ES2242620T3 - Estructuras peptidicas para exhibir bibliotecas de giros de un fago. - Google Patents

Abstract

Biblioteca de péptidos estructuralmente restringidos que comprende una pluralidad de péptidos cíclicos, en donde cada uno de dichos péptidos cíclicos comprende una secuencia de aminoácidos C1-A1-A2-(A3)n-A4- A5-C2 [SEC Nº ID.: 1], en donde, A1, A2, A3, A4, y A5 son L-aminoácidos que ocurren de manera natural; el extremo amino de la cisteína C1 está opcionalmente protegido con un grupo amino- protector; el extremo carboxilo de la cisteína C2 está opcionalmente protegido con un grupo carboxi- protector; A1 y A5 se seleccionan de entre el grupo que consiste en los aminoácidos W, Y, F, H, I, V y T; A2 y A4 se seleccionan de entre el grupo que consiste en los aminoácidos W, Y, F, L, M, I, y V; A3 es cualquier L-aminoácido que ocurre de forma natural, y n es un número entero que es 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12; y C1 y C2 se unen junto mediante un enlace disulfuro, formando de esta manera un péptido cíclico.

Description

Estructuras peptídicas para exhibir bibliotecas de giros de un fago.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a estudios de la relación estructura-actividad en proteínas, y en particular a las bibliotecas combinatorias de péptidos conformacionalmente restringidos y a procedimientos para generar y examinar tales bibliotecas para su uso biológico y farmacéutico.

Técnica previa

El estudio de la relación estructura actividad (SAR) proporciona conocimiento para entender las interacciones intermoleculares entre una proteína o péptido y otras moléculas biológicamente activas. En su entorno natural, los péptidos o proteínas adoptan estructuras únicas, conformacionalmente restringidas, con objeto de reconocer y unir sus parejas de unión, y formar un complejo molecular con las mismas, lo que, a su vez, elicitar determinadas actividades. Los ejemplos de parejas de unión proteína-proteína incluyen los enzima-sustrato, ligando-receptor, y antígeno-anticuerpo. Por tanto, la determinación de la conformación de un péptido en su forma nativa, deviene crucial para imitar estrechamente su actividad in vivo y para diseñar racionalmente sus análogos, los cuales podrían ser útiles como fármacos.

La mayoría de los péptidos pequeños son flexibles y típicamente no adoptan conformaciones únicas en solución; en particular, no mantienen la estructura que adopta la misma secuencia en la proteína nativa. La ausencia de estructura fija reduce la afinidad que el péptido pudiera tener por una diana (por razones entrópicas) y hace que la determinación de la conformación activa de la molécula sea extremadamente difícil. A causa de esto, se han descrito muchas estrategias para introducir restricciones en los péptidos (tales como los D-aminoácidos, los entrecruzamientos disulfuro y otros), o para sustituir partes del péptido con esqueletos no peptídicos más rígidos. Más aún, tales peptidomiméticos se han usado ampliamente para realizar estudios de estructura-actividad de forma sistemática para proporcionar información sobre los residuos aminoácidos específicos o grupos funcionales de un péptido que son adaptables a una conformación determinada y que son importantes para las actividades biológicas.

Se han identificado varios esqueletos de proteínas restringidos, capaces de presentar una proteína de interés como un dominio conformacionalmente restringido, incluyendo las estructuras minicuerpo (minibody) (Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236:649-659 (1994)), bucles sobre giros de hojas-\beta, estructuras ramificadas de bucle enrollado (Myszka y Chaiken, Biochem 33:2363-2372 (1994)), dominios dedos de zinc, estructuras unidas por cisteínas (disulfuro), estructuras enlazadas por transglutaminasa, péptidos cíclicos, barriles o haces helicoidales, motivos cremallera de leucina (Martin et al., EMBO J 13:5303-5309 (1994)), y otros. De los esqueletos proteicos identificados, los giros-\beta han sido implicados como un sitio importante para el reconocimiento molecular en muchos péptidos biológicamente activos. Smith y Pease, CRC Crit Rev Biochem 8:315-399 (1980). En consecuencia, los péptidos que contienen giros-\beta conformacionalmente restringidos son particularmente deseables. La gran mayoría de los péptidos portadores de giros-\beta identificados son ciclopéptidos, los cuales se han generado mediante la ciclización de un péptido similar a una secuencia en el sustrato natural. Milner-White, Trends Pharmacol Sci 10:70-74 (1989). Sin embargo, estos ciclopéptidos podrían retener todavía una flexibilidad significativa. Por esta razón, muchos estudios han intentado introducir compuestos rígidos, no peptídicos, que imitan el giro-\beta. Los péptidos con tal imitación de giro-\beta no peptídico proporcionan guías útiles para el descubrimiento de fármacos. Ball y Alewood, J Mol Recog 3:55-64 (1990); WO-94/03494 (Kahn).

Uno de los avances revolucionarios en el descubrimiento de fármacos es el desarrollo de bibliotecas combinatorias. Las bibliotecas combinatorias son una colección de moléculas diferentes, tales como péptidos, que pueden prepararse sintéticamente o de forma recombinante. Las bibliotecas de péptidos combinatorias contienen péptidos en los que todos los aminoácidos se han incorporado aleatoriamente en ciertas o todas las posiciones de la secuencia del péptido. Tales bibliotecas se han generado y usado de diversas formas para examinar en búsqueda de secuencias peptídicas que se unan efectivamente a las moléculas diana y para identificar tales secuencias.

Se han desarrollado y descrito muchos procedimientos para generar bibliotecas de péptidos. Por ejemplo, los miembros de la biblioteca de péptidos pueden crearse mediante síntesis y división (split-synthesis) realizada sobre un soporte sólido tal como una resina de poliestireno o poliacrilamida, tal como describió Lam et al., Nature 354:82 (1991) y la publicación PCT WO-92/00091. Otro procedimiento descubierto por Geysen et al., patente estadounidense nº 4.833.092, implica la síntesis de péptidos de una forma metódica y predeterminada, de forma que la ubicación de cada péptido miembro de la biblioteca proporciona información concerniente a la estructura sintética de ese péptido.

Se ha dedicado un esfuerzo considerable a introducir restricciones estructurales en las bibliotecas combinatorias de péptidos, de forma que los péptidos miembros representen más estrechamente sus contrapartidas nativas. Houston et al., en la patente estadounidense nº 5.824.483 describen una biblioteca de péptidos sintéticos que contiene péptidos que representan la conformación hélice-\alpha y, por tanto, son capaces de formar dímeros de hélices enrolladas entre ellos. McBride et al., J Mol Biol 259:819-827 (1996) describe una biblioteca sintética de péptidos cíclicos que imitan la región del bucle anti-tríptico de un inhibidor de proteinasa identificado.

Un procedimiento complementario para el descubrimiento de guías basado en bibliotecas de péptidos, es la exhibición de bibliotecas sobre bacteriófagos filamentosos. Este procedimiento permite la preparación de bibliotecas tan grandes como 10^{10}-10^{12} miembros peptídicos únicos, muchos órdenes de magnitud mayor que las bibliotecas que pueden prepararse sintéticamente. Además de los grandes tamaños de biblioteca, las ventajas de la exhibición sobre fagos incluyen la facilidad de construcción de la biblioteca (mutagénesis de Kunkel), el acoplamiento de la entidad unidora (péptido exhibido) a un identificador único (su secuencia de ADN), un protocolo de selección para amplificar los clones unidores raros en un conjunto, y la elevada fidelidad de la biosíntesis (en comparación con los procedimientos sintéticos). Más aún, hay disponibles protocolos de selección rápidos y baratos para identificar aquellos miembros de la biblioteca que se unen una diana de interés. Sin embargo, sólo pueden exhibirse sobre fagos péptidos naturales compuestos por L-aminoácidos, por tanto, el problema de definir la relación estructura tridimensional-actividad es más difícil que lo que podría ser para un peptidomimético que contenga péptidos que no ocurren naturalmente o compuestos no peptídicos. Una posible solución a este problema es usar las restricciones estructurales de una proteína plegada para presentar pequeños segmentos peptídicos variables. Más aún, se han propuesto varias proteínas estables como esqueletos de exhibición de péptidos. Nygren y Uhlen, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:463-469 (1997); Vita et al., Biopolymers 47:93-100 (1998); Vita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13091-13096 (1999); Smith et al., J. Mol. Biol 277:317-332 (1998); Christmann et al., Protein Engng. 12:797-806 (1999). Desafortunadamente, no está claro que los ligandos de proteína obtenidos mediante esta estrategia pudieran transformarse en pequeñas moléculas guía de fármacos. La transferencia del epítopo desde proteínas a péptidos pequeños o a pequeñas moléculas no peptídicas permanece como un problema extremadamente desafiante. Cochran, Chem. Biol. 7:R85-R94 (2000).

Por tanto, a pesar de los extensos estudios de las reglas que gobiernan las preferencias conformacionales en los péptidos naturales, y de la existencia de varios sistemas de bibliotecas de péptidos, esas características necesarias para la estabilidad estructural de los péptidos naturales permanecen pobremente comprendidas. En particular, ha habido una evaluación poco sistemática o cuantitativa del efecto de las sustituciones de residuos y de las interacciones no covalentes sobre la estructura.

Descubrimiento de la invención

La presente invención proporciona un novedoso sistema modelo para verificar las contribuciones de residuos individuales a la estabilidad de un esqueleto peptídico definido y para evaluar una serie de sustituciones presentada en una biblioteca combinatoria de péptidos. Los péptidos de la invención se ciclan a través de un enlace disulfuro entre dos cisteínas dentro de la secuencia peptídica. Las sustituciones de aminoácidos en varios sitios de residuos definidos influencia la conformación de los péptidos cíclicos y sus estabilidades estructurales. La invención también proporciona procedimiento para examinar en busca de, y analizar péptidos cíclicos con una estructura secundaria específica, el giro-\beta, la cual proporciona a los péptidos restricciones estructurales adicionales. La biblioteca de péptidos sujeto de la invención, que comprende una colección de péptidos cíclicos portadores de giro-\beta, puede usarse para examinar en busca de moléculas biológicamente activas candidatas a través de ensayos de unión molecular. Los procedimientos para tales exámenes son proporcionados también por la presente invención. Las composiciones y procedimientos de la invención pueden usarse para analizar las relaciones estructura-actividad de los péptidos de interés, proporcionando de ese modo una información útil para los estudios de las interacciones moleculares implicadas en procesos biológicos concretos, así como para el desarrollo racional de agentes terapéuticos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra el diseño del bhp, un péptido de 10 aminoácidos modelo de horquilla-\beta. (A) Las estructuras de proteínas superpuestas ilustran el empaquetado entre disulfuros y cadenas laterales de los residuos más cercanos no unidos mediante puentes de hidrógeno. (B) Representación esquemática del péptido bhp modelo de horquilla-\beta, se muestran las cadenas laterales de los residuos 1, 3, 8 y 10 ni unidos mediante puentes de hidrógeno. X representa el residuo cambiado seleccionado de entre 19 de los 20 L-aminoácidos naturales (excluyendo Cys).

La Figura 2 muestra la estabilidad relativa de la horquilla para la sustitución de X en la secuencia del péptido bhp. (A) Concentraciones efectivas (C_{eff}) de cisteína relativas a glutatión. Las barras de error son para \pm una desviación estándar. (B) Diferencias de energía libre en equilibrio relativas al péptido de alanina.

Las Figuras 3 (A-B) muestran dos vistas de la estructura de RMN media minimizada del bhpW horquilla-\beta ciclado-disulfuro. (A) Se destacan los residuos de la hebra no unidos mediante puentes de hidrógeno (NHB) Trp3 y Leu8. Se destacan los residuos de la hebra unidos mediante puentes de hidrógeno (HB) (Thr2, Thr9, Glu4 y Lys7).

Las Figuras 4 (A-B) ilustran el análisis mediante RMN de los péptidos CD4. (A) Solapamiento de la región huella del espectro COSY para cd1 y cd2. (B) Conjunto de la estructura de RMN para cd2 (20 modelos; dos vistas ortogonales) mostrada sobrepuesta a los residuos 37-46 de CD4 procedentes de la estructura cristalina de CD4 unido a gp120 (entrada en la PDB: 1GC1).

La Figura 5 muestra espectros de dicroísmo circular de tres pares de péptidos del Ejemplo 2.

La Figura 6 muestra los valores de concentración efectiva (C_{eff}) para sustituciones de X en los péptidos del Ejemplo 3. Las sustituciones de X en la hebra se muestran en la parte superior de la gráfica, y los residuos centrales de los giros se muestran a la derecha.

La Figura 7 ilustra estructuras medias minimizadas de los análogos de triptófano de los péptidos del Ejemplo 3 superpuestos sobre los átomos del esqueleto de los residuos 1-3 y 8-10 (RMSD de 0,36 y 0,30 angstroms para 1 con respecto de 2 y 3, respectivamente). El péptido 1 está en gris; el péptido 2 están en negreo; y el péptido 3 está en blanco. Por claridad, no se muestran los átomos de las cadenas laterales que no son de prolina para los cuatro residuos del giro.

Las Figuras 8 (A-B) muestran los valores de concentración efectiva (C_{eff}) para péptidos con pares hidrofóbicos en posiciones de la hebra no unidas mediante puentes de hidrógeno (NHB) tal como se describió en el Ejemplo 4. Los valores para las sustituciones emparejadas con una leucina cruzada de la hebra se muestran en (A); los de los pares de triptófano se muestran en (B).

La Figura 9 ilustra una representación de Hammett que compara las diferencias de energía libre entre los péptidos del Ejemplo 4.

La Figura 10 muestra el análisis mediante doble mutante de la estabilidad de W3Y8 relativa a L3L8.

Modelo(s) para llevar a cabo la invención I. Definiciones

El término "giro-\beta" se refiere a una estructura secundaria de proteína consistente en una secuencia de tetrapéptido que causa que la cadena peptídica invierta su dirección, y la cual a menudo contiene un puente de hidrógeno 4' a 1', formando un pseudo-anillo de 10 miembros. La clasificación más ampliamente aceptada de las diferentes conformaciones del giro-\beta se describe en Chou y Fasman, J Mol Biol 115:135-175 (1977), el descubrimiento de la cual se incorpora expresamente en ésta por referencia. Se han definido varios tipos de giros-\beta, incluyendo, por ejemplo, los tipos I, I', II, y II'. Para el propósito de esta invención, el término "giro invertido" se usa en un sentido general para abarcar estructuras secundarias de proteína bien conocidas, incluyendo los giros-\beta, los giros-\gamma, las horquillas-\beta y los dobleces-\beta.

"Célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan en ésta de forma intercambiable, y tales designaciones incluyen toda la progenie de una célula o línea celular. Así pues, por ejemplo, los términos como "transformantes" y "células transformadas" incluyen la células que es sujeto primario y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. Se entiende también que toda la progenie podría no ser precisamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha buscado en la célula transformada originalment. Cuando se deseen designaciones distintas, éstas serán evidentes a partir del contexto.

Los términos "células competentes" y "células competentes para electroporación" significan células que están en un estado de competencia y que son capaces de captar ADN procedente de una variedad de fuentes. El estado podría ser transitorio o permanente. Las células competentes para la electroporación son capaces de captar ADN durante la electroporación.

"Secuencias de control" cuando se refiere a la expresión significa secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un determinado organismo huésped. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión de ribosomas, y, posiblemente, otras secuencias todavía pobremente comprendidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

El término "proteína de cubierta" significa una proteína, al menos una porción de la cual está presente sobre la superficie de la partícula vírica. Desde una perspectiva funcional, una proteína de cubierta es cualquier proteína que se asocia con una partícula vírica durante el proceso de ensamblado viral en una célula huésped, y permanece asociada con el virus ensamblado hasta que éste infecta otra célula huésped. La proteína de cubierta podría ser la proteína de cubierta principal o podría ser una proteína de cubierta menor. Una proteína de cubierta "principal" es una proteína de cubierta que está presente en la cubierta viral como 10 copias de la proteína o más. Un proteína de cubierta principal podría estar presente en decenas, centenas o incluso miles de copias por virión.

Los términos "electroporación" y "electroporar" significan un proceso en el que se introduce material ajena (proteínas, ácidos nucleico, etc.) dentro de una célula mediante la aplicación de un voltaje a la célula en condiciones suficientes para permitir la captación de la material ajena dentro de la célula. La materia ajena es típicamente ADN.

Una "proteína de fusión" es un polipéptido que tiene dos porciones unidas covalentemente entre ellas, en donde cada una de las porciones es un polipéptido que tiene una propiedad diferente. La propiedad podría ser una propiedad biológica, tal como actividad in vitro o in vivo. La propiedad también podría ser una propiedad química o física sencilla, tal como la unión a una molécula diana, la catálisis de una reacción, etc. Las dos porciones podrían estar unidas directamente mediante un único enlace peptídico, o a través de un eslabón peptídico que contiene uno o más residuos aminoácidos. Generalmente, las dos porciones y el eslabón estarán en pauta de lectura entre ellas.

"ADN heterólogo" es cualquier ADN que se introduce dentro de una célula huésped. El ADN podría derivarse de una variedad de fuentes, incluyendo el ADN genómico, el ADNc, el ADN sintético, y fusiones y combinaciones de estos. El ADN podría incluir ADN procedente de la misma célula o tipo celular, por ejemplo, de un mamífero o planta. El ADN podría, opcionalmente, incluir genes de selección, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a la temperatura, etc.

"Ligación" es el proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico. Para la ligación de los dos fragmentos, los extremos de los fragmentos deben ser compatibles entre ellos. En algunos casos, los extremos serán directamente compatibles después de su digestión con endonucleasa. Sin embargo, podría ser necesario convertir primero los extremos "a tresbolillo" producidos comúnmente después de la digestión con endonucleasa en extremos romos para hacerlos compatibles para la ligación. Para hacer romos los extremos, el ADN podría tratarse en un tampón apropiado durante al menos 15 minutos a 15ºC, con aproximadamente 10 unidades del fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN o la polimerasa de ADN de T4 en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótidos. El ADN podría a continuación purificarse mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Los fragmentos de ADN que deben ligarse juntos se ponen en solución en cantidades aproximadamente equimolares. La solución generalmente también contendrá ATP, tampón de ligasa, y una ligasa tal como la ligasa de ADN de T4 en aproximadamente 10 unidades por 0,5 \mug de ADN. Si el ADN debe ligarse en un vector, el vector se linealiza primero mediante digestión con la(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s). El fragmento linealizado se trata a continuación con fosfatasa alcalina bacteriana o fosfatasa intestinal de ternera para prevenir la autoligación durante el paso de ligación.

Una "mutación" es una supresión, inserción, o sustitución de un(os) nucleótido(s) en relación a una secuencia nucleotídica de referencia, tal como una secuencia del tipo salvaje.

"Operativamente unido", cuando se refiere a ácidos nucleicos, significa que los ácidos nucleicos están colocados en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN para un polipéptido si este se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante si está ubicado con objeto de facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que son unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas en la fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en sitios de restricción apropiados. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o eslabones de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

La "exhibición sobre fago" es una técnica mediante la cual se exhiben polipéptidos variantes, como proteínas de fusión a una proteína de cubierta, sobre la superficie del fago, por ejemplo, partículas de fagos filamentosos. Una utilidad de la exhibición sobre fago radica en el hecho de que pueden clasificarse rápida y eficientemente bibliotecas grandes de variantes aleatorias de proteínas en busca de aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con elevada afinidad. La exhibición de bibliotecas de péptidos y proteínas sobre fagos se ha usado para examinar millones de polipéptidos en busca de unos con propiedades de unión específicas. Se han usado procedimientos de exhibición polivalente sobre fagos para presentar pequeños péptidos aleatorios y proteínas pequeñas a través de fusiones con el gen III o gen VIII del fago filamentoso. Wells y Lowman, Curr. Opin. Biotech. 3:355-362 (1992) y referencias citadas en la misma. En la exhibición monovalente en fagos, una biblioteca de proteína o péptido se fusiona a un gen III, o a una porción del mismo, y se expresa con niveles bajos en presencia de la proteína del gen III del tipo salvaje, de forma que las partículas de fago exhiben una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Los efectos de avidez se reducen en relación a los fagos polivalentes, de forma que la clasificación se realiza en base a la afinidad intrínseca del ligando, y se usan vectores fagómidos, lo cual simplifica la manipulación del ADN. Lowman y Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-216 (1991). En la exhibición sobre fagos, el fenotipo de las partículas de fago, incluyendo el polipéptido exhibido, se corresponde con el genotipo dentro de la partícula de fago, el ADN encerrado por las proteínas de cubierta del fago.

Un "fagómido" es un vector plasmídico que tiene un origen de replicación bacteriano, por ejemplo, el ColE1, y una copia de una región intergénica de un bacteriófago. El fagómido podría usarse con cualquier bacteriófago conocido, incluyendo el bacteriófago filamentoso. El plásmido generalmente también contendrá un marcador seleccionable para la resistencia a antibiótico. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores pueden propagarse como plásmidos. Cuando las células que albergan estos vectores se proporcionan con todos los genes necesarios para la producción de partículas de fago, el modo de replicación del plásmido cambia a replicación en círculo rodante para generar copias de una hebra del ADN plasmídico y empaquetar partículas de fago. El fagómido podría formar partículas de fago infecciosas o no infecciosas. Este término incluye los fagómidos que contienen un gen de proteína de cubierta o un fragmento del mismo unido a un gen de polipéptido heterólogo como un gen de fusión, de tal forma que el polipéptido heterólogo se exhibe sobre la superficie de la partícula de fago. Sambrook et al., 4.17.

El término "vector de fago" significa una forma replicativa de doble hebra de un bacteriófago que contiene un gen heterólogo y es capaz de replicarse. El vector de fago tiene un origen de replicación de fago que permite la replicación del fago y la formación de partícula de fago. El fago es preferiblemente un fago filamentoso, tal como un fago M13, f1, fd, Pf3 o un derivado de los mismos, un fago lamboide, tal como el lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc., o un derivado de los mismos, un baculovirus o un derivado del mismo, un fago T4 o un derivado del mismo, un virus fago T7 o un derivado del mismo.

"Preparación" de ADN a partir de células significa aislar el ADN plasmídico a partir de un cultivo de las células huésped. Los procedimientos comúnmente usados para las preparación del ADN son las preparaciones de plásmidos a gran y pequeña escala descritas en las secciones 1.25-1.33 de Sambrook et al. Después de la preparación del ADN, este puede purificarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito en la sección 1.40 de Sambrook et al.

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos de cadena corta, de hebra única o doble, que se sintetizan químicamente mediante procedimientos conocidos (tales como la química del fosfotriéster, del fosfito, o del fosforamidito, usando técnicas de fase sólida tales como las descritas en EP-266.032, publicada el 4 de mayo e 1988, o a través de intermediarios desoxinucleósido H-fosfonato tal como describieron Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14:5399-5407 (1986)). Los procedimientos adicionales incluyen la reacción en cadena de la polimerasa, definida más abajo, y otros procedimientos de autocebado y de síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos. Todos estos procedimientos se describen en Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28:716-734 (1989). Estos procedimientos se usan si se conoce la secuencia completa del ácido nucleico, o si está disponible la secuencia de ácido nucleico complementaria de la hebra codificante. Alternativamente, si se conoce la secuencia de aminoácidos diana, se podrían inferir secuencias de ácidos nucleicos potenciales usando residuos conocidos y codificantes para cada residuo de aminoácidos. Los oligonucleótidos se purifican a continuación en geles de poliacrilamida.

La "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en la cual cantidades minúsculas de una pieza específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describió en la patente estadounidense nº 4.683.195, concedida el 28 de julio de 1987. De forma general, la información de secuencia procedente de los extremos de la región de interés o de más allá tiene que estar disponible, de forma que puedan diseñarse cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las hebras opuestas de la plantilla a amplificar. Los nucleótidos terminales 5' de los dos cebadores podrían coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas procedentes del ADN genómico total, y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Consultar, de forma general, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987); ed. Erlich, PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Tal como se usa en ésta, se considera que la PCR es un ejemplo, pero no el único, de procedimiento de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador, y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un pieza específica de ácido nucleico.

El ADN está "purificado" cuando el ADN se separa de impurezas que no son ácido nucleico. Las impurezas podrían ser polares, no polares, iónicas, etc.

La "recuperación" o "aislamiento" de un de determinado fragmento de ADN a partir de un digerido de restricción significa la separación del digerido en gel de poliacrilamida o de agarosa mediante la electroforesis, la identificación del fragmento de interés mediante la comparación de su movilidad respecto la de fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, la retirada de la sección de gen que contiene el fragmento deseado, y la separación del gel del ADN. Este procedimiento es conocido de forma general. Por ejemplo, consultar Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9:6103-6114 (1981), y Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980).

Un "elemento regulador de la transcripción" contendrá uno o más de los siguientes componentes: un elemento potenciador, un promotor, una secuencia operadora, un gen represor, y una secuencia de terminación de la transcripción. Estos componentes son bien conocidos en la técnica. Patente estadounidense nº 5.667.780.

Un "transformante" es una célula que ha captado y mantenido ADN, tal como se evidencia por la expresión de un fenotipo asociado con el ADN (por ejemplo, resistencia a antibiótico conferida por una proteína codificada por el ADN).

"Transformación" o "transformar" significa un proceso mediante el cual una célula capta ADN y deviene un "transformante". La captación de ADN podría ser permanente o transitoria.

Una "variante" o "mutante" de un polipéptido de partida, tal como una proteína de fusión o un polipéptido heterólogo (heterólogo respecto el fago) es un polipéptido que 1) tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la del polipéptido de partida, y 2) se derivo del polipéptido de partida a través de mutagénesis natural o artificial (hecha por el hombre). Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés. Podría hacerse cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para llegar a la variante o construcción mutante final, a condición de que la construcción final posea las características funcionales deseadas. Los cambios de aminoácidos también podrían alterar los procesos post-traducción del polipéptido, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación. En la patente estadounidense nº 5.534.615 se describen procedimientos para generar variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de interés, la cual se incorpora expresamente en ésta por referencia.

El término "análogo de péptido" se refiere a una molécula o parte de la misma que está formada por aminoácidos y se parece, en relación a su capacidad de unión y/o especificidad, a una molécula específica, tal como se ha definido más arriba. Tales análogos de péptido podrían hallarse o construirse mediante técnicas de ingeniería de proteínas, siendo tales procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Alternativamente, tales análogos de péptido podrían hallarse mediante un proceso de examen reiterativo en el cual, por ejemplo, se usa una pareja unidora natural de la molécula específica (molécula específica que no es necesariamente una proteína o péptido), o una porción de la misma, tal como se describe en ésta (es decir, en una proteína quimérica), para buscar compuestos peptídicos por su capacidad para unirse a ella. En un segundo paso de búsqueda, el compuesto peptídico recién hallado (o una porción del mismo) podría usarse por sí mismo como un análogo del péptido de la molécula específica en una proteína quimérica para buscar análogos de la pareja unidora natural. Otros procedimientos para preparar análogos de péptidos serán evidentes a los especialistas en la técnica.

El término "epítopo" significa un antígeno o porción del mismo que es capaz de unirse con un anticuerpo como un determinante antigénico.

Por "complejo de parejas unidoras" se quiere indicar la asociación de dos o más moléculas que se unen entre ellas en una manera específica, detectable; así pues, la asociación de ligando y receptor, de anticuerpo y antígeno, y de la proteína quimérica y del compuesto al que se une.

El término "directa o indirectamente marcado" se refiere a una molécula que podría contener un grupo marcador, grupo que emite una señal que se puede detectar, tal como un radioisótopo, un colorante, o un grupo fluorescente o quimioluminiscente, o que podría contener un grupo, tal como un enzima unido, un ligando tal como biotina, un sustrato de enzima, un epítopo o secuencia nucleotídica, que no es detectable por sí misma, pero la cual, a través de cierta reacción adicional, es capaz de indicar la presencia del compuesto.

Por "ligando" se quiere significar una molécula o un complejo molecular multimérico que es capaz de unir específicamente otra molécula o complejo molecular. A menudo, aunque no necesariamente, un ligando es soluble mientras que su diana está inmovilizada, tal como mediante un dominio de anclaje insertado en una membrana celular.

El término "receptor" se refiere a al menos una porción de una molécula, o un complejo molecular multimérico, la cual tiene un dominio de anclaje insertado en una membrana celular, y es capaz de unir una molécula o complejo molecular determinado. Muchos receptores tienen afinidad particularmente elevada por un ligando cuando, uno de los dos o ambos, el receptor y el ligando, están en forma homo- o heterodimérica, tal como un dímero.

El término "soporte sólido" se refiere a una matriz insoluble, bien de naturaleza biológica, tal como, sin limitación, una célula o partícula de bacteriófago, o sintética, tal como, sin limitación, un derivado de la acrilamida, la celulosa, el nilón, el sílice, y partículas magnetizadas, a la cuales pueden unirse o pegarse moléculas solubles.

Por "que ocurre de forma natural" se quiere indicar que normalmente se halla en la naturaleza. Aunque una entidad química podría ocurrir de forma natural en general, no tiene porqué prepararse o derivarse de fuentes naturales en ninguna forma específica.

Por "que no ocurre de forma natural" se quiere indicar que raramente o nunca se halla en la naturaleza y/o que se ha preparado usando procedimientos sintéticos orgánicos.

"Modificado" significa que no ocurre de forma natural o que se ha alterado de una forma que se desvía de los compuestos que ocurren de forma natural.

II. General

La presente invención se dirige a péptido conformacionalmente restringidos y a bibliotecas de péptidos que son útiles para el análisis de la estructura-actividad de moléculas bioactivas y para el descubrimiento de conductores de fármacos. El péptido de la invención comprende dos residuos cisteínas que son capaces de formar puentes disulfuro entre ellos. Así pues, el péptido adopta una forma cíclica en solución, la cual facilita la formación de esqueletos de horquilla-\beta. La ciclización del disulfuro es útil, aunque no es suficiente para restringir la estructura de muchos péptidos. El resto de los residuos del péptido se seleccionan adicionalmente para que estén significativamente sesgados hacia la formación de la estructura de horquilla. Más aún, un subconjunto de los residuos dentro del péptido de la invención se varía para proporcionar una diversidad relativa para imitar varios péptidos bioactivos que tienen una estructura secundaria identificada, tal como un giro-\beta, el cua se ha probado que es importante en los procesos biológicos.

En un aspecto, la invención abarca una biblioteca de péptidos que comprende una colección de péptidos cíclicos estructuralmente restringidos. Cada péptido miembro de la biblioteca comprende la secuencia de aminoácidos C1-A1-A2-(A3)_{n}-A4-A5-C2 [SEC Nº ID.: 1], en donde,

A1, A2, A3, A4, y A5 son L-aminoácidos que ocurren de forma natural;

el extremo de la cisteína C1 está opcionalmente protegido con un grupo amino-protector;

el extremo de la cisteína C2 está opcionalmente protegido con un grupo carboxi-protector;

A1 y A5 se seleccionan de entre el grupo consistente en los aminoácidos W, Y, F, H, I, V y T;

A2 y A4 se seleccionan de entre el grupo consistente en los aminoácidos W, Y, F, L, M, I, y V;

A3 es cualquier L-aminoácido que ocurra de forma natural, y n es un número entero que se selecciona de entre el grupo consistente en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12; y

C1 y C2 se unen juntas mediante un enlace disulfuro, formando de ese modo un péptido cíclico.

En una realización preferida, los péptidos de la invención tienen un residuo \beta-ramificado que tiene dos sustituyentes que no son hidrógeno en el carbono \beta del residuo aminoácido en la posición A1 o A5, o en ambas. Los péptidos preferidos de la invención tienen un residuo alifático ramificado I, V o T en A1, A5 o en ambas. Más preferiblemente, A1 o A5 son treonina (T). Incluso más preferiblemente, ambas, A1 y A5, son residuos treonina.

De acuerdo con otra realización preferida, los péptidos tienen un residuo aromático W, Y, F o H en la posición A1 o A5, o en ambas. Más preferiblemente, A1 ó A5 son W. Un péptido preferido contiene H en A1 y V en A5.

En otra realización preferida, los péptidos de la invención tienen un residuo aromático W, Y o F en la posición A2 o A4, o en ambas. Más preferiblemente, A2 o A4 son W; e incluso más preferiblemente, A2 y A4 son W. Otra realización preferida incluye péptidos que tienen un residuo alifático no ramificado L o M en la posición A2 o A4, o en ambas; más preferiblemente, A2 o A4 son leucina. Todavía otros péptidos preferidos tienen un residuo alifático ramificado I o V en la posición A2 o A4, o en ambas.

En los péptidos de la invención, el número n de los residuos A3 puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12; preferiblemente 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; y más preferiblemente 4, 5 o 6. En una realización, los péptidos resultantes son decámeros. En estos decámeros, los sitios de residuo A1, A2, A4 y A5 se seleccionan cada uno de entre un grupo seleccionado de residuos aminoácidos, tal como se ha descrito más arriba, mientras que el (A3)_{4} del medio es una secuencia de tetrapéptido con aminoácidos variables. En un aspecto de la invención, la secuencia de tetrapéptido (A3)_{4} e selecciona de entre aquéllas favorables para la formación de una estructura de giro-\beta, incluyendo, pero no limitándose, a EGNK, ENGK, QGSF, VWQL y GPLT.

En un aspecto, la biblioteca de la presente invención contiene al menos aproximadamente 10^{2} péptidos miembros, cada uno de los cuales tiene al menos una variación de aminoácido respecto de los otros. Preferiblemente, la biblioteca contiene al menos aproximadamente 10^{4} péptidos, más preferiblemente aproximadamente 10^{10} péptidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 10^{12} péptidos. De acuerdo con varias realizaciones, la variación de aminoácidos ocurre en posiciones definidas dentro de los péptidos. Por ejemplo, las variaciones pueden ocurrir en los sitios de la hebra unidos por enlaces de hidrógeno (HB) (por ejemplo, A1/A5), o en sitios de la hebra no unidos por enlaces de hidrógeno (por ejemplo, A2/A4); un residuo y su pareja opuesta en la hebra (por ejemplo, A1/A5 o A2/A4) pueden tener los mismos o diferentes aminoácidos. Las variaciones pueden ocurrir también en los sitios (A3)_{n} del medio, en donde A3 puede ser cualquiera de los 20 L-aminoácidos que ocurren de forma natural.

El extremo carboxi-terminal y el extremo amino-terminal del péptido cíclico podrían protegerse con cualesquier grupos protectores conocidos o podrían unirse a otros residuos aminoácidos (generalmente residuos que ocurren de forma natural), tanto en la forma (L) como en la (D) a través de enlaces peptídicos amida convencionales. Los grupos protectores y los residuos adicionales pueden añadirse usando técnicas convencionales de síntesis peptídica. Generalmente, de 1 a aproximadamente 50, preferiblemente de 1 a aproximadamente 20, residuos aminoácidos podrían estar presentes independientemente en cada uno de las posiciones carboxi- y amino-terminales. Estos residuos adicionales podrían ser parte de una proteína conocida que contiene un giro beta de interés, o podrían ser cualquiera otra secuencia de residuos deseada. Estos residuos adicionales podrían añadirse para determinar el efecto de la estructura del giro beta de los residuos adicionales sobre la unión del péptido cíclico con giro beta a un proteína de interés.

Alternativamente, puede prepararse una biblioteca de péptidos cíclicos de la invención en la cual uno o más de los residuos A1, A2, A4, y/o A5 se fija independientemente y los residuos A3 se varían usando procedimientos conocidos para generar bibliotecas de péptidos. Un procedimiento preferido para generar una biblioteca es la exhibición sobre fago. Cualquier procedimiento de exhibición sobre fago, tales como los discutidos con más detalle más abajo, podría usarse en el procedimiento de la invención.

En una realización de la invención, el péptido cíclico de la invención se fusiona a, al menos, una porción de una proteína de cubierta de fago para formar una proteína de fusión que contiene el péptido cíclico de la invención. La proteína de fusión puede prepararse expresando una fusión de genes que codifica la proteína de fusión usando técnicas conocidas de exhibición sobre fago, tales como las descritas más abajo. La proteína de fusión podría formar parte de una fase o partícula de fagómido, en la cual una o más copias del péptido cíclico se exhiben sobre la superficie de la partícula. Un gen que comprende un ácido nucleico que codifica el péptido cíclico o la proteína de fusión se halla dentro del ámbito de la invención.

La presente invención también abarca procedimientos para examinar en busca de péptidos que tienen un esqueleto de horquilla-\beta que está conformacionalmente estabilizado, que comprenden los pasos de a) proporcionar una biblioteca combinatoria de la invención tal como se ha descrito más arriba; b) seleccionar al menos dos péptidos de la biblioteca combinatoria, en donde dichos al menos dos péptidos difieren en un aminoácido en una posición concreta A1, A2, A3, A4 o A5; c) determinar las conformaciones de los péptidos; y e) seleccionar el péptido que tenga un esqueleto de horquilla-\beta conformacionalmente estabilizado. La conformación y la estabilidad de los péptidos puede determinarse usando muchos procedimientos conocidos en la técnica, tales como RMN, modelado molecular, cristalografía, y cálculos de energía libre. Ver, por ejemplo, Cavanagh et al., (1995) Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practices (Academic Press, San Diego). Más adelante se describen, a modo de ejemplo, con más detalle, procedimientos concretos para determinar la conformación y estabilidad del péptido. Los péptidos que contienen giros-\beta de la invención pueden ser útiles para imitar proteínas bioactivas nativas en sus actividades de unión.

La identidad de los residuos A3 del giro-\beta podría determinarse estudiando estructuras de proteínas conocidas, y, a continuación, sustituyendo la secuencia estructural conocida en el compuesto con horquilla beta estructurada de la invención. En esta realización, los residuos A3 se toman a partir de la proteína conocida, mientras que los residuos A1, A2, A4 y A5 son tal como se describieron para la invención. De esta forma, los residuos fijados de la invención pueden usarse para estructurar giros concretos procedentes de proteínas de interés, permitiendo que se ensaye si el giro de la proteína es suficiente para unirse a una pareja de unión que es proteína conocida, o para antagonizar la interacción proteína-proteína relevante.

La invención también incluye procedimientos para identificar un péptido capaz de unir una pareja de unión específica, que comprende los pasos de a) proporcionar una biblioteca combinatoria, tal como se ha descrito más arriba; b) poner en contacto la biblioteca combinatoria con la pareja de unión; c) seleccionar de la biblioteca péptidos que son capaces de formar un complejo no covalente con la pareja de unión; y d) aislar opcionalmente dichos péptidos del paso. Los procedimientos y tecnologías para verificar la actividad de unión del péptido y aislar los péptidos de interés son conocidas en la técnica, y se describen con más detalla más abajo.

Las parejas de unión de los péptidos de la invención pueden ser, al menos, una porción de cualesquiera moléculas, incluyendo cualesquier péptidos, proteínas, otras moléculas o compuestos químicos que son capaces de unirse a los péptidos y opcionalmente ejercer bioactividades, conocidos o desconocidos. Las moléculas de proteínas, tales como receptores, ligandos, antígenos, anticuerpos, enzimas y sustratos de enzimas, y fragmentos o porciones de los mismos, se hallan abarcados por "parejas de unión". Otros compuestos químicos no proteicos, orgánicos o inorgánicos, pueden ser también las parejas de unión de los péptidos.

III. Péptidos con horquillas-\beta

Una realización de la presente invención implica un esqueleto de péptido cíclico que adopta conformaciones de horquilla-\beta en solución. Las partes componentes de la estructura de horquilla-\beta incluyen hojas-\beta emparejadas y antiparalelas y, preferiblemente, giros-\beta. Se ha estudiado la ubicación preferente de los pares de cisteínas unidas por enlaces disulfuro en los sitios de las hojas-\beta no unidos mediante enlaces de hidrógeno, así como los pares específicos de residuos de hebras entrecruzadas que están estadísticamente favorecidos (en sitios unidos o no unidos mediante enlaces de hidrógeno), al menos en proteínas. Un estudio describe las mediciones de estabilidad experimental de proteínas mutantes en las que se han introducido varios pares de residue en sitios unidos por enlaces de hidrógeno en hebras antiparalelas adyacentes. Smith y Regan, Science 270:980-982 (1995). Se han hecho intentos para determinar las preferencias intrínsecas de aminoácido individuales para adoptar conformaciones apropiadas para la geometría de una hoja-\beta, bien analizando el contenido en residuos de las hojas-\beta (Chou y Fassman, Annu. Rev. Biochem. 47:251-276 (1978)) o sustituyendo varios aminoácidos en una hoja-\beta de una proteína y midiendo las estabilidades relativas de los mutantes (Kim y Berg, Nature 362:267-270 (1993); Minor y Kim, Nature 367:660-663 (1994); Minor y Kim, Nature 371:264-267 (1993); Smith et al., Biochemistry 33:5510-5517 (1994)). Un procedimiento estadístico revisado para verificar las conformaciones de los residuos tiene correlaciones mejoradas con las diferentes escalas de propensión (Munoz y Serrano, Proteins 20:301-311 (1994)). La propensión asignada al triptófano es moderada en todas las escalas descritas.

Se ha mostrado recientemente que para algunos péptidos cortos, lineales (4-16 aminoácidos), la conformación en horquilla está parcialmente poblada en solución acuosa. Ambos, los péptidos diseñados y los péptidos tomados de secuencias de proteínas, han presentado este comportamiento. En general, estos estudios implican péptidos con secuencias de giro estadísticamente fuertes (por ejemplo, asn-gly en i+1, i+2). Sin embargo, las poblaciones de la horquilla raramente excedieron el 40-50% en solución acuosa.

Un péptido 16-mero derivado de la proteína ubiquitina, pero con una secuencia de giro estadísticamente más común (MQIGVKNPDGTITLEV) formó una horquilla altamente poblada en agua (cerca del 80%), pero la horquilla no tenía el mismo registro de hebra que la proteína nativa (Searle et al., Nat. Struct. Biol. 2:999-1006 (1995)). Otro grupo estudió un péptido similar en el cual se remplazó la región del giro con varias secuencias (MQIGVKSXXKTITLKV, en donde XX = pro-ala o pro-gly; Haque y Gellman, J. Am. Chem. Soc. 119:2303-2304 (1997)). La evidencia de la estructura en horquilla, con el registro de la hebra nativa, se observó para giros que contenían D-aminoácidos, pero no para secuencias de L-aminoácidos. En este estudio no se proporcionaron estimaciones de las poblaciones.

Varios grupos han estudiado péptidos modelos basados originalmente en una secuencia de la proteína tendamistat. El péptido YQNPDGSQA muestra evidencia por RMN de una pequeña población de horquilla en agua (Blanco et al., J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888 (1993); de Alba et al., Eur. J. Biochem. 233:283-292 (1995); Constantine et al., J. Am. Chem. Soc. 117:10841-10854 (1995); Friedrichs et al., J. Am. Chem. Soc. 117:10855-10864 (1995)). Se comparó una variante de este péptido con residuos de la hebra con una \beta-propensión esperada mayor (IYSNPDGTWT) con un segundo péptido con una secuencia de giro diferente (IYSNSDGTWT). Se estimó mediante RMN que ambos péptidos tenían un 30% de horquilla en agua (de Alba et al., Fold. Des. 1:133-144 (1996)). Una variación adicional de este péptido, predominantemente en la secuencia del giro, rindió horquillas de varias estructuras y poblaciones mixtas. Generalmente, ninguna población de confórmero excedía el 50% (de Alba et al., J. Am. Chem. Soc. 119:175-183 (1997)). En un estudio final, los tres residuos N-terminales en el péptido ITSNSDGTWT se remplazaron con varias secuencias. De nuevo, se observaron frecuentemente confórmeros mezclados y las poblaciones de un determinado confórmero de horquilla eran generalmente de menos del 50%: un péptido (YITNSDGTWT) sí que formó una horquilla con registro desplazado que estaba altamente poblada (80%; de Alba et al., Protein Sci. 6:2548-2560 (1997)). Los autores de estos estudios concluyen que las preferencias conformacionales de los residuos del giro dominan las interacciones a través de la hebra en la determinación de la estabilidad de las horquillas, al menos en estos péptidos modelo cortos.

El análisis de las secuencias de la horquilla en las estructuras cristalinas ha permitido el diseño de una serie diferente de péptidos de horquilla-\beta. La estructura diana fue un giro del tipo I' flanqueado por hebras de tres residuos. Se añadieron secuencias arg-gly a los extremos para mejorar la solubilidad. El péptido RGITVNGKTYGR está parcialmente plegado en un conformación de horquilla (aproximadamente el 30%) tal como se determinó mediante RMN (Ramirez-Alvarado et al., Nat. Struct. Biol. 3:604-612 (1996)). La importancia de los residuos de la hebra, tal como se indica mediante la sustitución de la ile y val, la lys y tyr, o de los cuatro residuos con alanina. Ninguno de los péptidos sustituidos con alanina mostró ninguna tendencia a formar una horquilla. Los mismos autores publicaron una segunda serie de experimentos en los que se variaba la posición i+1 del giro (asn a asp, ala, gly o ser). Ningún péptido estaba más estructurado que la secuencia original con asn en el giro (Ramirez-Alvarado et al., J. Mol. Biol. 273:898-912 (1997)). Una revisión describiendo este trabajo afirmaba que la adición de pares glu-lys a los extremos del péptido modelo estabilizaba la horquilla, pero no proporcionó detalles adicionales (Ramirez-Alvarado et al., Bioorg. Med. Chem. 7:93-103 (1999)).

Otra serie de péptidos modelo (RYVEVXGOrnKILQ) ha proporcionado evidencia de la formación de horquilla en agua. El residuos X como D-pro o L-asn proporciona NOE característicos y desplazamientos de alpha-H, pero el péptido L-pro está desplegado. No se proporcionaron estimaciones de las poblaciones, pero D-pro parece proporcionar la horquilla más estable (Stanger y Gellman, J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237 (1998)). Un estudio posterior usó una versión ciclizada, por disulfuro y por esqueleto, de este péptido como un modelo para la horquilla completamente plegada, permitiendo la estimación de la población en horquilla en los análogos no ciclados (30-70%). Syud, et al., J. Am. Chem. Soc. 121:11577-11578 (1999).

Un péptido diseñado de 16 residuos (KKYTVSINGKKITVSI) basado en la región unidora del ADN del represor met formó una estructura en horquilla en agua con una población estimada del 50% a 303 K. La truncación de una hebra mostró que el giro estaba poblado sin las interacciones de hebra, aunque con menor alcance (35%). Un análisis de los parámetros termodinámicos para la formación de horquilla mostró que el plegamiento estaba entálpicamente desfavorecido y dirigido entrópicamente, con \DeltaG = 0,08 kcal/mol a 298 K (Maynard y Searle, Chem. Commun. 1297-1298 (1997); Griffiths-Jones et al., Chem. Commun. 789-790 (1998); Maynard et al., J. Am. Chem. Soc. 120:1996-2007 (1998)). Griffiths-Jones, et al., J. Mol Biol. 292:1051-1069 (1999).

Un péptido con horquilla final (GEWTYDDATKTFTVTE), derivado del dominio B1 de la proteína G (GB1) tiene algunas de las características relevantes para los péptidos de la invención. A diferencia de las horquillas modelo descritas más arriba, la horquilla de GB1 tiene cuatro residuos treonina en sitios de las hebras unidos mediante enlaces de hidrógeno, incluyendo un par thr-thr entre hebras. Generalmente se cree que este es un emparejamiento desfavorable. Además, hay pares trp-val y tyr-phe en sitios adyacentes no unidos mediante enlaces de hidrógeno que podrían interaccionar para formar un pequeño núcleo hidrofóbico. Los datos publicados indican que el péptido GB1 formaba una horquilla bien poblada (aproximadamente el 50%) en agua. Los datos son consistentes con el emparejamiento de hebras nativas (Blanco et al., Nat. Struct. Biol. 1:584-590 (1994)). Un estudio de desnaturalización del péptido GB1 permitió la estimación de un 80% de horquilla a 273K, y el análisis de los datos (asumiendo \DeltaCp = 0) proporcionó \DeltaH = -11,6 kcal/mol, \DeltaS = -39 cal/mol K: es decir, el plegamiento está dirigido entálpicamente y desfavorecido entrópicamente (Munoz et al., Nature 390:196-199 (1998)). Los roles relativos de la entalpía y entropía están invertidos en comparación con el péptido del represor met descrito más arriba. Se publicaron resultados similares a partir de un estudio mediante RMN de la desnaturalización térmica del péptido GB1. Honda et al., J. Mol. Biol. 295:269-278 (2000). Un estudio de mutagénesis del mismo grupo (Kobayashi et al., Biochemistry 39:6564-6571 (2000)) identificó los residuos fenilalanina y tirosina entre hebras como especialmente importantes para la estabilidad de la horquilla. Finalmente, este grupo informó un análogo ciclado mediante disulfuro del péptido GB1 (CEWTYDDATKTFTVTCK; Kobayashi et al., Biochemistry 38:3228-3243 (1999)). La estructura de este análogo no se describió; sin embargo, se unía 7 veces más intensamente al resto de la proteína GB1 de lo que lo hacía el péptido sin ciclar.

Se han descrito varias hojas de tres hebras diseñadas: una de estas contiene sólo los 20 aminoácidos habituales que existen en las proteínas, y se pliega en agua (Kortemme et al., Science 281:253-256 (1998)). Un aspecto del diseño es la adición de un trp en una posición no unida mediante enlace de hidrógeno (por analogía con los dominios WW), mientras que también cambia dos residuos, no unidos mediante puente de hidrógeno en la siguiente hebra, a aminoácidos sin ramificar. Los autores afirman que los residuos ramificados no permiten que la cadena lateral del trp se empaquete a través de la siguiente hebra. El análisis termodinámico de los datos de desnaturalización rindió una energía libre de plegamiento de -0,6 kcal/mol a 278 K (población plegada estimada = 80-90%).

Se han descrito numerosos ejemplos de péptidos restringidos mediante disulfuro que se pretende imiten las horquillas de proteínas o como horquillas diseñadas de nuevo. En muchos casos, los diseños incluyen D-cisteínas en uno o ambos extremos, puesto que se creía inicialmente que la geometría del enlace disulfuro no era compatible con la geometría de hebras cruzadas de las horquillas. Sin embargo, hay algunos ejemplos que sí usan L-cys.

En la mayoría de estudios de péptidos ciclados mediante disulfuro está ausente la evidencia de estructura. Los ejemplos listados en ésta son aquéllos que se han determinado experimentalmente, o que usan aminoácidos no inusuales, y que tienen una potencia cercana a la de una proteína mayor, conteniendo una horquilla, en un ensayo biológico.

La estructura de un hexapéptido (Boc-CL-Aib-AVC-NMe) se determinó cristalográficamente, revelando un giro del tipo II' y una geometría de hoja-\beta (Karle et al., J. Am. Chem. Soc. 110:1958-1963 (1988)). Se estudió un octapéptido con el mismo espaciado de cisteínas (ACSPGHCE) mediante RMN, y tiene una estructura similar con un giro centrado en pro-gly (Walse et al., J. Comput.-Aided Mol. Des. 10:11-22 (1996)). Los péptidos de la forma Ac-CXPGXC-NHMe se evaluaron mediante medición del equilibrio de intercambio de disulfuro, el cual indica preferencias de giro entre péptidos tan grandes como 1 kcal/mol (Milburn et al., J. Am. Chem. Soc. 109:4486-4496 (1987)).

Un péptido cíclico de once residuos (CGVSRQGKPYC) basado en la proteína del gen 5 del M13 está estructurado establemente en solución acuosa, tal como se demuestra mediante análisis de RMN. El péptido cíclico adopta una estructura que es bastante similar al correspondiente bucle de la proteína. Los autores afirman que previamente no se había descrito una estructura de horquilla-\beta bien definida para ningún ciclo restringido mediante disulfuro y desprotegido (Rietman et al., Eur. J. Biochem. 238:706-713 (1996)). Este péptido tiene un par val-pro en los sitios no unidos mediante puente de hidrógeno más cercanos a las cisteínas.

La ciclización de péptidos correspondientes a bucles procedentes del factor anti-lipopolisacáridos de Limulus (LALF), en base a la estructura de rayos X, proporciono potentes unidores al lípido A. No hay evidencia de estructura en estos péptidos. Varios de estos péptido tienen pares aromáticos-aromáticos en los sitios no unidos mediante puentes de hidrógeno más cercanos a las cisteínas; sin embargo, el más potente (GCKPTFRRLKWKYKCG) tiene un par pro-tyr (Ried et al., J. Biol. Chem. 271:28120-28127 (1996)).

Los péptidos ciclados mediante disulfuro procedentes de la región de la horquilla de una defensina de conejo tienen actividad antibacteriana que excede (aproximadamente de 5 a 10 veces) la de los análogos lineales. La espectroscopia de dicroísmo circular indica cierta estructura no aleatoria en tampón fosfato. El péptido más potente (CAGFMRIRGRIHPLCMRR) tiene un par gly-pro en los sitios no unidos mediante puente de hidrógeno más cercanos a las cisteínas (Thennarasu y Nagaraj, Biochem. Biophys. Res. Commun. 254:281-283 (1999)).

Un último estudio describe varios péptidos procedentes de bucles del dominio 1 del CD4 humano. Además de la restricción del disulfuro, los autores han añadido aminoácidos aromáticos exocíclicos al extremo del péptido. Por ejemplo, un péptido que abarca los residuos 39-44 del CD4 se restringió como FCNQGSFLCY. No se proporciona evidencia de estructura, pero se describió que un péptido cíclico (FCYICEVEDQCY) antagonizaba tanto las interacciones normales del CD4 como las implicadas en la entrada en células por parte del HIV mediada por CD4 (Zhang et al., Nature Biotechnology 14:472-475 (1996); Zhang et al., Nature Biotechnology 15:150-154 (1997))

IV. Bibliotecas de péptidos

Muchos procedimientos para generar bibliotecas de péptidos que son conocidos en la técnica pueden usarse para generar las bibliotecas de la invención. En una realización, los miembros de la biblioteca de péptidos pueden crearse mediante síntesis y división realizada sobre un soporte sólido tal como el poliestireno o la resina de poliacrilamida, tal como se describe en Lam et al., Nature 354:82 (1991) y la publicación del PCT WO-92/00091. En un aspecto de la invención, pueden prepararse la biblioteca de péptidos cíclicos en la cual uno o más de los residuos A1, A2, A4, y/o A5 se fijan independientemente y los residuos A3 se varían.

Un procedimiento preferido para generar la biblioteca de la presente invención es mediante exhibición sobre fago. En una biblioteca de exhibición sobre fago, el péptido cíclico de la invención se fusiona al menos a una porción de una proteína de cubierta de fago para formar una proteína de fusión. La proteína de fusión puede prepararse expresando un gen de fusión que codifica la proteína de fusión usando técnicas conocidas de exhibición sobre fago, tales como las descritas más abajo. La proteína de fusión podría formar parte de un fago o partícula de fagómido, en la cual una o más copias del péptido cíclico se exhiben sobre la superfície de la partícula. Un gen que comprende un ácido nucleico que codifica el péptido cíclico o la proteína de fusión se halla dentro del ámbito de la invención.

En otra realización, la invención es un procedimiento que comprende los pasos de construir una biblioteca que contiene una diversidad de vectores de expresión replicables, comprendiendo cada vector de expresión un elemento regulador de la transcripción operativamente unido a una fusión de genes que codifica una proteína de fusión, en donde la fusión de genes comprende un primer gen que codifica un péptido cíclico de la invención y un segundo gen que codifica, al menos, una porción de una proteína de cubierta del fago, en donde la biblioteca comprende una pluralidad de genes que codifican proteínas de fusión de variantes del péptido cíclico. Los primeros genes variantes y las bibliotecas de los mismos que codifican péptidos cíclicos variantes se preparan usando técnicas de mutagénesis conocidas, tal como se describe con más detalle más abajo.

La invención también incluye vectores de expresión que comprenden genes de fusión, tal como se ha destacado más arriba, así como una biblioteca de estos vectores. La biblioteca de vectores podría adoptar la forma de una biblioteca de ADN, una biblioteca de partículas de virus (fagos o fagómidos) conteniendo la biblioteca de genes de fusión, o en forma de una biblioteca de células huéspedes que contienen una biblioteca de los vectores de expresión o partículas de virus.

También dentro de la invención, se halla un procedimiento de selección de nuevos polipéptidos unidores, que comprende (a) construir una biblioteca de vectores de expresión replicables variantes que comprenden un elemento regulador de la transcripción operativamente unido a una fusión de genes que codifica una proteína de fusión, en donde la fusión de genes comprende un primer gen que codifica el péptido cíclico de la invención, y un segundo gen que codifica al menos una porción de una proteína de cubierta de fago, en donde los vectores de expresión variantes comprenden primeros genes variantes; (b) transformar células huéspedes apropiadas con los vectores; (c) cultivar las células huésped transformadas en condiciones apropiadas formar partículas de virus (fagos o fagómidos) recombinantes que contienen al menos una porción del vector de expresión y capaces de transformar el huésped, de forma que las partículas exhiben una o más copias de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula; (d) poner en contacto las partículas con una molécula diana, de forma que al menos una porción de las partículas se unen a la molécula diana; y (e) separar las partículas que se unen de las que no lo hacen. En el procedimiento de la invención, la proteína de cubierta de fago es preferiblemente la proteína de cubierta del gen III o gen VIII de un fago filamentoso como el M13. Además, preferiblemente, el cultivo de las células huéspedes transformadas tiene lugar en condiciones apropiadas para formar fagos o partículas de fagómido recombinantes, en donde las condiciones se ajustan de forma que no más de una pequeña cantidad de fagos o partículas de fagómidos exhiban una o más copias de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula (exhibición monovalente).

La invención incluye también un procedimiento para introducir un sesgo estructural en una biblioteca de fagos exhibidos, usando los pasos (a) a (e) descritos más arriba. La invención incluye además un procedimiento para seleccionar las estructuras peptídicas formadoras de horquillas beta a partir de una biblioteca de exhibición sobre fago, usando los pasos (a) a (e) descritos más arriba, en donde se sabe que la diana une estructuras peptídicas en forma de horquilla beta, preferiblemente una proteína diana que se sabe las une.

La exhibición en bacteriófago (fago) es una técnica conocida mediante la cual polipéptidos variantes se exhiben como proteínas de fusión, con la proteína de cubierta, sobre la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J. K. y Smith, G. P., Science 249:386 (1990)). La utilidad de la exhibición sobre fagos radica en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteína selectivamente aleatorizadas (o ADNc aleatoriamente clonados) pueden clasificarse rápida y eficientemente en función de aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con elevada afinidad. La exhibición de bibliotecas de péptidos (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 (1990)) o proteínas (Lowman et al., Biochemistry 30:10832 (1991); Clackson et al., Nature 352:624 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991); Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8363 (1991)) sobre fagos se ha usado para examinar millones de polipéptidos en busca de aquéllos con propiedades de unión específicas (Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol. 2:668 (1991)). La clasificación de bibliotecas en fagos de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un número elevado de variantes, un procedimiento para la purificación mediante afinidad usando el receptor diana, y un medio para evaluar los resultados de enriquecimientos de unión. Patente estadounidense nº 5.223.409; patente estadounidense nº 5.403.484; patente estadounidense nº 5.571.689; patente estadounidense nº 5.663.143.

Típicamente, los polipéptidos variantes, tales como los compuestos cíclicos de la invención, se fusionan a una proteína del gen III, la cual se exhibe en un extremo del virión. Alternativamente, los polipéptidos variantes podrían fusionarse a la proteína del gen VIII, la cual es la principal proteína de cubierta del virión. Tales bibliotecas de exhibición polivalentes se construyen remplazando el gen III del fago con ADNc que codifica la secuencia ajena fusionada al extremo amino-terminal de la proteína del gen III.

La exhibición sobre fago monovalente es un proceso en el cual una secuencia de proteína o péptido se fusiona a una porción de una proteína del gen III y se expresas en niveles bajos en presencia de la proteína del gen III del tipo salvaje, de forma que las partículas exhiben mayoritariamente la proteína del gen III del tipo salvaje y una copia o ninguna de la proteína de fusión (Bass et al., Proteins 8:309 (1990); Lowman, H. B. y Wells, J. A., Methods: a Companion to Methods in Enzymology 3:205 (1991)). La exhibición monovalente tiene la ventaja frente a la exhibición en fago polivalente de que la progenie de las partículas de fagómido retiene su completa infectividad. Los efectos de avidez están reducidos, de forma que la clasificación es en base a la afinidad intrínseca por el ligando, y se usan vectores fagómidos, lo que simplifica las manipulaciones de ADN. Consultar también la patente estadounidense nº 5.750.373 y la patente estadounidense nº 5.780.279. Otros han usado fagómidos para exhibir proteínas, particularmente anticuerpos. Patente estadounidense nº 5.667.988; patente estadounidense nº 5.759.817; patente estadounidense nº 5.770.356; y patente estadounidense nº 5.658.727.

Los procedimientos para generar biblioteca de péptidos y para examinar estas bibliotecas se descubren también en la patente estadounidense nº 5.723.286; patente estadounidense nº 5.432.018; patente estadounidense nº 5.580.717; patente estadounidense nº 5.427.908; y patente estadounidense nº 5.498.530. Ver también la patente estadounidense nº 5.770.434; patente estadounidense nº 5.734.018; patente estadounidense nº 5.698.426; patente estadounidense nº 5.763.192; y patente estadounidense nº 5.723.323.

Podría usarse una estrategia en dos pasos para seleccionar ligandos de elevada afinidad a partir de bibliotecas de péptidos exhibidos sobre el fago M13. Primero se seleccionan las guías de baja afinidad a partir de bibliotecas polivalente, ingenuas, exhibidas sobre la principal proteína de cubierta (proteína VIII). Los seleccionados de baja afinidad se transfieren subsiguientemente a la proteína de cubierta menor del gen III y se maduran hasta una afinidad elevada en un formato monovalente.

Aunque muchos procedimientos de exhibición sobre fago han usado fagos filamentosos, también se conocen los sistemas de exhibición sobre fago lamboide (WO-95/34683; patente estadounidense nº 5.627.024), los sistemas de exhibición sobre fago T4 (Ren et al., Gene 215:439 (1998); Zhu, CAN 33:534 (1997); Jiang et al., CAN 128:44380 (1997); Ren et al., CAN 127:215644 (1997); Ren, Protein Sci. 5:1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes 10:173 (1995)) y los sistemas de exhibición sobre fago T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology 217:228-257 (1993); patente estadounidense nº 5.766.905), y pueden usarse para crear una biblioteca de los péptidos cíclicos de la invención.

Los vectores del gen III apropiados para la exhibición de los péptidos cíclicos de la invención incluyen el fUSE5 (Scott, J. K., y Smith G. P., Science 249:386-390 (1990)); fAFF1 (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6378-6382 (1990)); fd-CAT1 (McCafferty et al., Nature (London) 348:552-554 (1990)); m663 (Fowlkes et al., Biotechniques 13:422-427 (1992)); fdtetDOG, pHEN1 (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19:4133-4137 (1991)); pComb3 (Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3576-3580 (1992)); pCANTAB 5E (Pharmacia); y LamdaSurfZap (Hogrefe, Gene 137:85-91 (1993)).

Los procedimientos para exhibición sobre fagos de proteínas, péptidos y variantes mutadas de los mismos, incluyendo la construcción de una familia de vectores replicables variantes que contienen un elemento regulador de la transcripción operativamente unido a una fusión de genes que codifica un polipéptido de fusión, la transformación en células huéspedes apropiadas, el cultivo de las células transformadas para formar partículas de fago que exhibien el polipéptido de fusión sobre la superficie de la partícula de fago, la puesta en contacto de las partículas de fago recombinante con una molécula diana de forma que al menos una porción de la partícula se una a la diana, la separación de las partículas que se unen de las que no lo hacen, son conocidos y podrían usarse con el procedimiento de la invención. Consultar la patente estadounidense nº 5.750.373; WO-97/09446; patente estadounidense nº 5.514.548; patente estadounidense nº 5.498.538; patente estadounidense nº 5.516.637; patente estadounidense nº 5.432.018; WO-96/22393; patente estadounidense nº 5.658.727; patente estadounidense nº 5.627.024; WO-97/29185; O'Boyle et al., Virology 236:338-347 (1997); Soumillion et al., Appl. Biochem. Biotech. 47:175-190 (1994); O'Neil y Hoess., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:443-449 (1995); Makowski, Gene 128:5-11 (1993); Dunn, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:547-553 (1996); Choo y Klug, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:431-436 (1995); Bradbury y Cattaneo, TINS 18:242-249 (1995); Cortese et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:73-80 (1995); Allen et al., TIBS 20:509-516 (1995); Lindquist y Naderi, FEMS Micro. Rev. 17:33-39 (1995); Clarkson y Wells, Tibtech. 12:173-184 (1994); Barbas, Curr. Opin. Biol. 4:526-530 (1993); McGregor, Mol. Biotech. 6:155-162 (1996); Cortese et al., Curr. Opin. Biol. 7:616-621 (1996); McLafferty et al., Gene 128:29-36 (1993).

El gen que codifica la proteína de cubierta del fago y el gen que codifica la porción de polipéptido cíclico deseada de la proteína de fusión de la invención (es decir, el péptido cíclico de la invención fusionado a, al menos, una porción de una proteína de cubierta de fago) pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la técnica (ver, de forma general, Sambrook et al.). El ADN que codifica el gen podría sintetizarse químicamente (Merrfield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)) y, a continuación, mutarse para preparar una biblioteca de variantes tal como se describe más abajo.

Para ligar fragmentos de ADN juntos para formar un vector funcional que contenga la fusión de genes, los extremos de los fragmentos de ADN deben ser compatibles entre ellos. En algunos casos, los extremos serán directamente compatible después de su digestión con endonucleasa. Sin embargo, podría ser necesario convertir primero los extremos pegajosos producidos comúnmente por la digestión con endonucleasa en extremos romos para hacerlos compatibles con la digestión. Para hacer romos los extremos, el ADN se trata en un tampón apropiado durante al menos 15 minutos a 15ºC, con 10 unidades del fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN (Klenow) en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxinucleótidos. A continuación se purifica el ADN mediante extracción en fenol-cloroformo y precipitation con etanol, u otra técnica de purificación del ADN.

Los fragmentos de ADN cortados podrían separarse por tamaño y seleccionarse usando la electroforesis en gel del ADN. El ADN podría electroforarse a través de una matriz de agarosa o de poliacrilamida. La selección de la matriz dependerá del tamaño de los fragmentos de ADN a separar. Después de la electroforesis, el ADN se extrae de la matriz mediante electroelución, o, si se ha usado agarosa con bajo punto de fusión como matriz, fundiendo la agarosa y extrayendo el ADN de ella, tal como se describe en las secciones 6.30-6.33 de Sambrook et al.

Los fragmentos de ADN que han de ligarse juntos (digeridos previamente con los enzimas de restricción apropiados, de forma que los extremos de cada fragmento a ligar sean compatibles) se colocan en una solución en cantidades aproximadamente equimolares. La solución también contendrá ATP, tampón para ligasa, y una ligasa, tal como la ligasa de ADN del T4, en aproximadamente 10 unidades por 0,5 \mug de ADN. Si el fragmento de ADN debe ligarse en un vector, el vector se linealiza primero cortándolo con la(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s). El vector linealizado se trata a continuación con fosfatasa alcalina o con fosfatasa intestinal de ternera. La "fosfatación" impide la autoligación del vector durante el paso de ligación.

Después de la ligación, el vector, con el gen ajeno ahora insertado, se purifica y transforma en una célula huésped apropiada. Un procedimiento de transformación preferido es la electroporación. La electroporación podría llevarse a cabo usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4.910.140; patente estadounidense nº 5.186.800; patente estadounidense nº 4.849.355; patente estadounidense nº 5.173.158; patente estadounidense nº 5.098.843; patente estadounidense nº 5.422.272; patente estadounidense nº 5.232.856; patente estadounidense nº 5.283.194; patente estadounidense nº 5.128.257; patente estadounidense nº 5.750.373; patente estadounidense nº 4.956.288, o cualquier otro proceso conocido de electroporación por lotes o en continuo. Podría realizarse más de una electroporación (una pluralidad) para incrementar la cantidad de ADN que se transforma en las células huésped. Las electroporaciones repetidas se llevan a cabo tal como se describe en la técnica. Consultar, Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996). El número de electroporaciones adicionales podría variar según se desee desde varias (2, 3, 4, ... 10) hasta decenas (10, 20, 30, ... 100) e incluso centenas (100, 200, 300, ... 1000). Las electroporaciones repetidas podrían desearse para incrementar el tamaño de una biblioteca combinatoria, por ejemplo, una biblioteca de anticuerpos, transformada en las células huéspedes.

Preferiblemente, para la construcción de la biblioteca, el ADN está presente en una concentración de 25 microgramos/ml o superior. Más preferiblemente, el ADN está presente en una concentración de aproximadamente 30 microgramos/ml o superior, más preferiblemente, en una concentración de aproximadamente 70 microgramos/ml o superior, e incluso más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 100 microgramos/ml o superior, incluso hasta de varios cientos de microgramos/ml. Generalmente, la electroporación utilizará concentraciones de ADN en el rango de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 microgramos/ml. Una constante de tiempo durante la electroporación superior a los 3,0 milisegundos (ms) resulta en una eficiencia de transformación superior.

El ADN preferiblemente se purifica para retirar los contaminantes. El ADN podría purificarse mediante cualquier procedimiento conocido, no obstante, un procedimiento de purificación preferido es el uso de una purificación del ADN por afinidad. La purificación del ADN, por ejemplo, el ADN de plásmido recombinante, usando resinas unidoras del ADN y reactivos de afinidad es bien conocida y cualquiera de los procedimientos conocidos podría usarse en esta invención (Vogelstein, B. y Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615 (1979); Callen, W., Strategies 6:52-53 (1993)). También hay equipos para el aislamiento y purificación del ADN disponibles comercialmente a partir de diferentes fuentes, incluyendo Stratagene (CLEARCUT Miniprep Kit), y Life Technologies (GLASSMAX DNA Isolation Systems). Los procedimientos, no limitantes, apropiados para la purificación del ADN incluyen la cromatografía en columna (patente estadounidense nº 5.707.812), el uso de polímeros de sílice hidroxilados (patente estadounidense nº 5.693.785), el gel de sílice rehidratado (patente estadounidense nº 4.923.978), los silicatos boronados (patente estadounidense nº 5.674.997), las membranas de fibra de vidrio modificadas (patente estadounidense nº 5.650.506; patente estadounidense nº 5.438.127), los adsorbentes fluorinados (patente estadounidense nº 5.625.054; patente estadounidense nº 5.438.129), la tierra de diatomeas (patente estadounidense nº 5.075.430), la diálisis (patente estadounidense nº 4.921.952), los polímeros en gel (patente estadounidense nº 5.106.966) y el uso de compuestos caotrópicos con reactivos unidores de ADN (patente estadounidense nº 5.234.809). Después de la purificación, el ADN se eluye o resuspende de otro modo en agua, preferiblemente agua destilada o desionizada, para su uso en la electroporación en concentraciones de la invención. También se contempla el uso de soluciones tamponadas con poca sal.

Cualesquiera células apropiadas que puedan transformarse mediante electroporación podrían usarse como células huéspedes en los procedimientos de la presente invención. Las células huéspedes apropiadas que pueden transformarse incluyen las células bacterianas gram-negativas, tales como E. coli. Las cepas de E. coli apropiadas incluyen la JM101, cepa 294 de E. coli K12 (número de la ATCC: 31.446), la cepa W3110 de E. coli (número de la ATCC: 27.325), la E. coli X1776 (número de la ATCC: 31.537), la E. coli XL-1Blue (Stratagene), y la E. coli B; no obstante, también podrían usarse muchas otras cepas de E. coli, tales como las XL1-Blue MRF', SURE, ABLE C, ABLE K, WM1100, MC1061, HB101, CJ136, MV1190, JS4, JS5, NM522, NM538, y NM539. Las células se hacen competentes usando procedimientos conocidos. Sambrook et al., ver más arriba, 1.76-1.81, 16.30.

Para la electroporación, preferiblemente se usan concentraciones de células de aproximadamente 10^{10} unidades formadoras de colonias (cfu)/mL) de células vivas viables y superiores. Más preferiblemente, las células viables se concentran hasta aproximadamente 1 \times 10^{11} hasta aproximadamente 4 \times 10^{11} cfu/mL. Las células preferidas que podrían concentrarse hasta este rango son las células SS320 descritas más abajo. Las células preferible se hacen crecer en cultivo en caldo de cultivo estándar, opcionalmente durante 6-48 horas (o hasta OD_{600} = 0,6-0,8) a aproximadamente 37ºC, y a continuación se centrifuga el medio y se retira el sobrenadante (por ejemplo, se decanta). La purificación inicial es preferiblemente mediante resuspensión del precipitado de células en una solución tamponada (por ejemplo, HEPES, pH 7,4) seguida por centrifugación de nuevo y retirada del sobrenadante. El precipitado de células resultante se resuspende en glicerol diluido (por ejemplo, 5-20% v/v) y se centrifuga de nuevo para formar un precipitado de células y se retira el sobrenadante. La concentración final de células se obtiene resuspendiendo el precipitado de células en agua o glicerol diluido hasta la concentración deseada.

Una célula receptora particularmente preferida para la electroporación es una cepa de E. coli competente que contiene un episoma F' de fago. Cualquier episoma F0 que permita la replicación de fagos en la cepa podría usarse en la invención. Los episomas apropiados están disponibles a partir de cepas depositadas en la ATCC o están disponibles comercialmente (CJ236, CSH18, DH5alphaF', JM101, JM103, JM105, JM107, JM109, JM110), KS1000, XL1-BLUE, 71-18 y otras). La cepa SS320 se preparó emparejando células MC1061 con células XL1-BLUE en condiciones suficientes para transferir el episoma de la fertilidad (plásmido F') de XL1-BLUE a las células MC1061. En general, es suficiente mezclar cultivos de los dos tipos de células y hacer crecer la mezcla en medio de cultivo durante aproximadamente una hora a 37ºC para permitir que ocurra el emparejamiento y la transferencia del episoma. La nueva cepa de E. coli resultante tiene el genotipo de MC1061, que porta un marcador cromosómico de resistencia a la estreptomicina y el genotipo del plásmido F', el cual confiere resistencia a la tetraciclina. La progenie de este emparejamiento es resistente a ambos antibióticos y puede hacerse crecer selectivamente en presencia de estreptomicina y de tetraciclina. La cepa SS320 se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va., EE.UU., el 18 de Junio de 1998, y se le ha asignado el número de acceso al depósito 98795.

Este depósito de la cepa SS320 se realizó de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el "Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorgani1smos para el Propósito del Procedimiento de Patentes y las Regulaciones del mismo" (Tratado de Budapest). Este asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años a partir de la fecha de depósito. Los organismos estarán disponibles en la ATCC en los términos del Tratado de Budapest, y estarán sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie de los cultivos al público a partir de la concesión de la pertinente patente estadounidense o a partir hacerse pública cualquiera solicitud de patente estadounidense o extranjera, cualesquiera que suceda primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a cualquiera que detente el derecho a la misma, según determine el Comisionado de Patentes y Marca Registradas de los Estados Unidos de acuerdo con el artículo 35 de la Constitución de los Estados Unidos, sección 122, y las reglamentaciones del Comisionado relativas a la misma (incluyendo la nº 37 de la CFR, sección 1.14, con particular referencia a la 886 OG 638).

El asignatario de la presente invención ha aceptado que si los cultivos en depósito mueren, o se pierden, o se destruyen, cuando se cultivan en condiciones apropiadas, serán remplazados con prontitud, a partir de la notificación, con un espécimen viable del mismo cultivo. La disponibilidad de los cultivos depositados no debe considerarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes sobre patentes.

La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un procedimiento preferido para preparar las variantes por sustitución, supresión, e inserción de la invención. Esta técnica es bien conocida y el campo tal como es descrita por Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). En resumen, un gen que codifica una proteína de fusión o un polipéptido heterólogo se altera mediante hibridación de un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con una plantilla de ADN, en donde la plantilla es la forma en hebra única del plásmido que contiene la secuencia de ADN nativa o no alterada del gen. Después de la hibridación, se usa una polimerasa de ADN para sintetizar una segunda hebra completa, complementaria de la plantilla, la cual incorporará de ese modo el cebador de oligonucleótido, y codificará la alteración seleccionada en el gen. Generalmente, se usan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios de la plantilla en uno cualquiera de los lados del (de los) nucleótido(s) que codifican la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido se hibridará correctamente con la molécula plantilla de ADN de hebra única. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usando técnicas conocidas en el campo, tales como las descritas por Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765 (1978).

La plantilla de ADN se genera mediante aquellos vectores que se derivan del bacteriófago usado en el sistema de exhibición sobre fago, por ejemplo, los vectores del bacteriófago M13 (son apropiados los vectores M13mp18 y M13mp19 disponibles comercialmente), o aquellos vectores que contienen un origen de replicación de fago de hebra única; los ejemplos son descritos por Viera et al., Meth. Enzymol. 153:3 (1987). Por tanto, el ADN que debe mutarse puede insertarse en uno de estos vectores con objeto de generar la plantilla de hebra única. La producción de la plantilla de hebra única se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al.

Para alterar la secuencia del ADN nativo, el oligonucleótido se hibrida con la plantilla de hebra única en condiciones de hibridación apropiadas. A continuación, se añade un enzima polimerizador del ADN, usualmente la polimerasa de ADN de T4 o el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN, para sintetizar la hebra complementaria de la plantilla usando el oligonucleótido como un cebador para la síntesis. De ese modo se forma una molécula heterodúplex, de forma que una hebra del ADN codifica la forma mutada del gen, y la otra hebra (la plantilla original) codifica la secuencia no alterada, nativa, del gen. Esta molécula heterodúplex se transforma entonces en una célula huésped apropiada, usualmente una procariota tal como E. coli JM101. Después de cultivar las células, se siembran sobre placas de agarosa y se examinan usando el cebador de oligonucleótido marcado radiactivamente con 32-fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado.

El procedimiento descrito inmediatamente más arriba podría modificarse de tal forma que se creara una molécula homodúplex, en donde ambas cadenas del plásmido contienen la(s) mutación(es). Las modificaciones son como sigue: el oligonucleótido de hebra única se hibrida sobre la plantilla de hebra única tal como se ha descrito más arriba.. Una mezcla de los tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP), y desoxirribotimidina (dTTP), se combina con una tio-desoxirribocitosina denominada dCTP-(aS) (la cual puede obtenerse de Amersham). Esta mezcla se añade al complejo plantilla-oligonucleótido. A partir de la adición de la polimerasa de ADN a esta mezcla, se genera una hebra de ADN idéntica a la plantilla excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva hebra de ADN contendrá dCTP-(aS) en vez de dCTP, lo cual sirve para protegerla de la digestión por endonucleasa de restricción. Una vez se ha hecho una muesca en la hebra plantilla del heterodúplex de doble hebra con un enzima de restricción apropiado, se hebra plantilla se puede digerir con la nucleasa ExoIII, u otra nucleasa apropiada, más alla de la región que contiene el(los) sitio(s) a mutar. La reacción se detiene entonces para dejar una molécula que sólo parcialmente tiene una doble hebra. A continuación se forma un homodúplex de ADN de doble hebra usando polimerasa de ADN en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótidos, ATP, y ligada de ADN. Esta molécula homodúplex puede entonces transformarse en una célula huésped apropiada tal como E. coli JM101, tal como se describió más arriba.

Los mutantes en los que debe sustituirse más de un aminoácido podrían generarse de una de varias formas. Si los aminoácidos están ubicado juntos en la cadena polipeptídica, podrían mutarse simultáneamente usando un oligonucleótido que codifica todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están ubicados a cierta distancia los unos de los otros (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique la totalidad de los cambios deseados. En cambio, podría emplearse uno de dos procedimientos alternativos.

En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido para cada aminoácido a sustituir. A continuación, los oligonucleótido se hibridan simultáneamente con un ADN plantilla de hebra única, y la segunda hebra de ADN que se sintetitza a partir de la plantilla codificará la totalidad de las sustituciones de aminoácidos deseadas. El procedimiento alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es tal como se ha descrito para los mutantes únicos: el ADN del tipo salvaje se usa para la plantilla, un oligonucleótido que codifica la(s) primera(s) sustitución(es) de aminoácido(s) deseada(s) se hibrida con esta plantilla, y se genera entonces la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza como plantilla el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis. De ese modo, esta plantilla ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica la(s) sustitución(es) de aminoácido(s) deseada(s) se hibrida con esta plantilla, y la hebra de ADN resultante codifica ahora mutaciones procedentes de la primera y segunda rondas de mutagénesis. Este ADN resultante puede usarse como plantilla en una tercera ronda de mutagénesis, etcétera.

La mutagénesis por inserción de un casete es también un procedimiento preferido para preparar las variantes por sustitución, supresión, e inserción de la invención. El procedimiento se basa en el descrito por Wells et al., Gene 34:315 (1985). El material de partida es un plásmido (u otro vector) que contiene el gen a mutarse. Se identifican en el gen los codones que han de mutarse. Debe haber una único sitio para endonucleasa de restricción en cada lado de los sitios de mutación identificados. Si no existen tales sitios de restricción, podrían generarse usando el procedimiento de mutagénesis mediado por oligonucleótido descrito más arriba para introducirlos en las ubicaciones apropiadas en el gen. Una vez se han introducido los sitios de restricción en el plásmido, se corta el plásmido en esos sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido de doble hebra que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene las mutaciones deseadas usando procedimientos estándares. Este oligonucleótido de doble hebra se denomina como el casete. El casete se diseña para que tenga extremos 3' y 5' que sean compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de tal forma que puede ligarse directamente al plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de ADN mutado del gen. Los vectores que contienen las variantes mutadas pueden transformarse en células huéspedes apropiadas tal como se ha descrito más arriba.

Las células transformadas se seleccionan generalmente mediante cultivo con un antibiótico, comúnmente tetraciclina (tet) o ampicilina (amp), al cual se hacen resistentes debido a la presencia de genes de resistencia tet y/o amp en el vector.

Los vectores fagos y fagómidos apropiados para su uso en esta invención incluyen todos los vectores conocidos para la exhibición sobre fagos. Los ejemplos adicionales incluyen el pComb8 (Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992)); pC89 (Felici et al., J. Mol. Biol. 222:310-310 (1991)); pIF4 (Bianchi et al., J. Mol. Biol. 247:154-160 (1995)); PM48, PM52, y PM54 (Iannolo, J. Mol. Biol. 248:835-844 (1995)); fdH (Greenwood et al., J. Mol. Biol. 220:821-827 (1991)); pfd8SHU, pfd8SU, pfd8SY, y fdISPLAY8 (Malik y Perham, Gene 171:49-51 (1996)); "88" (Smith, Gene 128:1-2 (1993)); f88.4 (Zhong et al., J. Biol. Chem. 269:24183-24188 (1994)); p8V5 (Affymax); MB1, MB20, MB26, MB27, MB28, MB42, MB48, MB49, MB56: (Markland et al., Gene 109:13-19 (1991)). De forma similar, cualquier fago auxiliar conocidos podría usarse cuando se emplea un vector fagómido en el sistema de exhibición sobre fagos. Los ejemplo de fagos auxiliares apropiados incluyen el M13-KO7 (Pharmacia), M13-VCS (Stratagene), y R408 (Stratagene).

Después de la selección de las células transformadas, estas células se hacen crecer en cultivo y el ADN del vector podría aislarse entonces. El ADN del vector fago o fagómido puede aislarse usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1989).

El ADN aislado puede purificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la sección 1.40 de Sambrook et al., ver más arriba, y tal como se describe más arriba. Este ADN purificado puede entonces analizarse mediante secuenciación del ADN. La secuenciación del ADN puede efectuarse mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981), el procedimiento de Maxam et al., Meth. Enzymol. 65:499 (1980), o mediante cualquier otro procedimiento conocido.

V. Aplicaciones

Los diversos aspectos de la presente invención demuestran las ventajas de un sistema modelo original para el diseñar y analizar racionalmente péptidos con características estructurales definidas. Las bibliotecas combinatorias que comprenden tales péptidos, y los procedimientos para el uso de los mismos, proporcionan una información útil y herramientas para explorar las relaciones básicas estructura-actividad implicadas en casi todas las interacciones moleculares biológicas. Los péptidos descubiertos en ésta, o generados de acuerdo con los descubrimientos de la invención, pueden ser candidatos para varios agentes biológicos o terapéuticos, incluyendo, pero no limitándose a, inhibidores de enzimas, antagonistas de ligando, agonistas de ligando, toxinas, e inmunogenes.

Los ejemplos siguientes se proporcionan a modo de ilustración y no a modo de limitación. Todos los descubrimientos de las referencias citadas en ésta se incorporan expresamente en ésta, por referencia, en su totalidad.

Ejemplos Ejemplo 1 Diseño de un esqueleto de péptido con horquilla-\beta, restringido por disulfuro, estructurado

En este ejemplo, escogimos investigar las horquillas-\beta restringidas por disulfuro de los decámero en forma de CX8C como esqueletos para la exhibición de giro-\beta. Para nuestro propósito, es esencial diseñar una estructura compatible con muchas secuencias de giro. Es decir, los residuos distintos de aquellos en el giro deben sesgar significativamente el péptido hacia la estructura en horquilla. La ciclación mediante disulfuro es útil, aunque no lo suficiente para determinar si el enlace disulfuro podría usarse, no sólo como restricción covalente, sino también para nuclear una interacción más extensa de las hojas-\beta.

Materiales y Procedimientos

Síntesis del péptido. Los péptidos se sintetizaron usando la química del Fmoc estándar en un sintetizador Pioneer (PE Biosystems), se separaron de la resina con triisopropilsilano al 5% en ácido trifluoroacético (TFA), y se purificaron mediante HPLC en fase inversa (acetonitrilo/H_{2}O/0,1% de TFA). La identidad del péptido se confirmó mediante espectrometría de masas. Los péptidos se convirtieron en disulfuros cíclicos mediante la adición gota a gota de una solución saturada de I_{2} en ácido acético y se repurificaron mediante HPLC. Los péptidos purificados eluyeron como picos simétricos únicos en columnas analíticas de C18 (0-40% de acetonitrilo en 40 minutos).

Mediciones de la concentración efectiva de cisteína. Se prepararon soluciones de reserva de glutatión mezclando 3 volúmenes de glutatión reducido 0,2 M (GSH) con 1 volumen de glutatión oxidado 0,1 M (GSSG). Las alícuotas se almacenaron a -80ºC, y fueron estables durante varios meses; el uso de un único lote eliminó cualquier error en los valores de \Delta\DeltaG que pudiera originarse de la variabilidad de la concentración total de glutatión. El equilibrio tiol-disulfuro se estableció mezclando 50 \muL de solución de reserva de péptido (aproximadamente 3 mM en agua) con 50 \muL de solución de reserva de glutatión, desoxigenando la solución ácido con ciclos de vacío/argón a partir de una válvula Firestone, añadiendo a continuación mediante una jeringa 300 \mul de tampón desoxigenando (tris 0,2 M, pH 8,0; EDTA 1 mM; tris base 67 mM para tritar el glutatión), seguida por la desoxigenación adicional de la mezcla. El pH final de todas las mezclas de reacción fue 8,10 \pm 0,05. Las soluciones se agitaron bajo argón y se mantuvieron a 20ºC en un baño con agua. Transcurridas 1,5 h, se retiraron sucesivas alícuotas (100 \muL) con una jeringa hermética a los gases, inmediatamente apagadas mediante su descarga en 400 \muL de HCl 31 mM, y se analizaron mediante HPLC con un retraso mínimo. Los valores de C_{eff} se calcularon a partir de las proporciones molares de las formas reducida y oxidada del péptido y glutatión (proporción de áreas de picos, corregida para las diferencias de absorbancia, medidas mediante HPLC), asumiendo 0,025 M de monómero de glutatión total (es decir, despreciando la pequeña cantidad (<1%) de glutatión presente en los disulfuros mezclados con el péptido):

C_{eff}=([péptido_{ox}]/[ péptido_{red}]) \times ([GSH]^{2}/[GSSG])

[GSH] + 2[GSSG] = 0,025 M

[GSSG] = 0,025 M/(2 + 3,26 (área del pico de GSH/área del pico de GSSG))

[péptido_{ox}]/[ péptido_{red}] = (proporción de áreas de picos en equilibrio)/(proporción de absorbancias)

Dos o tres muestras de cada mezcla de reacción se analizaron; no hubo desplazamientos en las poblaciones con el tiempo, y los valores de C_{eff} calculados típicamente variaron en menos del 5% (equivalente a una imprecisión de 30 cal/mol en la \Delta\DeltaG).

Espectroscopia de RMN. Las muestras de RMN contenían 5-10 mM peptide en 92% H_{2}O/8% D_{2}O, pH 5,1, y 1,4-dioxano 0,1 mM como referencia de desplazamiento químico. Todos los espectros se adquirieron en un espectrómetro Bruker DRX-500 o Varian Unity-400, a 15ºC. Se adquirieron espectros 2QF-COSY, TOCSY y ROESY tal como se ha descrito (Cavanagh et al., Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practices (Academic Press, San Diego, (1995)) con selección de coherencia mediante gradientes (van Zijl et al., J. Magn. Reson. 113A:265-270 (1995)), o modulación de la excitación (excitation sculpting) (Hwang & Shaka, J. Magn. Reson. 112A, 275-279 (1995)) para supresión del agua. Las resonancias de protón se asignaron mediante procedimientos estándares (Wuthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids (John Wiley and Sons, New York(1986)). Las ^{3J}H^{N}-H^{\alpha} se obtuvieron ajustando curvas lorenzianas a los dobletes en antifase de los picos H^{N}-H^{\alpha} en los espectros 2QF-COSY procesados con elevada resolución digital en F_{2}. Las ^{3J}H^{N}-H^{\alpha} se extrajeron a partir de espectros COSY-35 adquiridos en soluciones de los péptidos en D_{2}O. Las restricciones de distancia y ángulos diedros se generaron tal como se ha descrito (Skelton et al., Biochemistry 33:13581-13592 (1994)). Se calcularon 100 estructuras iniciales usando el programa híbrido de geometría de distancias/"recocido" simulado (simulated annealing) DGII (Havel et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 56:43-78. (1991)); 80 de estas se refinaron aún más mediante dinámicas moleculares restringidas usando el campo de fuerzas de átomos AMBER implementado en el DISCOVER tal como se ha descrito previamente (Skelton et al., Biochemistry 33:13581-13592 (1994)). Se escogieron 20 conformaciones con la energía de violación de las restricciones más baja para representar la conformación en solución de cada péptido.

Cálculo de estructuras. Las estructuras se calcularon con 78 restricciones de distancia derivadas de ROE (10 restricciones de medio alcance y 28 de largo alcance; límites superiores de 5,4, 4,3, 3,4 o 3,0 angstroms) y 12 restricciones de ángulo diedro. Las 20 estructuras finales tenían una violación máxima promedio de las restricciones de distancia y ángulo diedro de 0,05 \pm 0,02 angstroms y 0,7 \pm 0,2º, respectivamente. Las desviaciones RMS de la distancia experimental y del ángulo diedro fueron 0,007 \pm 0,002 angstroms y 0,29 \pm 0,08º, respectivamente. El RMSD promedio de la estructura promedio es 0,28 \pm 0,04 angstroms para N, C^{\alpha}, y los átomos de los residuos Cys1-Cys10, mientras que el 75% de los residuos tenía valores \Phi, \Psi en las porciones más favorecidas de la gráfica de Ramachandran (ninguno estaba en la región no permitida o generosamente permitida) (Laskowski et al., J. Appl. Crystallogr. 26:283-291 (1993)).

Análisis de la RMN. Las muestras de péptidos CD4 contenían aproximadamente 2 mM de péptido en 92% H_{2}O/8% D_{2}O, pH 3,5, con 50 \muM de ácido 3-(trimetilsilil)-1-propano-1,1,2,2,3,3,-d_{6}-sulfónico (DSS) como referencia de desplazamiento químico. Los espectros se adquirieron y analizaron como se ha descrito más arriba. La estructura del cd2 se calculó a partir de 84 restricciones de distancia (incluyendo 13 de medio rango y 23 de largo rango) y 13 restricciones de ángulo diedro derivadas de ROE. Las violaciones máximas promedio de las restricciones de distancia y ángulo diedro fueron 0,05 \pm 0,01 angstroms y 0,6 \pm 0,4º, respectivamente; las RMSD respecto la distancia experimental y las restricciones de ángulo diedro fueron 0,009 \pm 0,002 angstroms y 0.2 \pm 0,1º, respectivamente. La geometría covalente es buena, con un 74% de los ángulos \Phi, \Psi dentro de la región más favorecida y ninguno en las regiones no permitidas o generosamente permitidas de la gráfica de Ramachandran plot (Laskowski et al., J. Appl. Crystallogr. 26:283-291 (1993)).

Análisis de los rotámeros de las cadenas laterales. La observación de ambas, ^{3J}H^{\alpha}-H^{\beta1} y ^{3J}H^{\alpha}-H^{\beta2} en el rango de 6-9 Hz indica que una cadena lateral no ocupa un único rotámero clásico (\chi1=-60º, +60º o 180º), y lo más probable es que represente los tres pozos de rotámero espaciados. Esta es la situación para Trp3 y Leu8 de bhpW y para Gln4, Phe7 y Leu8 de cd2. Los picos ROE observados para estas cadenas laterales representan un promedio temporal a lo largo del rango de valores de \pi1 muestreados. No todas estas conformaciones originarán picos ROE fácilmente observables, por tanto, el proceso de cálculo estará sesgado hacia aquellos rotámeros para los cuales se pudieron obtener restricciones. Por ejemplo, se observan ROE de Phe7 de cd7 con protones en la hebra opuesta, forzando de ese modo que Phe7 esté en el pozo de rotámero a +60º. Dado el número elevado de restricciones de distancia esqueleto-esqueleto y de ángulo diedro \Phi dihedral, las estructuras calculadas para bhpW y cd2 sí que representan con precisión la conformación en solución de esos péptidos, excepto por la sobredeterminación de algunas orientaciones de cadenas laterales.

Resultados

En nuestra inspección de hojas-\beta a partir de un conjunto de 928 estructuras de proteínas no redundantes, las distancias medias C^{\beta}-C^{\beta} entre pares de residuos unidos mediante puentes de hidrógeno y no unidos en hebras adyacentes era 4,82 \pm 0,58 y 5,37 \pm 0,56 angstroms, respectivamente, mientras que la distancia promedio C^{\beta}-C^{\beta} en cisteínas unidas mediante enlace disulfuro era 3,84 angstroms. Por tanto, los átomos C^{\beta} de residuos opuestos en hebras antiparalelas estaban normalmente demasiado lejos para la formación de un enlace disulfuro. Sin embargo, a veces se encuentran entrecruzamientos disulfuro entre cisteínas en el registro que no se une mediante enlaces de hidrógeno en hojas-\beta. Hallamos 23 pares de cisteínas unidas mediante enlace disulfuro que unían hebras antiparalelas adyacentes. En 14 de los 23 casos, el disulfuro se empaqueta estrechamente contra la cadena lateral hidrofóbica que hay dos residuos antes de una (o ambas) de las cisteínas (Figura 1a). En 5 casos adicionales, este sitio hidrofóbico estaba ocupado por un residuo polar o cargado con metilenos \beta o \gamma (E, Q o R). En particular, las cadenas laterales de leucina o un aminoácido aromático proporcionan un buen perfil de complementariedad para esta conformación de disulfuro característica. En consecuencia, escogimos leucina como residuo nº 9 en nuestro péptido modelo (Figura 1b), incluimos treoninas en las posiciones 2 y 9 para promover una conformación de esqueleto extendida, y escogimos la secuencia de giro EGNK como un giro-\beta del tipo II' representativo, pero no exageradamente fuerte. Para determinar el mejor emparejamiento a través de las hebras con la leucina, se varió la posición 3.

La presencia de un enlace disulfuro proporciona una sonda conveniente para la estabilidad de la horquilla. El equilibrio tiol-disulfuro se midió en relación a la referencia tiol-glutatión, rindiendo concentraciones efectivas (C_{eff}) para los pares de cisteína. Valores elevados de C_{eff} indican una proximidad incrementada, en promedio, de los tioles de cisteína, consistente con la formación de la estructura en horquilla. Este procedimiento se ha usado para evaluar el efecto de las sustituciones de residuos en un giro-\beta sobre la estabilidad de la horquilla. Stroup y Gierasch, Biochemistry 29:9765-9771 (1990). Los valores de C_{eff} del péptido variaron significativamente para diferentes residuos en la posición 3 (Figura 2a). Sorprendentemente, el triptófano en la posición 3 desplaza fuertemente el equilibrio hacia la forma oxidada: este comportamiento no estaba causado por la agregación del péptido. Escalando los valores de C_{eff} con los del análogo de alanina (-RT ln(C_{eff},a/C_{eff},ala)) rinde diferencias de energía libre que abarcan > 0,8 kcal/mol (Figura 2b), que pueden interpretarse como las tendencias relativas de los péptidos a plegarse. Sin embargo, estos datos no distinguen entre efectos sobre los estados plegado y desplegado del péptido. Por ejemplo, una determinada sustitución podría promover el empaquetamiento favorable de la cadena lateral en el péptido oxidado, o simplemente sesgar hacia conformación de esqueleto extendido en el péptido reducido.

Para verificar si los péptidos formaban realmente horquillas-\beta, varios de ellos es evaluaron mediante espectroscopia de RMN de ^{1}H NMR (Tabla 1). El péptido con triptófano (bhpW) exhibió todas las características distintivas de una horquilla-\beta altamente poblada en términos de NOE H^{\alpha}-H^{N} secuenciales intensos, numerosos NOE del esqueleto entre hebras, y grandes constantes de acoplamiento escalar del esqueleto (^{3J}H^{N}-H^{\alpha} > 8,0 Hz) para los residuos de la hebra. Los desplazamientos químicos de H^{\alpha} para Cys1 y Cys10 estaban desplazados hacia campos más bajo en relación a los valores observados en los péptidos no estructurados, indicando que las hebras antiparalelas abarcan estos residuos terminales. Los otros péptidos estudiados se juzgo que tenían una población inferior con la estructura en horquilla (consultar la Tabla 1). De forma interesante, los datos de RMN se correlacionan bien con la C_{eff} (Tabla 1); así pues, el ensayo de intercambio de disulfuro proporciona una cuantificación útil del grado de estructura en horquilla en los péptidos oxidados.

TABLA 1

\begin{minipage}[t]{150mm} Comparación de las concentraciones efectivas de cisteína (C_{eff}) y los datos de RMN de ^{1}H para péptidos con horquilla modelo seleccionados.\end{minipage}
Residuo 3 (X,	C_{eff}, mM	Nº de ^{3J}HN	\delta (Cys1	\delta (Cys10
Figura 1b)		-H^{\alpha} > 8 Hz	H^{\alpha}), ppm	H^{\alpha}), ppm
Trp bhpW	210 \pm 4	7	5,20	5,00
Tyr	98 \pm 2	7	5,07	4,91
Phe	88 \pm 0	5	5,07	4,92
Leu	85 \pm 1	6	5,04	4,89
Val	73 \pm 0	4	4,97	4,85
Lys	52 \pm 2	3	4,92	4,82
Asn	52 \pm 1	3	4,92	4,76
hélice aleatoria		0	4,71	4,71

El número máximo de residuos de la hebra con ^{3J}HN-H^{\alpha} > 8 Hz es 8; para el péptido con triptófano (bhpW), la constante de acoplamiento de Leu8 es 7,9 Hz. Las constantes de acoplamiento de la hélice aleatoria se tomaron de Smith et al., (Smith et al., J. Mol. Biol. 225:494-506 (1996)). Los desplazamientos químicos de H^{\alpha} de la hélice aleatoria se tomaron de Wishart et al., (Wishart et al., Biochemistry 31:1647-1651 (1992)).

Ejemplo 2 Transferencia de secuencias de giro alternativas al esqueleto de la horquilla

Las estructuras calculadas para bhpW de acuerdo con el Ejemplo 1 revelan una horquilla antiparalela bien formada con un giro-\beta del tipo II' (Gly5-Asn6), y contactos hidrofóbicos entre las cadenas laterales de Cys1, Trp3, Leu8 y Cys10 (Figura 3). El análisis termodinámico de la estabilidad de bhpW se complicó por la imposibilidad del péptido oxidado para desplegarse completamente, bien a alta temperature o en presencia de desnaturalizantes químicos. Sin embargo, estimamos que la conformación en horquilla estaba altamente poblada, lo más probablemente > 80%, a 15ºC. Debido a su estabilidad estructural, hemos escogido el bhpW para investigar como un esqueleto para mostrar un giro. En consecuencia, hemos ensayado si una secuencia de giro diferente podría ser estructurada por las secuencias de la hebra de bhpW.

Una reciente estructura de cristal de la gp120 de VIH unida a un anticuerpo neutralizador y a un CD4 humano reveló detalles de las superficies de contacto (Kwong et al., Nature 393:648-659 (1998)). Tal como se había anticipado, la región del CD4 más importante para la unión de la gp120 es el bucle en horquilla C'-C'' (residuos 37-46), con la cadena lateral de la Phe43 crítica extendiéndose desde la superficie de la proteína. De hecho, los residuos 40-48 del CD4 contribuyen el 63% del área superficial enterrada en la interfaz, con un 23% del total contribuido por Phe43 (Kwong et al., Nature 393:648-659 (1998)). Inesperadamente, hay una gran cavidad en gp120, detrás del sitio de unión de Phe43, que está recubierta de residuos hidrofóbicos. Parecía posible que un péptido estructurado basado en el giro C'-C'' pudiera unirse a la gp120 y, caso de hacerlo, podría ser un punto de unión para diseñar ligandos que se extendieran hacia la cavidad observada en la estructura del cristal.

Sintetizamos un péptido restringido mediante enlace disulfuro en base a la secuencia nativa de la horquilla del CD4 (residuos 38-45, cd1 en la Tabla 2) y hallamos que estaba esencialmente no estructurado en solución (Figura 4a). A continuación realizamos las sustituciones G2T y N3W, para igualar los residuos correspondientes en el bhpW (cd2, Tabla 2); los residuos L8 y T9 ya están presentes en la secuencia nativa del CD4. El péptido cd2 está bien ordenado, adoptando una estructura en horquilla con un giro del tipo II' (Figura 4). En la Figura 4A, se muestran las asignaciones de picos para el cd2; las flechas indican la ubicación del correspondiente pico cruzado en cd1. Aquellos residuos de cd2 con ^{3J}H^{N}-H^{\alpha} > 8,3 Hz están subrayados; todos los residuos cd1 tienen constantes de acoplamiento del esqueleto entre 5,9 y 7,7 Hz. A partir de los valores de C_{eff} medidos, el giro de CD4 (QGSF) desestabiliza el modelo en horquilla (giro EGNK) en 0,5 kcal/mol, y hemos hallado que ambas, las sustituciones de T2 y W3 eran necesarias para una estructura en horquilla estable (Tabla 2). De forma importante, la comparación de la estructura del péptido con la de CD4 indica que las conformaciones del esqueleto son esencialmente las mismas, dentro de las imprecisiones de las determinaciones estructurales (RMSD = 0,93 angstroms; Figura 4B). La Figura 4B muestra el conjunto de estructuras por RMN para cd2 (20 modelos; dos vistas ortogonales) mostradas sobrepuestas a los residuos 37-46 de CD4 (en rojo) procedentes de la estructura del cristal del CD4 unido a gp120. La RMSD para los 20 modelos, con relación a las coordenadas promedio para los átomos del esqueleto de los residuos 1-10, es de 0,50 \pm 0,09 angstroms; en comparación, las coordenadas promedio de los residuos 1-10 con los residuos 37-46 del CD4 procedentes de la estructura del cristal dan una RMSD de 0,93 angstroms. Debe notarse que las constantes de acoplamiento ^{3J}H^{\alpha}-H^{\beta} para Phe7 de cd2 indican que esta cadena lateral no está fijada en el rotámero observado en el conjunto; la cadena lateral de Phe7 adopta múltiples conformaciones en solución, sin duda, muestreando la observada en la estructura del cristal. Esto demuestra que el esqueleto del péptido presenta correctamente el giro-\beta de CD4.

TABLA 2

Comparación del bhpW y de péptidos basados en el bucle C'-C'' del CD4
Peptide	C_{eff} (mM)	[\theta]_{215} (deg	Nº de ^{3J}H^{N}-	\delta(Cys_{N} H^{\alpha})	\delta(Cys_{C} H^{\alpha})
		cm^{2} dmol^{-1}	H^{\alpha} > 8 Hz	(ppm)	(ppm)
Ac-CTWEGNKL
TC-NH_{2} bhpW	210 \pm 4	-19800	7	5,20	5,00
SCTWEGNK
LTCK-NH_{2}	273 \pm	-17400	n.d.	n.d.	n.d.
Ac-CGNQGSFL
TC-NH_{2} cd1	n.d.	n.d.	0	4,66	4,66
Ac-CTWQGSFL
TC-NH_{2} cd2	n.d.	-15800	6	5,08	4,93
SCGNQGSF
LTCK-NH_{2} cd1a	45 \pm 4	-1500	0	4,80	1,72
SCTNQGSF
LTCK-NH_{2}	n.d.	-5000	2	4,96	4,79
SCGWQGSF
LTCK-NH_{2}	48 \pm 0	-6100	3	5,00	4,88
SCTWQGSF
LTCK-NH_{2}	120 \pm 0	-14000	6	5,36	5,14
n.d.: no determinado;
Cys_{N} H^{\alpha}: desplazamiento químico del H^{\alpha} para la cisteína más N-terminal (Cys1 o Cys2);
Cys_{C} H^{\alpha}: desplazamiento químico del H^{\alpha} para la cisteína más C-terminal (Cys10 o Cys11).

Se añadieron residuos serina y lisina terminales para mejorar la solubilidad de algunas variantes del péptido CD4, las cuales están de otro modo inalteradas. Se hizo una modificación similar al bhpW como control. Los residuos que no pertenecen al giro y que difieren entre el bhpW y el bucle del CD4 están subrayados. La coelución de los péptidos reducidos y oxidados impidió la medición de la C_{eff} para la variante T2, N3 del péptido CD4. Los espectros de dicroísmo circular se adquirieron a 10ºC, con un espectrofotómetro Model 202 de Aviv Instruments, Inc.; las concentraciones de péptido fueron de 20 \muM en fosfato potásico 20 mM, pH 7.0.

[n.d.: no determinado; Cys_{N} H^{\alpha}: desplazamiento químico del H^{\alpha} para la cisteína más N-terminal (Cys1 o Cys2); Cys_{C} H^{\alpha}: desplazamiento químico del H^{\alpha} para la cisteína más C-terminal (Cys10 o Cys11)].

Otras dos secuencias del giro evaluadas fueron la VWQL del bucle F-G del dominio 2 de un Fc-epsilon-RI humano, y la GPLT del péptido EMP1 agonista de la EPO. Los tres giros se evaluaron en el esqueleto del péptido trp y en péptidos ciclados cuyas secuencias imitaban más estrechamente las horquillas progenitoras nativas:

	SCGNQGSFLTCK-NH_{2}	péptidos CD4	a
	SCTWQGSFLTCK-NH_{2}		b
	Ac-CTKVWQLWTC-NH_{2}	péptidos Fc-epsilon-RI	c
	SCTWVWQLLTCK-NH_{2}		d
	SCHFGPLTWVCK-NH_{2}	péptidos EMP1	e
	SCTWGPLTLTCK-NH_{2}		f

Los espectros de dicroísmo circular muestran que en cada caso, el esqueleto de horquilla de trp diseñado proporciona un péptido más estructurado (Figuras 5a-c). Los datos de RMN son consistentes con una estructura en horquilla incrementada en los péptidos, demostrando que el esqueleto puede desplazar una variedad de giros "difíciles" hacia estados estructurados.

Otros giros comunes que pueden presentarse sobre el esqueleto en horquilla incluyen los giros-gamma (3 aminoácidos), los giros en doblez (5 ó 6 aminoácidos), y las horquillas más largas (8 aminoácidos). Se conocen otras longitudes de giros, y también son compatibles con el esqueleto.

Los resultados en los Ejemplos 1 y 2 demuestran que la optimización de una única posición de la hebra es una horquilla pequeña restringidas por enlace disulfuro es suficiente para convertir una molécula pobremente estructurada en una que está altamente estructurada (-\Delta\DeltaG > 0,8 kcal/mol). La porción de tallo de la horquilla estructurada,
-CTW- - - -LTC-, no requiere una secuencia de giro optimizada; por tanto, es un esqueleto apropiado para la exhibición de bibliotecas de giros-\beta y para estudiar giros particulares que de otro modo podrían no estar altamente poblados. De forma importante, solo se requieren aminoácidos naturales, por tanto, las bibliotecas de giros podrían exhibirse sobre fago.

Es interesante comparar las energías de sustitución que publicamos aquí con estudios previos sobre sistemas de hoja-\beta. Aunque la magnitud de las diferencias de energía es similar, el orden de rangos que nosotros obtenemos no se correlaciona con las escalas de \beta-propensión o con las frecuencias de pares de residuos observadas en hojas-\beta conocidas (Hutchinson et al., Protein Sci. 7:2287-2300 (1998), Wouters, M.A. y Curmi, P.M.G., Proteins 22:119-13 (1995)1). En particular, el triptófano es corriente en tales escalas. Estas diferencias recalcan que las tendencias promedio en dominios proteicos típicos podrían no aplicarse directamente a péptidos pequeños en los cuales la mayoría de los residuos están altamente expuestos al solvente, complicando el uso de tal información en el diseño de novo. Más aún, el orden de rangos de \Delta\DeltaG no se correlaciona bien con la creciente área de superficie no polar de las cadenas laterales, aunque los residuos preferidos son hidrofóbicos.

Finalmente, el tallo de la horquilla es muy pequeño, aunque la combinación de enlace disulfuro y contacto terciario entre hebras confiere un sesgo estructural que excede el del enlace disulfuro solo, por ejemplo, CX_{4}C. Aunque es bien conocido que algunas secuencias concretas (por ejemplo, VVVV) (Milburn et al., Int. J. Peptide Protein Res. 31:311-321 (1988)) no pueden adoptar conformaciones compatibles con nuestra horquilla, es también cierto que se ha observado que muy pocas de las secuencias de giros observadas en proteínas adoptan conformaciones en giro bien definidas en péptidos aislados. Hemos demostrado una estrategia simple para incrementar este número. Nosotros prevemos que las bibliotecas de horquillas con secuencias de giros aleatorizadas (por ejemplo, XCTWX_{4}LTCX) podrían proporcionar ligandos estructurados cuyos determinantes de unión podrían transferirse fácilmente a pequeños miméticos sintéticos de giros, o incluso usarse directamente para identificar pequeñas moléculas guía para una optimización por afinidad con elevado rendimiento (Rohrer et al., Science 282:737-740 (1998)).

Ejemplo 3 Cuantificación de las contribuciones relativas de los giros y de las interacciones a través de hebras

En el Ejemplo 1 anterior, las sustituciones se introdujeron en la posición 3 (X) del péptido modelo bhp (péptido 1). Este sitio del invitado está bastante cerca en el espacia al giro del tipo II' (gly-asn, Figura 1). Para investigar aún más si las horquillas con diferentes secuencias de giro y geometrías tendrían diferentes preferencias de residuos en el sitio del invitado de NHB, la secuencia central asn-gly en el péptido modelo 1 se remplazó con el giro del tipo I' asn-gly (péptido 2) y con los giros del tipo II' D-pro-asn y D-pro-gly (péptidos 3 y 4). Las sustituciones en la posición 3 (X) se escogieron para abarcar el rango es estabilidades de la horquilla observadas en las series gly-asn. La C_{eff} se midió como se
ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Los valores obtenidos para los diferentes giros se comparan en la Figura 6.

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	Ac-CT X E GN KLTC- NH_{2}	1	II'
	Ac-CT X E NG KLTC- NH_{2}	2	I'	X = W, Y, L, V, T o D
	Ac-CT X E pN KLTC- NH_{2}	3	II'	p = D-pro
	Ac-CT X E pG KLTC- NH_{2}	4	II'

En todos los casos, el triptófano en la posición 3 proporciona el valor de C_{eff} más elevado para un giro determinado, demostrando que su influencia estabilizadora es general. Los grandes cambios en C_{eff} para las diferentes interacciones entre hebras (eje horizontal) y las secuencias de giros (eje vertical) muestran que ambas pueden contribuir significativamente a la estabilidad en estos péptidos con horquilla cíclicos. Finalmente, hay sorprendentes correlaciones lineales entre estos conjuntos de datos, indicando que las sustituciones en la posición 3 de la hebra y las sustituciones del giro hacen contribuciones independientes a la estabilidad de la horquilla cíclica. Estos datos sugieren que el plegamiento en horquilla podría ser bastante modular, lo que simplificaría significativamente el diseño de la horquilla.

Las energías relativas de los giros pueden calcularse comparando los valores de C_{eff} para los pares apropiados de péptidos. Sin embargo, la correlación en la Figura 6 permite el cálculo de las energías del giro a partir de las pendientes, lo que debería menos sensible al error experimental. Estos valores se listan en la Tabla 3. En comparación con asn-gly (tipo I'), gly-asn (tipo II') es menos estabilizador, mientras que los giros que contienen D-pro (también del tipo II') potencian la estabilidad de la horquilla. En el caso en que pudiera hacerse una comparación, asn-gly vs. D-pro-gly, el valor de \Delta\DeltaG obtenido en ésta concuerda razonablemente bien con el obtenido mediante RMN. Esto sugiere que los estados de referencia asignados por Syud et al., J Am Chem Soc 121:11577 (1999) y su suposición de plegamiento en dos estados son apropiados para su sistema modelo; sin embargo, no siempre es posible definir tales estados de referencia.

TABLA 3

*Energías del giro relativas a Asn-Gly en los péptidos 1-4
secuencia del giro	Correlación C_{eff}		\Delta\DeltaG, kcal mol^{-1\alpha}
	pendiente	R^{2}
repetición
asn-gly^{1}	1,19	0,99	-0,10
gly-asn	0,29	0,97	0,72
D-pro-asn	2,72	0,98	-0,58
D-pro-gly^{c}	3,01	0,99	-0,64
^{a}\Delta\DeltaG = -RT ln(pendiente). T = 293 K. Las pendientes proceden de la gráfica de la Figura 2.
^{b} \begin{minipage}[t]{153mm} Se hicieron dos conjuntos de mediciones completamente independientes para los péptidos asn-gly con objeto de verificar la fiabilidad del ensayo a lo largo del tiempo. \Delta\Delta G para los dos conjuntos de datos (\sim100 cal mol^{-1}) podría tomarse como una estimación del error en las energías del giro mencionadas aquí.\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{153mm} \Delta\Delta G podría compararse con el valor de -0,52 \pm 0,11 kcal mol^{-1} (277 K) publicado recientemente por Syud et al., (1999), ver más arriba.\end{minipage}

Alternativamente, las energías de sustitución para la posición en la hebra podrían obtenerse representando los mismos datos agrupados, en cambio, según el residuo X (no se muestran). Las correlaciones son de nuevo excelentes, y las pendientes proporcionan los cambios en energías libres (Tabla 4). El rango de energías es mayor que el mencionado en el Ejemplo 1 para el péptido 1 (1,42 vs 0,85 kcal mol^{-1}). La mayor parte de la diferencia es atribuible a aquellas sustituciones en la parte inferior de la escala de estabilidad (particularmente, asp). Los menos estables de los péptidos del giro gly-asn no están detectablemente estructurados, y los ensayos de C_{eff} no registran diferencia alguna entre ellos. Por tanto, los datos obtenidos en péptido con secuencias de giro más fuertes proporciona una visión más completa de las energías de sustitución en la hebra.

TABLA 4

Contribuciones energéticas relativas del residuo X de la hebra.
residuo X	pendiente^{a}	\Delta\DeltaG, kcal mol^{-1 b}	\Delta\DeltaG, giro GN^{c}
trp	2,92	-0,62	-0,53
tyr	1,27	-0,14	-0,08
val	0,66	0,24	0,09
thr	0,45	0,46	0,30
asp	0,25	0,80	0,32
^{a} Los valores de C_{eff} se representaron frente a los de los péptidos 1-4 de leucina.
^{b}\Delta\DeltaG = -RT ln(slope), T = 293 K.
^{c}\Delta\DeltaG para la serie de giros gly-asn (\Delta\DeltaG = -RT ln (C_{eff,X}/C_{eff,leu})), tal como se describe en el Ejemplo 1.

Con objeto de verificar cómo los tipos de giro afectan la estructura en horquilla, se caracterizaron mediante espectroscopia de RMN los análogos con triptófano de 2 y 3, y se calcularon las estructuras tal como se describe en el Ejemplo 1 para el péptido 1. La comparación de las estructuras promedio minimizadas en la Figura 7 revela que las conformaciones del esqueleto y cadena lateral son muy similares para los residuos que no pertenecen al giro (RMSD \sim0,3 angstroms) con independencia del tipo de giro presente. Por tanto, de forma consistente con las correlaciones lineales en C_{eff} (Figura 6), estos tres giros no ejercen ninguna influencia estructural sobre las hebras adyacentes.

La importancia de la secuencia del giro y del buen emparejamiento entre hebras para la estructura en horquilla se ha tratado en muchos estudios con modelos. No obstante, hay pocos datos cuantitativos o evaluación sistemática de las sustituciones de residuos. Nuestros datos muestran que, para estos sencillos péptidos cíclicos, las sustituciones en un sitio de la hebra y en el giro conforman unas sencillas relaciones lineales de energía libre, y tienen efectos independientes y aditivos sobre la estabilidad de la horquilla. Esto es inesperado, dada su proximidad en la estructura (Figuras 3 y 7), y la sensibilidad descrita de las energías de los giros respecto las características de anclaje de la proteína. Mattos et al., J. Mol. Biol. 238:733 (1994). Sin embargo, parece que el acoplamiento entre estos giros y las hebras es despreciable en comparación con la gran influencia que ejercen solos. Esto sugiere que la estabilidad de la horquilla-\beta podría comprenderse mediante el análisis separado de estos componentes.

Ejemplo 4 Cuantificación de las contribuciones energéticas de los residuos entre hebras

Los resultados de los Ejemplos anteriores revelaron que el triptófano era bastante estabilizador en el sitio X no unido por puentes de hidrógeno (NHB) de la hebra del péptido 1, cuando se emparejaba con una leucina en la hebra opuesta. El péptido con triptófano (bhpW) estaba bastante estructurado en agua, adoptando la conformación en horquilla pretendida (Figura 3). Aquí investigamos la relación entre los residuos NHB a través de la hebra. De forma remarcable, hallamos que las preferencias de residuo para los dos sitios estructuralmente no equivalentes son las mismas, y que las interacciones de pares específicos producen sólo pequeñas desviaciones respecto las contribuciones del sitios solo. En consecuencia, un par triptófano-triptófano a través de las hebras parece ser óptimo para la estabilidad de la horquilla.

Nuestra observación de una contribución estabilizadora del triptófano nos llevó a preguntarnos cuan general podría ser el efecto. En triptófano en el péptido bhpW (Figura 3) está espacialmente cerca de ambos, la leucina en la hebra opuesta y las cadenas laterales de los residuos en el giro del tipo II'. Por tanto, parecía posible que el efecto del triptófano pudiera depender de los contactos estabilizadores con estos otros residuos. Con objeto de estudiar esta cuestión, invertimos los pares hidrofóbicos (péptido 5) cambiando el aminoácido en la posición 8 (el más cercano al disulfuro, Figura 3) con leucina fijada en la posición 3. Las concentraciones efectivas (C_{eff}) de tioles de cisteínas se determinaron como en nuestros estudios previos.

	Ac-CTXEGNKLTC-NH_{2}	1
	Ac-CTLEGNKXTC-NH_{2}	5	X = W, Y, F, L, M, I, V o A
	Ac-CTXEGNKWTC-NH_{2}	6
	Ac-CTWEGNKXTC-NH_{2}	7

Hallamos que el triptófano en la posición 8 es el más estabilizador de esos residuos ensayados (Figura 8A). De forma significativa, los valores de C_{eff} son bastante próximos para los pares trp-leu y leu-trp, indicando que las dos disposiciones son energéticamente aproximadamente equivalentes. Este resultado parece mantenerse papra otros pares de residuos con leucina: el orden del rango y los valores numéricos de C_{eff} son similares, pero no exactos, en las dos series (Figura 8A).

Para ensayar si la equivalencia de los pares hidrofóbicos invertidos podría ser más general, examinamos las series de péptido 6 y 7, en las que los residuos estan, en cambio, emparejados con un triptófano en la hebra opuesta (Figura 8B). Al igual que con los pares de leucina, se observa una estrecha correspondencia entre las dos series con triptófano, tanto en el orden del rango como en el valor de C_{eff}. Concluimos que los dos sitios que cruzan las hebras son esencialmente equivalentes, a pesar de la diferencia en la posición de la cadena lateral relativa al giro y disulfuro.

Las dos series de leucina (1 y 5) podrían compararse con las series de triptófano (6 y 7). Las tendencias de los dos conjuntos de datos son de forma remarcable similares (Figuras 8A y B), sugiriendo que los residuos que cruzan las hebras contribuyen a la estabilidad de manera independientes. Para explorar esta idea, calculamos las diferencias en energía libre para sustituciones en cada una de las series de péptidos relativas a un péptido de referencia en esa serie (\Delta\DeltaG = -RT ln(C_{eff},X/C_{eff},ref)). En la Figura 9 se representan comparaciones representativas.

Existen relaciones lineales de la energía libre entre los cuatro conjuntos de datos. Esto se observa en comparaciones de pares que cruzan las hebras intercambiados entre los sitios NHB 3 y 8, y también para comparaciones de pares trp con pares leu en la misma orientación (Figura 3). (No hay más dispersión en estas últimas correlaciones). Las pendientes (\rho) se determinaron usando los valores \Delta\DeltaG escalados respecto dos péptidos de referencia diferentes en cada serie (X = ala y trp). Los valores de \rho obtenidos nu fueron enormemente diferentes (Tabla 5).

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TABLA 5

Pendientes (p) de las gráficas Hammett para las series de péptidos 1-4
conjunto en el eje x	\rho, X3 vs X8	\rho, leu vs trp
W3X8^{\alpha}	1.15 (1.11)^{b}	0,47 (0.43)^{b}
L3X8	0.98 (0.86)^{b}	---
X3W8	---	0,43 (0.32)^{b}
^{\alpha} \begin{minipage}[t]{140mm} Las gráficas vs los datos de W3X8 se muestran en la Figura 9. Los valores entre paréntesis se obtuvieron usando el péptido de triptófano en cada serie como referencia interna (en vez del péptido de alanina).\end{minipage}

De forma consistente con la idea de que las posiciones 3 y 8 son equivalentes, \rho es cercana a 1 para gráficas que comparan estos datos. Por contra, cuando los pares de leu se comparan con los pares de trp, \rho es aproximadamente 0,4. Esto significa que para un determinado para de residuos X, la diferencia esperada en la estabilidad de la horquilla es aproximadamente 2,5 veces mayor con trp como pareja a través de hebras. Dadas estas sencillas relaciones, \Delta\DeltaG podría calcularse para cualquier sustitución relativa a un par de referencia multiplicando una energía de sustituyente \sigma_{x} por \rho para la pareja entre hebras (ver más abajo). Esto es sorprendente, puesto que estos residuos se hallan dentro de la distancia de contacto, y esto tiene importantes implicaciones para el diseño de la horquilla-\beta.

Los análisis estadísticos de los pares HB y NHB entre hebras en las proteínas con hojas-\beta hallan muchos pares de residuos que están positiva o negativamente correlacionados con una elevada confianza. En gran parte de acuerdo con las preferencias estadísticas, los estudios de mutagénesis de proteínas han identificado energías de interacción tan elevadas como 1 kcal mol^{-1} entre pares HB. Se ha propuesto que la inclusión de pares entre hebras preferidos en las proteínas podría mejorar su estabilidad o fijar el registro de la hebras en horquillas-\beta aisladas. Para buscar estos efectos, calculamos las energía de interacción de pares (Figura 10). Las proporciones de C_{eff} proporcionaron \Delta\DeltaG para las sustituciones sencillas o dobles. Típicamente, la diferencia entre \Delta\DeltaG para la doble sustitución y \Sigma\Delta\DeltaG para las sustituciones sencillas so toma como una energía de interacción. En el ejemplo mostrado, esta sería de -136 cal mol^{-1} para el par trp-trp en relación a un estado de referencia leu-leu. Si las energías de sustitución sencilla se calculan secuencialmente, escalando por \rho en el segundo paso, la discrepancia es de solo +41 cal mol^{-1} (insignificante en estos experimentos). Para el par phe-trp (comparar la Figura 2, superior e inferior), un análisis similar rindió \Delta\Delta\DeltaG = -253 cal mol^{-1} cuando se incluye \rho. Esta discrepancia es significativa, y sugiere que podría haber cierta ventaja estructural específica en el emparejamiento de phe con trp (más allá de la superioridad general de trp). Es interesante que la discrepancia es pequeña cuando se compara con el rango total de energía observado para sustituciones de un único sitio (Figura 9); creemos que tales efectos específicos de pares (y el error experimental) podrían explicar la dispersión en nuestras correlaciones.

Nuestros experimentos muestran claramente que los contactos terciarios entre hebras potencian la estabilidad de la horquilla. Notablemente, la introducción del par trp-trp resulta en una gran estabilización en comparación con nuestro péptido bhpW original (Figuras 3 y 8), y creemos que, a pesar de su rareza en las proteínas, trp-trp es el par NHB óptimo para horquillas aisladas. En la mayoría de los casos, las energías de interacción de pares que obtenemos a través del análisis convencional de dobles mutantes es explican adecuadamente por diferencias en \rho. Es decir, estas energías no son específicas de un único par, sino que reflejan en cambio la mayor o menor sensibilidad a todas las sustituciones de residuo que opone un determinado para entre hebras. Por tanto, concluimos que las preferencias combinadas de un único sitio (\sigma y \rho) son las más importantes para predecir la estabilidad de la horquilla. De forma significativa, debería ser posible hacer predicciones a partir de un conjunto limitado de datos experimentales.

Ejemplo 5 Construcción de bibliotecas de exhibición sobre fagos basadas en el esqueleto del péptido trp

Se produjeron bibliotecas de péptidos aleatorios fusionados a la proteína del gen 8 del bacteriófago filamentoso M13 mediante mutagénesis Kunkel del plásmido pS1302b, un derivado de pS349 (solicitudes de patentes estadounidenses nº de serie 60/103.514 y 60/134.870, incorporadas en ésta por referencia). El plásmido pS1302b incluye el promotor tac promoter y la secuencia líder malE del pS349. La secuencia hGH y la secuencia eslabón rica en Gly/Ser del pS349 se remplazaron con la secuencia:

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100

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La secuencia insertada codifica tres codones de detención, la etiqueta del epítopo GD, y una secuencia eslabón seleccionada para la exhibición con nivel elevado de la hGH. El plásmido también incluye el represor de lac (lacl^{q}) y el gen de la resistencia a la ampicilina del pS349. El oligonucleótido usado para construir la biblioteca fue:

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101

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Por tanto, la forma de los péptidos aleatorios fue XCTWX4LTCX. Se preparó una biblioteca de 10^{9} a 10^{10} transformantes individuales siguiendo procedimientos previamente descritos (solicitudes de patentes estadounidenses nº de serie 60/103.514 y 60/134.870). Aproximadamente un tercio de los clones individuales codificaron una secuencia de péptido funcional. El resto eran plantilla de inicio, contenía codones de detención, o contenía supresiones sencillas de nucleótidos. El tamaño de la biblioteca es por tanto el adecuado para incluir varias copias de cada posible secuencia aleatoria.

Ejemplo 6 Selección de péptidos de unión a partir de la biblioteca estructuralmente sesgada

Se recubrieron durante la noche placas MaxiSorp de Nunc con 2 \mug/mL de la fusión rhuFc-epsilon-RI-IgG en PBS. A continuación se bloquearon las placas durante una hora a temperatura ambiente con BSA al 0,5% (Sigma A-7638) en PBS. Se prepararon pocillos negativos recubriendo sólo con 0,5% de BSA. Se añadieron los fagos (10^{11} ifu por pocillo) a diez pocillos positivos y negativos, y se incubaron con agitación durante 20 horas a temperatura ambiente. Después del lavado extenso para retirar fago unido no específicamente, se eluyeron los unidores mediante tratamiento con glicina 0,2 M, pH 2, durante cinco minutos. El fago eluido se neutralizó entonces mediante la adición de base TRIS y se usó para infectar un cultivo de E. coli (XL1-blue, Stratagene). Se realizaron varios ciclos de unión, elución, y amplificación (3-5 en total) en condiciones similares. Se examinaron 192 clones individuales en función de la unión al receptor diana mediante la incubación de sobrenadante de fago con placas preparadas como se ha descrito para la clasificación de fagos. Después del lavado, se trataron los pocillos con el conjugado alpha-M13-HRP (Pharmacia Biotech 27-9421-01), y el anticuerpo unido se detectó con el sustrato OPD (Sigma P-9187). Se comparó la absorbancia de la placa (A_{492}-A_{405}) entre placas positivas y negativas para identificar aquellos clones positivos para la unión del receptor. Se identificaron doce de tales clones.

La secuencia de los clones positivos se identificó secuenciando el ADN codificantes. Los péptidos correspondientes a las secuencias exhibidas (se decir, los 12-meros) se sintetizaron usando procedimientos estándares en fase sólida. A continuación, se ensayaron los péptidos, usando un ensayo biológico o de unión apropiado, para determinar su potencia. La estructura en horquilla de los péptidos puede evaluarse usando cualquiera de las técnicas conocidas y esbozadas más arriba: dicroísmo circular, RMN, o equilibrio del disulfuro. A continuación podrían hacerse sustituciones en los péptidos para determinar las contribuciones relativas de los residuos del giro seleccionados a la unión. Idealmente, estas sustituciones no alterarán la estructura del esqueleto. Una vez se ha comprendido la naturaleza del motivo unidor, la secuencia del giro puede transferirse a un esqueleto orgánico apropiado para su ulterior optimización.

Claims (18)

1. Biblioteca de péptidos estructuralmente restringidos que comprende una pluralidad de péptidos cíclicos, en donde cada uno de dichos péptidos cíclicos comprende una secuencia de aminoácidos C1-A1-A2-(A3)_{n}-A4-A5-C2 [SEC Nº ID.: 1], en donde,

A1, A2, A3, A4, y A5 son L-aminoácidos que ocurren de manera natural;

el extremo amino de la cisteína C1 está opcionalmente protegido con un grupo amino-protector;

el extremo carboxilo de la cisteína C2 está opcionalmente protegido con un grupo carboxi-protector;

A1 y A5 se seleccionan de entre el grupo que consiste en los aminoácidos W, Y, F, H, I, V y T;

A2 y A4 se seleccionan de entre el grupo que consiste en los aminoácidos W, Y, F, L, M, I, y V;

A3 es cualquier L-aminoácido que ocurre de forma natural, y n es un número entero que es 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12; y

C1 y C2 se unen junto mediante un enlace disulfuro, formando de esta manera un péptido cíclico.

2. Biblioteca de la reivindicación 1, en donde A1 ó A5 es un residuo ramificado en \beta que tiene dos sustituyentes que no son hidrógeno en el carbón \beta del residuo aminoácido.

3. Biblioteca de la reivindicación 1, en donde A1 ó A5 es T.

4. Biblioteca de la reivindicación 1, en donde A1 ó A5 es un aminoácido W, F, H o Y.

5. Biblioteca de la reivindicación 1, en donde A2 ó A4 es un aminoácido W, F o Y.

6. Biblioteca de la reivindicación 5, en donde A2 ó A4 es W.

7. Biblioteca de la reivindicación 6, en donde A2 y A4 son W.

8. Biblioteca de la reivindicación 1, en donde n es al menos 4.

9. Biblioteca de la reivindicación 8, en donde n no es mayor de 10.

10. Biblioteca de la reivindicación 9, en donde n es 4.

11. Biblioteca de la reivindicación 10, en donde (A3)_{4} es EGNK, ENGK, QGSF o VWQL.

12. Biblioteca de la reivindicación 11, en donde A1 es T y A5 es T.

13. Biblioteca de la reivindicación 12, en donde A2 es W o L.

14. Biblioteca de la reivindicación 13, en donde A4 es W o L.

15. Biblioteca de la reivindicación 1, en donde el péptido cíclico está fusionado a una proteína de cubierta de fago, y el péptido cíclico se exhibe sobre la superficie de una partícula de fago o fagómido.

16. Procedimiento para examinar péptidos que tienen un esqueleto de horquilla-\beta que está conformacionalmente estabilizado, que comprende los pasos de:

a)

proporcionar una biblioteca de la reivindicación 1;

b)

seleccionar al menos dos péptidos de la biblioteca del paso a), en donde dichos al menos dos péptidos difieren en un aminoácido en una posición particular A1, A2, A3, A4 ó A5;

c)

determinar las conformaciones de los péptidos del paso b);

d)

medir y comparar las energías libres relativas de los péptidos del paso b);

e)

seleccionar los péptidos que tienen un esqueleto de horquilla-\beta conformacionalmente estabilizada.

17. Procedimiento para identificar un péptido capaz de unir una pareja de unión específica, que comprende los pasos de:

a)

proporcionar una biblioteca de la reivindicación 1;

b)

poner en contacto la biblioteca del paso a) con una pareja de unión;

c)

seleccionar de la biblioteca péptidos capaces de formar un complejo no covalente con la pareja de unión; y

d)

opcionalmente aislar los péptidos del paso c).

18. Procedimiento de la reivindicación 17, en donde la pareja de unión se selecciona de entre el grupo que consiste en un antígeno, un anticuerpo, un enzima, un sustrato de enzimas, un receptor, y un ligando.