BRPI0819066A2 - anticorpo anti-14-3-3 eta, método de elaboração do anticorpo anti -14-3-3 eta, método de diagnóstico de artrite, uso do anticorpo anti-14-3-3 eta, kit de diagnóstico de artrite, método de tratamento de artrite, composição farmaceutica - Google Patents

anticorpo anti-14-3-3 eta, método de elaboração do anticorpo anti -14-3-3 eta, método de diagnóstico de artrite, uso do anticorpo anti-14-3-3 eta, kit de diagnóstico de artrite, método de tratamento de artrite, composição farmaceutica Download PDF

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Abstract

ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA, MÉTODO DE ELABORAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE ARTRITE, USO DO ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA, KIT DE DIAGNÓSTICO DE 5 ARTRITE, MÉTODO DE TRATAMENTO DE ARTRITE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção fornece antícorpos anti-14?3-3 eta que especificamente ligam à isoforma eta da proteína 14-3-3 humana na sua configuração natural enquanto exibe seletividade sobre isoformas de proteínas 14-3-3 alfa, beta, delta, épsilon, gama, tau e zeta humanas. Métodos, kits e composições farmacêuticas que compreendem ditos específicos anticorpos anti-14-3-3 eta que são ainda providos para diagnosticar e tratar artrite.

Description

% 1/87 i 9) $ % ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA, MÉTODO DE ELABORAÇÃO DO 4 ' ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE ARTRITE, · USO DO ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA, KIT DE DIAGNÓSTICO DE ARTRITE, MÉTODO DE TR.ATAMENTO DE ARTRITE, COMPOSIÇÃO 5 FARMACÊUTICA Referência Cruzada a Pedidos Reíacíonados O presente pedido reivindica o benefícío do Pedido Provisório Norte-Zjmericano com número de série 60/990.520, depositado em 27 de novembro de 2007, e do Pedido 10 Provisório Norte-Americano com número de séríe 61/077.123, " deposítado em 30 de junho de 2008, que são expressa e integralmente incorporados ao presente como referência. Campo da Invenção A presente invenção refere—se a anticorpos que se · '·N . '·15 ' ligam·-.-especificamente à· is.o£orma-,,.--eta-.-da-.·proteína 14-3-3--e- são capazes de diferenciar entre a isoforma eta e as outras isoformas de proteína 14-3-3.
Antecedentes da Invenção Proteínas 14-3-3 são uma família de moléculas 20 reguladoras íntracelulares conservadas que são expressas cie forma onipresente em eucariotes. As proteínas 14-3-3 possuem a capacidade de ligar uma. séríe de proteínas de sinalização funcionalmente diferentes, incluindo quinases, fosfatases e receptores transmembrana. De fato, mais de cem 25 proteínas de sinalização foram relatadas como Iígantes 14- 3-3. As proteínas 14-3-3 podem ser consideradas membros evoluídos da superfamília de Repetição de Peptídeos Tetratrico. Elas geraj-mente contêm nove ou dez hélíces alfa e normalmente formaw interações entre homo e/ou 30 heterodímeros ao Iongo das suas hélices aminoterminaís. Essas proteínas contêm urna série de domíníos conhecidos, incluindo regiões de interação de cátions divalentes, fosforilação e acetííação e divisão proteolítica, entre gi
D ' % outros. Existem sete isoformas geneticamente codificadas " distintas das proteínas 14-3-3 que são conhecidamente 't expressas em mamíferos, em que cada ísoforma compreende de 242 a 255 aminoácidos. As sete isoformas de proteínas 14-3- 5 3 são denominadas 14-3-3 cx/j3 (alfa/beta), 14-3-3 cjg (delta/zeta), 14-3-3 e (epsilon), 14-3-3 y (gama), 14-3-3 rj (eta), 14-3-3 t/Õ (t-au/teta) e 14-3-3 (j (sigma/estratifina). As proteínas 14-3-3 possuem um alto grau de lO similaridade de sequências. Consequentemente, os anticorpos anti-14-3-3 reconhecem típicamente mais de uma isoforma de proteína 14-3-3. Várias preparações de anticorpos anti-14- 3-3 que foram caracterizadas são disponíveis comercialmente. Anticorpos policlonais de coelhos que - 15---reconhecem proteína 14-3-3-- são d-ísponíveís, , por-·-- exemplo,, - por meio da Biornol, Santa Cruz Biotechnology, Upstate Biotechnology e Assay Designs. Estas preparações de anticorpos policlonais reconhecein 14-3-3 eta de alguma forma; nenhuma, entretanto, é seletiva para a ísoforma eta 20 sobre çmtras isoformas de proteínas 14-3-3. Víde também Martin, H. et al (1993), Antibodies against the major brain isctforms OjÉ 14-3-3 protein, FEBS 331: 296-303. Vide também WO 2007/128132 depositada em nove de maio de 2007. Além da falta de seletividade de isoformas, demonstrou-se que 25 poucos anticorpos 14-3-3 reconhecem proteína 14-3-3 na sua configuração nativa. Proteínas 14-3-3 foram indicadas em uma série de condições. A iibiquidade e a diversidade funcíonal de proteínas 14-3-3 eliminam em grande parte, entretanto, a 30 aplicação terapêutica de anticorpos que se ligam a díversas isoformas de proteína 14-3-3 ("anticorpos pan 14-3-3") e/ou 'são' incapazes de reconhecer proteína 14-3-3 na sua configuração nativa. Além dísso, isoformas 14-3-3
Ik, 3/87
Ê ;ô, b
P ' particulares são indicadas em condições específicas, em que - # " os anticorpos pan 14-3-3 podeni não ser detectados' com ' I confiança em testes de díagnóstíco e podem não ser tratáveis de forma dírigida por esses anticorpos pan 14-3- 5 3. 14-3-3 eta e 14-3-3 gama, por exemplo, foram relacionados com a artrite. Vide WO 2007/128132 depositada em nove de maío de 2007. vide também Kííani et al (2007, ,J.
Rheum. 34: 1650-1657; WO 2007/128132), que relataram que dois membros da família de proteínas 14-3-3, 10 particularmente 14-3-3 eta e 14-3-3 gama, estão presentes no fluído sinovíaí e no soro de pacíentes com artríte e essas ísoformas estão diretamente correlacionadas com os níveis de MMP-I e MMP-3 no fluido sinovial e no soro.
Resumo da Invenção - . , j5, "i.·-A-presente 'invenção-"derivaT.se em .parte:'"da"."descober.taL surpreendente de que anticorpos seletívos para a isoforma eta de proteína 14-3-3 na sua configuração nativa podern ser elaborados utilizando epítopos selecionados de 14-3-3 eta, apesar do alto grau de identidade de sequências entre 20 isoformas 14-3-3. Partícuíarmente, a presente ínvenção fornece anticorpos de proteína anti-14-3-3 que (i) se ligam especificamente à proteína 14-3-3 eta na sua configuração nativa, conforme evídenciado, por exemplo, por meío de imunoprecipitação e (íi) Iígam—se seletívamente à proteína 25 14-3-3 eta sobre outras isoformas de proteína 14-3-3. Esta combinação de qualidades diferencia anticorpos de acordo com a presente ínvenção do estado da técnica e proporciona o uso de anticorpos anti-14-3-3 eta seíetívos em métodos de diagnóstico e terapêuticos dirigidos a condições nas quais 30 14-3-3 eta está implicada. Consequentemente, em um aspecto, a presente ínvenção fornece anticorpos antí-14-3-3 eta. Os anticorpos antí-14- 3-3 de acordo com a presente invenção são capazes de (i)
tg 4/87 u"jk}
F g·
L !7 ' ligar-se especificamente à proteína 14-3-3 eta humana na j4 4 sua configuração nativa, conforme evidenciado, por exemplo, ' por meio de imunoprecípitação de 14t-3-3 eta nativo, e (ii) ligação seletíva a proteína 14-3—3 eta humana sobre outras 5 isoformas de proteína 14-3-3 humana. Em uma realização preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção é capaz de 1igar|se a uma proteína 14-3-3 eta que está local-izada de forma aberrante no espaço sinovial extracelular em artríte.
10 Eir uma realização preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção não se Ii-ga a um
P epítopo localizado no termínaj- N da proteína 14-3-3 eta humana. Em uma realização preferida, um anticorpo anti-14-3-3 15 eta de acordo com a,presente"ínvenção é capaz de 1ígarTse a '
L , um epítopo que compreende um peptídeo selecionado a partír i do grupo que consiste de peptídeos 14-3-3 eta de circuito, l peptídeos 14-3-3 eta de hélíce e peptídeos 14-3-3 eta não- l hélice, ern. que peptídeos eta de círcuíto são especíalmente l
I 20 preferidos. N Eiii uma realização preferida, o peptídeo de. circuito ! i h 14-3-3 eta compreende uma sequêncía de amínoácidos k selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 11 ; a 16. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta | "25 liga-se a uma região de 14-3-3 eta que se sobrepõe a uma t l
E sequência de arninoácidos correspondente a uma sequência r selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 11 i 3 a 16. t Em uma realização preferida, o .peptídeo de hélice 14- 30 3-3 eta compreende uma sequência de aminoácídos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N" 1 a 10. Em uma outra realização, um anticorpo antí—14-3-3 eta Iiga-se a uma região de 14-3-3 eta que se sobrepõe a uma sequência de
& á 5/87 r e * :K 'a · aminoácidos correspondente a uma sequência selecionada a ,P partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a 10.
. Em uma realização preferida, o peptídeo não-hélice 14- 3-3 eta compreende uma sequência de aminoácidos selecionada 5 a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 17 a 32. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 eta que se sobrepõe a uma sequência de aminoácidos correspondente a uma- sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 17 a 32.
10 Em uma realização especialmente preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção liga-se a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30), KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31) e KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N° 32).
15 Exemplos de peptídeos 14-3-3 de circuito, hélice e não-hélice são aqui descritos na Tabel-a 1. Notadamente, SEQ ID N° 30 varia da sequência 14-3-3 eta correspondente pelo fato de que uma cisteína que ocorre na sequência 14-3-3 eta foi substituída por serina para evitar a formação de 20 ligações de dissulfeto. Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos que tambéin se ligam à sequência 14-3-3 natural relativa a SEQ ID N° 30 que compreende uma cisteína. Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos capazes de ligar-se a sequências de peptídeos 25 que variam das relacionadas na Tabeía 1 pela substituição de serina por cisteína. Exemplos de peptídeos 14-3-3 de circuito, hélice e não-hélice são aqui descritos na Tabela 1. Notadamente, SEQ ID N° 30 varia da sequência i4-3-3 eta correspondente pelo 30 fato de que uma cisteína que ocorre na sequência 14-3-3 eta foi substituída por serina para evitar a formação de ligações de dissulfeto. Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos que também se ligam à sequência y 6/87 "Y q Ò, ' bp 14-3-3 natural relativa a SEQ ID n° 30 que compreende uma ' cisteína. Eir uma realização, a presente invenção fornece "" anticorpos capazes de ligar-se a sequências de peptídeos que variam das relacionadas na Tabeía 1 pela substítuíção 5 de serina por cisteína. Em uma realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta é capaz de inibir a indução de MMP por 14-3-3 eta. Preferencialmente, o MMP é seíecíonado a partír do grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13, em que MMP-I e 10 MMP-3 são especialmente preferidos. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de diagnóstíco de doenças e condições que envolvam 14-3-3 eta. Os métodos compreendem o uso de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo coir a presente invenção para detectar uma ,15-· al,teração-,na proteína'-I4-3r3 eta, ta1.",como uma-"a1teração.na"' .
expressão, localízação, função etc. Em uma realízação, a detecção envolve iraunoprecipitação com um anticorpo anti- 14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a detecção envolve o uso de ELISA empregando um 20 anticorpo anti-1-4—3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em urria realização, a detecção envolve Western Blot utilizando um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a detecção envoíve o uso de um antícorpo antí-14-3-3 eta de acordo com a 25 presente invenção em imuno-hístoquímica. Em uma realização, a detecção envolve o uso de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção em imunofíuorescência. Em uma realização, a detecção envolve o uso de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção em 30 análise FACS. Em uma realização, a detecção envolve o uso de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção em radioímunoteste. Em uma reaíízação, a detecção envolve o uso de um antícorpo anti-14-3-3 eta de acordo com .·· X
"i 7/87 b e b,
' a presente ínvenção em um teste de faixas.
Em uma . · db, -ÈF
' realização, a detecção envolve o uso de um anticorpo anti-
"' 14-3-3 eta de acordo com a presente invenção em um teste de ponto de cuidado.
Eírt uma realização, a detecção de 14-3-3
5 eta é combinada com a detecção de um outro marcador da condição (tal coino MMP para artrite). Em uma realização, a presente ínvenção fornece métodos de díagnóstico das condíções ín£1amatórías.
Em uma . realização preferída, são fornecidos métodos de diagnóstico
10 de artrite.
São incluídos métodos de diagnóstíco de doenças selecíonadas a partir do grupo que consíste de espondílíte anquílosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Ehlers-Danlos (EDS), Síndrome de Felty, fibromialgia, gota, artrite ínfecciosa,
.. , 15 -artríte '-juvenil,- --Iúpus,- 'doença" .de. ,tecído "conectivo - misturado (MCTD), osteoartríte, Mal de Paget, poIimial-gia reumática, polimiosite e dermatomíosite, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reatíva, artrite reumatoide, escleroderma, Síndrome de Sjõgren, Mal
20 de Still e granulomatose de Wegener.
Eiíi uma realização, os métodos envolvem a detecção de proteína 14-3-3 eta no fluido sinovial, pIasma ou soro de um paciente.
Em uma realízação, a detecção é realízada por meio de imunoprecípitação de proteína 14-3-3 eta de fluido
25 sinovial, plasma ou soro utilizando um anticorpo anti-14-3- 3 eta de acordo COIll a presente invenção.
Em uma realização, a detecção envolve o uso de ELISA empregando um antícorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção.
Ení uma realização, a detecção envolve Western Blot de uma amostra
30 que compreende fluido sinovial, plasma ou soro de um paciente utilizando um anticorpo anti—l4-3-3 eta de acordo com a presente invenção.
Em uma realízação, a detecção envolve o uso de radioimunoteste.
Em uma reaíização, a k b 8/87 b · b ' detecção envolve o uso de um teste de cadeia. Em uma b " realização, a detecção envolve o uso de um teste de ponto " de cuídado. Em uma realização, a detecção de 14-3-3 eta é conibínada com a detecção de um outro marcador de artrite 5 (tal como MMP, anti-CCP, anti-RF e/ou CRP). Em uma realização, a presente invenção fornece métodos de diagnóstico das condições neurológícas. Em uma realização preferida, são fornecídos métodos de díagnóstico de doenças selecionadas .a partir do grupo que c.onsiste de .
10 meningite bacteriana e mal de Creutzfeldt jakob. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de doenças que envolvem 14-3-3 eta. Os métodos ccmpreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-14-3-3 eta de . -15 acordo·- com a, presente ínvenção :ã pacíentes'.--Em -al'gumas-' realizações, os métodos compreendem tratamentos de combinação. Em uma realização, a presente invenção fornece métodos de tratamento de condições inflamatórías. Em uma reaíização 20 preferída, são fornecídos métodos de tratamento de artríte. São incluídos métodos de tratamento de doenças selecionadas a partir do grupo que consiste de espondilite anquilosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopátíca dífusa (DISH), Síndrome de Eh1ers-Dan1os (EDS), Síndrome de Felty, 25 fibromialgia, gota, artrite infeccíosa, artrite juvenil, lúpus, doença de tecido conectivo misturado (MCTD), osteoartrite, Mal de Paget, poIimíaígía reumática, polimiosite e dermatomiosite, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reativa, artrite 30 reumatoide, escleroderma, Síndrome de Sjõgren, Mal de Still e granulomatose de Wegener. Em uma realização, o método envolve um tratamento de combinação, em que pelo írienos um outro agente terapêutico é bb 9/87 k. ·b Ô.
' adininistrado além de um ou mais anticorpos de 14-3-3 eta de b b acordo com a presente invenção. Em uma realização " preferida, o agente terapêutico é selecíonado a partír do grupo que consiste de drogas antirreumáticas modífícadoras 5 de doenças (DMARDS) e drogas de osteoartrite modificadoras de doenças (DMOADS; vide, por exemplo, Loeser, Reumatologia, 21: 104-106, 2005), anticorpo anti-TNFcx, anticorpo anti-ILl, anticorpo ant'i-CD4, anticorpo anti- CTLA4, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-IL-6, 10 leflunomida, suífassalazina e metotrexato. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos profilátícos de prevenção do desenvolvímento de condíções que envolvem 14-3-3 eta. Em uma realização, a presente ínvenção fornece métodos 15,-'-profí1átícos- de pr,evenção do desenvolvimento' de condições " "" - inflamatórias em pacientes com risco de desenvolvimento de condições inflamatórias. Em uma realização preferida, são fornecidos métodos profiláticos de prevenção de artrite errt pacientes com rísco de desenvolvimento de artrite. São 20 incluídos métodos profíj-átícos de prevenção de doenças selecionadas a partir do grupo que consiste de espondilite anquilosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Eh1ers-Dan1os (EDS), Síndrome de Felty, fibromialgía, gota, artrite infeccíosa, 25 artrite juvenil, Iúpus, doença de tecido conectivo misturado (MCTD), osteoartrite, Mal de Paget, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomíosite, pseudogota, artrite psoriátíca, Fenômeno de Raynaud, artrite reatíva, artrite reumatoide, escleroderma, Síndrorrte de Sjògren, Mal 30 de Still e granulomatose de Wegener. Os métodos compreendem a administração ao paciente de um anticorpo antí-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção. Em uma realização, o anticorpo anti-14-3-3 eta é administrado como um componente âg 10/87 L"
E ' de uma terapia de combinação descríta no presente. 4È " Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de " monitoramento do tratamento de doenças que envolvam 14-3-3 eta. Os métodos envolvem a determinação do nível de 14-3-3 5 eta em amostras de pacientes utilizando um anticorpo anti— 14-3-3 eta de acordo com a presente invenção e rnonitoramento do nível de 14-3-3 eta em pacientes que passam por tratamento. Em uma realização, a presente invenção fornece métodos 10 de monitoramento do tratamento de condíções ínfíamatórias .
Em uma realização preferída, são fornecidos métodos de monitoramento do tratamento de artrite. São incluídos rnétodos de monitoramento do tratarnento de doênças selecionadas a partír do grupo que consíste de espondilite . .. -15.. anquilosante, MjiEL - de ·'Behcet,. -hiperostose" , esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Ehlers-Danlos (EDS), Síndrome de Felty, fíbromialgia, gota, artrite infecciosa, artrite juvenil, Iúpus, doença de teci.do conectivo misturado (MCTD), osteoartríte, Mal de paget, polímialgia , 20 reumática, polimiosite e dermatomiosite, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artríte reativa, artrite reumatoíde, escleroderma, Síndrome de Sjõgren, Mal de Still e granulomatose de Wegener. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de 25 determinação do potencial de reação de um paciente ao tratamento dirigído a doenças que envolvem 14-3-3 eta. Em uma realização, os métodos envolvem a determinação do nível de 14-3-3 eta- em amostras de pacíentes utílizando um antícorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente 30 invenção. Eni real-ízações preferidas, o nível de 14-3-3 eta na amostra de pacientes é comparado com o de amostras de pacientes cuja capacidade de reagir ao tratamento é conhecida.
Ôj· 11/87 é
W " \È Em uma realização, a presente invenção fornece métodos ' de determínação do potencíal de reação de um pacíente ao " tratamento dirigido a condições inflamatórias. Em uma realização preferida, são fornecidos rnétodos de 5 determinação do potencial de reação de um paciente a tratamento dirígído à artrite. São incluídos métodos de determinação do potencial de reação ao tratamento de doenças selecionadas a partir do grupo que consiste de espondilite anquilosante, Mal de Behcet, híperostose 10 esquelétíca idíopática dífusa (DISH), Síndrome de Ehlers- Danlos (EDS), Síndrome de Felty, fibromialgia, gota, artrite infecciosa, artrite juvenil, lúpus, doença de tecído conectívo mi-sturado (MCTD), osteoartri-te, Mal de Paget, poIimialgía reumátíca, poíímiosíte e dermatomiosíte, .: 15-,-pseudogota, : artri'te '.psoriática-,: Fenômeno " de" Raynaud," """. artrite reativa, artrite reumatoíde, escleroderma, Síndrorne de Sjõgren, Mal de Still e granulomatose de Wegener. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de diferenciação entre subtipos de doenças que envoívem 14-3-3 20 eta. Em uma realízação, métodos de diferenciamento entre subtipos de distúrbíos inflamatórios. Em uma realização preferida, são fornecidos métodos de diferencíação entre subtipos de artrite. São incluídos métodos de diferenciação 25 entre grupos que consistem de espondílite anquílosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Ehlers-Dan1os (EDS), Síndrome de Felty, fibromialgia, gota, artrite infecciosa, artrite juvenil, lúpus, doença de tecido conectívo misturado (MCTD), 30 osteoartrite, Mal de Paget, poIimiaígia reumátíca, polimiosite e dermatomiosite, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reativa, artrite reumatoide, escleroderma, Síndrome de Sjõgren, Mal de Stí11
9j 12/87 b b 8 ' e granulomatose de Wegener. Em uma reaíízação, os métodos ¢L b envolvem a determinação do nível de 14-3-3 eta em amostras ' de pacientes utilizando um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em uma realização 5 preferida, o nível de 14-3-3 eta em pacíentes é comparado com o de amostras de pacíentes cujo subtípo de distúrbio inflamatório ou prognóstico é conhecido.
Em um aspecto, a presente invenção fornece rnétodos de ,redução da lesão de uma junta Iesionada por trauma. Os 10 métodos compreendem a admínistração de um antícorpo anti- 14-3-3 eta de acordo corn a presente invenção a pacientes que possuem juntas lesionadas por trauma. Em uma realização, o anticorpo antí-14-3-3 eta é adminístrado corno urrt componente de uma terapía de combínação aquí descrita.
-1,5- ·-- Em um,aspecto',' a presente invenção fornece"métodos""de " redução da expressão de MMP. Em uma realização, a expressão de MMP a ser reduzida encontra-se no sinóvío. Os métodos compreendem o fornecimento de um anticorpo anti_—14-3-3 eta de acordo com a presente invenção a urri tecido ou 20 compartimento no qual estão presentes células produtoras de MMP, em que as células produtoras de MMP reagem a proteínas 14-3-3 eta. O fornecímento pode ser direto para o tecído ou compartímento afetado ou índireto. Em uma realização preferida, as células que reagem são fibroblastos ou 25 células FLS. Em uma realização preferida, a expressão de MMP que deve ser reduzida é a expressão de MMP que é associada a artrite. Em uma realização preferida, a expressão de MMP que 30 deve ser reduzida é a de um MMP selecíonado a partir do grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13 . Em uma realização especialmente preferida, a expressão de MMP que deve ser reduzida é a de MMP-I ou MMP-3.
'i 13/87 b! ' B.
b b "' ' Em um aspecto, a presente ínvenção fornece métodos de lt " inibição da indução de MMP por uma proteína 14-3-3 eta. A "- inibição pode ser parcial ou completa. Os métodos compreendem o fornecimento de um anticorpo anti—14-3-3 eta 5 de acordo com a presente in.venção a um tecído ou compartimento no qual estão present.es céluj-as produtoras de MMP, em que as células produtoras de MMP reagem a proteínas 14-3-3 eta. O fornecimento pode ser direto para o tecido ou compartímento afetado ou indireto. Em uma realízação 10 preferida, o anticorpo anti_-14-3-3 eta é admínistrado ao sinóvio. Em uma realização preferida, as células que reagem são fibroblastos ou células FLS. Em uma realização preferi-da, a indução de MMP que deve ser inibída é a de um MMP que é regul-ado para .cima em 15-' artrite . '" . ' - "" . ",. ,' & ' ""' ' . ,' " ' - r · ' r '" · " ".. ~ T·n·-. "- ' -': ' " 7" ' "' Em uma realização preferida, a indução de MMP que deve ser inibida é a de um MMP selecionado a partír do grupo que consíste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13. Em uma realização especialmente preferida, a induçào de MMP que deve ser 20 inibida é a de MMP-I ou MMP-3. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de redução do ínchaço de juntas em pacíentes. Os métodos coinpreendeín a administração de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção a pacientes afetados.
25 Em um aspecto, a presente ínvenção fornece métodos de redução da degradação de cartilagem em pacientes. Os métodos compreendem a administração de um anticorpo anti- 14-3-3 eta de acordo corri a presente invenção a pacientes afetados.
30 Eín um aspecto, a presente ínvenção fornece métodos de redução da degradação óssea em pacíentes. Os métodos compreendem a administração de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção a pacientes afetados.
b, , ..»
14/87 e b ¶N
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Òq >)
' Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de q t vti *' ,b redução do acúmulo de citoquína pró-ínflamatória em fluido
'· sinovial.
Os métodos cornpreendem a administração de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção
5 a pacientes afetados.
Para métodos que envolvam a admínístração de um anticorpo anti-14-3-3 eta a um paciente afetado, ern uma realização preferida, é utilizado fornecimento intracapsular.
Em uma outra realízação, utíliza-se 10 fornecimento sistêmico.
São formuladas composíções terapêuticas e a adrninistração é tal que o anticorpo anti- 14-3-3 eta fornecido desta forina é disponível para dirigir- se à proteína 14-3-3 eta em Iocal extracelular.
Ein um aspecto, a presente inve'nção fornece kíts úteis ,, .'-'15 ' para-. diagnóstico 'de'condições que -envolvern --14-3 3 eta ou- determinação do prognóstico de um paciente afetado por condições que envolvem 14-3-3 eta.
Em um aspecto, a presente ínvenção fornece composíções farmacêuticas úteis para o tratamento de doenças que 20 envolvem 14-3-3 eta.
As composições farmacêuticas compreendem um antícorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção.
Em uma realízação preferi-da, são fornecidas composições farmacêutícas úteís para o tratamento de artrite. 25 Em um aspecto, a presente ínvenção fornece métodos de produção de medi-camentos útei-s para o tratamento de condições que envolvem 14-3-3 eta.
Breve Descrição das Figuras Figura I. elisa: teste de títulação de sangramento de
30 soro imune anti-AUGI-CLDK de camundongo (após segunda amplificação) sobre o antígeno AUGI-CLDK-BSA (apenas reação de IgG). Figura 2. ELISA: teste de títulação de sangramento de b& 15/87
Ò 'â C, ,5 b soro imune antí-AUG2-KKLE de camundongo (após segunda .,è # amplificação) sobre antígeno AUG2-KKLE-BSA (apenas reação Ei de IgG). ' Figura 3. ELISA: Teste de titulação de sangramento de 5 soro ímune antí—AUG3-CKNS de camundongo (após segunda amplificação) sobre antígeno AUG3-CKNS-BSA (apenas reação de IgG). Figura 4. Alínhamento de sequências para díversas isoformas de proteínas 14-3-3. ' 10 Fígura 5. Western Blot que exibe reatividade cruzada de um anticorpo políclonal 14-3-3 eta disponível coniercialmente contra as sete isoformas de proteínas 14-3-
3. Figura,6. Western Bíot que exibe proteína 14-3-3 eta '- 15- derivada de li·sato ce'lular e l4T3T3,, eta" recombínante"humana" " imunoprecipitada por anticorpo monoclonal levantado contra 14-3-3 eta recombinante humano com comprímento total. Figura 7. Western Blot que exíbe proteína 14-3-3 eta derivada de lisato celular e 14-3-3 eta recombinante humana 20 imunoprecipitada por anticorpo monoclonal Ievantado contra um fragmento de peptídeo 14-3-3 eta humano 142-158 SEQ ID N° 24 a partir de uma região não helicoidal da proteína. Figura 8. ELISA: Teste de titulação de sangramento de soro imune anti—14-3-3 eta de camundongo (após segunda 25 cpLificação) sobre antígeno 14-3-3 eta (apenas reação de IgG). Descrição Detalhada Afirma-se que um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígenos "liga-se específicamente'", "Ii-ga-se 30 imunologicamente"' e/ou é ""imunologicamente reativo" caso reaja em um nível detectáveí (dentro, por exemplo, de um teste ELISA) com Iigante e não reage de forma detectável com ligantes não relacíonados sob condíções símilares.
GB
16/87 bí ',&
6 q,b,
'" Ligação imunológica, da forma utííizada neste . 4 .b contexto, designa geraímente as ínterações não covalentes "" do tipo que ocorre entre uma molécula de ímunoglobulina e um antígeno para o qual a imunoglobulina é específica.
A
5 resistência ou a afinidade de interações de ligação imunológica pode ser expressa em termos da constante de dissociação (K,i) da interação, em que um K,i menor representa uma afinidade maior.
Propriedades de Iigação imunológica podem ser qjuanti-fi-cadas utílízmdo métodos bem conhecídos
10 na técnica.
Vide, por exemplo, Davies et al (1990), Annual Rev.
Biochem. 59: 439-473. "Anticorpo'" designa uma composição que compreende uma proteína que se 'Iiga específicamente a um antígeno correspondente e possui uma estrutura geral comum de ;15- imunog'lobulinas.
O,termo,-?'ant-icorpo",,-ínclui, especi-ficamente.-. .. anticorpos poIiclonais, antícorpos monoclonais, dímeros, multímeros, antícorpos mul-tíespecífícos (tais como anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.
Os anticorpos 20 podem ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espécies.
Tipicamente, um antícorpo compreenderá. pelo menos duas cadeías pesadas e duas cadeias leves interconectadas por Iigações de dissuj-feto que, quando combinadas, formam um domínio de Iigação que 25 interage com um antígeno.
Cada cadeía pesada é composta de uma regíão variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A região constante de cadeia pesada é composta de três domínios, CHl, CH2 e CH3 e pode ser do ísoti-po mu, delta, gama, alfa ou épsííon.
De
30 forma similar, a cadeía Ieve é composta de uma região variável de cadeia leve (VL) e üma região constante de cadeia leve (CL). A regíão constante de cadeia Ieve é composta de um dcmínio, CL, que pode ser do ísotípo capa ou
"" T éj 17/87 b '$ e.
,y ' lainbda. As regi-ões VH e VL podem ser adicíonalmente 0 6 subdivididas em regiões de hípervari-abilídade, denomínadas " regiões de determinação de complernentaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, 5 denominadas regíões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRS e quatro ERS, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na ordern a seguir: FRI, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias Ieve e pesada contêm um doinínio de ligação que ínterage com 10 um antígeno. As regíõe's constantes dos anticorpos podem mediar a Iigação da imunoglobulina a fatores ou tecidos hospedeiros, incluindo diversas células do sistema imunológico (tais como células efetoras) e o prímeiro componente (CIq) do sistema de comp1,emento cIássico. A 15 região-. constante-·de--cadeia·- pesada medi"a' .a '-1igação-,"da' " .. irnunoglobulina a tecido hospedeiro ou fatores hospedeiros, particularmente por meío de receptores ceíulares tais como os receptores Fc (taís como Fcyri, fcyrii, FcyRIII etc.)- Da forma como aqui utilizada, o antícorpo tamibém ínclui uma 20 parte de ligação de antígenos de uma 4 imunoglobulina que retém a capacidade de Iigar antígeno. Estes íncluem, por exempl-o, F(ab), um fragmento monovalente de domínios de anticorpo VL CL e VH CH; e fragrnento de F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos de Fab 25 Iigados por uma ponte de díssulfeto na regíão de articulação. O termo anticorpo também designa fragmentos de Fv de cadeia única recombínantes (SCFv) e moléculas biespecíficas, tais como diacorpos, triacorpos e tetracorpos (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana 30 n° 5.844.094). Os antícorpos podem ser produzidos e utilizados de diversas formas, incluindo complexos de anticorpos. Da forma como aquí utílizada, a expressão "complexo de
#. h 18/87 '6 b ' anticorpos" designa um complexo de um ou mais antícorpos 0 "' com um outro anticorpo ou com um ou maís fragmentos de ' anticorpos ou uni complexo de dois ou mais fragmentos de anticorpos. Os complexos de anticorpos incluem formas 5 multiméricas de anticorpos antí-14-3-3, tais como homoconjugados e heteroconjugados, bem como outros anticorpos reticulados conforme descrito no presente. "Antígeno" deve ser interpretado amplamente e designa qualquer molécula, composição ou partícula que pode Iigar- lo se especificamente a um anti-corpo. Um antígeno contém. um ou mais epítopos que ínteragem com o anticorpo, embora não induzam necessa.riamente a produção daquele anticorpo.
Os termos "reticulado"", '"retículação" seus equivalentes gramatícais designam a Lígação de dois ou maís - '- 15 , anticorpos para ,formar -complexos de anticorpos"-'.e .'podem"" também ser denominados multimerízação. Reticulação ou multimerização ínclui a Iigação de doís ou maís dos mesmos anticorpos (tais como homodímeri-zação), bem como a Iígação de dois ou mais anticorpos diferentes (tais como 20 heterodimerização). Os técnicos no assunto também reconhecerão que retícul-ação ou muítímerízação também é indicada como Eormação de homoconjugados de antícorpos e heteroconjugados de anticorpos. Esses conjugados podem envolver a ligação de dois ou mais antícorpos monoclonais 25 da mesma origem cIonal (homoconjugados) ou a Iigação de dois ou maís antícorpos com origem cíonal díferente (também denominados heteroconjugados ou bíespecífícos). Os anticorpos podem ser reticulados por rneio de Iigação covalente ou não covalente. Diversos métodos apropriados 30 para reticulação serão aprecíados pelos técnícos no assunto. A ligação não covalente pode ser atingida utilizando uin anticorpo secundário que é específico para as . substâncías de antícorpos primáríos. Um antícorpo
- á ·· — · ' -—-— — 6, 19/87 6"' 4 h, ' secundário anticamundongo de cabra (GAM) pode ser d ' utilizado, por exemplo, para retícular um antícorpo " monoclonal de camundongo. A Iigação covalente pode ser atingida utilizando reticulantes químicos.
5 "Epítopo"' desígna um determinante capaz de ligação específíca a um anticorpo. Epítopos são características químicas geralmente presentes sobre superfícies de moléculas e acessíveis para interação com anticorpos. Característícas químícas típícas são aminoáci-dos e porções 10 de açúcar, que possuem ca.racterístícas estruturais tridimensionais bem como propriedades químicas que inclueín carga, hidrofilicidade e lipofilicidade. Epítopos de conformação são diferenciados de epítopos não de conformação peía perda de reativídade com um anti-corpo após ,. . .15 uma- alteração'- nos- elementos-,-espacíais.-da molécula 'sem.- nenhuma alteração na estrutura química subjacente. "Anticorpo humanízado" desígna uma molécula de imunoglobulina que contém uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados 20 incluem ímunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região de determinação complementar (CDR) do paciente são substituídos por resíduos de CDR de uma espécíe não humana (antícorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho que possui a 25 especificídade, afinidade e capacídade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de estrutura Fv da ímunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados· no antícorpo receptor nem nas 30 sequências de estrutura ou CDR importadas. Geralmente, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos " dentre pelo menos um, tipicamente dois domíníos variáveis, nos quais todas ou substancíaímente todas as regiões CDR .
..
¢í 20/87 € b " correspondem às de uma ímunog1obu1ina nào humana e todas ou r ' súbstancíalmente todas as regíões de estrutura (FR) são as è de uma sequência de consenso de irnunoglobulina humana. Um anticorpo humanizado também englobará imunoglobulinas que 5 compreendem pelo menos uma parte de uma região constante de imunogíobulina (Fc), geralmente a de uma imunoglobulina humana (jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al, Nature 332: 323-329 (1988)). "Imunogene"" desígna uma substância, composto ou- lO composição que estimula a produção de uma reação imunológica.
A expressão "local de imunoglobulina'" designa um elemento genétíco ou um conjunto de elementos genétícos ligados que compreende i-nformações que podeín ser utílízadas ·- · 15.'. por uma célula:B ou-·precursor,de""célu1a. B.'para-expressar"um' " polipeptídeo de imunoglobuíina. Esse polipeptídeo pode ser um poIipeptídeo de cadeía pesada, um poIipeptídeo de cadeia leve ou a fusão de um poIipeptídeo de cadeía leve e um de cadeia pesada. No caso de um local não redisposto, os 20 elementos genéticos são montados por uin precursor de células B para formar o gene que codífica um poIípeptídeo de ímunogl-obulina. No caso de um Iocal redisposto, um gene que codifica um polipeptídeo de imunoglobulina está contido no local.
25 "Isotipo"' designa uma cIasse de antícorpos defínida pela sua regíão constante de cadeia pesada. Cadeías pesadas são ge.ralmente classificadas como gama, mu, alfa, delta, épsilon e denominadas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Variações em cada ísotipo são cIassificadas em subtípos; subtipos de 30 IgG, por exemplo, são dividi-dos em IgGl, IgG2, Igg3 e IgG4, enquanto IgPt é dividido em IgPtl e IgA2. O isotípo IgY é específico de aves. "'Anticorpo monocíonal'" ou "composíção de antícorpo
Kl .6 21/87 b í 6 rnonoclonal" desígna uma preparação de moléculas de
G anticorpos com composição molecular única. Uma composição ' de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de Iigação e afinidade para um epítopo específico.
5 A expressão ""antícorpo monoclonal humano'"' inclui anticorpos que exibem uma única especifícídade de Iigação que contêm regiões variáveis e/ou constantes (quando presentes) derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Em uma realização, os anticorpos monocíonaís 10 humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, tal corrto um camundongo transgênico, que possui um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeía Ieve fundi-dos a urna célula 4 - . - - - .
· -·- · a 15 "imortal'i.zada.' ", ' "":" . ^ . .. "Fv de cadeia única"" ou "SCFv'" designarn um anticorpo que compreende os domíníos vh e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma úníca cadeia de polipeptídeo. Geralmente, um SCFv corrtpreende adicionalmente 20 um ligante de polipeptídeo entre os dcmínios VH e VL, o que permíte que o SCFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. "Paciente"' é utilizado para designar, exceto quando indicado, mamíferos tais como seres humanos e primatas não 25 humanos, bem como coelhos, ratos, camundongos, cabras, porcos e outras espécies de mamíferos.
"Anticorpo recombinante"" designa todos os anticorpos produzidos por meio de métodos recombinantes. Estes incluem antícorpos obtidos de um animal que é transgênico para o 30 Iocal de imuIlog1obuiína, anticorpos expressos a partir de um vetor de expressão reconibinante e anticorpof criadosv preparados e expressos por meio da cIivagem de qualquer sequêncía genétíca de ímunoglobulina em qualquer outra tt$ 22/87 b b.
,&..
Ç sequência de ácidos nucléicos. ' Anticorpos anti-14-3-3 ' Ern um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos anti-14-3-3 eta. Os anticorpos anti-14-3-3 eta de acordo 5 com a presente invenção são capazes de (i) ligar-se especificamente à proteína 14-3-3 eta humana na sua configuração nativa, conforrne evidenciado, por exemplo, por meio de imunoprecipitação e (ii) ligar-se seletivamente a proteína 14—3—3 eta humana sobre outras ísoformas de 10 proteína 14-3-3 humana. Por ligação específica a uma proteína 14-3-3 eta humana na sua "'configuração natural", indica—se uma capacidade de ligação a proteína 14-3-3 encontrada in v"ivo.
Isso pode ser evidenciado, por exemplo, pela capacídade do . -- ' 15 , anticorpo-de imunoprecipitar, proteína-x--14 ,3 3--.eta a- partir - '. "- de uma amostra biológica.
Por "seletividade para a ínencionada proteína 14-3-3 eta humana sobre outras isoformas de proteína 14-3-3 humana", indica-se uma capacidade de ligação específica a 20 proteína 14-3-3 eta humana e ligação preferencial a 14-3-3 eta em contparação com outras ísoformas de proteína 14-3-3 humana sob as mesmas condições. A seletívídade pode ser evidenciada, por exemplo, utilizando um teste ELISA, que pode ser realizado einpregando, por exemplo, sobrenadante de 25 clones de hibrídoma. É preferencialmente utilízado um controle (tal como soro pré-imune). Um anticorpo "'seletívo" é capaz de reconhecer 14-3-3 eta e gerar um sínal mais alto contra 14-3-3 eta em comparação com outras isoformas de 14- . 3-3, preferencialmente um sínal- pelo menos uma vez e meia, 30 de maíor preferêncía pelo menos duas vezes maís alto em comparação com outras isoformas. Em uma realização preférida, um anticorpo seletivo possui uma capacidade de imunoprecipitar seletivamente 14-3-3 eta em comparação com , E t, 23/87 6 E' k
K l l T ' outras ísoformas de 14-3-3. i t Em uma realização preferida, o anticorpo antí-14-3-3 ' eta exibe seletividade para a inencionada proteína 14-3-3 eta humana sobre proteínas 14-3-3 " alfa, beta, delta, 5 épsilon, gama, tau e zeta humanas. Isso pode ser evidenciado, pòr exemplo, por meio de EL.ISA. Em uma realização preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção é capaz de ligar-se a uma proteína 14-3-3 eta que está Iocalízada de forma 10 aberrante no espaço sínovial, extracelular em, artrite. Isso pode ser evidenciado, por exeniPio, por rríeio de imunoprecipitação de proteína '14-3"3 eta presente em uma amostra de fluido sinovial 'de um paciente' portador de artrite. . . 15 Em uma' realização preferida,;' um-antícorpo· anti--14--3-3 eta é capaz de inibir a indução de MMP por 14-3-3 eta. Preferencialmente, o MMP é selecionado a partír do grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, IO, 11 e 13, em que MMP-I e mp-3 são especialinente preferidos. Essa capacidade pode 20 ser determinada por meio de um teste in vitro ou um teste in vivo. Como apreciarão os técnicos no assunto, os testes serão projetados de tal forma que, na ausência de anticorpo anti-14-3-3 eta, a presença de 14-3-3 eta resultará na indução de MMP. Uma capacidade de reduzir esta índução" de 25 MMP por 14-3-3 eta pode evidenciar essa capacidade de inibição de função para um anticorpo antí-14-3-3.
Epítopos 14-3-3 Eta . - Ç Em uma realização preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção não se Iiga a um 30 epítopo no terminal- N de 14-3-3 eta. Por 14-3-3 eta "N- terminal", indica-se os aminoácidos 1-12 (ou sejav DREQLLQRARLA (SEQ ID N° 33).
Em uma realização preferída, um antícorpo anti-14—3-3
Õ m + » ~ r * eta de acordo com a presente invençao é capaz de ligar-se a um epítopo que compreende um peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de peptídeos 14-3-3 eta de circuito, peptídeos 14-3-3 eta de hélice e peptídeos 14-3-3 eta não- 5 hélice, em que peptídeos de circuito eta são especialmente preferidos. Vide aqui a Tabela I. Exemplos de peptídeos 14- 3-3 de circuito, hélice e não-hélice são aqui descritos na Tabela 1. Notadamente, SEQ ID N° 30 varia da sequência 14- 3-3 eta correspondente pelo fato de que uma cisteína que 10 ocorre na sequência 14-3-3 eta foi substituída por serina para evitar a formação de ligações de dissulfeto. Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos que também se ligam à sequência 14-3-3 natural relativa a SEQ ID N° 30 que compreende uma cisteína. Em uma realização, a 15 presente invenção fornece anticorpos capazes de ligar-se a sequências de peptídeos que variam das relacionadas na Tabela 1 pela substituição de serina por cisteína. (i) Peptídeos de circuito Em uma realização preferida, o peptídeo de circuito 20 14-3-3 eta compreende uma sequêncía de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 11 a 16. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 eta que se sobrepõe a uma sequência de amínoácidos correspondente a uma sequência 25 selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 11 a 16.
Em uma realização especialmente preferida, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção liga-se a uina sequência de aminoácidos selecionada a partir 30 do grupo que consiste de LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30), KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31) e KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N° 32).
(ii) Peptídeos de hélice Em uma realização preferida, o peptídeo de hélice 14-
m 25/87
Q N
W ." " 3-3 eta compreende uma sequência de aminoácidos selecionada - a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a 10. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 gama que se sobrepõe a uma sequência 5 de aminoácidos correspondente a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 1 a 10.
(iii) Peptídeos não-hélice Em uma realização preferida, o peptídeo não-hélice 14- 3-3 eta compreende uma sequência de aminoácidos selecionada 10 a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 17 a 32. Em uma outra realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta liga-se a uma região de 14-3-3 eta que se sobrepõe a uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 17 a 32.
15 Anticorpos monoclonais, hibridomas e métodos de sua elaboração Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-14-3-3 eta que são anticorpos anti-14-3-3 eta monoclonais. Também são fornecidas linhagens de células 20 de hibridoma capazes de produzir esses anticorpos. São ainda fornecidos métodos de produção desses hibridomas e métodos de produção desses anticorpos.
Os anticorpos anti-14-3-3 eta monoclonais fornecidos incluem anticorpos que se ligam a peptídeos 14-3-3 eta de 25 circuito, hélice e não-hélice descritos no presente. Em um aspecto, a presente invenção fornece hibridomas produzidos por meio de fusão de uma célula do baço derivada de um camundongo imunizado com um imunogene que compreende um peptídeo 14-3-3 eta de circuito, hélice ou não-hélice.
30 Também são fornecidos anticorpos monoclonais produzidos por esses hibridomas. A presente invenção fornece adicionalmente métodos de produção desses anticorpos monoclonais ou seus derivados,
'Y 26/87 '¢ l . * !A. 1> \j'-""i,. que compreendem o cultivo de um hibridoma de acordo COIll a 7, t $ r presente invenção sob condições apropriadas, por meio do !"
P i que é produzido um antícorpo monoc1ona1, e obtenção do l anticorpo e/ou seu derivado ·da célula e/ou do meio de | 5 cultivo celular.
i Os anticorpos podem ser produzidos facilmente pelos [ I técnicos no assunto. A metodologia geral de elaboração de t i anticorpos monoclonaís por meio de hibridomas é agora bem .conhecida na técnica. Vide, por_,exeinp1o,. M. Schreíer et ?lv 10 Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor,Laboratory) 1980; Haimerling et al, , Monoclonal Antibodíes , and T-Ce11 Hyb-ridomas (E-Zsevier Biomedical Press) 1981.
Em algumas realizações, estes métodos cornpreendem o cultivo de. urna célula de hibridoma. sob condições 15 apr,opriadas em .que o anticorpo é produz-ído e..,a obtenção.do anticorpo e/ou seu derivado da célula e/ou do meío de cultivo celu·lar.
A presente invenção tarríbém contempla o uso de bibliotecas de fagos para eíaborar antícorpos capazes de 20 ligação aos- peptídeos 14-3-3. de interesse descritos no presente. Vide, por exemplo, Konthur et al, Targets, 1: 30- 36, 2002. , ,, . . Os anticorpos produzídos' por qualquer meio podem ser purificados por meío de métodos conhecídos dos técnicos no 25 assunto. Os métodos de purifícação incluem, entre outros, preparação seletiva, crornatografía de líquidos, HPLC, eletroforese, cromatoconcentração e vários métodos de afínidade. A.precipitação seletiva pode utilizar sulfato de amônio, etanol (precipitação de Cohn), poIietileno. glicol 30 ou outros agentes disponíveis na técnica. Meios de cromatografía de líquídos inctuem, ent.re outros, meio de troca de íons DEAE, polia-spartato, hidroxilapatíta, exclusão de tarnanho (tal como os baseados em agarose
W + 4 .. 4
X " .' . - reticulada, acrilamida, dextran etc.), matrizes * hidrofóbicas (tais como Blue Sepharose). Métodos de afinidade dependem tipicamente de proteínas que interagem com o domínio Fc de imunoglobulina. A proteína A de 5 Staphylococcus aureas pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeias pesadas Yj, y2 ou p'4 humanas (Lindmark et al, j. Ihununol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Proteína G de C e G streptococci é útil para todos os isotipos de camundongos e para yt3 humano {Guss et al, 10 EMBO j. 5: 1567-1575 (1986)). Proteína L, ima proteína de parede celular de Peptostreptococcus magnus que liga imunoglobulinas (Ig) por meio de interações de cadeia leve k (BD Bioscience/ClonTech, Palo Alto CA), é útil para purificação de afinidade de subclasses de Ig IgM, IgA, IgD, 15 IgG, IgE e IgY. Formas recombinantes dessas proteínas taIrbéIn são disponíveis comercialmente. Caso o anticorpo contenha resíduos de ligações metálicas, tais como anticorpos de exibição de fagos construídos para conter marcas de histidina, pode-se utilizar cromatografia de 20 afinidade metálica. Quando forem disponíveis quantidades suficientes de populações celulares específicas, poderrt ser elaboradas inatrizes de afinidade de antígenos com as células para fornecer um método de afinidade para purificar os anticorpos. 25 Em uma realização preferida, o isolamento envolve cromatografia de afinidade utilizando 14-3-3 eta ou seu fragmento. A presente invenção fornece os anticorpos descritos no presente, bem como fragmentos de anticorpos correspondentes 30 e partes de ligação de antígenos. Todos são englobados pela expressão anticorpo anti-14-3-3 eta. As expressões "fragmento de anticorpo" ou "parte de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou simpleswente "parte de anticorpo") de r 28/87 á r-
D I
W " acordo coín a presente invenção, da forma utilizada no presente, indicam um ou mais fragmentos de um anticorpo que
C retêm a capacidade de ligação específica a um antígeno. Demonstrou-se que a função de Iigação de antígenos de um 5 anticorpo pode ser realizada por meio de fraguientos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fraginentos de ligação englobados na expressão "fragmento de anticorpo" ou "parte de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste 10 dos domínios VL, VH, CL e CHl; (ii) uin fragmento de F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento de Fd que consiste dos domínios VH e CHl; (iv) um fragmento de Fv que 15 consiste dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; {v) um fragmento de c1Ab (tal como Ward et al (1989), Nature 341: 544-546), que consiste de urn domínio VH; e (vi) uma região de determinação da complementaridade isolada (CDR); e (vii) dímeros de Fv de cadeia única 20 biespecíficos (por exemplo, PCT/US92/09965). Além disso, embora qs dois domínios do fragmento de Fv, VL e vh, sejam codificados por genes separados, eles podení ser ligados, utilizando métodos recombina.ntes, por um ligante sintético que permite a sua elaboração como uma única cadeia de 25 proteína na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (SCFv); vide, por exemplo, Bird et al (1988), Science 242: 423-426; e Huston et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A., 85: 5879-5883). Esses anticorpos de cadeia única 30 tanibém se destinam a ser englobados na expressão "parte de ligação de antígenos" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando métodos convencionais conhecidos dos técnicos no assunto e os fragmentos são é e 3 q selecionados para utílidade da mesma forrna que anticorpos . intactos. Os fragmentos de anticorpos podem ser modificados. As moléculas podem ser estabilizadas, por exemplo, por meio da incorporação de pontes de dissulfeto 5 que ligam os domínios VH e VL (Reiter et al, 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245). As moléculas de imunoglobulina podem ser clivadas em fragmentos. A região de ligação de antígenos da inolécula pode ser dividida em fragmentos de F(ab')2 ou Fab. O 10 fragmento de F(ab')2 é divalente e é útil quando a região Fc for indesejável ou não for uma característica necessária. O fragmento de Fab é univalente e é útil quando um anticorpo possuir uma avidez muito alta para o seu antígeno. A eliininação da região Fc do anticorpo reduz a 15 ligação não específica entre a região Fc e as células que contêm receptor Fc. Para gerar fragmentos de Fab ou F(ab')2, os anticorpos são digeridos com uma enzima. As proteases que se clivam na região de articulação de uma inolécula de imunoglobulina preservam a(s) ligação(ões) de 20 dissulfeto que liga(m) os domínios de Fab de tal forma que permaneçam juntas após a clivagem. Uma protease apropriada com este propósito é pepsina. Para a produção de fragmentos de Fab, são selecionadas proteases de tal forma que a clivagem ocorra acima da região de articulação que contém 25 as ligações de dissulfeto que ligam as cadeias pesadas mas deixa intacta a ligação de dissulfeto que liga a cadeia pesada e a leve. Uma protease apropriada para elaboração de fragmentos de Fab é papaína. Os fragmentos são purificados por meío dos métodos descritos acima, com exceção de 30 métodos de afinidade qjue necessitam da região Fc intacta (tal como cromatografia de afinidade de Proteína A).
Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por meio de proteólise limitada de anticorpos e são denominados
N
30/87 ê
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· fragmentos de anticorpos proteolíticos.
Estes incluem, mas serri limitações, os seguintes: fragmentos de F(ab')2, fragmentos de Fab', fragmentos de Fab'-SH e fragmentos de Fab. "Fragmentos de F(ab')2"' são liberados de um anticorpo
5 por meio de exposição limitada do anticorpo a uma enzima proteolítica, tal como pepsina ou ficina.
Um fragmento de F(ab')2 compreende dois "braços", cada um dos quais compreende ima região variável que é dirigida e liga-se especificamente a um antígeno comum.
As duas moléculas de
10 Fab' são ligadas por meio de ligações de dissulfeto intercadeias nas regiões de articulação das cadeias pesadas; as rnoléculas de Fab' podem ser dirigidas ao mesmo epítopo (bivalente) ou diferentes (biespecíficos). "Fragmentos de Fab"' contêm um único domínio de ligação de
15 antígeno que compreende um Fab e uma parte adicional da cadeia pesada por meio da região de articulação. "Fragmentos de Fab'-SH" são típicamente produzidos a partir de fragmentos de F(ab')2, que são mantidos juntos por ligação(ões) de dissulfeto entre as cadeias H em um 20 fragmento de F(ab')2. Tratamento com um agente redutor suave tal coikio, como exemplo não Iimitador, betamercaptoetilamina roMpe a(s) ligação(ões) de dissulfeto e dois fragmentos de Fab' são liberados de um fragmento de F(ab')2. Fragmentos de Fab'-SH são monovalentes e 25 monoespecíficos. "Fragmentos de Fab'" (ou seja, um fragmento de anticorpo que contém o domínio de ligação de antígenos e compreende uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada errt ponte com uma ligação de dissulfeto) podem ser produzidos por meio de digestão de papaína de anticorpos intactos.
Um 30 método conveniente é o uso de papaína imobilizada sobre uma resina, de tal forma que a enziína possa ser facilmente removida e a digestão encerrada.
Os fragmentos de Fab não possuem a(s) ligação(ões) de dissulfeto entre as cadeias H
% e, k ? qj presentes em um fragmento de F(ab')2. è, ¥ "Antícorpos de cadeia única" são um tipo de fragmento de anticorpo. A expressão anticorpo de cadeia úníca é frequentemente abreviada '"ScFv'" ou "SFv". Estes fragmentos 5 de anticorpos são produzidos utílizando tecnología de dna recombinante. Um anticorpo de cadeia única consiste de uma cadeia de poIipeptídeo que compreende os domínios Vh e Vl que interagem para formar um local de Iigação de antígenos. Os domínios V,j e Vl são normalmente Iígados por um peptídeo 10 com 10 a 25 resíduos de aminoácidos. A expressão "antícorpo de cadeia única" inclui ainda, mas sem límitações, um Fv ligado por dissulfeto (dsFv) no qual dois antícorpos de cadeia única (cada um dos quaís pode referír-se a um epítopo diferente) são Iigados entre ' 15 ""!3-i--"Por -urn 1igação."'de",dissulfeto;,'" uin sFv....biespecífíco no "" qual dois SCFVS discretos com especificidade diferente são conectados com um ligante de peptídeo; um díacorpo (um SFv dimerizado forniado quando o domínio V,, de um prímeiro sFv reúne COIll o domínio Vl de um segundo sFv e o domínio Vl do 20 primeiro SFv reúne com o domínio \/h do segundo sFv; as duas regiões de jLigação de antígenos do díacorpo podem ser dirígidas a epítopos idênticos ou díferentes); e um triacorpo (um SFV trimerizado, formado de maneira similar a um diacorpo, mas no qual três domínios de ligação de 25 antígenos são criados em um único complexo; os três domínios de Iigação de antígenos podem ser dirígídos a epítopos idênticos ou diferentes). "Peptídeos de região de determinação completar" ou "peptídeos de CDR"" são uma outra forma de um fragmento de 30 antícorpo. Em uma realização, a presente invenção fornece esses peptídeos de CDR. Eín uma realização preferida, esses peptídeos de CDR funcionam como antagonistas de 14-3-3 eta.
Um peptídeo de CDR (também conhecído como "unídade de -T
0' 32/87 b 4 # T" "" " "'" · á|,
I reconhecimento mínimo" ) é um peptídeo correspondente a uma e b- única região de determinação de complementaridade (CDR) e pode ser preparado por meio de construção de genes que codificam a CDR de um antícorpo de interesse. Esses genes 5 são preparados, por exemplo, utiíizando a reação em cadeia de poIimerase para sintetizar a região variável de RNA de células produtoras de anticorpos. Vide, por exemplo, Larrick' et al, Methods: a Companíon to Methods in Enzymology, 2: 106, 1991.
10 Em "antícorpos modificados por cisteína", um aminoácído de cisteína é inserido ou substituído sobre a superfície de anticorpo por meio de manipulação genética e utilizado para conjugar o antícorpo a uma outra molécula, por exemplo, por meío de uma ponte de dissulfeto. Eoram .-,-15 descritas . substituições ou '"inserções.-:de" cisteína ."para ' anticorpos (vide a Patente Norte-Americana n° 5.219.996).
Métodos de introdução de resíduos de Cys na regíão constante dos anticorpos IgG para uso na conjugação específica de local de anticorpos são descritos por Stimmel 20 et al (J. Biol. Chem., 275: 330445-30450, 2000). A presente divulgação fornece adícíonalmente anticorpos humanizados e não humanízados. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de camundongos) são anticorpos químéricos que contêm sequência 25 mínima derivada de ímunoglobulina não humana. Geralmente, anticorpos humanízados são anticorpos não humanos que apresentaram as regiões de estrutura de domínío variável comutadas por sequências encontradas em anticorpos humanos.
Os anticorpos humanizados podem ser imunog1obu1ínas humanas 30 (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou b q —-m _ & < _. ,.
W primata não humano que possuí a específicídade, afínídade e fi e · capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além 5 disso, os anticorpos human.izados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o antícorpo humanizado compreenderá substancíaímente todos 10 dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios varíáveis, eín que todos ou substancialmente todos os Iaços hipervariáveis correspondem. aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancíalmente todas as FRS são as de uma sequêncía de imunoglobulína humana. O anticorpo" 15 humanizado-também compreenderá-opcionalmente pe1o"rnenos" uma' . r . ·: parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma ímunog1obu1ina humana.
Geralmente, em um anticorpo humanizado, todo o anticorpo, exceto as CDRS, é codificado por um 20 polinucleotídeo de origem humana ou é idêntico a esse anticorpo, exceto nas suas CDRS. As CDRs, das quais algumas ou todas são codificadas por ácidos nucléicos origináríos em um organismo não humano, são enxertadas na estrutura de folha beta de uma região varíável de anticorpo humano para 25 criar um anticorpo, cuja especifícídade é determínada pelas CDRS enxertadas. A criação desses antícorpos é descrita, por exemplo, em WO 92/11018, jones, 1986, Natu-re 321: 522- 525, Verhoeyen et al, 1988, Science 239: 1534-1536. Anticorpos humanizados podem também ser gerados utílízando 30 camundongos com um sistema imunológíco geneticamente elaborado, tal como em Roque et al, 2004, Biotechnol. Prog.
20: 639-654.
Pode ser desejável modificar os antícorpos de acordo
'P 34/87 b
Q h - .—-—- * r com a presente i.nvenção com reíação à função efetora. a Resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s), por exemplo, na região Fc, de forma a permitir a forinação de ligações de dissulfeto íntercadeias nessa região. 5 Antícorpos homodímérícos podem também ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais, tal como em Wolff et al, Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser elaborado um anticorpo que contém regíões Fc duplas. Víde, por exemplo, Stevenson et 10 al, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989). Anticorpos modificados Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-14-3-3 eta que são antícorpos modificados. Os anticorpos ntodificados incluem antícorpos recombinantes "'"" ""'" 15"."""con£orme" 'aqui descril-o . · " . ..-.-, - ..,. - ,..-.. - ..K ."' ' j " " ^: . '. - -.- . "" Numerosos tipos de anticorpos modificados ou recombinantes serão aprecíados pelos técnícos no assunto. Tipos apropriados de anticorpos modíficados ou recombínantes incluern, sem limitações, anticorpos 20 monoclonaís elaborados (tais como anticorpos monoclonais quiméricos, antícorpos monoclonaís humanízados), anticorpos de domínio (tais como fragmentos de Fab, Fv, VH, SCFV e dsFV), anticorpos multivalentes ou multíespecífícos (tais corrto diacorpos, mínicorpos, minianticorpos, (SCFV)2, 25 tricorpos e tetracorpos) e conjugados de anticorpos conforme descrito no presente. Eni um aspecto, í a presente invenção fornece anticorpos anti-14-3-3 eta que são antícorpós de domínio. "Anticorpos de domínío"" são domínios de Iigação funcíonais . de 30 anticorpos, correspondentes às regíões varíáveis das cadeias pesada (VH) ou leve (VL) de anticorpos humanos. Anticorpos de domínío podem possuír um peso molecular de cerca de 13 kDa ou menos de um décimo do tamanho de um
B t .
W k » anticorpo completo. Eles são bem expressos em uma séríe de e ' hospedeiros que incluein sistemas de células bacterianas, de leveduras e de mamíferos. Aíém dísso, antícorpos de domínío são altamente estáveis e retêm a atividade mesmo após serem 5 submetidos a condições difíceis, tais como secagem por congelamento ou desnaturação por calor. Vide, por exernplo, a Patente Norte-Americana n° 6.291.158, 6.582.915, .
6.593.081, 6.172.197; Número de Série Norte-Americano n° 20'04/0110941; Patente Européia n° 0368684; Patente Norte- lO Americana n° 6.696.245, WO 04/058821, WO 04/003019 e WO 03/002609. Em uma realização, o anticorpo de domínio de acordo com a presente ínvenção é um único domínio. Anticorpos de domínio único podem ser preparados, por exemplo, conforme descrito na Patente Norte-Arriericana n° - -. -g" — .-. - 15.-r--6.248.516.. - . , . 1 . . . b Em um outro aspecto, a presente ínvenção inclui- anticorpos multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos incluem anticorpos biespecíficos, triespecíficos etc. Anticorpos bíespecíficos podem ser produzídos por meios 20 recombinantes, utilizando, por exemplo, porções de fecho de leucina (ou seja, das proteínas Fos e jun, que formam preferencialrnente heterodímeros; tais corrio Kostelny et al, 1992, lj. Iínmunol. 148: 1547) ou outras estruturas de domínío ínterativo de trava e fechadura, tal como conforme 25 descrito na Patente Norte-Americana n" 5.582.996. Os métodos úteis adicionais incluem os descritos na Patente Norte-Amerícana n° 5.959.083; e Patente Norte-Americana n° b
5.807.706. Os anticorpos biespecíficos às vezes são também 30 denominados "diacorpos". Estes são anticorpos que se ligam a doís (ou maís) antígenos diferentes. Também são conhecídos na técnica triacorpos (um sFv trimerizado, formado de maneira similar a um diacorpo, mas no qual três
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P" domínios de ligação de antígenos são criados em um único á complexo; os três dcmínios de ligação de antígenos podein ser dirigídos a epítopos ídêntícos ou díferentes) ou tetracorpos (quatro domínios de Iígação de antígenos 5 criados em um único complexo em que os quatro domínios de ligação de antígenos podem ser dírigidos a epítopos idênticos ou díferentes). Dia-, tria- e tetracorpos podem ser fabricados em uma série de formas conhecidas na técníca
(tais como Holliger e Winter, 1993, Cu.rrent Opinion
10 Biotechnol. 4: 446-449), tal como preparados quimicamente ou a partir de híbridomas híbridos.
Além dísso, esses anticorpos e seus fragrnentos podem ser construídos por meio de fusão genética (tal como Toml-inson et al, 2000, Methods Enzymol. 326: 461-479; WO 94/13804; Hollíger et al, 1993,
, .., 15'. Proc.
Natl: Acad: Sci:' U. 'S:' A." 90:' 6444-6448)": " " Em uma outra realização, a presente invenção fornece minicorpos, que são proteínas siinilares a anticorpos minimizados que incluem um SCFV Iígado a um domínio CH3 e são derivados de um anticorpo antí—14-3-3 eta.
Minícorpos
20 podem ser elaborados conforme descrito na técnica (vide, por exeinplo, Hu et al, 1996, Cancer Res. 56: 3055-3061). Em uma outra realização, a presente ínvenção fornece proteínas de fusão de imunogíoblina de domínío de Ii-gação de 14-3-3 eta.
Em uma realização, a proteína de fusão pode
25 incluir um polipeptídeo de domínio de ligação de 14-3-3 eta fundido a um poIipeptídeo de região de articulação de imunoglobulina, qjue é fundido a um poIipeptídeo de região constante de CH2 de cadeia pesada de imunog1obu1ina fundido a um polipeptídeo de região constante de CH3 de cadeia 30 pesada de imunoglobulina.
Com base na presente ínvenção,
' proteínas de fusão de anticorpo 14-3-3 podem ser elaboradas -por meio de métodos conhecidos dos técnicos no assunto (vide, por exemplo, os Pedidos de Patente Norte-Americanos
.
*
È b' publicados n° 20050238646, 20050202534, 20050202028,
G 2005020023, 2005020212, 200501866216, 20050180970 e 20050175614). Em uma outra realização, a presente irrvenção fornece 5 uma proteína de cadeia pesada derivada de um antícorpo anti-14-3-3 eta. Anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural (tais como anticorpos de camelídeos que não contêm cadeias Ieves) vêm sendo utílizados para desenvolver proteínas terapêuticas derivadas de anticorpos que 10 tipicamente retêm as propriedades estruturais e funcionais de anticorpos de cadeía pesada de ocorrêncía naturaí. Eles são conhecidos na técnica como nanocorpos. Proteínas de cadeia pesada derívadas de um antícorpo de cadeia pesada anti-14-3-3 eta podem ser elaboradas por meio de métodos 15 - conhecidos dos- técnicos no assunto (víde,, por exemplo, os".
Pedidos de Patente Norte—Americanos publicados n° 20060246477, 20060211088, 20060149041, 20060115470 e 20050214857). Além disso, com relação à produção de anticorpos apenas de cadeia pesada em camundongos corn 20 deficiência de cadeias Ieve, víde, por exemplo, Zou et al, JEM, 204: 3271-3283, 2007.
Em uma realizaçào, a presente ínvenção fornece anticorpos anti-14-3-3 eta modífícados que são antícorpos humanos. Em uma realização, são Eornecidos anticorpos 14-3- 25 3 totalmente humanos. "Anticorpo totalmente humano'" ou "anticorpo humano completo'" designa um anticorpo humano que contém apenas a sequência genética de um antícorpo derivado de um cromossomo humano. O anticorpo humano completo anti- 14-3-3 pode ser obtido por meio de um método que utiliza um 30 camundongo produtor de anticorpos humanos que contém um fragmento de cromossomo humano que contém os genes para uma cadeia.pesada e uma cadeia Ieve de um anticorpo humano (vide, por exemplo, Tomizuka, K. et al, Nature Genetics, .r" "
b â à 16, págs . 133-143, 1997; Kuroiwa, Y. et al, Nuc. Acids è $1 Res., 26, págs. 3447-3448, 1998; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, voI. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y. , Matuda, T. e Iijima, s. , eds. ) , Kluwer 5 Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al. , Rroc . Na t-Z . Acad. Sci. U. S. A., 97, 722-727, 2000) ou obtído por meio de um método de obtenção de uin anticorpo humano derivado de uma exibição de fago selecionada a partir de uma biblioteca de anti corpo s humanos (víde, por exemplo, Worms tone , I . M.
10 et al, Investígative Ct)h thalmol ogy & Vísua-Z Scí ence, 43 (7), págs. 2301-8, 2002; Carmen, S. et al. , Briefings in Functional Genomics and Proteomi cs, 1 (2), págs . 189-203, 2002; Siriwardena, D- et al- , (X)htha1mo1ogy, 109 (3) , págs . 427-431, 2002) . . - 15 ,- : ,Em . um aspçcto, - a· presente,,,.-inyenção- fornece u1n: - anticorpo 14-3-3 que é um análogo de anticorpo, denorninado às vezes "anticorpos sintéticos"". Pode-se utilizar, por exemplo, suportes de proteína alternativos ou suportes artíficiais com CDRS enxertadas. Esses suportes incluem, 20 mas sem limitações, suportes sintéticos que consistem, por exemplo, de poIímeros biocompatíveis . Vide, por exemplo, Korndorfer et al, 2003, Proteins : Structu-re, Functíon and Bioinformatics, Volume 53, edição 1: 121-129. Roque et al, 2004, Biotechnol . Prog. 20: 639-654. Além dísso, podem ser 25 utilizadas imitações de anticorpos de peptídeos ("PAMS") , bem como ímitações de antícorpos que utili zam componentes de fibronectina como suporte . Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos reticulados que incluem doís ou mais anticorpos 30 descritos no presente Iígados entre sí para formar complexos de anticorpos. Os antícorpos reticulados t ambém são denominados inultímeros de anticorpos, homoconj ugados e heteroconjugados .
OL O.
Em algumas realízações, os complexos de anticorpos - P' . 6\ fornecidos no presente íncluem formas multímérícas de anticorpos anti-14-3-3. Os comple9os de ãnticorpos de acordo com a presente invenção podem, por exemplo, assumir 5 a forma de dímeros de anticorpos, trímeros ou multímeros de ordem superior de moléculas de ímunog1obu1ína monomérícas. A reticulação de anticorpos pode ser realizada por meío de diversos métodos conhecidos na técnica. A reticulação de anticorpos pode ser realizada, por exemplo, por meí.o de 10 agregação natural de anticorpos, por meio de métodos de ligação química ou recombinante ou outros métodos conhecidos no assunto. As preparações de anticorpos purificados podem formar espontanea1nente, por exempl-o, agregados de proteína que contêm homodímeros de anticorpos Ú " k 15 - e-outros.'mult.ímeros de·.anti'corpos,-de ordem. superior. '-. .- ' ---- Em uma realização, " a presente invenção fornece anticorpos homodimerizados que se Iigam específícamente a 14-3-3 eta. Os anticorpos podem ser reticulados ou dimerizados por 20 rrteio de métodos de ligação conhecidos no assunto. Podem ser utilizados métodos de Iigação náo covalentes. Em uma reaíização específica, a reticulação de anticorpos pode ser atingida utilizando um anticorpo reticulante secundário. O anticorpo reticulante pode ser derivado de um animal 25 diferente em comparação com o anticorpo de interesse. Um antícorpo anticamundo'ngo de cabra (específico de Fab) pode ser adicionado, por exemplo, a um anticorpo monoclonal de camundongo para formar um heterodímero. Este anticorpo reticulante bívalente reconhece a região de Fab ou Fc dos 30 dois anticorpos de interesse que formam um homodímero. Em uma realização da presente invenção, um antícorpo que se liga especificamente a antígeno 14-3-3 é reticulado utilizando um anticorpo anticamundongo de cabra (GAM). Em
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40/87 b'
b,
b¶
uma outra reali-zação, o reticulante GAM reconhece a região g c) Fab ou Fc de doís anticorpos, cada um dos quaís Iíga especificamente 14-3-3 eta.
Podem também ser utilizados métodos de ligação química
5 ou covalente de anticorpos . Os reticulantes químícos podem ser homo ou heterobi funcionai s e se Iigarão covalentemente a dois anticorpos, f ormando um homodímero . Agentes reticulantes são bem conhecidos na técnica; por exemplo, ligantes homo ou heterobí func'íona.i s são bem conhecídos
10 (vide 2006 Pie:rce Chemícal Company C:rossli nkíng Reagents Technical Handbook; Hermanson, G.
T., Bioconjugate Techniques, Academíc Press, San Diego CA (1996) ; Aslam, M. e Dent, A.
H. , Biocon jugation: Protein Coupling Techniques Í'or the Bi omedí cal Sci ences, Houndsmills , Inglaterra:
" 15 . Macmillan Publishers;" (1999) ; Pierce ::, :'App1ications Handbook - & Catalog, Perbio Science, Erinbodegem, Bélgíca (2003-2004) ; Haughland, R.
P. , Handbook OF FI uorescen t Probes and Research Chemica-Zs Eugene, nona edíção, Molecular Probes , OR (2003) ; e Patente Norte-Ainericana n° 5.747.641) . Os 20 técnicos no assunto apreciarão a adequação de diversos grupos funcionais sobre o (S) aminoácido (S) de um antícorpo para modif icação, incluindo .a reticulação . Exemplo s apropriados de reticulantes químicos utilizados para a reticulação de anticorpos incluem, mas sem Iimitações, SMCC
25 (4- (maleimídometil) ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidila) , SATA (S-acetiltioacetato de N- succinimidila) , ésteres de semissuccinato de N- hidroxissuccinirnida; sulfo-N-hidroxissuccinimida; hídroxibenzotríazol e p-nítrof enol ; dícíc1o-hexi1carbodí-
30 imida (DCC) , 1- ( 3-dímet 1Àamínopropíl) - 3-et i 1 carbodi - imida (ECD) e metiodeto de 1- (3-dimetilamínopropil) -3- etilcarbodi-imida (EDCI) (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.526.714, cujo reíatório descritívo é
- L i' 0T
Ò integralmente incorporado ao presente como referêncía). € k- Outros reagentes de Iigação íncluem gíutationa, 3- (dietoxifosforilóxi)-1,2,3-benzotriazin-4 (3H)-ona (DEPBT), reagentes de acoplamento com base em sais de ônio, 5 reagentes reticulantes heterobi funcíonais com base em polioxietííeno e outros reagentes (Haítao et al, Organ Lett. 1: 91-94 (1999) ; Albericio et al, j. Organi c Chemistry 63: 9678-9683 (1998) ; Arpicco et al, Biocon jugate Chem. 8: 327-337 (1997) ; Frisch· et al, Bioconjugate Chem.
10 7: 180-186 (1996) ; Frísch et al, Bioconjugate Chem. lO: 32- 37 (1998) ; Beyer et al, j. Med. Chem. 41: 2701-2708 (1998) ; Drouillat et al, j. Ph a rm. Sci . 87 : 2 5-3 0 (1998) ; Trinible et al, Biocon jugate Chem. 8: 416-423 (1997) ) . Um exemplo de protocolo de f ormação de homodímeros de anticorpos é 15 --fornecido.; na - -Patente. Norte-Americana - · Publicada"-- ,,' n-°
20060062786. Os métodos de conj ugação de compostos terapêutícos de anticorpos também são descrítos em Arnon et al, Monoclonal An tibodí es Eo-r Tmmunotarge ti ng o:t D-rugs í n Cancers Therapy em Monoclonal Antibodies and Cancer 20 Therapy, Reisfeld et al, Ed., págs. 243-256, Alan R. Liss, Inc . (1985) ; Thorpe et al, The Prepara ti on and Cytotoxi c Properti es O:E Antíbody Toxín Con j uga tes, Immunol . Rev". 62 : 119-58 (1982) ; e Pietersz, G. a., The Linkage OÍ' Cytotoxic Drugs to Monoclonal Antibodi es for the Trea tment o:f Cancer, 25 Bioconjugate Chemistry 1 (2) : 89-95 (1990) , em que todas as referências são incorporadas ao presente como referêncía . Além disso, os conjugados de anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser ligados covalentemente entre si por meio de métodos conhecidos na técníca, taís como o 30 uso dos reagentes reticulantes heterobí funcionaís , GMBS (maleimidobutrilóxi succínirriida) e SPDP (3- (2- piridiltio) propionato de N-succinimidila) (vide, por exemplo, Hardy, Purífí ca ti on and Couplí ng OÍ" FI uorescent
Bk 42/87 b U\ b Proteíns for Use in FIOW Cytometry, Handbook o:f .8" " Experimental Iínmunology, VoIume 1, Ihmunochemísrtry, Weír et al, (Eds.), págs. 31.4-31.2, quarta edição (1986) e . Ledbetter et al, Patente Norte-Americana n° 6.010.902).
5 Além disso, anticorpos podem ser ligados por meío de uma reticulação de tíoéter conforme descrito na Patente Norte-Americana Publicada n° 20060216284, Patente Norte- Arnericana n° 6.368.596. Corno apreciarão os técnicos no assunto, os anticorpos podem ser reticulados na região Fab. - 10 Em algumas realízações, é desejável que o retículante químico não interaja com a região de ligação de antígenos do anticorpo, pois isso pode afetar a função de anticorpos. Anticorpos conjugados Os anticorpos antí-14 3—3 eta descrítos no presente
15. i.ncjuem anticorpos conjugados- .r a compostos.- orgânicos-, ou-.-. - inorgânicos, incluindo, por exemplo e sern Iimitação, outras proteínas, ácidos nucléicos, carbo-hidratos, esteroides e Iipídíos (vide, por exemplo, Green et al, Cancer Treatment Reviews, 26: 269-286 (2000). O composto pode ser bioativo. 20 Bioativo designa um composto que possui um efeito fisiológico sobre a célula em compáração com uma célula não exposta ao composto. Um efeíto físíológíco é uma alteração em um processo biológico, que inclui, por exemplo e sem limitações, reprodução e reparo de DNA, recombinação, 25 transcrição, tradução, secreção, rendímento de membrana, adesão celular, transdução de sínal, morte celular e similares. Um composto bioativo inclui compostos farmacêuticos. Em uma realização, um anticorpo anti-14-3-3 eta é conjugado a um peptídeo antagonísta de 14-3-3, 30 preferencialmente R—18, preferenciatmente por meio de um ligante. Com referêncía a Rl8, vide, por exernplo, Wang et al, 1999 - REF. 35). Composições farmacêuticas, acúninístração e dosagens
6, 43/87
D "d 'j à' Os anticorpos anti-14-3-3 eta de acordo com a presente € G,) invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas apropriadas para administração a um pacíente.
Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um 5 anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Da forma utilizada no presente, '"veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agentes antíbacteríanos e 10 antífúngicos, agentes de retardamento da absorção, isotônicos e similares que sejam fisiologícamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceítáveis íncluem um ou mais dentre água, soIução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, gíícerol, .. --"15 :etanol·,e similares, -bem"-"como suas:"çoInbinações.'--Em muí"tos. ' b casos, será preferível incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, poliálcoois tais como manitoí, sorbítol ou cIoreto de sódio na composíção. Substâncías farmaceuticamente aceitáveis são agentes umectantes ou 20 quantidades pequenas de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentem a vida útíl ou a efícácía do anticorpo anti-14-3-3 eta. Em uma realização preferida, os anticorpos antí-14-3-3 25 eta são dirigidos a proteína 14-3-3 eta que se encontra em local extracelulâr. Consequenteinente, essas coínposíções terapêuticas são formuladas e a aàmínístração é tal que o anticorpo anti-14-3-3 eta fornecido desta forma é disponível para dirigir'—se à proteína 14-3-3 eta 30 extracelular. As composições de acordo com a presente invenção podem apresentar-se em uma série de formas . Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólídas e i·
?J b sólídas, tais como soIuções líquídas (por exempío, soIuções 0 6 injetáveis e em ínfusão), dispersões ou suspensões, pastilhas, pílulas, pós, lipossomos e supositÓrios.
A forma preferida depende do modo pretendido de adminístração e 5 aplícação terapêutica. as composíções preferídas típicas encontram—se na forma de soIuções injetáveís ou em infusão, tais como composições símilares. às utilizadas para a imunização passiva de seres humanos com outros anticorpos.
O modo de administração preferido é pa-renteral (tal como 10 intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular, em que intracapsular é de preferência especial). Em uma realização, o anticorpo anti-14-3-3 eta é administrado por meio de infusão ou ínjeção intravenosa.
Em uma outra reaíização preferida, o anticorpo anti-14-3-3 eta . é
-- -- 15 ..admi-ni·strado por - meio de injeção "íntramuscul"ar .ou" _ subcutânea.
Em tma realização preferida, é realizada injeção díreta no sínÓvio.
As composíções terapêuticas devem tipicamente ser estérêis e estáveis sob as condições de fabricação e
20 armazenagem A composição pode ser formulada na forma de solução, microemulsão, dispersão, Iípossomo ou outra estrutura ordenada apropríada para alta concentração de droga.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por meio da incorporação do contposto ativo na quantidade 25 necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredíentes enumerados acima, conforme o necessário, seguida por esterilização filtrada.
Geralmente, dispersões são preparadas por meio da incorporação do composto atívo em um veículo estéril que contém um meío de
30 dispersão básico e os demaís íngredientes necessários dentre os enumerados acíma.
No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferídos de preparação são secagem a vácuo e secagem por
S,
I ej l "'
' , congelamento, que gera um jjó do íngredíente atívo maís 4 qualquer ingredíente desejado adicional de uma solução filtrada estéril anteriormente.
A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, utilizando urn 5 revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e utílizando tensoativos.
A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser causada pela inclusão na composição de um agente que retarda a. absorção, tal como sais de 10 monoestearato e gelatína.
Os anticorpos anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção podem ser administrados por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica, que incluem infusão ou injeção intravenosa.
A admínistração díreta ao sínóvio é
., 15', ,uma :via'"""preferída. de admínistração.
Como .apreciarão os " ' técnicos no assunto, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados.
Em certas realizações, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que protegerá o coinposto contra Liberação rápida, 20 tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sístema de fornecimento microencapsulado.
Podem ser utílízados polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como etileno vinil acetato, poIianidridos, ácido po1ig1icó1íco,
25 colágeno, poliortoésteres e ácido poIiláctíco.
Muítos métodos de preparação dessas formulações são patenteados ou geralmente conhecidos dos técnicos no assunto.
Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug De-Zivery Systems, j.
R.
Robinson, Ed., Marcel Dekker, Inc., Nova 30 Iorque, 1978. A tecnologia de forniu1ação representatíva é ensinada, entre outros, em Remington: The Science and Practice O:E Pharmacy, 19" edição, Mack Publishing Co.,
Easton, PA (1995) e Handbook O:E Pharmaceutical Excipients,
'È 'l
U ·H terceíra edição, Kíbbe, A.H. ed., Washington DC, Amerícan " Pharmaceutical Association (2000).
Em certas realizações, um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção pode ser adtninistrado · 5 oralmente, por exemplo, com um díluente ínerte ou um veículo comestível assímílável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser incluído em uma cápsula de gelatina com cobertura mole ou dura, comprimido em pastilhas ou incorporado díretamen.te à alimentação do 10 paciente. Para admi-nístração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados a excipientes e utílízados na forma de pastilhas ingeríveis, pastilhas bucais, expectorantes, cápsulas, eííxíres, suspensões, xaropes, wafers e similares. Para adrríínístrar um composto de acordo com a Ir - , -,15· .presente· invenção de---outra" forma'" a'1ém""da"" admini"stração" parenteral, pode ser necessário revestir ou coadministrar o composto com um material que evíte a sua desatívação.
Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados às composições. Em certas realizações, um 20 anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção é coformulado e/ou coadminístrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como um DMARD, DMOAD ou outro anticorpo. Essas terapías de combinação podem utilízar convenientemente dosagens maís baixas dos agentes 25 terapêuticos administrados, de forma a evítar possíveís toxicidades ou complicações assocíadas às diversas monoterapias. As composições farmacêutícas de acordo com a presente invenção podem incíuir uma "quantídade terapeutícamente 30 eficaz" ou uma "'quantidade profílatícamente efícaz"" de um anticorpo de acordo com a presente ínvenção. "'Quantidade " terapeuticainente eficaz" designa uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir
C
47/87 bj
'j 6
0} o resultado terapêutíco desejado. '"Quantídade b terapeuticamente eficaz" do antícorpo antí-14-3-3 eta pode variar de acordo com fatores tais coiro o estado da doença,
idade, sexo e peso do indivíduo, bein como a capacidade do
5 anticorpo anti-14-3-3 de permítir uma reação desejada no indivíduo.
Quantídade terapeuticamente efícaz também é aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. '"Quantidade profilaticamente eficaz'" designa uma
10 quantidade eficaz, em. dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profiíático desejado.
Tipicamente, conio a dose profilática é utilizada em pacientes antes ou em estado íniciaí da doença, a quantidade profilatícamente eficaz será menor que a . ., · 15 -quantidade-'terapeuticamente eficaz:'"_ ,'" , "" '. "'""" " '"",-.: .:,,, ' Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a reação desejada ideal (tal como uma reação terapêutica ou profílátíca). Uma úníca mistura pode ser administrada, por exemplo, diversas doses divididas podem 20 ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme índicado pelas exigências da situação terapêutíca.
É especíalmente vantajoso forniular composições parenterais em forma de dosagem unitária por facilidade de administração e 25 uniformidade de dosagem.
Forma de dosagem unítáría da forma utilizada no presente desígna unídades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para os pacientes mainíferos a serem tratados; em que cada unidade contém uma quantidade previ.amente determinada de composto
30 ativo calculada para produzir o efeíto terapêutíco desejado em associação com c) veículo farmacêutico necessário.
A especificação das formas de dosagem unítáría de acordo com a presente invenção é ditada (a) pelas característícas
! 66 gj $ W¶ exclusivas do composto atívo e pelo efeito terapêutíco ou
E profilático específico a ser atingido; e (b) pelas limitações inerentes na técníca de composição desse composto ativo para o tratamento de sensibilidade em 5 indivíduos, e é diretamente dependen-te deles. Um exemplo-de faixa não Iimítadora para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a presente invenção é de 0,1 a 20 mg/kg, de rnaior preferência de 1 a 10 mg/kg. Deve—se observar que os 10 valores de dosagem podem variar com o tipo e a severídade da condição a ser aliviada. Deve-se compreender adicionalmente que, para qualquer paciente específico, os regímes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade índívidual e o 15 -'·julgamento". prof.issional:' da "pessoa"" que :administra ou. supervisiona a administração das composições e que as faíxas de dosagem descrítas no presente são apenas exemplos e não se destinam a Iimítar o escopo ou a prática da cornposição reivindicada. 20 As composições farmacêuticas descritas no presente podem ser apresentadas em recipientes com dose unitáría ou múltiplas dosagens, taís como ampolas vedadas. Esses recipientes são tipicamente vedados de forma a preservar a esterilidade e a estabilídade da formulação até o uso. Em 25 geral, formulações podem ser armazenadas na forma de suspensões, soIuções ou emulsões em veículos oIeosos ou aquosos, conforme indicado acima. Alternatívamente, uma composição farmacêutica pode ser armazenada em uma condição seca por congetamento que necessíta apenas da adíção de um 30 veículo Iíquído estérít imedíatamente antes do uso. Uso terapêutico de anticorpos anti-14-3-3 eta Por "tratamento"" no presente, indíca-se tratamento terapêutico ou profilátíco, ou uma medida supressíva para a
¥ bj ·1
Ê doença, dístúrbío ou condíção índe'sejável. o tratamento é' & engloba a administração dos anticorpos anti-14-3-3 eta do presente de forma apropriada antes do início dos sintomas da doença e/ou após manifestações cíínicas, ou outras 5 manifestações, da doença para reduzír a severidade da doença, suspender o progresso da doença ou eliminar a doença. A prevenção da doença inclui o prolongarnento ou o retardamento do início dos sintomas do distúrbio ou doença, 'preferencialmente em pacientes com maior sus.ceptibílídade à 10 doença. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento que envolvem 14-3-3 eta. Os métodos compreendem a administração de uma quan.tidade terapeuticamente efícaz de um anticorpo antí-14-3-3 eta de acordo com a presente -· 15 .invenção a.'pacientes. "Em_algumas reali"zações,.: os" métodòs"" compreendern tratamentos de combinação. Em uma realização, a presente ínvençào fornece métodos de tratamento de artrite, íncluindo métodos de tratamento de espondilite anquilosante, Màl de Behcet, hiperostose 20 esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Ehlers- Danlos (EDS), Síndroine de Fetty, fíbromíalgia, gota, artrite infecciosa, artrite juveníl, Iúpus, doença de tecido conectivo misturado (MCTD), osteoartrite, Mal de Paget, polintialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, 25 pseudogota, artríte psoríátíca, Fenômeno de Raynaud, artrite reativa, artrite reumatoíde, escleroderma, Síndrome de sjôgren, Mal de Still e granulomatose de Wegener. Em uma realização, o método envolve um tratamento de combinação, em que pel.o menos um outro agente terapêutíco é 30 administrado além de um ou mais anticorpos anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em uma realização preferida, o agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste de drogas antírreumáticas modificadoras l Bp
J K
W de doenças (DMARDS) e drogas de osteoartrite modificadoras ' de doenças (DMOADS; vide, por exemplo, Loeser, Reumatologia, 21: 104-106, 2005), anticorpo anti-TNFcx, anticorpo anti-IL—l, anticorpo anti-CD4, anticorpo anti- 5 CTLA4, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-IL-6, leflunomida, sulfassalazina e metotrexato. Métodos de diagnóstico, prognóstico e teragnóstico e monitoramento do t-ratamento Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de 10 diagnóstico de doenças e condições que envolvem 14-3-3 eta. Os métodos compreendem o uso de um anticorpo anti-i4-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção para detectar uma alteração na proteína 14-3-3 eta, tal como uma alteração na expressão, localização, função etc. Em uma realização, a , 15 --detecção,envolve".'"ímunoprecipitação com um"'anticorpo.'anti""" 14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Eir uma realização, a detecção envolve o uso de ELISA empregando um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em uma reaíização, a detecção envoíve western 20 Blot utilizando um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a detecção envolve o uso de ujn anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção em ímuno-hístoquímica. Em uma realízação, a detecção envolve o uso de um anticorpo antí-i4-3—3 eta de 25 acordo com a presente invenção em imunofluorescência. Em urna realização, a detecção envolve o uso de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção em análise FACS. Eir uma realização, a detecção envolve o uso de urn anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo coiti a presente 30 invenção em radioimunoteste. Ein uma realização, a detecção envolve o uso de um antícorpo antí—14.-3-3 eta de acordo com a presente invenção em um teste de faixas. Em uma realização, a detecção envolve o uso de um anticorpo anti-
b 51/87 ,ü'j ' /{]J U,,
B 14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção ern um teste de 'F ' ponto de cuidado. Em uma realização, a detecção de 14-3-3 eta é combinada com a detecç'ão de um outro marcador da condição (tal como MMP, anti-CCP, anti-RF e/ou CRP para 5 artrite). Em uma realização, a presente invenção fornece métodos de diagnóstíco de condíções inflamatórias. Em uma . realização preferida, são fornecidos métodos de díagnóstico de artrite. São íncluídos métodos de diagnóstico de doenças 10 selecionadas a partir do grupo que consiste de espondilite anquilosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Ehíers-Danlos (EDS), Síndrome de Feíty, fíbromialgia, gota, artrite infecciosa, artrite juvenil, lúpus, doença de tecido conectivo ''- 15-;; misturado,,- (MCTDÁ osteoartríte, Maí- de Paget, poIímialgia"" reumática, poIimiosíte e dermatontiosíte, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reatíva, artrite reumatoide, escleroderma, Síndrome de sjõgren, Mal de Still e granulomatose de Wegener. 20 Geralmente, a artríte pode ser detectada em pacientes com base na presença de 14-3-3 eta no fluido sinovíal, plasma ou soro de um paciente. Em outras palavras, proteína 14-3-3 eta extracelular pode ser utiíizada como marcador para indicar artrite. 25 Além disso, a presença de 14-3-3 eta ou os níveis relativos de isoformas de proteínas 14-3-3 que incluem 14- 3-3 eta, conforme determinado utilízando um antícorpo anti- l4-3-3 eta de acordo com a presente invenção e outros anticorpos anti-14-3-3, pode ser um indicador do 30 prognóstico de artrite em estágio inicial, antes de progredir para uma forma debílitadora. Uma vantagem do prognóstico 'ou diagnóstico precoce é a implementação precoce de um regime de tratainento.
b 52/87 >, 'g 'J q * A presença ou os níveís relativos de 14-3-3 eta podem
F " estar correlacionados com a presença ou os níveis relativos de outras proteínas na amostra do pacíente, tais como metaloproteinases de matrizes (MMPS), como MMP-I ou MMP-3.
5 Foram identificadas pelo rnenos 25 MMPs diferentes. A detecção de 14-3-3 eta em coMbinação corn pelo menos um MMP em uma amostra de pacíente pode ser utílizada para diagnosticar artrite. Além disso, a presença ou os níveis relativos de 14-3-3 eta em combinação com pelo menos um MMP 10 em uma amostra de paciente podein ser utilizados como indicador de prognóstico de artrite em es'tágio ínícial, antes que a artrite progrida para uma forma debilítadora.
Em uma realização, os métodos envolvem a detecção de proteína 14-3-3 eta no fluido sinovial, pIasma ou soro de :- :,:,..- 15.-·w:paciente.··:Em.=a..rea1ízação-,. a-'detecção. é rea1ízada."por""" meio de imunoprecipitação de proteína 14-3-3 eta de fluído sinovial, plasma ou soro utilízando um anticorpo anti-14-3- 3 eta de acordo com a presente invenção. Eín uina realização, a detecção envolve q uso de ELISA empregando um anticorpo 20 anti-14-3-3 eta de acórdo com a presente invenção. Em uma realização, a detecção envolve Western Blot de uma amostra que compreende fluido sinovial, pIasina ou soro de Lllll paciente utílizando um antícorpo antí-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a detecção 25 envolve o uso de radioímunoteste. Em uma realização, a detecção envolve o uso de um teste de fita. Ein uma realização, a detecçào envolve o uso de um teste de ponto * de cuidado. Em uma realízação, a detecção de 14-3-3 eta é coinbinada com a detecção de um outro marcador de artríte 30 (tal coiro MMP, anti-CCP, anti-RF e/ou CRP). Em uma realização, a presente ínvenção fornece métodos de diagnóstico das condições neuroíógicas. Em uma realização preferida, são fornecidos métodos de diagnóstíco
I G' ! 6 de doenças selecíonadas a partir do grupo que consiste de € 6 rneningite bacteriana e mal de Creutzfeldt jakob. Em uma realização, é detectada a presença de 14-3-3 eta em fluido cerebroespinhal.
5 Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de determinação do potencial de reação de um paciente ao tratamento dírígído a condíções ínflamatórías. Em uma realização pre'ferida, são fornecídos métodos de determinação do potencial de reação de um paciente a 10 tratamento dirigiao à artrite. São incluídos inétodos de determinação do potencial de reação ao tratamçnto de doenças selecionadas a partír do grupo que consiste de espondilite anquilosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Ehlers- b - ,-, 1Sy Danlos -"(ERS)-v".'"Síndrome, de - Fe1ty,.,"..fíbromía1gía, ' .gota; -" artrite infeccíosa, artri-te juvenil, Iúpus, doença de tecido conectivo misturado (MCTD), osteoartrite, Mal de Paget, polimialgia retmática, polimiosite e dermatomiosite, pseudogota, artríte psoriática, Fenômeno de Raynaud, 20 artrite reatíva, artrite reumatoide, escleroderma, Síndrome de Sjògren, Mal de Still e granulomatose de Wegener. Em urna realização, os métodos envolvem a determinação do nível de 14-3-3 eta em amostras de pacíentes utílízando um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente 25 invenção. Em uma realização preferída, o nível de 14-3-3 eta na amostra de pacientes é comparado com o de araostras de pacientes cuja capacidade de reagír ao tratamento é conhecida. Um nível relativamente alto de 14—3—3 eta em uma primeíra amostra de paciente ern comparação com uma amostra 30 de um paciente não inflamatório e/ou uma amostra de um òutro paciente ínflamatório pode indícar que o primeíro paciente é um candídato preferído para tratamento com anticorpo anti-14-3-3 eta ou uma terapia de DMARD
O
Í ·d 6 alternativa, tal como antí-TNF. Por outro Iado, um nível * " relativamente baixo de 14—3-3 eta em uma primeira amostra de paciente eni comparação com uma amostra de um outro paciente não inflamatório pode indicar que o primeiro 5 paciente não é um candidato p'referido para tratamento com anticorpo antí-14-3-3 eta ou uma terapía de DMARD alternativa, , tal como anti-TNF, espcialmente se o nível estiver mais próximo de uma amostra de um paciente não inflamatório.
10 Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de diferenciamento entre subtipos de distúrbios inflamatórios.
Em uma realização preferida, são fornecidos métodos de diferenciação entre subtipos de artrite. Em uma reaíização, os métodos envolvem a determinação do nível de 14-3-3 eta h , 15 eni amostras de pacientes utilizando um an-ticorpo" anti-14-3-'" 3 eta de acordo com a presente invenção. Em uirta realização preferida, o nível de 14-3-3 eta em pacientes é comparado com o de amostras de pacientes cujo subtipo de dístúrbío inflarnatório ou prognóstíco é conhecido.
20 Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos profiláticos de prevenção do desenvolvímento de condições que envolvem 14-3-3 eta. Em uma realização, a presente invenção fornece métodos profiláticos de prevenção do desenvolvimento de condições 25 ínflamatórias em pacíentes com risco de desenvolvímento de condições inflamatórías. Eiíi uma realízação preferída, são fornecidos métodos profiláticos de prevenção de artrite em pacientes com risco de desenvolviinento de artrite. São incluídos métodos profílátícos de prevenção de doenças . 30 selecionadas a partir do grupo que consíste de espondiííte anquilosante, Mal de Behcet, hiperostose esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Ehlers-Danlos (EDS), Síndrome de Felty, fíbrornialgia, gota, artríte ínfeccíosa,
i' ?2 0 artríte juveníl, lúpus, doença de tecído conectívo e
8 rnisturado (MICTD), osteoartrite, Mal de Paget, poIímialgí.a reumática, polimiosite e dermatomiosite, pseudogota, artrite psoriática, Fenômeno de Raynaud, artrite reativa, 5 artrite reumatoide, escleroderma, Síndrome de sjõgren, Mal de Still e granuíomatose de Wegener.
Os métodos compreendem a administração ao paciente de um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção.
Eiii uma realização, o anticorpo anti-14-3-3 eta é administrado como um componente lo de uma terapia de coníbinação aquí descrita.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de monitoramento do tratamento de condições inflamatórias.
Em uma realízação preferída, são fornecídos métodos de monitoramento do tratamento de artrite.
São incíuídos 15 , métodos de-- monitoramento .do" tratamento ." de'" "doenças' selecionadas a partir do grupo que consiste de espondilite anquílosante, Mal de Behcet, hípe'rostose esquelética idiopática difusa (DISH), Síndrome de Eh1ers-Dan1os (EDS), Síndrome de Felty, fibroínialgia, gota, artrite ínfecciosa, 20 artrite juvenil, lúpus, doença de tecido conectivo místurado (MCTD), osteoartrite, Mal de Paget, poIimíalgía reumática, polimiosite e dermatomíosíte, pseudogota, artrite psoriá'tica, Fenômeno de Raynaud, artrite reativa, artrite reumatoide, escleroderma, Síndrome de Sjõgren, Mal 25 de Stílí e granulomatose de Wegener.
Em uma realização, os rnétodos envolvem a determínação do nível de 14-3-3 eta em amostras de pacientes utilizando um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo corrt a presente invenção e monítorando o nível de 14—3—3 eta em pacíentes
30 que passam por tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece kits de detecção da presença de 14-3-3 eta e opcionalmente outros marcadores, tais como MMPS, em uma amostra de paciente, em
&0 q 56/87 &.
i e· G; d que o kít é útil para o fornecímento de um resultado de
F ' diagnóstico ou prognóstico apropriado para o diagnóstico ou diferenciação de vários tipos de doenças que envolvern 14-3- 3 eta. Uiii kit compreende um anticorpo anti-14-3-3 eta de 5 acordo com a presente invenção. Esse kit pode íncluir adicionalmente reagentes de detecção específícos para MMPs específicas que são marcadores de artrite. O kit pode incluir ainda outros reagentes necessários para a detecção imunológica de 14-3-3 eta, taís como anticorpos secundáríos 10 rnarcados, reagentes cromogênicos ou fluorogênícos, agentes de polimerização e/ou instruções de uso do kit para fins de diagnóstico ou prognóstico. Com relação a métodos de diagnóstico, víde também WO 2007/128132, depositada em nove de maio de 2007. . -15 , T---7',Existe-yma-série de"'"formatos de"teste "conhecidos". dos"""" técnicos comuns no assunto para uso de um anticorpo para detectar marcadores de proteínas em uma amostra. Víde, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Labo-rato-ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Geralmente, a presença 20 ou ausência de artrite ou outras condições que envolvem 14- 3-3 eta ou o prognóstíco de pacientes, pode ser determinada por meío de (a) contato de uma amostra biológíca obtída de um paciente com um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção; (b) detecção na amostra de um nível de 25 14-3-3 eta que se Iiga ao antícorpo; e (C) comparação do nível de polipeptídeo com um valor de corte previamente determihado (ou seja, controle). . Em uma realização preferida, o teste envolve o uso de um anticorpo anti—14-3-3 eta de acordo com a presente 30 invenção imobilizado sobre um suporte sóIído para lígar-se à proteína 14-3-3 eta do restànte da amostra e removê-la. A proteína 14-3-3 eta ligada pode ser detectada ern seguida utilizando um reagente de detecção que contém um grupo
( 0- b relator e Iiga—se especificamente ao complexo de antícorpo
W e proteína. Esses reagentes de detecção podem coinpreender, por exemplo, um agente de ligação que se liga especificamente à proteína 14-3-3. Alternativamente, pode- 5 se utilizar um teste competitivo, no quaí uma proteína 14- 3-3 eta é marcada com um grupo relator e mantida para ligar-se ao anticorpo imobilizado após a incubação do anticorpo com a amostra. A extensão a que os componentes da amostra inibem a Iigação da proteína 14-3-3 eta marcada ao 10 anticorpo índica a reatívídade da amostra com o antícorpo imobilizado. Proteínas apropriadas para uso nesses testes incluem proteínas 14-3-3 eta de comprirnento total e suas partes de polipeptídeos às quais o anticorpo se Iiga.
O suporte sólído pode ser qualquer materíal conhecido 15 '"dos--técnicos"comuns no assunto: O".suporte sólido pode "ser," " "" por exemplo, uma cavidade de teste eni uma placa de microtítulos ou uma membrana de nitrocelulose ou outra apropriada. Alternativamente, o suporte pode ser uma esfera ou disco, tal como vidro, fibra de vidro, látex ou um 20 material plástico, tal como poliestíreno ou cloreto de polivinila. O suporte pode também ser uma partícula magnética ou um sensor de fíbra ótica, tal como os descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n°
5.359.681. O anticorpo pode ser imobilizado sobre o suporte 25 sólido utílizando uma séríe de métodos conhecidos dos técnicos no assunto, que são amplamente descritos na literatura científica e de patentes. No contexto da presente invenção, o termo "imobilização" designa associação não covalente, tal como adsorção, e ligação 30 covalente (que pode ser uma Iígação díreta entre o anticorpo e grupos funcionais sobre o suporte, ou pode ser uma ligação por meio de um agente reticulante). Prefere-se iinobilização por meio de adsorção a uma cavídade em uma b' 58/87 % t 0L
P placa de microtítulos ou a uma menibrana. Nestes casos, a ? adsorção pode ser atíngida por meio de contato do anticorpo, eín um tampão apropriado, com o" suporte sólido por um período de tempo apropriado. O tempo de contato 5 varia com a temperatura, mas é tipícamente de cerca de uma hora a cerca de um dia. Em uma realização, uma pIaca de microtítulos revestida corrt estreptavídína é utilizada em conjunto coir um anticorpo biotinilado. A Iigação covalente de antícorpo a um suporte sólido 1-0 pode geralmente ser atingída por meio de reação, em primeiro lugar, do suporte com um reagente bifuncional que reagirá com o suporte e o anticorpo. Em certas realizações, o teste é um teste sanduíche com dois anticorpos. Este teste pode ser realízado por mei-o, , ' ·.;-1"5'—'de·--contato,"em'""' primeiro- 'Iugar, rdé um anticorpo'que"' foi - imobilizado sobre um suporte sólido, comumente a cavidade de uma placa de microtítuíos, com a amostra, de forma a permítir a Iigação das proteínas 14-3-3 eta na amostra para ligar o anticorpo imobilizado. Ainostra não ligada é 20 removida em seguida dos complexos de anticorpo e proteína imobilizados e é adicionado um reagente de detecção (preferencialmente um segundo antíco'rpo capaz de Iígar—se a um local diferente no polipeptídeo) que contém um grupo relator. A quantidade de reagente de detecção que permanece 25 ligada ao suporte sólido é deterrrtinada em seguida utílizando um método apropríado para o grupo relator específico. Os anticorpos de detecção e iinobilizados são preferencialmente diferentes. Em urrta realização preferída, 30 o anticorpo ímobitízado é um antícorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção e o anticorpo de detecção é um outro anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção ou urrí outro anticorpo anti—14-3-3 capaz de Iigar-
t " i..
se a 14-3-3 eta. Eiii uma realização, o antícorpo de detecção é um anticorpo pan 14-3-3. Em uma outra realização, o anticorpo de detecção é um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente invenção 5 e-o antícorpo imobiíizado é um outro anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo coir a presente invenção ou um outro anti-corpo anti-14-3-3 capaz de ligar-se a 14-3-3 eta. Erri uma realização, o anticorpo imobilizado é um anticorpo pan 14- 3-3.
10 Os métodos compreendem o uso de um anticorpo anti-14- 3-3 eta de acordo com a presente invenção. Como alternativa para o segundo anticorpo, um outro ligante que se Iiga a 14-3-3 eta pode ser utilizado em conjunto com o antícorpo antí-14-3-3 eta de acordo com a presente ínvenção. Um - , .- 15---- exemplop,desse-.ligante." é R18"""(Wang'.et "al;."'j. 1999 '"-"REF.·"" 35). Após a imobilização do anticorpo sobre o suporte conforme descríto acíma, os Iocais de' Iígação de proteínas restantes sobre o suporte são tipicamente bloqueados.
20 Qualquer agente de bloqueio apropriado conhecido dos técnicos comuns no assunto, taí como albumina de soro bovino ou Ieíte desnatado em pó. O anticorpo imobilízado é incubado em seguida com a amostra e permite-se que a proteína 14-3-3 eta ligue-se ao anticorpo. A amostra pode 25 ser diluída com um diluente apropriado, tal como uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da incubação. De forma geral, um tempo de contato apropriado (ou seja, tempo de incubação) é um período de tempo que é suficiente para detectar a presença de proteína 14-3-3 eta 30 em uma arnostra obtida de um índívíduo com artrite ou outra condição que envolva 14-3-3 eta. Preferencialmente, o tempo de contato é suficiente para atingir um nível de ligação que é de pelo menos cerca de 95% da atingida em equilíbrio à t '6 entre proteína 14-3-3 eta Iígada e não Iigada. Os técnicos comuns no assunto reconhecerão que o tempo necessário para atingir o equilíbrio pode ser facitmente determinado testando-se o nível de ligação que ocorre ao longo de um , 5 período de tempo. À temperatura ambíente, geralmente é suficiente um tempo de íncubação de cerca de trinta minutos. " Ainostra não ligada pode ser removida em seguida Iavando-se o suporte sóIido com um tampão apropriado, tal 10 como PBS que contém 0,1% de Tween 20®. O segundo anticorpo, que contém um grupo relator, pode ser adicionado em seguida ao suporte sólido. Os grupos relatores apropriados para os métodos do presente sào bem conhecídos na técnica.
O reagente de detecção é incubado em seguida com o '- ."15 "complexo"-de...'anticorpo e..pMtèíhã imobil"izado"por um"periodo" " de tempo suficiente para detectar a proteína 14-3-3 eta ligada. Um período de tempo apropriado pode geralmente ser determinado testando-se o nível de ligação que ocorre ao longo de um período de tempo. Reagente de detecção não 20 ligado é removido em seguida e o reagente de detecção ligado é detectado utilizando o grupo relator. O método empregado para detecção do grupo relator depende da natureza do grupo relator. Para grupos radioativos, são geralmente apropriados métodos autorradiográficos ou 25 contagem de cíntilação. Podem ser utilízados métodos espectroscópicos para detectar tinturas, grupos luminescentes e grupos fluorescentes. Biotina pode ser detectada utilizando avidina, acoplada a um grupo relator diferente (comumente um grupo radioativo ou fluorescente ou 30 uma enzima). Grupos relatores de enzímas podem geralmente ser detectados por meio da adição de substrato (geralmente por um período de tempo específico), seguída por análise espectroscópica ou outra dos produtos de reação.
í 02
Para determínar a presença ou a ausêncía de artríte, 4 ou outra condição que envoíve 14—3-3 eta, o sínal detectado do grupo relator que permanece ligado ao suporte sólido geralmente é comparado com um sinal que corresponde a um 5 valor de corte previamente determinado (controíe). Em uma realização preferida, o valor de corte é o sinal médío obtido quando o anticorpo imobilizado é íncubado com amostras de pacientes sem artrite ou outra condição que envolva 14-3-3 eta.
Geralmente, uma amostra que gera um
10 sinal que está três desvíos padrão acima do valor de corte previamente determinado é considerada positiva para artrite ou outra condição que envolva 14-3-3 eta.
Em uma reaíização preferida alternativa, o vaíor de corte pode ser determinado utilizando uma Curva do Operador de Receptor;
15 vide, por: exemplo',:- o método .de Sackett"'et' al, ' C1inica'"l '. " Epidemiology: A Basic Science For Clinical Medicine, Little
Brown & Co., 1985, págs. 106-7. Resumídamente, nesta realização, o vaíor de corte pode ser determinado a partir de uma plotagem de pares de taxas positivas verdadeiras (ou
20 seja, sensibilidade) e taxas de falsos positivos (específicidade de 100%) que correspondem a cada valor de
, corte possível para o resultado de teste de díagnóstico.
O valor de corte sobre a plotagem que é c) mais próximo do canto superior esquerdo (ou seja, o valor que inclui a 25 maior área) é o valor de corte mais precíso e uma amostra que gere um sinal que é mais alto que o valor de corte determinado por meio deste método pode ser considerada positiva.
Alternativamente, o valor de corte pode ser comutado para a esquerda ao longo da pIotagem, para
30 minimizar a taxa de falsos positivos, ou para a díreita, para minimizar a taxa de falsos negativos.
Geralrnente, uma amostra que gera um sinal que é mais alto que o valor de corte previamente determínado é consíderada posítíva para
S
%
artrite ou outra condíção que envolva 14—3-'3 eta.. q
Em uma realização, o teste é fornecído como llIIl teste de ponto de cuidado.
Em uma realização relacionada, por exemplo, o teste é realizado em um formato de teste de
5 faixa ou de fluxo, em que o antícorpo é irnobilízado sobre uma membrana, tal como nitrocelulose.
No teste de fluxo, proteínas 14-3-3 na amostra ligam-se ao anticorpo imobilizado à medida que a amostra entra em contato com a t membrana.
Um segundo agente de ligação marcado Iiga-se em
10 seguida ao complexo de agente de ligação e polipeptídeo à medida que uma solução que contém o segundo agente de ligação entra em contato com a membrana.
A detecção de segundo agente de Iigação lígado pode ser realízada em seguida conforme descríto acima.
No formato de teste de
- ·15 ,fita,--·-uma extremidade 'da íneinbrana "à. quaí o"anticorpo é-" ' ligado é imersa em uma solução que contém a amostra.
A amostra mígra ao Iongo da membrana através de uma regíão que contém segundo agente de Iigação de 14-3-3 eta e até a área de anticorpo imobilizado.
A concentração de segundo
20 agente de ligação na área de anticorpo imobilizado indica a presença de artríte ou outra condição que envolva 14-3-3 eta, prognóstíco do pacíente etc.
Tipicamente, a concentração de segundo agente de ligação naquele local gera um padrão, tal como uma linha, que pode ser lido 25 visualmente.
A ausência desse padrão indica um resultado negativo.
Geralmente, a quantidade de agente de Iigação imobilizado sobre a membrana é selecíonada para gerar um padrão visualmente discernível quando a amostra biológica contíver um nível de poIipeptídeo que sería sufíciente para
30 gerar uín sinal posítívo no teste de sanduíche com doís anticorpos, no foirinato discutido acima.
Os agentes de ligação preferidos para uso nesses testes são anticorpos e seus fragmentos de Iígação de antígenos.
Esses testes podem
"é 4' { « Ql ser tipícamente realizados com uma quantidade muíto pequena
G de arnostra biológica e no ponto de cuidado. Em uma realização preferida, o anticorpo imobilizado é um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente 5 invenção. O segundo agente de lígação é um outro Iigante 14-3-3 eta que pode ou não ligar-se seletívamente a proteína 14-3-3 eta. Em uma outra realização, o segundo agente de ligação é ·— ~~mNwm ~ <· . . um anticorpo anti-14-3-3 eta de acordo com a presente 10 invenção, de maior preferência seu fragmento de Iigação de antígenos, e o antícorpo mobiíizado é um anticorpo anti-14- 3-3 capaz de ligar-se a proteína 14-3-3 eta. O anticorpo pode ou não ligar-se seíetivamente a proteína 14-3-3 eta.
Naturalmente, existem diversos outros protocolos de ,. : 15- -te.ste,que são apropriados para uso"com, os anticorpos anti-""" 14-3-3 de acordo com a presente invenção. As descrições acima destinam-se a ser apenas exempíos.
Para aumentar a sensibílidade, díversos marcadores podem ser testados em uma dada amostra. Particularmente, um 20 ou mais marcadores diferentes de artrite ou de outra condição que errvolva 14-3-3 eta ou indicadores de prognóstico etc. podem ser testados em combínação coir a proteína 14-3-3. Estes outros marcadores podem ser proteínas ou ácidos nucleicos. Em uma realízação preferida, 25 em que a doença é artrite, um ou mais dos outros marcadores são proteínas MMP, ácidos nucleícos ou outros fatores que são comumente utilizados como indicadores de artríte, taís como anti-CCP, anti-RF, CRP etc. Métodos de isolamento e teste de ácidos nucleicos com base em sequências de 30 referência são bem conhecidos na técnica. Testes de combinação podem ser realizados simultânea ou sequencialmente. A seleção de marcadores pode ser baseada em experimentos rotíneiros para determínar g fxQ{ '8 coInbinações que resultem em sensibílidade ideal. Ç?g A presente invenção fornece adicionalmente ki.ts para uso em qualquer um dos métodos de diagnóstico acirna. Esses kits compreendem tipicamente dois ou mais componentes 5 necessários para realizar um teste de diagnóstico. Os , ' componentes podem ser compostos, reagentes, recipientes e/ou equipamento. Um recipiente em um kit pode conter, por exemplo, um anticorpo anti-14-3-3 eta monoclonal de acordo , ,4 L .. com a presente ínvenção. Esses anticorpos b podem ser 10 fornecidos ligados a um material de sustentação, conforme descrito acíma. Um ou mais recipientes adicíonais podem incluir elementos, tais como reagentes ou tampões, a serem utilizados no teste. Esses kits podem também conter um reagente de detecção confornte descrito acima que contém um -.,- 15.- -'gr,upo--relator" apropriado,pra"detecção.direta ou inàireta de . ligação de anticorpos. Um kit pode também incíuír reagentes para a detecção de ínarcadores' ad'icionais de artrite, incluíndo mRNAs específicos que codificam MMPS específicos.
20 Parte Experimental Tabela 1. Epítopos 14-3-3 Eta SEQ ID N° 1 93-107 hélíce LETVCNDVLSLLDKF SEQ ID N° 2 191-199 hélice EQACLLAKQ SEQ ID N° 3 144-155 hélice NSVVEASEAAYK SEQ ID N° 4 144-152 hélíce NSVVEASEA SEQ ID N° 5 147-155 hélice VEASEAAYK SEQ ID N° 6 163-170 hélice EQMQPTHP ' SEQ ID N° 7 168-177 hélice THPIRLGLAL SEQ ID N° 8 82-92 hélíce VKAYTEKIEKE SEQ ID N° 9 i68-79 hélice QKTMADGNEKKL SEQ ID N° 10 138-146 hélice ASGEKKNSV SEQ ID N° 11 69-77 círcuito KTMADGNEK
Ekj
|SEQ id n° 12 | 32-40 jcírcuíto |elneplsne g' n° 1á'""'|'1o3-117 jcircuito TííTKFLIKNcNDFQY SEQ ID N° 14 130-143 circuito YYRYLAEVASGEKK SEQ ID N° 15 184-194 circuito YEIQNAPEQAC SEQ ID N° 16 206-218 circuito AELDTLNEDSYKD SEQ ID N° 17 44-57 Não-hélice LLSVAYKNVVGARR
SEQ ID N° 18 15-23 Não-héííce EQAERYDDM .SEQ ID N° 19 130-138 iNão hélice 'YYRYLAEVA . .- SEQ ID N° 20 118-125 Não-hélice ESKVFYLK SEQ ID N° 21 210-218 Não-hélíce TLNEDSYKD
SEQ ID N° 22 77-84 Não-hélice KKLEKVKA
SEQ ID N° 23 76-86 'Não-hélíce EKKLRKVKAYR SEQ ID N° 24 142-158 Não-hélice KKNSVVEASEAAYKEAF SEQ ID N° 25 105-120 -Não-hélice DKFLIKNCNDFQYESK SEQ ID N° 26 237'-246 " ' Não-hélice ;QQDEEAGEGN
SEQ ID N° 27 75-82 Não-hélíce NEKKLEKVK SEQ ID N° 28 104-116 Não-hélice LDKFLIKNCNDFQ SEQ ID N° 29 141-146 Não-hélice EKKNSV SEQ ID N° 30 104-115 Não-hélice LDKFLIKNS*NDF
SEQ ID N" 31 77-86 Não-hélice SEQ ID N° 32 143-157 Não-hélice knsvveaseaaykea SEQ ID N° 33 1-12 Não-hélice kDREQLLQRARLA * O aminoácido de cisteína ínterno foi substituído pelo aminoácido serina para evítar a formação de Iigações de dissulfeto.
Tabela 2. Sequêncía de proteínas de 14-3-3 eta humano
5 recombínante (SEQ ID N° 63) seq id n° mgdreqllqr arlaeqaery ddmasamkav telneplsne 40 I 63 j'DRNLLsvAYK nvvgarrssw rvissieqkt madgnekkle 80 |kvkayrekie keletvcndv lslldkflik ncndfqyesk 120 !vfylkmkgdy yrylaevasg ekknsvveas eaaykeafei 160 Iskeqmqpthp irlglalnfs vfyyeiqnap eqacllakqa 200 bcè
I FDDAIAELDT LNEDSYKDST LIMQLLRDNL TLWTSDQQDE 240 A,
|EAGEGN Em sequências que compreendem um resíduo de císteína, em uma realização, o resíduo de cisteína é síibstítuído por um resíduo de serína para evitar a formação de Iígações'de dissulfeto.
A cisteína pode ser um resíduo de cisteína
5 interno ou unt resíduo de císteína terminal.
Epítopos de peptídeos podem ser modificados com vários ··—~ " ", propÓsitos, que incluem a conjugação a iuna porção adicional, tal como a conjugação a uma porção para produzir um imunogene que compreende o epítopo.
Como se apreciará, a
10 cisteína pode ser coIocada adequadamente para conjugação ao veículo e fornecer exposição da área que se deseja expor para fins de fabricação de anticorpos.
No caso de KKLE, a
,. "" cisteína fói- adicíonada"" à"èZt1remi"dade" C-termiríai, a fim de " expor o outro Iado.
O veículo utilízado pode ser muito 15 grande e pode mascarar os prímeiros amínoácidos.
Exemplo 1. Sequêncía de Imunogenes 14-3-3 eta e Antícorpos
Antí—14—3—3 eta
Para preparar antícorpos antí-14-3-3 eta monoespecífícos, díversos peptídeos, com oíto a quinze
20 aminoácidos de comprimento, foram selecionados com base em nossos próprios crítérios.
Esses peptídeos, bem como 14-3-3 eta nativo reconibinante com comprímento total (não marcado), foram utílízados como ímunogenes na produção de anticorpos monoclonais.
Um alinhamento de sequências de
25 proteínas para as sete isoformas de 14-3-3 é exibido na Figura 4. Imunogene n° 1: C-LDKFLIKNSNDF (sequência de aininoácidos 104 - 115; "AUGI-CLDK"). Um peptídeo correspondente a um segmento de resíduos de 14-3-3 eta
30 humanos 104-115 foí modificado por meio da adição de uma porção de císteína N-terminal para conjugação ao veículo e
"P.
substituição de porção cisteína 112 ínterna para evitar a :.€ formação de ligações de dissuífeto ínternas. Imunogene n° 2: KKLEKVKAYR-C (sequência de aminoácidos 77 - 86; "AUG2-KKLE"). Um peptídeo correspondente a um 5 segmento de resíduos de 14-3—3 eta humanos 77-86 foí modificado por meio da adíção de urna porção de cisteína N- terminal para conjugação ao veículo.
Imunogene n° 3: C-KNSVVEASEAAYKEA (sequência de .,, _ W¶,· ·· wC " .·,- · · aminoácidos 143 - 157; "AUG3-CKNS'"). Um peptídeo 10 correspondente a um segmento de resíduos de 14-3-3 eta humanos 143-157 foi modificado por meio da adição de uma porção de cisteína N-terrninal para conjugação ao veículo.
Imunogene n° 4: 14-3-3 eta recombinante humano com comprimento total (SEQ ID N° 63), número de acesso de 4 .
, 7· 15 proteína NP_003396-..· -'- -- " ." "" , ': :.' " ". lmunização Grupos de quatro fêmeas de camundongos BALB/C foram imunizados ínicialmente por meio de injeções intraperitoneais utilizando 50 µg de antígeno. (Imunogene n° 20 1, n° 2, n° 3 ou n° 4) por camundongo em Adjuvante Corrtpleto de Freund. Quatro amplificações subsequentes foram administradas conforme acíma, espaçadas em íntervalos de três semanas, com um antígeno em Adjuvante de Freund Incompleto. Quando o título do soro houver aumentado mais 25 de dez vezes com relação ao da amostra de soro pré-imune, conforme determinado por ELISA, os dois reagentes mais altos em cada grupo foram amplificados por via intravenosa com 10 µg de antígeno em 100 µ1 de PBS estéril, pH 7,4, cada um. As títulações de amostras de soro dos camundongos 30 imunizados tomadas após a segunda amptíficação são exibidas na Figura 1 (Imunogene n° 1, CLDK), Figura 2 (Imunogene n° 2, KKLE), Figura 3 (Imunogene n° 3, CKNS) e Figura 8 (Imunogene n° 4).
É<.
Método de Í'usão .r0 Três dias após a amplificação final, os camundongos doadores foram sacrificados e as células do baço foram colhidas e reunidas. A fusão dos esplenócitos com células 5 de mielonta parental SP2/0 BALB/C foi realizada conforrne descrito anteriormente (Kohler et aí, abaíxo), exceto pela realização de seleção e cIonagem em uma etapa dos hibridomas. Os clones foram tomados em onze dias após a ·~FW." · · +ü-·"" " · ,.
fusão e novamente suspensos em cavidades de pIacas de 10 cultivo de tecidos com 96 cavidades em: 200 µ1 de meio D- MEM que contém 1% hipoxantina/timidina, 20% de soro de feto bovino, 2 mM de GlutaMax I, 1 iíiM de piruvato de sódio, 50 µg/ml de gentamicina, 1% OPI e 0,6 ng/ml de IL-6. Após quatro dias, os sobrenadantes foram seíecionados por meio .·. . .. . 15 6 ·de·.EL'ISA para- determinar -a"atívídade""de'-anti"corpos- sobre"" ' " placas revestidas com 1 µg/cavidade de antígeno purificado. Procedimento de reativação de cIones de hibridoma em crescimento lento As linhagens de células de hibridoma em lento 20 crescimento ou aparentemente não saudáveis poderão normalmente ser resgatadas por íneio da adição de um meio de crescimento ríco contendo: meio D-MEM com 1% hipoxantina/timidina, 20% de soro de feto bovino, 2 rriM de GlutaMax I, 1 mM de piruvato de sódio, 50 µg/ml de 25 gentamicina, n OPI, 20% de sobrenadante de cultivo de tecidos EL-4 condicionados e 0,6 ng/ml de IL-6. EL-4 é uma linhageni de células de timoma murino que, quando estimulada 4 com 12-miristato 12-acetato forbal (PMA, da Sigma, cat. N° P-8139), faz com que as cé1u1as secretem interleucina 2 30 (IL-2), um fator de diferenciação de células B (EL-BCDF- nak), dois fatores dê crescimento de células B (BSF-pI e EL-BCGF-swa) e outras linfoquínas adicionaís, que aumentam ínuito o crescintento e a díferenciação de Iínfócítos. Vide . .-m.
2'% G. Kohler e C. Milstein, P:repara ti on of monoclonal « antibodies, Nature 25 (1975) 256-259; Ma, M. , S. Wu, M.
Howard e A. Borkovec, 1984. Enhanced production of mouse h ybri doma s to picomoles o:f antigen using EL-4 condi ti oned 5 media wi th an in vítro ímmunization p-rotocol, In Vitiro 20:
739. Após trinta dias de testes de estabilidade, foi obtido um total de cem clones viáveis que secretaram IgG capaz de k , ·- . -mé' reconhecer 14-3—3 eta recombinante. Para os propósitos de 10 identificação de clones líderes a serem buscados, os cem clones viáveis foram selecionados utilizando uma série de métodos, que incluem: imunÓrnanchas (dot blot), um teste de captura e um ELISA de captura específico (sanduíche). Todos os cem clones também foram testados para determínar a --15. reatiYicíade' cruzadg utilizando--- O-'-'ELISA- --de"'""captura ,.. específico (sanduíche) com as outras seis isoformas de 14- 3-3. Exemplo 2. Teste da Reatividade Cruzada de Sobrenadantes de Cultivo de Tecido (TC) de Clones de Hibridoma Utilizando 20 Isoformas 14-3-3 Biotiniladas como Isca em um ELISA de Captura Utilizamos unt ELISA de captura específíco empregando as sete isoformas de 14-3-3 como "'isca" para determinar se algum dos clones de hibridoma que produzimos gerou reação 25 cruzada ou reconhece qualquer das seis isoformas diferentes de 14-3-3 Eta (rj)- Como é evidenciado pelos dados representativos. apresentados na Tabela 4, quatro dos clones de hibridoma selecionados (AUG3-CKNS-2D5, AUG3-CKNS-7F8, AUG3-CKNS-7H8, AUG4-ETA-8F1O) ligam-se a 14-3-3 Eta e o 30 reconhecem em duas diluíções em série, mas não se ligam nem apresentam reação cruzada coín nenhuma das outras isoformas .14-3-3, mesmo na diluição mais baixa testada. Estes dados demonstram cIaramente que esses cIones são altamente
Pè
F específicos para 14-3-3 Eta (rj). Por outro Iado, um cIone, 2 AUG3-CKNS-4F1O, Iiga-se ou apresenta reação cruzada com três outras isoformas de 14-3-3, principalmente 14-3-3 gama, beta e zeta, respectivamente. Tomados em conjunto, 5 estes dados indicam que o nosso ELISA de captura representa um método eficaz de seleção e ídentífícação de cIones de hibridoma que são altamente específicos para a isoforma 14- 3-3 Eta (rj)- ·"? % .* «. n"" ' ~ . " "' O experimento de ELISA de captura específico da Tabela 10 4 foi conduzido conforme segue. PIacas de ELISA foram revestidas com sobrenadante TC sobrecultivado puro a 100 µ1 por cavidade e incubadas por uma noite a 4 °C. 14-3-3 marcado com biotina (correspondente a todas as sete isoformas) foi titulado de 1/5O0k para 1/16000 no topo e - 15 incubado, por- urna hora·":à-temperatura---ambiente"; As placas . - foram bloqueadas em seguida com leite em pó desnatado a 3% em PBS (pH 7,4) a 100 µ1 por cavídade e íncubadas por uma hora à temperatura ambiente. 1/8000 Estreptavidína-HRPO foi diluída em PBS-Tween, adicionada a 100 µ1 por cavidade e 20 incubada por uma hora a 37 °C com agitação. Tarnpão TMB foi adicionado a 50 µ1 por cavidade e incubado no escuro à temperatura ambiente. As reações foram suspensas com 50 µ1 de 1 M HCl por cavidade após dez minutos e lidas a OD 450 nm.
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P W\ e Exemplo 3. Reatividade cruzada de antícorpo po1íc1ona1 .j anti-14-3-3 eta dísponível comercíalmente O anticorpo policlonal de coelho anti-14-3-3 disponível comercialmente levantado contra um epítopo de 5 peptídeo com doze amínoácídos (AC-DREQLLQRARLA-NH2) do
J terminal N de 14-3-3 eta (Biomol International LP, Cat. SA476-0100) foi utilizado para avaliar a especificidade do anticorpo. Resumidamente, 1 µg de 14-3-3 eta, r gama, sigma, . ~ * alfa/beta, epsilon, -teta ou zeta reconibinante humano foi 10 resolvido por meio de SDS-PAGE e sondado com q antícorpo anti-14-3-3 eta. Em notável contraste com os resultados obtidos com os anticorpos de acordo com a preSente ínvenção, os resultados da Figura 4 demonstram que este anticorpo contra 14-3-3 eta · 15 :-'disponível comercíalmente apresentou'- reação..cruzada.:'com- outras isoforntas de 14-3-3, principalmente gama. Banda 1: pesos moleculares padrào; banda 2: 14-3-3 eta recombinante; banda 3: 14-3-3 gama recombinante; banda 4: 14-3-3 si-gma recoínbinante; banda 5: 14-3-3 alfa/beta recombinante; banda 20 6: 14-3-3 epsilon recombinante; banda 7: 14-3-3 teta recombinarite; banda 8: 14-3-3 zeta recombínante Exemplo 4. Imunoprecípítaçào de 14-3-3 eta recombi-nante humano e 14-3-3 eta endógeno de células Helja Anticorpos anti-14-3-3 monoclonais do Exemplo 1 foram 25 testados para determinar a sua capacidade de imunoprecipitação ou "captura"' de 14-3-3 eta cel-ul-ar endógeno e recombínante. Para os métodos terapêuticos de + acordo com a presente invenção descritos no presente, é preferível utilizar anticorpos que possuam a capacidade de 30 imunoprecipitar ou reconhecer 14-3-3 eta na sua configuração 3-D natíva. Sobrenadantes de cultivo de clones de hibridoma anti-14-3-3 eta foram incubados a 4 °C por duas horas com cada tampão contendo lOO ng de 14-3-3 eta e b) b k [ 74/87 è l t } Y à
I recombinante humano ou tampão que contém sobrenadante (200 t E . µg de proteína) de células HeLa lisadas. Imunoprecipitados r k foram recolhidos com proteína A/G agarose utilizando l 'r metodologia padrão. Os imunoprecipitados foram analisados / i 5 por meio de SDS-PAGE e Western- Blot. A- Figura 6 exibe um f l í Western Blot obtido utilizando o clone de hibridorna 7Bll, l l que foi elaborado utilizando Imunogene n° 4 (14-3-3 eta l recombinante com comprimento totaí). Banda 1: esferas de proteína A/G agarose isoladamente; banda 2: esferas de 10 proteína A/G agarose foram misturadas com Iisato celular; !" banda 3: esferas de proteína A/G agarose foram místuradas l ! com 14-3-3 eta humano recombinante; banda 4: esferas de ' proteína A/G agarose foram misturadas com 'sobrenadante de
E hibridoma; banda 5: esferas de proteína A/G agarose foram t ·r --j 15 - misturadas com sobrenadante de -hibridoma.·e- lísato -celular; \ t banda 6: esferas de proteína A/G agarose foram místuradas F com sobrenadante de híbridoma e 14-3-3 eta recombinante. Os k q
T dados demonstram que o clone 7B1l imunoprecipitou 14-3-3 d Í eta derivado de células HeLa (banda 5) e 14-3-3 eta t l 20 recoinbinante humano (banda 6). ) l A Figura 7 exibe uin Western Bíot obtído utilizando o i clone de hibridoma 2D5 elaborado contra o Imunogene n° 3 I (CKNS). Banda 1: esferas de proteína A/G agarose isoladamente; banda 2: esferas de proteína A/G agarose
K l 25 foram misturadas com Iisato celular; banda 3: esferas de d proteína A/G agarose foram místuradas coir 14-3-3 eta humano recombinante; banda 4: esferas de proteína A/G agarose foram misturadas com sobrenadante de híbrídoma; banda 5: esferas de proteína A/G agarose foram misturadas com 30 sobrenadante de hibridoma e Iisato celular; banda 6: esferas de proteína A/G agarose foram místuradas com sobrenadante de hibridoma e 14-3-3 eta recombinante. Os dados dernonstram que o clone 2D5 ímunoprecípítou 14-3-3 eta
__1 75/87 .
- ' derivado de lisato de células HeLa (banda 5) e 14-3-3 eta recombinante humano (banda 6). Análises similares foram realizadas para vários outros clones de hibridoma (dados não exibidos). Estes 5 experimentos demonstram que os anticorpos monoclonais produzidos no Exemplo 1 são capazes de ligar, imunoprecipitar ou "'capturar" 14-3-3 eta na sua configuração nativa, conforme evidenciado pela imunoprecipitação da proteína a partir de lisatos de 10 células heLa. Exeniplo 5. Expressão de 14-3-3 em Fluido Sinovial e Soro de Pacientes Afetados com RA Os níveis das diferentes isoformas de proteínas 14-3-3 _B¶ Yt EJ rj, T, (J e G- em amostras de fluido sinovial (SF) 15 e soro (PS) de pacientes foram analisados por meio de análise Western utilizando lisato de células de queratinócitos (K) como controle positivo. Apenas as isoformas rj e y foram detectadas ein amostras de SF e manchadas com maior intensidade em comparação com PS. 20 Amostras de fluido sinovial das juntas articulares de dezessete pacientes com RA que apresentaram sinovíte ativa, mas ainda não haviam recebido terapias anti-TNF, tanibém exibiram expressão consistente da isoforma rj de 14-3-3 (dados não exibidos). Todos os pacientes apresentaram uma 25 avaliação da atividade de doença (DAS) de mais de 6,0. Exemplo 6. Expressão de P4MP eni Soro de Fluido Sinovial de Pacientes Para determinar se essas variações forain correlacionadas às de MMP-I e MMP-3 nas mesmas amostras 30 sinoviais, um total de doze amostras de fluido sinovial RA e suas amostras de soro correspondentes foram avaliadas simultaneamente para determinar 14-3-3 rj e y bem como proteínas MMP-I e MMP-3. 14-3-3 rj foi detectado em todas as eè 0 amostras. MMP-I foi detectado em todas as amostras, tanto \ SF quanto PS, enquanto MMP-3 era ntais variável nos níveis detectados. A isoforma 14-3-3 y também foi detectada em arrtostras de soro e fluído sinovíal de pacientes (dados não 5 exibidos). A expressão de MMP-I e MMP-3 demonstra correlação significativa com a expressão das isoformas 14-3—3 A e y em fluido sinovial e soro (Tabela 5)- · T .· Tabela 5. Correlação entre MMP e os Níveis de Proteína 14- f 10 3-3 em Soro e Fluido Sinovial 14-3-3 A 14-3-3 rj 14-3-3 y 14-3-3 y l soro I sinóvio I soro I sínóvio i MMP-I l r = 0,62; j r = 0,83; I r = 0,77; I r = 0,65; I'p = 0,02 ' jp =S 0,03 IP =. 0,02 ,p = 0,03 MMP-3" -" |r = 0,'68;""'"|r = 0,77; ' |r = 0,80; "|r'= 0,76;' " Ip = 0,01 Ip = 0,003 |:p = 0,03 Ip = 0,04 Exemplo 7. Sensibilidade de Detecção Western Blot de Proteína 14-3-3 em Amostras de Soro e Fluido Sínovial de Pacientes Para determínar o nível de detecção de 14-3-3 i) em 15 amostras de soro e fluido sinovial, amostras de doze ,
P pacientes normais ou afetados por ra foram reunídas e as , , diluições limitadoras das amostras reduzidas foram analisadas por meio de Western Blot. 14-3-3 i) foí l detectável ao Iongo de uma série de diluíções, desde 0,1 µ1 , 20 de volume efetivo de fluido sinovial até 1,0 µ1 de volume k efetivo de soro (dados não exibidos). 2 µ1 de soro normal reunido (NS) ou soro de pacíente (PS) foram conduzídos ao Iongo de concentrações conhecidas de 14-3-3 rj recombinante, que varia de 0,05 a 2,0 µg. O 25 volume de 2 µ1 de amostras de NS e PS foi estimado como possuindo 1 a 1,5 e 15 a 20 µg de 14-3-3 rj, respectívamente (dados não exibidos). Isso sugere que o nível de 14-3-3 rj
" ocorre em um excesso de cerca de dez vezes no soro de pacientes afetados por RA, em comparação com pacientes normais.
Para rríais detalhes e resultados, vide Kilani et al, j.
5 Rheumatology, 34: 1650-1657, 2007. Exemplo 8. Anticorpo anti-14-4-3 reduz a expressão de MMP ern modelo de ra de camundongos Artrite induzida por colágeno é induzida era camundongos DBA machos por meio da injeção de 100 µg de colágeno tipo II purificado emulsificado em adjuvante completo de Freund na base da cauda, conforme descrito em Williants et al, PNAS, 89: 9784-9788, 1992. Qs camundongos são inspecionados diariamente a seguir e os camundongos que exibem eritema e/ou inchaço ent 1jir ou mais meMbros são atribuídos aleatoriamente a uni regime de tratamento com um anticQrpo anti-14-3-3 eta descrito no presente ou a um tratamento com placebo. Alternativamente, um regime de tratamento começa no dia antes da imunização com colágeno tipo II. São implementados diversos regimes de tratamento, utilizando grupos de dez camundongos, conforníe segue: (1) anticorpos anti-14-3-3 eta selecionados obtidos e purificados a partir dos sobrenadantes de hibridoma do Exemplo 1 são administrados em várias dosagens que variam de 0,10 a 20 mg/kg (a) por via intraperitoneal ou (b) no sinóvio, duas vezes por seínana.
(2) Tratamento coin placebo A artrite é monitorada ao longo de um período de tratamento de vinte dias e são avaliados os índices de doenças a seguir.
Avaliação clínica. Membros de camundongos são avaliados para determinação de inchaço, eritema, rigidez das juntas e inchaço das patas. Os indícios clínicos de artrite são reduzidos em animais nos quais o regime de
B:' h ap tratamento foí efícaz, em comparação com controíes placebo. Expressão de 14-3-3 eta, MMP-I e/ou MMP-3 no sínóvio.
Amostras sinoviais são tomadas em diversos momentos e são determinados os níveis de 14-3-3 eta, MMP-I e/ou MMP-3. Os 5 níveis de MMP-I e MMP-3 são reduzidos em animais nos quais o regíme de tratamento foi eficaz, em comparação com controles placebo. Determinação histopatológica. As patas artríticas são fixas, embutídas em parafína, seccionadas e manchadas com 10 hematoxílína e eosina para avaliação mícroscópíca. A severidade da artrite em cada junta é graduada de acordo com os critérios a seguir: suave = sinovite mínima, perda . de cartilagem e erosões ósseas Iimitadas a focos discretos; rrtoderada = sinov'ite e erosões presentes, mas arquitetura -- ., 15 -das ,juntas -normais--i.ntac.ta;, sev,era---= sinovite, .-eros.ões .·- Y, extensas e arquitetura das juntas rompida. A severidade da artrite detectada por meio de histopatoíogia é reduzída em animais nos quais o regime de tratamento foí efícaz, em comparação com controles placebo.
20 Exemplo 9. Anticorpo anti-14-4-3 reduz a expressão de MMP em modelo de RA em coelhos induzida pelo ímplante de células que secretam IL-I Os anticorpos de 14-3-3 eta de acordo com a presente invenção são avaliados em um modelo de coelhos, no qual a 25 artrite é induzida por meio do implante de 5 x 10' células produtoras de IL-I nas juntas dos joelhos de coelhos brancos da Nova Zelândia conforme descrito em Yao et al, Arthritis Research and Therapy 2006, 8: R16, disponível oníine em http://arthritis-research.com/content/8/1/R16.
30 Testes e avaliações são realizados essencíalmente conforme descrito no Exemplo 8. Exemplo 10. Anticorpo anti-14-4-3 reduz a expressão de MMP em modelo de RA - ,T
79/8"7 a4t
X q d , Artríte experimental é induzida em ratos marrons da
F ..
Noruega ou em coelhos brancos da Nova Zelândía por meio da injeção de proteína 14-3-3 eta recombinante no sinóvio de juntas de pernas. Testes e avaliações são realizados 5 essencialmente conforme descríto no Exemplo 8.
Outros modelos de artrite reumatoide (artríte induzída por colágeno, "'CIA"') e projetos experimentais úteis para os métodos de acordo com a presente invenção podem ser encontrados, por exemplo, nas referências a seguír: 10 w1Llíams, Methods MOI. Med. 2004; 98: 207-16- CoIlagen- induced arthritis as a model For rheumatoid arth-ritís; Brand, Com. Med., 55: 114-122, 2005; Vierboom et al, Drug Discovery Today, 12: 327-335, 2007; Sakaguchi et al, Curr.
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.,, 15 --- Antes de começar .um regime, terapêutico -inicial em' uIr!' modelo animal específico, é preferível validar em primeiro Iugar o modelo como um modelo de distúrbio inflamatório que . en.volve 14-3-3 eta. Preferencíalinente, os níveís de 14-3-3 eta e mmp, preferencialmente MMP-I e/ou MMP-3, são 20 determinados exibindo elevação após a indução de artrite experimental no modeío.
Métodos Gerais Weste.rn Blot Amostras (fluido sínovial ou soro (2 µ1 de cada), 14- 25 3-3 eta humano recombínante, Iisatos celulares ou imunoprecipitados de lisatos celulares) foram submeti-das a análise SDS-PAGE com 12 a 15%" (peso/volume) gel de acrilamida e eletrotransferidas sobre membranas de PVDF.
Proteínas"não específícas sobre membranas foram bloqueadas 30 em Ieite desnatado em pó a 5% em PBS-O,1% Tween 20 por uma noite. As ímunomanchas do Exemplo 3 foram realizadas utilizando 2 µg/ml de sete isoformas de anticorpos policlonaís anti-14-3-3 humano de coelhos' específicos
± 80/87 ? í:f (Martin, H., Patel, Y., jones, d., Howelí, S., Robínson, K.
t:'p,' e Aitken, A., 1993, Antibodíes agaínst the major braín isoforms of 14-3-3 protein. An antibody specific Í'or the N- acetylated amino-terminus of a protein. FEBS Letters, 331: 5 296-303). Em alguns experimentos, príncipalmente no Exempío 7, os antícorpos dos c'Iones de híbridoma no Exemplo 1 foram utilizados para os experimentos de imunoprecipitação ou "captura"'. Os ímunoprecipitados foram resolvidos por meio de SDS-PAGE e as membranas foram bloqueadas em Ieíte . 10 desnatado e incuibadas com 14-3—3 eta primári.o (1:1000, B1OMO1 International SE-486) a peroxidase de rabanete silvestre secundário apropriada conjugou anticorpos IgG anticamundongos ou IgG anticoelhos em seguida (díluição de 1:2500). Proteínas imunorrreatívas foram vísuali-zadas . N' ,, 15- uti,lizando' o sistema -de- detecção..·ECL mais---western. Bl'ot: , -- Lisato de células de queratinócitos (K), proteína recombinante e/ou lisato de células HeLa foi utilizado coiiio controle positívo. SF: fluido sinovial; PS: soro de paciente.
20 Amostras de pacientes Fluido sinovial foi obt'ido das juntas de joelhos de pacientes com sinovíte ativa antes da ínstítuíção de produtos terapêuticos anti-TNF. Todos os pacíentes apresentaram avaliação das > 6,0. Amostras de sangue 25 coincidentes foram obtidas por meío de procedimentos de venipunção padrão. O coágulo foí removido por meio de centrifugação. 14-3-3 eta recombinante CDNA para 14-3-3 eta derívado de queratinócítos foi 30 preparado a partir de RNA total extraído de queratinócítos humanos, clonado e expresso em E- coli e purificado por afinidade, seguindo os métodos descrítos em Ghahary et al, 2004, j. Ihvest. Dermatol. 122: 1188-1197 (REF 36, abaíxo).
Q't r "N ° !€! Os primers utilizados para amplificação por PCR do CDNA de 14-3-3 eta foram (GCGAATTCCTGCAGCGGGCGCGGCTGGCCGA) e (GCTCGAGCCTGAAGGATCTTCAGTTGCCTTC). Proteínas 14-3-3 irecombinantes não marcadas 5 CDNA foi derivado de uma fonte humana, clonado e expresso em E. coli e purificado por afinidade. Os primers utilizados para amplificação por PCR do CDNA de 14-3-3 eta foram: (agaattcagttgccttctcctgctt) e (acatatgggggaccggga); para 14-3-3 gama (agaattcttaattgttgccttcgccg) e 10 (acatatggtggaccgcgagc); para 14-3-3 beta (acatatgacaatggataaaagtgagctg) e (agaattcttagttctctccctccccagc); para 14-3-3 epsilon (acatatggatgatcgagaggatctg) e (agaattctcactgattttcgtcttccac); para 14-3-3 ...sigína - 15 . (acatatggagagagccagtctgatcc)- e (agaattcagctctggggctcctg)";"- " para 14-3-3 teta (acatatggagaagactgagctgatcc) e (agaattcttagttttcagccccttctgc); para 14-3-3 zeta (acatatggataaaaatgagctggttc) e (agaattcttaattttcccctccttctcct).
20 Condições de teste ELISA Para seleção e teste: para seleção e teste, 1,0 µg/cavidade de antígeno anti-AUGI-CLDK, anti-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS ou anti-14-3-3 eta foi revestido sobre placas ELISA em dH2O a 50 µ1/cavídade e seco por uma noíte a 25 37 °C. Testes sobre 0,25 µg de antígeno 14-3-3 eta por cavidade foram revestidos em tampão de revestimento de carbonato e incubados a 4 °C por uma noite.
Para testes por ensaio de captura de anticorpos: 1/10000 anticorpo de captura de IgG/lgM anticamundongos de 30 cabra (Pierce cat. n° 31182) foi revestido sobre placa ELISA em tampão de revestimento de carbonato (pH 9,6) a 100 µl/cavidade íncubados por uma noite a 4 °C.
Para teste. sobre antígeno controle negativo: 0,5
82/8"7
N µg/cavidade de antígeno HT (transferrina humana) foram ·) revestidos sobre placa ELISA em dH2O a 50 µ1/cavidade e secos por uma noite a 37 °C.
Para testes por ELISA de captura: PIacas de ELISA 5 foram revestidas com sobrenadante TC sobrecultivado puro a 100 µ1 por cavidade e incubadas por uma noite a 4 °C. 14-3- 3 eta marcado com biotína (ou um dos seis outros membros de família 14-3-3) foi titulado a partír de sobreposição 1/500 a 1/16000 e incubado por uma hora à temperatura ambiente.
10 Bloqueio: as placas foram bloqueadas com leite em pó desnatado a 3% em PBS (pH 7,4) a 100 µ1 por cavídade e incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Primeiro antícorpo: sobrenadante de cuítivo de tecidos de hibridonta anti-AU'G1-CLDK, antí-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS , 15.-- ou. anti-14-3-3--eta de camundongos'e"_"contro1es monoclonai-s' " de camundongos foram adícíonados a 100 µ1 puros por cavidade para seleção e teste. Soro pré-imune de camundongo e soro imune anti-AUG1-CLDK, anti-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS ou anti-14-3-3 eta de camundongos foram diluídos 1/500 em 20 sobrenadante de cuítivo de tecído SP2/0 adicionado a 100 µl/cavidade para seleção e teste. Incubado por uma hora a 37 °C com agitação para a seleção e teste.
Segundo anticorpo utilizado para seíeção e teste: IgG Fc anticamundongo de cabra 1/25000 hrp conjugado (Jackson 25 cat. N° 115-035-164) foi utilizado em seleção e teste. Anticorpo secundário diluído em PBS-Tween foi adicionado a 100 µl/cavidade e incubado por uma hora a 37 °C com agitação. Estreptavidina uti-Zizada para ELTSA de captura: 30 Adicionar 100 µ1/cavidade de estreptavidína HRPO (1:8000, CedarLane cát. n" CLCSA1O07) e incubar por uma hora à temperatura ambiente mediante agitação. Substrato: tampão TMB (B1OFx cat. N° TMBW-1OOO-O1) foi b) .N adicionado a 50 µ1 por cavidade e incubado no escuro à .a ternperatura ambiente. As reações de seleção e teste foram suspensas com 50 µ1 de 1 M HCl por cavidade após dez minutos e lidas a OD45onIn.
5 Condições de manchas de pontos: Para seleção: Utilízou-se Milípore, membrana de transferência da Irrunobilon cat. N° IPVH304FO. Antígeno 14- 3-3 eta foi fervido em tampão de amostra por cinco minutos e mantido ent resfriamento. Antígeno foí manchado por um 10 total de 6 µg de quantidades de pontos com uma pipeta. Após permitir a secagem do antígeno por quinze minutos, as manchas foram lavadas com diversas alterações de P13S-Tween pH 7,4. As manchas foram mantídas em placas de Petri separadas por todo o processo de seleção- , . : --15- · Bloquei-o: a ·membrana- de PVDF foi bloqueada, coiii leite.-" , em pó a 5% eni PBS (pH 7,4) por uma hora à temperatura ambiente. A mancha foi lavada após bloqueio por quinze minutos com diversas aLterações de PBS-Tween, pH 7,4. As manchas foram mantidas para secar sobre papel-toalha com a 20 face para cima por dez minutos antes da aplicação de anticorpo primário. Primeiro antícorpo: Sobrenadante de cultívo de tecído de hibridoma AUGI-CLDK, antí-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS ou anti-14-3-3 eta de camundongo e controles monoclonais de 25 camundongos foram incubados com manchas em pIacas de Petri separadas. Soro pré-imune de camundongo e soro ímune anti- AUGI-CLDK, anti-AUG2-KKLE, anti-AUG3-CKNS ou anti-14-3-3 eta de camundongos foram diluídos 1/500 ein sobrenadante de cultivo de tecido SP2/0 utilizado como controle. As manchas 30 foram incúbadas com agitação por uma hora à temperatura ambiente. As manchas foram "lavadas após a incubação de anticorpo primário por trinta minutos com cinco alterações de PBS-Tween, pH 7,4.
.N S egundo antícorpo : IgG/lgM an't i camundongos de cabra t) 1/500 (H+L) , Fosfatase Alcalina conj ugada (Rockland 610- 4502) , diluído em PBS - Tween , pH 7,4, foi adicionado às manchas e incubado com agitação eín placas de Petri por uma 5 hora à temperatura ambiente . As manchas forarn lavadas após a incubação de anticorpo secundário por trinta minutos corn cinco alterações de PBS-Tween, pH 7, 4 . As manchas foram equilibradas em tampão Tris O, 1 M, pH 9, por dez mínutos à temperatura anibiente e, em seguida; secas por perfusão 10 antes da adição de substrato. Siibstrato: Substrato de membrana AP de um componente revelador BCIP/NBT (B1OFX produto n° BCID-1OOO-O1) foi gotej ado sobre a mancha pura à temperatura ambiente . A reação foi suspensa após cinco minutos com água fria da " G 15 -torneira, , % - os ---resultados - -- foram -- . determinados "' quantitativamente de forma vísual e receberam uma avaliação de forte positivo +++, positívo moderado ++, posítivo fraco +, positivo leve +/- ou negativo -. Referênci as 20 I. Harris ED jr. , Hi s tory and Epi demi O1 ogy o:f Rheumatoid Arthritis: How -Zong has i t affected us, and who is at risk? em: Rheumatoid Arth-ri tís. Filadélfia: W. B. Saunders Company, 1997: 21-27.
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Todas as citações são expres s amente incorporadas 5 integralmente ao presente como referêncía.
. . ·~ -

Claims (2)

%' REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo é capaz de Iígar-se específicamente a uma proteína 14—3-3 eta humana na sua 5 configuração natural e em que o mencionado anticorpo exibe a seletividade para a mencionada proteína 14-3-3 eta humana sobre outras isoformas de proteína 14-3-3 humana.
2. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação I, caracterizado pelo fato de que o 10 rnencionado anticorpo não se liga a um epítopo localizado no terminal N da mencionada proteína 14-3-3 eta humana.
3. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindícação 1, caracterízado pelo fato de' que c) rnencionado anticorpo é capaz de Iigar-se a um epítopo que ·15. © compreende·um, peptídeo eta- se1ecio!r!ado a parti'r'-do-gyipo' . que consiste de peptídeos de círcuito 14-3-3 eta, peptídeos de hélice 14-3-3 eta e peptídeos não-hélice 14-3-3 eta.
4. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o 20 mencionado antícorpo é capaz de ligar-se a um epítopo que compreende um peptídeo de circuíto 14-3-3 eta, em que o mencionado peptídeo de circuíto 14-3—3 eta compreende uma sequência de amínoácidos selecíonados a partir do grupo que consiste de SEQ ID N° 11-16.
25 5. ,ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo é capaz de Iigar-se a um epítopo que compreende um peptídeo de hélíce 14-3-3 eta, em que o mencionado peptídeo de hélice 14-3-3 eta compreende uma 30 sequência de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consíste de SEQ ID n° 1-10.
6. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o
* , mencionado anticorpo é capaz de Iigar-se a uin epítopo que compreende um peptídeo não-hélice 14-3-3 eta, em que o mencionado peptídeo não-hélice 14-3-3 eta compreende uma sequência de aminoácidos selecíonados a partir do grupo que 5 consiste de SEQ id n° 17-32.
7. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo é capaz de Iígar-se a um epítopo que compreende LDKFLIKNSNDF (SEQ ID N° 30).
10 8. ANTICORPO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo é capaz de ligar-se a um epítopo que compreende KKLEKVKAYR (SEQ ID N° 31).
9. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a
15. ··reivindicação." 4,"-" caracterízado-"" pe'lo" .."'fato_. "de- ""que '""o"'" mencionado anticorpo é capaz de Iígar-se a um epítopo que compreende KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID N° 32).
10. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado "pelo fato de que o 20 mencionado anticorpo exibe seletívídade para a mencíonada proteína 14-3-3 eta humana sobre proteínas 14-3-3 alfa, beta, delta, epsilon, gama, tau e zeta humanas.
11. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de aco:rdo com a reivíndicação 1, caracterizado pelo fato de que o 25 mencionado anticorpo é capaz de imunoprecipitar a mencionada proteína 14-3-3 a partir de uma solução biológica que compreende a mencionada proteína 14-3-3 eta.
12. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 1, caracterízado pelo fato de que o 30 mencionado anticorpo, quando utilizado em ELISA, é capaz de \ ligar-se especificamente à mencionada proteína 14-3-3 eta humana em uma soIução biológíca que compreende a mencionada proteína' 14-3-3 eta humana quando a mencionada solução e".
biológica for submetída ao mencionado ELISA. è
13. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com uma qualquer das reivindícações 11 ou 1.2, caracterízado pelo fato de que a mencionada soIução biológica compreende uma 5 amostra de fluido sinovial, plasma ou soro de um paciente portador de artrite.
14. ANTICORPO ANTI-14-3-3' ETA de acordo com a reivindicação 1, caracterízado pelo fato de que o mencionado anticorpo é capaz de inibir a indução de MMP por 10 14-3-3 eta, em que o mencionado MMP é selecionado a partir do grupo que consiste de MMP-I, 3, 8, 9, 10, 11 e 13.
15. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 1, caracterízado pelo fato de que o mencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal.
- 15 ,-- '.-16.- -ANTICORPO-..ANTI-14-3-3 - ETA de, acordo - com -a- -,· - . reivindicação 1, caracterízado pelo fato de que o mencionado anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado.
17. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA que compete com o anticorpo conforme' definido em uma qualquer das 20 reivindicações 2 ou 3 pela ligação a proteína 14-3-3 eta humana na sua configuração naturaí, caracterizado pelo fato de que o mencionado anticorpo exibe seletividade para a mencionada proteína 14-3-3 eta humana sobre outras isoformas de proteína 14-3-3 humana.
25 18. MÉTODO DE ELABORAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a imunização de mamíferos com um peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de peptídeos de circuito 14-3-3 eta,. peptídeos de hélice 14-3-3 eta e 30 peptídeos não-hélice 14-3-3 eta. " 19. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE ARTRITE, caracterizado pelo fato de que compreende o uso do anticorpo anti-14-3-3 eta conforme definido na reivindicação 1 para detectar
«" proteína 14-3-3 eta em uma amostra que compreende fluido è sinovial, pIasma ou soro de um paciente.
20. USO DO ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA conforme definído em uma quálquer das reivindicações 1 a 16, caracterizado 5 pelo fato de ser para detectar proteína 14-3-3 eta em uma amostra que compreende fluido sinovial, plasma ou soro de um paciente para diagnosticar artrite.
21. KIT DE DIAGNÓSTICO de ARTRITE, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo antí-14-3-3 eta conforme 10 definido na reivindicação 1 e instruções para realizar o método conforme descrito na reivindícação 19.
22. MÉTODO,DE TRATAMENTO DE ARTRITE, caracterízado ' pelo fato de que compreende adIninistrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo antí-14-3-3 eta 15 . conforme- definido em qua1querj·das- reivíndícações 1 4 ' A a 16,--a.,. - um paciente necessitado de tratamento.
23. USO DO ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA conforme definido em uma qualquer das reivindiCações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de artrite em pacientes.
20 24. USO DO ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA conforme defínido em uma qualquer das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de formul-ação de um rriedicamento para o tratamento de artríte em pacíentes.
25. ANTICORPO ANTI-14-3-3 ETA de acordo com uma 25 qualquer das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de artrite em pacientes.
26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterízada pelo fato de que compreende o antícorpo antí—14—3-3 eta conforme defínido em urna qualquer das reívindícações 1 a 16.
'«" 1/8 ELISA: teste de titulação de sangramento de soro imune anti-AUG1- CLDK de camundongo (após segunda amplificação) sobre o antígeno AUGI-CLDK-BSA apenas reação de lgG 3 . ')" ~ W Camundongo #4 Camundongo #1 Camundongo #2
2. Camundongo #3 2 & Soro pré-imune E . - -· K '" Y ' 2'"O 1/1® 1/200 1/400 ijm y= 1/3200 V64® 1/ Diluição de soro FlG.l r X
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