WO2011024887A1 - 環状ペプチドを含む結合体およびその作製方法 - Google Patents

環状ペプチドを含む結合体およびその作製方法 Download PDF

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WO2011024887A1
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peptide
unnatural amino
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carbon atoms
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真清 瀧
昌彦 宍戸
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国立大学法人 岡山大学
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a conjugate comprising a cyclic peptide in which a cyclic moiety is formed by a side chain of an unnatural amino acid and a functional part, and a method for producing the conjugate, and a novel unnatural amino acid.
  • a conjugate comprising a cyclic peptide in which a cyclic moiety is formed by a side chain of an unnatural amino acid and a functional part, and a method for producing the conjugate, and a novel unnatural amino acid.
  • Protein has various biological activities, and various protein preparations have been developed using this. In order to improve the stability and acceptability of proteins, research on relatively short peptides that encompass the active site of proteins and synthetic molecules that have a three-dimensional structure similar to the active site is underway. As a cyclic peptide, attention has been paid.
  • Cyclic peptides are considered useful because they provide structural constraints by cyclization and exhibit various biological activities. Cyclic peptides include those having properties such as antitumor properties themselves and those that specifically bind to a target substance, and are expected to be used in various applications.
  • a tumor-directed peptide vector has been disclosed as an application of a cyclic peptide (Patent Document 1).
  • Tumor-directed peptide vectors are based on the identification of several types of cyclic peptides that can be taken into tumor cells and transferred to the cytoplasm.
  • the peptide is bound to a substance that has a pharmacological action such as an antitumor action.
  • the cyclic peptide described in Patent Document 1 is a peptide having cysteines at both ends, and is considered to be cyclic by disulfide bonds.
  • Patent Document 2 use of a conjugate in which a cyclic peptide is bound to an immunoglobulin Fc region is disclosed (Patent Document 2).
  • the conjugate of Patent Document 2 is produced by covalently bonding a cyclic peptide or the like through the side chain of a specific amino acid residue in the Fc region.
  • a specific amino acid residue in the Fc region There is no specific disclosure about the synthesis of cyclic peptides.
  • Non-patent Documents As one method of synthesizing a cyclic peptide, preparation of a cyclic peptide having a thioether bond and production of a cyclic peptide library using an RNA catalyst and an in vitro translation system (ribosome system) are disclosed (Non-patent Documents). 1). Production of cyclic peptides using the in vitro translation system (ribosome system) is difficult to handle. In addition, the cyclic peptide of Non-Patent Document 1 has a problem that a methyl group is introduced into the main chain skeleton of a polypeptide chain, and there is a concern that toxicity to a living body is concerned.
  • Cyclic peptides are only known to have a limited structure, and a technique for easily using various cyclic peptides is desired.
  • phage displaying cyclic peptides on the cell surface are commercially available (Ph.D. TM -C7C Phage Display Peptide Library : New England Biolabs , Inc.).
  • a 7-amino acid peptide having two cysteines is presented on the phage, and a cyclic peptide is formed by disulfide bonding of the side chain SH group of cysteine.
  • Non-Patent Document 2 discloses that a phage having a bicyclic cyclic peptide was prepared by a linker compound.
  • phages having various cyclic peptides can be easily used, it is expected that research and application of cyclic peptides can be promoted.
  • An object of the present invention is to provide a conjugate in which a cyclic peptide in which a cyclic moiety is formed by a side chain of an unnatural amino acid and a functional portion are bonded via a peptide bond, and a method for producing the conjugate. It is.
  • the inventors of the present application introduced an unnatural amino acid having an unnatural side chain into a peptide (for example, introducing an unnatural amino acid itself into a peptide, or an unnatural amino acid).
  • the side chain of the unnatural amino acid can easily form a cyclic peptide with the side chain of the amino acid in the peptide molecule.
  • the present inventors have found that a conjugate containing a cyclic peptide in which a cyclic moiety is formed can be produced.
  • this invention consists of the following.
  • a conjugate comprising a cyclic peptide in which a cyclic part is formed by a side chain of an unnatural amino acid and a functional part bonded via a peptide bond.
  • the functional part is a phage and a cyclic peptide is bound to a coat protein of the phage.
  • the conjugate according to item 1 or 2 wherein the cyclic part formed by the side chain of the unnatural amino acid has a structure selected from the following: (A) a structure in which a side chain of an unnatural amino acid represented by the following chemical formula 9 is coordinated with a metal; (B) a structure represented by the following general formula 8; (In General Formula 8, Y 1 , Y 2 and Y 3 are each independently selected from alkylene groups having 1 to 5 carbon atoms.) 4).
  • R 3 is a halogen atom.
  • X 1 and X 2 are each independently selected from a haloalkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkenyl group having 2 to 5 carbon atoms, and Y 3 is (Selected from the group consisting of alkylene groups having 1 to 5 carbon atoms.)
  • R 3 is a halogen atom.
  • X 1 and X 2 are each independently selected from a haloalkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched alkenyl group having 2 to 5 carbon atoms, and Y 3 is (Selected from the group consisting of alkylene groups having 1 to 5 carbon atoms.) 6).
  • a method for screening for a cyclic peptide capable of binding to a target protein comprising the following steps: (I) The step of bringing the conjugate according to any one of the preceding items 1 to 3 into contact with the target protein: (Ii) selecting a conjugate bound to the target protein. 7). 2. The conjugate according to item 1, wherein the functional part is a polypeptide containing an Fc region. 8).
  • R 4 is an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, a phenylene group, an amide bond, an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, and an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
  • the precursor is prepared by culturing a cell into which a polynucleotide encoding a functional part which is a polypeptide having an Fc region and a polynucleotide encoding the linear polypeptide are introduced.
  • Unnatural amino acid represented by the following general formula (1): (Wherein R is NR 1 —CO—R 2 ; R 1 is selected from a hydrogen atom or a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms; R 2 is selected from an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a linear or branched alkenyl group having 2 to 4 carbon atoms. ) 14 14. The unnatural amino acid according to item 13, wherein R 1 is a hydrogen atom, and R 2 is a haloalkyl group having 1 or 2 carbon atoms or an alkenyl group having 2 or 3 carbon atoms.
  • conjugates having cyclic peptides with various structures can be provided, and the characteristics of the cyclic peptides can be effectively utilized. Further, according to the method of the present invention, a conjugate can be easily produced, and the conjugate can be produced and used even in an environment where scale and facilities are limited. According to the conjugate whose functional part is a phage, a system for screening a cyclic peptide having a desired function can be easily obtained, and various cyclic peptides can be selected according to the purpose.
  • the novel unnatural amino acid of the present invention has a functional group that can be bonded to the SH group of cysteine, and can be used to produce a cyclic peptide.
  • Example 1 It is a figure which shows cyclic peptide production using the unnatural amino acid of Chemical formula 2.
  • Example 1 It is a figure which shows cyclic peptide preparation using the unnatural amino acid of Chemical formula 3.
  • FIG. 6 is a view showing the results of producing a cyclic peptide using the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 5 (corresponding to FIGS. 3a to 3e) and the unnatural amino acid of Chemical Formula 2.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having produced the cyclic peptide using the peptide of sequence number 6, and the unnatural amino acid of Chemical formula 2.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having introduce
  • Example 3 It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 4 It is a figure which shows the result of having synthesize
  • FIG. (Example 5) It is a figure which shows the result of having synthesize
  • FIG. 3 is a view showing the result of introducing an unnatural amino acid of Chemical Formula 2 into the N-terminus of Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag-GFP.
  • FIG. 3 is a view showing the result of introducing an unnatural amino acid of Chemical Formula 2 into the N-terminus of Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag-GFP.
  • FIG. 3 is a view showing the result of introducing an unnatural amino acid of Chemical Formula 2 into the N-terminus of Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag-GFP.
  • Example 6 It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 7 It is a figure which shows the result of having synthesize
  • FIG. (Example 8) It is a figure which shows the result of having synthesize
  • FIG. Example 9 It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 10) It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 11 It is a figure which shows the result of having confirmed the cyclization of the peptide by the unnatural amino acid of Chemical formula 2 or Chemical formula 6 using iodoacetoamide.
  • Example 11 It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 12 It is a figure which shows the structural formula of three types of unnatural amino acids which can be introduce
  • Example 13 It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 13 It is a figure which shows the result of having synthesize
  • FIG. 14 It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 15 It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 17 It is the photograph which confirmed the infectivity to Escherichia coli of the phage which introduce
  • FIG. (Example 17) It is a figure which shows the result of having synthesize
  • FIG. (Example 18) It is a figure which shows the result of introduce
  • Example 19 It is the photograph which confirmed the infectivity to Escherichia coli of the phage which introduce
  • the present invention relates to a conjugate comprising a cyclic peptide in which a cyclic moiety is formed by a side chain of an unnatural amino acid and a functional part bonded via a peptide bond.
  • the unnatural amino acid in a cyclic peptide in which a cyclic moiety is formed by a side chain of an unnatural amino acid, the unnatural amino acid is present in the peptide, and the side chain of the unnatural amino acid is bound to other side chains or the like in the peptide. What is necessary is just to form an annular part by this.
  • the non-natural amino acid in the cyclic peptide of the present invention may exist as a non-natural amino acid molecule and introduced into the peptide, or as a result of addition of a compound having a non-natural structure to the peptide. An amino acid may be generated.
  • the cyclic peptide in the present invention may be any peptide as long as it contains an unnatural amino acid and a cyclic moiety. Even if the cyclic peptide forms the cyclic part in the whole peptide, a part of peptide may form the cyclic part. Further, the cyclic peptide may be singular or plural, but is preferably singular. That is, the cyclic peptide in the present invention is preferably monocyclic.
  • the cyclic portion is formed by combining a side chain of an unnatural amino acid with another unnatural amino acid or a side chain of a natural amino acid.
  • the number of amino acid residues in the cyclic peptide is not particularly limited, but is preferably 2 to 100, more preferably 4 to 50, particularly preferably 6 to 17, and further preferably 6 to 16.
  • the cyclic peptide contained in the conjugate of the present invention preferably has a structure in which the binding moiety formed by the side chain of the unnatural amino acid is selected from the following.
  • B Structure represented by the following general formula 8:
  • Y 1 , Y 2 , Y 3 are each independently selected from alkylene groups having 1 to 5 carbon atoms.
  • Y 1 , Y 2 , Y 3 are each independently (It is an alkylene group having 1 to 2 carbon atoms, more preferably Y 1 and Y 2 are ethylene groups, and Y 3 is a methylene group.)
  • Examples of the metal in the structure (A) include divalent metal ions such as Ca 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ and Cu 2+ .
  • the binding moiety formed by the side chain of the unnatural amino acid preferably has a structure represented by the following general formula 12.
  • R 4 represents an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, a phenylene group, an amide bond (NHCO), an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, and 1 to 5 carbon atoms
  • R 4 is a structure selected from the following chemical formulas 15-18.
  • the unnatural amino acid may be added to the N-terminus of the peptide by the Nexta method (see JP 2009-106268 A).
  • an amino acid preferably a basic amino acid, capable of acting on leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase (hereinafter also referred to as “L / F transferase”) at the N-terminus to which an unnatural amino acid is added.
  • L / F transferase leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase
  • the unnatural amino acid in the cyclic peptide of the present invention is an unnatural amino acid having a side chain that can bind to the side chain of another amino acid in the cyclic peptide molecule.
  • the bond between the side chain of the unnatural amino acid and the side chain of another amino acid in the cyclic peptide molecule include a disulfide bond, an amide bond, an ester bond, and a thioether bond, and a thioether bond is preferable.
  • an unnatural amino acid reacts with and binds to the SH group of cysteine in the cyclic peptide molecule.
  • Examples of such an unnatural amino acid include an unnatural amino acid represented by the following general formula (1), an unnatural amino acid represented by the following chemical formula 3, and the unnatural amino acid shown in FIG.
  • R is NR 1 —CO—R 2 or OR 2
  • R 1 is selected from a hydrogen atom or a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2 is selected from an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a linear or branched alkenyl group having 2 to 4 carbon atoms.
  • the unnatural amino acid is preferably an unnatural amino acid represented by the following chemical formula 2, general formula 20, or chemical formula 6. (Wherein R 5 is Br or I.)
  • the side chain of the unnatural amino acid of the general formula (1) can be bonded to the SH group of cysteine.
  • a reaction side reaction
  • R is OR 2 and R 2 is a haloalkyl group having 1 to 3 carbon atoms substituted with one halogen atom (preferably R 2 is a 1-bromoethyl group, or
  • a 1-iodoethyl group unnatural amino acid
  • the cyclic peptide is exemplified by a non-natural amino acid represented by Chemical Formula 2 bound to the N-terminus of the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a haloalkyl group of the unnatural amino acid represented by the chemical formula 2 of N-terminal, and SH group of cysteine is formed thioether bond by S N 2 reaction, the annular portion is formed (Fig. 1).
  • Specific examples of the cyclic peptide include those in which an unnatural amino acid of Formula 3 is bonded to the N-terminus of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the functional unit bound to the cyclic peptide by a peptide bond may be any one having any function, for example, a protein (including a peptide), a small molecule including an amide group Examples include compounds (including fluorine-containing unnatural amino acids), cells, bacteria, viruses (including bacteriophages), and the like.
  • the protein may be any protein, but a polypeptide containing an Fc region derived from an antibody, a fluorescent protein (for example, GFP) and the like are preferable.
  • the functional part is a protein
  • the N-terminus of the protein and the C-terminus of the cyclic peptide are bound by a peptide bond.
  • the functional part is a cell, bacterium, virus or the like
  • an embodiment in which a protein present in the inside of the cell, bacterium, virus or on the membrane and the cyclic peptide are bound is preferable.
  • the functional part is a low molecular weight compound, it is preferable that the amino group in the low molecular weight compound and the C-terminal carboxyl group of the cyclic peptide are bonded.
  • the Fc region includes a known Fc region, an Fc region to be obtained in the future, and variant molecules of these Fc regions.
  • the Fc region includes monomeric or multimeric forms.
  • the Fc region is a human-derived Fc region.
  • the Fc region can be any immunoglobulin, and examples thereof include IgG1, IgG2, and IgG4.
  • a variant molecule of the Fc region is one in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, added, or induced in the amino acid sequence of the Fc region.
  • properties of the Fc region such as interaction with complement, etc. Anything that retains the desired Fc region function may be used.
  • GenBank accession # 7044 is exemplified.
  • the functional part When the functional part is a virus, it is preferably a bacteriophage.
  • the bacteriophage include filamentous phage (f1, fd, and M13 phage) generally used in the phage display method, other bacteriophages (for example, T7 bacteriophage and lambdoid phage), and the like.
  • filamentous phage it is typically preferable to fuse a linear peptide to coat protein pIII or pVIII.
  • M13 phage a gene encoding a linear peptide is linked to a gene encoding a coat protein.
  • a phage library is prepared by infecting E. coli with this phage gene, transforming it and expressing it.
  • the conjugate of the present invention retains the ability to infect host cells such as E. coli.
  • the present invention also extends to an intermediate of a conjugate formed by binding a linear peptide having an unnatural amino acid at the N-terminus and a functional part via a peptide bond.
  • the “linear peptide having an unnatural amino acid at the N-terminus” means a peptide after the unnatural amino acid is bound by the Nexta method and before the cyclic portion is formed.
  • the conjugate of the present invention in which the cyclic peptide includes the structures (A) and (B) can be produced by a production method including the following steps.
  • a description will be given of a conjugate whose functional part is a phage.
  • a phage obtained by binding a linear peptide containing an amino acid having an SH group (for example, cysteine) and a compound represented by the following general formula 10 or general formula 11 are mixed and mixed at 0 to 80 ° C. (preferably Is a step of reacting for 0 to 15 ° C., more preferably 4 ° C.) for 0.5 to 16 hours (preferably 10 to 14 hours).
  • R 3 is a halogen atom, preferably an iodine atom.
  • X 1 and X 2 are selected from a haloalkyl group having 1 to 5 carbon atoms and a linear or branched alkenyl group having 2 to 5 carbon atoms
  • Y 3 is an alkylene having 1 to 5 carbon atoms Selected from the group consisting of groups, preferably X 1 and X 2 are vinyl groups (ethenyl groups) and Y 3 is a methylene group.
  • a phage having a linear peptide may be prepared by a known method, or a linear peptide You may purchase the phage which has this, or you may purchase the phagemid vector which codes linear peptide. Moreover, you may obtain by reducing a cyclization peptide using the phage which has the cyclization peptide by a commercially available disulfide bond.
  • an amino acid having an SH group for example, cysteine (Cys)
  • the compound of general formula 10 or general formula 11 forms the above-mentioned structure (A) or (B) by binding to the SH group of the amino acid, and cyclizes the linear peptide on the phage to form a cyclic peptide.
  • A the compound of general formula 10
  • B the compound of general formula 11
  • X 1 and X 2 need to bind to the SH group, so that there are two amino acids having an SH group in the linear peptide. Need to be.
  • Two amino acid molecules having an SH group may be adjacent to each other, but preferably 2 to 100 amino acids, more preferably 5 to 12 amino acids are present between two amino acid molecules having an SH group.
  • the solvent for the reaction of the phage with the compound of the general formula 10 or 11 may be a buffer solution having a pH of 3 to 11 (preferably pH 6 to 9).
  • a buffer solution having a pH of 3 to 11 preferably pH 6 to 9.
  • HEPES, phosphate or PBS, Tris And PIPES may be a buffer solution having a pH of 3 to 11 (preferably pH 6 to 9).
  • the phage in the solvent and the compound of the general formula 10 or 11 are 1 pmol to 1 ⁇ mol, preferably 0.1 nmol to 50 nmol of the compound of the general formula 10 or 11 with respect to 1 ⁇ 10 11 pfu / 50 ⁇ L of the phage. More preferably, they are mixed in such a ratio that 0.2 nmol to 22 nmol is present.
  • the methods described in Examples 16 and 17 can be used to make the conjugates of the invention.
  • the addition reaction of the compound of the general formula 10 or 11 is allowed to proceed under a mild condition, so that the phage which is a functional part is linear while retaining the infectivity. It is possible to cyclize the peptide, and the conjugate of the present invention can be produced. According to the method of the present invention, it is considered that the peptide displayed on the phage can be cyclized without affecting the structure of the coat protein considered to be essential for infectivity in the phage which is a functional part.
  • the present invention also relates to (a) a linear peptide that does not contain an unnatural amino acid at the N-terminus, and (b) a non-natural amino acid having a functional group in the side chain that can bind to the side chain of the amino acid in the linear peptide molecule. And (c) tRNA, (d) aminoacyl tRNA synthetase, and (e) a mixed solution containing leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase.
  • a linear peptide having (b) an unnatural amino acid at the N-terminus is prepared.
  • the method of the present invention comprises (1) (a) a step of providing a linear peptide not containing an unnatural amino acid at the N-terminus, and (2) using the mixed solution containing (a) to (e), A step of producing a linear peptide in which an unnatural amino acid is added to the N-terminus (Nexta method), and a step of forming a cyclic portion in the linear peptide produced by (3) step (2).
  • the “(a) linear peptide not containing an unnatural amino acid at the N-terminal” in step (1) may exist as a single peptide or may exist in the precursor of the conjugate of the present invention.
  • the precursor of the conjugate of the present invention means a conjugate obtained by peptide-bonding a linear peptide that does not contain an unnatural amino acid at the N-terminus.
  • Precursor means that in the previous stage of an intermediate having a linear peptide containing an unnatural amino acid at the N-terminus, and is distinguished from the intermediate.
  • a linear peptide that does not contain an unnatural amino acid at the N-terminus can be obtained, for example, by isolating it from the living body of various organisms. Moreover, it can also be produced using a technique known per se such as a genetic engineering technique or organic synthesis.
  • the precursor can be obtained by, for example, isolating those that are expressed in the living body of various organisms.
  • the precursor expressed in the living body of the organism may be obtained by introducing and expressing a gene encoding the precursor by a genetic engineering technique.
  • the functional part is a polypeptide such as a polypeptide containing an Fc region or a protein such as GFP, it encodes an Fc region and an oligonucleotide that encodes a linear peptide that does not contain an unnatural amino acid at the N-terminus in mammalian cells.
  • a precursor can be obtained by introducing a fusion with an oligonucleotide, culturing and expressing it. At this time, in order to secrete a precursor comprising a linear peptide containing no unnatural amino acid at the N-terminal and the Fc region to the outside of a mammalian cell, a signal peptide is added to the oligonucleotide encoding the precursor. Encoding oligonucleotides may be fused. Specifically, the method described in the embodiment may be used.
  • the present invention extends to the precursor in which a linear peptide having a basic amino acid at the N-terminus and a functional part are bonded via a peptide bond.
  • the precursor of the present invention is prepared by the above-described genetic engineering technique.
  • the method for producing the precursor of the present invention by genetic engineering techniques is as described with reference to the precursor obtained by binding the above-mentioned linear peptide and Fc region.
  • a precursor is produced by introducing nucleotides into precursor-expressing cells and culturing them.
  • the oligonucleotide encoding the precursor is preferably fused with the oligonucleotide encoding the signal peptide.
  • mammalian cells, insect cells and the like may be used as precursor-expressing cells.
  • the non-natural amino acid has a side chain that can bind to the side chain of another amino acid in the peptide molecule, and does not require a catalyst or the like with the side chain of the other amino acid, and contacts in a solvent. Or having a side chain that can be bound only by the presence of an initiator such as aqueous hydrogen peroxide.
  • an initiator such as aqueous hydrogen peroxide.
  • the unnatural amino acid for example, those represented by general formula (1) or chemical formula 3 can be used, and those represented by chemical formula 2 can be preferably used.
  • (C) tRNA is known to be aminoacylated by aminoacyl tRNA synthetase, and has a function to be aminoacylated by aminoacyl tRNA synthetase used in the present invention, in addition to known tRNA, And the tRNA which has the function in which the aminoacyl group couple
  • tRNA include natural tRNA such as tRNA Phe or tRNA Leu .
  • tRNA Phe coli-derived phenylalanyl tRNA synthetase mutant (Ala294 ⁇ Gly), it is preferable to use tRNA Phe .
  • the tRNA in the present invention can be obtained by a method known per se, or can be obtained by purchasing a commercially available product (for example, a crude tRNA containing natural E. coli-derived phenylalanine tRNA and natural E. coli-derived phenylalanine tRNA. (Purified product is available from SIGMA).
  • aminoacyl-tRNA synthetase (hereinafter sometimes referred to as “aaRS”) is an enzyme responsible for synthesizing an aminoacyl-tRNA that is a substrate in translation of the genetic code in a ribosome.
  • aaRS aminoacyl-tRNA synthetase
  • aaRS corresponding to lysine (Lys) is called lysyl tRNA synthetase.
  • the aminoacyl-tRNA synthetase used in the present invention includes a wild-type aminoacyl-tRNA synthetase having a substrate specificity for a natural amino acid or an unnatural amino acid to be introduced, and an unnatural amino acid compared to the specificity for an original amino acid.
  • a variant of an aminoacyl-tRNA synthetase with increased specificity for a derivative or the like can be used.
  • E. coli-derived phenylalanyl tRNA synthetase E. coli-derived phenylalanyl tRNA synthetase (E.
  • coli PheRS for example, any of Ala294 ⁇ Gly mutant, Ala356 ⁇ Trp mutant, Thr251 ⁇ Ala mutant, or Gly318 ⁇ Trp mutant) Or these multiple mutants) (Chembiochem, 2002, 02-03, 235-237, Taki, Chembiochem, 2009, 10, 2460-2464.) Or E. coli-derived leucyl-tRNA synthetase (E.
  • the aminoacyl-tRNA synthetase in the present invention can be synthesized by a method known per se or can be obtained by purchasing a commercially available product (for example, natural aminoacyl-tRNA synthetase can be obtained from SIGMA).
  • Leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase is derived from Escherichia coli and has a hydrophobic amino acid such as phenylalanine, leucine, or methionine bound to tRNA, and lysine or arginine at the N-terminus. Alternatively, it is an enzyme that catalyzes a reaction for transfer to a peptide.
  • L / F transferase can be synthesized and obtained by a method known per se (eg, genetic engineering technique) (M. Taki, et al., Chembiochem, 2008, 9, 719-722).
  • a buffer solution, salts and the like suitable for the reaction can be appropriately present.
  • the buffer include Hepes buffer and Tris-hydrochloric acid. Specifically, a mixture of a solution containing MgCl 2 , Spermidine, and Hepes buffer and a solution containing ATP can be used.
  • the reaction conditions such as temperature and pH can be selected arbitrarily according to the enzyme used.
  • the reaction temperature is preferably about 0 ° C. to 50 ° C., more preferably about 4 ° C. to 37 ° C.
  • the reaction pH is preferably about 6-9, more preferably about 7-8.
  • the reaction time is preferably about 10 minutes or more, more preferably about 15 minutes to 300 minutes, and most preferably about 60 minutes to 180 minutes.
  • the step (3) of forming a cyclic moiety in the linear peptide with an unnatural amino acid added to the N-terminus prepared by the step (2) is performed simultaneously with the step (2) and the step (2). Including the case of another process. For example, when an unnatural amino acid having a haloalkyl group in step (2) is used as (b) an unnatural amino acid, it is considered that the cyclization reaction proceeds simultaneously with the introduction of the unnatural amino acid. And step (3) are not distinguished, and incubation may be performed as it is. When step (2) and step (3) are distinguished, a linear peptide with an unnatural amino acid added to the N-terminus is purified once or without purification in an appropriate solvent or desired substance May be added and incubated. For example, the step (3) can be performed by adding an initiator such as a hydrogen peroxide solution after the completion of the step (2).
  • an initiator such as a hydrogen peroxide solution
  • An initiator is a substance for initiating a cyclization reaction, and is distinguished from an agent having a function of catalyzing the reaction. Specific examples of the initiator include hydrogen peroxide water.
  • R is NR 1 —CO—R 2
  • R 1 is selected from a hydrogen atom or a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2 is selected from an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a linear or branched alkenyl group having 2 to 4 carbon atoms.
  • R is NR 1 —CO—R 2
  • R 1 is a hydrogen atom, or a linear or branched saturated or unsaturated aliphatic group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 2 is a hydrocarbon group, and R 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a linear or branched alkenyl group having 2 to 4 carbon atoms.
  • R is NR 1 —CO—R 2
  • R 1 is a hydrogen atom
  • R 2 is a haloalkyl group having 1 or 2 carbon atoms, or 2 or 3 carbon atoms.
  • the aliphatic hydrocarbon group includes an alkyl group, a cycloalkyl group, an alkenyl group, and an alkynyl group.
  • alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and a tert-butyl group.
  • a haloalkyl group means an alkyl group substituted with at least one halogen (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine), and examples thereof include a bromomethyl group, a 2-bromoethyl group, a chloroethyl group, and a difluoroethyl group. Is done.
  • alkenyl group examples include those having an unsaturated group such as one or more double bonds in an alkyl group having 2 or more carbon atoms, such as a vinyl group, an allyl group, a 1-propenyl group, and a 2-butenyl group. Is exemplified.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • R 2 is a haloalkyl group having 1 or 2 carbon atoms or an alkenyl group having 2 or 3 carbon atoms.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • R 2 is a chloroalkyl group, a bromoalkyl group, or a vinyl group, and is represented by the following chemical formula 2, general formula 20, or chemical formula 6.
  • Unnatural amino acid is a hydrogen atom
  • the functional group represented by R 2 in such a novel unnatural amino acid can be bound to the SH group of the natural amino acid cysteine by S N 2 reaction or Michael type addition reaction, and is used for the production of the cyclic peptide. be able to.
  • the compound described in the general formula (1) is based on Longhu Zhou et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2006, 14, 7862-7874 or Shoji Nagaoka et al., Synthetic Communications, 35: 2529-2534,2005 Can be produced.
  • the production methods of Chemical Formulas 2, 5, and 6 are described in Examples 5, 8, and 9 below.
  • the present invention also extends to a reagent kit for producing a conjugate comprising the compound represented by the above general formula 10 or general formula 11.
  • the present invention provides a peptide having the above-mentioned novel unnatural amino acid, and a cyclic peptide or a conjugate having a cyclic peptide, including the novel unnatural amino acid, aminoacyl tRNA synthetase, and leucyl / phenylalanyl tRNA protein transferase. It extends to reagent kits for production.
  • the present invention also extends to a method for screening a cyclic peptide capable of binding to a target protein, comprising the following steps.
  • the cyclic peptide has the above structure (A)
  • the cyclic peptide itself is not only directional to the target protein, but the coordinated metal is predicted to have affinity for the target protein. It is considered that the cyclic peptide presented by the conjugate selected by the screening method of the present invention can bind to the target protein very effectively.
  • Arg-Val-Cys-Aka (SEQ ID NO: 1) Arg-Pro-Cys-Aka (SEQ ID NO: 2) Arg-Gly-Cys-Arg-Ala-Phe-Ile (SEQ ID NO: 3) Arg-Gly-Asp-Cys-Gly-Gly-Ser-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Bacd (SEQ ID NO: 4) Arg-Gly-Asp-Cys-Gly-Gly-Ser-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 5) Aka in the sequence is ⁇ - [acridine-9 (10H) -on-2-yl] -L-alanin ( ⁇ - [acridine-9 (10H) -on
  • FIG. Figures 3a-e show the results of cyclization of the peptides of SEQ ID NOs: 1-5, respectively.
  • “Before cyclization” indicates that before the introduction of the unnatural amino acid
  • “After cyclization” indicates that after the introduction of the unnatural amino acid.
  • the above reaction produced a peptide into which an unnatural amino acid was introduced, and a cyclized peptide could be produced.
  • the molecular ion peak that was not cyclized only by the introduction of the unnatural amino acid was not observed in the mass spectrum, and it was considered that the cyclization proceeded almost simultaneously with the introduction of the unnatural amino acid.
  • UITF Urinary Trypsin Inhibitor Fragment
  • coli PheRS (Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala double mutant) 0.75 ⁇ l (15 pmol), 7.6 ⁇ M L / F transferase (wild type) 2 ⁇ l (15 pmol) was mixed to prepare a mixed solution (total amount adjusted to 10 ⁇ l with ultrapure water). Incubated at 37 ° C for 60 minutes. It refine
  • a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 was bound to the N-terminus of the Fc region (CH2 + CH3 region), and a HA signal peptide was further bound to the N-terminus to prepare a fusion protein.
  • peptide-Fc SEQ ID NO: 7 + Fc region
  • HEK293 cells were introduced with a plasmid encoding the HA signal peptide-peptide-Fc region and cultured.
  • the peptide-Fc region was obtained by purification with proteinG-agarose, and it was confirmed by Edman degradation that the N-terminal sequence was KGL. As a result, it was confirmed that the precursor (peptide-Fc region) having N-terminal lysine was secreted extracellularly.
  • the results are shown in FIG.
  • the CBB staining in the upper part of FIG. 6 is a photograph showing the result of protein staining.
  • staining is observed when a fluorescent substance is introduced. From the result of fluorescence imaging, fluorescence could be observed in the fraction containing the precursor (peptide-Fc region), and it was confirmed that the unnatural amino acid was introduced.
  • the same experiment was performed except for the enzyme, tRNA and unnatural amino acid, and no fluorescence of the precursor (peptide-Fc region) was observed.
  • Example 5 Synthesis of unnatural amino acid represented by Chemical Formula 2 As an amino acid applicable to the NEXT-A method, an unnatural amino acid represented by Chemical Formula 2 (p- (chloroacetylamino) phenylalanine: p- (chloroacetylamino) ) phenylalanine) was newly synthesized.
  • p- (chloroacetylamino) phenylalanine may be expressed as “caaPhe”.
  • the synthesis method followed the following scheme with reference to Longhu Zhou et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2006, 14, 7862-7874.
  • Boc-Phe (4 -NHCOCH 2 Cl) reagents used in the synthesis of Boc-Phe (4-NHCOCH 2 Cl) -OH of -OH may, Boc-Phe (4-NH 2) -OH (1.12 g; 4.00 mmol), chloroacetyl chloride (2.00 mL; 25.0 mmol), NaHCO 3 (1.68 g; 20.0 mmol), dry THF (40.0 mL). NaHCO 3 and Boc-Phe (4-NH 2 ) —OH were added to the eggplant flask and dried with a vacuum line. 30 mL of dry THF was added thereto, and the mixture was stirred on ice. The added NaHCO 3 remained in the eggplant flask as a white precipitate.
  • Boc-Phe (4 -NHCOCH 2 Cl) Deprotection Deprotection Boc-Phe (4-NHCOCH 2 Cl) -OH to the -OH, Boc-Phe (4- NHCOCH 2 Cl) -OH (200mg; 0.56 mmol), 4M dioxane hydrochloride (2.5 mL; 10 mmol), and dry ethyl acetate (2.5 mL) were used.
  • the eggplant flask containing Boc-Phe (4-NHCOCH 2 Cl) —OH was dried under reduced pressure with a hydraulic pump, dryethyl acetate was added, and the eggplant flask was purged with nitrogen.
  • a peptide consisting of a His6 ubiquitin tag and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 (Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys) and a FLAG tag is added to GFP. I let you.
  • ubiquitin cleaving enzyme Usp2-cc
  • Somatostatin peptide SEQ ID NO: 8 -FLAG tag-GFP
  • a plasmid encoding His6 ubiquitin tag-Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag-GFP was introduced into Escherichia coli (BL21 (DE3)), followed by induction with IPTG and culture. Escherichia coli was disrupted and purified by Ni-NTA-agarose to obtain His6 ubiquitin tag-Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag-GFPSomatostatin. Furthermore, Usp2-cc was allowed to act to obtain Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag-GFP.
  • Mass spectra were measured for the precursor and the product obtained by reacting the precursor with an unnatural amino acid by the Nexta method (FIG. 9). As a result, it was confirmed that the peak was shifted, and it was confirmed that the intermediate was produced by binding the unnatural amino acid to the precursor. In addition, it was confirmed that almost no precursor with no unnatural amino acid remained.
  • the intermediate was treated with enterokinase at 23 ° C. for 48 hours to decompose between FLAG tag and GFP to obtain unnatural amino acid (caaPhe) -Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag.
  • enterokinase at 23 ° C. for 48 hours to decompose between FLAG tag and GFP to obtain unnatural amino acid (caaPhe) -Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag.
  • a mass spectrum of the unnatural amino acid (caaPhe) -Somatostatin peptide (SEQ ID NO: 8) -FLAG tag was measured (FIG. 10).
  • GFP was also analyzed by measuring a mass spectrum, and only a peak indicating GFP alone was obtained. This was thought to be because caaPhe did not react with the SH group in GFP but reacted specifically with the SH group present in the Somatostatin peptide.
  • the amino acid sequence of the FLAG tag is DYKDDDDK and does not have an SH group.
  • His6-FLAG peptide was prepared by peptide solid phase synthesis. Sequence of His6-FLAG peptide: Lys-His-His-His-His-His-His-His-Cys-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 9) 0.025 OD / ⁇ l E.
  • coli tRNA Phe 1 ⁇ l (0.05OD), 10 ⁇ Buffer A (100 mM MgCl 2 , 10 mM Spermidine, 500 mM Hepes buffer (pH 7.6)) 0.5 ⁇ l, 10 ⁇ Solution B (25 mM ATP, 200 mM KCl , 20 mM DTT) 0.5 ⁇ l, 0.35 mM His6-FLAG peptide 0.5 ⁇ l (180 pmol), 1 mM unnatural amino acid (caaPhe) 1 ⁇ l (1 nmol), 20 ⁇ M E.
  • Buffer A 100 mM MgCl 2 , 10 mM Spermidine, 500 mM Hepes buffer (pH 7.6)
  • 10 ⁇ Solution B 25 mM ATP, 200 mM KCl , 20 mM DTT
  • coli PheRS (Ala294 ⁇ Gly) 0.25 ⁇ l (5 pmol), 29 ⁇ M
  • a mixed solution (total amount: 5 ⁇ l) was prepared by mixing 0.25 ⁇ l (7.3 pmol) of L / F transferase (wild type) and 1 ⁇ l of ultrapure water. Incubated at 37 ° C for 60 minutes.
  • a negative control a sample in which 1 ⁇ l of ultrapure water was added instead of the above amino acid and the same operation was performed was also prepared. The mass spectra of these two samples were measured and compared.
  • the cyclic peptide having a His6 sequence has a binding activity to Ni-NTA-agarose gel, similarly to the peptide having a linear His6 sequence.
  • Example 8 Synthesis of Unnatural Amino Acid Represented by Chemical Formula 5
  • An unnatural amino acid represented by the following Chemical Formula 5 (hereinafter also referred to as “Phe (4-NHCOC 2 H 4 Br)”) was synthesized.
  • the target product was identified by 1H NMR (solvent: methanol-d4). Further, when silica gel TLC development with methanol / chloroform (1: 9) was performed, the Rf value of the starting material before the reaction was 0.2, and the Rf value of the reaction product was 0.3.
  • Example 9 Synthesis of Unnatural Amino Acid Represented by Chemical Formula 6
  • the Pasteur pipette was filled with cotton and filtered, and the eggplant flask was washed with a small amount of ultrapure water and filtered. Since the precipitate was not completely cut off with a Pasteur pipette, it was collected in a 1.5 mL tube, centrifuged for 5 min, and only the supernatant was collected in a 10 mL eggplant flask. While stirring at room temperature, 0.17 mL of acetone and 0.45 mL of 2.0M KOH were sequentially added. Thereafter, a mixed solution of acetone 1.0 mL and acryloyl chloride 80 ⁇ L was slowly added dropwise under ice cooling. At this time, it turned dark green.
  • coli PheRS (Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala double mutation Body) 0.25 ⁇ l (5 pmol), 29 ⁇ M L / F transferase (wild type) 0.25 ⁇ l (7.3 pmol) and ultrapure water 1 ⁇ l were mixed to prepare a mixed solution (total amount 5 ⁇ l). Incubated at 37 ° C for 60 minutes. Furthermore, instead of E. coli PheRS (Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala double mutant), E. coli PheRS (Ala294 ⁇ Gly & Phe248 ⁇ Ala double mutant), E.
  • FIG. 15a shows the Ala294 ⁇ Gly mutant
  • FIG. 15b shows the Ala294 ⁇ Gly & Phe248 ⁇ Ala double mutant
  • FIG. 15c shows the Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala double mutant
  • FIG. 15d shows the Ala294 ⁇ Gly & Gly318 ⁇ Trp double mutant
  • 15a shows the Ala294 ⁇ Gly & Ala356 ⁇ Trp double mutant
  • FIG. 15f shows the Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala & Gly318 ⁇ Trp triple mutant
  • 15g shows the Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala & Ala356 ⁇ The result when using the Trp triple mutant is shown.
  • Example 11 Introduction of an unnatural amino acid of Formula 2 or 6 into the peptide N-terminus (Nexta method) (1) In the same manner as in Example 10, using E. coli PheRS (Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala double mutant), an unnatural amino acid of Chemical Formula 2 or 6 was introduced into the H-2692 peptide, It refine
  • Example 12 Introduction of unnatural amino acid into peptide bound to Fc region
  • peptide-Fc region A fusion protein in which a peptide consisting of an amino acid sequence (KNFFWKTFTSCDYKDDDDKKVDKTHTCPPCP: SEQ ID NO: 11) is bound to the N-terminus of the Fc region (CH2 + CH3 region), and an HA signal peptide is bound to the N-terminus.
  • Results are shown in FIG.
  • the CBB staining in the upper part of FIG. 6 is a photograph showing the result of protein staining.
  • M represents a marker.
  • fluorescence could be observed, and it was confirmed that an unnatural amino acid was introduced.
  • the precursor (B) as a negative control experiment, no fluorescence was observed.
  • mu1 Thr247 ⁇ Val & Thr248 ⁇ Val double mutant mu2: Thr252 ⁇ Tyr & His537 ⁇ Gly double mutant mu3: Thr252 ⁇ Tyr & Thr247 ⁇ Val & Thr248 ⁇ Val triple mutant mu4: Thr252 ⁇ Tyr mutant mu5 : His537 ⁇ Gly mutant wt: No mutation
  • coli LeuRS (any of the above 6 types) ) (36 pmol), 39 ⁇ M L / F transferase (wild type) 1 ⁇ l (39 pmol) and 9.5 ⁇ l of ultrapure water (total amount 24 ⁇ l) were prepared. 4 ⁇ l of the mixed solution and 1 ⁇ l of various unnatural amino acids (final concentration 2 mM) were mixed and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • a stop solution 108 ⁇ l of 10% TFA in 180 ⁇ l, 54 ⁇ l of ultrapure water, 18 ⁇ l of UITF peptide that is pre-reacted with 0.32 mM Cys and CD 2 CD 2 Br as thioether
  • Propargylglycine can be introduced into peptides by mu1, mu3, mu4, azidohomoalanine can be introduced into peptides by mu1, mu2, mu3, mu4, and chloroalanine can be introduced by mu1, mu3 It was found that mu4 can be introduced into peptides.
  • coli LeuRS (mu1) 1.2 ⁇ M, L / F transferase (wild type) 1.2 ⁇ M, and chloroalanine 2.0 mM at 37 ° C. for 30 minutes. Incubated. After the reaction, the reaction was stopped by adding TFA, purified using ZipTip, and molecular weight was measured using CHCA (matrix).
  • FIG. 20a shows the result when the reaction is performed without adding chloroalanine
  • FIG. 20b shows the result when the reaction is performed with chloroalanine added. It was found that the peptide was cyclized by introduction of chloroalanine.
  • N-Boc-L-Tyrosine ester 3.5 mmol, dibromoethane 3.5 mmol, sodium methoxide 3.5 mmol, and dry acetonitrile 6.0 mL were mixed and reacted with reflux for 12 hours. Identification was performed by 1 H NMR after extraction and purification by silica gel column. As a result of identification, it was judged that N-Boc-bromoethyl-L-Tyrosine methyl ester was made. The yield was 30%. Subsequently, the methyl group of N-Boc-bromoethyl-L-Tyrosine ester was deprotected with LiOH.
  • coli PheRS (mu3) (Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala double mutant) 0.25 ⁇ l, 39 ⁇ M L / F transferase (wild type) 0.25 ⁇ l, super 1.0 ⁇ l of pure water and 1.0 ⁇ l of 1 mM unnatural amino acid of Chemical Formula 7 were mixed and incubated at 37 ° C. for 1, 3 and 5 hours. The reaction was stopped by mixing TFA, purified using ZipTip, and confirmed by MALDI-TOF-MS for cyclization. As a positive control, caaPhe was prepared instead of the unnatural amino acid of Chemical Formula 7, and a mixed solution containing no unnatural amino acid was prepared as a negative control, and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIG. Fig. 22a shows the result of the positive control
  • Fig. 22b shows the result of the negative control
  • Fig. 22c shows the result of adding the unnatural amino acid of Formula 7 and incubating for 1 hour
  • Fig. 22d shows the result of Formula 7
  • FIG. 22e shows the result of adding the unnatural amino acid of Formula 7 and incubating for 5 hours.
  • the reaction time of 1 hour although the unnatural amino acid of Chemical Formula 7 was introduced into the peptide, the cyclization proceeded only about 50%. When the reaction time was 3 hours and 5 hours, the cyclization reaction almost proceeded.
  • a phage displaying a model peptide (SEQ ID NO: 13: ACHHHHHHCDYKDDDDK) (not cyclized)
  • 84 ⁇ L of 20% PEG / 2.5M NaCl was added and suspended. After centrifugation (4 ° C., 15000 rpm, 30 minutes), the supernatant was removed.
  • 50 ⁇ L of phage (1 ⁇ 10 11 pfu) and 74 mM BVSM were mixed so that the final concentrations were 1100 ⁇ M, 110 ⁇ M, and 11 ⁇ M. Thereafter, PBS degassed with nitrogen was added to make the total volume 2 mL. The mixture was allowed to stand and reacted at 4 ° C. overnight.
  • Cyclization was performed with BVSM at three concentrations (final concentrations of 1100 ⁇ M, 110 ⁇ M, and 11 ⁇ M). The same experiment was performed without phage (Lys-N only) as a negative control and without BVSM as a Mock. In BVSM 11 ⁇ M, only the peak of the peptide cyclized by BVSM was confirmed. Moreover, when the infectivity to Escherichia coli was confirmed about the phage which performed cyclization reaction by BVSM 11micromol, it turned out that the infectivity is maintained.
  • phages that had been cyclized with 11 ⁇ M BVSM were incubated with iodoacetoamide or DTT after the cyclization reaction, and then treated with Lys-N and subjected to MS measurement as described above. Since iodoacetoamide binds by reacting with an unreacted SH group in the peptide, if the peptide is not cyclized, it is considered that iodoacetoamide binds and the molecular weight of the peptide increases. On the other hand, when the peptide is cyclized, it is thought that the molecular weight of the peptide does not change because iodoacetoamide cannot bind.
  • Example 17 Addition of compound of formula 22 (qui-I) to peptide on phage Using a phage displaying a model peptide (SEQ ID NO: 13: ACHHHHHHCDYKDDDDK) on the pIII protein, a compound of Formula 9 was added to the peptide on the phage. Thereafter, the cyclized peptide (SEQ ID NO: 14: ACHHHHHHCDY) on the phage is cleaved with a protease (Lys-N) that cleaves at the N-terminal side of lysine, His-tag purification is performed, and molecular weight is analyzed using MS. The qui-I addition was confirmed. Qui-I was synthesized and purified according to the document R. J. Radford et al., Inorg. Chem. 49, 4362-4369 (2010).
  • a phage displaying a model peptide (SEQ ID NO: 13: ACHHHHHHCDYKDDDDK) (not cyclized)
  • 84 ⁇ L of 20% PEG / 2.5M NaCl was added and suspended. After centrifugation (4 ° C., 15000 rpm, 30 minutes), the supernatant was removed. After adding 175 ⁇ L of PBS and suspending the phage, 50 ⁇ L (1 ⁇ 10 11 pfu) of this was mixed with 1 ⁇ L of 2 mM qui-I. The mixture was allowed to stand and reacted at 4 ° C. overnight.
  • FIG. 23a shows the result of a negative control experiment in which qui-I was not reacted.
  • FIG. 23 b shows the result of reacting qui-I.
  • FIG. 24 shows the result of confirming the infectivity to Escherichia coli for the phage introduced with qui-I.
  • FIG. 24a shows the result of phage mocked with 1 ⁇ L of water added instead of qui-I
  • FIG. 24b shows the result of phage after qui-I introduction reaction. It was found that the qui-I-introduced phage maintained the same infectivity as the phage without qui-I.
  • N-Boc-bromoetyl-L-Tyrosine methyl ester 0.22 mmol, NaI 0.40 mmol, and dry acetone 1.5 mL were mixed and reacted by reflux. Identification was performed by 1 H NMR after extraction and purification by silica gel column. As a result of identification, it was judged that N-Boc-Iodoethyl-L-Tyrosine methyl ester was made. The yield was 10%. Subsequently, the methyl group of N-Boc-Iodoethyl-L-Tyrosine ester was deprotected with LiOH. Subsequently, the Boc group was deprotected with TFA. Then, ether precipitation was performed, and it was confirmed by 1 H NMR whether the target unnatural amino acid O-Iodoethyl-L-tyrosine (Chemical Formula 19) was formed.
  • coli PheRS (mu3) (Ala294 ⁇ Gly & Thr251 ⁇ Ala double mutant) 0.25 ⁇ l, 39 ⁇ M L / F transferase (wild type) 0.25 ⁇ l, super 1.0 ⁇ l of pure water and 1.0 ⁇ l of 1 mM unnatural amino acid of Formula 19 were mixed and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The reaction was stopped by mixing TFA, purified using ZipTip, and confirmed by MALDI-TOF-MS for cyclization. As a positive control, caaPhe was prepared in place of the chemical formula 19 natural amino acid, and a mixed solution containing no unnatural amino acid was prepared as a negative control, and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIG. Fig. 26a shows the result of the positive control
  • Fig. 26b shows the result of the negative control
  • Fig. 26c shows the result of adding the unnatural amino acid of Formula 19 and incubating for 1 hour.
  • the peak of the UITF peptide that is the starting peptide disappeared.
  • conjugates provided by the present invention for example, a conjugate in which the functional part is a polypeptide having an Fc region can be used as a cancer therapeutic drug, for example, by making a cyclic peptide tumor-oriented. it can.
  • a conjugate in which the functional part is a polypeptide having an Fc region can be used as a cancer therapeutic drug, for example, by making a cyclic peptide tumor-oriented. it can.
  • bacteriophages having various cyclic peptides as conjugates, screening by phage display becomes possible, and cyclic peptides having desired characteristics (for example, tumor tropism) can be selected from various cyclic peptides.
  • desired characteristics for example, tumor tropism
  • the method of the present invention can easily produce and provide these conjugates.
  • the conjugate can be used even in an environment where facilities and the like are limited, and it can be an effective tool for promoting research on cyclic peptides. Furthermore, according to the novel unnatural amino acid of the present invention, it is possible to provide a cyclic peptide having a thioether bond, and it is possible to provide cyclic peptides having various structures.

Abstract

　本発明の課題は、非天然アミノ酸を含む環状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる結合体、および当該結合体を作製する方法を提供することである。かかる課題は、環状ペプチド分子内のアミノ酸の側鎖と結合し得る非天然アミノ酸を、環状ペプチドのＮ末端に付加することにより、容易に環状ペプチドを作製することにより解決される。かかる作製方法により、種々の環状ペプチドを含む結合体を提供可能である。また本発明の一般式１に記載の新規非天然アミノ酸を、環状ペプチドの作製に使用することが可能である。

Description

環状ペプチドを含む結合体およびその作製方法
　本発明は、非天然アミノ酸の側鎖により環状部分が形成される環状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる結合体、当該結合体を作製する方法、および、新規非天然アミノ酸に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2010-035541号および特願2008-281348号の優先権を請求する。
　タンパク質は種々の生物学的活性を有し、これを利用して多様なタンパク質製剤が開発されている。タンパク質の安定性や受容性を向上させるために、タンパク質の活性部位を包含する比較的短いペプチドや、活性部位に似た三次元構造をとる合成分子などの研究が進められており、その一つとして環状ペプチドが注目されている。
　環状ペプチドは、環化によって構造的な拘束性が得られるとともに、多様な生物学的活性を示すため有用であると考えられている。環状ペプチドには、それ自身が抗腫瘍性などの性質を持つものや、標的物質に対して特異的に結合する性質を持つものなどがあり、種々の用途に用いられることが期待される。
　環状ペプチドの応用として、腫瘍指向性ペプチドベクターが開示されている（特許文献１）。腫瘍指向性ペプチドベクターは、腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチドを数種同定したことに基づくものであり、環状ペプチドと、抗腫瘍作用等の薬理作用を有するような物質と結合させて使用することが開示されている。特許文献１に記載の環状ペプチドは、両端にシステインを有するペプチドであり、ジスルフィド結合により環状をなしていると考えられる。
　もう一つの応用として、環状ペプチドを免疫グロブリンFc領域に結合させた結合体の利用が開示されている（特許文献２）。特許文献２の結合体は、Fc領域の特定のアミノ酸残基の側鎖を通じて、環状ペプチド等を共有結合させて作製される。環状ペプチドの合成についての具体的な開示はない。
　環状ペプチドの合成方法の一つとして、RNA触媒およびin vitro翻訳系（リボソーム系）を応用した、チオエーテル結合を持たせた環状ペプチドの作製および環状ペプチドライブラリの作製が開示されている（非特許文献１）。in vitro翻訳系（リボソーム系）を応用した環状ペプチドの作製は、取り扱いが難しい。また、非特許文献１の環状ペプチドは、ポリペプチド鎖の主鎖骨格中にメチル基が導入されたものであり、生体に対する毒性が心配されるなどの問題がある。
　環状ペプチドは限られた構造のものしか知られておらず、多様な環状ペプチドを簡便に利用可能とするための技術が望まれている。
　特定の機能を有する環状ペプチドをスクリーニングするため、環状ペプチドを細胞表面に提示するファージが市販されている（Ph.D.TM-C7C　Phage　Display　Peptide　Library：New England Biolabs社）。かかる市販品では、２つのシステインを有する７アミノ酸のペプチドがファージに提示されており、システインの側鎖SH基がジスルフィド結合することにより環状ペプチドが形成されている。また非特許文献２には、リンカー化合物により二環性の環状ペプチドを有するファージを作製したことが開示されている。
　多様な環状ペプチドを有するファージが簡便に利用可能となれば、環状ペプチドの研究や応用を進めることができると期待される。
特開２００５－２１０２１号公報 特表２００９－５０４１６４号公報
Kawakami, T.; Murakami, H.; Suga, H., Chem Biol 2008, 15, (1), 32-42. Heinis C, Rutherford T, Freund S, Winter G.,　Nat Chem Biol. 2009 Jul;5(7):502-7.
　本発明の課題は、非天然アミノ酸の側鎖により環状部分が形成される環状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる結合体、および当該結合体を作製する方法を提供することである。
　本願発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、非天然の側鎖を有する非天然アミノ酸をペプチド内に導入すること（例えば、非天然アミノ酸自体をペプチド内に導入すること、もしくは非天然の構造を有する化合物をペプチドに付加すること）により、非天然アミノ酸の側鎖がペプチド分子内のアミノ酸の側鎖と容易に環状ペプチドを作製し得ることに着目し、非天然アミノ酸の側鎖により環状部分が形成される環状ペプチドを含む結合体を作製し得ることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下よりなる。
１．非天然アミノ酸の側鎖により環状部分が形成される環状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる結合体。
２．前記機能部がファージであり、環状ペプチドがファージのコートタンパク質に結合してなる、前項１に記載の結合体。
３．非天然アミノ酸の側鎖により形成される環状部分が、以下から選択される構造を有する、前項１または２に記載の結合体：
（Ａ）以下の化学式９にて示される非天然アミノ酸の側鎖と、金属とが配位してなる構造；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （Ｂ）以下の一般式８にて示される構造；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （一般式８中、Y1、Y2、Y3は各々独立して、炭素数１～５のアルキレン基から選択される。）
４．以下の工程を含む、前項１～３のいずれか１に記載の結合体を作製する方法：
（１）SH基を有するアミノ酸を含むペプチドがコートタンパク質に結合してなるファージと、以下の一般式１０もしくは一般式１１に示される化合物を混合して、０～８℃、0.5～１６時間反応させる工程；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （一般式１０中、R3はハロゲン原子である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （一般式１１中、X1およびX2は各々独立して、炭素数が１～５のハロアルキル基、炭素数が２～５の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択され、Y3は炭素数１～５のアルキレン基からなる群から選択される。）
（２）環状ペプチドを有するファージを分離する工程。
５．以下の一般式１０もしくは一般式１１に示される化合物を含む、前項１～３のいずれか１に記載の結合体を作製するための試薬キット：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （一般式１０中、R3はハロゲン原子である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （一般式１１中、X1およびX2は各々独立して、炭素数が１～５のハロアルキル基、炭素数が２～５の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択され、Y3は炭素数１～５のアルキレン基からなる群から選択される。）
６．以下の工程を含む、標的タンパク質に結合し得る環状ペプチドをスクリーニングする方法：
（ｉ）前項１～３のいずれか１に記載の結合体と、標的タンパク質を接触させる工程：
（ｉｉ）標的タンパク質に結合した結合体を選択する工程。
７．前記機能部がFc領域を含むポリペプチドである、前項１に記載の結合体。
８．非天然アミノ酸の側鎖により形成される環状部分が、以下の一般式１２に示される構造を有する、前項７に記載の結合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、R4は、炭素数１～５のアルキレン基、炭素数１～５のアルキレン基－フェニレン基－アミド結合－炭素数１～５のアルキレン基、および炭素数１～５のアルキレン基－フェニレン基－エーテル結合－炭素数１～５のアルキレン基から選択される。）
９．Ｎ末端に非天然アミノ酸を有する直鎖状ペプチドと、機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、前項７または８に記載の結合体の中間体。
１０．Ｎ末端に非天然アミノ酸を結合させるために、塩基性アミノ酸をＮ末端に有する直鎖状ペプチドと、機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、前項９に記載の中間体の前駆体。
１１．以下を含む混合溶液を用いて、前項７または８に記載の結合体を作製する方法：
（ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を有さない直鎖状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、前記結合体の前駆体、
（ｂ）前駆体分子内のアミノ酸の側鎖と結合可能な官能基を側鎖に有する非天然アミノ酸、
（ｃ）tRNA、
（ｄ）アミノアシルtRNA合成酵素、
（ｅ）ロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素。
１２． Fc領域を有するポリペプチドである機能部をコードするポリヌクレオチドと、前記直鎖状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが導入された細胞を培養することにより、前記前駆体が作製される、前項１１に記載の作製方法。
１３．下記一般式（１）により表される非天然アミノ酸：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  （式中Rは、NR1-CO-R2であり、
　R1は水素原子、又は炭素数が１～６の直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基から選択され、
　R2は炭素数が１～３のアルキル基、炭素数が１～３のハロアルキル基、または炭素数が２～４の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択される。）
１４．R1は水素原子であり、R2は炭素数が１もしくは２のハロアルキル基または炭素数が２もしくは３のアルケニル基である、前項１３に記載の非天然アミノ酸。
　本発明の結合体によれば、種々の構造の環状ペプチドを有する結合体を提供することができ、環状ペプチドの特性を有効に活用することができる。また本発明の方法によれば、結合体を簡便に作製することができ、規模や設備の限られた環境であっても、結合体を作製して利用することが可能である。機能部がファージである結合体によれば、所望の機能を有する環状ペプチドをスクリーニングするシステムを簡便に得ることができ、目的に応じて多様な環状ペプチドを選択することができると考えられる。
　また本発明の新規非天然アミノ酸は、システインのSH基と結合し得る官能基を有しており、環状ペプチドの作製に用いることができる。
化学式２の非天然アミノ酸を用いた環状ペプチド作製を示す図である。（実施例１） 化学式３の非天然アミノ酸を用いた環状ペプチド作製を示す図である。（実施例２） 配列番号１～５（図３ａ～ｅに対応）のペプチドと、化学式２の非天然アミノ酸とを用いて、環状ペプチドを作製した結果を示す図である。（実施例１） 配列番号６のペプチドと、化学式２の非天然アミノ酸とを用いて、環状ペプチドを作製した結果を示す図である。（実施例２） 配列番号２のペプチドに、化学式３の非天然アミノ酸を導入した結果を示す図である。（実施例３） 化学式４の非天然アミノ酸を、Fc領域の結合したペプチドのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例４） 化学式２の化合物を合成した結果を示す図である。（実施例５） 化学式２の化合物を合成した結果を示す図である。（実施例５） 化学式２の非天然アミノ酸を、Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFPのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例６） 化学式２の非天然アミノ酸を、Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFPのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例６） 化学式２の非天然アミノ酸を、Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFPのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例６） 化学式２の非天然アミノ酸を、ペプチドＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例７） 化学式５の化合物を合成した結果を示す図である。（実施例８） 化学式６の化合物を合成した結果を示す図である。（実施例９） 化学式５の非天然アミノ酸を、ペプチドのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例１０） 化学式２または化学式６の非天然アミノ酸を、ペプチドＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例１１） 化学式２または化学式６の非天然アミノ酸によるペプチドの環化を、iodoacetoamideを用いて確認した結果を示す図である。（実施例１１） 化学式４の非天然アミノ酸を、Fc領域の結合したペプチドのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例１２） ペプチドＮ末端に導入可能な３種の非天然アミノ酸の構造式を示す図である。（実施例１３） クロロアラニンをペプチドＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例１３） 化学式７の化合物を合成した結果を示す図である。（実施例１４） 化学式７の非天然アミノ酸を、ペプチドのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例１５） 化学式９の化合物を、ファージ上のペプチドに導入した結果を示す図である。（実施例１７） 化学式９の化合物を導入したファージの大腸菌への感染能を確認した写真である。（実施例１７） 化学式１９の化合物を合成した結果を示す図である。（実施例１８） 化学式１９の非天然アミノ酸を、ペプチドのＮ末端に導入した結果を示す図である。（実施例１９）
（結合体）
　本発明は、非天然アミノ酸の側鎖により環状部分が形成される環状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる結合体に関する。
　本発明において、非天然アミノ酸の側鎖により環状部分が形成される環状ペプチドは、非天然アミノ酸がペプチド内に存在し、当該非天然アミノ酸の側鎖がペプチド内の他の側鎖等と結合することにより環状部分を形成するものであればよい。本発明の環状ペプチドにおける非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸一分子として存在してペプチドに導入されたものであってもよいし、非天然の構造を有する化合物がペプチドに付加された結果、非天然アミノ酸を生じたものであってもよい。すなわち本発明における環状ペプチドは、非天然アミノ酸と環状部分を含むペプチドであればいかなるものであってもよい。環状ペプチドは、ペプチド全体で環状部分を形成しているものであっても、ペプチドの一部が環状部分を形成しているものであってもよい。また環状ペプチドは、環状部分が単数であっても複数であってもよいが、好ましくは単数である。すなわち本発明における環状ペプチドは単環であることが好ましい。環状部分は、非天然アミノ酸の側鎖と、他の非天然アミノ酸もしくは天然アミノ酸の側鎖が結合することにより形成される。環状ペプチドのアミノ酸残基数は特に制限されないが、２～１００個が好ましく、４～５０個がより好ましく、６～１７個が特に好ましく、６～１６個がさらに好ましい。
　本発明の結合体に含まれる環状ペプチドは、非天然アミノ酸の側鎖により形成される結合部分が、以下から選択される構造であることが好ましい。
（Ａ）以下の化学式９にて示される非天然アミノ酸の側鎖と、金属とが配位してなる構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （Ｂ）以下の一般式８にて示される構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （一般式８中、Y1、Y2、Y3は各々独立して、炭素数１～５のアルキレン基から選択される。好ましくは、Y1、Y2、Y3は各々独立して、炭素数１～２のアルキレン基であり、より好ましくはY1およびY2はエチレン基であり、Y3はメチレン基である。）
　上記（Ａ）の構造における金属とは、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+等の二価の金属イオンが例示される。
　上記（Ａ）の構造では、ペプチド内に化学式９の非天然アミノ酸の側鎖が少なくとも１つ存在すればよく、好ましくは２つ存在する。ペプチド内に化学式９の非天然アミノ酸の側鎖が（ｉ）１つ存在する場合と、（ii）２つ存在する場合の構造式について以下の化学式１３と１４に例示する。以下の構造式においてＭは、金属を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （ｉ）非天然アミノ酸の側鎖が１つ存在する場合には、非天然アミノ酸の側鎖が一方の金属配位子として機能し、もう一方の金属配位子として、例えば天然アミノ酸であるヒスチジンの側鎖が機能することにより、環状をなすことができる。（ii）非天然アミノ酸の側鎖が２つ存在する場合には、２つの非天然アミノ酸の側鎖が金属配位子として機能することにより環状をなすことができると考えられる（Inorg. Chem. 49, 4362-4369 (2010)）。
　本発明の結合体に含まれる環状ペプチドの別の態様として、非天然アミノ酸の側鎖により形成される結合部分が、以下の一般式１２で示される構造であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中、R4は、炭素数１～５のアルキレン基、炭素数１～５のアルキレン基－フェニレン基－アミド結合（NHCO）－炭素数１～５のアルキレン基、および炭素数１～５のアルキレン基－フェニレン基－エーテル結合（O）－炭素数１～５のアルキレン基から選択される。）
　好ましくは、R4は以下の化学式１５～１８から選択される構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　本発明の環状ペプチドにおいて、非天然アミノ酸はNexta法（特開2009-106268号公報参照）により、ペプチドのＮ末端に付加されてもよい。環状ペプチドにおいて、非天然アミノ酸が付加されるＮ末端には、ロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素（以下、「L/F転移酵素」とも称する）が作用し得るアミノ酸、好ましくは塩基性のアミノ酸（例えばリジンもしくはアルギニン）が存在している必要がある。
　また本発明の環状ペプチドにおける非天然アミノ酸は、環状ペプチド分子内の他のアミノ酸の側鎖と結合可能な側鎖を有する非天然アミノ酸である。非天然アミノ酸の側鎖と環状ペプチド分子内の他のアミノ酸の側鎖との結合は、ジスルフィド結合、アミド結合、エステル結合、チオエーテル結合などが例示されるが、チオエーテル結合が好ましい。チオエーテル結合による環状ペプチドでは、非天然アミノ酸が環状ペプチド分子内のシステインのSH基と反応して結合する。かかる非天然アミノ酸としては、下記一般式（１）で示される非天然アミノ酸や、下記化学式３で示される非天然アミノ酸、図１に記載の非天然アミノ酸が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （一般式（１）中Rは、NR1-CO-R2またはO-R2であり、
　R1は水素原子、又は炭素数が１～６の直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基から選択され、
　R2は炭素数が１～３のアルキル基、炭素数が１～３のハロアルキル基、または炭素数が２～４の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択される。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　上記非天然アミノ酸は、下記化学式２、一般式２０、もしくは化学式６で示される非天然アミノ酸が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （式中、R5は、BrまたはIである。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　一般式（１）の非天然アミノ酸の側鎖は、システインのSH基と結合可能なものである。一般式（１）の非天然アミノ酸を用いてNexta法を行った場合、当該非天然アミノ酸がＮ末端に結合せずに、直鎖状ペプチド内のSH基にのみ結合する反応（副反応）が見られる場合がある。一般式（１）中、RがO-R2であり、R2が１つのハロゲン原子で置換された炭素数１～３のハロアルキル基である非天然アミノ酸（好ましくはR2が１－ブロモエチル基、もしくは１－ヨードエチル基である非天然アミノ酸）を用いた場合は、かかる副反応が見られないため、より有効にペプチドの環化を行うことが可能である。
　具体的には環状ペプチドは、配列番号１～６に記載されるアミノ酸配列のＮ末端に化学式２で示される非天然アミノ酸が結合したものが例示される。これらのペプチドにおいて、Ｎ末端の化学式２で示される非天然アミノ酸のハロアルキル基と、システインのSH基とがＳＮ２反応してチオエーテル結合が形成され、環状部分が形成される（図１）。また、具体的な環状ペプチドとして、配列番号１～６に記載されるアミノ酸配列のＮ末端に化学式３の非天然アミノ酸が結合したものが例示される。これらのペプチドでは過酸化水素などの存在下で、フェニルセレン(PhSe)部分が脱離して二重結合となり、H2N-CH(=CH2)-COOHが形成され、システインのSH基とマイケル型で付加してチオエーテル結合が形成される（図２）。
　本発明の結合体において環状ペプチドとペプチド結合により結合している機能部は、何らかの機能を有するものであればいかなるものであってもよく、例えばタンパク質（ペプチドを含む）、アミド基を含む低分子化合物（フッ素含有非天然アミノ酸を含む）、細胞、細菌、ウイルス（バクテリオファージを含む）等が例示される。
　タンパク質はいかなるものであってもよいが、抗体由来のFc領域を含むポリペプチド、蛍光タンパク質（例えばGFP）などが好ましい。機能部がタンパク質である場合は、当該タンパク質のＮ末端と環状ペプチドのC末端とが、ペプチド結合により結合する。機能部が細胞、細菌、ウイルスなどの場合は、細胞、細菌、ウイルスの内部もしくは膜上に存在するタンパク質と、環状ペプチドとが結合している態様が好ましい。機能部が低分子化合物である場合は、低分子化合物内のアミノ基と、環状ペプチドのC末端のカルボキシル基が結合することが好ましい。
　機能部が、抗体のFc領域を含むポリペプチド場合は、Fc領域は、公知のFc領域、今後取得されるFc領域、及びこれらのFc領域のバリアント分子を包含する。Fc領域には、単量体又は多量体形態のものが含まれる。好ましくはFc領域は、ヒト由来のFc領域である。Fc領域は、免疫グロブリンの何れでもあり得るが、例えばIgG1やIgG2、IgG4が例示される。Fc領域のバリアント分子は、Fc領域のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、誘導されたものであり、補体との相互作用など、Fc領域の性質のうち、所望のFc領域機能を保持するものであればよい。本発明におけるFc領域を含むポリペプチドの具体例として、GenBank accession# X70421のものが例示される。
　機能部がウイルスである場合は、バクテリオファージであることが好ましい。バクテリオファージとしては、ファージディスプレイ法に一般的に用いられる繊維状ファージ（ｆ１、ｆｄ、およびＭ１３ファージ）、他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージとラムドイドファージ）などが挙げられる。繊維状ファージにおいては、典型的には、直鎖状ペプチドをコートタンパク質pIIIやpVIIIに融合させることが好ましい。例えば、Ｍ１３ファージの場合は直鎖状ペプチドをコードする遺伝子を、コートタンパク質をコードする遺伝子に連結する。このファージの遺伝子を大腸菌に感染させて形質転換をし、発現させることによりファージライブラリーを作製する。本発明において機能部がバクテリオファージである場合、本発明の結合体は、大腸菌等の宿主細胞に対して感染能を保持しているものである。
　本発明は、Ｎ末端に非天然アミノ酸を有する直鎖状ペプチドと、機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、結合体の中間体にも及ぶ。「Ｎ末端に非天然アミノ酸を有する直鎖状ペプチド」とは、Nexta法により非天然アミノ酸が結合された後のペプチドであって、環状部分が形成される前のペプチドを意味する。
（結合体の作製方法）
　環状ペプチドが上記（Ａ）および（Ｂ）の構造を含む本発明の結合体は、以下の工程を含む作製方法により作製することができる。なお、機能部がファージである結合体を例示して説明する。
（１）SH基を有するアミノ酸（例えばシステイン）を含む直鎖状ペプチドを結合してなるファージと、以下の一般式１０もしくは一般式１１に示される化合物を混合して、０～８０℃（好ましくは０～１５℃、より好ましくは４℃）、0.5～１６時間（好ましくは、１０～１４時間）反応させる工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （式中、R3はハロゲン原子であり、好ましくはヨウ素原子である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式中X1およびX2は、炭素数が１～５のハロアルキル基、炭素数が２～５の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択され、Y3は炭素数１～５のアルキレン基からなる群から選択される。好ましくはX1およびX2はビニル基（エテニル基）であり、Y3はメチレン基である。）
（２）環状ペプチドを結合してなるファージを分離する工程。
　SH基を有するアミノ酸（例えばシステイン（Cys））を含む直鎖状ペプチドを結合してなるファージは、直鎖状ペプチドを有するファージを自体公知の手法により作製してもよいし、直鎖状ペプチドを有するファージを購入、または直鎖状ペプチドをコードするファージミドベクターを購入してもよい。また、市販のジスルフィド結合による環化ペプチドを有するファージを用いて環化ペプチドを還元することにより得てもよい。
　一般式１０もしくは一般式１１の化合物は、アミノ酸のSH基に結合することにより、前述の（Ａ）もしくは（Ｂ）の構造を形成し、ファージ上の直鎖状ペプチドを環化して環状ペプチドとする。一般式１０の化合物２分子を直鎖状ペプチドに結合させる場合には、直鎖状ペプチド内に、SH基を有するアミノ酸が２分子存在している必要がある。また一般式１１の化合物により環状ペプチドを作製する場合には、X1およびX2の両方がSH基と結合する必要があるため、直鎖状ペプチド内にSH基を有するアミノ酸が２分子存在している必要がある。SH基を有するアミノ酸２分子間は、隣接していてもよいが、SH基を有するアミノ酸２分子の間に、好ましくは２～１００個、より好ましくは５個～１２個のアミノ酸が存在する。
　工程（１）において、ファージと一般式１０もしくは１１の化合物との反応の溶媒は、ｐＨ３～１１（好ましくはｐＨ６～９）の緩衝液であればよく、例えば、HEPES、リン酸またはPBS、Tris、PIPES等が例示される。
　工程（１）において、溶媒中のファージと一般式１０もしくは１１の化合物は、ファージ1×1011　pfu/50μLに対して、一般式１０もしくは１１の化合物が1pmol～1μmol、好ましくは0.1nmol～50nmol、より好ましくは0.2nmol～22nmol存在するような割合で混合する。
　より具体的には、本発明の結合体を作製するためには、実施例１６および１７に記載の方法を使用することが可能である。
　本発明では、工程（１）にて記載するように、緩やかな条件で一般式１０もしくは１１の化合物の付加反応を進行させることにより、機能部であるファージが感染能を保持したまま、直鎖状ペプチドを環化させることが可能となり、本発明の結合体の作製が可能である。本発明の方法によると、機能部であるファージにおいて感染能に必須と思われるコートタンパク質の構造に影響を与えることなく、ファージ上に提示されたペプチドを環化可能と考えられる。
　また本発明は、（ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチド、（ｂ）直鎖状ペプチド分子内のアミノ酸の側鎖と結合可能な官能基を側鎖に有する非天然アミノ酸、（ｃ）tRNA、（ｄ）アミノアシルtRNA合成酵素、（ｅ）ロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素を含む混合溶液を用いて、ペプチドを環化する方法にも及ぶ。本発明の方法において上記混合溶液を用いることにより、まずＮ末端に（ｂ）非天然アミノ酸を有する直鎖状ペプチドが作製される。
　本願発明の方法は、（１）（ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチドを提供する工程、（２）（ａ）～（ｅ）を含む前記混合溶液を用いることにより、Ｎ末端に非天然アミノ酸が付加された直鎖状ペプチドを作製する工程（Nexta法）、（３）工程（２）により作製された直鎖状ペプチドおいて環状部分を形成する工程を含む。
　工程（１）における「（ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチド」は、ペプチド単体で存在していてもよいし、本発明の結合体の前駆体内に存在してもよい。本発明の結合体の前駆体とは、Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチドが機能部とペプチド結合してなる結合体を意味する。前駆体は、Ｎ末端に非天然アミノ酸を含む直鎖状ペプチドを有する中間体の前の段階のものを意味し、中間体とは区別されるものである。（ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチドが、前記前駆体内に存在する場合は、本発明のペプチドを環化する方法は、本発明の結合体を作製する方法として使用することができる。
　（ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチドは、例えば種々の生物の生体内から単離して得ることができる。また、遺伝子工学的手法や有機合成などの自体公知の手法を用いて、産生することも可能である。
　（ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチドが、前記前駆体内に存在する場合、前駆体は、例えば種々の生物の生体内に発現するものを単離して得ることができる。生物の生体内に発現する前駆体は、遺伝子工学的手法により、前記前駆体をコードする遺伝子を導入させて発現させることにより、得られたものであってもよい。機能部がFc領域を含むポリペプチドやGFP等のタンパク質である場合は、哺乳動物の細胞などに、Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドとFc領域をコードするオリゴヌクレオチドとを融合したものを導入して、培養を行い発現させることにより、前駆体を得ることができる。この際、Ｎ末端に非天然アミノ酸を含まない直鎖状ペプチドとFc領域とが結合してなる前駆体を哺乳動物の細胞外に分泌させるために、前駆体をコードするオリゴヌクレオチドにシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを融合させてもよい。具体的には、実施例に記載の手法を用いればよい。
　なお本発明は、Ｎ末端に塩基性アミノ酸を有する直鎖状ペプチドと、機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、前記前駆体にも及ぶ。当該前駆体がＮ末端に塩基性アミノ酸を有することにより、Nexta法により非天然アミノ酸を塩基性アミノ酸に結合させることが可能となる。また本発明の前駆体は、上記の遺伝子工学的手法により作製されたものである。本発明の前駆体を遺伝子工学的手法により作製する方法は、上述の直鎖状ペプチドとFc領域とが結合してなる前駆体を例示して記載したとおりであるが、前駆体をコードするオリゴヌクレオチドを、前駆体発現用細胞に導入して、培養等を行うことにより、前駆体を作製する。前駆体をコードするオリゴヌクレオチドにはシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを融合させて置くことが好ましい。また前駆体発現細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞等を用いればよい。
　（ｂ）非天然アミノ酸は、ペプチド分子内の他のアミノ酸の側鎖と結合しうる側鎖を有するものであり、他のアミノ酸の側鎖と、触媒等を必要とせず、溶媒中で接触等するだけで、または過酸化水素水のような開始剤を存在させるだけで、結合可能であるような側鎖を有するものである。非天然アミノ酸は、例えば一般式（１）または化学式３に記載のものを使用することができ、好ましくは化学式２に記載のものを使用することができる。
　（ｃ）tRNAとは、アミノアシルtRNA合成酵素によりアミノアシル化されることが公知であるtRNA、ならびに公知tRNA以外には、本発明にて使用するアミノアシルtRNA合成酵素によるアミノアシル化される機能を有し、かつ本発明にて使用するL/F転移酵素により、当該非天然アミノアシルtRNAに結合しているアミノアシル基がペプチドに転移される機能を有するtRNAを含む。tRNAの例としては、tRNAPheまたはtRNALeuなどの天然tRNAが含まれる。大腸菌由来フェニルアラニルtRNA合成酵素変異体（Ala294→Gly）を用いる場合は、tRNAPheを用いることが好ましい。本発明におけるtRNAは、自体公知の方法により合成して、もしくは市販のものを購入して入手することができる（例えば、天然の大腸菌由来フェニルアラニンtRNA、および、天然の大腸菌由来フェニルアラニンtRNAを含むtRNA粗精製物は、SIGMA社より入手可能）。
　アミノアシルtRNA合成酵素（以下、「aaRS」と称することもある）とは、一般的にはリボソームでの遺伝暗号の翻訳における基質となるアミノアシルtRNAの合成を担う酵素である。aaRSはタンパク質を合成するのに使われる20種のアミノ酸に対応した20種類が存在し、例えば、リジン（Lys）に対応するaaRSはリジルtRNA合成酵素と呼ばれる。本発明において用いられるアミノアシルtRNA合成酵素としては、導入する天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸に対して基質特異性を有する野生型のアミノアシルtRNA合成酵素、ならびに、本来のアミノ酸に対する特異性に比べて非天然アミノ酸誘導体等に対して特異性が高められたアミノアシルtRNA合成酵素の変異体を用いることができる。好ましくは、大腸菌由来フェニルアラニルtRNA合成酵素（E. coli PheRS）変異体（例えば、Ala294→Gly変異体、Ala356→Trp変異体、Thr251→Ala変異体、もしくは、Gly318→Trp変異体のいずれか、またはこれらの多重変異体）（Chembiochem, 2002, 02-03, 235-237、Taki, Chembiochem, 2009 , 10, 2460-2464.）あるいは、大腸菌由来ロイシルtRNA合成酵素（E. coli LeuRS）変異体（例えば、Thr247→Val変異体、Thr248→Val変異体、Thr252→Tyr変異体、もしくは、His537→Gly変異体のいずれか、またはこれらの多重変異体）（Tang Y, Wang P, Van Deventer JA, Link AJ, Tirrell DA., Chembiochem. 2009 Sep 4;10(13):2188-90、Yan Ling Joy Pang and Susan A. Martinis, Biochemistry 2009, 48, 8958-8964、Wu N, Deiters A, Cropp TA, King D, Schultz PG., J Am Chem Soc. 2004 Nov 10;126(44):14306-7、Yuxin Zhai and Susan A. Martinis, Biochemistry, 2005, 44, 15437-15443） を用いることができる。
　本発明におけるアミノアシルtRNA合成酵素は、自体公知の方法により合成して、もしくは市販のものを購入して入手することができる（例えば、天然のアミノアシルtRNA合成酵素はSIGMA社から入手可能）。
　ロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素（L/F転移酵素）は大腸菌由来であり、tRNAに結合しているフェニルアラニンや、ロイシン、メチオニンなどの疎水性アミノ酸を、Ｎ末端にリジンやアルギニンを有するタンパク質もしくはペプチドに転移させる反応を触媒する酵素である。L/F転移酵素は、自体公知の方法（例えば遺伝子工学的手法）により合成して入手することができる（M. Taki, et al., Chembiochem, 2008, 9, 719-722）。
　本発明の方法において用いられる混合溶液中には、反応に好適な緩衝液、塩類などを適宜存在させることができる。緩衝液としては、例えばHepes緩衝液、Tris-塩酸などが挙げられる。具体的には、MgCl2、Spermidine、Hepes緩衝液を含む溶液と、ATPを含む溶液を混合したものを用いることができる。
　温度およびpHなどの反応条件は、使用する酵素などに応じて任意の条件を選択できる。反応温度は、好ましくは約0℃～50℃、さらに好ましくは約4℃～37℃である。反応pHは、好ましくは約6～9、さらに好ましくは約7～8である。反応時間は、好ましくは約10分以上であり、より好ましくは約15分～300分、最も好ましくは約60分～180分である。
　工程（２）により作製された、Ｎ末端に非天然アミノ酸が付加された直鎖状ペプチドにおいて環状部分を形成する工程（３）は、工程（２）と同時に進行する場合と工程（２）と別の工程である場合を含む。例えば工程（２）においてハロアルキル基を持つ非天然アミノ酸を（ｂ）非天然アミノ酸として用いた場合は、当該非天然アミノ酸が導入されると同時に環化反応が進むものと考えられ、工程（２）と工程（３）は区別されず、そのままインキュベーションを行えばよい。工程（２）と工程（３）が区別される場合は、Ｎ末端に非天然アミノ酸が付加された直鎖状ペプチドを一旦精製して、もしくは精製せずに、適当な溶媒中や所望の物質を添加してインキュベーションすることにより行ってもよい。例えば、過酸化水素水等の開始剤を、工程（２）の終了後に添加することにより工程（３）を行うことが可能である。
　開始剤とは、環化反応を開始させるための物質であって、反応を触媒する機能を有する薬剤とは区別される。開始剤の具体的な例としては、過酸化水素水などが例示される。
（新規非天然アミノ酸）
　本発明はさらに、下記一般式（１）により表される新規非天然アミノ酸にも及ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　一般式（１）中Rは、NR1-CO-R2であり、
　R1は水素原子、又は炭素数が１～６の直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基から選択され、
　R2は炭素数が１～３のアルキル基、炭素数が１～３のハロアルキル基、または炭素数が２～４の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択される。
　なお、一般式（１）中、好ましくはRはNR1-CO-R2であり、R1は水素原子、又は炭素数が１～６の直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基であり、R2は炭素数が１～３のアルキル基、炭素数が１～３のハロアルキル基、炭素数が２～４の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基である。さらに好ましくは、一般式（１）中RはNR1-CO-R2であり、R1は水素原子であり、R2は炭素数が１もしくは２のハロアルキル基または炭素数が２もしくは３のアルケニル基である。
　ここで、脂肪族炭化水素基とは、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基を包含する。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基などが例示される。ハロアルキル基とは、少なくとも１個のハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）で置換されたアルキル基を意味し、例えば、ブロモメチル基、２－ブロモエチル基、クロロエチル基、ジフルオロエチル基などが例示される。アルケニル基とは、炭素数２以上のアルキル基に１個以上の二重結合などの不飽和基を有するものが挙げられ、例えば、ビニル基、アリル基、１－プロペニル基、２－ブテニル基などが例示される。
　好ましくは、一般式（１）において、R1は水素原子であり、R2が炭素数が１もしくは２のハロアルキル基または炭素数が２もしくは３のアルケニル基である。
　より好ましくは、一般式（１）においてR1は水素原子であり、R2はクロロアルキル基、ブロモアルキル基、またはビニル基であり、下記化学式２、一般式２０、または化学式６にて示される非天然アミノ酸である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （式中、R5は、BrまたはIである。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　かかる新規非天然アミノ酸におけるR2にて表される官能基は、天然アミノ酸システインのSH基とＳＮ２反応またはマイケル型付加反応により結合することが可能であり、上記環状ペプチドの作製に使用することができる。
　上記一般式（１）に記載の化合物は、Longhu Zhou et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2006, 14, 7862-7874またはShoji Nagaoka et al., Synthetic Communications,35:2529-2534,2005を参考にして作製することができる。一例として化学式２，５，６の製造方法を、下記実施例５，８，９に記載する。
（結合体を作製するための試薬キット）
　また、本発明は、上記の一般式１０もしくは一般式１１に示される化合物を含む、結合体を作製するための試薬キットにも及ぶ。
　さらに、本発明は、上記新規非天然アミノ酸を有するペプチド、ならびに、新規非天然アミノ酸、アミノアシルtRNA合成酵素、およびロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素を含む、環状ペプチドもしくは環状ペプチドを有する結合体を作製するための試薬キットにも及ぶ。
（結合体を用いたスクリーニング方法）
　本発明は、以下の工程を含む、標的タンパク質に結合し得る環状ペプチドをスクリーニングする方法にも及ぶ。
（ｉ）本発明の結合体（好ましくは機能部がファージである結合体）と、標的タンパク質を接触させる工程：
（ｉｉ）標的タンパク質に結合した結合体を選択する工程。
　環状ペプチドが上記（Ａ）の構造を有する場合、環状ペプチド自体が標的タンパク質に指向性を示すだけではなく、配位している金属が標的タンパク質への親和性を有することが予測される。本発明のスクリーニング方法によって選択される結合体が提示する環状ペプチドは、極めて有効に標的タンパク質に結合し得るものと考えられる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）ペプチドＮ末端への非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　0.025 O.D./μl E.coli tRNAPhe 2μl(0.05 O.D.;77 pmol)、5×aat緩衝液（アミノアシル化緩衝液;50mM MgCl2, 5mM Spermidine, 250mM Hepes buffer(pH7.6), 100mM KCl） 2μl、40mM ATP(Na)-KOH(pH7.0) 0.36μl、350 pmol/μl 下記の各種ペプチド 1μl(0.35nmol)、化学式２にて示される新規非天然アミノ酸 2 nmol、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体)0.75μl(15 pmol)、7.6μM L/F転移酵素(野生型) 2μl(15 pmol)を混合した混合溶液（超純水で全量10μlに調節）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。ZipTipを用いて精製し、TOF-MSにより環状ペプチドが作製されたか否かを測定した。
　上記反応に用いたペプチドは以下のとおりである。
・Arg-Val-Cys-Aka　（配列番号１）
・Arg-Pro-Cys-Aka　（配列番号２）
・Arg-Gly-Cys-Arg-Ala-Phe-Ile　（配列番号３）
・Arg-Gly-Asp-Cys-Gly-Gly-Ser-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Bacd（配列番号４）
・Arg-Gly-Asp-Cys-Gly-Gly-Ser-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（配列番号５）
　なお、配列中のAkaは、β-[アクリジン-9(10H)-オン-2-イル]-L-アラニン（β-[acridine-9(10H)-on-2-yl]-L-alanin）であり、Bacdは、β-[ベンゾ[b]アクリジン-12(5H)-オン-2-イル]-L-アラニン（β-[benzo[b]acridin-12(5H)-on-2-yl]-L-alanine）（渡辺化学工業（株）から、Boc保護されたもの、Fmoc保護されたものが市販されている（＃M02045、M02046など）（ペプチド固相合成用））である。これらは、蛍光性アミノ酸であり、Akaはブルーレーザーで、Bacdは可視光レーザーで励起可能である。
　結果を、図３に示す。図３ａ～ｅはそれぞれ、配列番号１～５のペプチドを環化した結果を示す。「環化前」は、非天然アミノ酸が導入される前のものであり、「環化後」は非天然アミノ酸が導入された後のものを示す。例えば、図３ｄの下段では、環化前ペプチドの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1957.75に相当するピークがみられ、上段では環化後ペプチドの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=2159.83に相当するピークがみられた。また図３ｅの下段では、環化前ペプチドの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1643.65に相当するピークがみられ、上段では環化後ペプチドの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1845.72に相当するピークがみられた。なお、図３ｅにおける1866.7のピークは測定時の内部標準として用いたものである。
　上記反応により非天然アミノ酸が導入されたペプチドが作製され、環化ペプチドを作製することができた。なお、非天然アミノ酸が導入されただけで環化されていない分子イオンピークはマススペクトルでは観察されておらず、非天然アミノ酸導入とほぼ同時に素早く環化が進行したものと考えられた。
（実施例２）Urinary Trypsin Inhibitor Fragment（以後「UITF」と称する）ペプチドＮ末端への非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　0.025 O.D./μl E.coli tRNAPhe 2μl(0.05 O.D.;77 pmol)、5×aat緩衝液（アミノアシル化緩衝液;50mM MgCl2, 5mM Spermidine, 250mM Hepes buffer(pH7.6), 100mM KCl） 2μl、40mM ATP(Na)-KOH(pH7.0) 0.36μl、350 pmol/μl UITFペプチド（Arg-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Phe-Ile；配列番号６） 1μl(0.35nmol)、化学式２にて示される新規非天然アミノ酸 2 nmol、20μM E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体)0.75μl(15 pmol)、7.6μM L/F転移酵素(野生型) 2μl(15 pmol)を混合した混合溶液（超純水で全量10μlに調節）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。ZipTipを用いて精製し、TOF-MSにより環状ペプチドが作製されたか否かを測定した。
　結果を、図４に示す。図４上段では、環化したUTIFの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1121.57に値するピーク（Observed Mass[M+H]+=1121.81）が見られた。化学式２の非天然アミノ酸がUTIFのＮ末端に入ったが環化はしていないペプチド（理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1257.55）について、ピークは見られなかった。なお図４下段では、非天然アミノ酸を導入する前のUTIFの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=919.50に相当するピーク（Observed Mass[M+H]+=919.97）が見られた。Nexta法によってＮ末端に化学式２の非天然アミノ酸が導入されると、特異的かつ高効率にペプチド分子内のシステインと反応することがわかった。非天然アミノ酸が導入されたペプチドが作製され、環化ペプチドを作製することができた。
（実施例３）ペプチドＮ末端への非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　0.1 O.D./μl E. coli tRNAPhe 0.5μl(0.05 O.D.;77 pmol)、5×aat緩衝液（アミノアシル化緩衝液;50mM MgCl2, 5mM Spermidine, 250mM Hepes buffer(pH7.6), 100mM KCl） 2μl、 40mM ATP(Na)-KOH(pH7.0) 0.36μl、350 pmol/μl 配列番号２のペプチド　1μl(0.35nmol)、化学式３にて示される非天然アミノ酸 110nmol、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体) 0.5μl(10 pmol) 7.6μM L/F転移酵素(野生型) 0.5μl(3.8 pmol)を混合した混合溶液（超純水で全量10μlに調節）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。インキュベート後の混合溶液を薄い過酸化水素水中(終濃度100mM)で処理することによって、化学式３のPhSe部分を脱離させて２重結合に変換して反応を進行させ、マススペクトルで同定した。
　結果を、図５に示す。理論値は[M+H]+:708.29であり、実測値709.02であった。上記反応により非天然アミノ酸が導入されたペプチドが作製されたことがわかった。
（実施例４）Fc領域と結合したペプチドへの非天然アミノ酸の導入
１．前駆体の発現
　プラスミドps521をBruno Robert氏より譲り受け、これを元に前駆体（ペプチド（配列番号７）－Fc領域）をコードするプラスミドを作製した（P. Schneider, Methods in Enzymology, 322, 325-(2000)の図２Ａ）。Fc領域の配列は、GenBank accession# X70421のものを使用した。Fc領域（CH2+CH3領域）のＮ末端に配列番号７に示すアミノ酸配列（KGLNDIFEAQKIEWHEVDKTHTCPPCP）からなるペプチドを結合させ、さらにそのＮ末端にHAシグナルペプチドを結合させて、融合タンパク質を作製した。HAシグナルペプチドが切断されることにより、ペプチド－Fc（配列番号７＋Fc領域）が細胞外に分泌される。HEK293細胞に、HAシグナルペプチド－ペプチド－Fc領域をコードするプラスミドを導入して培養した。細胞培養液を採取した後、proteinG-agaroseにより精製してペプチド－Fc領域を取得し、Ｎ末端の配列がKGLであることをEdman分解によって確認した。この結果、Ｎ末端がリジンになっている前駆体（ペプチド－Fc領域）が、細胞外に分泌されていること確認された。
２．前駆体への非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　0.1 O.D./μl E. coli tRNAPhe 0.63μl(0.063 O.D.;97pmol)、5×aat緩衝液（アミノアシル化緩衝液; 50mM MgCl2, 5mM Spermidine, 250mM Hepes buffer(pH7.6), 100mM KCl） 5.4μl、100mM ATP(Na)-KOH (pH7.0) 0.36μl、350 pmol/μl 精製された前駆体（ペプチド－Fc領域） 20μl(2.1 nmol)、下記化学式４にて示される非天然アミノ酸15nmol、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 14μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 0.63μl(8.8 pmol)、7.6μM L/F転移酵素(野生型) 0.63μl(4.8 pmol)を混合した混合溶液（全量27μl）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。
　上記反応液に、蛍光物質（DIB-TAMRA;合成法などは、Taki, Chembiochem, 2009 , 10, 2460-2464.の文献内に記載）を添加してインキュベートした。反応後アセトン沈殿にてペプチド－Fc領域を精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、蛍光イメージャー用いて蛍光を確認した。
　結果を図６に示す。図６上段のＣＢＢ染色はタンパク質を染色した結果を示す写真である。下段の蛍光イメージングでは、蛍光物質が導入された場合に染色がみられる。
　蛍光イメージングの結果から、前駆体（ペプチド－Fc領域）を含む画分に、蛍光を観察することができ、確かに非天然アミノ酸が導入されたことが確認できた。負対照実験として、酵素、tRNAおよび非天然アミノ酸を除いて同じ実験を行ったところ、前駆体（ペプチド-Fc領域）の蛍光は観察されなかった。
（実施例５）化学式２にて示される非天然アミノ酸の合成
　NEXT-A法に応用可能なアミノ酸として、化学式２にて示される非天然アミノ酸（p-(クロロアセチルアミノ)フェニルアラニン：p-(chloroacetylamino)phenylalanine）を新規に合成した。以後p-(クロロアセチルアミノ)フェニルアラニンは「caaPhe」と表記することもある。合成法はLonghu Zhou et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2006, 14, 7862-7874を参考に、以下のスキームに従った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（１）Boc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHの合成
　Boc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHの合成に用いた試薬は、Boc-Phe(4-NH2)-OH（1.12g；4.00mmol）、chloroacetyl chloride（2.00mL；25.0mmol）、NaHCO3（1.68g；20.0mmol）、dry THF（40.0mL）である。ナスフラスコにNaHCO3とBoc-Phe(4-NH2)-OHを加えて真空ラインで乾燥した。そこへdry THFを30mL加えて氷上で攪拌した。加えたNaHCO3は白色沈殿としてナスフラスコに残った。また、別のナスフラスコにdry THF 10mLとchloroacetyl chlorideを混合して、十分に冷やした。
　氷上でBoc-Phe(4-NH2)-OH混合溶液の入ったナスフラスコ内を窒素置換して、そこへ冷やしたchloroacetyl chloride溶液を15分かけて滴下した。その後、アルミホイルで包んで20時間反応させた。反応の進行は薄層クロマト (TLC) で確認した。Chloroform/ methanol (7:3) で展開し、UV 照射時 (照射波長：254nm) にRf値0.60 (原料)、Rf値0.68 (反応物) の2つのスポットを得た。また、UV照射時 (照射波長： 365nm) にRf値0.85 (反応物)のスポットがあった。ニンヒドリン反応ではRf値0.60 (原料) 付近に濃い黒紫色、Rf値0.68 (反応物) 付近に薄い黄色がでた。
　反応終了後に4% NaHCO3水溶液を加えて、分液漏斗に移した。NaHCO3は4% NaHCO3水溶液に溶けきらず、残留した。そこに酢酸エチルを加え、分液漏斗を振り、下層を仮捨てして上層の有機層を回収した。仮捨てした下層に酢酸エチルを加え、同様に洗浄した。この操作を2回繰り返した。その後、回収した有機層にMgSO4を加えて脱水した。これを減圧濾過した後、エバポレーションして白色粉末を得た。続いて、得られた白色粉末を油圧式ポンプで再度減圧乾燥した。得られた白色粉末は1.06gで、収率は74%だった。この白色粉末を展開溶媒Chloroform/ methanol (8:2) でTLC展開した。UV 照射時 (照射波長：254nm) にRf値0.33 (原料)、Rf値0.30 (反応物) の2つのスポットを得た。また、UV 照射時 (照射波長：365nm) にRf値 0.53 (原料)のスポットがあった。ニンヒドリン反応ではRf値0.33 (原料) 付近に濃い紫色、Rf値0.30 (反応物) 付近に薄い黄色がでた。
（２）Boc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHの同定
　原料アミノ酸(Boc-Phe(4-NH2)-OH)および合成したBoc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHを1HNMR (測定溶媒：重DMSO)によって同定した。その結果、目的物が合成されていることがわかった。
（３）Boc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHの脱保護
　Boc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHの脱保護に、Boc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OH（200mg；0.56mmol）、4M dioxane hydrochloride（2.5mL；10mmol）、dry　ethyl acetate（2.5mL）を用いた。Boc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHの入ったナスフラスコを油圧式ポンプで減圧乾燥後、dryethyl acetateを加え、ナスフラスコを窒素置換した。そこにドラフト内で、氷上において塩酸ジオキサンをゆっくりと滴下、攪拌して氷上で2時間放置した。このとき、ナスフラスコ内の液体は白色不透明だった。
　反応終了後、アルカリトラップを敷き、エバポレーションして白色粉末を得た。続いて、油圧式ポンプで減圧乾燥した。得られた白色粉末は143mgだった。収率は87%だった。また、この白色粉末を展開溶媒Chloroform/ methanol (8:2)でTLC展開した。UV 照射時 (照射波長： 254nm) に原料および反応物ともにRf値0.43のスポットを1つずつ得た。
　しかし、得られた白色粉末は完全に水に溶解しなかった。そのため、この白色粉末を11.8mg量りとり、超純水 (milliQ)に溶けるだけ溶かした。この溶液から上清だけを注射器で分取して1.5mLチューブに移した。これを凍結乾燥し、4.0mgの白色粉末を得た。収率は34%だった。
（４）caaPheの1H NMRによる同定
　脱保護したBoc-Phe(4-NHCOCH2Cl)-OHを1H NMR (測定溶媒：D2O) によって同定したところ、Boc基のピークの消失が確認でき、目的物が合成できたことがわかった（図７）。最終収率は22%だった。
（５）caaPheのMSによる同定
　MALDI-TOF-MassによりcaaPheの同定を行った。
　まず、caaPhe溶液をMSのプレートにアプライした。続いて、DHBを10mg/mL の濃度になるように10%エタノールに溶かしたマトリクス溶液を作製した。caaPhe溶液をアプライしたMSのプレートと同一の場所に、このマトリクス溶液をアプライし、よく混合した。プレートを十分に乾燥させた後、MALDI-TOF-Mass分析で分子量を測定した。caaPheの理論分子量Calculated Mass[M+H]+は257.07である。caaPheの実測値Observed Mass [M+H]+が257.37のピークとして見られた（図８）。理論値と実測値が近い値であるので、caaPheができたことがわかった。
（実施例６）GFP（緑色蛍光タンパク質）と結合したペプチドへの非天然アミノ酸の導入
１．前駆体の発現
　芳坂貴弘氏より譲り受けたプラスミドpGGFPHおよびAlexander Varshavsky氏より譲り受けたプラスミドpH10UEを、これらを元に前駆体（Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFP）をコードするプラスミドを作製した（P. Schneider, Methods in Enzymology, 322, 325-(2000)の図２Ａ）。GFPの配列は、GenBank accession# U62636のものを使用した。GFPに、His6ユビキチンタグと、そのＣ末端に配列番号８に示すアミノ酸配列（Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys）とFLAG　tagからなるペプチドを付与させた。His6ユビキチンタグをユビキチン切断酵素(Usp2-cc)を用いて切断することにより、「Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFP」を作製できる。大腸菌（BL21(DE3)）に、His6ユビキチンタグ－Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFPをコードするプラスミドを導入し、IPTG誘導を行って培養した。大腸菌を破砕した後、Ni-NTA-agaroseにより精製してHis6ユビキチンタグ－Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFPSomatostatinを取得した。更に、Usp2-ccを作用させて、Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFPを取得した。
２．前駆体への非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　0.1 O.D./μl E. coli tRNAPhe 6μl(0.6 O.D.;0.2 nmol)、10×aat緩衝液A（0.10M MgCl2, 10mM Spermidine, 0.50M Hepes buffer(pH7.6)） 3μl、10×aat溶液B（25mM ATP(Na)-KOH (pH7.0), 0.20M KCl, 20mM DTT) 3μl、380 pmol/μl 精製された前駆体（Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tag－GFP） 3μl(1.14 nmol)、1 mM化学式２にて示される非天然アミノ酸（caaPhe）3μl(3 nmol)、20 μM E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体) 3μl(60 pmol)、29μM L/F転移酵素(野生型) 6μl(0.17nmol)、超純水3μlを混合した混合溶液（全量30μl）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。この時、「精製された前駆体」以外の全ての物質を前もって予め37℃60分インキュベーションしておくことで、アミノアシル化反応およびアミノアシルtRNAのL/F転移酵素への結合反応を促した。
　前駆体と、前駆体を非天然アミノ酸とNexta法にて反応させた産物とについて、マススペクトルを測定した（図９）。その結果、ピークがシフトしていることが確認でき、確かに非天然アミノ酸が前駆体に結合して中間体が作製されたことがわかった。また非天然アミノ酸が付加していない前駆体がほとんど残っていないことが確認できた。
　さらに前駆体に非天然アミノ酸が結合した中間体について、部分環状ペプチド構造ができているか否かを確認した。まず中間体をエンテロキナーゼにより23℃で48時間処理してFLAG　tagとGFPとの間で分解し、非天然アミノ酸（caaPhe）－Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tagを得た。かかる非天然アミノ酸（caaPhe）－Somatostatinペプチド（配列番号８）－FLAG　tagについてマススペクトルを測定した（図１０）。
　その結果、未反応のSomasitanin－FLAG　tagペプチドの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=2403.06に値するピーク（Observed Mass[M+H]+=2402.95）、caaPheが導入された環状ペプチドの理論値（Calculated Mass）[M+H]+=2605.14に値するピーク（Observed Mass[M+H]+=2606.03）、caaPheがＮ末端以外の箇所に結合した副産物の理論値（Calculated Mass）[M+H]+=2623.15に値するピーク（Observed Mass[M+H]+=2624.59）が見られた。よって、主生成物として環状ペプチドが存在することがわかった。非天然アミノ酸が付加していない前駆体は、ほとんど残っておらず、前駆体のＮ末端以外の箇所に非天然アミノ酸が結合した副産物が、少量できていることがわかった。また、MS/MS解析にて部分配列解析を行い、本ピークが目的のN末端ペプチドフラグメントであることを確認した（図１１）。またエドマン解析によって、N末端に非天然アミノ酸が結合した環状ペプチドを75％の割合で作製することができることがわかった。
　次に、上記部分環状構造を持つGFPに対しエンテロキナーゼによる分解反応を行った後、GFPについてもマススペクトルを測定して解析を行ったところ、GFP単独を示すピークのみが得られた。これはcaaPheがGFP内のSH基とは反応せず、Somatostatinペプチドに存在するSH基と特異的に反応したためと考えられた。なお、FLAG　tagのアミノ酸配列は、DYKDDDDKであり、SH基を持たない。
（実施例７）His6-FLAGペプチドＮ末端への非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　ペプチド固相合成によってHis6-FLAGペプチドを作製した。
　His6-FLAGペプチドの配列： Lys-His-His-His-His-His-His-Cys-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（配列番号９）
　0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 1μl (0.05O.D)、10×緩衝液A(100mM MgCl2, 10mM Spermidine, 500mM Hepes buffer(pH7.6)）0.5μl、10×溶液B(25mM ATP,200mM KCl,20mM DTT) 0.5μl、0.35mM His6-FLAGペプチド 0.5μl(180pmol)、1 mM非天然アミノ酸（caaPhe）1μl(1nmol)、20 μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 0.25μl(5pmol)、29μM L/F転移酵素(野生型) 0.25μl(7.3pmol)、超純水1μlを混合した混合溶液（全量5μl）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。
　ネガティブコントロールとして、上記のアミノ酸の代わりに超純水1μlを加え、同様の操作を行ったサンプルも作製した。それら２つのサンプルのマススペクトルを測定し、比較した。
　結果を、図１２に示す。ネガティブコントロールのマススペクトル（図１２上段）は原料のペプチドのピーク（理論分子量Exact Mass[M+H]+=2065.9）が確認された。Nexta法で非天然アミノ酸を導入したサンプルはピークがシフトし（図１２下段）、部分環状ペプチドのピーク（理論分子量Exact Mass[M+H]+=2267.4）が確認された。また非天然アミノ酸が付加していない原料のピーク、付加はしているが環状構造をとっていないペプチドのピークはほとんどみられなかった。
　さらにHis6配列を持つ環状ペプチドは、直鎖状のHis6配列を持つペプチドと同様に、Ni-NTA-agaroseゲルに対する結合活性を有することを確認した。
（実施例８）化学式５にて示される非天然アミノ酸の合成
　下記の化学式５にて示される非天然アミノ酸（以下、「Phe(4-NHCOC2H4Br)」とも称する）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（１）Boc-Phe(4-NHCOC2H4Br)の合成
　Boc-Phe(4-NH2)95mg(0.34mmol)をナスフラスコに量り取り、dry THF　2.0mLとNaHCO3　0.14g(1.7mmol)を加えた。そこに、dry THF　100μLと3-bromopropionyl chloride　0.13μL(1.4mmol)との混合溶液を、0℃・N2封入下でゆっくりと滴下した。0℃から室温に戻しながら、4時間攪拌した。1時間後、4時間後にTLCで反応の進行具合を確認し、原料の消失を確認してから反応のワークアップを行った。具体的には、反応混合物に対し5%　NaHCO3 aqを3mL加えた。その後、酢酸エチルを用いて抽出操作を3回行った。有機層を乾燥後、ナスフラスコに回収し、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させた。質量を量ると、38mg(92μmol)、収率は27%であった。
　1H　NMR(溶媒:methanol-d4)により目的物を同定した。また、methanol/chloroform(1:9)によるシリカゲルTLC展開を行うと、反応前の出発物質のRf値は0.2、反応生成物のＲｆ値は0.3であった。
（２）Phe(4-NHCOC2H4Br)の合成
　38mgのBoc-Phe(4-NHCOC2H4Br)に、氷冷下でトリフルオロ酢酸（TFA）を2mL加え、氷上から室温に戻して30分間攪拌した。30分後、大部分のＴＦＡをN2ガスで乾燥させた後、diethyl etherでエーテル沈殿を行った。この時、やや黄色がかった固体を得た。固体を減圧乾燥させたのち、1H　NMR (溶媒：Deuterium Oxide)測定を行い、目的物を同定した（図１３）。
（実施例９）化学式６にて示される非天然アミノ酸の合成
　下記の化学式６にて示される非天然アミノ酸（以下、「Phe(4-NHCOCH=CH2)」とも称する）を、Shoji Nagaoka et al., Synthetic Communications,35:2529-2534,2005を参考にして合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
（１）Phe(4-NH2)の合成
　サンプル瓶に原料Boc-Phe(4-NH2)-OHを0.21g(0.74mmol)はかりとり、氷冷下でTFA約3mLを加え、室温で30分間反応させた。TLCで反応の進行具合を確認した。methanol/chloroform(5:5)で展開すると、原料はRf値0.7-0.8、目的物はRf値0.2-0.4および原点吸着であった。窒素ガスを当てて溶媒を乾燥させた後、diethyl etherによるエーテル沈殿を３回行った。その後再びmethanol/chloroform(5:5)でTLC展開を行うと、原料はRf値0.7-0.8、目的物は0.2-0.4であった。また、TOF-Mass、NMR(溶媒：D2O)で同定した。
（２）Phe(4-NHCOCH=CH2)の合成
　合成したPhe(4-NH2)245mg（実際には収率100%でも134mgであった。減圧乾燥を行ったが、溶媒が残ってしまったと考えられる）をナスフラスコに回収し、超純水1mLを加え、90℃の温浴につけた。CuCO3/Cu(OH)2　(>basic cupric carbonate) 79mg（0.36mmol; アミノ酸に対して0．55等量）を量りとり、ゆっくりと加えた。このとき、緑色に変化した。90℃の温浴内で10分間攪拌した。パスツールピペットに綿を詰め、濾過した後、少量の超純水でナスフラスコを洗浄し、濾過した。パスツールピペットでは沈殿を完全にはろ過紙切れなかったので、1.5mLチューブに回収し、5min遠心後、上清のみを10mLナスフラスコに回収した。室温で攪拌しながら、acetone0.17mL、2.0M　KOH　0.45mLを順に加えた。その後、氷冷下でacetone　1.0mLとacryloyl　chloride　80μLの混合溶液をゆっくりと滴下した。この時、濃い緑色に変化した。ここに2.0M　KOHを0.30mL加え、pH試験紙で塩基性状態になっていることを確認した。この時、この状態で、4℃で16時間攪拌した。この時、黒色の懸濁液に変化した。懸濁液を1.5mLチューブに分注し、5分間遠心後、上清を除去した。その後、H2O、MeOH、diethyl　etherの順に洗浄し、減圧乾燥した。この時、黒色結晶Phe(4-NHCOCH=CH2)　copper　complexを得た。質量を量ると、89mg(0.17mmol)であった。ここに超純水1.1mLを加え、室温で攪拌した。さらに、chloroform　1.1mL、8-quinolinol　29mg(0.20mmol)の混合溶液を加えると、暗い黄緑色に変化した。室温で19.5時間攪拌した。攪拌後、水層を回収して分液漏斗に回収し、等量のchloroformを用いて抽出操作を３回行った。水層を10mLナスフラスコに回収し、ロータリーエバポレーターで溶媒を乾燥させた。この時、茶色粉末を得た。質量を量ると、33.0mg(0.14mmol)、収率は19%であった。TOF-MassとNMR(溶媒:D2O)により同定した。MALDI-TOF　Massの結果、理論値[M+H]+=235.11に対し、実測値[M+H]+=235.59が確認された（図１４）。
（実施例１０）ペプチドＮ末端への、化学式５の非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　H-2692ペプチド（RGPCRAFI（配列番号１０）：分子量919.12、推定値Expected[M+H]+: 919.50）のＮ末端に化学式５の非天然アミノ酸を導入して、ペプチドが環化するか否かを確認した。
　0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 1μl (0.05O.D)、10×緩衝液A(100mM MgCl2, 10mM Spermidine, 500mM Hepes buffer(pH7.6)）0.5μl、10×溶液B(25mM ATP,200mM KCl,20mM DTT) 0.5μl、0.35mM H-2692ペプチド 0.5μl(180pmol)、1 mM非天然アミノ酸（化学式５）1μl(1nmol)、20 μM E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体) 0.25μl(5pmol)、29μM L/F転移酵素(野生型) 0.25μl(7.3pmol)、超純水1μlを混合した混合溶液（全量5μl）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。
　さらに、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体)の代わりに、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Phe248→Ala　二重変異体)、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Gly318→Trp　二重変異体)、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Ala356→Trp　二重変異体)、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala & Gly318→Trp　三重変異体)、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala & Ala356→Trp　三重変異体)を用いて、反応を行った。
　ZipTipを用いて精製し、TOF-MSにより環状ペプチドが作製されたか否かを測定した。
　結果を図１５に示す。図１５ａはAla294→Gly変異体、図１５ｂはAla294→Gly & Phe248→Ala　二重変異体、図１５ｃはAla294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体、図１５ｄはAla294→Gly & Gly318→Trp　二重変異体、図１５ｅはAla294→Gly & Ala356→Trp　二重変異体、図１５ｆはAla294→Gly & Thr251→Ala & Gly318→Trp　三重変異体、図１５ｇはAla294→Gly & Thr251→Ala & Ala356→Trp　三重変異体を用いた場合の結果を示す。
　環化が成功した場合の推定値Expected[M+H]+=1135.59であるが、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Phe248→Ala　二重変異体)を用いた場合以外は、化学式５の非天然アミノ酸により、H-2692ペプチドが環化されることがわかった。
（実施例１１）ペプチドＮ末端への、化学式２または６の非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
（１）実施例１０と同様にして、E. coli PheRS(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体)を用いて、化学式２または６の非天然アミノ酸を、H-2692ペプチドに導入し、ZipTipを用いて精製し、TOF-MSにより環状ペプチドが作製されたか否かを測定した。
　結果を図１６に示す。ネガティブコントロールとして非天然アミノ酸が存在しない系を用いて反応を行ったところ（図１６ｃ）、H-2692の推定値（Calculated Mass[M+H]+=920.13）にのみピークが存在することを確認した（Observed Mass[M+H]+=919.90）。化学式６の非天然アミノ酸（図１６ａ（Calculated Mass[M+H]+=1135.59、Observed Mass[M+H]+=1136.16））もしくは化学式２の非天然アミノ酸（図１６ｂ（Calculated Mass[M+H]+=1122.33、Observed Mass[M+H]+=1122.19））を用いた場合、ピークがシフトしており環化したことが確認できた。
（２）上記（１）と同様にして、化学式２または６の非天然アミノ酸を、H-2692ペプチドに導入した。その後各反応物に、500mM　iodoacetoamideを1μL添加して、室温で30分間インキュベートした後、ZipTipを用いて精製し、TOF-MSにより分子量を測定した。iodoacetoamideはSH基と反応して結合する。ペプチドが環化していない場合は、iodoacetoamideが結合するため、ペプチドの分子量が増加すると考えられ、ペプチドが環化している場合は、iodoacetoamideが結合できないため、ペプチドの分子量は変化しないと考えられる。ネガティブコントロールとして、H-2692ペプチドに天然のフェニルアラニンを導入した。
　結果を、図１７に示す。ネガティブコントロールのマススペクトル（図１７ｃ）はiodoacetoamideの結合したペプチドのピーク（理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1123.59）が確認された（Observed Mass[M+H]+=1123.90）。化学式２または６の非天然アミノ酸を導入した場合は（図１７ａ，ｂ）は、iodoacetoamideの結合していないペプチドのピーク（理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1136.35（Observed Mass[M+H]+=1136.10）、および理論値（Calculated Mass）[M+H]+=1122.33（Observed Mass[M+H]+=1122.04））が確認された。
（実施例１２）Fc領域と結合したペプチドへの非天然アミノ酸の導入
　実施例４と同様にして、以下の２種類の前駆体（ペプチド－Fc領域）を用いて実験を行った。
（Ａ）Fc領域（CH2+CH3領域）のＮ末端にアミノ酸配列（KNFFWKTFTSCDYKDDDDKKVDKTHTCPPCP：配列番号１１）からなるペプチドが結合し、さらにそのＮ末端にHAシグナルペプチドが結合している、融合タンパク質。
（Ｂ）Fc領域（CH2+CH3領域）のＮ末端側にアミノ酸配列（CDKTHTCPPCP：配列番号１２）からなるペプチドが結合し、さらにそのＮ末端にHAシグナルペプチドが結合している、融合タンパク質。
　上記２種の前駆体を実施例４と同様に発現させて、Edman分解によりＮ末端が各々リジンおよびシステインになっていることを確認した。次に当該前駆体に、Nexta法を用いて、化学式４の非天然アミノ酸を結合させた。蛍光物質（DIB-TAMRA）を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、蛍光イメージャーにより蛍光を確認した。
　結果を図１８に示す。図６上段のＣＢＢ染色はタンパク質を染色した結果を示す写真である。下段の蛍光イメージングでは、蛍光物質が導入された場合に染色がみられる。Ｍはマーカーを示す。（Ａ）の前駆体では蛍光を観察することができ、確かに非天然アミノ酸が導入されたことが確認できた。負対照実験として（Ｂ）の前駆体を用いて同じ実験を行ったところ、蛍光は観察されなかった。
（実施例１３）ペプチドＮ末端への、各種非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　UITFペプチド（実施例２）のＮ末端に図１９に記載の３種の非天然アミノ酸（クロロアラニン、プロパギルグリシン、アジドホモアラニン）を導入した。
（１）本実施例では、以下の６種類のE. coli LeuRSを使用した。
　mu1:　Thr247→Val　＆　Thr248→Val　二重変異体
　mu2:　Thr252→Tyr　＆　His537→Gly　二重変異体
　mu3:　Thr252→Tyr　＆　Thr247→Val　＆　Thr248→Val　三重変異体
　mu4:　Thr252→Tyr　変異体
　mu5:　His537→Gly　変異体
　wt:　変異なし
（２）0.1 O.D./μl E. coli tRNALeu 1.5μl (0.24 nmol)、10×緩衝液A(100mM MgCl2, 10mM Spermidine, 500mM Hepes buffer(pH7.6)）3μl、10×溶液B(25mM ATP,200mM KCl,20mM DTT) 3μl、0.37mM UITFペプチド（CysをCH2CH2Brと予め反応させてチオエーテルとしてある） 3μl(1.1 nmol)、12 μM E. coli LeuRS(上記の６種類のいずれか)(36pmol)、39μM L/F転移酵素(野生型) 1μl(39pmol)、超純水9.5μlを混合した混合溶液（全量24μl）を作製した。かかる混合溶液4μlと、各種非天然アミノ酸1μl（終濃度2mM）とを混合し、37℃で60分間インキュベートした。停止溶液（180μl中、10%　TFA　108μl、超純水　54μl、0.37mMの　CysをCD2CD2Brと予め反応させてチオエーテルとしてあるUITFペプチド　18μl）を5μl添加して反応を停止させ、ZipTipを用いて精製し、MALDI-TOF-MSにより非天然アミノ酸が導入されたか否かを測定した。各々３回ずつ測定を行った。
　非天然アミノ酸がペプチドに導入された割合を、H. A. Ebhardt et al,, Anal. Chem., 2009, 81, 1937-1943を参考にして算出した。
　３回測定の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　プロパルギルグリシンは、mu1、mu3、mu4によりペプチドに導入することが可能であり、アジドホモアラニンは、mu1、mu2、mu3、mu4によりペプチドに導入することが可能であり、クロロアラニンは、mu1、mu3、mu4によりペプチドに導入することが可能であることがわかった。
（３）クロロアラニンをmu1により、UITFペプチドに導入した場合において、クロロアラニン側鎖とUITFペプチド内のシステイン側鎖との環化が起こっているかの確認を行った。終濃度が、0.1 O.D./μl E. coli tRNALeu 8.0μM、緩衝液A（10mM MgCl2, 1mM Spermidine, 50mM Hepes buffer(pH7.6)）、溶液B（2.5mM ATP,　20mM KCl,　2mM DTT）、 UITFペプチド35μM、E. coli LeuRS(mu1)1.2μM、L/F転移酵素(野生型) 1.2μM、クロロアラニン2.0mMとなるように混合溶液（全量5μl）を作製し、37℃で30分間インキュベートした。反応後、TFAを加えて反応を停止させ、ZipTipを用いて精製し、CHCA（マトリックス）を用いて分子量測定した。
　結果を図２０に示す。図２０ａは、クロロアラニンを添加せずに反応を行った場合の結果であり、図２０ｂはクロロアラニンを添加して反応を行った場合の結果である。クロロアラニン導入によりペプチドが環化されることがわかった。
（実施例１４）化学式７にて示される非天然アミノ酸の合成
　下記の化学式７にて示される非天然アミノ酸（O-bromoethyl-L-tyrosine）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　N-Boc-L-Tyrosine ester　3.5 mmol、dibromoethane　3.5 mmol、sodium methoxide　3.5 mmol、dry acetonitrile　6.0 mLを混合して、refluxにより12時間反応を行った。抽出およびシリカゲルカラムによる精製の後、1H NMRにより、同定を行った。同定の結果、N-Boc-bromoethyl-L-Tyrosine methyl esterができていると判断した。収率は30%だった。続いて、N-Boc-bromoethyl-L-Tyrosine esterのメチル基をLiOHによる脱保護を行った。続いて、TFAによってBoc基の脱保護を行った。その後、エーテル沈殿を行い、1H NMRによって、目的の非天然アミノ酸であるO-bromoethyl-L-tyrosine（化学式７）ができているか確認した。
　その結果、目的物が得られたと考えられた（図２１）。最終的な収率は1.5%であった。
（実施例１５）ペプチドＮ末端への、化学式７の非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 1.0μl 、10×緩衝液A(100mM MgCl2, 10mM Spermidine, 500mM Hepes buffer(pH7.6)）0.5μl、10×溶液B(25mM ATP,200mM KCl,20mM DTT) 0.5μl、0.35mM UITFペプチド 0.5μl、20 μM E. coli PheRS(mu3)(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体)0.25μl、39μM L/F転移酵素(野生型) 0.25μl、超純水1.0μl、1mM　化学式７の非天然アミノ酸1.0μlとを混合し、37℃で1時間、3時間、5時間インキュベートした。TFAを混合して反応を停止させ、ZipTipを用いて精製し、MALDI-TOF-MSにより環化したか否かを確認した。なお陽性コントロールとして、化学式７の非天然アミノ酸の代わりにcaaPheを、陰性コントロールとして非天然アミノ酸を含まない混合溶液を準備し、37℃で1時間インキュベートした。
　結果を、図２２に示す。図２２ａは、陽性コントロールの結果であり、図２２ｂは、陰性コントロールの結果であり、図２２ｃは、化学式７の非天然アミノ酸を添加して1時間インキュベートした結果であり、図２２ｄは、化学式７の非天然アミノ酸を添加して3時間インキュベートした結果であり、図２２ｅは、化学式７の非天然アミノ酸を添加して5時間インキュベートした結果である。
　反応時間1時間では、化学式７の非天然アミノ酸はペプチドに導入されるものの環化は50％程度しか進行していなかった。反応時間を3時間、5時間にすると、ほぼ環化反応が進行していた。また、ペプチドのSH基と非天然アミノ酸の側鎖のみが反応し非環状ペプチド（Calculated　Mass[M+H]+=1126.59）を生成する副反応は、検出されなかった。
（実施例１６）リンカー化合物（化学式２１：BVSM）を用いたファージ上ペプチドの環化
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　pIIIタンパク質上にモデルペプチド（配列番号１３：ACHHHHHHCDYKDDDDK）を提示しているファージを用いて、ファージ上での環化を試みた。その後、リジンのＮ末端側で切断するプロテアーゼ(Lys-N)を用いてファージ上の環化ペプチド（配列番号１４：ACHHHHHHCDY）を切断し、His-tag精製を行い、MSを用いて分子量を解析し、環化の確認を行った。
　モデルペプチド（配列番号１３：ACHHHHHHCDYKDDDDK）（環化していない）を提示しているファージに84μLの20% PEG/2.5M NaClを加え、懸濁した。遠心（4℃、15000rpm、30分間）後、上清を除いた。175μLのPBSを加え、懸濁した後、ファージ　50μL（1 x 1011 pfu）、74mM BVSMを終濃度が1100μM、110μM、11μMとなるように混合した。その後、窒素により脱気したPBSを加えて、全量を2mLとした。静置して4℃、一晩、反応させた。
　反応溶液2mLに対し、500μLの20% PEG/2.5M NaClを加え、懸濁し、遠心（4℃、15000rpm、30分間）後、上清を除いた。沈殿を40μLの50mMリン酸バッファー(Na2HPO4, pH8.5)に懸濁後、4μLのLys-N（Metalloendopeptidase）を加えた。37℃、4時間、600rpmで反応させた。反応後、0.8μLの100mM TCEP水溶液を加え、37℃、30分間、600rpmで攪拌し反応させた。Co-NTAゲルを用いてHis-tagアフィニティー精製後、ZipTip処理をし、MS測定を行った。
　環化は３種の濃度(終濃度が1100μM、110μM、11μM)のBVSMで実験を行った。陰性コントロールとしてファージなし（Lys-Nのみ）、MockとしてBVSMなしで同様の実験を行った。BVSM　11μMでは、BVSMによって環化されたペプチドのピークのみが確認された。
　またBVSM　11μMにより環化反応を行ったファージについて、大腸菌への感染能を確認したところ、感染能が保たれていることがわかった。
　さらに、BVSM　11μMにより環化反応を行ったファージについて、環化反応後、iodoacetoamideまたはDTTとインキュベートを行ったのち、上記同様に、Lys-Nにより処理をし、MS測定を行った。iodoacetoamideはペプチド内の未反応のSH基と反応して結合するため、ペプチドが環化していない場合は、iodoacetoamideが結合してペプチドの分子量が増加すると考えられる。一方、ペプチドが環化している場合は、iodoacetoamideが結合できないため、ペプチドの分子量は変化しないと考えられる。同様に、DTT はBVSM由来の未反応のビニル基と反応して結合するため、ペプチドが環化していない場合は、DTTが結合して、ペプチドの分子量が増加すると考えられる。一方、ペプチドが環化している場合は、DTTが結合できないため、ペプチドの分子量は変化しないと考えられる。
　その結果、BVSMによって環化されたペプチドのピークのみが確認された。
（実施例１７）化学式２２の化合物（qui-I）のファージ上ペプチドへの付加
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 　pIIIタンパク質上にモデルペプチド（配列番号１３：ACHHHHHHCDYKDDDDK）を提示しているファージを用いて、ファージ上のペプチドに化学式９の化合物を付加させた。その後、リジンのＮ末端側で切断するプロテアーゼ(Lys-N)を用いてファージ上の環化ペプチド（配列番号１４：ACHHHHHHCDY）を切断し、His-tag精製を行い、MSを用いて分子量を解析し、qui-I付加について確認を行った。なお、qui-Iは、文献R. J. Radford et al., Inorg. Chem. 49, 4362-4369 (2010)に従って合成および精製を行った。
　モデルペプチド（配列番号１３：ACHHHHHHCDYKDDDDK）（環化していない）を提示しているファージに84μLの20% PEG/2.5M NaClを加え、懸濁した。遠心（4℃、15000rpm、30分間）後、上清を除いた。175μLのPBSを加え、ファージを懸濁した後、このうちの50μL（1 x 1011 pfu）を、2mM qui-I　1μLと共に混合した。静置して4℃、一晩、反応させた。
　反応溶液に12.5μLの20% PEG/2.5M NaClを加え、懸濁し、遠心（4℃、15000rpm、30分間）後、上清を除いた。沈殿を、40μLの50mMリン酸バッファー(Na2HPO4, pH8.5)に懸濁後、4μLのLys-N（Metalloendopeptidase）を加えた。37℃、4時間、600rpmで反応させた。反応後、0.8μLの100mM TCEP水溶液を加え、37℃、30分間、600rpmで攪拌し反応させた。Co-NTAゲルを用いてHis-tagアフィニティー精製後、ZipTip処理をし、MS測定を行った。
　MS測定の結果を図２３に示す。図２３ａは、qui-Iを反応させていない負対照実験の結果である。図２３ｂは、qui-Iを反応させた結果である。図２３ｂではqui-I２分子がモデルペプチド内の２つのシステインに各々結合した場合のピーク（Calculated Mass[M+H]+=1796.64）が確認された（Observed Mass[M+H]+=1797.31）。よって、qui-Iがモデルペプチド中の２つのシステインの側鎖に付加したことがわかった。
　またqui-I導入を行ったファージについて、大腸菌への感染能を確認した結果を図２４に示す。図２４ａは、qui-Iの代わりに水1μLを加えて同じ操作を行った（mock）ファージの結果であり、図２４ｂはqui-I導入反応後のファージの結果である。qui-Iの導入したファージにおいても、qui-Iを導入していないファージと同程度の感染能が保たれていることがわかった。
（実施例１８）化学式１９にて示される非天然アミノ酸の合成
　下記の化学式１９にて示される非天然アミノ酸（O-Iodoethyl-L-tyrosine）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　N-Boc-bromoetyl-L-Tyrosine methyl ester　0.22 mmol、NaI　0.40 mmol、dry acetone　1.5 mLを混合して、refluxにより反応を行った。抽出およびシリカゲルカラムによる精製の後、1H NMRにより、同定を行った。同定の結果、N-Boc-Iodoethyl-L-Tyrosine methyl esterができていると判断した。収率は10%だった。続いて、N-Boc-Iodoethyl-L-Tyrosine esterのメチル基をLiOHによる脱保護を行った。続いて、TFAによってBoc基の脱保護を行った。その後、エーテル沈殿を行い、1H NMRによって、目的の非天然アミノ酸であるO-Iodoethyl-L-tyrosine（化学式１９）ができているかを確認した。
　その結果、目的物が得られたと考えられた（図２５）。
（実施例１９）ペプチドＮ末端への、化学式１９の非天然アミノ酸の導入（Nexta法）
　0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 1.0μl 、10×緩衝液A(100mM MgCl2, 10mM Spermidine, 500mM Hepes buffer(pH7.6)）0.5μl、10×溶液B(25mM ATP,200mM KCl,20mM DTT) 0.5μl、0.35mM UITFペプチド 0.5μl、20 μM E. coli PheRS(mu3)(Ala294→Gly & Thr251→Ala　二重変異体)0.25μl、39μM L/F転移酵素(野生型) 0.25μl、超純水1.0μl、1mM　化学式１９の非天然アミノ酸1.0μlを混合し、37℃で1時間インキュベートした。TFAを混合して反応を停止させ、ZipTipを用いて精製し、MALDI-TOF-MSにより環化したか否かを確認した。なお陽性コントロールとして、化学式１９天然アミノ酸の代わりにcaaPheを、陰性コントロールとして非天然アミノ酸を含まない混合溶液を準備し、37℃で1時間インキュベートした。
　結果を、図２６に示す。図２６ａは、陽性コントロールの結果であり、図２６ｂは、陰性コントロールの結果であり、図２６ｃは、化学式１９の非天然アミノ酸を添加して1時間インキュベートした結果である。図２６ｃでは、原料ペプチドであるUITFペプチドのピークは無くなっていた。図２６ｃには、２つのピークが存在し、これらは環化ペプチドのピーク（Calculated Mass[M+H]+=1108.57、Observed Mass[M+H]+=1108.64）と、化学式１９の非天然アミノ酸がＮ末端に付加しただけで環化していないペプチドのピーク（Observed Mass[M+H]+=1236.49）と考えられた。よって1時間の反応時間では完全に環化していないことがわかった。化学式７の非天然アミノ酸の場合（実施例１５）、インキュベートの時間を3時間、5時間とのばすことにより環化反応が進んだので、化学式１９の非天然のアミノ酸の場合でも、インキュベート時間をのばすことにより、同様に環化反応が進むと考えられる。
　また、ペプチドのSH基と非天然アミノ酸の側鎖のみが反応し非環状ペプチド（Calculated　Mass[M+H]+=1126.59）を生成する副反応は、検出されなかった。
　本発明により提供される結合体のうち、例えば機能部がFc領域を有するポリペプチドである結合体は、例えば環状ペプチドを腫瘍指向性のものとすることにより、癌治療用医薬として使用することができる。種々の環状ペプチドを有するバクテリオファージを結合体として作製することにより、ファージディスプレイによるスクリーニングが可能となり、多様な環状ペプチドから所望の特性（例えば腫瘍指向性）を持つ環状ペプチドを選択することができ、有用である。本発明の方法は、これらの結合体を容易に作製して提供することができる。また本発明の方法によれば、設備等が限られた環境でも結合体を利用することを可能とし、環状ペプチドに関する研究を推進させるための有力なツールとなり得る。さらに本発明の新規非天然アミノ酸によれば、チオエーテル結合による環状ペプチドを提供可能であり、多様な構造を持つ環状ペプチドを提供することが可能である。

Claims (14)

  1. 非天然アミノ酸の側鎖により環状部分が形成される環状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる結合体。
  2. 前記機能部がファージであり、環状ペプチドがファージのコートタンパク質に結合してなる、請求項１に記載の結合体。
  3. 非天然アミノ酸の側鎖により形成される環状部分が、以下から選択される構造を有する、請求項１または２に記載の結合体：
    （Ａ）以下の化学式９にて示される非天然アミノ酸の側鎖と、金属とが配位してなる構造；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （Ｂ）以下の一般式８にて示される構造；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （一般式８中、Y1、Y2、Y3は各々独立して、炭素数１～５のアルキレン基から選択される。）
  4. 以下の工程を含む、請求項１～３のいずれか１に記載の結合体を作製する方法：
    （１）SH基を有するアミノ酸を含むペプチドがコートタンパク質に結合してなるファージと、以下の一般式１０もしくは一般式１１に示される化合物を混合して、０～８℃、0.5～１６時間反応させる工程；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （一般式１０中、R3はハロゲン原子である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （一般式１１中、X1およびX2は各々独立して、炭素数が１～５のハロアルキル基、炭素数が２～５の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択され、Y3は炭素数１～５のアルキレン基からなる群から選択される。）
    （２）環状ペプチドを有するファージを分離する工程。
  5. 以下の一般式１０もしくは一般式１１に示される化合物を含む、請求項１～３のいずれか１に記載の結合体を作製するための試薬キット：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （一般式１０中、R3はハロゲン原子である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （一般式１１中、X1およびX2は各々独立して、炭素数が１～５のハロアルキル基、炭素数が２～５の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択され、Y3は炭素数１～５のアルキレン基からなる群から選択される。）
  6. 以下の工程を含む、標的タンパク質に結合し得る環状ペプチドをスクリーニングする方法：
    （ｉ）請求項１～３のいずれか１に記載の結合体と、標的タンパク質を接触させる工程：
    （ｉｉ）標的タンパク質に結合した結合体を選択する工程。
  7. 前記機能部がFc領域を含むポリペプチドである、請求項１に記載の結合体。
  8. 非天然アミノ酸の側鎖により形成される環状部分が、以下の一般式１２に示される構造を有する、請求項７に記載の結合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、R4は、炭素数１～５のアルキレン基、炭素数１～５のアルキレン基－フェニレン基－アミド結合－炭素数１～５のアルキレン基、および炭素数１～５のアルキレン基－フェニレン基－エーテル結合－炭素数１～５のアルキレン基から選択される。）
  9. Ｎ末端に非天然アミノ酸を有する直鎖状ペプチドと、機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、請求項７または８に記載の結合体の中間体。
  10. Ｎ末端に非天然アミノ酸を結合させるために、塩基性アミノ酸をＮ末端に有する直鎖状ペプチドと、機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、請求項９に記載の中間体の前駆体。
  11. 以下を含む混合溶液を用いて、請求項７または８に記載の結合体を作製する方法：
    （ａ）Ｎ末端に非天然アミノ酸を有さない直鎖状ペプチドと機能部とがペプチド結合を介して結合してなる、前記結合体の前駆体、
    （ｂ）前駆体分子内のアミノ酸の側鎖と結合可能な官能基を側鎖に有する非天然アミノ酸、
    （ｃ）tRNA、
    （ｄ）アミノアシルtRNA合成酵素、
    （ｅ）ロイシル／フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素。
  12.  Fc領域を有するポリペプチドである機能部をコードするポリヌクレオチドと、前記直鎖状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが導入された細胞を培養することにより、前記前駆体が作製される、請求項１１に記載の作製方法。
  13. 下記一般式（１）により表される非天然アミノ酸：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
      （式中Rは、NR1-CO-R2であり、
    　R1は水素原子、又は炭素数が１～６の直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基から選択され、
    　R2は炭素数が１～３のアルキル基、炭素数が１～３のハロアルキル基、または炭素数が２～４の直鎖状若しくは分岐状のアルケニル基から選択される。）
  14. R1は水素原子であり、R2は炭素数が１もしくは２のハロアルキル基または炭素数が２もしくは３のアルケニル基である、請求項１３に記載の非天然アミノ酸。
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