KR20100045235A - 14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 임파구의 과잉 성장을 유도하여 악성 형질 전환을 초래하는 14-3-3감마를 불활성화 시키는 방법으로 종양을 예방, 개선 및 치료하기 위한 것으로, 이를 위하여 14-3-3감마 특이적 펩타이드, 항체, 안티센스 핵산 및 siRNA 등의 14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.

14-3-3감마형, 세포 증식, 인터루킨-3, 임파구, 신호 전달

Description

14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물{Composition comprising 14-4-4γ antagonist}

본 발명은 14-3-3감마 특이적 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 종양 세포를 감소시키는 방법에 관한 것이다

세계적으로 암 발병률이 점차 증가하고 있는 추세이다. 그간 다양한 항암제들이 개발되어 왔으며 지금도 새로운 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도, 종양형성과정에 관여하는 유전자 또는 그 단백질을 직, 간접적으로 불활성화시키는 기작의 항종양 조성물은 안전하고 효과적인 치료 뿐 아니라 맞춤 의약에 적용될 수 있어 중요한 의미를 가진다.

14-3-3 단백질들은 모든 진핵 세포에서 단백질 카이네이즈 신호전달 (protein kinase signaling) 기작에 관여하는 편재된 분자 패밀리이다. 포스포세린/포스포쓰레오닌-결합 모듈(modules)로서의 기능을 하는 14-3-3 단백질들은 세포 주기 진행 (cell cycle progression)과 DNA 손상 체크 포인트 (DNA damage check points), 세포 사멸 (apoptosis), 세포증식 (cell proliferation)과 생존 (survival)의 개시와 유지하는 등의 과정들을 조절하는 인산화-의존적인 단백질-단백질 상호작용에서 역할을 한다. 14-3-3의 아형 중에서 14-3-3감마는 세포내에 14-3-3 단백질 패밀리의 한 종류로서, 뇌, 골격근, 심장 등에서 과발현 되는 것으로 알려졌다. 그리고 알츠하이머 질환(Alzheimer’s disease) 및 다운 신드롬(Down syndrome)에서 뇌의 14-3-3감마 수준이 현저하게 증가하는 것이 밝혀졌다. 그러나 14-3-3감마의 과발현이 종양 형성에 미치는 영향 및 14-3-3감마의 불활성화의 효과와 관련한 고찰은 이루어지지 않았다.

프로테오믹스(proteomics) 연구 분야가 발전하면서, 세포 혹은 조직에서 단백질의 발현의 종합적인 연구 및 종양형성과정에 관여하는 유전자의 효율적인 동정이 가능하게 되었다. 종양 치료의 표적으로 작용하는 유전자의 발굴은 종양의 예방 및 치료적 관점에서 중요한 의미를 가진다.

본 발명은 다양한 종양의 억제 및 치료를 위한 효과적인 표적으로 작용할 수 있는 유전자를 제공하기 위한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 과발현되면서 임파구의 과잉 성장을 유도하여 악성 형질전환을 초래하는 유전자인 14-3-3감마를 스크리닝하고, 상기 14-3-3감마를 불활성화 시키는 기작으로 종양을 억제 및/또는 치료하기 위한 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.

상기 14-3-3감마 안타고니스트가 14-3-3감마 특이적 항체, 펩타이드, 안티센스 핵산 또는 siRNA인 조성물일 수 있다.

상기 siRNA는 (i) 14-3-3감마의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및 센스 RNA 가닥에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하는 이중사슬 siRNA 또는 (ii) 상기 이중사슬 siRNA를 코딩하는 벡터를 포함하는 항종양 조성물일 수 있다.

상기 siRNA는 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥을 가지는 조성물일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물을 처리하여 종양 세포를 억제하는 방법을 제공한다.

14-3-3감마 안타고니스트, 구체적으로 siRNA를 처리할 경우, 14-3-3감마의 증가에 의해 유도된 세포 증식 현상이 효과적으로 억제된다. 따라서, 14-3-3감마의 안타고니스트를 처리함으로써, 14-3-3감마의 증가에 의해 유발된 질병의 효과적인 예방, 개선 및 치료가 가능하다.

본 발명은 14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, “14-3-3감마 안타고니스트(antagonist)”란 14-3-3감마의 mRNA, 단백질, 또는 신호전달 과정에서 작용하여 14-3-3감마의 생물학적 활성을 억제, 차단, 파괴, 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 안타고니스트가 세포에서 안타고니스트로 작용하게 되는 기작은 특별히 제한되지 않으며, 전사, 번역 등 유전자 발현에 영향을 주는 물질, 분해시키는 물질, 활성형 단백질을 비활성형의 형태로 변경 또는 전환시키는 물질 등을 예로 들 수 있다. 이런 안타고니스트에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물; 및 복수 화합물의 복합체 등을 포함한다.

본 발명에서, 용어 “특이적”은 세포 내에서 표적을 특이적으로 선택, 결합, 또는 반응하는 능력을 의미하고, 본 발명은 14-3-3감마 특이적 안타고니스트를 제공한다. 상기 안타고니스트는 14-3-3감마의 변형된 (증가된) 발현과 연관된 질병의 예방, 개선 및 치료에 이용될 수 있다.

핵산 및 단백질 서열이 공지된 14-3-3감마에 대하여 당업자는 안타고니스트 활성은 가지는 펩타이드, 항체, 안티센스 핵산 및 siRNA 등을 당 분야의 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

안타고니스트의 한 구현 예는, 14-3-3감마에 대하여 안타고니스트 활성을 가 지는 14-3-3감마 특이적인 펩타이드 또는 항체이다.

특이적인 “펩타이드”는 아미드 결합으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머로, 14-3-3감마에 특이적으로 결합하여 14-3-3감마 기능을 억제하는 효과를 가지는 펩타이드를 의미한다. 또한, 특이적인 “항체”란 14-3-3감마를 특이적으로 인지하는 단백질 분자를 의미하고 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다.

본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등의 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 또한, 세포내에서 면역원성이 감소되도록 개질되어진 인간화된 항체일 수 있다.

상기 펩타이드 또는 항체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있으며, 단량체나 다량체의 형태일 수 있다.

상기, 펩타이드 또는 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 결합된 형태일 수 있다. 결합되는 치료제는 화학치료제, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소 등을 포함한다.

또한, 본 발명의 펩타이드 또는 항체는 세포내에서 발현되도록 이를 코딩하는 벡터의 형태로 세포내로 투여될 수 있다.

본 발명의 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 벡터, 항체 및 상기 항체를 코딩하는 벡터로 이루어진 그룹 중에서 1 이상 선택되는 물질을 포함하는 조성물은 암 세포의 증식을 저해시키는 추가의 물질, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 세포 내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다.

안타고니스트의 또 다른 구현 예는, 14-3-3감마에 대하여 안타고니스트 활성을 가지는 14-3-3감마 안티센스 핵산 또는 siRNA이다.

본 발명에서 용어 "안티센스 핵산”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체인 핵산서열을 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA에서 단백질로의 번역을 저해하는 특징을 가진다. 안티센스 핵산의 서열과 길이는 특별히 제한되지 않는다. mRNA에 대응하지 않는 일부의 서열을 포함할 수 있다. 전체 길이는 6 내지 60 염기이고, 바람직하게는 8 내지 50 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 것이다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어, “siRNA (small interfering RNA (siRNA)”는 표적 유전자의 mRNA에 특이적으로 작용하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미하고, 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된 다. 구체적으로, 14-3-3감마 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 일부 영역과 동일한 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 14-3-3감마 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 일부 영역에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥이 이중가닥 RNA를 형성한 형태이다. siRNA는 14-3-3감마의 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있으면 서열과 길이는 특별히 제한되지 않는다. siRNA의 전체 길이는 10 내지 60 핵산, 바람직하게는 12 내지 50 핵산, 더욱 바람직하게는 15 내지 40 핵산이다. siRNA는 바람직하게는, 서열번호 1의 센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 서열을 가지는 서열번호 2의 안티센스 RNA 가닥이다.

본 발명의 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루거나, 하나 이상의 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분을 포함할 수 있다.

siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 3 말단 및 5 말단 모두 평활 말단 또는 점착 말단이거나, 한쪽만 돌출한 구조일 수 있다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, 이중사슬 RNA의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 6 내지 18개의 뉴클레오타이드 길이를 가진다.

siRNA를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, RNA 올리고뉴크레오타이 드를 화학적으로 합성하는 방법, 인 비트로 전사를 이용한 small RNA의 합성 방법, 인 비트로 전사에 의해 합성된 long dsRNA를 siRNA로 프로세싱하는 효소인 Rnase III 패밀리 효소 (예를 들어, Dicer, Rnase III)을 이용하여 다양한 염기서열을 갖는 siRNA를 생산하는 방법 등을 예시할 수 있다.

siRNA를 세포 외에서 합성하여 세포내로 도입시키는 방법 외에도, siRNA가 세포내에서 일시적, 또는 영구적으로 발현되는 siRNA 발현 벡터를 세포내로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다.

siRNA 발현 벡터는 14-3-3감마 mRNA의 어느 한 영역에 대하여 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및/또는 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 벡터의 종류는 특별히 제한되지 않고, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다.

siRNA의 안티센스 RNA 가닥과 센스 RNA 가닥은 동일 벡터에서 발현될 수도 있고, 각각의 벡터에서 발현될 수도 있다. 동일한 벡터로부터 안티센스 RNA 및 센스 RNA를 발현시킬 경우, 프로모터에서 센스 RNA가 발현되는 발현 카세트와 프로모터에서 안티센스 RNA가 발현되는 발현 카세트를 각각 구축하고 이들 카세트를 같은 방향 혹은 역방향으로 벡터에 삽입한다. 또한, 스템루프형 siRNA를 발현할 수 있는 시스템으로 안티센스 RNA와 센스 RNA를 코딩하는 뉴클렐오타이드 서열을 동일 DNA 사슬상에 역방향으로 배치하고, 이들 DNA 사이에 링커를 삽입하여 연결시킨 단위를 하나의 프로모터의 하위(downstream)에 위치하도록 할 수 있다. 이 때, 발현되는 순서는 제한되지 않는다. 즉, 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA-링커-센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태와 센스 RNA를 코딩하는 DNA-링커-안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태일 수 있다. 그 결과, 생성되는 siRNA는 링커 부분을 루프로 하고, 그 양쪽의 센스 RNA와 안티센스 RNA가 짝을 이루게 되는 스템 루프형 구조를 가진다.

14-3-3감마 안타고니스트로 사용될 안티센스 핵산 또는 siRNA 제조시, 당 분야의 전문가는 기존의 데이터베이스를 토대로 표적 유전자내 서열간의 혼성화 정도 등의 변수를 고려하여, 표적 유전자 서열 내에서 특이성 및 민감성이 높은 서열을 결정할 수 있다.

또한, 안티센스 핵산 및 siRNA는 특이성, 안정성 등을 증가시킬 목적으로 siRNA의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 임의 위치에서 변형이 일어날 수 있다. 구체적으로, 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)이 선택적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다.

또한, 안티센스 핵산 또는 siRNA는 다양한 기능을 가지거나 siRNA에 추가적인 기능을 제공하는 결합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말단에 tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA 분자 등의 저분자 RNA를 포함할 수 있다.

또한, 안티센스 핵산 또는 siRNA는 임의의 면역자극성 서열 또는 모티프 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산, 상기 안티센스 핵산을 발현하는 벡터, siRNA 및 상기 siRNA를 발현하는 벡터로 이루어진 그룹 중에서 1 이상 선택되는 물질을 포함하는 조성물은 암 세포의 증식을 저해시키는 추가의 물질을 포함할 수 있다. 또한 세포 내 유입을 촉진시키는 제제로 핵산 유입을 촉진하는 통상의 제제를 포함할 수 있다. 세포내 유입을 촉진시키는 제제로서, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수도 있다. 안티센스 핵산, 상기 안티센스 핵산을 발현하는 벡터, siRNA 또는 상기 siRNA를 발현하는 벡터를 복합체 형태로 체내 투여할 경우, 세포내 전달 효율, 체내 체류시간 및 발현 지속시간이 네이키드 핵산에 비하여 현저히 증가한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 기술을 이용하여 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등 을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물을 처리하여 종양 세포를 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 14-3-3감마의 증가와 연관이 있는 질병, 구체적으로 종양에 걸린 개체의 치료에 이용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 혈액암, 뇌척수액암, 간암, 신장암, 유방암, 갑상샘암 등을 포함하는 모든 종양 또는 암 유형의 성장을 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 가능한 개체는 인간뿐만 아니라 새, 가금류, 가축 등의 동물도 포함한다. 본 발명에서, 치료는 종양의 발병을 예방하거나, 질환과 관련된 증상을 감소, 경감, 역전시키고 확립된 종양의 성장과 진행을 억제하는 것을 포함한다.

본 발명의 조성물은 기존의 세포독성제, 화학요법제 등의 다양한 치료제와 병합 투여될 수 있으며, 이 경우 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 표면에 전달하는 임의의 방식으로 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 비경구 투여 경로는 혈관내 투여(예, 정맥내 볼루스 주사, 정맥내 주입, 동맥내 볼루스 주사, 동맥내 주입, 맥관내로의 카테터 점적주입), 피하 주입을 포함하는 피하 주사 또는 침착(deposition)(예를 들면 삼투압 펌프 이용), 조직주위 및 조직내 투여(예: 종양주위 및 종양내 주사) 또는 침착 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 성별, 연령, 건강상태, 체중, 투여 방법과 횟수, 표적 조직이나 세포 등 다양한 요인을 고려하여 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 상기 유효량은 14-3-3감마를 불활성화시키기에 충분한 양 또는 개체의 종양을 억제하기에 충분한 양이다. 각 치료에 요구되는 총 용량은 수회 용량 또는 일회량으로 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 실험방법

1-1: 사용 세포주, 세포 배양 및 형질 도입법

Ba/F3 세포는 10% FBS (Gibco, NY, USA)와 10 pM의 인터루킨-3 (PeproTech, London, UK)가 포함된 RPMI 1640 (Gibco, NY, USA)에서 배양되었으며, 자극을 주기 위해서, 8시간 동안 인터루킨-3가 결핍된 배지에서 배양한 후에 10 pM의 인터루킨-3가 포함된 배지에 1시간 동안 배양하였다. 인간 혈액암 세포인 K562와 마우스 혈액암 세포인 L1210과 마우스 T림프구 세포인 EL4는 10% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하였다. NIN3T3 세포는 설명서에 따라 리포펙타민 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 형질도입되었으며, 이를 제외한 모든 형질도입은 Bio-Rad Gene Pulsar II (Hercules, CA, USA)를 이용하여 300V, 960 μF에서 실행하였다.

1-2: 2-DE 분석법

2-DE 분석을 위해 모은 세포들은 단백질 분해효소 억제제 (Roche, Mannheim, Germany)가 포함된 샘플 버퍼 (7M urea, 2M thiourea, 4.5% CHAPS, 100 mM DTE, 40 mM Tris, pH 8.8)에서 용해하였으며, 이후에 DNase I을 첨가하여 30분간 얼음 안에서 보관한 후, 14,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 세포 부스러기와 깨지지 않은 세포들을 제거하였다. 분리된 단백질 1 mg은 pH3-10으로 구성된 비선형 농도구배 스트립 (nonlinear gradient strips) (Amersharm Bioscience, Uppsala, Sweden)에서 이동시켰으며 IEF(isoelectric focusing) 은 80,000 Vh에서 실행하였다. 2 차원적 분리는 9-16% 선형 농도구배 폴리아크릴아마이드 (linear gradient polyacrylamide) 젤에서 5시간 동안 40 mA로 실행하였다. 이후에 40% 메탄올과 5% 인산(phosphoric acid)으로 1시간 동안 고정하였으며 쿠마시에 블루 (CBB) G-250에서 12시간 동안 염색하였다. 염색된 젤은 GS-710 이미징 덴시토미터 (imaging densitometer) (Bio-Rad, Hercules,CA,USA)로 스캔하였고, ImageMaster™2-DE 플레티늄 이미지 분석 프로그램 (platinum image analysis program) (AmershamBiosciences, Uppsala, Sweden)으로 분석하였다. 스팟의 발현 정도는 Melanie II 프로그램을 이용하여 젤에서 전체 단백질 스팟 양에 대한 하나의 스팟 양을 조사하여 결정하였다.

1-3: In-gel 절단과 매스 스펙트로미트릭 분석

젤에서 도려낸 스팟은 트립신 (Promega, Madison,WI,USA)에 의해 절단되었다. Nano LC-MS/MS 분석은 Agilent 1100 Series Nano-LC와 LTQ-mass 스펙트로미터 (Thermo Electron)로 실행하였다. LC-MS/MS 분석 (150 mm × 0.075 mm)에 사용된 캐필러리 컬럼 (capillary column)은 5 μm, 100 Å 포어 크기 (pore size) Magic C18 고정상 (Michrom Bioresources)으로 만들어진 프로제온(Proxeon)과 슬러리(slurry)로부터 얻어냈다. LC 분리를 위한 이동상 (mobile phase) A는 0.1% 포름산 (formic acid)을 포함한 탈이온화된 물을 사용하였고 이동상 (mobile phase) B는 0.1% 포름산을 포함한 아세토니트릴(acetonitrile)를 사용하였다. 크로모토그래피 농도구배 (chromatography gradient)는 50분 동안 5% B에서 35% B로 다음 20분은 40% B에서 60% B로 다음은 5분 동안 60% B에서 80% B로 설정하였고 유속(flow rate)은 스플리팅(splitting) 후 300 nL/min를 유지하였다. 매스 스펙트라는 풀 매스 스캔 (full mass scan) (400-1800 m/z)으로 데이터-의존적 액쿼지션을 이용하여 획득하였고 MS/MS 스캔하였다. 각각의 MS/MS 스캔은 LTQ에서 하나의 마이크로스캔의 평균을 요구하였다. 이온 전달 튜브의 온도는 200 ℃로 조절하였고 분사는 1.5-2.0 kV로 실행하였다. 평균화된 충돌 에너지 (normalized collision energy) MS/MS를 위해 35%로 설정하였다. 시크스트 소프트웨어 (sequest software)는 펩타이드 시퀀스를 동정하기 위해 사용되었다. 높은 신뢰 결과를 얻기 위해서, 전하 상태 (charge state) 1+는 δCn ≥ 0.1, Rsp≤ 4와 Xcorr ≥ 1.5 조건으로 전하상태는 2+는 Xcorr ≥ 2.0로 전하상태 3+는 Xcorr ≥ 2.5로 펩타이드 프로바빌리티(peptide probability) > 0.1 조건으로 단백질 동정에 사용하였다.

1-4: 사용된 생물 정보학

데이터베이스 조사 기준 (database search criteria); 피크 리스트 소프트웨어 발생, 4700 MALDI-TOF/TOF; 조사 엔진 및 버젼, MASCOT 및 CAJ18416.1; 효소 특이성, 다음 잔기가 P가 아니면 KR의 C-말단을 절단하는 트립신; 최대 잘못된 절단, 오직 1; 다양한 변형, 메티오닌에서의 산화; 전구체-이온 매스 허용, 0.8 Da; 적어도 하나의 유일한 상동(identity) 스코어 펩타이드를 가지는 단백질을 명백하게 동일한 것으로 간주함.; 데이터베이스, NCBInr 20050805; 분류학, Musmusculus(housemouse), 85003서열; 60보다 큰 단백질 스코어가 유의함.

1-5: RNA 준비와 cDNA 합성

Ba/F3 세포의 총 RNA는 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 준비하였으며 cDNA 합성은 Superscript^TM First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하였다. 2 μg의 총 RNA에 0.5 μg Oligo (dT)1_2-18 프라이머를 첨가하여 70 ℃에서 20분 반응한 후, 5X first strand 버퍼 (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl 및 15 mM MgCl₂), 10mM DTT (dithiothreitol)와 0.5 mM dNTP를 첨가하여 최종양이 20 μl가 되도록 혼합하였다. 혼합된 튜브는 42 ℃에서 2분간 반응 후, SuperScript^TM II RT (50units/ml)를 첨하한 후 42 ℃에서 50분 간 반응하고 70 ℃에서 15분간 변성시켰다.

1-6: 대상 유전자의 전사 분석

인터루킨-3의 처리 유무 상태에서 발굴된 유전자들의 비교 전사량은 GAPDH로 정량화하여 비교되었다. 이들 유전자를 위한 프라이머는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) GenBank에 등록된 시퀀스를 대상으로 제작되었다. 프라이머 시퀀스는 표 1에 나타내었으며 PCR 조건은 94 ℃에서 1 분 동안 변성, 55-58 ℃에서 1분 동안 어닐링, 72 ℃에서 1분 동안 진행하였고 마지막 단계에서 72 ℃에서 10분 동안 신장 단계를 거쳐 마지막으로 4 ℃에서 보관하였다. PCR 생성물은 ABI Prism (Applied Biosystems, FosterCity,CA,USA) 자동화 기계로 시퀀싱되었다. 이를 1% 아가로오스 젤에서 크기를 확인하였으며 Etbr을 이용하여 UV를 조사하여 가시화하였다. DNA의 밴드밀도는 Fluor-S^TMMultiImager (Bio-Rad,Hercules,CA,USA)로 분석하였다.

1-7: 데이터화 과정 및 통계 분석

모든 데이터의 통계 분석은 2 그룹 간을 비교할 때 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 이용하여 분석하였다. 수치화된 데이터들은 ±로 표시하였으며 P 값은 0.005보다 작을 경우에 유의성이 있다고 보았다.

1-8: 인터루킨 처리 유무에 따른 Ba/F3 세포의 면역블롯 분석

인터루킨 처리 유무에 따라 모아진 세포로부터 30 mg의 단백질을 얻어낸 후 SDS-PAGE를 진행하였으며 단백질들은 니트로셀루로즈 멤브레인으로 블롯팅하였다. 이 멤브레인들은 항-14-3-3감마 항체 (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA)가 1:500으로 포함된 블로킹 용액에서 반응시킨 후, 1:5,000으로 희석된 HRP-콘쥬게이트된 항-고트 IgG (horse radish peroxidase-conjugated anti-goat immunoglobulinG) 이차 항체로 반응시켰다. 이후 ECL 시스템 (ElpisBiotech,Taejeon,Korea)으로 조사하였다. 웨스턴 블롯으로부터 얻은 밴드는 Fluor-S^TMMultiImager (Bio-Rad,Hercules,CA,USA)로 분석되었다. 수치는 평균±표준오차로 나타내었다.

1-9: 14-3-3감마, 베타와 이타 아형들의 발현 벡터 내로의 클로닝

인터루킨-3에 의해 유도된 마우스 Ba/F3 세포에서 총 RNA를 준비하였고 oligo (dT) 프라이머와 SuperScript 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). 14-3-3감마, 베타와 이타 아형의 전장 길이 cDNA를 PCR로 증폭하였으며, NCBI에 보고된 GenBank 시퀀스를 참고하였다 (표 1). PCR 생성물은 진핵생물 발현벡터 (eukaryotic expression vector) pCDNA3-6myc에 EcoRI과 XhoI을 이용하여 클로닝하였다. 14-3-3감마에 특이적인 siRNA는 NCBI에 보고된 14-3-3감마 시퀀스를 이용하여 Ambion사의 siRNA 제 작 프로그램을 이용하여 제작하였으며, 설명서를 따라 pSilencer 3.0 vector (Ambion, Austin, TX, USA)내로 클로닝하였다. 14-3-3감마 특이적 siRNA는 14-3-3γ mRNA에 상동인 센스 RNA 가닥 서열로서 서열번호 1의 핵산서열과 센스 RNA 가닥에 상보적인 안티센스 RNA 가닥 서열로서 서열번호 2의 핵산서열을 가진다. 14-3-3감마, 베타, 이타 아형과 감마 특이적인 siRNA 자동화 시퀀스로 확인하였다. 다른 14-3-3 아형들은 한국 고려대학교 홍정호 (Dr. Jeong-Ho Hong) 박사님으로부터 제공받았다.

1-10: Ba/F3와 혈액암 세포에서 14-3-3 아형과 14-3-3감마 특이적 siRNA의 안정적 발현

14-3-3 아형들의 전장 길이 cDNAs와 14-3-3감마형 특이적 siRNA는 300V와 960μF로 세팅된 Bio-Rad Gene Pulsar II (Hercules,CA,USA)를 이용하여 Ba/F3, K562, L1210와 EL4 세포 내로 일시적으로 형질 도입되었고 48시간 후에 웨스턴 블롯 분석을 위해 일부 모아두고, 나머지는 400 mg/ml Geneticin (G418) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 선별 과정을 거쳤다. 14-3-3 아형들과 14-3-3감마형 특이적 siRNA들은 1 x 10⁴으로 3 세트 형질 도입을 실시하였고 0일, 1일, 2일과 3일에 걸쳐 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 트립판블루 (0.4%)로 염색하였으며, 실험값은 3차례 반복 실험을 통해 평균 ± SEM 값을 구하였다.

1-11: 기본 골수 (primary bone marrow) 세포 구축과 IL-3 처리

6-8주령의 Balb/c 마우스는 목 경부 탈골로 희생시켰으며 넓적 다리와 턱을 얻기 위해 부착된 연골 부위를 조심스럽게 제거하였다. 각 뼈의 끝부분은 뼈집게로 제거하였으며 골수 세포는 RPMI 1640 배지에 실린지 바늘 (27-gauge)을 이용하여 분리하였고 70-mm 나일론 메쉬 필터 (BD, Falcon, San Jose, CA, USA)로 거른 후, 원심 분리하고 차가운 PBS로 씻은 후 트립판 블루 염색을 통해 분리한 후 배양하였다. 세포들은 6-웰 플라스틱 배양 플레이트를 이용하여 10% FBS, 1% 페닐실린과 스펩트로마이신이 포함된 RPMI 1640에 각 웰당 2.5 x 10⁶ 세포로 배양하였다. 배양은 95% 공기와 5% CO₂ 로 구성된 37 ℃ 배양기에서 이루어졌다. 1차적으로 부유된 배양액이 혼합된 경우가 많으므로 PBS로 6번 세척한 후, 8시간 동안 RPMI 1640에서 배양하였고 세포들은 10 pM IL-3 처리 유무 상태에서 1시간 동안 유지되었다. 이후 이 세포들로 cDNA을 합성하였고 단백질은 위에서 설명한 바와 같이 준비하였다. 정량적 PCR과 반-정량적 PCR과 면역 블롯은 14-3-3감마 프라이머와 해당 항체 및 인터루킨-3 리셉터 항체 (S-12) (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA) 를 이용하여 진행하였다.

1-12: 기본 골수 세포에서 14-3-4 전사의 과발현

14-3-3감마와 siRNA는 250V (650V/cm)와 25μF (Elizabeth Turf, personnel communication)로 설정된 Bio-Rad Gene Pulsar II (Hercules, CA, USA)를 이용하여 기본 골수 세포 내로 일시적으로 형질도입 되었으며 48시간 후에 웨스턴 블롯 분석을 위해 일부 모아두고, 나머지는 400 mg/ml Geneticin (G418) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 선별 과정을 거쳤다. 14-3-3 아형들과 14-3-3감마형 특이적 siRNA들은 1 x 10⁴으로 3 세트 형질 도입을 실시하였고 0일, 1일, 2일과 3일에 걸쳐 헤모사이토미터를 이용하여 트립판블루 (0.4%)로 염색하였으며, 실험값은 3차례 반복 실험을 통해 ± SEM 값을 구하였다.

1-13: Ba/F3의 세포 사멸과 종양 발생 시도

세포 사멸과 세포 증식 시도를 위해 위 설명에서 만들어진 Ba/F3 세포주를 사용하였다. 세포주들은 1x10⁶ cells/ml로 배양 시작하였으며, PI(Propidiumiodide)와 아넥신 V (annexin V)는 FACS Vantage^TM 플로 사이토미터 (BectonDickinson, SanJose, CA, USA)를 사용하여 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) 분석시 처리하였다.

1-14: NIH3T3 세포의 세포 증식과 포커스 형성 분석

14-3-3 아형과 14-3-3감마 특이적 siRNA은 NIH3T3 세포들은 2.5 x 10⁵ 세포에 리포펙타민 시약 (Lipofectamine reagent) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 형질 도입하였다. 형질도입된 세포주들은 2.5% FBS와 0.4% 저융점 아가로즈 (Gibco, GrandIsland, NY, USA)가 포함된 배지와 5% FBS와 0.53% 아가로즈가 포함된 배지에 각각 1x10³ cells/ml 세포를 배양하였다. 배양 2주 후에 콜로니 형성 정도를 촬영하였다.

1-15: 인터루킨-3 신호 전달 체계에서 14-3-3감마의 과발현 효과

Ba/F3 세포를 PBS로 세척한 후, 1 mM의 단백질 분해효소 억제제 (Roche, Mannheim, Germany)가 포함된 샘플 버퍼 (50 mM Tris [pH 7.4], 150 mM NaCl, 1% Triton X-100)에 용해하였으며, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 단백질을 브래드포드 시약 (Bradford reagent) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 정량하여, 동량의 단백질 30 mg을 SDS-PAGE를 통해 분리하고 멤브레인으로 옮긴 후 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 사용된 항체들은 p-p38, p-p44/42 (Lab Frontier, Seoul,Korea)와 PI3K p85a, JNK1 (FL), hPKC, Bad (C-20), Bax (B-9), Bcl-2와 베타-액틴 (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA)이다.

실시예 2: Ba/F3 세포의 형태와 단백질 발현에 미치는 인터루킨-3의 영향

Ba/F3 세포는 인터루킨-3이 결핍된 상태에서 8시간 동안 유지된 후, 사이토카인 (cytokine)으로 1시간 동안 자극시켰으며, 결핍 또는 재-자극된 세포를 현미경으로 비교하였다. 결핍 후 인터루킨-3에 의해 자극된 세포들은 증가된 운동성 (motability), 파상운동 (ruffling), 버딩 (budding) 및 길어진 형태 (elongation)를 보였다. 이로부터 인터루킨-3이 Ba/F3 세포의 형태학적인 특징과 세포수의 변화가 세포 성장과 증식에 관여할 것이라는 것을 예상할 수 있으며, 이와 관련된 단백질들을 살펴보고자 하였다. 인터루킨-3이 결핍되면 아포프토시스 (apoptosis)의 전-세포사멸 인자 (pro-apoptotic members)들의 활성으로 인한 세포 사멸이 보고되었고, 인터루킨-3의 자극은 이를 감소시킨다는 것도 보고되었다. 인터루킨-3 자극으로 인한 단백질들의 발현 변화를 이해하기 위하여, 다양한 표현형의 차이 (differential-display)를 알아보기 위한 프로테오믹 분석 (proteomic analysis) 방법을 이용하는 등전점 초점화 (isoelectronic focusing)를 적용하였다. Ba/F3 세포로부터 얻어진 단백질 샘플은 이차원 전기영동 (2-DE) 겔로 분리하였고 단백질 서열 분석 (protein sequencing)을 위해 쿠마시-블루 염색 (Coomassie blue staining)하여 탐색하였다 (도 1a). 인터루킨-3의 결핍과 유도된 샘플들 사이의 단백질 발현 패턴의 차이는 도 1a에서 스팟 <c>, 스팟 <d>와 스팟 <e>로 표시된 겔의 세 부위에서 확실하게 나타났으며, 인터루킨-3에 의해 유도된 샘플에서 11개의 단백질이 높게 발현되었다. 이 중에서, 5205번 스팟은 <c> 부위에, 5831, 6647, 6046, 6175, 6330번의 5개 스팟은 <d> 부위에, 나머지 6671, 6848, 6855, 6871, 6984번의 5개 스팟은 <e> 부위에 존재하였다. 이차원 전기영동 (2-DE) 겔에서 증가된 발현을 보이는 11개의 단백질을 발굴하기 위해 고성능 질량 분석기 (4700 MALDI-TOF/TOF)를 통해 펩타이드 지문 분석 (peptide mass fingerprinting; PMF)을 하였다. 이들 중에서, 14-3-3γ에 초점을 맞추어 살펴보았다.

실시예 3: 인터루킨-3 유도된 Ba/F3 세포에서 14-3-3γ 활성화와 연관된 전사, 번역 분석

14-3-3γ 상대적 전사 수준 변화를 양적 실시간 중합 연쇄 반응 (quantitative real-time PCR)으로 살펴보았다 (도 1b). 대조구로 G3PDH를 사용하였다. 인터루킨-3 처리된 세포와 비처리된 세포에서 추출한 14-3-3γ 단백질의 수준을 14-3-3γ의 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석 (wastern blot)으로 확인하였다 (도 2a). 인터루킨-3에 의한 유도 1시간 후에 14-3-3γ는 강하게 발현되었으며, 이는 도 1a에서 보여진 프로테오믹스 결과와 일치하는 것이다.

실시예 4: 14-3-3γ는 인터루킨-3가 제거된 Ba/F3 세포의 증식을 조절

14-3-3γ가 Ba/F3 세포의 증식 반응을 위해 인터루킨-3에 의해 유도되는지를 확인하기 위하여, 14-3-3γ 및 대조군으로 공 벡터를 세포에 형질 도입시켰다. 14-3-3γ의 세포외 (ectopic) 발현과 함께 14-3-3γ의 세포내 (endogenous) 발현은 차이가 없었다. 공 벡터가 형질 도입된 Ba/F3 세포의 증식 특징은 무크(mock)-형질 전환 세포와 유사하였다 (도 2b). 대조적으로, 14-3-3γ가 과발현된 Ba/F3 세포는 높은 증식율을 보였다 (도 2b). 인터루킨-3가 결핍된 상황에서 14-3-3γ 형질도입된 세포의 증식은 인터루킨-3가 존재하의 세포보다 약간 느렸다. 게다가, siRNA에 의해 세포내 14-3-3γ가 제거되면 인터루킨-3가 존재하는 Ba/F3 세포에서조차 증식이 억제되었다 (도 2b). 공 벡터, 14-3-3γ와 siRNA의 형질도입 여부는 중합연쇄반응과 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 2c).

실시에 5: 기본 골수 (primary bone marrow) 세포에서 14-3-3γ의 기능 분석

기본 골수 세포에서 14-3-3γ의 주요 기능을 조사하기 위해서 정해진 시간 동안 인터루킨-3이 처리된 기본 골수 세포를 준비하였다. 이렇게 준비된 세포들로부터 cDNA을 합성하고 단백질 추출액을 준비하였다. 양적과 반-양적 중합효소연쇄반응 결과, 인터루킨-3이 처리된 전사물 (transcripts)과 번역물에서 14-3-3γ가 유도된 것을 확인할 수 있었다 (도 3a, b 및 c). 유사하게 14-3-3γ 단백질 번역 생성물도 인터루킨-3 처리군에서 높게 나타났다. 이러한 결과들은 14-3-3γ가 조혈 계통 (hematopoietic lineage)에서 인터루킨-3에 의해 특이적으로 자극된다는 것을 의미한다. 다음, 14-3-3γ와 14-3-3γ 특이적 siRNA를 각각 형질도입한 쥐의 기본 골수 (murine primary bone marrow) 세포들을 인터루킨-3 결핍된 배양액과 처리된 배양액에서의 증식 분석에 사용하였다. 14-3-3γ가 과발현되면 인터루킨-3에 의해 자극된 기본 골수 세포들은 높은 증식율을 보였다. 또한 14-3-3γ 과발현은 무크와 공벡터가 형질도입된 군과 비교했을 때 인터루킨-3이 결핍된 경우에서도 높은 증식율을 보였다 (도 3d). 이러한 결과들은 기본 골수 세포에서 14-3-3γ의 안정적인 발현이 세포의 증식을 유도하는 것을 나타낸다.

실시예 6: NIH3T3 세포에서 14-3-3γ의 안정적 발현은 포커스(focus) 형성을 조절

이전에 NIH3T3 세포에서 14-3-3β의 과발현이 증식 포커스-형성 (proliferative focus-forming) 세포로 형질전환 시킨다는 것이 보고되었다. 14-3-3γ도 이런 효과를 보이는지를 확인하기 위해서 NIH3T3 세포에 14-3-3γ를 안정적으로 형질도입한 세포를 구축하였다. 시럼이 감소된 환경에서 14-3-3γ가 과발현된 세포들은 포커스를 형성했고 이는 14-3-3β의 경우와 동일하였다 (도 4a). 그러나, 14-3-3γ의 siRNA를 발현시킨 세포에서는 포커스 형성이 관찰되지 않았다. 또한 14-3-3γ가 과발현된 NIH3T3 세포의 소프트 아가 (soft agar) 콜로니-형성능력은 14-3-3γ가 발현되지 않은 세포보다 월등하였다 (도 4b). 이 실험에서 14-3-3β를 양성 대조군으로 사용하였다. 이것은 14-3-3β와 같이 14-3-3γ도 앵커러지(anchorage)-의존적인 성장을 촉진할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 능력은 NIH3T3 세포 내로 14-3-3의 다른 이소폼(isoform)들을 과발현 했을 때는 나타나지 않았던 특징이었다 (도 4c). 14-3-3의 β와 γ만 foci 형성능을 보였다. 이런 결과는 Ba/F3 세포에서 인터루킨-3에 의해 유도된 14-3-3γ는 성장 요인이 결핍된 곳에서의 생존뿐만 아니라 세포 증식을 촉진한다는 것을 의미한다. NIH3T3 세포에서 포커스 형성과 앵커러지-의존적 증식을 촉진하는 14-3-3γ 과발현은 세포 형질전환의 요인으로 작용할 수 있음을 의미하는 것이다.

실시예 7: 14-3-3γ를 과발현하는 Ba/F3 세포는 면역 결핍 쥐에서 발암성을 나타냄

14-3-3γ를 과발현시킨 Ba/F3 세포가 인 비보(in vivo)에서 발암성 세포인지를 확인하기 위해서 SCID-NOD 쥐 피하에 주사하였다. 주사된 쥐 (inoculated mice)는 종양이 발생하였으며 (도 5a), 주입 후 6주 이내에 평균 30mm 크기를 나타냈다 (도 5b). 대조적으로, 공벡터가 도입된 Ba/F3 세포가 주입된 쥐에서는 12주 후에도 종양이 형성되지 않았다. Myc, 14-3-3γ, PCNA와 p53의 발현 확인을 위해 14-3-3γ를 과발현하는 Ba/F3 세포에 의해 형성된 종양을 절개하여 면역조직학 분석을 실시하였다. 종양세포의 50% 이상에서 Myc, 14-3-3γ, PCNA의 핵 내 발현이 확인되었지만 (도 5C, <b> - <d>), p53은 일부 세포에서만 확인되었다 (도 5c, <e> 부위). 인 비보에서 14-3-3γ의 과발현이 Ba/F3 세포의 발암을 야기함을 의미한다.

실시예 8: Ba/F3에서 14-3-3γ 과발현이 세포 증식, 생존과 세포 주기 조절 요소에 미치는 효과

14-3-3 단백질들은 모든 진핵 세포에서 단백질 카이네이즈 신호전달 (protein kinase signaling) 기작에 관여하는 편재된 분자 패밀리이다. 포스포세린/포스포쓰레오닌-결합 모듈(modules)로서의 기능을 하는 14-3-3 단백질들은 세포 주기 진행 (cell cycle progression)과 DNA 손상 체크 포인트 (DNA damage check points), 세포 사멸 (apoptosis), 세포증식 (cell proliferation)과 생존 (survival)의 개시와 유지하는 등의 다른 과정들을 조절하는 인산화-의존적인 단백질-단백질 상호작용에서 역할을 한다. 14-3-3γ 과발현이 MAP 키나제 신호 캐스케이드 (MAP kinase signaling cascade)에 영향을 주는지를 조사하기 위해서 형질도입된 세포의 추출액을 PI3K, Akt, MEK1, p-ERK, p-p38, p-JNK 또는 ηPKC 특이적 항체들을 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 테스트하였다. 14-3-3γ 과발현에 의한 이들 유전자의 과조절이 이전 실험들과 동일하게 나타났다 (도 6a). 이 결과는 이들 각 단백질들의 발현이, 공 벡터가 형질도입된 세포와 무처리된 세포와 비교하여, 14-3-3γ 과발현된 세포에서 증가하는 것을 나타낸다. 이는 14-3-3γ 과발현이 Ba/F3에서 PI3K와 MAP 카나제 신호전달 (kinase signaling) 양쪽 모두의 활성을 유도한다는 것을 설명한다.

실시예 9: Ba/F3 세포에서 14-3-3γ는 세포 사멸을 억제하고 증식 유도

사이토카인이 존재하지 않는 조건에서 헤마토포이에틱 (hematopoietic) 세포의 사멸은 Bcl-2 패밀리인 Bax와 Bad와 같은 프로-아폽토틱 (pro-apoptotic) 멤버의 활성에 의한 것이라는 추측을 하였다. 이전 보고들에서는 14-3-3γ보다 다른 14-3-3 패밀리들이 탈인산화와 프로-아폽토틱 단백질들의 세포질 분리 (cytoplasmic sequestration)에 의해 세포 사멸의 개시를 억제하는 것으로 보고되었다. Ba/F3 세포에서 14-3-3γ의 발현이 세포생존과 증식에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위해서 14-3-3γ가 과발현된 세포들을 공 벡터나 무크가 형질도입된 세포들과 비교하였다 (도 6b와 c). Ba/F3 세포에서 14-3-3γ가 넉-다운된 경우는 무크가 형질도입된 Ba/F3와 비교했을 때 생존률이 현저히 떨어졌으며, 가장 높은 생존률은 14-3-3γ가 과발현된 경우였다 (도 3c와 6c). 면역블로팅(Immunoblotting) 분석으로 이러한 샘플에서 Bax와 Bad와 같은 프로 아톱토틱(pro-apoptotic) 멤버들이 발현이 증가한다는 것이 밝혀졌다 (도 6d). 이런 결과들로부터, 14-3-3γ가 인터루킨-3 의존적인 Ba/F3 세포에서 생존과 증식에 관여한다는 것을 나타낸다.

실시예 10: 14-3-3γ 특이적 siRNA의 강력 발현은 백혈구 세포들의 생존을 억제

14-3-3γ의 7개 아형들 중 14-3-3γ가 조혈모세포(hematopoietic cell) 의신생물 (neoplasms)을 밝히는데 어떻게 관여하는지를 더 조사하기 위해서, 인간 적백혈병 (erythroleukemia) 세포인 K562와 쥐 림프성백혈병(lymphocytic leukemia) 세포인 L1210과 쥐 T 림프종 (lymphoma) 세포인 EL4를 선택하여, 14-3-3γ와 특이적인 siRNA를 형질도입되었다. Ba/F3에서 보여진 것과 같이, 14-3-3γ 특이적인 siRNA의 강력한 발현은 3개 세포에서 14-3-3γ의 발현을 감소시키고 (도 7a), 세포 사멸을 유도하였다. 반면에 14-3-3γ의 과발현은 증식을 증가시켰다 (도 7b-d). 이것은 림프종 세포들에서 14-3-3γ 발현을 하향 또는 상향 조절하는 것이 각각 세포 사멸과 세포 증식을 유도한다는 것을 보인다.

본 발명의 14-3-3감마 안타고니스트, 특히 14-3-3감마 특이적 siRNA 또는 이를 발현하는 벡터를 포함하는 본 발명의 조성물은 14-3-3감마 증가와 관련된 질병, 구체적으로 종양의 개선 및 치료를 위해 의학적, 수의학적 분야에서 이용이 기대된다.

도 1은 B-임파구 세포에서 IL-3에 의해 유도된 단백질들의 2-DE 분석을 나타낸다. (a) 단백질 샘플 (100ug)들은 2-DE 젤에서 분리되었고 <a>와 <b> 쿠마시 블루로 염색하였다. IL-3에 의해 유도된 단백질들은 구역화된 <c>, <d>와 <e> 부위에 위치하고 있다. 총 11개의 단백질들이 IL-3에 의해 유도되었다. 화살표는 대조군보다 강하게 유도된 단백질들을 나타낸다. 분자량은 왼편에 kDa으로 나타내었다. (b) 실시간 중합효소연쇄반응으로 조사된 14-3-3γ의 전사 수준은 물리적 밀도법(densitometric) 분석으로 정량화하였으며 GAPDH 전사 생성물의 수준으로 표준화하였다. 값은 세 번의 독립된 실험의 ±SEM으로 나타내었다.

도 2는 IL-3가 처리군과 비처리군 상태의 B-임파구 세포에서 전사와 번역 수준에서 14-3-3γ의 분석 및 세포 성장률의 변화를 나타낸다. (a) IL-3를 처리하고 처리하지 않은 배양 상태의 B-임파구 세포에서 14-3-3γ와 β-액틴의 수준을 알아보기 위한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. (b) B-임파구 세포를 IL-3가 포함된 배양액과 포함되지 않은 배양액에서 배양하였다. 생존한 세포의 수는 트립판 블루 배제(exclusion)법에 의해 관찰하였다. 값은 세 번의 독립된 실험의 ±SEM으로 나타내었다. (c) 14-3-3γ와 GAPDH 전사 생성물의 상대적인 양은 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 조사하였고 비처리된 B-임파구 세포와 공벡터, myc-14-3-3γ, siRNA-14-3-3γ가 형질도입된 B-임파구에서의 14-3-3γ와 β-액틴 단백질은 myc, 14-3-3γ과 β-액틴의 특이적인 항체를 사용하여 확인하였다.

도 3은 일차골수세포(primary bone marrow cell)에서 IL-3에 의한 14-3-3γ 발현의 과조절을 나타낸다. (A)와 (B)는 역전사 중합효소연쇄 반응과 실시간 중합효소연쇄 반응에 의해 조사된 14-3-3γ의 전사 생성물은 밀도 (densitometric) 분석에 의해 정량화되었고 GAPDH 전사 생성물의 수준으로 표준화하였다. 값은 세 번의 독립된 실험의 ±SEM으로 나타내었다. (C) IL-3의 처리와 비처리된 상태에서 B-임파구 세포에서 14-3-3γ와 β-액틴의 수준을 알아보기 위한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. (D) PMB 세포는 IL-3가 포함된 배양액에서 배양된 후 IL-3 없는 배양액에서 3일 동안 배양되었다. 생존한 세포의 수는 트립판 블루법으로 매일 조사되었다. 값은 세 번의 독립된 실험의 ±SEM으로 나타내었다.

도 4는 14-3-3γ와 14-3-3β가 안정적으로 발현하는 NIH3T3 세포의 포커스-형성과 콜로니-형성을 보여준다. (a) 공벡터, 14-3-3γ, 14-3-3β와 14-3-3γ 특이적인 siRNA가 안정적으로 발현된 NIH3T3 세포는 줄어든 시럼 (2.5% FBS) 배양액에서 배양하였다. 10일 후, 세포가 바닥 전체에 꽉 찬 곳에서 처음으로 foci가 나타났다. 현미경 사진은 17일째를 보여주고 있다. (b) 소프트 아가 콜로니 (soft agar colony)-형성법을 나타낸다. 공벡터만 형질도입된 NIH3T3 세포와 각각이 안정적으로 발현하는 NIH3T3 세포를 배양액에 각각 뿌렸다. 콜로니 수는 2주 후에 정량화하였다. 값은 다섯 번의 독립된 실험의 ±SEM으로 나타내었다. (c) 2.5% 저 시럼 배양액에서 14-3-3 아형(isoform)들이 안정적으로 발현하는 NIH3T3 세포의 콜로니 형성 활성도를 나타낸다. 값은 세 번의 독립된 실험의 ±SEM으로 나타내었다.

도 5은 공벡터와 14-3-3γ가 안정적으로 형질도입된 B-임파구 세포의 종양 유도 활성을 나타낸다. (a)와 (b)는 공벡터와 14-3-3γ이 안정적으로 형질도입된 B-임파구 세포는 5마리의 SCID-NOD 마우스로 피하 주사되었다. 5주 후에 종양(tumor)의 크기는 25에서 36 ㎣ 범위였다. (c) 14-3-3γ에 의해 종양이 형성된 B-임파구 세포는 헤마토실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)에 의해 염색되었고, 대조군은 <a>에서 보여지며 <b>는 myc, <c>는 14-3-3γ, <d>는 PCNA, <e>는 p53 항체로 반응하였다.

도 6은 B-임파구 내에서 IL-3 신호전달 과정의 여러 요인들에 대한 14-3-3γ의 효과를 나타낸다. (a)는 14-3-3γ와 siRNA가 형질도입된 B-임파구 세포에서 PI3K, Akt, MEK1, ηPKC, p-p44/p42, p-p38, p-JNK와 β-액틴 항체를 이용하여 각각 발현을 확인하였다. (b) 형질 도입된 B-임파구 세포에서 세포 사멸에 대한 IL-3 결핍의 효과를 나타낸다. (c) 14-3-3γ와 siRNA가 형질도입된 B-임파구 세포에서 Bad, Bax와 β-액틴 항체를 이용하여 각각 발현을 확인하였다.

도 7은 인간과 마우스의 조혈 암 세포들에서 14-3-3γ의 과발현과 넉-다운의 효과를 나탄내다. K563, L1210과 EL4 세포로부터 준비된 추출물을 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 각각의 안정화된 형질도입 후에 myc, 14-3-3γ와 β-액틴 항체를 이용하였다. 살아있는 세포들은 트립판 블루로 염색하여 매일 확인하였다. 값은 세 번의 독립된 실험의 ±SEM으로 나타내었다.

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition comprising 14-4-4gamma antagonist <130> P08-273 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for 14-3-3gamma <400> 1 gccacugucc aacgaggaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense strand of siRNA for 14-3-3gamma <400> 2 guuccucguu ggacaguggc 20

Claims (8)

14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물.

제 1항에 있어서,

상기 14-3-3감마 안타고니스트가 14-3-3감마 특이적 항체, 펩타이드, 안티센스 핵산 또는 siRNA인 조성물.

제 2항에 있어서,

상기 siRNA는 (i) 14-3-3감마의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및 센스 RNA 가닥에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하는 이중사슬 siRNA, 또는 (ii) 상기 이중사슬 siRNA를 코딩하는 벡터를 포함하는 항종양 조성물.

제 3항에 있어서,

상기 siRNA는 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥을 가지는 조성물.

14-3-3감마 안타고니스트를 포함하는 항종양 조성물을 처리하여 종양 세포를 억제하는 방법.

제 5항에 있어서,

상기 14-3-3감마 안타고니스트가 14-3-3감마 특이적 항체, 펩타이드, 안티센스 핵산 또는 siRNA인 방법.

제 6항에 있어서,

상기 siRNA는 (i) 14-3-3감마의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및 센스 RNA 가닥에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하는 이중사슬 siRNA, 또는 (ii) 상기 이중사슬 siRNA를 코딩하는 벡터를 포함하는 방법.

제 7항에 있어서,

상기 siRNA는 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥을 가지는 방법.

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