ｏ¹−Ｘ²−Ｏ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶]［配列番号６］は、[Ｏ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｏ⁵−Ｘ⁶]などと同一である。環化を容易にするために線状ペプチドにおける特異的な位置において定義されたアミノ酸を調製することがライブラリーの合成の間に有用であるが、環状ペプチドの記述における文字の使用は、合成中間体における残基の絶対的な位置を示すことは意図しない。ペプチド骨格の配座は、ペプチド骨格原子の位置だけでなく、ペプチド骨格からのアミノ酸側鎖の突出の角度（Ｃａ−Ｃｂベクター）をも明記する３つの二面角、φ(Ｃ−Ｎ−Ｃ_α−Ｃ)、ψ(Ｎ−Ｃ_α−Ｃ−Ｎ)およびω(Ｃ_α−Ｃ−Ｎ−Ｃ_α )によって測定される。各残基についてのφ、ψおよびωの特異的な値によって特徴付けられる単一のコンホーマーにのみ存在するか、または、相対的に２、３の分離したコンホーマーの平衡混合物として存在する「よく定義された骨格配座」を有するペプチドは、剛直である。各コンホーマーについての全残基の捩れ角度がよく記載されている。かくして、よく定義された骨格配座を有する環状ペプチドは、環を構成する原子および結合が、室温または室温付近でお互いに関係する空間における限定された数の位置だけをエネルギッシュに仮定することができるものであり、これらの位置は、分子模型製作および結晶学の慣用技術によってよく定義される。本明細書では略語を使用して、本発明およびその製造および使用方法を記載する。例えば、ｔ−Ｂuは、第３ブチル基を表し、Ｂocは、ｔ−ブチルオキシカルボニル基を表し、Ｆmocは、フルオレニルメトキシカルボニル基を表し、Ｐhは、フェニル基を表し、Ｃbzは、カルボベンジルオキシ基を表し、ＢrＺは、ｏ−ブロモベンシジルオキシカルボニル基を表し、ＣlＺは、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル基を表し、Ｂnは、ベンジル基を表し、Ｍtsは、４−メトキシ−２, ３,６−トリメチルベンゼンスルホニルを表し、Ｐmcは、ペンタメチルクロマン −６−スルホニルを表し、Ｔsは、トルエンスルホニルを表し、ＤＭＡＰは、ジメチルアミノピリジンを表し、ＤＩＥＡは、ジイソプロピル−エチルアミンを表し、Ａibは、２−アミノ−イソ酪酸を表し、Ｄtcは、５,５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸を表し、Ｔprは、チアゾリジン−４−カルボン酸を表し、Ｔrtは、トリチルを表し、ＨＯＢＴは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを表し、ＴＨＦは、テトラヒドロフランを表し、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドを表し、ＢＯＰは、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ(ジメチルアミノ) ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを表し、ＤＣＣは、ジシクロヘキシルカルボジイミドを表し、ＤＰＰＡは、ジフェニルホスホリルアジドを表し、ＥＤＣは、Ｎ−エチル−Ｎ'(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを表し、ＨＢＴＵは、(１−ヒドロキシベンゾトリアゾリルテトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート)／Ｎ−メチルモルホリンを表し、ＰＰＡは、１−プロパンホスホン酸環状無水物を表し、ＨＦは、塩酸塩を表し、ＬＡＷＥＳＳＯＮ試薬は、２,４−ビス(４−メトキシフェニル)−１,３−ジチア−２,４−ジホスフェタン−２,４−ジスルフィドであり、ＴＨＦは、テトラヒドロフランを表し、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸を表す。ＳＡＳＲＩＮ^R樹脂は、３−メトキシ−４− ヒドロキシメチル−フェノキシメチル化した１％ジビニルベンゼン架橋結合ポリスチレンであり、Ｆmoc保護アミノ酸による直交（orthogonal）保護スキームを使用する。ＰＡＭ樹脂は、４−(ヒドロキシメチル)フェニル−アセトアミドメチル１％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンであり、Ｂoc保護アミノ酸による直交保護スキームにおいて使用される。ＨＭＰＢ樹脂は、樹脂と最初のアミノ酸との間で４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシブタン酸（ＨＭＰＢ）基が切断可能な連結基として結合しているアミノベンジルまたはベンズヒドリルアミンビニルベンゼン架橋結合ポリスチレン樹脂を表し、Ｆmoc保護アミノ酸と一緒に使用される。Ｒink樹脂は、(２,４−ジメトキシフェニル)−ヒドロキシメチル )フェノキシ−メチル１％ジビニルベンゼン架橋結合ポリスチレン樹脂である。本発明において使用されるアミノ酸は、市販されているか、または、慣用の合成方法によって入手可能なものである。ある残基は、ペプチドへの取込みのための特別な方法を必要とする。線状ペプチドへの連続的なおよび収束的な両方の合成方法は、本発明において有用である。例えば、チオアミド同配体は、ジペプチドを合成し、クラウゼン（Ｋlausen）らのケミカ・スクリプタ(Ｃhemica Ｓcrip ta)、２０、１４(１９８２)に開示されているようにジペプチドをＬＡＷＥＳＳＯＮ試薬で処理してアミドをチオアミドに転換し、該ジペプチドを未完成ペプチド配列に導入することによってペプチドに導入される。還元アミド同配体は、例えば、ササキ（Ｓasaki）らのペプタイディス（ＰＥＰＴＩＤＥＳ）、第８巻、１１９（１９８７）またはホチャート（Ｈochart）らのジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Ｊ.Ｍed.Ｃhem.)、３１、１９２０（１９８８）に開示されているように、末端遊離アミンをアミノアルデヒド（対応するアミノ酸から製造された）と反応させ、該イミンを還元することによってペプチドに導入される。ヒドロキシエチレン同配体は、よく知られており、エバンズ(Ｅvans)らのジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.)、５０、４６１５（１９８５）およびケンプ（Ｋempf）のジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.)、５１、３９２１（１９８６）に開示されているように製造される。本発明の環状ペプチドを製造するための一般的な方法は、鎖伸長、側鎖保護ペプチドの固体支持体からの切断、保護ペプチド混合物の環化、次いで、側鎖の脱保護をさせる直交保護スキームを使用する固相ペプチド合成法を含む。種々のランダムペプチド配列が実質的に等しい量でライブラリー中に存在するのが好ましい。本発明の環状ペプチドのランダム配列を製造するためのいくつかの方法が利用可能である。１つの方法は、ａ）樹脂をｎ個の異なるアリコットに分割し(ここで、ｎは、定義されたアミノ酸セットにおけるアミノ酸残基の数である)、ｂ）各アリコットに、いずれかの順序で（１）セットの単一の可変性アミノ酸を徹底的にカップリングさせるか（例えば、各アリコットに、セットされたランダム化された異なるアミノ酸をカップリングさせる）、（２）一定のアミノ酸を徹底的にカップリングさせるか(例えば、全てのアリコットに同一のアミノ酸をカップリングさせる)、または（３）定義されたアミノ酸を徹底的にカップリングさせ、ｃ）可変性アミノ酸を含有するアリコットを再度合わせ、混合し（例えば、別々に、定義されたアミノ酸を含有するアリコットを有する）、ｄ）アミノ酸上の反応性官能基から保護基を除去し、ｅ）５個または６個の残基が付加されるまで、次の残基が可変性または定義されたアミノ酸である場合、工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返して、次の残基をカップリングさせるか、または、次の残基が不変のアミノ酸である場合、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、次の残基をカップリングさせ、ｆ）樹脂からペプチドを切断し、ｇ）ペプチドを環化し、ｈ）保護基を除去することからなることを特徴とする、１カ所以上の位置でアミノ酸のランダム混合物を含有する環状ホモデチックペンターまたはヘキサ−ペプチドのライブラリーのセットの製造方法である。ＷＯ９２／０００９１［バイオリガンド(Bioligand)］に開示されている方法は、線状ペプチドについてのライブラリー中にランダムにアミノ酸残基を取り込むためのライブラリーの分割および組換え方法を開示している。かかるスキームにおいて、不変のアミノ酸残基または配座的に束縛するモチーフは、ライブラリーをアリコットに分割することなく、全ライブラリーを不変のアミノ酸と徹底的にカップリングさせることによって取り込まれる。ランダムアミノ酸をペプチド中に取り込む別の方法は、Ｕ.Ｓ.Ｐ５,０１０, １７５に開示されている。この方法によると、アミノ酸混合物は、個々のアミノ酸がカップリングにおけるそれらの相対的な反応速度に依存して変化する割合で存在する混合物をカップリングさせることによって取り込まれる。例えば、アミノ酸の量は、そのカップリング速度に反比例する。別の方法は、ａ）樹脂に、いずれかの順序で（１）樹脂上の反応性官能基の数と同量のランダム化アミノ酸セットの等モル混合物をカップリングさせるか（例えば、１つの反応性アミノ酸は、樹脂上の各反応性部位について存在する）、（２）一定のアミノ酸をカップリングさせるか、または（３）樹脂をｎ個の分離アリコットに分離し、各アリコットに定義されたアミノ酸をカップリングさせ（次いで、各アリコットに別々に担持させ）(ここで、ｎは、定義されたアミノ酸セットにおけるアミノ酸残基の数である)、ｂ）アミノ酸上の反応性官能基から保護基を除去し、ｃ）５または６個の残基が付加されるまで工程（ａ）を繰り返して前のアミノ酸の反応性官能基に次の残基をカップリングさせ、ｄ）該樹脂からペプチドを切断し、ｅ）ペプチドを環化させ、ｆ）保護基を除去することからなることを特徴とする、１カ所以上の位置でアミノ酸のランダム混合物を含有する環状ホモデチックペンターまたはヘキサ−ペプチドのライブラリー１組の製造方法である。典型的には、樹脂と第１アミノ酸との間のカップリングは、エステル結合を形ＨＭＰＢ、Ｒink、ＰＡＭおよびヒドロキシメチル樹脂が典型的である。カルボン反応は、アミドまたはエステル結合を生じさせるための方法によって行われ、本明細書に記載されている当該技術分野においてよく知られている方法によって行われる。典型的なカルボン剤は、カルボジイミド、活性化無水物およびエステルおよび酸ハロゲン化物である。ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＤＰＰＡ、ＨＰＴＵ、ＰＰＡ、ＢＯＰ試薬、ＨＯＢＴ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび塩化オキサリルなどの試薬が典型的である。各アミノ酸またはペプチドの側鎖の反応性官能基は、ペプチド技術において知られているように保護されるのが好適である。例えば、Ｂoc、ＣbzまたはＦmoc 基は、アミノ基、特に、α−アミノ基の保護のために使用される。アルキル(例えば、t−Ｂu、Ｍe)、cＨexまたはベンジルエステルは、ＡspまたはＧluのカルボキシル側鎖の保護のために使用される。ベンジルまたは好適に置換されているベンジル、トリチルまたはｔ−Ｂu基は、システインまたは他のチオール含有残基のメルカプト基またはＴyr、ＳerまたはＴhrのヒドロキシルを保護するために使用される。Ｃysおよび他の硫黄含有アミノ酸は、アセトアミド基によって、またはチオアルキル（例えば、エチルメルカプタン）またはチオアリール基とのジスルフィド形成によって保護されてもよい。ベンジル／ベンジルオキシメチルまたは好適に置換されているベンジル／ベンジルオキシメチル、Ｂocまたはホルミル基は、Ｈisのイミダゾリル基の保護のために使用され、Ａrgのグアニジノ窒素の保護のためにはＰmc、ニトロまたは好適に置換されているベンゼン−スルホニル基（例えば、Ｔs、Ｍts）が使用される。フタルアミド、Ｂoc、Ｆmoc、カルボベンジルオキシまたはベンジル基または好適に置換されているベンジルまたはベンジルオキシ基は、リシンのε−アミノ酸を保護するために使用される。カルボベンジルオキシまたはベンジル保護基の好適な置換は、５個のクロロ、ブロモ、ニトロ、メトキシまたはメチル基との置換であり、一般にオルトおよび／またはパラであり、保護基の反応性を変化させるために使用される。これらの保護基は、当該技術分野において知られている接触水素添加、アンモニア溶液中ナトリウム、ヒドラジン、塩基、ＴＦＡまたはＨＦ処理などの方法によって除去される。側鎖保護基の選択は、それらが線形ペプチド鎖を形成するためにカップリング反応で使用される反応性官能基（例えば、一般的には、α−アミノ酸）を保護するために使用される条件下で除去されないように選択される。反応性官能基の保護基は、各々連続するアミノ酸をカップリングする前に除去される。該ペプチドは、当該技術分野において知られている方法によって樹脂支持体から切断される。正確な方法は、樹脂の特徴に依存する。Ｒink樹脂、ＨＭＰＢおによって切断される。当業者には、保護基の除去がペプチドの樹脂からの切断と同時に起こることが理解されるであろう。環化方法は、線状ペプチドの末端アミノ基がペプチドの末端カルボキシ基にカップリングされる別のカップリング反応である。ＤＰＰＡは、カップリング反応用の特に有用な試薬である。高希釈の溶液条件下でカップリングを行うのも有用である。またはＨＭＰＢ樹脂などの超酸−不安定樹脂を、側鎖についてα−アミノ保護基およびｔ−ブチルベースの保護基としてＦmocおよびＡrgのグアニジン側鎖についてＰmc（ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）を使用することを含む。当業者に知られているオルトゴナール保護の別のスキームも同様に利用可能であることが明らかである。一般的に、ペプチド鎖の長さおよび該ペプチドにおける各Ｉについてのアミノ酸セットにおけるアミノ酸の数を基本とする起こりうる固有のランダムペプチド配列の数が計算されるであろうし、起こりうるランダム化ペプチド配列の数の少なくとも１０倍モル過剰の該樹脂の反応性部位があるように充分な樹脂が使用されるであろう。Ｃ−末端アミノ酸がランダム化されると、個々のアミノアシルペプチド樹脂の、使用されるアミノ酸の等モル分配との混合物を使用して合成を開始することが好都合である。同一の保護アミノ酸の等モル混合物も製造される。正確に１当量の全アミノ酸に対応する保護アミノ酸混合物のアリコットは、樹脂混合物にカップリングさせられる。典型的な標準は、ＨＢＴＵカップリングなどの迅速なカップリング方法が使用され、該カップリング反応が一晩進行せしめられることである。正確に１当量の全アミノ酸および長いカップリング時間の使用は、混合物中の個々のアミノ酸の異なるカップリング速度について部分的に修正し、アミノ酸の等モル混合物が各位置で得られることを確実にする助けをする。この点で、カイザー試験は、カップリングの完全性を評価するために行われ、所望により、１当量の等モル混合物との再カップリングを行うことができる。保護アミノ酸の等モル混合物の添加は、定義されたアミノ酸が添加される時点まで徐々に進行することができる。この時点で、該樹脂は、混合物のために使用されるアミノ酸の数に対応する多くの等価のアリコットに分割される。各樹脂アリコットは、この時点から個々に処理される。各アリコットは、標準的な固相法を使用して単一のアミノ酸にカップリングされる。さらなるランダム化残基が配列に付加される必要がある場合、それらは、１当量のペプチジル樹脂当たり１当量の全アミノ酸が存在するように注意しつつ、前と同様の等モル混合物を添加される。ペプチド配列の完成後、塩化メチレン中の希（１〜２％）トリフルオロ酢酸による処理によって、保護ペプチド混合物が樹脂から切断され、この反応からの濾液は、メタノール中ピリジンなどの有機塩基で中和される。側鎖保護ペプチド混合物は、エチルエーテルの添加によって沈殿され、遠心分離または濾過によって回収される。側鎖保護ペプチド混合物は、１.１当量のジフェニルホスホリルアジドおよびジイソプロピル−エチルアミンなどの２.２当量の第３級塩基を使用してＤＭＦ中で環化される。ペプチドの濃度は、約５mＭであり、反応は、室温で数時間、次いで、４℃で一晩進行せしめられる。溶媒は、蒸発によって除去され、環状ペプチド混合物の側鎖は、室温で２時間、トリフルオロ酢酸、アニソール、水（および所望によりエタンジチオール）の混合物による処理により脱ブロックされる。脱保護ペプチドは、エチルエーテルの添加によって沈殿し、遠心分離または濾過によって回収される。次いで、完全に脱保護された環状ペプチド混合物を１０％酢酸水溶液に溶解させ、ゲル濾過カラムを通過させて、残存する有機不純物を除去する。全ペプチドピークを回収し、凍結乾燥させて、環状ペプチドライブラリーの１つのプールを得る。線状ペプチドは、すべての実施目的のために、無数のポテンシャル配座を有する。したがって、それらは、標的分子に結合する非常に多数の配座を採用することができるように最大限に柔軟である。逆に、それらは、それらが標的分子に結合する配座に関する多くの情報を与えることができない。例えば、ペプチドが高いエネルギー配座で結合しているか、または低いエネルギー配座で結合しているかを知ることができない。対応する線状ペプチドと比較して、しばしば結合のために好ましい位置におけるポジティブ官能基がそれらの配座により、有効かつ選択的である。かくして、アミノ酸の側鎖上の官能基は、お互いに比較してスペースにおける減少した位置を仮定することができる。環化ペプチドは、線状ペプチドについての低いエネルギー配座を構成するものを達成することができないので、それらは、好ましい配座でさらに何回も使用することができる。さらに、それらは、ある配座を達成することができないので、それらは、増大した選択性を生じる対応する線状ペプチドほど多くは外来分子に結合できない。ホモデチックペプチドを得るための線状ペプチドの環化は、環状ペプチドに利用可能な配座の数を束縛する。許容される配座およびそれらのエネルギーは、分子モデリング方法を使用して評価することができ、熟練した化学者は、標的分子に結合するペプチドにおける官能基の好ましい位置に関して仮定を行うことができる。次いで、これは、好ましい結合特性を有する他の分子、例えば、非ペプチドの合理的な設計の助けをする。大きなサイズの環状ペプチドがあまり配座リジディティを有さず、一般的に分析に従わないので、本発明のペプチドは、５または６個の残基を有するものであるのが好ましい。５または６個の残基のペプチドでさえ、分析を困難にする多数の配座を採用することができる。それらの成分の空間的な方向があまりよく決定されない。許容される配座の数は、さらに、配座的束縛素子を環状ペプチド中に取り込むことによって減少させることができる。配座的束縛素子は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせであり、それらの固有の構造により、環化ペプチドの骨格におけるある種の結合の回りの回転に対するエネルギーバリヤーを生じる。したがって、環状ペプチドについての利用可能な配座の数は、さらに減少し、その結果、ペプチドは、よく定義された骨格配座を有する。配座的束縛素子の例は、ＰroまたはＡib残基、還元されたジペプチド同配体、または、ペンタペプチドにおいてγ−回転を誘発するチオアミド同配体、環状ヘキサペプチドにおいてβ −回転を誘発するＰro-Ｄ−Ｐro、環状ヘキサペプチドにおいて伸長した骨格配座を誘発するＤ−Ｐro−Ｇly−Ｐroである。かかる素子は、例えば、ペイショッフ（Ｐeishoff）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Ｊ.Ｍed. Ｃhem.)、３５、３９６２（１９９２）によって開示されている。これらの素子は、大きな基の所有による立体障害によるある種の結合の回りの回転を制限することにより(例えば、Ａib、Ｃ_α−メチルアミノ酸、Ｎ_α−メチルアミノ酸)、または、環構造における炭素骨格の素子を取り込むことにより(例えば、Ｐro)、または、連結残基との水素結合を形成することにより（例えば、チオアミド同配体、ジペプチド同配体）それらの効果を有する。他の配座的束縛素子は、これらの原理を使用する当該技術から設計または選択される。ペプチド混合物における環化の効率および完全性は、正確にはモニターすることができず、実際に、エネルギー的に好都合ではないので、環化反応の間に実質的に環化されないペプチドもある。典型的には、長い反応時間を使用し、環化の部位は、あまりラセミ化しないアミノ酸が線状ペプチドのカルボキシ末端部分を占有する（例えば、ラセミ化を最小限にする）ように選択される。したがって、別の態様では、本発明は、有効な環化を誘発するための部位においてペプチドにおいて配座的束縛素子を取り込むことからなる改良された線状ペプチド環化方法である。好ましくは、配座的束縛素子は、ペプチドの中間位置に取り込まれ、その結果、末端アミノおよびカルボキシ基が配座的束縛素子によって空間的に近位になる。かくして、本発明の線状ペプチドは、好ましくは、最適な環化のために設計される。例えば、本明細書に記載するように、ペプチド（例えば、γ−回転）のさらなる配座的束縛を誘発するためにプロリン残基を取り込む場合、線状ペプチドの第３の位置においてそれを置くことは、迅速かつ実質的に完全な環化を促進する。かかる場合、環化の速度は、他の４個のアミノ酸の性質に非常に依存していると思われ、環化は、ＤＰＰＡを使用して室温で約１時間以内に実質的に完了する。これは、プロリンが同一ペプチドに取り込まれる場合と対照しているが、環化は、ペプチドの末端（例えば、第１または第５）位置のプロリンにより影響される。後者の場合の環化は、約３日間取り、実質的な完了まで操作される。例えば、分子モデリング、規則的合成、および、所望により、結晶化および結晶構造分析により配座的束縛についてのモチーフを発明することは、当該技術分野の技術の範囲内である。ライブラリーの範囲内に含まれ、束縛を取り込む２、３の単純ペプチドに対する効果を研究することによって、配座的に束縛するモチーフについての適正な置換を測定することもできる。例えば、ＰroおよびＡibは、ペンタペプチドの３位にあるのが好ましくは、Ｐro−Ｄ−Ｐroは、３および４位にあるのが好ましく、Ｐro−Ｇly−Ｐroは、典型的には、線状ヘキサペプチドの２、３および４位にある。収束的なアプローチを使用して、標的分子についての最適化された結合ペプチドを見いだすことができる。収束的なアプローチによると、少なくとも１つのアミノ酸残基が定義されているライブラリーのセミランダムセットがスクリーンされる。定義されたアミノ酸セットにおけるアミノ酸の数がｎである場合、これは、ｎ個のライブラリーのスクリーニングを生じる。スクリーンの結果に基づいて、最適な活性を有するライブラリー（または、２、３のライブラリー）が同定される。最適な活性を有するライブラリーは、その定義されたアミノ酸の同一性および位置によって特徴付けられる。最適な定義されたアミノ酸が第１のスクリーンにおいて同定され、ライブラリーの全体にわたって一定であり、第２残基が定義されているライブラリーの第２のセットが構築される。このライブラリーの第２セットをスクリーンし、最適な定義された残基を同定し、前記で定義された最適な定義されたアミノ酸の両方がライブラリーの全体にわたって一定であるライブラリーの新しいセットを構築する。この方法は、ペプチドの全ての残基が最適化されるまで、反復的に繰り返される。もちろん、１個を超えるアミノ酸が存在するライブラリーを生じることは、当該技術分野の技術の範囲内であり、これは、ｎ^d個のライブラリーのスクリーニングを必要とするであろう[ここで、ｎは、前記定義と同じであり、ｄは、定義されたアミノ酸残基の数である]。配座的に束縛するモチーフがペプチド中に存在する場合、該モチーフからなる残基の同一性および位置は、全てのライブラリーの全体にわたって一定である。この収束的な方法のバリエーションは、最適なペプチドが収束される方法によって生じる。この方法では、１個を超える最適なペプチドが同定される。例えば、第１の定義されたアミノ酸のカルボキシ末端から配列において各残基を反復的に最適化することによってペプチドを最適化する。別法としては、第１の定義された残基のアミノ末端からの配列における各残基を最適化する。かかる収束的なスキームにより、 [ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴およびＸ⁶は、アミノ酸のランダム化混合物であり、Ｘ⁵は、アミノ酸の混合物であるか、または不在であり、Ｏ¹〜Ｏ⁴のうち１つは、定義されたアミノ酸であり、残りの残基は、不変のアミノ酸であり、Ｏ⁵は、定義されたアミノ酸もしくは不変のアミノ酸であるか、または不在である] の形態のライブラリーのセットが調製される。別のバリエーションにおいては、第１の定義されたアミノ酸から他の残基ごとに最適化することができる。かくして、ライブラリーのセットは、 [ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴およびＸ⁶は、アミノ酸のランダム化混合物であり、Ｘ⁵は、アミノ酸の混合物であるか、または不在であり、Ｏ¹〜Ｏ⁵のうち１つは、定義されたアミノ酸であり、残りの残基は、不変のアミノ酸である] の形態である。ゲイセン（Ｇeysen）ら、Ｂiorg.Ｍed.Ｃhem.Ｌett.、３、３９７（１９９３）には、線状ペプチドを最適化するためのアプローチが開示されている。本発明は、基質に関する所望の活性を有するペプチドを同定することからなる本発明のライブラリーの使用方法を構成する。この方法によると、ライブラリーは、標的分子と接触し、ライブラリーのペプチドと標的分子または生物的系との間の相互作用が評価される。該相互作用を定量化する一般的な方法は、結合アッセイおよび生物活性アッセイによる。本発明のペプチドは、固定化ペプチドライブラリーとは異なり、可溶性および固定化標的分子の両方と相互作用するので、かかるアッセイによく適している。基質について結合リガンドを選択する方法は、ａ）ライブラリーが、少なくとも１カ所における第１の定義されたアミノ酸および１カ所以上のアミノ酸のランダム混合物を有する基質に対する環状ホモデチックペンタ−またはヘキサ−ペプチドのライブラリー１組をスクリーニングし、ｂ）最大活性を有するライブラリーを測定し、ｃ）最大活性を有するライブラリーにおいて第１のアミノ酸の同一性を測定し、ｄ）第１のアミノ酸が最大活性を有すると定義されるものであり、第２のアミノ酸が各ライブラリーについて定義される環状ホモデチックペンタ−またはヘキサ−ペプチトの第２回収を生じ、ｅ）最大活性を有するライブラリーを測定し、ｆ）第２のアミノ酸の同一性を測定し、ｇ）最大結合配列が全ての位置について同定されるまで、工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返すことからなる。「結合リガンド」は、ライブラリーにおける１個以上のペプチドまたはライブラリーのセットである。「基質」は、一般に、標的分子または結合もしくは生物学的応答のようないくつかの相互作用を示すことができる生物学的系である。典型的な基質標的分子は、タンパク、炭化水素、核酸、脂質、糖タンパク、糖脂質、ウイルスまたは細菌または薬物、または特に、レセプター、抗体、酵素、成長因子、ホルモン、または、成長因子もしくはホルモンの作動薬または拮抗薬である。該基質は、細胞、組織、器官または微生物などの生物系、または、細胞、組織、器官または微生物のホモジネートであってもよい。例えば、該基質は、ウイルス、細菌または真菌類(いずれも、天然またはクローン化標的分子を発現していてもよい)、脳組織、腎組織または血管組織由来のような組織ホモジネート、血液、骨、皮膚または神経細胞系（再度、いずれも、天然またはクローン化標識分子を発現していてもよい）などの培養哺乳動物細胞系または調製物であってもよい。最大活性の測定は、最大結合、または最大もしくは最小阻害、刺激、または他の生物学的応答を用いてライブラリーを測定することによる。結合アッセイは、結合リガンドの検出のためのよく知られている好都合な方法である。例えば、ライブラリーの、標的分子、細胞または組織ホモジネートからの放射性リガンドの阻害能または置換能を測定する。直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡおよび競争ＥＬＩＳＡは、標的分子に結合する抗体の測定および／またはマーカー分子の存在の同定のための当該技術分野でよく知られている好都合な方法である（例えば、メディエーター放出）。生物活性アッセイは、一般に、生物学的応答の程度が測定される細胞ベースまたは組織ベースのアッセイである。例えば、細胞毒性の程度、イオン束密度、極性の変化、放出された媒介物質の量、刺激、増殖、収縮、またはペプチドライブラリーと標的分子もしくは細胞との間の接触により生じる他の生理学的変化が測定される。別法としては、ペプチドライブラリーの濃度の制御によって、所定のパーセントの生物学的応答を生じるための有効投与量が測定される(例えば、５０％応答［ＥＣ₅₀］を生じる濃度、または応答の５０％阻害［ＩＣ₅₀］を生じる濃度)。生物活性アッセイは、結合アッセイなどの他のアッセイと一緒に用いてもよく、その結果、定量化は、間接的である。かかる方法は、当該技術分野においてよく知られている。結合リガンドの選択方法のプラクティスは、疾患の治療、予防もしくは改善または若干の生物的機能の遂行または増強のための治療薬を同定させる。例えば、当該方法によって同定された治療薬は、酵素阻害薬、レセプター作動薬、レセプター拮抗薬、抗菌剤またはワクチンである。さらにまた、結合リガンドの同定は、生物学的活性を増強した結合リガンドの誘導体または類似体を同定せしめる。以下の実施例は、本発明のライブラリーの製造方法および使用ならびに方法を説明するものであり、如何なる場合も限定するものではない。実施例１環化によって束縛されるペンタペプチドライブラリーおよび不変のＰro残基を使用するエンドセリンのその天然レセプターへの結合の阻害薬の同定。Ｐroを残基１であると考えると、当該セットは、残基３についての天然Ｌ−アミノ酸（ＣysおよびＰroを除く）ならびに、残基２、４および５についての天然アミノ酸（ＣysおよびＰroを除く）のＤ−異性体からなる(しかしながら、Ｐro は、線状ペプチドにおける第３の位置を占めて、有効な環化を促進させると思われる)。ペプチドライブラリーの構築のための一般的な方法を、１３０℃で４時間、ＨＣl／プロピオン酸（１：１）中で加水分解し、アミノ酸分析により、ほぼ等モル量の１８個のアミノ酸全てを含有することが判明した。ＤＭＦ４０mＬの全体積中に各々０.８mmolの、Ｆmoc−Ｄ−Ａla、Ｆmoc−Ｄ −Ａrg(ＰＭＣ)、Ｆmoc−Ｄ−Ａsn、Ｆmoc−Ｄ−Ａsp(t-Ｂu)、Ｆmoc−Ｄ−Ｇln 、Ｆmoc−Ｄ−Ｇlu(t-Ｂu)、Ｆmoc−Ｇly、Fmoc−Ｄ−Ｈis(Ｔrt)、Ｆmoc−Ｄ− Ｉle、Ｆmoc−Ｄ−Ｌeu、Ｆmoc−Ｄ−Ｌys(Ｂoc)、Ｆmoc−Ｄ−Ｍet、Ｆmoc−Ｄ −Ｐhe、Ｆmoc−Ｄ−Ｐhe、Ｆmoc−Ｄ−Ｓer(t-Ｂu)、Ｆmoc−Ｄ−Ｔhr(t-Ｂu) 、Ｆmoc−Ｄ−Ｔrp、Ｆmoc−Ｄ−Ｔyr(t-Ｂu)およびＦmoc−Ｄ−Ｖalを溶解させることによって、Ｆmoc−Ｄ−アミノ酸の母液を調製した。間脱ブロックし、ＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＭＦ中、３.６mmolのＨＢＴＵおよび７.２mmolのＤＩＥＡを使用して、３.６mmolの全アミノ酸と等価の母液の１０mＬアリコットにカップリングさせた。ニンヒドリン試験は、完全なカップリングが起こらなかったことを示し、そこで、同量の試薬を用いて２時間結合を繰り返した。ニンヒドリン試験は、陰性であり、これは、完全なカップリングを示ＨＣl／プロピオン酸（１：１）中で加水分解し、アミノ酸分析に付した。これを示した。これにより、ほぼ等モルのアミノ酸カップリングが得られたことが判明した。洗浄し、次いで、一晩、ＨＢＵＴ（１０.８mmol、３当量）およびＤＩＥＡ（２１.６mmol、６当量）を使用して、Ｆmoc−Ｐro（１０.８mmol、３当量）にカップリングさせた。ニンヒドリン試験は、陰性であり、これは、完全なカップリンおよび洗浄し、前記と同様に、一晩、ＤＭＦ中、３.６mmolのＨＢＴＵおよび７. ２mmolのＤＩＥＡを使用して、３.６mmolの全アミノ酸を含有するＦmoc−Ｄ−Ｘ母液のアリコットにカップリングさせた。ニンヒドリン試験は、完全なカップリングが起こらなかったことを示しており、そこで、同量の試薬を用いてカップリングを４時間繰り返した。ニンヒドリン試験は、陰性であり、これは、完全なカッ脂が得られた。該樹脂を洗浄し、一晩、真空乾燥させて、７.４gを得た。これを、ライブラリーの完成のために各々０.４１gの等しいアリコット１８個に分けた。ライブラリー１シクロ[Ｄ−Ｏ⁴−Ｄ−Ｘ⁵−Ｐro¹−Ｄ−Ｘ²−Ｘ³]の調製残基４での定義されたアミノ酸ａ）シクロ[Ｄ−Ａla−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１）の０.４１g（０.２mmolと等価）アリコットを、２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いて２０分間脱保護し、ＤＭＦで洗浄し、０.６mmolのＨＢＴＵおよび１.２mmol のＤＩＥＡを３時間使用して、０.６mmolのＦmoc−Ｄ−Ａlaにカップリングさせた。ニンヒドリン試験は、陽性であり、そこで、同量の試薬を用いて一晩カップリングを繰り返した。ニンヒドリン試験は、陰性であり、２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いてペプチジル樹脂を再度脱ブロックし、洗浄し、一晩乾燥させた。１％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃl₂ ５mＬを２分間用いて、保護されたペプチドを樹脂から切断し、低アルゴン圧下、１０％ピリジン／ＭeＯＨを含有する遠心管中に直接濾過した。この方法を、毎回、１０％ピリジン／ＭeＯＨを含有する新しい遠心管を使用して４回繰り返した。ピリジン／ＭeＯＨ溶液を約半分の体積に減少させ、エーテルの添加によりペプチドを沈殿させた。該ペプチドを遠心分離によって回収し、エーテルをデカントし、ペプチドをエーテルに再懸濁させ、再度、遠心分離に付した。これを２回繰り返し、次いで、ペプチドを一晩風乾した。乾燥した沈殿物を合わせて、１３０mgを得た。保護した線状ペプチドをＤＭＦ１０mＬに溶解させ、次いで、トリエチルアミン３０μＬ（０.２２mmol、１.１当量）に溶解させた。該溶液を０℃に冷却し、ジフェニルホスホリルアジド（０.２０mmol、１当量）を添加した。該溶液を室温に加温し、一晩撹拌した。次いで、該溶液を真空下で除去し、得られたガラス状物を一晩乾燥させた。該残留物をＴＦＡ１０mＬ、チオアニソール０.５mＬ、水０.５mＬおよびエタンジチオール０.５mＬの混合物で２時間処理した。該混合物を２本の遠心管に移し、氷冷エーテルの添加により、ペプチドを沈殿させた。該ペプチドを遠心分離により回収し、エーテルで２回洗浄した。次いで、沈殿物を濾過により回収し、風乾させ、氷酢酸に溶解させ、凍結乾燥させて、環状ペプチド２９.９mgを得た。該ペプチドを１０％ＨＯＡcに溶解させ、１.６×６０cmのセファデックス（Ｓ ephadex^TM）Ｇ−１５カラムに適用し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ− ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプール２８.０mgを得た。ｂ）シクロ[Ｄ−Ａrg−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（２）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ａrg(Ｐmc)−Ｄ−Ｘ− Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、２２６mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化させ、側鎖を脱保護し、凍結乾燥後、６４.８mg を得た。環状ペプチドを１.６×６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｃ）シクロ[Ｄ−Ａsn−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（３）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ａsn−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ −Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、１７３mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護し、凍結乾燥後、４６.６mgを得た。環状ペプチドを１.６×６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｄ）シクロ[Ｄ−Ａsp−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（４）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ａsp(ｔ−Ｂu)−Ｄ− Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、１４０mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護し、凍結乾燥後、３５.９mgを得た。環状ペプチドを１.６×６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｅ）シクロ[Ｄ−Ｇln−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（５）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ｇln−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ −Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、２０３mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護し、凍結乾燥後、７１.２mgを得た。環状ペプチドを１.６×６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｆ）シクロ[Ｄ−Ｇlu−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（６）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ｇlu(ｔ−Ｂu)−Ｄ− Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、１５１mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護し、凍結乾燥後、３８.８m gを得た。環状ペプチドを１.６×６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ− １５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄ ）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｇ）シクロ[Ｇly−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（７）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＧly−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ− Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、１２０mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護した。環状ペプチドを１.６×６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｈ）シクロ[Ｄ−Ｈis−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（８）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ｈis(Ｔrt)−Ｄ−Ｘ− Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、１１３mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護した。環状ペプチドを１.６× ６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡc で溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｉ）シクロ[Ｄ−Ｉle−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（９）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ｉle−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ −Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、１４４mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護した。環状ペプチドを１.６×６０cm のセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｊ）シクロ[Ｄ−Ｌeu−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１０）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ｌeu−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ −Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、２８９mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護した。環状ペプチドを１.６×６０cm のセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。ｋ）シクロ[Ｄ−Ｌys−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１１）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ｌys(Ｂoc)−Ｄ−Ｘ− Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、２１３mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護した。環状ペプチドを１.６× ６０cmのセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡc で溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。１）シクロ[Ｄ−Ｍet−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１２）（１）におけると同様に、保護された線状ペプチドＤ−Ｍet−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ −Ｘ−Ｘを調製し、樹脂から切断して、２４６mgを得た。（１）におけると同様に、該ペプチドを環化し、側鎖を脱保護した。環状ペプチドを１.６×６０cm のセファデックス（Ｓephadex^TM）Ｇ−１５カラムに通し、１０％ＨＯＡcで溶離した。全てのＵＶ−ポジティブ（Ａ₂₅₄）物質を回収し、プールし、凍結乾燥させて、標記ペプチドプールを得た。Ｄ−Ａlaを適切なアミノに代えた以外は、１(ａ)の方法を使用して、以下のライブラリーを調製した。ｍ）シクロ[Ｄ−Ｐhe−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１３）ｏ）シクロ[Ｄ−Ｓer−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１４）ｐ）シクロ[Ｄ−Ｔhr−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１５）ｑ）シクロ[Ｄ−Ｔyr−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１６）ｒ）シクロ[Ｄ−Ｖal−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１７）ｓ）シクロ[Ｄ−Ｔrp−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（１８）ライブラリー２〜５各々の位置について同一のアミノ酸セットを用い、適切な位置で適切な定義されたアミノ酸を代わりに用いる以外は、１(ａ)〜１(ｓ)の方法を使用して、以下のライブラリーを調製した。シクロ[Ｄ−Ｘ−Ｄ−Ｏ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｘ]（２０）シクロ[Ｄ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｏ−Ｘ]（２１）シクロ[Ｄ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｐro−Ｄ−Ｘ−Ｏ]（２２）ライブラリー６〜８ライブラリー１〜１８を使用してエンドセリン（endothelin）結合アッセイを行い、エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーを同定する。５位において適切な定義されたアミノ酸を代わりに用いる以外は、実施例１(ａ)〜１(ｓ) の方法に従って、式シクロ[Ｄ−Ａ⁴−Ｄ−Ｏ⁵−Ｐro¹−Ｄ−Ｘ²−Ｘ³]［ここで、１位および４位は、不変のアミノ酸残基である］のライブラリー６を構築するための基礎として、エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーに対応する４位の既知のアミノ酸（Ａ⁴）を使用する。ライブラリー６を使用してエンドセリン結合アッセイを行い、エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーを同定する。２位において適切な定義されたアミノ酸を代わりに用いる以外は、実施例１(ａ)〜１(ｓ)の方法に従って、シクロ[Ｄ−Ａ⁴−Ｄ−Ａ⁵−Ｐro¹−Ｄ−Ｏ²−Ｘ³]［ここで、１位、４位および５位は、不変のアミノ酸残基である］のライブラリー７を構築するための基礎として、エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーに対応する５位の既知のアミノ酸（Ａ⁵）を使用する。ライブラリー７を使用してエンドセリン結合アッセイを行い、エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーを同定する。３位において適切な定義されたアミノ酸を代わりに用いる以外は、実施例１(ａ)〜１(ｓ)の方法に従って、シクロ[Ｄ−Ａ⁴−Ｄ−Ａ⁵−Ｐro¹−Ｄ−Ａ²−Ｏ³]［ここで、１位、２位、４位および５位は、不変のアミノ酸残基である］のライブラリー８を構築するための基礎として、エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーに対応する２位の既知のアミノ酸（Ａ²）を使用する。ライブラリー８を使用してエンドセリン結合アッセイを行い、エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーを同定する。エンドセリン結合の最大阻害を有するライブラリーに対応する３位の既知のアミノ酸（Ａ³）を同定し、これにより、前記アミノ酸セットを使用するエンドセリン結合の阻害薬について、最適化ペンタペプチド配列シクロ[Ｄ−Ａ⁴−Ｄ−Ａ⁵−Ｐro¹−Ｄ−Ａ²−Ａ³]が完成される。ライブラリー２〜５を用いて開始することによるなど、異なる順序、または可変性の順序でアミノ酸残基を最適化すること以外は、同様のアプローチを使用して、最適な結合配列が確認されるか、または、他の最適化ペプチド結合配列がエンドセリン結合の阻害について同定される。さらなる最適化配列は、種々の位置について使用されるアミノ酸セットを変えることによって得られる。エンドセリン（ＥＴ）結合の阻害についての結合アッセイＡ）膜調製ラットの小脳または腎皮質を迅速に解剖し、液体窒素中ですぐに冷凍するか、または、生で使用した。電動式ホモジナイザーを使用して、４℃で、２０mＭトリスＨＣlおよび５mＭＥＤＴＡを含有する緩衝液（pＨ７.５）１５mＬに、小脳については１〜２g、腎皮質については３〜５gの組織をホモジナイズした。ホモジネートをチーズクロスを介して濾過し、４℃で１０分間、２０,０００×ｇで遠心分離した。上清を取り出し、４℃で３０分間、４０,０００×ｇで遠心分離した。得られたペレットを、５０mＭトリス、１０mＭＭgＣl₂を含有する少量の緩衝液（pＨ７.５）に再懸濁し、小さなバイアルにアリコットを取り、液体窒素中で冷凍した。膜を希釈して、結合アッセイにおいて小脳および腎皮質のために各管についてタンパク１mgおよび５mgを得た。新しく単離したラットの腸間膜動脈および側副枝血管床を氷冷生理食塩水（氷上）中で洗浄し、主要な血管に沿ってリンパ節を取り出した。次いで、側副枝血管床〜６mgについて、４℃、２０mＭトリスおよび５mＭＥＤＴＡを含有する緩衝液（pＨ７.５）中のポリトロンを体積１５mＬで使用して、該組織をホモジナイズした。ホモジネートをチーズクロスを介して濾過し、４℃で１０分間、２, ０００×ｇで遠心分離に付した。上清を取り出し、４℃で３０分間、４０,０００×ｇで遠心分離に付した。小脳および腎皮質について前記したと同様に、得られたペレットを再懸濁させた。結合実験において、各管について膜タンパク約１０mgを使用した。Ｂ）[¹²⁵Ｉ]ＥＴ−１結合プロトコール合計体積１００mＬの５０mＭトリスＨＣl、１０mＭＭgＣl₂、０.０５％ＢＳＡ、pＨ７.５緩衝液中、３０℃で６０分間インキュベートした後、ラットの小脳からの膜（タンパク２〜５mg／アッセイ管）または腎皮質からの膜（タンパク３〜８mg／アッセイ管）に結合する[¹²⁵Ｉ]ＥＴ−１を測定した。緩衝液または所定濃度の化合物を含有する管に膜タンパクを添加した。ＢＳＡを含有する同一の緩衝液中で[¹²⁵Ｉ]ＥＴ−１（２２００Ｃi／mmol）を希釈して、最終濃度０.２〜０.５nＭのＥＴ−１を得た。１００nＭ非標識ＥＴ−１の不在および存在下、全非特異的結合を測定した。インキュベーション後、５０mＭトリスおよび１０m ＭＭgＣl₂を含有する冷緩衝液（pＨ７.５）３.０mＬを用いて停止させた。ワットマンＧＦ／Ｃ濾紙を介して濾過し、該フィルターを、ブランドル（Brandel）セルハーベスターを使用して冷緩衝液３mＬを用いて５回洗浄することによって、膜結合放射能を遊離リガントから分離した。７５％の効率を有するガンマーカウンター中で濾紙をカウントした。本発明は、前記具体例の範囲に限定されるものではなく、前記方法の種々の変形は、当業者に明らかであろう。かかる変形は、以下の請求の範囲によりのみ限定される本発明に含まれるものである。本明細書において引用される種々の文献の記載は、従来技術を開示するものであり、出典明示により明細書の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ムーア，マイケル・リーアメリカ合衆国ペンシルベニア州19063、メディア、サウス・ジャクソン・ストリート417番

Claims

【特許請求の範囲】１．１カ所以上の位置のアミノ酸の可変性混合物および少なくとも１カ所における定義されたアミノ酸からなる環状ホモデチックペンターおよびヘキサ−ペプチドライブラリーのセットからなる組成物。２．ライブラリーのペプチド骨格がよく定義されたペプチド骨格構造を有する請求項１記載の組成物。３．式(Ｉ)：［式中、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、Ｘ⁵およびＸ⁶は、各々独立して、アミノ酸の可変性混合物である；ただし、少なくとも１つの残基は、既知であり、１つの残基は、所望により存在しなくてもよい］で示される環状構造を有する請求項１記載の組成物。４．環状ホモデチックペプチドライブラリーが式：［式中、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴およびＸ⁶は、アミノ酸のランダム化混合物であり、Ｘ⁵は、アミノ酸の混合物であるか、または、存在せず、Ｏ¹〜Ｏ⁴のうち１つは、定義されたアミノ酸であり、残りの残基は、不変のアミノ酸であり、Ｏ⁵は、定義されたアミノ酸もしくは不変のアミノ酸であるか、または、存在しない］を有する請求項１記載の組成物。５．環状ホモデチックペプチドライブラリーが式：［式中、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴およびＸ⁶は、アミノ酸のランダム化混合物であり、Ｘ⁵は、アミノ酸の混合物であるか、または、存在せず、Ｏ¹〜Ｏ⁵のうち１つは、定義されたアミノ酸であり、残りの残基は、不変のアミノ酸である］を有する請求項１記載の組成物。６．アミノ酸が天然アミノ酸のＤ−またはＬ−異性体のいずれかから選択される請求項３記載の組成物。７．Ｏ¹、Ｏ¹−Ｏ²またはＯ¹−Ｏ²−Ｏ³が配座的に収縮する素子からなる請求項４記載の組成物。８．Ｏ¹がＰroであるか、または、Ｏ¹−Ｏ²がＤ−Ｐro−Ｐroであるか、または、Ｏ¹−Ｏ²−Ｏ³がＤ−Ｐro-Ｇly−Ｐroである請求項４記載の組成物。９．Ｘ²、Ｘ⁴およびＸ⁶がＤ−配置のアミノ酸（またはＧly）であり、Ｘ³がＬ −配置のアミノ酸（またはＧly）であり、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴およびＸ⁶の少なくとも１つがその位置について適切な光学的配置のアミノ酸のランダム化混合物である配列[Ｐro−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁶]からなる請求項８記載の組成物。１０．アミノ酸がα−アミノ酸のいずれかから選択される請求項９記載の組成物。１１．ａ）樹脂に、いずれかの順序で（１）樹脂上の反応性官能基の数と同量のランダム化アミノ酸セットの等モル混合物を結合させるか、（２）不変のアミノ酸を結合させるか；または（３）該樹脂をｎ個の分離アリコットに分離し、定義されたアミノ酸を各アリコットに結合させ（ここで、ｎは、定義されたアミノ酸セットにおけるアミノ酸残基の数である）；ｂ）アミノ酸上の反応性官能基から保護基を除去し；ｃ）工程（ａ）を繰り返し、５個または６個の残基が付加されるまで、前のアミノ酸の反応性官能基に次の残基を結合させ、ｄ）該樹脂からペプチドを切断し、ｅ）該ペプチドを環化し、ｆ）いずれの保護基をも除去することからなることを特徴とする、１カ所以上の位置のアミノ酸のランダム化混合物を含有する環状ホモデチックペンターまたはヘキサ−ペプチドのライブラリーのセットの製造方法。１２．ａ）樹脂をｎ個の異なるアリコットに分割し(ここで、ｎは、定義されたアミノ酸セットにおけるアミノ酸残基の数である)、ｂ）各アリコットに、いずれかの順序で（１）セットの単一の可変性アミノ酸を徹底的に結合させるか（例えば、各アリコットに、ランダム化されたセットの異なるアミノ酸を結合する）、（２）不変のアミノ酸を徹底的に結合させるか(例えば、全てのアリコットに同一のアミノ酸を結合する)、または（３）定義されたアミノ酸を徹底的に結合させ、ｃ）可変性アミノ酸を含有するアリコットを再度合わせ、混合し（例えば、別々に、定義されたアミノ酸を含有するアリコットを有する）、ｄ）アミノ酸上の反応性官能基から保護基を除去し、ｅ）５個または６個の残基が付加されるまで、次の残基が可変性または定義されたアミノ酸である場合、工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返して、次の残基を結合するか、または、次の残基が不変のアミノ酸である場合、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、次の残基を結合し、ｆ）樹脂からペプチドを切断し、ｇ）該ペプチドを環化し、ｈ）保護基を除去することからなることを特徴とする、１カ所以上の位置のアミノ酸のランダム混合物を含有する環状ホモデチックペンターまたはヘキサ−ペプチドのライブラリーのセットの製造方法。１３．ａ）ライブラリーが、少なくとも１カ所の位置の第１の定義されたアミノ酸および１カ所以上の位置のアミノ酸のランダム混合物を有する基質に対する環状ホモデチックペンターまたはヘキサ−ペプチドのライブラリーのセットをスクリーニングし、ｂ）最大活性を有するライブラリーを測定し、ｃ）最大活性を有するライブラリーにおいて第１のアミノ酸の同一性を測定し、ｄ）第１のアミノ酸が最大活性を有すると定義されるものであり、第２のアミノ酸が各ライブラリーについて定義される環状ホモデチックペンターまたはヘキサ−ペプチドのライブラリーの第２回収を生じ、ｅ）最大活性を有するライブラリーを測定し、ｆ）第２のアミノ酸の同一性を測定し、ｇ）最大結合配列が全ての位置について同定されるまで、工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返すことからなることを特徴とする、基質についての結合リガンドを選択する方法。１４．基質がタンパク、炭水化物、核酸、脂質、糖タンパク、糖脂質、ウイルスまたは細菌または薬物である請求項１３記載の方法。１５．基質がレセプター、抗体、酵素、成長因子、ホルモン、または成長因子もしくはホルモンの作動薬もしくは拮抗薬である請求項１４記載の方法。１６．請求項１３記載の方法で測定された環状ペンターまたはヘキサ−ペプチドからなる治療薬。１７．ペプチドが酵素阻害薬、レセプター作動薬、レセプター拮抗薬、抗菌薬またはワクチンである請求項１６記載の治療薬。