BR112015031679B1

BR112015031679B1 - Método para a preparação de um peptídeo contendo arginina ou homo-arginina

Info

Publication number: BR112015031679B1
Application number: BR112015031679-4A
Authority: BR
Inventors: Kleomenis Barlos; Kostas BARLOS; Dimitrios GATOS
Original assignee: Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S.A.
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2024-03-05
Also published as: WO2014203193A1; EP3010930A1; AU2014282839A1; ES2753407T3; CA2915439C; AU2014282839B2; BR112015031679A8; BR112015031679A2; GB201310921D0; CN105408344A; HK1217022A1; US20160137689A1; CN105408344B; CA2915439A1; EP3010930B1; AU2014282839B9

Abstract

conjugado de peptídeo-resina, seu uso, processo para sua produção, peptídeo e método para sua preparação. a presente invenção se refere a um processo para a inertização de um primeiro gás que contém oxigênio, o qual está contido em um compartimento de proteção (4) que envolve uma célula de combustível (1), no qual é introduzida uma quantidade previamente determinada de um segundo gás que contém hidrogênio no compartimento de proteção (4) e, pelo menos, uma parte do oxigênio contido no primeiro gás é reduzida por meio de combustão a frio.

Description

[0001] A presente invenção refere-se aos conjugados de peptídeo- resina adequados para uso na síntese de peptídeos. Mais especificamente, a invenção refere-se aos peptídeos curtos contendo ácidos de diamino na sua sequência, e ao seu uso na síntese de amidas de peptídeo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O uso de resinas do tipo tritila instáveis a ácido na síntese de fase sólida dos peptídeos e peptídeos protegidos é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, Barlos K, Chatzi O, Gatos D, Stavropoulos G., Int J Pept Protein Res. 1991 Jun; 37(6): 513-20). Os conjugados de peptídeo-resina são tipicamente ligados à resina através de uma ligação de éster conjugado no terminal de carbóxi (ver, por exemplo, a US 7.939.629). Os conjugados de peptídeo-resina, ligados à resina pro meio da cadeia lateral de um resíduo de aminoácido lisina terminal, também são conhecidos (ver, por exemplo, a US 2009/0292106).

[0003] As resinas de amida Rinck comumente utilizadas resultam em amidas peptídicas, as quais contêm, em muitos casos, vários subprodutos, os quais têm a sua origem na clivagem parcial do ligante.

[0004] Giraud et al na US 2010/0197891 descrevem um método de apoio de uma cadeia peptídica em desenvolvimento durante a síntese química a um suporte de fase sólida através do grupo de amino de uma cadeia lateral de aminoácido. No entanto, a US 2010/0197891 não divulga a ligação de uma amida peptídica à resina.

[0005] A presente invenção procura fornecer novos conjugados de peptídeo-resina para uso na síntese de peptídeos. Mais particularmente, em uma modalidade, a invenção procura fornecer novos conjugados de peptídeo-resina e métodos relacionados com eles, os quais permitem a preparação de peptídeos que apresentam um ou mais dos seguintes: rendimentos melhorados, maior pureza, menos reações colaterais e condições de reação mais suaves.

[0006] Os aspectos da invenção são apresentados nas reivindicações anexas e são descritos com maiores detalhes mais abaixo.

DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO

[0007] Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um conjugado de peptídeo-resina de Fórmula (2'), em que: Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; Y é um peptídeo natural ou sintético que compreende dois ou mais resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, em que cada um de ditos resíduos de aminoácido naturais ou não naturais é opcionalmente protegido, e em que dito peptídeo natural ou sintético é selecionado do seguinte: [1] 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-; [2] Arg-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-; [3] Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-; [4] Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-; [6] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-; [7] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-; [11] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-; [13] D-2-Nal-4-cloro-D-Phe-β-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-; [14] D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-; [15] Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys- Cys-Thr-Gly- Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-; [16] Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-; [17] Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Ser-Asn-Gln- Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-; [18] Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-; [19] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-; [20] Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn-Leu-lle-Thr- Arg-Gln-; e [21] Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu- Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr- Arg-GIn-; Dia é um diaminoácido natural ou não natural; A é uma resina polimérica conjugado com a função de amino da cadeia lateral do diaminoácido; X é um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 15 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; R1 e R2 são cada um independentemente selecionado de H, alquila, arila, aralquila, NH2 e NH-CO-NH2.

[0008] Até esta data, com o melhor de nossos conhecimentos, não houve nenhuma divulgação de conjugados de peptídeo-resina como presentemente reivindicado. Também não houve qualquer divulgação do uso dos conjugados de peptídeo-resina presentemente reivindicados na síntese de peptídeos.

[0009] Vantajosamente, os conjugados de peptídeo amida presentemente reivindicados permitem a preparação de peptídeos com melhores rendimentos e/ou com pureza mais elevada e/ou com menos reações colaterais. Além do mais, as condições de reação suaves requeridas para remover as amidas peptídicas da resina permitem que as amidas peptídicas sejam obtidas na forma protegida ou parcialmente protegida, isto é, o método permite a clivagem da resina de amidas peptídicas parcialmente protegidas. Isso permite que os peptídeos obtidos sejam convertidos seletivamente nos peptídeos guanilados correspondentes. Os conjugados presentemente reivindicados são particularmente úteis na preparação de vários peptídeos específicos aqui descritos.

[0010] Um segundo aspecto da invenção refere-se a um conjugado de peptídeo-resina que é selecionado do seguinte: em que a resina é uma resina polimérica clivável por TFA selecionada das resinas de tritila, 2-cloro-tritila, 4-metil-tritila e 4-metóxi-tritila; e Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção.

[0011] Um terceiro aspecto da invenção refere-se a um processo para a produção de um conjugado de peptídeo-resina de fórmula (2) em que: Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; Y é uma ligação direta; ou um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 200 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; Dia é um diaminoácido natural ou não natural; A é uma resina polimérica conjugada com a função amino da cadeia lateral do diaminoácido; X é um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo compreendendo de 2 a 15 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; R1 e R2 são cada um independentemente selecionado de H, alquila, arila, aralquila, NH2, NH-CO-NH2; dito processo compreendendo a etapa de reagir uma amida peptídica de fórmula (1) em que Pr1, Dia, X, Y, R1 e R2 são como definidos acima, com um haleto de resina adequado em um solvente adequado na presença de uma base.

[0012] Um quarto aspecto da invenção refere-se a um método para a preparação de um peptídeo contendo arginina, ou um sal deste, a partir de um conjugado de peptídeo-resina de Fórmula (2), em que: Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; Y é uma ligação direta; ou um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 200 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; Dia é ornitina; A é uma resina polimérica conjugada com a função de amino da cadeia lateral do diaminoácido; X é um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 15 resíduos de aminoácido natural ou não natural, cada um dos quais é opcionalmente protegido; R1 e R2 são cada um independentemente selecionado de H, alquila, arila, aralquila, NH2, NH-CO-NH2; dito método compreendendo as etapas de: (a) desproteger a função α-amino N-terminal de dito conjugado de peptídeo-resina de fórmula (2) para remover o grupo de proteção Pri; (b) acoplar pelo menos um aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal tendo uma função de ácido carboxílico livre ou ativada com a função de α-amino desprotegida da etapa (a), prolongando assim o composto de fórmula (2), (c) repetir opcionalmente as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes, em que o pelo menos aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal é idêntico ou diferente daquele da etapa anterior (b); (d) clivar o peptídeo resultante de A; (e) submeter a guanila a cadeia lateral do resíduo de ornitina (Dia) no peptídeo obtido na etapa (d); (f) opcionalmente remover todos os grupos de proteção que permanecem após a etapa (d); (g) isolar e opcionalmente purificar o peptídeo assim obtido.

[0013] Um quinto aspecto da invenção refere-se a um método para a preparação de um peptídeo, ou um sal deste, a partir de um conjugado de peptídeo-resina de Fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f), em que a Resina é uma resina polimérica clivável por TFA selecionada das resinas de tritila, 2-cloro-tritila, 4-metil-tritila e 4-metóxi-tritila; e Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; dito método compreendendo as etapas de; (a) desproteger a função α-amino N-terminal de dito conjugado de peptídeo-resina de Fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f) para remover o grupo de proteção de Pr1; (b) acoplar pelo menos um aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal tendo uma função de ácido carboxílico livre ou ativada com a função α-amino desprotegida da etapa (a), prolongando assim o composto de fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f), (c) opcionalmente repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes, em que o pelo menos aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal é idêntico ou diferente daquele da etapa anterior (b); (d) clivar o peptídeo resultante a partir da resina; (e) opcionalmente submeter a guanila o peptídeo obtido na etapa (d); (f) opcionalmente remover todos os grupos de proteção que permanecem após a etapa (d); (g) isolar e opcionalmente purificar o peptídeo assim obtido.

[0014] Um sexto aspecto da invenção refere-se ao uso de um conjugado como acima definido na preparação de um peptídeo selecionado do seguinte: [1] 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [2] Arg8-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2; [3] H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [4] H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2; [6] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; [7] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt; [11] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt; [13] Ac-D-2-Nal-4-cloro-D-Phe-β-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu- Arg-Pro-D-Ala-NH2; [14] Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Arg-Pro-D- Ala-NH2; [15] H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp- Cys-Cys-Thr- Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2; [16] Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2; [17] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Ser-Asn-Gln- Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2; [18] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2; [19] Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2; [20] H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asri-Leu-lle-Thr- Arg-Gln-Arg-Tyr- NH2; e [21] H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu- Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

[0015] Um sétimo aspecto da presente invenção refere-se a um peptídeo obtido pelos métodos obteníveis aqui descritos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0016] Como aqui utilizado, o termo "alquila" inclui os grupos de alquila saturados tanto de cadeia reta quanto ramificada que podem ser substituídos (mono- ou poli-) ou não substituídos. De preferência, o grupo de alquila é um grupo de alquila C1-20, mais preferivelmente um C1-5, mais preferivelmente ainda um grupo de alquila C1-12, mais preferivelmente ainda um grupo de alquila C1-6, mais preferivelmente um grupo de alquila C1-3. Os grupos de alquila particularmente preferidos incluem, por exemplo, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila e hexila. Os substituintes adequados incluem, por exemplo, um ou mais grupos selecionados de OH, O- alquila, halogêneo, NH2, NH-alquila, N-(alquila)2, CF3, NO2, CN, COO- alquila, COOH, CONH2, CO-NH-alquila, CO-N(alquila)2, SO2-alquila, SO2-NH2 e SO2-NH-alquila.

[0017] Como aqui utilizado, o termo "arila" refere-se a um grupo aromático C6-12 que pode ser substituído (mono- ou poli-) ou não substituído. Exemplos típicos incluem fenila e naftila, etc. Os substituintes adequados incluem, por exemplo, um ou mais grupos selecionados de OH, O-alquila, halogêneo, NH2, NH-alquila, N- (alquilo)2, CF3, NO2, CN, COO-alquila, COOH, CONH2, CO-NH-alquila, CO-N(alquila)2, SO2-alquila, SO2NH2 e SO2-NH-alquila.

[0018] O termo "aralquila" é utilizado como uma conjunção dos termos alquila e arila como fornecido acima. Como aqui utilizado, o termo "aroíla" refere-se a um radical "Ar-CO", em que Ar é um grupo de arila como definido acima. Exemplos de grupos de aroíla incluem benzoíla e naftoíla.

[0019] Como aqui utilizado, o termo "acila" refere-se a um radical "alquila-CO", onde a alquila é como definida acima.

[0020] Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção incluem os seus sais de adição de ácido ou base adequados. Uma revisão de sais farmacêuticos adequados pode ser observada em Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Os sais são formados, por exemplo, com ácidos inorgânicos fortes tais como ácidos minerais, por exemplo, ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácidos hidroálicos; com ácidos carboxílicos orgânicos fortes, tais como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono os quais são não substituídos ou substituídos (por exemplo, por halogêneo), tais como ácido acético; com ácidos dicarboxílicos saturados ou insaturados, por exemplo, ácido oxálico, malônico, succínico, maléico, fumárico, ftálico ou tetraftálico; com ácidos hidroxicarboxílicos, por exemplo, ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico ou cítrico; com aminoácidos, por exemplo, ácido aspártico ou glutâmico; com ácido benzóico; ou com ácidos sulfônicos orgânicos, tais como ácidos (C1- C4)-alquil- ou aril-sulfônicos que são não substituídos ou substituídos (por exemplo, por um halogêneo) tais como ácido metano- ou p- tolueno sulfônico. Os sais de acetato são particularmente preferidos.

[0021] Em todos os aspectos da presente invenção anteriormente debatida, a invenção inclui, onde apropriado, todos os enantiômeros e tautômeros dos compostos da invenção. A pessoa versada na técnica reconhecerá os compostos que possuem uma propriedade ótica (um ou mais átomos de carbono quirais) ou características tautoméricas. Os enantiômeros e/ou tautômeros correspondentes podem ser isolados/preparados por métodos conhecidos na técnica.

[0022] Alguns dos compostos da invenção podem existir como estereoisômeros e/ou isômeros geométricos - por exemplo, eles podem possuir um ou mais centros assimétricos e/ou geométricos e assim podem existir em duas ou mais formas estereoisoméricas e/ou geométricas. A presente invenção contempla o uso de todos os estereoisômeros e isômeros geométricos individuais desses compostos, e suas misturas. Os termos utilizados nas reivindicações abrangem estas formas.

[0023] A presente invenção também inclui todas as variações isotópicas adequadas dos compostos ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Uma variação isotópica de um agente da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável deste é definida como aquela em que pelo menos um átomo é substituído por um átomo tendo o mesmo número atômico, mas uma massa atômica diferente da massa atômica geralmente encontrada na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados no agente e seus sais farmaceuticamente aceitáveis incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor e cloro tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F e 36CI, respectivamente. Certas variações isotópicas do agente e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, aqueles em que um isótopo radioativo tal como 3H ou 14C é incorporado, são úteis nos estudos de distribuição de medicamento e/ou substrato no tecido. Os isótopos tritiados, isto é, 3H, e carbono-4, isto é, 14C, são particularmente preferidos pela sua facilidade de preparação e capacidade de detecção. Além disso, a substituição com isótopos tais como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida aumentada in vivo ou requisitos de dosagem reduzidos e, em conseqüência, pode ser preferível em algumas circunstâncias. As variações isotópicas do agente da presente invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem geralmente ser preparadas por procedimentos convencionais utilizando as variações isotópicas apropriadas de reagentes adequados.

[0024] Os aminoácidos naturais incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

[0025] Como aqui utilizado, o termo "aminoácido não natural" inclui aminoácidos alfa e alfa-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido láctico, derivados haleto de aminoácidos naturais tais como trifluorotirosina, p-Cl-fenilalanina, pF-fenilalanina, p-Br-fenilalanina, p- NO2-fenilalanina, fenilglicina, azaglicina, sarcosina, penicilamina, D-2- metiltriptofano, fosfosserina, fosfotreonina, fosfotirosina, p-l- fenilalanina, L-alil-glicina, β-alanina, ácido e—aspártico, β- cicloexilalanina, citrulina, homoserina, homocisteína, ácido piroglutâmico, ácido L-α-amino butírico, ácido L—Y—amino butírico, ácido L-α-amino isobutírico, α-cicloexilglicina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopimélico, N-ε-dinitrofenil-lisina, L-1-naftilalanina, L-2- naftilalanina, 3-(2-piridil)-L-alanina, 3-(3-piridil)-L-alanina, 3-(4-piridil)-L- alanina, N-ε-metil-lisina, N,N-ε-dimetil-lisina, N,N,N -ε-trimetil-lisina, ácido 3-mercaptopropiônico, ácido L-ε-amino capróico, ácido 7-amino heptanóico, ácido 6-amino hexanóico L-metionina sulfona, ornitina, L- norleucina, L-norvalina, p-nitro-L-fenilalanina, L-hidroxiprolina, ácido Y- glutâmico, ácido Y-amino butírico L-tioprolina, derivados de metila de fenilalanina (Phe) tais como 4-metil-Phe, pentametil-Phe, L-Phe (4- amino), L-Tyr (metila), L-Phe (4-isopropila), L-Tic (ácido 1,2,3,4- tetraidroisoquinolina-3-carboxílico), ácido L-diaminopropiônico e L-Phe (4-benzila).

[0026] O peptídeo da presente invenção pode compreender aminoácidos na forma L ou D, isto é, um ou mais resíduos, de preferência todos os resíduos podem estar na forma L ou D.

[0027] Como aqui utilizado, o termo "peptídeo sintético" refere-se a um peptídeo que é quimicamente sintetizado. Os peptídeos sintéticos podem ser preparados a partir de aminoácidos naturais ou não naturais, ou uma combinação destes.

[0028] Como aqui utilizado, o termo "peptídeo natural" refere-se a um peptídeo que é encontrado na natureza.

[0029] Os presentes inventores demonstraram que os diaminoácidos contendo amidas peptídicas curtas ligadas às resinas adequadas altamente sensíveis ao ácido a partir da sua cadeia lateral podem fornecer amidas peptídicas grandes e amidas peptídicas parcialmente protegidas com função amino de cadeia lateral de diaminoácido seletivamente liberada. Estes podem ser ainda seletivamente modificados na cadeia lateral de diaminoácido liberado. Uma modificação importante da cadeia lateral de diaminoácido é, por exemplo, a guanidilação seletiva de Om para Arg para fornecer peptídeos contendo Arg. Isto é vantajoso em relação à síntese de peptídeos contendo Arg através do uso de derivados de Arg protegidos pela cadeia lateral, porque a desproteção da cadeia lateral de Arg utilizando os grupos de proteção de guanidino habituais normalmente dá origem à formação de vários subprodutos e, além disso, é em muitos casos, incompleta.

[0030] Vários produtos secundários também são formados durante a remoção das amidas peptídicas a partir de resinas que fornecem amidas peptídicas tais como as resinas de amida de Rink.

[0031] Os presentes inventores descobriram que a ligação de peptídeos contendo diaminoácido curto, em resinas do tipo tritila, prossegue com rendimento elevado e que os peptídeos e as amidas peptídicas parcialmente protegidas obtidas são de elevada pureza, mais elevada do que aquela obtida através do uso do método de síntese de amida peptídica correspondente que utiliza uma resina de amida. As amidas peptídicas e as amidas peptídicas parcialmente protegidas clivadas a partir da resina podem ser transformadas com um rendimento elevado em peptídeos que contêm na sua sequência aminoácidos submetidos à guanila tais como Arg, D-Arg, homo-Arg. As amidas peptídicas obtidas são de um grau de pureza mais elevado do que os peptídeos contendo Arg correspondentes sintetizados utilizando os derivados de Arg protegidos pela cadeia lateral, por exemplo, Fmoc-Arg(Pbf)-OH.

[0032] As amidas peptídicas curtas adequadas requeridas (1) são obtidas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através da desproteção da função amino da cadeia lateral do peptídeo curto. As amidas peptídicas curtas protegidas são subseqüentemente conjugadas com resinas sensíveis muito ácidas do tipo tritila através da função amino de cadeia lateral do diaminoácido contido na cadeia de peptídeo de acordo com o esquema abaixo.

[0033] Por exemplo, o diaminoácido que está contido na parte C-ter- minal da amida peptídica é reagido com um haleto de resina, A-CI, na presença de uma base para fornecer o conjugado de peptídeo-resina (2) com um rendimento elevado: em que Pri é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; Y é uma ligação direta; ou um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 200 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; Dia é um diaminoácido natural ou não natural; A é uma resina polimérica conjugada com a função amino de cadeia lateral do diaminoácido; X é um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo compreendendo de 2 a i5 resíduos de aminoácido natural ou não natural, cada um dos quais é opcionalmente protegido; Ri e R2 são cada um independentemente selecionado de H, alquila, arila, aralquila, NH2, NH-CO-NH2.

[0034] Em uma modalidade preferida, a base é uma base de trialquilamina, mais preferivelmente, DIPEA.

[0035] Em uma modalidade preferida, A é uma resina polimérica clivável por TFA conjugada na função amino de cadeia lateral do Dia.

[0036] Mais preferivelmente, A é uma resina clivável por TFA do tipo de tritila.

[0037] Ainda mais preferivelmente, A é selecionado de resinas de tritila, 2-cloro-tritila, 4-metil-tritila e 4-metóxi-tritila conforme mostrado abaixo, em que Q pode estar ausente, ou é um ligante entre o grupo de tritila e a matriz polimérica P, tal como um grupo de carboxila.

[0038] Amidas peptídicas ligadas à resina também podem ser obtidas pela ligação do diaminoácido à resina através da função amino de cadeia lateral e do acoplamento na resina com a amida de aminoácido ou amida peptídica como mostrado no esquema abaixo:

[0039] As amidas peptídicas (3) também podem ser obtidas através da amidação de peptídeos ligados à resina como mostrado abaixo:

[0040] Os peptídeos ligados à resina de fórmula (2) e (3) podem ser utilizados na síntese de peptídeo de fase sólida. Após a conclusão da montagem da cadeia, as amidas peptídicas obtidas da fórmula geral (2) podem ser clivadas a partir das resinas extremamente sensíveis a ácido na forma de peptídeo parcialmente protegida da fórmula geral (1) ou na forma desprotegida completa como mostrado no esquema abaixo com a fórmula geral (4):

[0041] A seletividade dos peptídeos desprotegidos de função de cadeia lateral de diaminoácido (1) pode ser ainda modificada na cadeia lateral do diaminoácido como mostrado no esquema acima através da guanidilação. A etapa de guanidilação pode ser executada por qualquer método conhecido na técnica, exemplo, para uso dos reagentes de guanidilação tais como S-metiltiouréia, 1-H-1,2,4-triazol- carboxamidina etc.

[0042] Em uma modalidade preferida, o reagente de guanidilação é selecionado de 1H-pirazol-1-carboxamidina 2, 1-H-1,2,4-triazol-car- boxamidinas, trifil guanidina e tosilato de benzotriazol-1-carboxamidí- nio.

[0043] Os peptídeos parcialmente protegidos submetidos à guanidila obtidos da fórmula geral (5) podem então ser totalmente desprotegidos para fornecer peptídeos contendo função de cadeia lateral de guanidila de fórmula geral (6), em que Gua é um aminoácido contendo grupo de guanidila de cadeia lateral tal como Arg.

[0044] Em uma modalidade preferida da invenção, o conjugado de peptídeo-resina é da Fórmula (2'a) em que: n é um número inteiro entre 1 e 10; A, X, Y, R1 e R2 são como definidos acima; e Pr1 é um grupo de proteção sendo ortogonal à ligação entre A e a função amino.

[0045] Mais preferivelmente, n é um número inteiro de 1 a 5.

[0046] Em uma modalidade preferida, X é um aminoácido selecionado de Gly, Pro, D-Ala, Azagly, Leu, Val, Cys e Tyr, ou uma combinação de dois ou mais destes.

[0047] Em uma modalidade preferida, X é selecionado de entre Gly, Pro, D-Ala, Azagly, Leu, Val, Cys, Tyr, Pro-Gly, Pro-Azagly, ProD-Ala e Pro-Val.

[0048] Em uma modalidade preferida, X é um aminoácido selecionado de Gly, Pro, D-Ala e Tyr.

[0049] Em uma modalidade preferida, Dia é um diaminoácido selecionado de L-Dap, D-Dap, L-Dab, D-Dab, L-Orn, D-Orn, L-Lys e D- Lys.

[0050] Em uma modalidade ainda mais preferida, Dia é selecionado a partir de L-Orn, D-Orn e L-Lys e D-Lys.

[0051] Em uma modalidade especialmente preferida, o Dia é L-Orn ou D-Orn, mais preferivelmente L-Orn.

[0052] Os grupos de proteção adequados para os aminoácidos serão familiares para a pessoa versada na técnica (ver, por exemplo, Chem. Rev. 2009, 109, 2455-2504). Estes grupos de proteção podem ser separados em três grupos, como se segue: • grupos de proteção N-terminais • grupos de proteção C-terminais • grupos de proteção de cadeia lateral

[0053] Exemplos de grupos de proteção N-terminais altamente preferidos para aminoácidos incluem, mas não são limitados a estes, t- Boc (terc-butiloxicarbonila) e Fmoc (9-fluorenilmetilóxi-carbonila). A sua instabilidade é provocada pelo grupo de carbamato que facilmente libera CO2 em uma etapa de desacoplamento irreversível. Outro grupo com base em carbamato apropriado é o grupo de benzilóxi-carbonila (Z ou Cbz); este é removido em condições mais severas.

[0054] Outro exemplo preferido é o grupo de proteção de aliloxicarbonila (alloc), que é muitas vezes utilizado para proteger um grupo de ácido carboxílico, hidroxila ou amino quando um esquema de desproteção ortogonal for necessário.

[0055] Outro exemplo preferido é o grupo de nitro-2-piridinassul- fenila (Npis), que é útil para a proteção e ativação de grupos amino e hidroxila na síntese peptídica. O grupo Npys é facilmente introduzido através do tratamento de aminoácidos com cloreto de 3-nitro-2- piridinassulfenila. O grupo Npys é facilmente removido mediante o tratamento com HCl muito diluído, por exemplo, de 0,1 a 0,2 N de HCl em dioxano, mas é resistente ao ácido trifluoroacético e ácido fórmico a 88 %. Npys também é removido seletivamente sob condições neutras utilizando trifenilfosfina ou 2-piridinatiol 1-óxido sem afetar os grupos de proteção de benziloxicarbonila (Z), terc-butiloxicarbonila (Boc), 2-(4-bifenilil)propil(2)oxicarbonila (Bpoc), 9- fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc), benzila (Bzl) ou terc-butila (tBu).

[0056] As cadeias laterais de aminoácido representam uma ampla faixa de grupos funcionais e são sítios de reatividade não específicos durante a síntese de peptídeos. Devido a isso, muitos grupos de proteção diferentes são requeridos os quais são geralmente baseados no grupo de benzila (Bzl) ou terc-butila (tBu). Os grupos de proteção específicos utilizados durante a síntese de um dado peptídeo variam dependendo da sequência do peptídeo e do tipo de proteção N- terminal utilizado. Os grupos de proteção da cadeia lateral são geralmente conhecidos como grupos de proteção permanentes ou semi-permanentes, porque eles podem suportar os vários ciclos de tratamento químico durante a síntese e são apenas removidos durante o tratamento com ácidos fortes após a síntese de peptídeo ter sido concluída.

[0057] Os aminoácidos individuais purificados são reagidos com estes grupos de proteção antes da síntese e depois seletivamente removidos durante as etapas específicas da síntese de peptídeo.

[0058] Em uma modalidade preferida, o Pr1 representa um grupo de proteção ortogonal selecionado de Fmoc, Boc, Cbz, Npys e Alloc.

[0059] Em uma modalidade altamente preferida, o Pri é Fmoc.

[0060] Em uma modalidade especialmente preferida, o conjugado de peptídeo-resina é selecionado do que se segue: [1] 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn(Resina)- Gly-NH2; [2] Arg-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- Orn(Resina)-Gly-NH2; [3] H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- Orn(Resina)-Gly-NH2; [4] H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys(Resina)-Gly-NH2; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D- Orn(Resina)-Gly- NH2; [6] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu- Orn(Resina)-Pro-Gly-NH2; [7] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu- Orn(Resina)-Pro-Gly-NH2; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Orn(Resin)-Pro-Azagly-NH2; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Orn(Resina)-Pro-NHEt; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Orn(Resina)-Pro-NHEt; [11] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Orn(Resina)-Pro-NHEt; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Orn(Resina)-Pro-NHEt; [13] Ac-D-2-Nal-4-chloro-D-Phe-β-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu- Orn(Resina)-Pro-D-Ala-NH2; [14] Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Orn (Resina)-Pro-D-Ala-NH2; [15] H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp- Cys-Cys-Thr- Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys(Resina)-Cys-NH2; [16] Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(Resina)-Pro- Val-NH2; [17] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Ser-Asn-Gln- Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Orn(Resina)-Leu-NH2; [18] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Orn(Resina)-NH2; [19] Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(Resina)-Pro- Val-NH2; [20] H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn-Leu-lle-Thr- Arg-Gln-Orn(Resina)-Tyr-NH2; e [21] H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu- Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Orn(Resina)-Tyr-NH2; e seus sais, em que a Resina é uma resina polimérica clivável por TFA selecionada de resinas de tritila, 2-cloro-tritila, 4-metil-tritila e 4-metóxi-tritila.

[0061] Outro aspecto da invenção refere-se a um conjugado de peptídeo-resina que é selecionado do seguinte: em que a Resina é uma resina polimérica clivável por TFA selecionada das resinas de tritila, 2-cloro-tritila, 4-metil-tritila e 4-metóxi-tritila; e Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção.

[0062] Em uma modalidade preferida, o Pr1 é um grupo de proteção, mais preferivelmente um grupo de proteção Fmoc.

[0063] Mais preferivelmente, a Resina é resina de tritila ou 4- metóxi-tritila.

[0064] Como mencionado acima, outro aspecto da invenção refere-se a um processo para a produção de um conjugado de peptídeo-resina de fórmula (2) em que: Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; Y é uma ligação direta; ou um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 200 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; Dia é um diaminoácido natural ou não natural; A é uma resina polimérica conjugada com a função amino da cadeia lateral do diaminoácido; X é um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo compreendendo de 2 a 15 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; R1 e R2 são cada um independentemente selecionado de H, alquila, arila, aralquila, NH2, NH-CO-NH2; dito processo compreendendo a etapa de reagir uma amida peptídica de fórmula (1) em que Pr1, Dia, X, Y, R1 e R2 são como definidos acima, com um haleto de resina adequado em um solvente adequado na presença de uma base.

[0065] Em uma modalidade preferida, Y é um peptídeo opcionalmente protegido que compreende de 2 a 100 resíduos de aminoácido. Mais preferivelmente, Y é um peptídeo opcionalmente protegido compreendendo de 2 a 50 resíduos de aminoácido, ainda mais preferivelmente de 2 a 20 resíduos de aminoácido, ainda mais preferivelmente de 2 a 10 resíduos de aminoácidos, ainda mais preferivelmente de 2 a 6 resíduos de aminoácidos.

[0066] De preferência, o haleto é selecionado de cloreto, brometo e iodeto.

[0067] De preferência, o solvente é selecionado de DCM, DCE, DMF, NMP, THF, DME e suas misturas.

[0068] Preferivelmente, a base é selecionada de DIPEA, NMM, DBU, piridina, DMAP e TEA.

[0069] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para a preparação de um peptídeo contendo arginina, ou um sal deste, a partir de um conjugado de peptídeo-resina da Fórmula (2), em que: Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; Y é uma ligação direta; ou um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 200 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; Dia é ornitina; A é uma resina polimérica conjugada com a função de amino da cadeia lateral do diaminoácido; X é um resíduo de aminoácido natural ou não natural opcionalmente protegido; ou um peptídeo natural ou sintético compreendendo de 2 a 15 resíduos de aminoácido naturais ou não naturais, cada um dos quais é opcionalmente protegido; R1 e R2 são cada um independentemente selecionado de H, alquila, arila, aralquila, NH2, NH-CO-NH2; dito método compreendendo as etapas de: (a) desproteger a função α-amino N-terminal de dito conjugado de peptídeo-resina de fórmula (2) para remover o grupo de proteção Pri; (b) acoplar pelo menos um aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal tendo uma função de ácido carboxílico livre ou ativada com a função de α-amino desprotegida da etapa (a), prolongando assim o composto de fórmula (2), (c) repetir opcionalmente as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes, em que o pelo menos aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal é idêntico ou diferente daquele da etapa anterior (b); (d) clivar o peptídeo resultante de A; (e) submeter a guanila a cadeia lateral do resíduo de ornitina (Dia) no peptídeo obtido na etapa (d); (f) opcionalmente remover todos os grupos de proteção que permanecem após a etapa (d); (g) isolar e opcionalmente purificar o peptídeo assim obtido.

[0070] Em uma modalidade preferida, Pri é um grupo de proteção ortogonal selecionado do grupo que consiste de Fmoc, Boc, Cbz, Npys e Aloc.

[0071] Em uma modalidade preferida, os aminoácidos protegidos de modo N-terminal ou os peptídeos das etapas (b) e (c) são protegidos com Fmoc.

[0072] Em uma modalidade preferida, o pelo menos aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal da etapa por fim repetida (c) é protegido por um grupo de proteção que é ortogonal a Fmoc.

[0073] Em uma modalidade preferida, o grupo de proteção ortogonal é Boc.

[0074] Em uma modalidade preferida, A é uma resina selecionada de resina de tritila, resina de 2-clorotritila, resina de 4-metiltritila e resina de 4-metoxitritila.

[0075] Em uma modalidade preferida, a etapa (d) compreende a clivagem do peptídeo a partir da resina mediante o tratamento com um ácido.

[0076] Em uma modalidade preferida, a etapa (e) compreende o tratamento do peptídeo com um reagente de guanilação selecionado de 1H-pirazol-1-carboxamidina 2, 1-H-1,2,4-triazol-carboxamidina, triflil guanidina e tosilato de benzotriazol-1-carboxamidínio.

[0077] Em uma modalidade preferida, o conjugado de peptídeo- resina de fórmula (2) é selecionado dos seguintes: em que a Resina é uma resina polimérica clivável por TFA selecionada a partir das resinas de tritila, 2-cloro-tritila, 4-metil-tritila e 4-metóxi- tritila; e Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção.

[0078] Em uma modalidade preferida, o conjugado de peptídeo- resina de fórmula (2) é selecionado do seguinte: em que a Resina é resina de tritila ou resina de 4-metoxitritila.

[0079] Em uma modalidade preferida, o método da invenção é utilizado para a preparação de um peptídeo selecionado do seguinte: [1] 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [2] Arg8-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2; [3] H-Cys-Tyr-Phe-Gin-Asn-Cys-Pro-Orn-Giy-NH2; [4] H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2; [6] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sal de acetato; [7] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sal de acetato; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt; [11] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [13] Ac-D-2-Nal-4-chloro-D-Phe-p-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu- Arg-Pro-D- Ala-NH2 sal de acetato; [14] Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Arg-Pro-D- Ala-NH2 sal de acetato; [15] H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp- Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 sal de acetato; [16] Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val- NH2 sal de acetato; [17] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2; [18] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2; [19] Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2; [20] H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn-Leu-lle-Thr- Arg-Gln-Arg-Tyr- NH2; e [21] H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu- Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr- NH2.

[0080] Em uma modalidade preferida, o método ainda compreende a etapa de preparação do dito conjugado de peptídeo-resina de fórmula (2) por um processo como definido mais acima.

[0081] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para a preparação de um peptídeo, ou um sal deste, a partir de um conjugado de peptídeo-resina de fórmula geral (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f), em que a Resina é uma resina polimérica clivável por TFA selecionada das resinas de tritila, 2-cloro-tritila, 4-metil-tritila e 4-metóxi-tritila; e Pr1 é selecionado de H, alquila, arila, aralquila, acila, aroíla e um grupo de proteção; dito método compreendendo as etapas de; (a) desproteger a função α-amino N-terminal de dito conjugado de peptídeo-resina de Fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f) para remover o grupo de proteção de Pr1; (b) acoplar pelo menos um aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal tendo uma função de ácido carboxílico livre ou ativada com a função α-amino desprotegida da etapa (a), prolongando assim o composto de fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f), (c) opcionalmente repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes, em que o pelo menos aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal é idêntico ou diferente daquele da etapa anterior (b); (d) clivar o peptídeo resultante a partir da resina; (e) opcionalmente submeter a guanila o peptídeo obtido na etapa (d); (f) opcionalmente remover todos os grupos de proteção que permanecem após a etapa (d); (g) isolar e opcionalmente purificar o peptídeo assim obtido.

[0082] Em uma modalidade preferida, Pri é um grupo de proteção ortogonal selecionado do grupo que consiste de Fmoc, Boc, Cbz, Npys e Alloc.

[0083] Em uma modalidade preferida, os aminoácidos ou peptídeos protegidos de forma N-terminal das etapas (b) e (c) são protegidos por Fmoc.

[0084] Em uma modalidade preferida, o pelo menos aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal da etapa por fim repetida (c) é protegido por um grupo de proteção que é ortogonal a Fmoc.

[0085] Em uma modalidade preferida, o grupo de proteção ortogonal é Boc.

[0086] Em uma modalidade preferida, a Resina é selecionada de resina tritila, resina de 2-clorotritila, resina de 4-metiltritila e resina de 4-metoxitritila.

[0087] Em uma modalidade preferida, a etapa (d) compreende a clivagem do peptídeo a partir da resina através do tratamento com um ácido.

[0088] Em uma modalidade preferida, a etapa de guanilação (e) é um aspecto essencial, em vez de opcional.

[0089] Em uma modalidade preferida, o método compreende o tratamento do peptídeo com um reagente de guanilação selecionado de iH-pirazol-i-carboxamidina 2, i-H-i,2,4-triazol-carboxamidina, triflil guanidina e tosilato de benzotriazol-i-carboxamidínio.

[0090] Em uma modalidade preferida, o conjugado de peptídeo- resina é selecionado do que se segue: em que a Resina é resina de tritila ou resina de 4-metoxitritila.

[0091] Em uma modalidade preferida, o método é utilizado para a preparação de um peptídeo selecionado do seguinte: [1] 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [2] Arg8-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2; [3] H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [4] H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2; [6] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; [7] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt; [11 ] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt; [13] Ac-D-2-Nal-4-cloro-D-Phe-β-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu- Arg-Pro-D- Ala-NH2; [14] Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Arg-Pro-D- Ala-NH2; [15] H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp- Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2; [16] Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2; [17] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2; [18] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2; [19] Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2; [20] H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-AIa-Pro-Ala-Glu- Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn-Leu-lle-Thr- Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2; e [21] H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu- Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0092] Em uma modalidade preferida, o método compreende ainda a etapa de preparação de dito conjugado de peptídeo-resina de fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f) por um processo como definido acima.

[0093] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso de um conjugado como acima definido na preparação de um peptídeo selecionado do seguinte: [1] 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [2] Arg8-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2; [3] H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [4] H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2; [6] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; [7] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt; [11] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt; [13] Ac-D-2-Nal-4-cloro-D-Phe-β-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu- Arg-Pro-D-Ala-NH2; [14] Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Arg-Pro-D- Ala-NH2 sal de acetato; [15] H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp- Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2; [16] Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2; [17] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Ser-Asn-Gln- Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2; [18] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2; [19] Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2; [20] H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn-Leu-lle-Thr- Arg-Gln-Arg-Tyr- NH2; e [21] H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu- Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0094] Os peptídeos específicos preparados pelo método da invenção incluem os seguintes: Acetato de atosiban, 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2 sal de acetate Acetato de vasopressina, Arg-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 sal de acetato Acetato de ornipressina, H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2 sal de acetato Acetato de terlipressina, H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2 sal de acetato Acetato de desmopressina, 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2 sal de acetato Acetato de triptorelina, Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sal de acetate Acetato de nafarelina Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sal de acetato Goserelina Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2 Acetato de buserelina, Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato Leuprolide (Leuprolina) Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt Acetato de histrelina Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato Acetato de deslorelina superior Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato Cetrorelix Ac-D-2-Nal-cloro-D-Phe-β-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro- D-Ala-NH2 sal de acetato Ozarelix Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Arg-Pro-D-Ala- NH2 sal de acetato Acetato de ziconotide H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys- Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 sal de acetato Afamelanotide Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 sal de acetate Acetato de GRF (humano) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 sal de acetato Amida de GRF (1-29) (humano) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2 Acetato de α-Melanotropina (humano) Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 sal de acetato Acetato de Neuropeptídeo Y (humano, rato) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp- Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn-Leu-lle-Thr-Arg- Gln-Arg-Tyr-NH2 sal de acetato Acetato de Peptídeo YY (humano) H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu- Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr- Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 sal de acetato

[0095] O método da invenção é adequado para a preparação de uma variedade de peptídeos diferentes incluindo, mas não limitado aos seguintes: [1] 3-Mercaptopropionil-D-Tyr(Et)-lle-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [2] Arg-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2; [3] H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2; [4] H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2 sal de acetato; [6] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sal de acetato; [7] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sal de acetato; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt; [11] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [13] Ac-D-2-Nal-4-cloro-D-Phe-β-(3-piridil)-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu- Arg-Pro-D-Ala-NH2 sal de acetato; [14] Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Arg-Pro-D- Ala-NH2 sal de acetato; [15] H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp- Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 sal de acetato; [16] Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 sal de acetato; [17] H-Tyr-AIa-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 sal de acetato; [18] H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2; [19] Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 sal de acetato; [20] H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn-Leu-lle-Thr- Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 sal de acetato; e [21] H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu- Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 sal de acetato.

[0096] Vantajosamente, o método presentemente reivindicado permite que as amidas peptídicas e as amidas peptídicas parcialmente protegidas clivada da resina sejam transformadas com um rendimento elevado em peptídeos que contêm na sua sequência aminoácidos submetidos à guanila tais como Arg, D-Arg, homo-Arg. As amidas peptídicas obtidas são de uma pureza mais elevada do que os peptídeos contendo Arg correspondentes sintetizados utilizando os derivados de Arg protegidos da cadeia lateral, por exemplo, Fmoc- Arg(Pbf)-OH.

[0097] A presente invenção é ainda descrita por meio dos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS Síntese de fase sólida de peptídeos e de seus segmentos protegidos. Procedimento geral. Preparação de resinas de tritila carregadas com peptídeos ligados através da cadeia lateral de um diaminoácido, procedimento geral

[0098] Resina de cloreto de tritila (100 g; carga 0,9-1,6 mmol/g) da CBL-Patras, foi colocada em reator de síntese de peptídeo de 2 L e intumescida com 700 ml de diclorometano (DCM) durante 30 min a 25 °C. A resina foi filtrada e uma solução de 100 mmol de ácido Fmoc- peptídeo e diisopropiletilamina (DIEA) em DCM foi adicionada de modo a que a relação em mmol de Fmoc-peptídeo/DIPEA veio a ser 0,80. A mistura foi agitada sob nitrogênio durante 4 horas a 25 °C. Em seguida, os sítios ativos remanescentes da resina foram neutralizados através da adição de 10 ml de metanol (MeOH) e reação durante 1 hora na RT. A resina foi filtrada e lavada 4 x com 400 ml de DMF, reduzida no volume com 3 lavagens de 500 ml de isopropanol (IPA) e 4X 400 ml de DEE. A resina foi secada até o peso constante. 60 a 80 % da mmol do peptídeo utilizado foram ligados na resina.

[0099] Todas as resinas do tipo tritila descritas na patente estão comercialmente disponíveis (CBL-Patras e outros).

A3. Amidação dos ácidos peptídicos ligados na fase sólida através de uma cadeia lateral de aminoácido de um diaminoácido, procedimento geral.

[00100] Um peptídeo ligado à resina (5,0 g = 0,2-1,2 mmol/g) foi colocado em um reator de fase sólida e tratado com 0,25 a 1,4 mmol de HOBt e DIC. A mistura foi agitada durante 1 h na RT e depois uma solução de amônia ou Alquilamina em DMF ou HOBt.sal de NH3 ou de uma amida peptídica em DMF foi adicionada com um excesso molar de 1,00 a 1,5. A mistura foi então agitada durante 2 h na RT e o procedimento foi repetido uma vez. A resina é então filtrada e lavada 5x com DMF, 3x com IPA e 3x com DEE e secada em vácuo até o peso constante.

B. Síntese de fase sólida, um protocolo geral B1. Intumescimento da resina

[00101] A resina foi colocada em um reator de 15 ml e tratada duas vezes com 7 ml de NMP, seguido por filtração.

B2. Ativação do aminoácido

[00102] O aminoácido (3,0 equiv.) e 1-hidroxibenzotriazol (4,0 equiv.) foi ponderado e dissolvido em um reator com 2,5 de seu volume em NMP e esfriado para 0 °C. DIC foi então adicionado (3,0 equiv.) e a mistura foi agitada durante 15 min.

B3. Acoplamento

[00103] A solução que foi preparada em B2 foi depois adicionada ao reator de B1. O reator foi lavado uma vez com um volume de DCM e adicionou-se ao reator o qual foi agitado durante 1 a 3 h a 25 ° a 30 °C. Em uma amostra o teste de Kaiser foi executado para determinar a conclusão da reação. Se a reação de acoplamento não tiver sido concluída após 3 horas (Teste de Kaiser positivo), a mistura de reação foi filtrada e acoplada novamente com uma solução fresca de aminoácido ativado. Após a conclusão do acoplamento a mistura de reação foi filtrada e lavada 4 vezes com NMP (5 volumes por lavagem).

B4. Remoção do grupo Fmoc

[00104] A resina resultante em B3 foi filtrada e depois tratada durante 30 min com 5 ml de uma solução que continha 25 % em volume de piperidina. A resina é então lavada três vezes com 5 ml de NMP.

B5. Alongamento da cadeia de peptídeo

[00105] Após a incorporação de cada aminoácido a etapas de B1 a B5 foram repetidas até a conclusão da cadeia de peptídeo.

[00106] Para a introdução de cada aminoácido individual os seguintes Fmoc-aminoácidos foram utilizados: Fmoc-Gly-OH, Fmoc- Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Orn(Mtt)-OH, Fmoc-Orn(Mmt)-OH, Fmoc- Orn(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Mmt)-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)- OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Thr(Trt)-OH, Fmoc- Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(Clt)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-His(Trt)- OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Mmt)-OH e Fmoc-Cys(Acm)-OH e os seguintes Boc-aminoácidos: Boc-Phe-OH e Boc-Gly-OH.

C. Método geral para a clivagem das resinas do tipo tritila de peptídeos parcialmente protegidos e de seus segmentos protegidos que contêm grupos de Fmoc ou Boc ou outro grupo de proteção adequado no seu N-terminal e são seletivamente desprotegidos em uma lisina, ornitina ou qualquer outra cadeia lateral diaminoácido individual.

[00107] O peptídeo ou o segmento de peptídeo ligado a resina que foi produzido como descrito acima em B1 a B5 e foi ligado a um Lys, Orn ou qualquer outra cadeia lateral de diaminoácido específico com uma resina de 2-clorotritila (Clt), TRT, Mmt ou Mtt foi lavado 4 vezes com 5 ml de NMP, 3 vezes com 5 ml de IPA e finalmente 5 vezes com 7 ml de DCM para remover completamente qualquer NMP residual ou outros componentes básicos. A resina foi então esfriada para 0 °C, filtrada a partir de DCM e tratada seis vezes com uma solução de 10 ml de TFA a 1,0 a 1,5 % em DCM/TES (95:5) a 5 °C. A resina foi filtrada e lavada três vezes com 10 ml de DCM. A piridina é então adicionada aos filtrados (1,3 equiv. em relação ao TFA) para neutralizar o TFA. A solução de clivagem em DCM foi em seguida misturada com um volume igual de água.

[00108] A mistura resultante foi destilada na pressão reduzida para remover o DCM (350 torr a 28 °C). O peptídeo ou segmento de peptídeo precipitou-se após a remoção de DCM. O peptídeo resultante foi lavado com água e éter e secado em 30 a 35 °C sob vácuo de 15 Torr. Alternativamente o DCM pode ser removido em vácuo e o peptídeo parcialmente protegido pode ser precipitado pela adição de DEE ou éter di-isopropílico (DIE).

D. Método geral para a guanilação do peptídeo parcialmente protegido que é seletivamente desprotegido na cadeia lateral de um ou mais diaminoácidos.

[00109] Em parte no peptídeo desprotegido da cadeia lateral de diaminoácido (1,0 mmol) é dissolvido em 10 a 15 ml de DMF ou uma mistura apropriada de DMF/água e a solução é então neutralizada pela adição de DIPEA ou 1-N-NaOH. Depois, um excesso molar de 1,0 a 1,5 do reagente de guanilação, por exemplo, de cloridreto de 1-H- 1,2,4-triazol-carboxamidina, é adicionado e a mistura agitada até a conclusão da guanilação ter sido determinada por HPLC, TLC ou o teste de Kaiser. A mistura é então diluída com salmoura e o produto é extraído na fase orgânica com EtAc ou DCM seguido por uma extração com ácido/base padrão. A solução obtida do peptídeo submetido à guanila é depois concentrada no RE precipitado com a adição de DEE ou DIE e desprotegido de acordo com o nosso método geral abaixo.

E. Desproteção de peptídeo - Método geral.

[00110] O peptídeo parcialmente protegido obtido como descrito acima (0,01 a 0,005 mmol) foi tratado com 10 ml de TFA/TES ou TIPS/tioanisol/água (85:5:5:5) ou TFA/DTT/água (90:5:5 durante 3 h a 5 °C e durante 1 h a 15 °C. A solução resultante foi concentrada em vácuo e em seguida o peptídeo desprotegido foi precipitado pela adição de DEE ou DIE e lavado três vezes com 10 ml de DEE ou DIE. O sólido resultante foi secado em vácuo (25 °C, 1 a 10 Torr) até um peso constante. Exemplo 1. Síntese do Atosiban partindo de Fmoc-Om-Gly-NH2 ligado através da cadeia lateral de ornitina na resina de tritila.

[00111] Resina de cloreto de tritila (20,0 g; 24,4 mmol de carga) foi colocada em um reator de síntese peptídica e intumescida com 200 ml de DCM/DMF (1:1) durante 30 min a 25 °C. Depois 4,63 g (10 mmol) de Fmoc-Om-Gly-NH2.HCI - produzido através de procedimentos conhecidos na técnica a partir de Fmoc-Orn(Boc)-Gly- NH2 e HCl em dioxano - foram adicionados. A mistura foi agitada durante a noite na RT. Em seguida, os sítios ativos remanescentes da resina foram neutralizados pela adição de 10 ml de metanol (MeOH) e reação durante 2 h adicionais na RT. A resina foi então filtrada e lavada 4 x com 400 ml de DMF, submetida a redução de volume com 3 lavagens de 500 ml de isopropanol (IPA) e 4 X 400 ml de DEE e intumescida novamente com DMF. Então, o alongamento da cadeia peptídica foi executado de acordo com os procedimentos padrão utilizando Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH e Fmoc-D-Tyr(Et)-OH. O ácido propiónico N-terminal S-Trt-mercapto (MPA) foi introduzido finalmente por um procedimento similar utilizado para a introdução dos ácidos Fmoc-amino. A resina foi então lavada com 6X com DMF e 6X com DCM. Depois a resina foi tratada 6X com 100 ml de 1 % de TFA em DCM e aos filtrados combinados 2,54 g (100 mmol) de iodo foram adicionados e a solução foi agitada até a conclusão da reação de oxidação (20 min). Em seguida o iodo em excesso foi neutralizado pela extração com uma solução de Na2S2O3 a 3 % e o DCM foi removido no RE e precipitado com DEE. O peptídeo obtido foi então desprotegido utilizando procedimentos padrão, purificado por HPLC e liofilizado. Rendimento: 7,14 g de sal de TFA, 78 % de teor de peptídeo (44,8 %). Exemplo 2. Síntese de Atosiban partindo de Fmoc-Orn-OH ligado através da cadeia lateral de ornitina na resina 4-metóxi. 1 mmol de Fmoc-Orn-OH foi dissolvido em 15 ml de DCM. Depois, 1,5 mmol de DIPEA foi adicionado e 1 g de resina 4-metoxitritila (1,2 mmol/g) e a mistura agitada durante a noite. 1 ml de metanol foi adicionado e a mistura foi agitada durante um adicional de 4 horas na RT. A resina foi então filtrada, lavada 3 x DCM, 3 x DMF, 3 x iPrOH e 3 x hexano e secada em vácuo até peso constante para fornecer Fmoc- Orn(resina de 4-metoxitritila)-OH.

[00112] 2,0 g (1,0 mmol) de Fmoc-Orn(resina de 4-metoxitritila)-OH foram colocados em suspensão em 10,0 ml de DMF, esfriados para 5 °C e reagidos com 0,18 g (1,3 mmol) de HOBt e 0,13 g (1,0 mmol) de DIC. A mistura foi agitada durante 5 min a 5 °C e depois aquecida até 15 °C. Depois 0,22 g (2 mmol) de cloridreto de glicina amida e 0,39 g (3,0 mmol) de DIPEA foram adicionados e a mistura foi agitada durante 90 min na RT. O procedimento foi repetido e Fmoc-Orn(resina de 4-metoxitritila)-Gly-NH2 obtido foi utilizado para a síntese de Atosiban como descrito acima. Rendimento 0,79 g de sal de TFA com teor de peptídeo de 76 % (48,6 %).

Exemplo 3. Síntese de Fmoc-Om-Pro-NH2, Fmoc-Orn-Pro-NHEt e Fmoc-Orn-Pro-NH-NH-CO-NH2 ligados à resina, processo geral.

[00113] Fmoc-Orn(Boc)-OH ou Fmoc-Orn(MTT)-OH ou Fmoc- Orn(MMT)-OH foram acoplados através de métodos conhecidos na técnica com H-Pro-NH2 ou H-Pro-NHEt ou H-Pro-NH-CO-NH-NH2. O produto obtido foi depois desprotegido na cadeia lateral com TFA em DCM. O dipeptídeo de ornitina bem seco obtido 10,0 mmol foi então dissolvido em 100 ml de DCM/DMF (1:1). Esta solução foi então adicionada a 10,0 g de resina de cloreto de 2-clorotriila ou tritila ou 4- metiltritila ou 4-metoxitritila (carga = 0,9 a 1,6 mmol/g) e à mistura obtida de 30,0 mmol de DIPEA foram adicionados. A mistura foi então agitada durante 12 h na RT e depois 5,0 ml de MeOH foram adicionados e a mistura foi agitada durante mais 2 h na RT. A resina foi então filtrada e lavada com 6X de DMF, 3X de IPA e 3X de DEE, e secada em vácuo até um peso constante. Rendimento 12,5 a 14, 5 g com uma carga total de 7,9 a 8,7 mmol.

Exemplo 4. Síntese de Fmoc-Orn(resina de 4-metoxitritila)-Tyr(tBu)- NH2

[00114] Fmoc-Orn(Mtt)-OH ou Fmoc-Orn(Mmt)-OH foram acoplados por métodos conhecidos na técnica com H-Tyr(tBu)-NH2. O produto obtido foi então desprotegido na cadeia lateral com 1 % TFA em DCM/TES (97:3) durante 2 h na RT. O dipeptídeo de ornitina bem seco obtido 1,0 mmol foi então dissolvido em 10 ml de DCM/DMF (1:1). Esta solução foi depois adicionada a 2,0 g de resina de cloreto de 4- metoxitritila (carga = 1,42 mmol/g) e à mistura obtida 3,0 mmol de DIPEA foram adicionados. A mistura foi depois agitada durante 12 h na RT e depois 0,5 ml de MeOH e a mistura foi agitada durante mais 2 h na RT. A resina foi então filtrada e lavada com 6X DMF, 3X IPA e 3X hexano, e secada em vácuo até um peso constante. Rendimento de 3,02 g com uma carga total de 0,86 mmol (0,28 mmol de dipeptídeo/g).

Exemplo 5. Síntese de Pyr-His-Trp-Ser-Tir-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro- Azagly-NH2 (Goserelina).

[00115] 1,0 g (0,64 mmol) de Fmoc-Orn(resina de 4-metoxitritila)- Pro-NH-NH-CO-NH2 foi acoplado sequencialmente com Fmoc-Leu- OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(Clt)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-His(Mmt)-OH e ácido piroglutâmico. A resina obtida foi então lavada 6X DMF, 3X IPA e 3X DEE e secada em vácuo. Em seguida 20 ml de TFA a 1 % em DCM/TES (97:3) foram adicionados e a resina foi filtrada e lavada com TFA a 1 % em DCM/TES (97:3). Os filtrados combinados foram então concentrados em vácuo, precipitados pela adição de DEE e secados com ar. A resina remanescente foi então lavada 3X DMF e 4X DMF/água (1:1). Aos filtrados combinados o sólido obtido pelo tratamento da resina com TFA foi adicionado e a solução foi neutralizada pela adição de 1N-NaOH. Depois 145,5 mg (1,0 mmol) de cloridreto de 1-H-1,2,4- triazol-carboxamidina e 258 mg (2,0 mmol) de DIPEA foram adicionados e a mistura foi agitada durante a noite. A mistura foi então acidificada para pH = 2,5, concentrada e purificada por RP-HPLC e liofilizada. Rendimento: 555,3 mg (67,6 %).

Exemplo 6. Síntese de Pyr-His-Trp-Ser-Tir-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro- NHEt (Buserelina)

[00116] 1,0 g (0,55 mmol) de Fmoc-Orn-Pro-NHEt foi acoplado sequencialmente com Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, Fmoc- Tyr(Clt)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-His(Mmt)-OH e ácido piroglutâmico. De acordo com o procedimento acima descrito obtivemos 477,0 mg de peptídeo (61,8 %).

Exemplo 7. Síntese de Pyr-His-Trp-Ser-Tir-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt (Leuprolida, Leuprolina)

[00117] 1,0 g (0,55 mmol) de Fmoc-Orn-Pro-NHEt foi acoplado sequencialmente com Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Leu-OH, Fmoc-Tyr(Clt)- OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-His(Mmt)-OH e ácido piroglutâmico. De acordo com o procedimento descrito acima obtivemos 488,1 mg (61,5 %).

Exemplo 8. Síntese de H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-AIa-Pro-Gly-Glu-Asp- Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 (peptídeo YY).

[00118] 1,0 g (0,28 mmol) de Fmoc-Orn(resina de 4-metoxitritila)- Tyr(tBu)-NH2 foi acoplado sequencialmente com Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Orn(Mmt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu- OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc- His(Trt)-OH, Fmoc-Orn(Mmt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Orn(Mmt) -OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc- Glu(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc- Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc- Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc- lle-OH, Fmoc-Pro-OH e Fmoc-Tyr(tBu)-OH. O peptídeo foi então clivado da resina e desprotegido parcialmente na cadeia lateral de ornitina e subseqüentemente submetido a guanila com 442,5 mg (3 mmol) de cloridreto de 1-H-1,2,4-triazol-carboxamidina em DMF e DIPEA. O produto foi então precipitado pela adição de água filtrada, lavado com água e DEE, desprotegido, purificado por RP-HPLC e liofilizado. Rendimento: 289,9 mg (24,4 %).

[00119] Várias modificações e variações dos aspectos descritos da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com as formas de realização preferidas específicas, deve ficar entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais formas de realização específicas. De fato, várias modificações dos métodos de realização da invenção descritos que são óbvios para aqueles versados nos setores relevantes são compreendidas de estarem dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

Claims

1. Método para a preparação de um peptídeo, ou um sal do mesmo, a partir de um conjugado de peptídeo-resina de Fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f), em que a resina é resina de 4-metóxi-tritila; e Pr1 é um grupo de proteção selecionado do grupo consistindo em: Fmoc, Boc, Cbz, Npys e Alloc; o dito método, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) desproteger a função α-amino N-terminal de dito conjugado de peptídeo-resina de Fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f) para remover o grupo de proteção de Pr1; (b) acoplar pelo menos um aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal tendo uma função de ácido carboxílico livre ou ativada com a função α-amino desprotegida da etapa (a), prolongando assim o composto de fórmula (2b), (2c), (2d), (2e) ou (2f), (c) opcionalmente repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes, em que o pelo menos aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal é idêntico ou diferente daquele da etapa anterior (b); (d) clivar o peptídeo resultante a partir da resina; (e) submeter à guanila o peptídeo obtido na etapa (d); (f) opcionalmente remover todos os grupos de proteção que permanecem após a etapa (d); (g) isolar e opcionalmente purificar o peptídeo assim obtido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos ou peptídeos protegidos de forma N- terminal das etapas (b) e (c) são protegidos por Fmoc.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um aminoácido ou peptídeo protegido de forma N-terminal da etapa por fim repetida (c) é protegido por um grupo de proteção que é ortogonal a Fmoc.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) compreende o tratamento do peptídeo com um reagente de guanilação selecionado de 1H-pirazol-1-carboxamidina 2,1-H-1,2,4-triazol-carboxamidina, triflil guanidina e tosilato de benzotriazol-1-caroxamidínio.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o conjugado de peptídeo-resina é selecionado dentre: em que a Resina é resina de 4-metóxi-tritila.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um peptídeo selecionado dentre: [2] Arg-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2; [5] 3-Mercaptopropionil-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg- Gly-NH2; [8] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly- NH2; [9] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [10] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt; [11] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [12] Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt sal de acetato; [20] H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-AIa- Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-lle-Asn- Leu-lle-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2; e [21] H-Tyr-Pro-lle-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala- Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2.