CN113785058A - 制作和利用琥珀专性的噬菌体展示文库的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开的实施方式涉及构建噬菌体展示文库的方法，其中噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。本公开的进一步实施方式涉及所形成的噬菌体展示文库。本公开的其他实施方式涉及通过利用本公开的噬菌体展示文库选择结合所需靶标(如所需靶标的配体结合位点)的肽或蛋白质的方法。本公开的进一步实施方式涉及从本公开的噬菌体展示文库和方法中筛选出的肽，如去乙酰化酶2的抑制剂或ENL的抑制剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月4日提交的美国临时专利申请第62/813,340号的优先权。上述申请的全部内容通过引用纳入本文。
关于联邦资助研究的说明
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号R01CA161158资助完成。政府对本发明拥有一定的权利。
本发明的开发由韦尔奇基金会(the Welch Foundation)部分资助，资助号为A-1715。
背景技术
噬菌体展示技术有许多限制，包括在生成肽文库时结合噬菌体展示和化学修饰的能力有限，以及在细胞表面展示中纳入非经典氨基酸。本公开的各种实施方式解决了上述限制。
发明内容
在一些实施方式中，本公开涉及通过以下步骤构建噬菌体展示文库的方法：(a)提供原始
噬菌体展示文库，其中原始噬菌体展示文库包括多种核酸，其中多种核酸包括具有含有组合区域的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，其中至少某些核酸的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子；(b)将原始噬菌体展示文库转化到细菌宿主细胞内；(c)在转化的细菌宿主细胞中诱导表达噬菌体衣壳蛋白基因，其中来自仅包含噬菌体衣壳蛋白基因中的框内有义密码子的核酸的噬菌体衣壳蛋白的表达使细菌宿主细胞对辅助噬菌体的感染免疫；(d)用辅助噬菌体感染转化的细菌宿主细胞，其中辅助噬菌体编码并表达使被感染的细菌对抗生素具有抗性的基因；(e)使受感染和未受感染的细菌宿主细胞在含有抗生素的培养基中生长，其中生长的结果是选择受感染的细菌，而受感染的细菌包括辅助噬菌体和具有在组合区域中带有至少一个框内琥珀密码子的噬菌体衣壳蛋白基因的至少某些核酸；(f)从细菌细胞宿主细胞中提取核酸；(g)将提取的核酸转化进琥珀抑制性细菌宿主菌株，其中琥珀抑制性细菌宿主菌株被不表达噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，并且，其中，该转化允许从细胞中选择性地生产噬菌体颗粒，所述细胞含有组合区域中具有至少一个框内琥珀密码子的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸；和(h)从生产的噬菌体颗粒中纯化核酸以提供噬菌体展示文库，其中噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
本公开的其他实施方式涉及包含多个核酸的噬菌体展示文库。该多个核酸包括具有含组合区域的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，其中噬菌体显示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。本公开的进一步实施方式涉及通过以下步骤选择与所需靶标结合的肽或蛋白质的方法：(a)提供本公开的噬菌体展示文库；(b)将噬菌体展示文库转化进细菌宿主细胞，其中细菌宿主细胞能够翻译噬菌体衣壳蛋白基因的组合区域，使至少一个框内琥珀密码子编码所需的非经典氨基酸，其中，细菌宿主细胞被不表达噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，其中，转化允许生产出包含在组合区域中具有所需非经典氨基酸的噬菌体衣壳蛋白的噬菌体颗粒；(c)针对所需靶标筛选噬菌体颗粒，其中筛选的结果是选择具有与所需靶标结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒；以及(d)鉴定所选噬菌体颗粒组合区域的氨基酸序列。
本公开的其他实施方式涉及通过以下步骤选择与所需靶标的配体结合位点结合的肽的方法：(a)提供具有多种核酸的噬菌体展示文库，其中多种核酸包括具有噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，该基因包括组合区域，其中噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子，并且该至少一个框内琥珀密码子位于与所需靶标的配体结合位点结合的肽的编码区域内；(b)将噬菌体展示文库转化进细菌宿主细胞，其中细菌宿主细胞能够翻译噬菌体衣壳蛋白基因的组合区域，使得至少一个框内琥珀密码子编码一个所需的非经典氨基酸，其中细菌宿主细胞被不表达噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，并且，其中，转化允许生产出含有在组合区域中具有所需非经典氨基酸的噬菌体衣壳蛋白的噬菌体颗粒；(c)针对所需靶标筛选噬菌体颗粒，其中筛选的结果是选择具有与所需靶标的配体结合位点结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒，其中非经典氨基酸作为配体引导噬菌体衣壳蛋白组合区域至所需靶标的配体结合位点；以及(d)鉴定所选噬菌体颗粒的组合区域的氨基酸序列。
本公开的其他实施方式涉及从本公开的噬菌体展示文库和方法中筛选出的肽。例如，在一些实施方式中，本公开涉及包括去乙酰化酶2(sirtuin 2)抑制剂的组合物。在一些实施方式中，本公开涉及包括ENL抑制剂的组合物。
附图说明
图1提供了制作噬菌体展示文库(图1A)和利用噬菌体展示库选择与靶标结合的含有非经典氨基酸的肽或蛋白质(图1B)的方法的方案。
图1C说明了使用噬菌体展示的活性位点定向配体进化的实施方式。图A显示了靶标和配体结合以形成蛋白质-配体复合物。靶标是生物大分子，其为RNA或蛋白质。图B说明了噬菌体辅助的活性位点定向配体进化，以鉴定蛋白质靶标的高亲和性配体。含有配体的非经典氨基酸被纳入噬菌体展示的随机化肽文库中，以促进与蛋白质靶标的结合。侧接含配体的非经典氨基酸的氨基酸残基提供了与蛋白质靶标的其它相互作用，以改善结合。
图1D显示了各种非经典氨基酸的结构。
图2是通过超感染选择构建琥珀-密码子-专性(amber-codon-obligate)噬菌体展示文库的方法示意图。克隆后，用原始噬菌粒文库转化有F性菌毛的大肠杆菌(图2A-B)。用IPTG诱导pIII的表达，不久后，用CM13辅助噬菌体对细胞进行超感染(图2A)。pIII在只包含有义密码子的文库拷贝的细胞中的表达使这些细胞对超感染免疫(图2B)。将培养基改为含有卡那霉素的培养基，允许具有含有框内琥珀密码子的文库拷贝的细胞选择性生长(图2C)。携带有害突变的文库拷贝的细胞也能通过这种选择。纯化噬菌粒文库(图2D)并用于转化大肠杆菌的琥珀抑制性菌株DH5α(图2E)。在大肠杆菌DH5α中用pIII-敲除的辅助噬菌体补充噬菌粒，允许只从具有含有框内琥珀密码子的肽-pIII文库拷贝的细胞中生产噬菌粒颗粒。
图3说明了超感染选择的结果。图3A显示，在两轮超感染选择过程中，通过在卡那霉素上的生长来监测对超感染敏感的群体(如含有琥珀密码子的克隆)的百分比。第一轮和第二轮之间超感染敏感的细胞数量的增加，表明成功地选择了含有琥珀密码子的文库克隆。图3B显示了第二轮超感染选择后的测序分析，证实了每个克隆中存在框内琥珀密码子。
图4说明了非经典氨基酸(ncAA)遗传纳入噬菌体展示的肽文库。图4A提供了用于将ncAA纳入肽文库的三质粒系统的示意图。图4B显示了苯丙氨酸衍生物1-4的结构。图4C显示了存在和不存在(NA)4mM的ncAA 1-4时的噬菌体产量。产量以每毫升培养基的百万个菌落形成单位显示。误差条代表至少三个独立实验的平均值的一个标准差。图4D显示了赖氨酸衍生物5-7的结构。图4E显示了赖氨酸衍生物5和6存在和不存在(NA)时的噬菌体产量。对于化合物5和6，产量分别以百万或十万个菌落形成单位显示。误差条代表三个独立实验的平均值的一个标准差。
图5说明了所选择的含有ncAA的肽的氨基酸序列。图5A显示了针对链霉亲和素进行第三和第四轮选择后分离的肽的氨基酸序列。图5B显示了针对SIRT2的第三轮选择后分离的肽的氨基酸序列。X代表ncAA mBrF或BuK的位置，其由DNA序列中的琥珀密码子的位置决定。
图6说明了分子动力学模拟和人去乙酰化酶(SIRT)在体外和体内的抑制。图6A显示了SIRT2在与肽S2P03的复合物中的分子动力学模拟(帧95/1000)。SIRT2中与肽中侧接thBuK的残基相互作用的疏水残基以橙色显示。图6B显示S2P04(左)和TB(右)对人去乙酰化酶1-3的抑制。误差条代表至少两个独立实验的平均值的一个标准差。图6C显示了用50μMS2P04、TB或载剂(0.25％DMF)处理24小时的MCF-7和HEK 293T细胞中α-微管蛋白乙酰化和总α-微管蛋白的代表性免疫印迹。
图7说明了选择ENL抑制剂的方法。图7A提供了说明蛋白质靶点和配体之间的相互作用的示意图。图7B显示了将配体融合的ncAA遗传纳入噬菌体展示的肽中，用于活性位点定向结合到蛋白靶点，然后进行严格的洗涤和洗脱，以选择高亲和性和选择性的噬菌体。图7C显示了与PDB条目5HJB的ENL复合的H3K9cr肽的晶体结构。CrK，青色，在F59和Y78之间复合，绿色。
图8提供了多种ENL抑制剂的结构和特性。图8A显示了从噬菌体展示中选择的7CrKEnl1的结构。图8B显示了从噬菌体展示中选择的7CrKEnl2的结构。图8C显示了5-FAM偶联的7CrkENL1与ENL结合的荧光偏振分析。图8D显示了5-FAM偶联的7CrkENL2与ENL结合的荧光偏振分析。表格中显示了第一轮和最后一轮配体的百分比、富集比率和两种配体的解离常数(Kd)。
具体实施方式
应理解，上述的一般性描述和以下的详细描述都是说明性和解释性的，不对要求专利保护的主题构成限制。在本申请中，单数形式的使用包括复数形式，词语“一个”或“一种”表示“至少一个/一种”，“或”字的使用表示“和/或”，除非另有具体说明。此外，使用术语“包括”以及其它形式，如“包含”和“含有”不是限制性的。同时，除非另外具体说明，术语如“元件”或“组件”包括一个单元的元件或组件以及包括超过一个单元的元件或组件。
本文所用章节标题用于组织目的，而不应理解为限制所述内容。本申请引用的包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和条约在内的所有文件或文件的部分，在此通过引用全文纳入本文以用于任何目的。当一篇或多篇所结合的文献及类似材料对术语的定义与本申请对该术语的定义相抵触时，以本申请为准。
与药物发现中使用的传统随机筛选方法相比，噬菌体展示法具有若干优势。这些优势包括简单、成本效益和速度。
例如，可以迅速筛选出与靶标结合的文库，并通过DNA测序最终确定‘选择物(selectant)’。同样地，使用标准而快速的分子生物学方法，可以在噬菌体表面展示出种类繁多的外源肽或蛋白质文库，而不是单独使用基因工程改造的蛋白质或肽变体。
采用大型文库且伴随着高通量筛选的肽噬菌体展示在开发临床上有用的肽和肽模拟物方面发挥了重要作用。例如，在临床应用中，如内分泌科、肿瘤科、泌尿科和妇产科，肽现在被广泛用作治疗药物和诊断方法。此外，在制造成本、活性、稳定性、免疫原性和器官穿透效率方面，肽往往比蛋白质(包括抗体)有许多优势。
事实上，目前肽类药物的年市场规模为3-5亿美元，年增长率为25％。此外，利用噬菌体展示法开发的几种肽类药物已经被批准用于临床，或正在进行临床试验。
第一个上市的肽体(peptibody)Nplate1(罗米司亭(Romiplostim)，AMG 531)，是一种血小板生成素受体的激动剂，用于治疗免疫性血小板减少性紫癜。这种肽体的肽组分经历了大量的开发，但其起源于噬菌体展示的肽文库。
寻找对诊断和治疗目的有用的高亲和性肽和蛋白质也可以通过替代的展示方法来实现，这些方法起源于最初的噬菌体展示概念。这些方法可大致分为细胞表面系统或无细胞展示系统。然而，由于DNA转化效率和展示的分子对宿主细胞的任何毒性，基于细胞的方法受限于文库的大小。
化学修饰策略也被用来改进肽的药代动力学。例如，在肽的N-末端添加官能团(如磷酸酯)，以改进与血清白蛋白或其他血清蛋白的结合，延长半衰期。然而，没有可以将噬菌体展示和化学修饰结合在一起生成肽文库的有效技术。此外，目前还没有将非经典氨基酸纳入细胞表面展示中的有效策略。
上述限制在肿瘤学等领域变得更加明显，在这些领域中，除了20种天然氨基酸之外，潜在的配体靶标还必须负载表观遗传学修饰。本公开的各种实施方式解决了上述限制。
在一些实施方式中，本公开涉及可用于有效地生产含有非经典氨基酸的肽或蛋白质的琥珀专性(amber-obligated)噬菌体展示文库。在一些实施方式中，本公开涉及构建上述琥珀专性噬菌体展示文库的方法。本公开的其他实施方式涉及通过利用本公开的噬菌体展示文库选择结合所需靶标的肽或蛋白质的方法。本公开的进一步实施方式涉及通过利用本公开的方法选择的肽，例如包括一种或多种去乙酰化酶2或ENL抑制剂的组合物。
在一些实施方式中，本公开内容涉及一种通用策略，该策略将作为所需靶标配体(或经化学修饰形成配体)的非经典氨基酸纳入噬菌体展示文库。在一些实施方式中，本公开涉及噬菌体展示文库的构建，其中纳入的非经典氨基酸引导噬菌体展示的肽与所需靶标的配体结合位点结合，并促进选择直接与所需靶标的配体结合位点结合的有效配体。
本公开的进一步实施方式涉及纳入的非经典氨基酸。在一些实施方式中，纳入的非经典氨基酸与和表观遗传酶和表观遗传阅读蛋白直接相互作用的翻译后修饰的氨基酸相同。在一些实施方式中，纳入的非经典氨基酸和结合细胞蛋白的活性位点的非自然氨基酸相同。
琥珀专性噬菌体展示文库
在一些实施方式中，本公开涉及有多个核酸的噬菌体展示文库。该多个核酸包括具有含有组合区域的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸。在一些实施方式中，噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
本公开的其他实施方式涉及构建本公开的噬菌体展示文库的方法。在图1A中说明的一些实施方式中，本公开的方法包括：(a)提供原始噬菌体展示文库，其中原始噬菌体展示文库包括多个具有噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，这些核酸包括组合区域，其中至少某些核酸的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子(步骤10)；(b)将原始噬菌体展示文库转化到细菌宿主细胞中(步骤12)；(c)在转化的细菌宿主细胞中诱导噬菌体衣壳蛋白基因的表达，其中来自仅包含噬菌体衣壳蛋白基因中框内有义密码子的核酸的噬菌体衣壳蛋白的表达使细菌宿主细胞对辅助噬菌体的感染免疫(步骤14)；(d)用辅助噬菌体感染转化的细菌宿主细胞，其中辅助噬菌体编码并表达使被感染细菌对抗生素具有抗性的基因(步骤16)；(e)受感染和未受感染的细菌宿主细胞在含有抗生素的培养基中生长，其中生长的结果是选择受感染的细菌，而受感染的细菌包括辅助噬菌体和具有噬菌体衣壳蛋白基因的至少某些核酸，这些噬菌体衣壳蛋白基因在组合区域中含有至少一个框内琥珀密码子(步骤18)；(f)从细菌细胞宿主细胞中提取核酸(步骤20)；(g)将提取的核酸转化进琥珀抑制性细菌宿主菌株(步骤22)，其中琥珀抑制性细菌宿主菌株被不表达噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，并且，其中，该转化允许从细胞中选择性地生产噬菌体颗粒，所述细胞含有组合区域包含具有至少一个框内琥珀密码子的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸(步骤24)；和(h)从生产的噬菌体颗粒中纯化核酸，以提供本公开的噬菌体展示文库(步骤26)。
本公开的方法可以有许多实施方式。例如，在一些实施方式中，原始噬菌体展示文库是通过定点诱变制备的。
在一些实施方式中，噬菌体展示文库包括多种噬菌体。在一些实施方式中，噬菌体展示文库中的多种核酸包括噬菌体的核酸。
在一些实施方式中，噬菌体展示文库包括多种噬菌粒。在一些实施方式中，噬菌体展示文库中的核酸包括噬菌粒的核酸。
在一些实施方式中，噬菌体衣壳蛋白基因是PIII基因。在一些实施方式中，细菌宿主细胞包括带有F性菌毛的大肠杆菌。
在一些实施方式中，噬菌体衣壳蛋白基因位于IPTG-诱导型启动子附近。在一些实施方式中，通过将细菌宿主细胞暴露于IPTG表达噬菌体衣壳蛋白。
在一些实施方式中，辅助噬菌体是CM13辅助噬菌体。在一些实施方式中，辅助噬菌体编码并表达使受感染的细菌对卡那霉素有抗性的基因。因此，在一些实施方式中，在含有卡那霉素的培养基中发生选择性生长。
本公开的噬菌体展示文库也可以有许多实施方式。例如，在一些实施方式中，噬菌体展示文库中多于90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。在一些实施方式中，噬菌体展示文库中多于95％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。在一些实施方式中，噬菌体展示文库中多于99％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
在一些实施方式中，噬菌体展示文库中至少某些核酸中的组合区域包括多个框内琥珀密码子。在一些实施方式中，多个框内琥珀密码子随机地分布在整个组合区域。在一些实施方式中，至少一个框内琥珀密码子在与蛋白质的配体结合位点结合的肽的区域内。
在一些实施方式中，组合区域编码肽。在一些实施方式中，组合区域编码蛋白质。
选择与所需靶标结合的肽或蛋白质的方法
本公开的其他实施方式涉及通过利用本公开的噬菌体展示文库选择结合所需靶标的肽或蛋白质的方法。在图1B中说明的一些实施方式中，本公开的方法包括：(a)提供本公开的噬菌体展示文库(步骤30)；(b)将噬菌体展示文库转化进细菌宿主细胞(步骤32)，其中细菌宿主细胞能够翻译噬菌体衣壳蛋白基因的组合区域，使得组合区域中的框内琥珀密码子编码所需非经典氨基酸，其中，细菌宿主细胞被不表达噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，并且，其中，转化允许生产含有组合区域中具有所需非经典氨基酸的噬菌体衣壳蛋白的噬菌体颗粒(步骤34)；(c)针对所需靶标筛选噬菌体颗粒(步骤36)，其中筛选的结果是选择具有与所需靶标结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒(步骤38)；以及(d)鉴定所选择的噬菌体颗粒组合区域的氨基酸序列，以鉴定所选肽或蛋白质(步骤40)。
在更具体的实施方式中，本公开涉及通过以下步骤选择与所需靶标的配体结合位点结合的肽的方法：(a)提供包括多种核酸的噬菌体展示文库，其中多种核酸包括具有噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，该基因包括组合区域，其中噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子，并且该至少一个框内琥珀密码子位于与所需靶标的配体结合位点结合的肽的编码区域内；(b)将噬菌体展示文库转化进细菌宿主细胞，其中细菌宿主细胞能够翻译噬菌体衣壳蛋白基因的组合区域，使得至少一个框内琥珀密码子编码一个所需的非经典氨基酸，其中细菌宿主细胞与不表达噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，并且，其中，转化允许生产出含有组合区域中具有所需非经典氨基酸的噬菌体衣壳蛋白的噬菌体颗粒；(c)针对所需靶标筛选噬菌体颗粒，其中筛选的结果是选择具有与所需靶标的配体结合位点结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒，其中非经典氨基酸作为配体引导噬菌体衣壳蛋白组合区域至所需靶标的配体结合位点；以及(d)鉴定所选噬菌体颗粒的组合区域的氨基酸序列。
本公开的选择方法还可以有许多实施方式。例如，在一些实施方式中，针对所需靶标通过亲和性选择进行筛选步骤。在一些实施方式中，进行筛选通过以下步骤进行：(1)用固定在表面上的所需靶标孵育噬菌体颗粒；(2)将未结合的噬菌体颗粒与结合所需靶标的噬菌体颗粒分开；以及(3)分离结合的噬菌体颗粒。在一些实施方式中，分开步骤可能通过将未结合的噬菌体颗粒从结合所需靶标的噬菌体颗粒洗去来进行。
在一些实施方式中，所需靶标可被生物素化并固定在链霉亲和素表面。在一些这种实施方式中，进行筛选可通过以下方式进行：(1)将噬菌体颗粒与固定在链霉亲和素表面的所需靶标孵育；(2)通过洗涤步骤将未结合的噬菌体颗粒与结合所需靶标的噬菌体颗粒分开；以及(3)通过利用生物素竞争性地洗脱已结合的噬菌体颗粒，或通过添加酸性缓冲液(例如，pH 2)以释放结合的噬菌体颗粒，来分离结合的噬菌体颗粒。
在一些实施方式中，该筛选可进行多次。例如，在一些实施方式中，筛选步骤进一步包括：(1)将所选的噬菌体颗粒转化进细菌宿主细胞，以允许生产其他噬菌体颗粒；以及(2)根据步骤(c)再筛选噬菌体颗粒(如上文概述并如图1B中步骤36所说明的)。在一些实施方式中，该进一步筛选可重复多次。
在一些实施方式中，筛选的结果是选择具有与所需靶标的配体结合位点结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒。在一些实施方式中，非经典氨基酸作为配体将噬菌体衣壳组合区域引导到所需靶标的配体结合位点。在一些实施方式中，配体抑制一种或多种表观遗传酶或表观遗传阅读蛋白的活性。
也可以利用多种方法来鉴定所选择的噬菌体颗粒的组合区域的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，通过测序所选择的噬菌体颗粒的组合区域进行鉴定。在一些实施方式中，鉴定通过以下方式进行：(1)纯化所选择的噬菌体颗粒；(2)将核酸从所选择的噬菌体颗粒中分离；以及(3)测序所述核酸的组合区域。
本公开的方法也可以利用各种细菌宿主细胞。例如，在一些实施方式中，细菌宿主细胞是琥珀抑制性细菌宿主菌株。在一些实施方式中，细菌宿主细胞包含琥珀抑制子tRNA，该琥珀抑制子tRNA已经通过同源的氨酰基-tRNA合成酶由所需非经典氨基酸氨酰基化。在一些实施方式中，所需的非经典氨基酸在翻译过程中由琥珀抑制子tRNA响应于框内琥珀密码子而纳入。
在更具体的实施方式中，细菌宿主细胞是已经被三个质粒转化的细菌：(1)编码噬菌体衣壳蛋白基因的质粒，该基因在组合区域中具有至少一个框内琥珀密码子；2)编码琥珀抑制子tRNA和同源氨酰基-tRNA合成酶的质粒，该酶能将所需非经典氨基酸连接到抑制子tRNA上；以及(3)编码除了含有组合区域的噬菌体衣壳蛋白之外的所有必需的噬菌体蛋白质的辅助噬菌体。
可以利用本公开的方法将各种非经典氨基酸纳入噬菌体衣壳蛋白的组合区域中。例如，在一些实施方式中，所需的非经典氨基酸包括但不限于苯丙氨酸衍生的非经典氨基酸、赖氨酸衍生的非经典氨基酸，及其组合。在一些实施方式中，所需的非经典氨基酸包括但不限于：S-2-氨基-8-氧代壬酸、S-氨基-8-氧代癸酸、N6-乙酰基-L-赖氨酸、N6-丙酰基-L-赖氨酸、N6-丁酰基-L-赖氨酸、N6-巴豆酰基-L-赖氨酸、N6-(丙-2-炔-1-基)-赖氨酸、N6-甲基-N6-N6-(丙-2-炔-1-基)-赖氨酸，及其组合。上述非经典氨基酸的结构如图1D所示。
本公开的方法可用于针对多种所需靶标筛选噬菌体衣壳蛋白的组合区域中的肽或蛋白质。例如，在一些实施方式中，所需靶标包括但不限于肽、蛋白质、酶、小分子、细胞受体、抗原、蛋白质的配体结合位点、所需靶标的活性位点、蛋白质的活性位点及其组合。在一些实施方式中，所需靶标是蛋白质的配体结合位点。在一些实施方式中，配体结合位点是蛋白质的活性位点。在一些实施方式中，配体结合位点是所需蛋白质的变构位点。在一些实施方式中，所需靶标是酶，例如去乙酰化酶2。
去乙酰化酶2的抑制剂
本公开的其他实施方式涉及通过利用本公开的方法选择的去乙酰化酶2的肽抑制剂。本公开的更具体的实施方式涉及包括去乙酰化酶2抑制剂的组合物。在一些实施方式中，去乙酰化酶2的抑制剂包括但不限于：(a)CTVXTSL；(b)TCTVXIG；(c)CTFXVPT；(d)CTVXI；(e)ZTVXI；或(f)其组合。在一些实施方式中，X是非经典氨基酸。在一些实施方式中，Z是非经典氨基酸或氨基丁酸。
在一些实施方式中，去乙酰化酶2的抑制剂是NH2-CTVXTSL-NH2(S2P03)。在一些实施方式中，去乙酰化酶2的抑制剂是NH2-TCTVXIG-NH2(S2P04)。在一些实施方式中，去乙酰化酶2的抑制剂是NH2-CTFXVPT-NH2(S2P07)。在一些实施方式中，去乙酰化酶2的抑制剂是Ac-CTVXI-NH2(Ac-S2P04-5)。在一些实施方式中，去乙酰化酶2的抑制剂是NH2-ZTVXI-NH2，其中Z是氨基丁酸(S2P04(Abu)-5)。
SNL的抑制剂
本公开的进一步实施方式涉及通过利用本公开的方法选择的SNL的肽抑制剂。本公开的更具体的实施方式涉及包括SNL抑制剂的组合物。在一些实施方式中，SNL的抑制剂包括但不限于：(a)DIWCFXG；(b)SXDIWCF；或(c)其组合。在一些实施方式中，X是非经典氨基酸。
在一些实施方式中，SNL的抑制剂是DIWCFXG。在一些实施方式中，SNL的抑制剂是SXDIWCF。
应用与优势
本公开的方法和噬菌体展示文库可以有各种优势和应用。例如，在一些实施方式中，本公开的方法允许高效地将非经典氨基酸纳入被展示的肽，以扩大噬菌体展示文库的结构和功能多样性。此外，本公开的方法可用于生成适于进行定向进化所需的迭代轮次的选择和扩增的文库，从而允许从巨大的多肽文库中快速鉴定新型肽配体和单克隆抗体，这些文库携带的官能团不限于在20个经典氨基酸中发现的那些。
在更具体的实施方式中，本公开的噬菌体展示文库和选择方法可用于配体结合位点定向配体进化，以鉴定在体外和体内都有活性的含有非经典氨基酸的抑制剂。在一些实施方式中，所述抑制剂可以包括锌依赖性和NAD依赖性HDAC抑制剂，它们以高特异性与酶的活性位点区域结合。
在一些实施方式中，本公开的噬菌体展示文库和选择方法可用于生成肽文库，以筛选和发现表观遗传调控中具有增加的药物效力的先导分子。
现将参考本公开的更具体的实施方式和为这些实施方式提供支持的实验数据。但是，申请人说明以下公开仅用于说明目的，并不意在以任何方式限制所要求保护的主题的范围。
实施例1.伴随有活性位点定向配体进化的琥珀-密码子-专性噬菌体展示系统以
协助药物发现
噬菌体展示技术能够从巨大的多肽文库中快速鉴定新型肽配体和单分子抗体。然而，这些文库仅限于二十种经典氨基酸。使用正交氨酰基-tRNA合成酶和tRNA，该组库(repertoire)可以被扩大到包括非经典氨基酸(ncAA)。然而，低效ncAA纳入使得噬菌体文库出现偏差，限制了这种技术的广泛采用。
在本实施例中，申请人报告了被称为超感染选择(superinfection-selection)的方法，用于构建每个克隆都含有框内琥珀密码子编码的ncAA的噬菌体展示文库。这种琥珀-密码子-专性文库消除了因ncAA低效纳入到展示肽中而产生的偏差。申请人证明，这些文库适于进行定向进化所需的迭代轮次的选择和扩增。利用这种技术，申请人生成了含有遗传编码的赖氨酸翻译后修饰的肽文库，并将该文库用于在体外和人类癌细胞中抑制去乙酰化酶2的肽的活性位点定向配体进化。
噬菌体展示是广泛使用的工具，用于从大型组合多肽文库中选择肽配体和单克隆抗体。在这种技术中，DNA文库被克隆为与编码噬菌体衣壳蛋白基因的遗传融合。当融合蛋白被表达并整合到病毒衣壳时，多肽文库被‘展示’在病毒的表面。这种配置在展示的肽和它的编码DNA之间建立了物理连接，允许在细菌宿主中扩增文库，并在几轮靶标定向选择后进行便捷的肽序列测定。噬菌体展示文库已用于许多应用，从表位映射到鉴定酶的抑制剂和蛋白-蛋白相互作用，多种噬菌体衍生的肽和抗体已被批准用于制药用途或处于后期临床试验阶段。然而，由于噬菌体展示文库是在大肠杆菌中表达的，这些库中的肽限制于20个经典氨基酸，这大大限制了它们可以用来探索的序列空间。
利用正交的氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)和tRNA对，研究人员已经能够人为地将遗传密码扩展到纳入许多非经典氨基酸(ncAA)，承担各种功能，跨多种宿主生物体。在这项技术中，ncAA在翻译过程中被一个正交抑制子tRNA纳入，以响应一个重定义的无义密码子，该正交抑制子tRNA已经被其同源的aaRS用ncAA选择性地氨酰基化。将无义抑制应用于噬菌体展示，先前的研究已经证明了将几个ncAA遗传纳入到展示在噬菌体表面的蛋白质和肽中。然而，已经证明含有ncAA的多肽的选择是极具挑战性的，主要是由于含有ncAA的噬菌体克隆的繁殖偏差(propagation bias)。这种偏差是由低效的终止密码子抑制导致的，其限制了肽衣壳融合蛋白的生产，由此，相对于那些只含有典型氨基酸的克隆，降低了含有ncAA的克隆的繁殖率。尽管已经从这些类型的文库中选择了含有ncAA的肽和蛋白质，但是对高效aaRS-tRNA对和表达条件的广泛优化的需求阻止了这种技术的广泛采用。
为了克服表达偏差的挑战，申请人开发了用于构建每个克隆都含有框内琥珀密码子编码的ncAA的噬菌体展示文库的通用方法。申请人在本实施例中证明了这种‘琥珀密码子专性’文库适于展示包含各种ncAA的肽，从而大大扩展了噬菌体展示的应用。申请人通过生成一个展示在M13噬菌体的次要衣壳蛋白(minor coat protein)(pIII)N-末端的琥珀-密码子-专性七肽文库，验证了文库构建的方法。申请人进一步证明，这种类型的文库适用于将苯丙氨酸衍生的和赖氨酸衍生的ncAA都纳入的迭代轮次的扩增和选择。最后，申请人使用包含遗传编码的赖氨酸翻译后修饰的文库，以选择与赖氨酸脱酰酶去乙酰化酶2的活性位点结合的肽。申请人证明这些肽的衍生物是在体外和体内去乙酰化酶2催化的赖氨酸去乙酰化的有效抑制剂。
实施例1.1.琥珀-密码子-专性噬菌体展示文库的构建
通过使用覆盖32个密码子(包括一个琥珀密码子)并编码所有20个经典氨基酸的简并引物的定点饱和诱变，构建了能够展示包含ncAA的肽的噬菌体展示文库。先前的构建琥珀-密码子-专性文库的方法利用其中琥珀密码子(因而ncAA)的位置固定而所有其他位置随机化的引物对。申请人寻求构建更加多样化的文库，其中琥珀密码子的位置可以随机地分布在整个肽序列中。为了构建这样的文库，理论上可以使用引物对组合，所述引物对中琥珀密码子的位置经改变以覆盖序列中的每个位置。除了可能通过克隆产物的不等混合使文库出现偏差外，这种引物组合的方法并没有解决与基于引物的DNA文库构建相关的共同的问题。合成错误，如核苷酸缺失，尽管它们发生频率低，但在寡核苷酸引物中是不可避免的。
因此，在使用这种方法时，不可避免地将没有琥珀密码子的克隆引入文库。这些不依赖终止密码子抑制的克隆将比琥珀编码的克隆有明显的生长优势。在噬菌体生产过程中，这种繁殖偏向将导致这些克隆被富集并逐渐掩盖琥珀编码的克隆。申请人在涉及固定一个琥珀编码位点的平行研究中观察到这个问题。
鉴于缺少解决这一问题的替代方法，申请人开发了用于构建允许ncAA随机分布的琥珀-编码-专性噬菌体文库的通用方法。该方法利用了丝状(Ff)噬菌体生物学的一种现象，称为超感染免疫。简言之，超感染免疫描述了被感染的细菌对同一类型噬菌体的进一步感染(超感染)的抗性。对于感染了Ff噬菌体的大肠杆菌来说，超感染免疫是由噬菌体外壳蛋白pIII赋予的，该蛋白在宿主中是由驻留噬菌体(resident phage)表达。内源性表达的pIII与TolA结合，TolA是大肠杆菌细胞表面蛋白，被Ff噬菌体用作宿主吸附的受体。内源性pIII与TolA的结合阻断竞争性噬菌体的吸附，因此也阻断其超感染。
申请人构建琥珀-密码子-专性噬菌体展示文库的策略包括两个步骤。第一步中，申请人构建了原始文库作为与噬菌体外壳蛋白pIII的遗传融合。该文库是用简并引物构建的，因此，包括有琥珀密码子的序列和只有有义密码子的序列。第二步，被称为“超感染选择”，申请人利用超感染免疫的原理来选择含有琥珀密码子的文库成员，从文库池中除去那些只含有义密码子的文库成员。
申请人首先构建了一个原始的与pIII融合的组合七肽文库。为了克隆该文库，申请人通过定点饱和诱变将7个随机化(NNK)的密码子引入pADL-10b噬菌粒上pIII的N-末端遗传融合。克隆后，申请人用纯化的文库转化电感受态大肠杆菌Top10 F’，产生了1.4x109个独特的转化体(理论肽多样性＝1.8x109)。
接下来，申请人进行了超感染选择，以选择含有框内琥珀密码子的文库克隆。申请人将具有噬菌粒文库的大肠杆菌Top10 F’在补充有氨苄青霉素和四环素的培养基中生长到早期对数期，此时申请人通过添加IPTG诱导pIII的表达(图2A)。在这些条件下，全长的pIII在只有有义密码子的文库拷贝的细胞中表达。然而，翻译终止阻止了pIII在具有含有琥珀密码子的文库拷贝的细胞中表达(图2B)。
由于内源性pIII赋予了超感染免疫，所以前者对超感染免疫，后者对超感染易感。在诱导pIII表达后，申请人用带有赋予卡那霉素抗性的基因的CM13辅助噬菌体感染培养物。在用CM13进行超感染后，申请人将培养基改为一种含有25μg·mL-1卡那霉素的培养基，这种培养基允许对超感染敏感的细胞(即那些具有含框内琥珀密码子的文库拷贝的细胞)选择性地生长(图2C)。
在一轮超感染选择后，申请人测序了几个文库中的克隆。测序结果显示，还富集了多个在肽或pIII编码区含有有害突变的克隆，以及含有琥珀密码子的克隆。这些突变阻止了功能性pIII的表达，从而使克隆通过了选择。
为了消除这些不期望的克隆群体，申请人纯化了噬菌粒文库，并使用纯化的文库转化大肠杆菌DH5α。DH5α是响应琥珀密码子纳入谷氨酰胺的大肠杆菌supE菌株。因此，在该菌株中表达所述文库允许在含有琥珀密码子的克隆中生产全长的pIII，但在包含有害突变的克隆中则不能。
申请人用M13KO7(pIII-)补充噬菌粒文库，M13KO7(pIII-)是辅助噬菌体，其在基因III中含有无义(TAA)突变因而不能产生其自身的pIII。用M13KO7(pIII-)补充导致来自肽序列中含有琥珀密码子的克隆的噬菌粒颗粒选择性表达(图2D-E)。为了确认成功地除去有害的克隆，申请人在表达后测序了几个噬菌粒。申请人测序的在DH5α中表达的克隆中没有一个含有会阻止pIII表达的有害突变。通过DH5α传代后，申请人纯化了噬菌粒颗粒，并用它们感染大肠杆菌Top10 F’以供另一轮超感染选择。
在两轮超感染选择中，申请人通过测量对超感染敏感的大肠杆菌群体的百分比来监测琥珀密码子的富集。在第一轮中，18％的种群对CM13辅助噬菌体的超感染是敏感的。这与预测在7个NNK密码子的文库中19.9％的克隆含有至少一个琥珀密码子的理论计算相一致(基于二项分布，采用1/32的琥珀密码子概率)。在第二轮选择后，大于98％的群体对超感染是敏感的，这表明在第1轮和第2轮之间，含有琥珀密码子的克隆数量有很大的增加(图3A)。
第二轮超感染选择后的文库测序证实了选择成功，因为申请者测序的所有克隆(n＝10)都在随机序列中含有一个琥珀密码子(图3B)。这些数据证明，超感染选择是生成琥珀-密码子-专性噬菌体展示文库的有效策略。
实施例1.2.ncAA遗传纳入噬菌体展示肽
申请人使用吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶(PylRS)的衍生物与其同源的琥珀抑制性tRNA
结合，测试了苯丙氨酸和赖氨酸衍生物在琥珀-密码子-专性文库中的遗传纳入。申请人首先测试了含有苯环的邻位和间位取代的苯丙氨酸衍生物的纳入。为了将这些ncAA纳入肽文库，申请人利用了先前报道的在N346和C348位置含有丙氨酸突变的PylRS突变体(PhdRS)。为了表达噬菌粒颗粒，申请人用三个质粒转化大肠杆菌Top10：1)pADL(NNK)7gIII，编码琥珀-密码子-专性肽-pIII文库，2)pEDF-PhdRS，包含编码PhdRS和
的基因，以及3)M13KO7(pIII-)，编码除了pIII以外的所有必需噬菌体蛋白(图4A)。申请人在补充有4mM的四种苯丙氨酸衍生物1-4其中之一(图4B)的2xYT培养基中培养转化的细胞，与不添加ncAA的生长培养基相比，噬菌粒颗粒产量增加36至83倍(图4C)。
ncAA依赖性的颗粒产量增加与
对琥珀密码子的抑制是一致的，表明ncAA成功地纳入了噬菌体展示的肽文库中。在没有ncAA的情况下，低水平的背景噬菌粒的产生可能是由于苯丙氨酸的纳入，因为申请人已经表明，尽管程度很小，
利用苯丙氨酸的错误氨酰化(mis-aminoacylation)是进化的PylRS中常见的现象。
申请人成功纳入苯丙氨酸衍生物后，接下来申请人测试了赖氨酸衍生物纳入肽文库。申请人选择了两个赖氨酸衍生物来测试它们的纳入：Nε-丁酰基-赖氨酸(5，BuK)和Nε-巴豆酰基-赖氨酸(6，CrK)(图4D)。这两种ncAA代表了天然的赖氨酸翻译后修饰。因此，包含这些ncAA的肽文库可以证明对研究与这些修饰有天然相互作用的酶很有用。
为了纳入BuK和CrK，申请人使用了先前报道的在Y384位置含有色氨酸突变的PylRS突变体(BuKRS)。申请人已经证明，BuKRS与
一起，可以促进大肠杆菌中BuK和CrK响应琥珀密码子的有效纳入。申请人在含有pEDF-BuKRS和M13KO7(pIII-)的大肠杆菌Topl0中表达了噬菌粒文库，其导致在没有ncAA的情况下，颗粒的产量极少。然而，向生长培养基中加入5mM的BuK或CrK导致颗粒产量增加近100倍，表明这些ncAA成功地纳入了噬菌体展示的肽文库中(图4E)。
实施例1.3.在多轮扩增中维持文库完整性
基于噬菌体展示的定向进化实验需要能经受迭代轮次的扩增和靶向选择的强大文库。如果用于文库构建的超感染-选择策略不能成功地去除所有只包含有义密码子的克隆，或者如果获得的突变在扩增期间导致琥珀密码子丢失，有利于这些序列的繁殖偏差将阻碍选择工作。
为了研究申请人的琥珀-密码子-专性文库在面对迭代轮次的扩增和选择时的完整性，申请人进行了针对链霉亲和素的模拟选择。申请人将在ncAA3(mBrF)存在下表达的噬菌体展示的七肽文库(约5x1010c.f.u.)与固定化的链霉亲和素靶标孵育，通过洗涤除去未结合的噬菌粒颗粒，并用0.1mM生物素竞争性地洗脱特异性结合的颗粒。每轮选择后，申请人扩增洗脱的大肠杆菌Top10中的含有pEDF-PhdRS和M13KO7(pIII-)的噬菌粒颗粒，以供进一轮的选择。
申请人总共进行了四轮扩增和选择。在第三轮(n＝6)和第四轮(n＝12)后对噬菌粒克隆进行了测序。值得注意的是，即使在四轮扩增之后，所有被测序的克隆都在肽序列中含有mBrF，这一点由框内琥珀密码子的存在表明(图5A)。这些数据证明，超感染选择的方法产生了强大的文库，可以经受定向进化所需的迭代轮次的扩增。
实施例1.4.选择含有Nε-丁酰基-赖氨酸的肽作为去乙酰化酶2的抑制剂
去乙酰化酶(sirtuin)是一组NAD+-依赖的赖氨酸脱酰酶，其催化NAD+和Nε-酰基-赖氨酸转化为赖氨酸和O-酰基-ADP核糖。作为蛋白质的赖氨酸酰化水平的调节剂，去乙酰化酶被认为是从基因转录和DNA修复到代谢和衰老的各种细胞过程的关键调节剂。因此，去乙酰化酶已成为人类疾病治疗干预的有希望的靶标。最近，去乙酰化酶2(SIRT2)的抑制剂，一种主要定位于细胞质的去乙酰化酶同种型，已被证明在人类癌症的细胞和动物模型中具有显著的抗癌活性。SIRT2抑制剂还在治疗与年龄有关的神经退行性疾病方面显示出前景。因此，目前人们对开发有效和选择性的SIRT2抑制剂非常感兴趣。
申请人设想，含有遗传编码的酰基赖氨酸ncAA的噬菌体展示肽文库可用于活性位点定向配体进化，以揭示与SIRT2活性位点结合的肽序列。为此，申请人使用琥珀-密码子-专性文库表达了包含BuK残基的超过3亿条肽的文库，并在这个文库中选择与SIRT2结合的序列。
使用具有pEDF-BuKRS和M13KO7(pIII-)的大肠杆菌菌株，申请人表达了琥珀-密码子-专性文库，并使纯化的噬菌粒文库经历针对重组人SIRT2的亲和性选择。为了避免在选择过程中催化去除丁酰基修饰，申请人在没有NAD+的情况下针对载脂(apo)SIRT2进行了选择。申请人分离出在第三轮亲和性选择后被洗脱的噬菌粒克隆，并测序其DNA(n＝20)。图5B显示了在针对SIRT2的第三轮选择后分离的克隆的肽序列。
针对SIRT2的亲和性选择后的噬菌粒测序显示，该群体已集中于主要涉及紧邻BuK残基的残基的共有序列。与针对SIRT2筛选修饰肽文库的两项先前研究一致，申请人观察到缬氨酸和亮氨酸残基在紧邻BuK的N-端位置(-1位置)的富集。申请人还观察到苯丙氨酸在这个位置上的强烈富集。申请人观察到在紧邻BuK的C-端(+1位)脂肪族侧链的氨基酸的强富集，其中超过50％的分离克隆在此位置有异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸。
总之，这些发现表明SIRT2对于具有与修饰的赖氨酸邻近的疏水残基的序列的底物偏好。为了进一步了解所选的肽如何与酶相互作用，申请人对与SIRT2形成复合体的肽进行了分子动力学模拟。模拟结果显示，酰基赖氨酸残基的侧接残基与SIRT2的Phe235和Leu239残基之间有疏水相互作用(图6A)。这一观察对于为什么申请人和其他人员观察到对于肽底物中这些位置上疏水残基的偏好给出了可能的解释。同样与先前的发现一致，申请人观察到+3位置的丝氨酸和苏氨酸残基的富集。已经证明+3位置的苏氨酸与SIRT2的Gln265产生氢键合相互作用，为这一观察提供了合理解释。在申请人选择的所有测序的克隆中，25％包含共有基序Cys-Thr-Val/Phe-BuK-Val/Ile。
已经证明，用缓慢水解的硫代酰胺(thioamide)类似物取代去乙酰化酶底物的酰基赖氨酸酰胺部分是抑制去乙酰化酶的有效策略。因此，申请人用Nε-硫代丁酰-赖氨酸(7，thBuK)(图6D)代替BuK，化学合成了含有Cys-Thr-Val/Phe-Buk-Val/Ile基序的各个选定肽，并测试了合成肽对SIRT2的抑制。申请人利用TB(表1)作为参考化合物，其为最近报道的有效的SIRT2选择性抑制剂。
表1概括了所选肽和TB的抑制活性。值表示为两次独立实验的平均值±标准差。
申请人测试的所有三种肽对SIRT2的抑制作用都显著优于TB(高达45倍)，IC50值在68-101nM之间(表1)。由于在申请人的选择中发现的共有基序只包括文库中七个残基中的五个，申请人还合成了其中一个肽(S2P04-5)的截短形式，其只包含共有基序的五个残基。S2P04-5抑制SIRT2的IC50为136±29nM，略高于其亲本肽S2P04。这一观察表明，尽管BuK远端位置的残基身份可能并不关键，但诸如骨架氢键合的相互作用仍可能有助于酶与配体的结合。
申请人通过测量S2P04对另外两种也识别赖氨酸丁酰化的去乙酰化酶(SIRT1和SIRT3)的抑制特性来测试其对SIRT2的选择性。S2P04对SIRT2的抑制作用比SIRT1和SIRT3分别强2.7倍和152倍(图6B)。这种选择性与TB的测量结果相当，然而，对于每种酶，S2P04的效力至少比TB高33倍。
最后，申请人测试了S2P04(具有中等效力的所选择的肽)在人胚肾细胞(HEK293T)和乳腺癌细胞(MCF-7)中抑制SIRT2的能力。为了测试对SIRT2的抑制作用，申请人将细胞培养物在含有50μM S2P04、TB或载剂对照的培养基中孵育24小时。用抑制剂孵育后，申请人测量了α-微管蛋白的赖氨酸40的乙酰化水平，其为已知的SIRT2的去乙酰化底物。
申请人观察到在用S2P04处理的MCF-7和HEK 293T细胞中，α-微管蛋白的乙酰化都有增加，但对MCF-7细胞系的影响最大(图6C)。与对照组相比，用TB处理的MCF-7细胞也显示α-微管蛋白乙酰化增加。然而，该效果低于在S2P04观察到的。这一观察结果与TB在体外的低效力相一致。在用TB处理的HEK 293T细胞中没有观察到α-微管蛋白乙酰化的增加。
在观察到S2P04在体内抑制SIRT2后，申请人合成了该肽的两种缩短衍生物：Ac-S2P04-5和S2P04(Abu)-5。前者包含一个N-末端乙酰化，可能有助于细胞渗透性和蛋白水解稳定性，后者包含一个氨基丁酸(Abu)来取代半胱氨酸，更具有氧化还原稳定性。虽然这两种肽在体外都能抑制SIRT2(表1)，但与S2P04相比，这两种肽在体内都没有导致乙酰化水平的更大提高。这些数据证明，通过超感染选择方法构建的噬菌体展示文库可用于活性位点定向配体进化，以鉴定含有ncAA的具有体外和体内活性的抑制剂。
实施例1.5.讨论
申请人开发了用于构建噬菌体展示的肽文库的方法，其中每个成员都包含响应随机分布的琥珀密码子编码的ncAA。在这个实施例中虽然申请人的重点是构建短肽文库，但是较大的蛋白质(如抗体)通常也展示在丝状噬菌体的表面。由于超感染选择依赖于Ff噬菌体生物学的固有特性，这种方法不受文库设计或大小的限制。因此，理论上超感染选择可用于在pIII展示的通用约束下生成大得多的肽和蛋白质文库。
申请人通过生成一个展示在M13噬菌体上的融合到pIII蛋白的N-末端的琥珀-密码子-专性七肽文库，验证了文库构建的方法。申请人进一步证明，来自该文库的噬菌粒颗粒的表达依赖于生长培养基中ncAA的添加。之前的涉及噬菌体文库遗传密码扩展的研究仅限于高效的aaRS/ncAA对，以最小化含有ncAA的文库克隆的表达偏差。然而，琥珀-密码子-专性文库消除了这种偏差。因此，尽管它们的纳入效率不同，但申请人测试的每一个ncAA都易于被纳入到噬菌体展示的肽中，而无需优化。
迄今，超过150个含有天然翻译后修饰、生物正交官能团、光谱探针和其他独特的化学和结构基序的ncAA已经通过无义抑制进行了遗传编码。本实施例中报告的方法提供了易于生成包含这些不同的ncAA的肽文库的方法，可以设想该肽文库的众多应用。
作为该技术的实用性的证明，申请人产生了包含自然发生的翻译后修饰的肽文库，并将该文库用于与SIRT2结合的肽的活性位点定向配体进化。对经过三轮选择后的噬菌体颗粒进行测序，发现肽的序列与先前针对SIRT2的文库筛选一致，验证了申请人的结果。
用thBuK取代BuK合成的选择的肽被证明是SIRT2催化的赖氨酸去乙酰化的有效抑制剂。尽管所选择的肽保留了与TB相当的同种型选择性，但其更高的效力导致了体内对SIRT2的抑制更强。由于SIRT1和SIRT2在其活性位点和肽结合裂隙周围有很高的序列同源性，S2P04和TB的去乙酰化酶选择性相似并不令人惊讶。BuK含有一个化学部分，可以自然地引导肽与SIRT2活性位点结合。这种活性位点定向配体进化可以扩展到其他遗传编码的ncAA(如甲基赖氨酸)，用于鉴定组蛋白去甲基化酶配体。虽然在本实施例中没有报告，但是通过高通量筛选鉴定的小分子配体可以共价附接到ncAA上并展示在噬菌粒上，允许鉴定有机肽配体。总之，申请人认为琥珀-密码子-专性噬菌体展示技术与活性位点定向配体进化相结合，将在药物发现领域具有很大应用。
实施例1.6.分子克隆
噬菌粒文库构建
包含编码pIII的基因的噬菌粒pADL-10b购自抗体设计实验室(AntibodyDesignLabs)。为了在pIII的N-末端引入七个位点的文库，用引物pADL-g3-P1：5'-CATGCCATGGCC(NNK)7GCGGCGAAAGCGG-3’和引物pADL-g3-P2：5'-CATGCCATGGCCGGCTGGGCCGC-3’对噬菌粒进行PCR扩增。用NcoI消化PCR产物，连接，并用以转化电感受态大肠杆菌Top10 F’(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))。将小等分的转化的细胞接种到琼脂选择平板上以量化转化效率，其余的培养物在新鲜的2xYT培养基中稀释，在37℃下生长过夜。次日，通过离心收获细胞，将其重悬在含有20％甘油的1/10体积的2xYT中，并将等分保存在-80℃，以供之后超感染选择。
M13KO7(pIII-)
辅助噬菌体M13KO7购自(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))。为了生产M13KO7的pIII缺陷衍生物用于噬菌粒补充，申请人通过定点诱变在基因3的K10位置引入了TAA突变。用引物M13gIII-1：5’-CCTTCCCTCCCTTAATCGGTTGAATG-3’和引物M13gIII-2：5'-CATTCAACCGATTAAGGGAGGGAAGG-3’扩增噬菌体载体，以得到M13KO7(pIII-)载体。
pEDF-PylRS
为了在编码
和PylRS突变的pEVOL构建体上将复制起点从p15A改成CloDF，使用引物CloDFori-1：5'-TTGGCGCGCCCAATTAGCTAGCTCACTCGGTC-3’和引物CloDFori-2：5'-TGTTCCTAGGGATAAATTGCACTGAAATCTAG-3’，从质粒pCDF-1(EMO密理博公司(EMD Millipore))中扩增CloDF起点。使用引物pEVOLori-1：5'-TGTTCCTAGGTCTTCAAATGTAGCACCTGAAG-3’和引物pEVOLori-2：5'-TTGGCGCGCCCCTTTTTTCTCCTGCCACATG-3’将PCR产物克隆到已被引入先前报道的pEVOL-PhdRS和pEVOL-BuKRS构建体中的AscI和AvrII位点中，以分别获得pEDF-PhdRS和pEDF-BuKRS。
实施例1.7.超感染选择用于琥珀密码子富集
对于第一轮的超感染选择，将含有原始噬菌体文库的大肠杆菌Top10 F’在37℃在含有100μg·mL-1氨苄青霉素和10μg·mL-1四环素的2xYT培养基中培养。达到OD600≈0.3后，通过加入0.2mM IPTG诱导pIII的表达。诱导30分钟后，用CM13辅助噬菌体(抗体设计实验室，1x1011p.f.u.，MOI≈15)对培养物进行超感染，并在37℃下再孵育40分钟。超感染后，通过离心沉淀细胞，重悬在含有100μg·mL-1氨苄青霉素、25μg·mL-1卡那霉素和1mM IPTG的新鲜2xYT培养基中，并在37℃下生长过夜。次日，沉淀细胞，用商购质粒抽提试剂盒(新时代生命科学有限公司(Epoch Life Sciences，Inc.))从细胞中纯化出质粒。噬菌粒文库与辅助噬菌体分离，并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
在第一轮超感染选择之后，将噬菌粒通过大肠杆菌DH5α以去除含有无功能的pIII的克隆。包含M13KO7(pIII-)辅助噬菌体的大肠杆菌DH5α(Lucigen)被纯化的噬菌粒文库转化，在2xYT培养基中恢复1小时，然后在含有100μg·mL-1氨苄青霉素、25μg·mL-1卡那霉素和1mM IPTG的2xYT中生长过夜。次日沉淀细胞，在冰上加入1/5体积的5x噬菌体沉淀溶液(2.5M NaCl，20％PEG 8,000)，从上清中沉淀出噬菌体颗粒。通过离心将沉淀的颗粒沉淀，然后重悬在1/10体积的PBS中。通过离心将重悬液澄清，并将上清液在65℃下孵育15分钟以杀死残留的大肠杆菌。
对于第二轮超感染选择，将纯化的噬菌粒颗粒(3.7x109c.f.u.，MOI≈0.1)加入到100mL在补充有10μg·mL-1四环素的2xYT培养基中的对数中期大肠杆菌Top10 F’的培养物中。培养物在37℃下孵育1小时，然后用含有100μg·mL-1氨苄青霉素和0.5mM IPTG的新鲜2xYT按1∶1稀释。培养物在37℃下孵育至OD600≈0.4，然后取出60mL，用CM13辅助噬菌体(1x1011p.f.u.，MOI≈10)感染。培养物再孵育45分钟，然后将细胞沉淀，重悬在500mL补充有100μg·mL-1氨苄青霉素、25μg·mL-1卡那霉素和1mM IPTG的新鲜2xYT培养基中。然后将培养物在37℃下孵育过夜，次日按上述方法提取并纯化噬菌粒文库。
实施例1.8.噬菌粒颗粒和噬菌体定量
在所有的实验中，噬菌粒颗粒和噬菌体都是通过菌落形成单位试验(colonyforming unit assay)来定量的。在该试验中，在2xYT培养基中制备噬菌体溶液的连续稀释液，并将每个稀释液的10μL加入90μL对数期的大肠杆菌Top10 F’中。加入噬菌体稀释液后，将培养物在37℃下孵育45分钟，然后取10μL点样到含有100μg·mL-1氨苄青霉素(噬菌粒)或25μg·mL-1卡那霉素(噬菌体)的琼脂选择板上，在37℃下培养过夜。次日，计数各个接种斑点的菌落，用该数字计算溶液中菌落形成单位的数。
实施例1.9.噬菌粒颗粒表达与纯化
为了表达具有苯丙氨酸衍生物的琥珀-密码子-专性噬菌粒文库，申请人使用了先前报道的吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶突变体，该突变体在N346和C348位置含有丙氨酸突变(PhdRS)。PhdRS及其同源的tRNA
由含有CloDF复制起点的pEVOL质粒(称为pEDF-PhdRS)表达。来自第二轮超感染选择的琥珀-密码子-专性文库被用来转化含有M13KO7(pIII-)和pEDF-PhdRS的大肠杆菌Top10，产生6.92x108个转化体。在含有100μg·mL-1氨苄青霉素、34μg·mL-1氯霉素和25μg·mL-1卡那霉素的200mL 2xYT培养基中在37℃下将转化的细胞培养至OD600≈0.5，此时加入1mM IPTG和0.2％阿拉伯糖诱导蛋白表达，并将培养物分进两个烧瓶。向一个烧瓶中加入苯丙氨酸衍生物1-4中的一种，最终浓度为4mM。诱导后，将温度改为30℃，表达噬菌粒颗粒18-24小时。
为了表达带有赖氨酸衍生物的噬菌粒颗粒，申请人使用了先前报道的含有Y384W突变的PylRS突变体(BuKRS)。19BuKRS和
由上述pEDF构建体表达。用琥珀-密码子-专性文库转化含有M13KO7(pIII-)和pEDF-BuKRS的电感受态大肠杆菌Top10，产生3.1×109个转化体。颗粒的表达与用于苯丙氨酸衍生物的描述的完全一致，除了在诱导时向生长培养基中加入5mM烟酰胺。
为了纯化纳入ncAA的噬菌粒颗粒，通过离心沉淀细胞，并将上面80mL的培养基转移到一个新的试管中。向澄清的培养基中加入20mL的5x噬菌体沉淀溶液，将混合物在4℃下孵育过夜。次日，离心沉淀颗粒，倾除上清液，并将沉淀在10mL的pH7.4的PBS中重悬。剩余的细胞离心沉淀，通过在1x噬菌体沉淀溶液中孵育过夜，再次沉淀噬菌粒颗粒。第二次沉淀后，通过离心沉淀颗粒，将沉淀重悬于1mL PBS中。剩余的细胞离心沉淀，溶液在65℃下孵育15分钟以杀死任何剩余的大肠杆菌。如上所述，对纯化的噬菌粒颗粒进行定量，并立即用于选择实验。
实施例1.10.重组蛋白制备
去乙酰化酶1
含有质粒pQE80-His6-SIRT1的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在3L补充有100μg·mL-1氨苄青霉素的2xYT培养基中生长到OD600为0.7，此时加入0.5mM IPTG诱导蛋白表达。诱导4小时后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀储存在-80℃直到纯化。
将细胞沉淀重悬于50mL裂解缓冲液(50mM Tris pH 8.0，250mM NaCl，10mM咪唑，0.1mM苯基甲磺酰氯(PMSF)，1％Triton X-100)，并与1mg·mL-1溶菌酶(鸡蛋白)在冰上孵育30分钟。孵育后，将重悬液超声处理两次(1秒开，1秒关，共1分钟，60％输出)，并通过离心澄清。向澄清的上清液中加入4mL50％的高亲和性充Ni树脂(Genscript)浆液，将混合物在4℃上下颠倒旋转(end-over-end rotation)孵育30分钟。30分钟后，将混合物通过一次性柱子过滤，用40mL含有0.1％Triton X-100的裂解缓冲液洗涤树脂，然后再用40mL不含TritonX-100的裂解缓冲液洗涤。用7mL洗脱缓冲液(含250mM咪唑的裂解缓冲液)洗脱结合的蛋白质，并将洗脱的蛋白质装载到HiPrep 26/10脱盐柱(GE医疗公司(GE Healthcare))，该柱已用Source 15Q缓冲液A(20mM Tris pH 8.0，50mM NaCl，0.2mM DTT，10％甘油)预平衡。将脱盐的蛋白质通过超滤浓缩至1mL(10kDa MWCO)，并施加于10mL用Source 15Q缓冲液A预平衡的Source 15Q柱(GE医疗公司)。用3个CV(2mL·min-1)的Source 15Q缓冲液A洗柱子，然后用0-60％线性梯度的Source 15Q缓冲液B(20mM Tris pH 8.0，1M NaCl，0.2mM DTT，10％甘油；1mL·min-1)洗脱5个CV。含有SIRT1的级分被浓缩并储存在-80℃。由280nm处的吸光度使用计算消光系数40,340M-1·cm-1测定酶的浓度。
去乙酰化酶2
含有质粒pHEX-His6-SIRT2的大肠杆菌Top10在37℃下在2L含有100μg·mL-1氨苄青霉素的2xYT培养基中生长到OD600为0.6，此时加入0.1mM IPTG诱导SIRT2表达。诱导2小时后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀储存在-80℃直到纯化。
解冻细胞沉淀并重悬在含有50mM NaH2PO4pH 8.0，300mM NaCl，10mM咪唑，0.1mMPMSF的40mL裂解缓冲液中。重悬的沉淀在1mg·mL-1溶菌酶的存在下在冰上孵育30分钟。孵育后，将重悬液超声处理两次(1秒开，1秒关，共1分钟，60％输出)，并通过离心澄清。向澄清的上清液中加入4mL 50％的高亲和性充Ni树脂(Genscript)浆液，将混合物在4℃上下颠倒旋转(end-over-end rotation)孵育30分钟。30分钟后，将混合物通过一次性柱子过滤，用40mL含有裂解缓冲液洗涤树脂，用7mL洗脱缓冲液(含有250mM咪唑的裂解缓冲液)洗脱结合蛋白。随后的纯化步骤取决于该蛋白是否用于生物素化和亲和性选择或抑制试验。
对于亲和性选择，通过超滤(10kDa MWCO)将洗脱的蛋白浓缩到1mL，用QSepharose缓冲液A(50mM NaH2PO4 pH 8.0，50mM NaCl，0.1mM DTT)1∶9稀释，并再次浓缩到1mL。浓缩的样品被施加于25mL用Q Sepharose缓冲液A预平衡的Q Sepharose柱(GE医疗公司)。用2CV(2mL·min-1)缓冲液A洗涤柱子，并用0-100％线性梯度的缓冲液B(50mM NaH2PO4pH 8.0，1M NaCl，0.1mM DTT)洗脱蛋白，洗脱3个CV(2mL·min-1)。将主峰的级分合并并浓缩到1mL，用于生物素化。
为了进行抑制试验，将洗脱的蛋白质装载到HiPrep 26/10脱盐柱(GE医疗公司)，该柱已用Source 15Q缓冲液A(20mM Tris pH 8.0，50mM NaCl，0.2mM DTT，10％甘油)预平衡。将脱盐的蛋白质通过超滤浓缩至1mL(10kDa MWCO)，并施加于10mL用Source 15Q缓冲液A预平衡的Source 15Q柱(GE医疗公司)。用3个CV(2mL·min-1)的Source 15Q缓冲液A洗柱子，然后用0-60％线性梯度的Source 15Q缓冲液B(20mM Tris pH 8.0，1M NaCl，0.2mMDTT，10％甘油；1mL·min-1)洗脱5个CV。含有纯SIRT2的级分被浓缩并储存在-80℃。由280nm处的吸光度使用计算消光系数32,470M-1·cm-1测定酶的浓度。
去乙酰化酶3
含有质粒pGEX4T-GST-SIRT3的大肠杆菌Top10在37℃下在2L补充有100μg·mL-1氨苄青霉素的2xYT培养基中生长到OD600为0.6，此时加入2mM IPTG诱导蛋白表达。诱导2小时后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀储存在-80℃直到纯化。
将细胞沉淀重悬于50mL裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，0.1mMPMSF，1％Triton X-100)，并在1mg·mL-1溶菌酶的存在下在冰上孵育30分钟。孵育后，将重悬液超声处理两次(1秒开，1秒关，共1分钟，60％输出)，并通过离心澄清。向澄清的上清液中加入3mL 50％的固定化的谷胱甘肽树脂(Genscript)浆液，将混合物在4℃上下颠倒旋转孵育30分钟。30分钟后，将混合物通过一次性柱子过滤，用50mL含有0.1％Triton X-100的裂解缓冲液洗涤树脂。洗涤后，用10mL含有10mM还原谷胱甘肽但不含Triton X-100的裂解缓冲液洗脱结合的蛋白质。将洗脱液直接装载到HiPrep 26/10脱盐柱(GE医疗公司)，该柱已用50mM Tris pH 7.5，150mM NaCl，0.2mM DTT和10％甘油预平衡。脱盐后的蛋白质被浓缩并储存在-80℃。由280nm处的吸光度使用计算消光系数80,790M-1·cm-1测定酶的浓度。
实施例1.11.去乙酰化酶2的生物素化
SIRT2(53μM)在PBS pH 7.4中用10倍摩尔过量的EZ-LinkTM NHS-生物素(赛默飞世尔科技公司)在冰上轻柔振荡2小时，进行生物素化。反应结束后，将溶液直接装载到用50mM Tris pH 8.0、250mM NaCl、0.2mM DTT和10％甘油预平衡的Superdex 7510/300GL尺寸排阻柱(GE医疗公司)。通过超滤(10kDa MWCO)浓缩洗脱的蛋白，快速冷冻，并储存在-80℃。如前所述，使用2μg生物素化的SIRT2，通过在磁性链霉亲和素珠子(Genscript)上的捕获来确认蛋白质的生物素化，然后进行SDS-PAGE和Coomassie染色。
实施例1.12.针对链霉亲和素的亲和性选择
将冻干的链霉亲和素(Chem-Impex国际有限公司(Chem-Impex International，Inc.)溶于0.1M NaHCO3，(pH 8.6)，浓度为25μg·mL-1。用1.5mL的蛋白溶液涂覆在聚苯乙烯培养皿(60x15mm)上，在封口湿盒中4°孵育过夜。除去蛋白溶液后，用含有5mg·mL-1BSA和0.1μg·mL-1链霉亲和素的0.1M NaHCO3在4℃下封闭该板2小时。用2mL PBST(含0.1％Tween-20的PBS，pH7.5)洗涤板6次，然后将纯化的噬菌体文库(2x1010-4x1011c.f.u.)与靶标在室温下孵育1小时(第1-3轮)或30分钟(第4轮)。与纳入ncAA的噬菌粒颗粒孵育后，用PBST洗板10次，然后用1mL的0.1mM D-生物素溶液孵育30分钟，竞争性地洗脱结合的噬菌粒颗粒。
实施例1.13.针对去乙酰化酶2的亲和性选择
对于亲和性选择，生物素化的SIRT2通过链霉亲和素涂覆的磁珠捕获(第1轮和第3轮)或中性亲和素涂覆的聚苯乙烯板上(第2轮)被固定。对于第1轮和第3轮的选择，100μL的链霉亲和素涂覆的磁珠(50％浆液，GenScript)用PBS洗两次，然后分成两管。在一个试管中加入400μL PBS中的生物素化的SIRT2(10μg)，在另一个试管中加入同等体积的缓冲液。两管都在室温下孵育20分钟。孵育后，除去上清液，用1mL含有5mg·mL-1BSA的0.1M NaHCO3pH8.6在室温下旋转封闭珠子30分钟。封闭后，从没有SIRT2的试管中除去上清液，用PBST洗三次，用PBS洗一次，用纯化的噬菌体文库(，2.9x1010-6.2x1010c.f.u.)在1mL PBS中缓慢旋转孵育30分钟，进行负选择。负选择后，沉淀珠子，上清液被转移到含有SIRT2的珠子上，该珠子已如上所述洗涤过。噬菌体文库在室温下与固定化的靶标旋转孵育30分钟。选择后，除去上清液，用PBST洗涤珠子10次。在第三次、第六次和第九次洗涤后，将珠子转移到新的试管中，将展示与聚丙烯管结合的肽的噬菌粒颗粒除去。洗涤后，将结合的颗粒在100μL的50mM甘氨酸pH2.2中孵育恰好10分钟洗脱。10分钟后，除去上清液，用50μL 1M Tris pH 8.0中和。
对于第2轮选择，预封闭的中性亲和素涂覆聚苯乙烯板(Pierce)的8个孔用250μLPBS洗涤3次，然后将100μL PBS中的生物素化的SIRT2(1.25μg)加入每个孔。将平板在室温下在封口湿盒中孵育30分钟，以允许生物素化的SIRT2靶标被捕获。然后用PBST洗涤三次，再用PBS洗一次，将800μL PBS中的噬菌体文库(5.4x109c.f.u.)均匀地分配到各孔中。噬菌粒颗粒与固定化的靶标孵育30分钟，然后除去上清液，每个孔用250μL PBST洗涤10次。洗涤后，将结合的噬菌粒颗粒在100μL的50mM甘氨酸pH2.2中孵育恰好10分钟洗脱。10分钟后，从各个孔中汇集洗脱的颗粒并用400μL 1M Tris pH 8.0中和。
实施例1.14.噬菌粒扩增
在每一轮选择之后，洗脱的噬菌粒颗粒通过含有M13KO7(pIII-)辅助噬菌体和质粒pEDF-PhdRS(用于纳入mBrF)或pEDF-BuKRS(用于纳入BuK)的大肠杆菌Top10传代进行扩增。保留10μL洗脱的噬菌粒颗粒用于滴定，剩余的溶液用于感染20mL大肠杆菌Top10 F’的培养物，在37℃下感染45分钟。感染后，沉淀细胞并重悬在100-300mL含有100μg·mL-1氨苄青霉素的2xYT培养基中，并在37℃下扩增过夜。次日，使用商购质粒抽提试剂盒纯化噬菌粒文库，纯化的文库用于转化含有M13KO7(pIII-)和合适的pEDF-aaRS构建体的电感受态大肠杆菌Top10。对转化的小部分进行滴定，以确保转化体的数量超过前一轮洗脱的噬菌粒颗粒的数量至少100倍。转化的细胞直接用于表达噬菌粒颗粒，用于下一轮选择。
实施例1.15.分子动力学模拟
一般信息
基于晶体结构PDB 4X3O，通过模拟在类似抑制剂的位置上不同的肽的相互作用，研究肽与NAD+反应后的蛋白质环境。
(2017-4版本)39和Desmond软件用于所有模拟。研究蛋白质-肽相互作用的每个模拟都遵循以下所述步骤。
蛋白质准备模块
在PDB中，有几个可获得的SIRT2的结构。通过覆盖这些条目，由它的许多环明显看出SIRT2是一个柔性构象蛋白质。然而，肽抑制剂结合的结构域是有些不柔性的区域。选择4X3O晶体结构作为模板结构，是因为它包含类似的硫代肉豆蔻酰基(thiomyristoyl)-赖氨酸肽，其被修饰成靶标肽(S2P03、S2P04、S2P07、S2P04-5和Ac-S2P04-5)，而且因为在可获得的晶体结构中，它的缺失残基最少，分辨率最高。使用
软件中的蛋白质制备向导(Protein Preparation Wizard)以制备4X3O.pdb结构，在7.5±0的pH下进行模拟。保持晶体结构水。使用PrimeLoop算法来填补缺失的残基(Met299-Gly304)。初步制备之后，使用PROPKA工具在7.5±0的pH下对H-键合网络进行了优化，对水分子取向进行采样，并使用OPLS3力场对所有原子进行了约束最小化。
系统生成器模块：分子动力学模拟的准备
使用Desmond模块中的系统生成器(System Builder)工具(注：这在随Desmond分发的
软件Maestro界面中)准备Desmond MD-模拟的模型。在应用溶剂盒之前进行了改造，将原始的硫代肉豆蔻酰基-赖氨酸肽转化为靶标肽。在肽-蛋白质组件周围构建了距离为
的正交晶溶剂盒(orthorhombic solvent box)。在将显式水分子(explicit water molecule)应用到系统中之前，溶剂盒的尺寸被最小化。TIP4P水模型用于显式水分子，OPLS3力场用于所有其他原子。使用浓度为0.15M的生理NaCl对蛋白质-肽组件进行电荷中和。
Desmond模块：分子动力学模拟
所有的运行使用Desmond仿真(multisim)分子动力学方案，使用NPT套系(1.0135巴，310.15K)，10ns的生产运行，每10ps拍摄快照，产生1000帧的轨迹。在生产运行之前，系统被置于一个松弛方案中，在Desmond
软件Maestro界面中实现，概述如下：
1.约束最小化步骤
2.布朗动力学NVT，T＝10K，小时间步长(small time step)，对溶质重原子的约束，100ps
3.NVT，T＝10K，小时间步长，对溶质重原子的约束，12ps
4.NVT，T＝10K，对溶质重原子的约束，12ps
5.NVT，对溶质重原子的约束，12ps
6.NPT且无约束，24ps
7.生产运行
蛋白质-肽相互作用图
导入MD-模拟结果，然后使用Desmond分布式
软件中的配体相互作用图模块生成配体相互作用表。结果表明，在肽抑制剂中，只有thBuK残基相邻的残基产生疏水相互作用。附图显示了在1000帧中发生相互作用的帧(橙色条)。
实施例1.16.肽合成
在Rink-酰胺树脂上使用N，N，N′，N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)六氟磷酸铀(HBTU)作为偶联剂，通过手动基于Fmoc的固相肽合成合成肽。Rink-酰胺MBHA树脂(Novabiochem，100mg，取代：0.78mmol g-1)在10mL DMF中溶胀1小时。脱保护、偶联和裂解反应在室温下于玻璃反应容器中进行，并在以下条件下进行上下颠倒旋转搅拌：
脱保护
将20％哌啶在DMF中的溶液(v∶v，5mL)加入到溶胀的树脂中，持续5分钟。洗涤树脂(3x5mL DMF)并重复脱保护反应15分钟。第二次脱保护反应后，再次洗涤树脂(5x5mL DMF，2x5mL DCM)。
偶联
每个偶联反应包含溶解在5mL DMF中的Fmoc-保护的氨基酸(312μmol，4当量)、HBTU(304.2μmol，3.9当量)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，780μm0l，10当量)。用HBTU和DIPEA对Fmoc-保护的氨基酸进行了5分钟的预活化，然后加入到树脂中40分钟。40分钟后，再次洗涤树脂(5x5mL DMF，2x5mL DCM)。
N-末端乙酰化
为了合成具有N-末端乙酰化修饰的Ac-S2P04-5，在最后一次Fmoc脱保护后，洗涤树脂(5x5mL DMF，3x5mL DCM)，然后在室温下用乙酸酐、吡啶和DMF(1∶2∶3，v∶v∶v)的溶液旋转孵育1小时。然后裂解肽并同时进行侧链脱保护，如下所述。
裂解和脱保护
在最后的Fmoc脱保护后，洗涤树脂(5x5mL DMF，5x 5mL DCM)，将肽从树脂上裂解下来，同时使用7mL裂解混合物(包含88％三氟乙酸(TFA)、5％酚、5％H2O和2％三异丙基硅烷(v∶w∶v∶v))，在氮气保护下进行两小时的侧链脱保护。两小时后，过滤并洗涤树脂(2x1mL裂解混合物)，用氮气流将合并的滤液减至约4mL。将浓缩的溶液滴加到冷乙醚(40mL)中，在冰上孵育10分钟。通过离心收集沉淀的肽，用冷乙醚(20mL)洗涤两次，在氮气流下干燥，并储存在-20℃。
纯化
将粗制肽溶解在DMF中，在C18柱(Alltech，10x250mm，10μm，
孔或Supelco，10x250mm，5μm，
孔)上进行半制备的RP-HPLC纯化。溶剂A：含0.1％TFA的水，溶剂B：含0.1％TFA的乙腈。肽在30分钟内以线性梯度从20-50％的溶剂B洗脱。将含有纯化的肽的级分合并并冻干，得到蓬松的白色粉末。肽的质量通过MALDI-TOF质谱确认。肽的纯度根据215nm处的HPLC踪迹测定，所有使用的肽的纯度都大于90％。
实施例1.17.去乙酰化酶抑制剂试验
使用最近报道的荧光性通用去乙酰化酶底物(JPT肽科技有限公司(JPT PeptideTechnologies，GmbH))进行SIRT1-3的抑制试验。抑制反应是以50μL的体积在37℃下在黑色半面积96孔板中进行的。将去乙酰化酶(0.25μM)与不同浓度的合成肽(SIRT1和SIRT2为0.0064-50μM，SIRT3为0.5-100μM)或TB(SIRT1-3为0.16-150μM)和1mM NAD+在试验缓冲液(20mM Tris pH 7.8，150mM NaCl，5mM MgCl2，1mM DTT)中预孵育15分钟。孵育后，加入底物(5μM)开始反应，在BioTek Synergy H1酶标仪中，在λEx＝320nm、λEm＝408nm(增益＝130，读高＝7mm)，持续5分钟(SIRT2)或30分钟(SIRT1和SIRT3)，通过每20秒测量一次荧光强度，监测产物形成。产物形成的初始速率通过荧光强度与时间的线性回归来确定，并相对于0％活性(最大抑制)和100％活性(无抑制)对照进行归一化。通过使用GraphPad Prism对归一化初始速率与抑制剂浓度曲线进行非线性回归确定IC50值。
实施例1.18.细胞培养和蛋白质印迹
将购自美国典型培养物保藏中心的MCF-7(HTB-22)和HEK293T(CRL-11268)细胞在含有10％胎牛血清(英杰公司(Invitrogen))的达氏改良伊氏培养基(英杰公司)中于37℃、5％CO2气氛中生长。在6孔板(Falcon353046)中以5x 105个活细胞/孔接种细胞，生长24-48小时至60-70％汇合。吸出培养基，用含有50μM合成肽、TB或载剂对照(0.25％DMF)的培养基替换。与抑制剂孵育24小时后，去除培养基，用冰冷PBS(英杰公司)清洗细胞两次。在含有25mM Tris pH7.4、150mMNaCl、10％甘油、4mM MgCl2、0.2mM DTT、1％NP-40、25mM烟酰胺、5μM曲古抑菌素A和1：100稀释的蛋白酶抑制剂混合物(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))的缓冲液中冰上裂解细胞30分钟。通过离心澄清裂解液，用BCA测定试验(皮尔斯)定量，并将等分试样储存在-80℃。细胞裂解物(15或20μg)在变性条件下通过SDS-PAGE在12％的丙烯酰胺凝胶上解析，然后转移到0.2μm的硝化纤维素膜上(伯乐公司(Bio-Rad))。乙酰化(K40)α-微管蛋白和总α-微管蛋白分别用一抗克隆6-11B-1和B-5-1-2探测，这些克隆购自西格玛奥德里奇(1∶2,000稀释)。一抗用HRP-偶联的山羊抗-小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)，1∶10,000稀释)探测。化学发光信号用SuperSignalTM ELISA Pico化学发光底物(赛默飞世尔科技公司)产生，并用伯乐公司的ChemiDoc XRS+成像系统进行观察。
实施例2.鉴定ENL抑制剂
急性髓性白血病(AML)是一种以异常成髓细胞不受控制的增殖为特征的疾病，是最常检出和最致命的白血病亚型。在美国，据估计，每年有21,450人被诊断为AML，10,920人将死于该病，几乎占所有白血病亚型的所有死亡人数的一半。
现已清楚，几种类型的AML细胞的生存与ENL有关，ENL是组蛋白的表观遗传阅读器。ENL蛋白通过其N-末端YEATS结构域与酰化组蛋白H3结合，然后将RNA聚合酶II招募到白血病细胞中高度表达的原癌基因。白血病细胞中ENL蛋白的敲除或突变对其生长有明显的抑制作用，并增加其分化。
因此，如果ENL与乙酰化组蛋白的结合被抑制，白血病细胞中原癌基因的转录应该被下调，这导致对AML的潜在靶向治疗。在本实施例中，申请人描述了一种由噬菌体辅助的、活性位点定向配体进化技术，能够容易地筛选出具有纳摩尔亲和性的潜在抑制剂。
基于肽的抑制剂优于小分子，对涉及大的、相对平坦的表面的蛋白质的结合提供令人满意的亲和性和选择性。肽也易于筛选。例如，使用噬菌体显示技术，一个研究人员可能在几天内筛选出有超过1010种独特的肽的文库。
然而，由于噬菌体展示肽是在大肠杆菌中表达的，这限制了细菌翻译的编码能力，使其仅有20个经典氨基酸(cAA)构建模块，限制了可开发的序列和化学成分。此外，传统的噬菌体展示通常依赖于随机化文库的使用，并且通常与任何已知的蛋白质-配体相互作用无关联，这可能会限制模仿强相互作用的能力。
因此，为了扩大文库的化学多样性并利用20个cAA所不具备的独特的化学相互作用，申请人将非经典氨基酸(ncAA)纳入噬菌体展示系统。图7A-B显示了提出的由噬菌体辅助的、活性位点定向配体进化方法，其中具有已知的结合靶标蛋白能力的弹头被安装在ncAA中，其可以被遗传纳入噬菌体展示的序列随机化肽文库中。在噬菌体展示肽中，弹头预期与结合位点相互作用，并作为锚与靶标酶的配体结合腔结合，而侧接配体融合的ncAA的氨基酸残基在肽结合沟提供额外的相互作用，以提高亲和性和选择性。
最近的研究发现，YEATS结构域的配体结合位点的两个芳香族残基F59和Y78可以与Nε-巴豆酰基赖氨酸(CrK，图7C)的偶联π系统形成π-π-π堆叠作用。受这一发现的启示，申请人决定将CrK纳入实施例1中描述的噬菌体展示系统，并利用由ncAA产生的π-π-π相互作用将肽文库引导到含YEATS结构域的蛋白的活性部位。
在本实施例中，申请人首先构建了一个21个碱基对的DNA文库，该文库编码来自NNK三联体核苷酸的7个随机氨基酸。为了遗传纳入CrK，申请人应用实施例1中所述的基于超感染免疫的技术，构建了琥珀专性噬菌粒文库。所得的琥珀专性文库可以使用申请人先前进化的PylRS琥珀抑制系统进行表达(ACS chemical biology 2013，8(8)，1664-70)。
为了证明活性位点配体进化的概念，针对已经生物素化并固定在链霉亲和素涂覆磁珠上的ENL淘选展示的肽文库。一旦与靶标蛋白结合，表达的肽文库经清洗以去除非特异性结合，用酸性变性条件洗脱，并在大肠杆菌中扩增。选择过程进行了四次，以筛选出高亲和性和选择性的抑制剂。在四轮选择中，噬菌体产量显著增加，第一轮和第四轮之间相差540倍。
另外，在四轮选择之后，使用Illumina下一代测序分析文库区域。这得到了两个强共有序列，7CrKEnl1和7CrKEnl2(图8A-B)，在第四轮选择后，这两个序列占总噬菌体的98％，第一轮和第四轮之间分别富集了540倍和300倍。为了测定7CrKEnl1和7CrKEnl2对ENL的亲和性，申请人合成了5-FAM偶联的肽，然后用荧光偏振分析表征它们与ENL的结合。结果表明，7CrKEnl1的解离常数为94nM，7CrKEnl2的解离常数为90nM(图8C-D)。总之，图8中的结果证明了使用我们的遗传编码噬菌体辅助的活性位点定向配体进化在鉴定用于治疗性蛋白质靶标的有效肽抑制剂方面的成功应用。
无需进一步阐述，据信本领域技术人员可以通过本文的描述，最充分地利用本发明的内容。本文所述的实施方式应被理解为说明性的，而不是以任何方式限制本公开的其余部分。虽然示出并描述了实施方式，但是本领域技术人员可以在不偏离本发明的精神和教导的情况下可以对其进行许多变化和修改。因此，保护范围不受上述描述的限制，而只受权利要求的限制，包括权利要求主题的所有等同物。本文中列举的所有专利、专利申请和出版物的公开内容都通过引用纳入本文，在此范围内它们提供程序或其他细节与本文所述的相符并对其进行补充。
序列表
<110> 得克萨斯A&M大学系统(THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM)
<120> 制作和利用琥珀专性噬菌体展示文库的方法
<130> 13260-P182WO
<150> US 62/813,340
<151> 2019-03-04
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 去乙酰化酶2抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 1
Cys Thr Val Xaa Thr Ser Leu
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 去乙酰化酶2抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 2
Thr Cys Thr Val Xaa Ile Gly
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 去乙酰化酶2抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 3
Cys Thr Phe Xaa Val Pro Thr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 去乙酰化酶2抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 4
Cys Thr Val Xaa Ile
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 去乙酰化酶2抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(1)
<223> X是非经典氨基酸或氨基丁酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 5
Xaa Thr Val Xaa Ile
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SNL抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (6)..(6)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 6
Asp Ile Trp Cys Phe Xaa Gly
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SNL抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (2)..(2)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 7
Ser Xaa Asp Ile Trp Cys Phe
1 5
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码琥珀-密码子-专性肽-pIII文库的部分质粒
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(2)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (4)..(5)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(14)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(17)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (19)..(20)
<223> n是a, c, g或t
<400> 8
nnknnknnkn nknnknnknn k 21
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P04-5
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 9
Cys Thr Val Xaa Ile
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P04(Abu)-5
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(1)
<223> X是Abu
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 10
Xaa Thr Val Xaa Ile
1 5
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pADL-g3-P1引物
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(14)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (16)..(17)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (19)..(20)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (22)..(23)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (25)..(26)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (28)..(29)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (31)..(32)
<223> n是a, c, g或t
<400> 11
catgccatgg ccnnknnknn knnknnknnk nnkgcggcga aagcgg 46
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pADL-g3-P2引物
<400> 12
catgccatgg ccggctgggc cgc 23
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M13gIII-1引物
<400> 13
ccttccctcc cttaatcggt tgaatg 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M13gIII-2引物
<400> 14
cattcaaccg attaagggag ggaagg 26
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CloDFori-1引物
<400> 15
ttggcgcgcc caattagcta gctcactcgg tc 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CloDFori-2引物
<400> 16
tgttcctagg gataaattgc actgaaatct ag 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEVOLori-1引物
<400> 17
tgttcctagg tcttcaaatg tagcacctga ag 32
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEVOLori-2引物
<400> 18
ttggcgcgcc ccttttttct cctgccacat g 31
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 19
tcgttgtagt tgcagcattc t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 20
tagagtgcta ttacgtattg t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 21
atttagattc atccgtattt t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 22
tatagtatta agtggtaggt t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 23
ggtgcgtaga ggccggggat g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 24
cgtatgcatt aggcgttttt t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 25
actacttata ctggtgatta g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 26
ggttcgttgc atgttcatta g 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 27
tagttgcatc cggggatgcg t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自噬菌体展示的框内琥珀密码子片段
<400> 28
tattagactg attctgatgc t 21
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP01
<220>
<221> MISC_特征
<222> (2)..(2)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 29
Lys Xaa Asn Phe Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP02
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 30
Lys Trp Lys Val Xaa Thr Ser
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP03
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 31
Thr Trp Xaa Lys Ser Asn Trp
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP04
<220>
<221> MISC_特征
<222> (7)..(7)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 32
Met Ala Lys Pro Gln Arg Xaa
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP05
<220>
<221> MISC_特征
<222> (6)..(6)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 33
Arg Glu His Lys Pro Xaa Asn
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP06
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 34
Lys Leu Xaa Lys His Tyr Pro
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP09
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 35
Lys Leu Xaa Lys His Tyr Pro
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP10
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 36
Lys Leu Xaa Lys His Tyr Pro
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP11
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 37
Lys Leu Xaa Lys His Tyr Pro
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP12
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 38
Lys Leu Xaa Lys His Tyr Pro
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP13
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 39
Lys His Xaa Lys Ala Ile Pro
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP14
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 40
Lys Met Xaa Pro Gln Arg Asn
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP15
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 41
Lys Met Xaa Pro Gln Arg Asn
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP16
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 42
Lys Met Xaa Pro Gln Arg Asn
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP17
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 43
Lys Met Xaa Pro Gln Arg Asn
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP18
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 44
Lys Met Xaa Pro Gln Arg Asn
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP19
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 45
Lys Trp Cys Xaa Asn Cys Arg
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SAP20
<220>
<221> MISC_特征
<222> (6)..(6)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 46
Ser Ala Ala Lys Thr Xaa Ile
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P01
<220>
<221> MISC_特征
<222> (2)..(2)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 47
Leu Xaa Met Thr Ser Ile Leu
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P02
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 48
His Leu Xaa Thr Phe Phe Tyr
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P03
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 49
Cys Thr Val Xaa Thr Ser Leu
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P04
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 50
Thr Cys Thr Val Xaa Ile Gly
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P05
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 51
Thr Cys Thr Val Xaa Ile Gly
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P06
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 52
Thr Cys Thr Val Xaa Ile Gly
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P07
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 53
Cys Thr Phe Xaa Val Pro Thr
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P08
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 54
Trp Ser Gly Phe Xaa Ala Pro
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P09
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 55
Trp Ser Gly Phe Xaa Ala Pro
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P10
<220>
<221> MISC_特征
<222> (2)..(2)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 56
Phe Xaa Leu Glu Ser Phe Leu
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P11
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 57
Ser Asn Val Phe Xaa Val Ile
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P12
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 58
Ala Phe Xaa His Met Thr Val
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P13
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 59
Gln Met Arg Phe Xaa Pro Ile
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P14
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 60
Gln Met Arg Phe Xaa Pro Ile
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P15
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(1)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 61
Xaa Val Cys Ser Cys Tyr Ala
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P16
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(1)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 62
Xaa Val Cys Ser Cys Tyr Ala
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P17
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 63
Cys Trp Trp Cys Xaa Val Ser
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P18
<220>
<221> MISC_特征
<222> (6)..(6)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 64
Thr Glu Ser Asn His Xaa Gly
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P19
<220>
<221> MISC_特征
<222> (7)..(7)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 65
Leu Phe Leu Trp Met Pro Xaa
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2P20
<220>
<221> MISC_特征
<222> (4)..(4)
<223> X是非经典氨基酸
<400> 66
Ser Pro Met Xaa Asn Lys Val
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ENL抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (6)..(6)
<223> X是CrK
<400> 67
Asp Ile Trp Cys Phe Xaa Gly
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ENL抑制剂
<220>
<221> MISC_特征
<222> (2)..(2)
<223> X是CrK
<400> 68
Ser Xaa Asp Ile Trp Cys Phe
1 5
Claims (67)
1.一种构建噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：
(a)提供原始噬菌体展示文库，
其中所述原始噬菌体展示文库包括多种核酸，
其中所述多种核酸包括具有含组合区域的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，和
其中至少某些所述核酸的所述组合区域包含至少一个框内琥珀密码子；
(b)将原始噬菌体展示文库转化进细菌宿主细胞中；
(c)诱导所述噬菌体衣壳蛋白基因在所述转化的细菌宿主细胞中表达；
其中来自仅包含噬菌体衣壳蛋白基因中框内有义密码子的核酸的噬菌体衣壳蛋白质的表达使得所述细菌宿主细胞对辅助噬菌体的感染免疫；
(d)用所述辅助噬菌体感染所述转化的细菌宿主细胞，
其中所述辅助噬菌体编码并表达使所述受感染的细菌对抗生素有抗性的基因；
(e)在含有抗生素的培养基中培养所述受感染的和未感染的细菌宿主细胞，
其中所述培养导致对于所述受感染的细菌的选择，和
其中所述受感染的细菌包含所述辅助噬菌体和包括在组合区域中具有至少一个框内琥珀密码子的所述噬菌体衣壳蛋白基因的至少某些核酸；
(f)从所述细菌细胞宿主细胞中提取所述核酸；
(g)将所述提取的核酸转化进琥珀抑制性细菌宿主菌株，
其中所述琥珀抑制性细菌宿主菌株由不表达所述噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，和
其中所述转化允许从含有核酸的细胞中选择性生产所述噬菌体颗粒，所述核酸包括在组合区域中具有所述至少一个框内琥珀密码子的所述噬菌体衣壳蛋白基因；和
(h)从所述生产的噬菌体颗粒中纯化所述核酸以提供所述噬菌体展示文库，
其中噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体展示文库中多于90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体展示文库中多于95％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
4.如权利要求1所述方法，其中所述噬菌体展示文库中多于99％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体衣壳蛋白基因是PIII基因。
6.如权利要求1所述的方法，其中通过定点诱变制备所述原始噬菌体展示文库。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌体，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌体的核酸。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌粒，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌粒的核酸。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体展示文库中至少某些核酸中的组合区域包括多个框内琥珀密码子。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述多个框内琥珀密码子随机地分布在整个组合区域。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述组合区域编码肽。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述组合区域编码蛋白质。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌宿主细胞包括带有F性菌毛的大肠杆菌。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体衣壳蛋白基因位于IPTG诱导型启动子附近，其中所述噬菌体衣壳蛋白是通过将所述细菌宿主细胞暴露于IPTG而表达的。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述辅助噬菌体是CM13辅助噬菌体。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述辅助噬菌体编码并表达使受感染的细菌对卡那霉素有抗性的基因。
17.一种噬菌体展示文库，其包括多种核酸，
其中所述多种核酸包括具有含组合区域的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，
其中所述噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
18.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述噬菌体展示文库中多于90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
19.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述噬菌体展示文库中多于95％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
20.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述噬菌体展示文库中多于99％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子。
21.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述噬菌体衣壳蛋白基因是PIII基因。
22.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述噬菌体展示文库中至少某些核酸中的组合区域包括多个框内琥珀密码子。
23.如权利要求22所述的噬菌体展示文库，其中所述多个框内琥珀密码子随机地分布在整个组合区域。
24.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述组合区域编码肽。
25.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述组合区域编码蛋白质。
26.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌体，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌体的核酸。
27.如权利要求17所述的噬菌体展示文库，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌粒，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌粒的核酸。
28.一种选择结合所需靶标的肽或蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供噬菌体展示文库，其包括多种核酸，
其中所述多种核酸包括具有含组合区域的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，
其中所述噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子；
(b)将所述噬菌体展示文库转化进细菌宿主细胞中；
其中所述细菌宿主细胞能够翻译所述噬菌体衣壳蛋白基因的组合区域，使至少一个框内琥珀密码子编码所需的非经典氨基酸，
其中所述细菌宿主细胞由不表达所述噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，和
其中所述转化允许噬菌体颗粒的生产，所述噬菌体颗粒包括在组合区域具有所述所需非经典氨基酸的所述噬菌体衣壳蛋白；
(c)针对所述所需靶标筛选所述噬菌体颗粒，
其中所述筛选的结果是选择具有与所述所需靶标结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒；和
(d)鉴定所选择的噬菌体颗粒的组合区域的氨基酸序列。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述筛选是通过针对所述所需靶标的亲和性选择来进行。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述筛选通过以下方式进行：
(a)将所述噬菌体颗粒与所述所需靶标孵育，
其中所述所需靶标是固定在表面上的；
(b)将未结合的噬菌体颗粒与结合到所述所需靶标的噬菌体颗粒分开；和
(c)分离所述结合的噬菌体颗粒。
31.如权利要求28所述的方法，其中，所述筛选进一步包括：
(a)将所述选择的噬菌体颗粒转化进所述细菌宿主细胞，以允许用于生产其他噬菌体颗粒；和
(b)根据权利要求22的步骤(c)，再筛选所述噬菌体颗粒。
32.如权利要求31所述的方法，其中，该进一步筛选重复多次。
33.如权利要求28所述的方法，其中所述筛选结果是选择具有与所需靶标的配体结合位点结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒，且其中所述非经典氨基酸作为配体将所述噬菌体衣壳组合区域引导至所述所需靶标的配体结合位点。
34.如权利要求28所述的方法，其中通过测序所选择的噬菌体颗粒的组合区域来进行鉴定。
35.如权利要求28所述的方法，其中所述鉴定包括：
(a)纯化所选择的噬菌体颗粒；
(b)将所述核酸与所选择的噬菌体颗粒分离；和
(c)测序所述核酸的所述组合区域。
36.如权利要求28所述的方法，其中所述所需靶标选自下组：肽、蛋白质、酶、小分子、细胞受体、抗原、所需靶标的配体结合位点、所需靶标的活性位点、蛋白质的活性位点、蛋白质的变构位点及其组合。
37.如权利要求28所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是琥珀抑制性细菌宿主菌株。
38.如权利要求28所述的方法，其中所述细菌宿主细胞包含琥珀抑制子tRNA，该琥珀抑制子tRNA已经通过同源的氨酰基-tRNA合成酶由所需非经典氨基酸氨酰基化。
39.如权利要求28所述的方法，其中所述所需非经典氨基酸选自下组：苯丙氨酸衍生的非经典氨基酸、赖氨酸衍生的非经典氨基酸，及其组合。
40.如权利要求28所述方法，其中所述所需非经典氨基酸选自下组：S-2-氨基-8-氧代壬酸、S-氨基-8-氧代癸酸、N6-乙酰基-L-赖氨酸、N6-丙酰基-L-赖氨酸、N6-丁酰基-L-赖氨酸、N6-巴豆酰基-L-赖氨酸、N6-(丙-2-炔-1-基)-赖氨酸、N6-甲基-N6-N6-(丙-2-炔-1-基)-赖氨酸，及其组合。
41.如权利要求28所述的方法，其中所述至少一个框内琥珀密码子在与蛋白质的配体结合位点结合的肽的区域内。
42.如权利要求28所述的方法，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌体，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌体的核酸。
43.如权利要求28所述的方法，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌粒，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌粒的核酸。
44.一种选择结合所需靶标的配体结合位点的肽的方法，所述方法包括：
(a)提供噬菌体展示文库，其包括多种核酸，
其中所述多种核酸包括具有含组合区域的噬菌体衣壳蛋白基因的核酸，
其中所述噬菌体展示文库中至少90％的组合区域包括至少一个框内琥珀密码子，
其中所述至少一个框内琥珀密码子在与所述所需靶标的配体结合位点结合的肽的编码区内；
(b)将所述噬菌体展示文库转化进细菌宿主细胞中；
其中所述细菌宿主细胞能够翻译所述噬菌体衣壳蛋白基因的组合区域，使至少一个框内琥珀密码子编码所需的非经典氨基酸，
其中所述细菌宿主细胞由不表达所述噬菌体衣壳蛋白基因的敲除辅助噬菌体共同感染，和
其中所述转化允许噬菌体颗粒的生产，所述噬菌体颗粒包括在组合区域具有所述所需非经典氨基酸的所述噬菌体衣壳蛋白；
(c)针对所述所需靶标筛选所述噬菌体颗粒，
其中所述筛选的结果是选择具有与所述所需靶标的配体结合位点结合的噬菌体衣壳蛋白组合区域的噬菌体颗粒，和
其中所述非经典氨基酸作为配体将所述噬菌体衣壳蛋白组合区域引导到所述所需靶标的配体结合位点；和
(d)鉴定所选择的噬菌体颗粒的组合区域的氨基酸序列。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述筛选通过针对所述所需靶标的亲和性选择来进行。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述筛选通过以下方式进行：
(a)将所述噬菌体颗粒与所述所需靶标孵育，
其中所述靶标固定在表面上；
(b)将未结合的噬菌体颗粒与结合到所述所需靶标的噬菌体颗粒分开；和
(c)分离所述结合的噬菌体颗粒。
47.如权利要求44所述的方法，其中，所述筛选进一步包括：
(a)将所述选择的噬菌体颗粒转化进所述细菌宿主细胞，以允许用于生产其他噬菌体颗粒；和
(b)根据权利要求38的步骤(c)，再筛选所述噬菌体颗粒。
48.如权利要求47所述的方法，其中，该进一步筛选重复多次。
49.如权利要求44所述的方法，其中通过测序所选择的噬菌体颗粒的组合区域来进行鉴定。
50.如权利要求44所述的方法，其中所述鉴定包括：
(a)纯化所选择的噬菌体颗粒；
(b)将所述核酸与所选择的噬菌体颗粒分离；和
(c)测序所述核酸的所述组合区域。
51.如权利要求44所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是琥珀抑制性细菌宿主菌株。
52.如权利要求44所述的方法，其中所述细菌宿主细胞包含琥珀抑制子tRNA，该琥珀抑制子tRNA已经通过同源的氨酰基-tRNA合成酶由所需非经典氨基酸氨酰基化。
53.如权利要求44所述的方法，其中所述所需非经典氨基酸选自下组：苯丙氨酸衍生的非经典氨基酸、赖氨酸衍生的非经典氨基酸，及其组合。
54.如权利要求44所述方法，其中所述所需非经典氨基酸选自下组：S-2-氨基-8-氧代壬酸、S-氨基-8-氧代癸酸、N6-乙酰基-L-赖氨酸、N6-丙酰基-L-赖氨酸、N6-丁酰基-L-赖氨酸、N6-巴豆酰基-L-赖氨酸、N6-(丙-2-炔-1-基)-赖氨酸、N6-甲基-N6-N6-(丙-2-炔-1-基)-赖氨酸，及其组合。
55.如权利要求44所述的方法，其中所述所需靶标的配体结合位点是所需蛋白质的活性位点、所需蛋白质的变构位点，或其组合。
56.如权利要求44所述的方法，其中所述配体抑制一种或多种表观遗传酶或表观遗传阅读蛋白的活性。
57.如权利要求44所述的方法，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌体，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌体的核酸。
58.如权利要求44所述的方法，其中所述噬菌体展示文库包括多种噬菌粒，且其中所述噬菌体展示文库中的多种核酸包括所述噬菌粒的核酸。
59.一种包括去乙酰化酶2的抑制剂的组合物，其中所述去乙酰化酶2的抑制剂选自下组：
(a)CTVXTSL；
(b)TCTVXIG；
(c)CTFXVPT；
(d)CTVXI；
(e)ZTVXI；或
(f)其组合，
其中X是非经典氨基酸，和
其中Z是非经典氨基酸或氨基丁酸。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述抑制剂是NH2-CTVXTSL-NH2(S2P03)。
61.如权利要求59所述的组合物，其中所述抑制剂是NH2-TCTVXIG-NH2(S2P04)。
62.如权利要求59所述的组合物，其中所述抑制剂是NH2-CTFXVPT-NH2(S2P07)。
63.如权利要求59所述的组合物，其中所述抑制剂是Ac-CTVXI-NH2(Ac-S2P04-5)。
64.如权利要求59所述的组合物，其中所述抑制剂是NH2-ZTVXI-NH2，其中Z是氨基丁酸(S2P04(Abu)-5)。
65.一种包括去SNL的抑制剂的组合物，其中所述SNL的抑制剂选自下组：
(a)DIWCFXG；
(b)SXDIWCF；或
(c)其组合，
其中X是非经典氨基酸。
66.如权利要求65所述的组合物，其中所述抑制剂是DIWCFXG。
67.如权利要求65所述的组合物，其中所述抑制剂是SXDIWCF。
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