CN103555750B - 一种人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体的构建及应用，其步骤是：首先是目的基因的扩增与纯化，设计上引物和下引物，提取子宫肌瘤RNA，逆转录后为模板进行PCR扩增，将目的条带切下后，用试剂盒回收纯化；其次是重组质粒14-3-3 γ-pCMV-N-Flag构建与鉴定，将纯化的PCR产物和载体pCMV-N-Flag用BamH I和EcoR I双酶切后，分别用试剂盒回收纯化酶切产物，连接片段，筛选培养，克隆，鉴定，测序，Western Blot 检测蛋白表达，CCK-8检测细胞增殖变化，AnnexinV-FITC/PI双染色法经流式细胞术检测细胞凋亡。

Description

一种人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种人子宫肌瘤14-3-3 γ表达载体的构建方法及应用。

背景技术

子宫肌瘤是人体最常见的肿瘤之一，也是女性生殖器官最常见的肿瘤。据统计，30～50岁生育年龄的妇女中子宫平滑肌肿瘤的发病率高达20%～30%。近年来其患病率有逐年增加的趋势。虽然子宫肌瘤是良性肿瘤，却是导致生育年龄妇女子宫切除的首位原因，严重危害了妇女的生殖健康。子宫肌瘤的发生与雌、孕激素密切相关，但其发生发展的分子机制尚未明确。目前用来治疗子宫肌瘤的药物主要有促性腺激素释放激素类似物（GnRHa）和米非司酮，但是都存在停药后子宫肌瘤反跳性增大的危险。因此，深入探讨子宫肌瘤发生发展的分子机制，将为有效治疗子宫肌瘤提供新思路和实验依据。

14-3-3蛋白是一类高度保守的酸性蛋白家族，在所有的真核细胞中均有表达。目前已发现14-3-3蛋白在哺乳动物中有七种亚型，分别为：β、γ、ε、η、ζ、σ和τ。该蛋白能够与细胞内200多种蛋白质结合，参与细胞信号传导、周期调控、凋亡、分化、恶性转化、迁移等多种细胞生命活动，在肿瘤的发生发展中发挥多方面的作用。近年的研究表明，多种肿瘤的发生，包括乳腺癌、前列腺癌子宫内膜癌和卵巢癌等与14-3-3σ蛋白表达的降低/缺失密切相关。

在我们的前期研究中，率先应用双向凝胶电泳和电喷雾串联质谱技术研究子宫肌瘤和周围正常肌层组织的差异蛋白质，并采用RT-PCR和Western blot进一步验证，发现14-3-3γ在子宫肌瘤中的表达明显低于正常子宫肌层组织，但14-3-3γ在子宫肌瘤发生发展中的具体作用机制尚缺乏客观依据。

为此，本项目拟通过质粒转染技术，构建人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体，探讨14-3-3γ对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响；为治疗子宫肌瘤提供新思路和实验依据。。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人子宫肌瘤表达载体的构建方法，探讨14-3-3γ对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响，为子宫肌瘤的治疗提供新思路和实验依据。

为了实现上述目的，本发明公开了一种人子宫肌瘤表达载体的构建方法，其特征在于：选用pCMV-N-Flag为中间载体，设计一对引物，在引物中引入BamH I和EcoR I酶切位，以含有目的基因的RNA逆转录后为模板进行PCR扩增，将目的条带切下后，用试剂盒回收纯化，将纯化后的PCR产物和载体pCMV-N-Flag用BamH I和EcoR I双酶切后，用试剂盒回收纯化酶切产物，再经连接片段、筛选培养、克隆，即可得人子宫肌瘤表达载体。所述构建方法步骤如下：

1）设计引物

根据待扩增的目的基因序列，设计一对如下引物：

14-3-3γ 前引物序列 CGCGGATCCATGGTGGACCGCGAGCAACTG

14-3-3γ 后引物序列：CCGGAATTCTTAATTGTTGCCTTCGCCGC

2）以含有目的基因的RNA逆转录后为模板，用上述一对引物和DNA聚合酶进行PCR扩增，用试剂盒纯化得到扩增产物；

3）pCMV-N-Flag载体扩增及双酶切

将pCMV-N-Flag载体用BamH I和EcoR I进行双酶切，BamH I 切割位点： G↓GATCC ；EcoR I 切割位点： G↓AATTC；

4）基因重组

将步骤2）得到的扩增产物与步骤3）得到的经过双酶切的pCMV-N-Flag载体进行片段连接，再经筛选培养、克隆，即可得所述人子宫肌瘤表达载体。

本构建方法的优点和特点：通过本设计人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体的构建，为研究14-3-3 γ对细胞的增殖和凋亡提供可靠的依据，以及其在细胞内的表达、定位、功能提供了直观便捷的工具；此外，pCMV-N-Flag载体及BamH I和EcoR I等试剂购买方便，制备过程简单有效，操作方便，合成产物筛选方便，重组体稳定。

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

附图1为本发明重组载体构建示意图；

附图2为pCMV-N-Flag质粒扩增后提取DNA，琼脂糖凝胶电泳结果示意图；

附图3为PCR扩增14-3-3γ基因后提取纯化，琼脂糖凝胶电泳结果示意图；

附图4为载体及目的基因双酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果示意图；

附图5为载体与目的基因连接后，对重组基因进行扩增，提取质粒筛选重组载体示意图；

附图6为对重组基因分别单酶切和双酶切来验证是否转染成功示意图；

附图7A为基因测序结果截取的部分正向链序列图；

附图7B为基因测序结果截取的部分反向链序列图；

附图8为重组基因测序结果示意图；

附图9为Western blot结果示意图；

附图10为重组体转染子宫肌瘤细胞后的双变量流式细胞仪的散点图。

具体实施方式

如图1所示，本发明人子宫肌瘤表达载体的构建方法通过选用pCMV-N-Flag为中间载体，设计一对引物，在引物中引入BamH I和EcoR I酶切位，以含有目的基因的RNA逆转录后为模板进行PCR扩增，将目的条带切下后，用试剂盒回收纯化，将纯化后的PCR产物和载体pCMV-N-Flag用BamH I和EcoR I双酶切后，用试剂盒回收纯化酶切产物，再经连接片段、筛选培养、克隆，即可得人子宫肌瘤表达载体。

以下为具体的表达载体的构建实例及应用：

    一、目的基因制备

（一）RNA 提取

TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

试剂以及相关材料准备 : TRIzol试剂，氯仿，异丙醇，75% 乙醇（ DEPC H₂O 配制），DEPC H₂O（DEPC处理过的水，DEPC是diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯），DNA &RNase free 各类枪头 （1ml、200μL、10μL 各一盒），1.5ml 的 DNA &RNase free EP 管若干。

提取步骤：

1）、6 孔板细胞汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIzol 试剂（invtrogen 公司）1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5 分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。

2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到DEPC 处理过的1.5 ml EP 管中，加新开的氯仿0.2 ml，上下颠倒5-6 次，室温静置2-3 分钟后。

3）、12000 rpm，15分钟，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP 管（DEPC 处理过），加0.6 ml 新开的异丙醇，室温下静置10分钟。

4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA 在管底的白色沉淀，弃去上清，75%乙醇1.0 ml 洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 分钟，4℃离心，重复2 次。

5）、去上清，用小Tip 吸干液体。气干沉淀5-10 分钟， DEPC 处理水20μL 加入，用枪轻轻混匀，取1μL 测OD 值。剩余RNA 置于-80℃中保存。

6）、电泳。

（二）逆转录反应（cDNA合成）

cDNA（complementary DNA）的合成是RT-PCR的重要环节，以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的cDNA。

如下表为逆转录反应所需试剂及配置，反应体系20μL：

PCR扩增仪中反应稳定为37℃，反应时间为15分钟，之后反应温度为85℃，反应时间为5秒钟，冷却后至下一步骤中使用。

（三）PCR扩增目的基因

   在引物设计的过程中考虑了如下原则：①引物长度一般在为15-30个碱基对，G-C含量控制在40-60%左右，避免近3’端有酶切位点或发夹结构；②尽可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C，尽可能避免在3’端最后1个碱基为A，避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现；③退火温度Tm控制在58-60℃左右。基于以上原则，选取了如下引物系列：

14-3-3γ前引物序列：CGCGGATCCATGGTGGACCGCGAGCAACTG

14-3-3γ后引物序列：CCGGAATTCTTAATTGTTGCCTTCGCCGC

如下表为PCR扩增目的基因所需试剂及配置，反应体系50μL：

如下表为PCR扩增仪扩增目的基因所需条件：

PCR 试剂盒纯化，30μL洗脱缓冲液洗脱，取1μL PCR产物进行电泳鉴定，如附图3所示，由图可知1,2,3,4孔道与目的基因大小相似。

(四)PCR 产物双酶切：

BamH I 切割位点： G↓GATCC

EcoR I 切割位点： G↓AATTC

如下表为PCR 产物双酶切所需试剂及配置，酶切体系50μL：

37℃ 金属浴（恒温加热器）中作用2小时，PCR 纯化试剂盒纯化，取1μL于1%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察电泳带，凝胶成像分析系统扫描拍照，如附图4所示，双酶切后14-3-3γ目的基因大小为745bp，双酶切后质粒载体大小为4303bp，与图示相符。Nanodrop 测定浓度。

二、pCMV-N-Flag载体扩增及双酶切

（一）pCMV-N-Flag载体转化感受态细胞

1．将-80℃保存的感受态细胞DH5α置于冰中融化5-10分钟。

2．取100μL感受态细胞移至新的转化管中。

3．向感受态细胞中加入10ng的转化用pCMV-N-Flag质粒，冰中放置20-30分钟。

4．42℃水浴中放置60-90秒钟后，立即于冰中放置1-2分钟。

5．加入890 μL37℃预温的LB培养基。

6．37℃振荡培养1小时。

7．取适量涂LB平板后，将平板倒置于37℃培养箱中培养过夜。

8．确认培养菌落，进行下步实验。

其中pCMV-N-Flag购自碧云天生物技术有限公司，用于在哺乳动物细胞中表达N端和Flag tag（Flag标签）融合的目的蛋白的表达质粒。含有CMV启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；在多克隆位点的5'端含有一个可以编码Flag标签的序列，因此可以表达出含有Flag标签的融合蛋白，可以方便地使用抗Flag的抗体来识别目的蛋白，有利于目的蛋白检测和分离纯化，质粒为卡那霉素抗性。

（二）液体培养

1．从培养箱中取出平板，在超净工作台内挑取单菌落接种至液体LB培养基中。（事先将5ml 液体LB培养基倒入到一干净灭菌的15ml 离心管中，并加入卡那霉素）

2．振荡培养箱中37℃，250rpm 过夜。

3．待离心管下段可见絮状沉淀时，停止振荡，进行下一步实验提取质粒等。

（三）质粒提取

严格按照质粒小量提取试剂盒（Generay公司）说明书上进行。

1. 取1-2ml过夜培养的菌液，12000rpm离心1分钟，弃尽上清。

2.  加入200μL Solution Ⅰ（确认Solution I中已加入RnaseA），用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

3.  加入200μL Solution Ⅱ，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液，此步骤不宜超过5分钟。

4.   加入350μL SolutionⅢ，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5分钟。12,000rpm，离心10分钟。

5.  将步骤4中的上清转移到套放于2ml收集管内的GenClean Column中，室温6000rpm 离心1分钟，取出GenClean Column，倒掉收集管中废液。

6.  将GenClean Column重新放回收集管中，加入500μL Solution IV，12,000rpm，室温离心1分钟，倒掉收集管中废液。

7.  将GenClean Column重新放回收集管中，加入500μL Wash Solution，12,000rpm，室温离心1分钟，倒掉收集管中废液。

8.  重复步骤7一次。

9.  倒掉收集管中废液，12,000 rpm，室温离心1分钟，彻底去除Wash Solution。

10. 将GenClean Column放入干净的1.5ml离心管中，在GenClean Column膜中央加入50μL-70μL Elution Buffer，37℃放置2分钟。12,000rpm，室温离心1分钟，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液。纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存；

质粒提取完毕后用Nanodrop 测定质粒浓度，并电泳鉴定，如附图2所示。

（四）pCMV-N-Flag 载体双酶切

如下表为pCMV-N-Flag 载体双酶切所需试剂及配置，酶切体系50μL：

Reagents	Volume（μL）
		10×Fast digest buffer(快切酶缓冲液)	5
pCMV-N-Flag	X (质量为1μg)
		BamHI(1U/μL)	1.5
EcoRI(1U/μL)	1.5
		ddH2O（双蒸水）	42-X
Total	50

37℃ 金属浴中作用1小时，取2μL载体双酶切后产物于1%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察电泳带，凝胶成像分析系统扫描拍照，如附图4所示，双酶切后质粒载体大小为4303bp，与图示相符。严格按照PCR 纯化试剂盒说明书操作。纯化后的产物于-20℃存放备用。

三、载体与目的基因连接

在Mg²⁺和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。

如下表为载体与目的基因连接所需试剂及配置，反应体系20μL：

试剂	容量（μL）
		10×buffer	2
载体	X (质量为100ng)
		目的基因	Y (质量>500ng)
T4 连接酶	1
		ddH2O	17-X-Y
总计	20

22℃ 金属浴连接过夜。

四、重组基因扩增及筛选

1． 将-80℃保存的感受态细胞DH5α 置于冰中融化5-10 分钟。

2． 取100μL 的感受态细胞移至新的转化管中。

3． 向感受态细胞中加入10μL 重组基因，冰中放置20-30 分钟。

4． 42℃水浴中放置60-90 秒钟后，立即于冰中放置1-2 分钟。

5． 加入890μL 37℃预温的LB 培养基。

6． 37℃振荡培养1小时。

7． 取适量涂平板后，将平板倒置于37℃培养箱中培养过夜。

8． 确认培养菌落。

9．从培养箱中取出平板，在超净工作台内挑取单菌落接种至液体培养基中（事先将5ml 液体LB培养基倒入到一干净灭菌的15ml 离心管中，并加入卡那霉素）。

10．振荡培养箱中37℃，250rpm 8-10小时。

11．待离心管下段可见絮状沉淀时，停止振荡，提取质粒进行筛选及鉴定等。

五、鉴定方法及结果

1．重组质粒筛选及提取，如附图5所示，由图示，重组基因大小为5048bp，大于空载体，表明连接成功。

2．酶切鉴定，如附图6所示，对重组基因分别单酶切和双酶切来验证是否转染成功，由图可知，酶切后基因片段大小与实际相符，表明重组成功。

3．基因测序，如附图7A、图7B和附图8所示，为基因测序结果图，将重组基因委托上海英俊生物有限公司进行基因序列测定，回报后截取部分正向链和反向链序列图，通过Blast软件对重组基因序列与14-3-3γ编码序列对比，结果表明100%相同。

4．Western blot即蛋白质印迹法检测，常用于检测蛋白表达水平。如附图9所示，采用脂质体转染技术，将重组质粒14-3-3 γ-pCMV-N-Flag转入体外原代培养的子宫肌瘤细胞，36小时后提取细胞蛋白，检测14-3-3γ蛋白表达水平，经SPSS统计软件进行t检验，有统计学差异（P＜0.05），转染后14-3-3γ蛋白表达水平较转染前升高，表明转染成功。

六、应用

（一）CCK-8检测细胞增殖

CCK-8试剂（购自日本同仁化学研究所）中含有WST-8，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

实验步骤：

1．在96孔板中分三组，第一组、第二组每孔均配置100μL的子宫肌瘤细胞悬液，细胞数为5000个/100μL，第三组每孔仅配置不含细胞的培养基。将培养板在培养箱预培养（37℃，5% CO₂）24-48小时，至细胞80%融合。采用脂质体转染技术，向第一组、第二组细胞分别转染重组体和空载体，继续培养24小时。

2．向每孔加入10μL CCK-8溶液。

3．将培养板在培养箱内孵育4小时。

4．用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

活力计算：细胞增殖抑制率（%）=（A-B）/（C-B）×100%

A：具有转染重组体后的细胞、CCK8溶液的孔的吸光度

B：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度

C：具有转染空载体后的细胞、CCK8溶液的孔的吸光度

每组设5个复孔，独立实验重复3次，取均值。

结果：

子宫肌瘤细胞转染14-3-3 γ-pCMV-N-Flag体外培养24小时后，经CCK-8检测细胞增殖抑制率为52.90%。表明14-3-3γ经转染在子宫肌瘤细胞内表达增高后，有抑制肌瘤细胞增殖的作用。

（二）AnnexinV-FITC/PI双染色法经流式细胞术检测细胞凋亡

AnnexinV-FITC/PI双染色试剂盒购自invitrogen公司。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35.8KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。

实验步骤：

1. 用不含EDTA的胰酶消化收集子宫肌瘤细胞，离心，微量离心机转速1000rpm，离心时间5分钟，弃培养基。

2. 用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次（1000rpm，离心时间5分钟收集细胞）。

3. 用400μL 1×Binding Buffer 悬浮细胞，浓度大约为1×10⁶cells/ml。

4. 在细胞悬浮液中加入5μL Annexin V-FITC和1μL 100 μg/ml PI轻轻混匀后于2-8°C 避光条件下孵育15 分钟。

5. 在1 小时内用流式细胞仪检测。

每组设3个重复样本，独立实验重复3次，取均值。

结果：

如附图10所示，为重组体转染子宫肌瘤细胞转染后的双变量流式细胞仪的散点图，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI）。经统计，未转染的子宫肌瘤细胞有0.201±0.011处于凋亡状态，转染空载体的细胞有0.325±0.009处于凋亡状态，转染重载体的细胞有0.394±0.010处于凋亡状态。经SPSS统计软件进行配对t检验，未转染组与空载体组有统计学差异（P＜0.01）。重载体组与未转染组相比，有统计学差异（P＜0.01），重载体组与空载体组相比，也有统计学差异（P＜0.01），表明转染重组体后细胞凋亡率增加，即转染14-3-3γ，在子宫肌瘤细胞内高表达后，有促进肌瘤细胞凋亡的作用。

14-3-3γ 前引物序列：CGCGGATCCATGGTGGACCGCGAGCAACTG

14-3-3γ 后引物序列：CCGGAATTCTTAATTGTTGCCTTCGCCGC

 

Claims (1)

1.一种人子宫肌瘤14-3-3 γ表达载体的构建方法，其特征在于：选用pCMV-N-Flag为中间载体，设计一对引物，在引物中引入BamH I和EcoR I酶切位，以含有目的基因的RNA逆转录后为模板进行PCR扩增，将目的条带切下后，用试剂盒回收纯化，将纯化后的PCR产物和载体pCMV-N-Flag用BamH I和EcoR I双酶切后，用试剂盒回收纯化酶切产物，再经连接片段、筛选培养、克隆，即可得人子宫肌瘤表达载体，具体操作如下：

1）设计引物

根据待扩增的目的基因序列，设计一对如下引物：

14-3-3γ 前引物序列 CGCGGATCCATGGTGGACCGCGAGCAACTG

14-3-3γ 后引物序列：CCGGAATTCTTAATTGTTGCCTTCGCCGC

2）以含有目的基因的RNA逆转录后为模板，用上述一对引物和DNA聚合酶进行PCR扩增，用试剂盒纯化得到扩增产物；

3）pCMV-N-Flag载体扩增及双酶切

将pCMV-N-Flag载体用BamH I和EcoR I进行双酶切，BamH I 切割位点： G↓GATCC ；EcoR I 切割位点： G↓AATTC；

4）基因重组

将步骤2）得到的扩增产物与步骤3）得到的经过双酶切的pCMV-N-Flag载体进行片段连接，再经筛选培养、克隆，即可得所述人子宫肌瘤表达载体。