KR20170096199A - Kras 돌연변이와 관련된 악성 종양을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Kras 돌연변이와 관련된 악성 종양을 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20170096199A
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겐지로우 미노미
바라트 마제티
리 왕
지화 리우
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닛토덴코 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 포유동물에서의 종양 세포 확인에 의해 (종양 세포는 다음의 것 중 하나 이상을 포함함: (i) KRAS 유전자의 돌연변이, 및 (ii) KRAS 단백질의 비정상적인 발현 수준); 및 GST-π 의 발현을 감소시키는데 있어서 활성인 하나 이상의 RNAi 분자를 포함하는 조성물의 치료적 유효량의 포유동물에 대한 투여에 의해, 그를 필요로 하는 포유동물에서의 KRAS 돌연변이와 관련된 악성 종양의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

KRAS 돌연변이와 관련된 악성 종양을 치료하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING MALIGNANT TUMORS ASSOCIATED WITH KRAS MUTATION}
본 발명은 핵산 기반 분자로 구성된 생물의약품 및 치료제 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 암 세포가 KRAS 돌연변이를 함유하거나 일탈적인 KRAS 발현 수준을 나타내는, KRAS-관련 암을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 종양 치료요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GST-π 의 발현을 저해하기 위한 하나 이상의 RNAi 분자를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
서열 목록
본원은 100,000 바이트 크기인, ND5123946WO_SL.txt 로 명명된 2015 년 12 월 20 일에 생성된 ASCII 파일로서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이것은 그로써 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (IUBMB EC 2.5.1.18) 는 감소된 글루타티온을 갖는 많은 소수성 및 친전자성 화합물의 접합을 촉매화시킴으로써 해독에 있어서 중요한 역할을 하는 효소 패밀리이다. 그의 생화학적, 면역학적 및 구조적 특성에 따라, 가용성 GST 는 4 개 주요 클래스: 알파, 뮤 (mu), 파이 (pi) 및 쎄타 (theta) 로 분류된다. 이들 형태 중 일부는 근접한 또는 최종적인 발암 물질, 특히 마이클 (Michael) 반응 수용체, 디페놀, 퀴논, 이소티오시아네이트, 퍼옥시드, 인접 디메르캅탄 등을 포함하는 친전자제를 해독함으로써 발암을 예방하는 작용을 하는 것으로 제시된다. 그러나 신생물성 세포에서, 특정 형태가 발현되는 것으로 공지되어 있으며 이는 항암 약물에 대한 그의 저항성에 관여하는 것으로 공지된 바 있다.
글루타티온 S-트랜스퍼라아제-π 유전자 (GSTP1) 는 생체이물 대사에 있어서 기능하며 암에 대한 감수성에 있어서 그 역할을 하는 것으로 여겨지는 활성, 기능적으로 상이한 GSTP1 변이체 단백질을 인코딩하는 다형성 유전자이다. 이는 종양 세포에서 다량으로 발현된다. 예를 들어, [Aliya S. et al. Mol Cell Biochem., 2003 Nov; 253(1-2):319-327] 을 참고한다. 글루타티온 S-트랜스퍼라아제-P 는 인간에서 GSTP1 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. 예를 들어, [Bora PS, et al. (Oct 1991) J. Biol. Chem., 266 (25): 16774-16777] 을 참고한다. GST-π 동종효소는 일부 알킬화 항암제와의 GSH 의 접합을 촉매화하는 것으로 나타났는데, 이것은 GST-π 의 과발현이 종양 세포 저항성을 초래할 것임을 제시한다.
상승한 혈청 GST-π 수준이 위, 식도, 결장, 췌장, 간세포 및 담관 암을 포함하는 다양한 위장 악성 종양을 갖는 환자에서 관찰되었다. 양성 위장 질환을 갖는 환자는 정상 GST-π 를 갖지만, 만성 간염 및 간경변을 갖는 일부 환자는 약간 상승한 수준을 가졌다. 병기 III 또는 IV 위암을 갖는 환자의 80% 초과 및 병기 I 및 II 위암을 갖는 환자의 약 50% 는 상승한 혈청 GST-π 를 가졌다. 예를 들어, [Niitsu Y, et al. Cancer, 1989 Jan 15; 63(2):317-23] 을 참고한다. 혈장 중 상승한 GST-π 수준이 구강암 환자에서 관찰되었으나, 양성 구강 질환을 갖는 환자는 정상 GST-π 수준을 가졌다. GST-π 는 화학요법에 대한 반응을 평가하기 위한, 수술후 종양 절제 가능성 또는 종양 크기를 모니터링하기 위한, 그리고 구강암 환자에서의 종양 재발을 예측하기 위한 유용한 마커인 것으로 발견되었다. 예를 들어, [Hirata S. et al. Cancer, 1992 Nov 15:70(10):2381-7] 을 참고한다.
면역조직화학 연구는 선암종 또는 편평상피 세포 암종으로서 조직학적으로 분류된 많은 암이 GST-π 를 발현한다는 것을 밝혀내었다. 혈장 또는 또는 혈청 GST-π 수준은 위장관 암을 갖는 환자의 30-50% 에서 증가한다. 이러한 형태는 또한 시스플라틴 및 다우노루비신과 같은 항암 약물에 대한 저항성에 관여하는 것으로 제시되며, 암 조직에서의 이의 발현은 암 환자에서의 예후값일 수 있다.
정상 인간 KRAS 유전자 (V-Ki-ras2 Kirsten 랫트 육종 바이러스 종양 유전자 동족체) 의 단백질 생성물은 정상 조직에서 신호전달 기능을 수행하며, KRAS 유전자의 돌연변이는 많은 암의 발생에서의 추정 단계이다. 예를 들어 [Kranenburg O, Nov 2005, Biochim. Biophys. Acta, 1756(2):81-82] 를 참고한다. KRAS 단백질은 GTPase 이며 몇몇 신호 전달 경로에 관련된다. KRAS 는 성장 인자의 전파에 필요한 단백질 및 c-Raf 및 PI 3-키나아제와 같은 다른 수용체의 신호를 활성화시키는 분자적 온/오프 (on/off) 스위치로서 작용한다.
KRAS 에서의 돌연변이는 악성 종양, 예컨대 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 유관 암종, 및 결장직장 암종에 관련될 수 있다. 인간 결장직장암에서, KRAS 돌연변이는 AP-1 의 활성화를 통해 GST-π 의 과발현을 유도하는 것으로 나타난다. 예를 들어, [Miyanishi et al., Gastroenterology, 2001; 121 (4):865-74] 를 참고한다.
돌연변이체 KRAS 는 결장암 (Burmer GC, Loeb LA, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86(7):2403-2407), 췌장암 (Almoguera C, et al., 1988, Cell, 53(4):549-554) 및 폐암 (Tam IY, et al., 2006, Clin. Cancer Res., 12(5):1647-1653) 에서 발견된다. KRAS 는 폐 선암종에서 RAS 돌연변이의 90% 를 차지한다 (Forbes S, et al. Cosmic 2005. Br J Cancer, 2006; 94:318-322).
KRAS 유전자는 또한 결장직장암에서 증폭될 수 있다. KRAS 증폭은 KRAS 돌연변이와 상호 배타적일 수 있다. 예를 들어, [Valtorta E, et al., 2013, Int. J. Cancer, 133(5):1259-65] 를 참고한다. 야생형 KRAS 의 증폭은 또한 난소암, 위암, 자궁암 및 폐암에서 관찰되었다. 예를 들어, [Chen Y, el al., 2014, PLoS ONE, 9(5):e98293] 을 참고한다.
GST-π 의 발현은 다양한 암 세포에서 증가하는데, 이는 일부 항암제에 대한 저항성과 관련될 수 있다. 예를 들어 [Ban et al., Cancer Res., 1996, 56(15):3577-82; Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther., 2003, 306(3):861-9] 를 참고한다.
GST-π 를 억제하는 작용제가 세포에서 세포자멸사를 유도하기 위해 개시되어 있다. 그러나, 이러한 조성물 및 기술은 또한 자가포식을 야기하였으며 다양한 작용제의 조합된 작용을 필요로 하였다. 예를 들어, US 2014/0315975 A1 을 참고한다. 또한, GST-π 를 억제하는 것은 종양을 수축시키거나 감소시키는 것으로 발견되지는 않았다. 예를 들어 GST-π 를 과발현한 암에서, 종양의 중량은, 다른 효과가 관찰되었음에도 불구하고 GST-π 의 억제에 의해 영향받지 않았다. 예를 들어, [Hokaiwado et al., Carcinogenesis, 2008, 29(6):1134-1138] 를 참고한다.
KRAS 관련 악성 종양을 갖는 환자에 대한 치료요법을 개발하기 위한 방법 및 조성물이 시급히 필요하다.
악성 종양을 예방 또는 치료하기 위한 방법 및 조성물이 필요하다. 악성 종양을 예방, 치료, 감소 또는 수축시키기 위한 RNAi 분자, 및 기타 구조 및 조성물이 계속해서 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 GST-π 의 siRNA 저해제로의 처리에 의해 악성 종양 크기가 생체내에서 감소될 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다.
일부 구현예에서, KRAS 돌연변이를 함유하거나 일탈적인 KRAS 발현 수준을 나타내는 악성 종양은 GST-π 의 발현을 조절하는 siRNA 작용제로의 처리에 의해 감소될 수 있다.
본 발명은 악성 종양에 대항하는 핵산 기반 치료 화합물에 대한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 GST-π 의 발현을 침묵화시킬 수 있는 RNAi 분자, 구조 및 조성물을 제공한다. 본 개시물의 구조 및 조성물은 악성 종양의 예방, 치료 또는 그 크기의 감소에 사용될 수 있다.
본 발명은 대상에서의 신조직형성 (neoplasia) 을 치료하는데 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 원치않는 자가포식이 없는, KRAS-관련 신조직형성을 치료하기 위해 GST-π 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시킬 수 있는 치료 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 GST-π 핵산 분자의 적어도 단편에 상응하거나 상보적이고 세포에서 GST-π 발현을 감소시키는 저해성 핵산 분자를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포에서 GST-π 발현을 감소시키는 GST-π 핵산 분자의 적어도 단편에 상응하거나 상보적인 이중-가닥 저해성 핵산 분자를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 이다.
일부 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 저해성 핵산 분자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 추가 구현예에서, 벡터는 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 프로모터를 함유할 수 있다. 추가적인 구현예는 KRAS 돌연변이를 함유하거나 일탈적인 KRAS 발현 수준을 나타내는 암 세포를 포함하는데, 이는 또한 상기 측면 중 임의 하나의 저해성 핵산 분자, 또는 벡터를 함유할 수 있다. 추가 구현예에서, 세포는 생체내 신생물성 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 KRAS 돌연변이를 함유하거나 일탈적인 KRAS 발현을 나타내는 악성 종양 세포에서의 GST-π 발현을 감소시키는 방법을 포함한다. 방법은 GST-π 핵산 분자의 적어도 일부에 상응하거나 상보적인 저해성 핵산 분자의 유효량을 세포와 접촉시키는 것을 포함할 수 있는데, 여기서 저해성 핵산 분자는 GST-π 폴리펩티드의 발현을 저해함으로써 세포에서 GST-π 발현을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 저해성 핵산 분자는 안티센스 핵산 분자, 소 간섭 RNA (siRNA), 또는 이중-가닥 RNA (dsRNA) (유전자 발현 저해에 대해 활성임) 일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 방법은 악성 종양에서 GST-π 전사 또는 번역을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 악성 종양 세포에서 GST-π 발현을 감소시키는 방법을 포함하며, 여기서 세포는 인간 세포, 신생물성 세포, 생체내 세포, 또는 시험관내 세포일 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 신생물을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공할 수 있으며, 여기서 신생물 암 세포는 KRAS 돌연변이를 함유하거나 일탈적인 KRAS 발현 수준을 나타낸다. 방법은 GST-π 핵산 분자에 상응하거나 상보적인 저해성 핵산 분자의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있는데, 여기서 저해성 핵산 분자는 GST-π 발현을 감소시킴으로써 신생물을 치료한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 치료 전 또는 무-치료의 신생물 크기에 관하여 신생물의 크기를 감소시킬 수 있다.
다양한 구현예에서, 저해성 핵산 분자는 리포솜, 중합체, 미소구체, 나노입자, 유전자 치료요법 벡터, 또는 네이키드 (naked) DNA 벡터로 전달될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 신생물 암 세포가 KRAS 돌연변이를 함유하거나 일탈적인 KRAS 발현 수준을 나타내는, 신생물을 갖는 대상, 예를 들어 인간 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 방법은 유효량의 저해성 핵산 분자를 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 저해성 핵산 분자는 안티센스 핵산 분자, siRNA, 또는 dsRNA (GST-π 폴리펩티드의 발현을 저해함) 이다.
특정 구현예에서, 신생물의 세포는 GST-π 를 과발현한다.
특정 구현예에서, 신생물은 악성 종양, 또는 폐암, 또는 췌장암일 수 있다.
본 발명의 구현예는 하기를 포함한다:
KRAS 유전자에서의 돌연변이 또는 야생형 KRAS 유전자의 과발현과 관련된 종양의 치료 또는 치료요법을 위한 약학 조성물, 상기 조성물은 RNAi 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하고, 여기서 상기 RNAi 분자는 GST-π 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함함.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 GST-π mRNA 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 듀플렉스 부위를 갖는 RNAi 분자를 포함한다.
특정 측면에서, RNAi 분자는 유전자 발현 억제에 대해 활성인 siRNA 또는 shRNA 이다.
약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제 예컨대 하나 이상의 지질 화합물을 포함할 수 있다. 지질 화합물은 지질 나노입자를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 지질 나노입자는 RNAi 분자를 캡슐화할 수 있다.
본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물에서의 KRAS 돌연변이와 관련된 악성 종양의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 방법을 추가로 고려하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
포유동물에서의 종양 세포를 확인하는 단계로서, 종양 세포가 다음의 것 중 하나 이상을 포함하는 단계: (i) KRAS 유전자의 돌연변이, 및 (ii) KRAS 단백질의 비정상적인 발현 수준; 및
GST-π 의 발현을 감소시키는데 있어서 활성인 하나 이상의 RNAi 분자를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계.
이러한 방법에서, 포유동물은 인간일 수 있으며, GST-π 는 인간 GST-π 일 수 있다. RNAi 분자는 siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 일 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 듀플렉스 부위를 가질 수 있는데, 듀플렉스 부위는 GST-π mRNA 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. RNAi 분자는 포유동물에서 GST-π 의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 투여는 포유동물에서 GST-π 의 발현을 5 일 이상 동안 5% 이상 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 투여는 포유동물에서 악성 종양의 용적을 5% 이상, 또는 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상 감소시킬 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 방법은 악성 종양의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 악성 종양의 진행 또는 성장을 지연 또는 종료시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 투여는 대상에서 악성 종양 세포의 성장을 감소시킬 수 있다. 투여는 대상에서 2% 이상, 또는 5% 이상, 또는 10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상 악성 종양 세포에 대한 성장을 감소시킬 수 있다.
일반적으로, 종양 세포는 정상 세포와 비교하여 야생형 KRAS 단백질의 증가한 발현 수준을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 야생형 GST-π RNA 또는 단백질을 과발현한다.
특히, 종양 세포는 잔기 12, 13 및 61 중 하나 이상에서 KRAS 단백질에서의 돌연변이를 가질 수 있다.
본 발명은 KRAS 단백질에서의 돌연변이를 가질 수 있는 종양 세포를 고려하며, 종양은 폐암, 결장암 및 췌장암에서 선택되는 암일 수 있다.
일부 구현예에서, 종양 세포는 KRAS 단백질에서의 돌연변이를 가질 수 있으며, 종양은 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 유관 암종, 및 결장직장 암종으로 이루어지는 군에서 선택되는 육종일 수 있다. 특정 구현예에서, 악성 종양은 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 유관 암종, 결장직장 암종, 유방암, 및 섬유육종의 군에서 선택되는 육종일 수 있다. 또한, 악성 종양은 폐, 결장, 췌장, 담낭, 간, 유방, 및 이들의 임의의 조합의 군에서 선택되는 해부학상 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 측면은 투여가 1 일 당 1 내지 12 회 수행되는 방법을 제공할 수 있다. 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일의 지속 기간 동안 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 12 주의 지속 기간 동안 수행될 수 있다.
투여를 위한 용량은 최대 12 주의 기간 동안 1 일 당 1 회 이상의, 0.01 내지 2 mg/kg 의 RNAi 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 GST-π RNAi 분자에 대해 1 내지 1000 ㎍*분/㎖ 의 평균 AUC(0-마지막) 및 0.1 내지 50 ㎍/㎖ 의 평균 Cmax 를 제공할 수 있다.
투여는 정맥내 주사, 진피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경구, 국소, 주입, 또는 흡입에 의한 것일 수 있다.
이들 및 다른 측면은, 본 개시물의 신규한 개념의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않고 변화 및 변형이 이루어질 수 있지만, 하기 도면과 함께 주어진 구현예의 하기 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1: 도 1 은 GST-π 에 대해 표적화된 본 발명의 siRNA 에 의한 동소이식 폐암 종양의 생체내 큰 감소를 나타낸다. GST-π siRNA 는 A549 동소이식 폐암 종양을 나타내는 무흉선 누드 마우스에 2 mg/kg 의 용량으로 리포솜 제형으로 투여되었다. 최종 원발성 종양 중량을 치료군 및 비히클 대조군에 대한 부검에서 측정하였다. GST-π siRNA 는 이러한 6-주 연구에서 폐암 종양의 저해를 위한 유의미한 효능을 나타내었다. 도 1 에 나타낸 바와 같이, 43 일 후, GST-π siRNA 는 현저히 유리한 종양 저해를 나타내었는데, 최종 원발성 종양 평균 중량은 대조군에 비해 2.8 배로 유의미하게 감소하였다.
도 2: 도 2 는 GST-π siRNA 에 대한 생체내 종양 저해 효능을 나타낸다. 0.75 mg/kg 에서의 상대적으로 저용량의 siRNA 로, A549 세포를 사용하는 암 이종이식 모델을 이용하였다. GST-π siRNA 는 며칠 내에 유리한 종양 저해를 나타내었다. 36 일 후, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 저해를 나타내었는데, 최종 종양 평균 용적은 대조군에 비해 약 2 배로 유의미하게 감소하였다.
도 3: 도 3 은 도 2 의 종료점에서 GST-π siRNA 에 대한 생체내 종양 저해 효능을 나타낸다. GST-π siRNA 는 2 배 초과로 평균 종양 중량이 감소하여, 유리한 종양 저해를 나타내었다.
도 4: 도 4 는 본 발명의 GST-π siRNA 가 시험관내 세포자멸사에 의한 암 세포사를 크게 증가시켰다는 것을 나타낸다. GST-π siRNA 는 세포 생존력에서의 손실과 관련되는, 세포자멸사에 대한 바이오마커인 PUMA 의 상향조절을 초래하였다. 도 4 에서, PUMA 의 발현은 GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 2-6 일에 크게 증가하였다.
도 5: 도 5 는 본 발명의 GST-π siRNA 가 A549 이종이식 종양에 대한 생체내 녹다운 (knockdown) 효능을 제공하였다는 것을 나타낸다. GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 를 갖는 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스 (Charles River) 에서 관찰되었다. 도 5 에서 나타낸 바와 같이, 4 mg/kg 의 용량에서, GST-π mRNA 에서의 약 40% 의 유의미한 감소가 주사 24 시간 후 검출되었다.
도 6: 도 6 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 췌장암 이종이식 종양을 생체내 저해하였다는 것을 나타낸다. GST-π siRNA 는, 6 내지 8 주령 무흉선 누드 암컷 마우스에서의 췌장암 이종이식 종양에 리포솜 제형으로 투여시, 생체내 유전자 침묵화 효력을 제공하였다. 도 6 에서 나타낸 바와 같이, GST-π 에 대해 표적화된 0.375 mg/kg 내지 3 mg/kg 범위 용량의 siRNA 로 용량 반응이 수득되었다. GST-π siRNA 는 투여 후 며칠 내에 유리한 종양 저해를 나타내었으며, 종양 용적은 종료점에서 약 2 배로 감소된다.
도 7: 도 7 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 증가한 혈청 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다. 도 7 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 센스 가닥 (도 7, 상부) 및 안티센스 가닥 (도 7, 하부) 모두에 대한 혈청 중 반감기 (t½) 는 약 100 분이었다.
도 8: 도 8 은 본 발명의 GST-π siRNA 가 혈장 중 제형에서의 향상된 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다. 도 8 은 PBS 중 50% 인간 혈청에서의 GST-π siRNA 의 리포솜 제형 인큐베이션, 및 다양한 시점에서의 잔여 siRNA 검출을 나타낸다. 도 8 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 제형의 혈장 중 반감기 (t½) 는 100 시간보다 유의미하게 더 길었다.
도 9: 도 9 는 GST-π siRNA 의 가이드 가닥 (guide strand) 에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 9 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운은, 효과를 나타내지 않은 스크램플된 서열을 갖는 대조군에 비해 대략 지수적이었다.
도 10: 도 10 은 도 9 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥 (passenger strand) 에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 10 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 에 대한 패신저 가닥 오프 타겟 (off target) 녹다운은, 본질적으로 효과 없이, 크게 감소하였다.
도 11: 도 11 은 몇몇 고활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 11 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운 활성은 대략 지수적이었다.
도 12: 도 12 는 도 11 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 12 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 에 대한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운 활성은, 약 500 pM 미만으로 유의미하게 감소하였다.
도 13: 도 13 은 고활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 13 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 의 가이드 가닥 녹다운 활성은 대략 지수적이었다.
도 14: 도 14 는 도 13 의 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 나타낸다. 도 14 에서 나타낸 바와 같이, GST-π siRNA 에 대한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운 활성은 유의미하게 감소하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 대상에서의 신조직형성 치료를 위해 GST-π 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키는 치료 조성물을 이용하는 방법을 제공하며, 여기서 신조직형성은 KRAS 돌연변이를 함유하거나 일탈적인 KRAS 발현 수준을 나타내는 세포와 관련된다.
본 발명의 치료 조성물은 저해성 핵산 분자 예컨대 siRNA, shRNA 및 안티센스 RNA 를 포함할 수 있다.
GST-π 는 GSTP1 유전자에 의해 인코딩되며 글루타티온 접합을 촉매화하는 효소를 나타낸다. GST-π 는 인간을 비롯하여 다양한 동물에 존재하고, 이의 서열 정보는 공지되어 있으며 NCBI 데이터베이스 등록 번호 (예를 들어, 인간: NP_000843 (NM_000852), 랫트: NP_036709 (NM_012577), 마우스: NP_038569 (NM_013541) 등) 에서 제공된다.
"GST-π 폴리펩티드" 는 GST-π 코딩 서열에 의해 인코딩된 단백질의 일부 이상과 실질적으로 동일한 단백질 또는 단백질 변이체, 또는 이의 단편을 의미한다. "GST-π 핵산 분자" 는 GST-π 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
생물학적 개인 사이의 유전자 서열 또는 아미노산 서열의 돌연변이 발생은 단백질의 생리학적 기능을 손상시키지 않을 수 있다. 본 발명에서 GST-π 및 GSTP1 유전자는 본원에 열거된 GST-π 서열과 동일한 서열을 갖는 단백질 또는 핵산에 제한되지 않으며, 하나 이상의 아미노산 또는 염기, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산 또는 염기에 의해 상기 서열과 상이한 서열을 갖지만 공지된 GST-π 와 동등한 기능을 갖는 것들을 포함할 수 있다.
인간 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 유전자 (GST-π) 의 서열, 완전 CDS, GenBank 등록 번호: U12472 를 표 1 에 나타낸다.
표 1: 인간 GST-π 유전자의 완전 서열. (SEQ ID NO: 1)
Figure pct00001
Figure pct00003
본원에서 KRAS-관련 악성 종양 또는 KRAS-관련 암은 (a) 체세포 KRAS 돌연변이를 함유하는 암 세포 또는 종양 세포, 또는 (b) KRAS 인코딩 DNA 의 증폭, 또는 KRAS 유전자의 과발현, 또는 KRAS 유전자의 저발현 (under-expression) (정상, 비-암 세포에서 발견된 수준과 비교시) 을 비제한적으로 포함하는, KRAS 의 비정상적 발현 수준을 갖는 암 세포 또는 종양 세포로서 정의된다.
표 2 는 KRAS 단백질의 아미노산 서열을 나타내며 암과 관련된 돌연변이를 확인시킨다.
표 2: 암과 관련된 KRAS 단백질 및 돌연변이의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2)
Figure pct00004
QIAGEN's THERASCREEN KRAS 시험은 결장직장암 세포에서 KRAS 유전자에서의 7 개 돌연변이의 존재를 검출하도록 설계된 유전적 시험이다.
치료 조성물
대상이 KRAS 돌연변이 또는 KRAS 증폭과 관련된 신조직형성, 예를 들어 폐암 또는 췌장암을 갖는 것으로 진단된 후, GST-π 의 억제를 포함하는 치료 방법이 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 저해성 핵산 분자는 약 1 내지 100 mg/kg, 예를 들어 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75, 또는 100 mg/kg 의 투약량으로 전신 투여된다.
추가 구현예에서, 투약량은 약 25 내지 500 mg/㎡/일 범위일 수 있다.
본원에서 사용한 바와 같은 GST-π 를 억제하는 작용제의 예는 GST-π 생성 및/또는 활성을 억제하는 약물, 및 GST-π 분해 및/또는 불활성화를 촉진하는 약물을 포함한다. GST-π 생성을 억제하는 약물의 예는 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, GST-π 를 인코딩하는 DNA 에 대한 DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 또는 이를 발현하는 벡터를 포함한다.
GST-pi 및 RNAi 분자
당업자는 보고된 서열이 경시적으로, 및 그에 따라 본원의 핵산 분자에 필요한 임의의 변화를 포함하도록 변화할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 구현예는 작은 핵산 분자를 사용하는 GST-pi 발현의 유전자 침묵화를 위한 조성물 및 방법을 제공할 수 있다. 핵산 분자의 예는 RNA 간섭에 있어서 활성인 분자 (RNAi 분자), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 포함한다. 이러한 분자는 GST-pi 유전자 발현에 대하여 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 대상에서의 다양한 종류의 악성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 방법은 GST-pi 를 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은, 독립적으로 또는 조합으로 GST-pi 단백질 및/또는 GST-pi 단백질을 인코딩하는 유전자, GST-pi 와 관련되는 질환, 병태 또는 장애, 예컨대 악성 종양의 유지 및/또는 발달과 관련된 GST-pi 를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조정하거나 제어할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 GST-pi 의 예시적인 서열과 관련하여 기재된다. 당업자는 본 발명의 다양한 측면 및 구현예가 임의의 관련된 GST-pi 유전자, 서열, 또는 변이체, 예컨대 동족체 유전자 및 전사 변이체, 및 다형성 (임의의 GST-pi 유전자와 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 포함) 에 대한 것이라는 점을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 GST-pi 유전자, 예를 들어 인간 GST-pi 의 발현을 하향 조절하는 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siRNA) 분자를 제공할 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는, 예를 들어 상보적 서열을 사용하거나 비-표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 동요 (wobble) 염기쌍 (추가적인 표적 서열을 제공할 수 있음) 을 혼입함으로써, GST-pi 및 임의의 상동 서열에 대해 표적화될 수 있다.
미스매치가 확인되는 경우, 비-표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 동요 염기를 사용하여, 하나 초과의 유전자 서열을 표적화하는 핵산 분자를 생성할 수 있다.
예를 들어, UU 및 CC 염기쌍과 같은 비-표준적 염기쌍을 사용하여, 서열 상동성을 공유하는 상이한 GST-pi 표적에 대한 서열을 표적화할 수 있는 핵산 분자를 생성할 수 있다. 따라서, RNAi 분자는 상동성 유전자 사이에 보존되는 뉴클레오티드 서열에 대해 표적화될 수 있으며, 단일 RNAi 분자를 사용하여 하나 초과의 유전자 발현을 저해할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 GST-pi mRNA 에 대하여 활성인 RNAi 분자를 포함하며, 여기서 RNAi 분자는 GST-pi 서열을 인코딩하는 임의의 mRNA 에 상보적인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시물의 RNAi 분자는 GST-pi RNA 에 대하여 활성을 가질 수 있으며, 여기서 RNAi 분자는 변이체 GST-pi 인코딩 서열을 갖는 RNA, 예를 들어 악성 종양과 관련되는 당업계에 공지된 돌연변이체 GST-pi 유전자에 상보적인 서열을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 GST-pi 유전자 발현의 침묵화를 매개할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 3 에 나타낸다.
표 3: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
표 3 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘을 지칭한다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 4 에 나타낸다.
표 4: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00008
Figure pct00009
표 4 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자는 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 5 에 나타낸다.
표 5: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00010
Figure pct00011
표 5 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 6 에 나타낸다.
표 6: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00012
Figure pct00013
표 6 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 7 에 나타낸다.
표 7: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00014
Figure pct00015
표 7 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
GST-π mRNA 에 대해 표적화된 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 8 에 나타낸다.
표 8: GST-π 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
표 8 에 대한 기호 설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 을 지칭한다. 밑줄 친 것은 2'-OMe-치환된 것을 지칭한다 (예를 들어, U). 소문자 f 는 2'-데옥시-2'-플루오로 치환을 지칭하며, 예를 들어 fU 는 2'-데옥시-2'-플루오로-U 이다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 변형된, 역전된, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, RNAi 분자는 RNA 간섭, 예컨대 비제한적으로, 듀플렉스 RNA 예컨대 siRNA (소 간섭 RNA), miRNA (마이크로 RNA), shRNA (짧은 헤어핀 RNA), ddRNA (DNA-유도 RNA), piRNA (Piwi-상호작용 RNA), 또는 rasiRNA (반복 관련 siRNA) 및 이의 변형된 형태를 초래하는 임의의 분자를 나타낸다. 이들 RNAi 분자는 상업적으로 입수가능하거나 공지된 서열 정보 등을 기반으로 설계되고 제조될 수 있다. 안티센스 핵산은 RNA, DNA, PNA, 또는 이의 복합체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로, 표적 유전자의 발현을 저해하는 DNA 및 RNA 로 구성된 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 작용제는 치료제로서 siRNA 를 함유한다. siRNA 분자는 약 10-50 개 이상 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 약 15-45 개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 약 19-40 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 19-23 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 표적 mRNA 에 대하여 RNAi 를 매개할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 설계 도구 및 키트, 예컨대 Ambion, Inc. (Austin, TX), 및 Whitehead Institute of Biomedical Research at MIT (Cambridge, MA) 에서 입수가능한 것들이 siRNA 의 설계 및 생성을 가능하게 한다.
GST-pi 를 조정하고 악성 종양을 치료하기 위한 방법
본 발명의 구현예는 GST-pi 및/또는 GST-pi 단백질의 발현을 하향 조절 또는 저해하는데 사용될 수 있는 RNAi 분자를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 악성 종양과 같은 질환 또는 병태와 관련될 수 있는 GST-pi 일배체형 다형성으로부터 비롯되는 GST-pi 및/또는 GST-pi 단백질의 발현을 하향 조절 또는 저해하는데 사용될 수 있다.
GST-pi 단백질 또는 mRNA 수준의 모니터링을 사용하여 유전자 침묵화를 특성분석하고, 본 발명의 화합물 및 조성물의 효능을 측정할 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 개별적으로, 또는 다른 siRNA 와의 조합으로 사용되어, 하나 이상의 유전자의 발현을 조정할 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 개별적으로, 또는 조합으로, 또는 다른 공지된 약물과 함께, 악성 종양을 포함하는 GST-pi 와 관련된 질환의 예방 또는 치료, 또는 병태 또는 장애의 증상의 완화를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는 GST-pi 의 발현을 서열-특이적 방식으로 조정 또는 저해하는데 사용될 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 가이드 가닥을 포함할 수 있으며, 가이드 가닥의 일련의 인접 뉴클레오티드는 GST-pi mRNA 에 적어도 부분적으로 상보적이다.
특정 측면에서, 악성 종양은 본 발명의 RNAi 분자를 사용하여 RNA 간섭에 의해 치료될 수 있다.
악성 종양의 치료는 적합한 세포 기반 모델 뿐만 아니라 생체외 또는 생체내 동물 모델에서 특성분석될 수 있다.
악성 종양의 치료는 병든 조직의 세포에서의 GST-pi mRNA 의 수준 또는 GST-pi 단백질의 수준을 측정함으로써 특성분석될 수 있다.
악성 종양의 치료는 병든 장기 또는 조직의 비-침습적 의료 스캐닝에 의해 특성분석될 수 있다.
본 발명의 구현예는 그를 필요로 하는 대상에서 GST-pi 관련된 질환 또는 병태의 증상을 예방, 치료, 또는 완화하는 방법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상에서 악성 종양의 증상을 예방, 치료, 또는 완화하는 방법은 대상에게 본 발명의 RNAi 분자를 투여하여 대상 또는 유기체에서 GST-pi 유전자의 발현을 조정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포 또는 유기체를 본 발명의 RNAi 분자와 접촉시킴으로써 세포 또는 유기체에서 GST-pi 유전자의 발현을 하향 조절하는 방법을 고려한다.
GST-π 저해성 핵산 분자는 GST-π 발현이 감소되도록 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 분자로서 이용될 수 있는 뉴클레오티드 올리고머일 수 있다. 한 접근 방식에서, GST-π 저해성 핵산 분자는 GST-π 유전자 발현의 RNA 간섭 (RNAi)-매개 녹다운에 사용되는 이중-가닥 RNA 이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 올리고머의 8 내지 25 개 (예를 들어, 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 개) 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자가 생성된다. dsRNA 는 듀플렉스화된 RNA 의 2 개 상보적 가닥, 또는 자가-듀플렉스화된 단일 RNA 가닥 (소 헤어핀 (sh)RNA) 일 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 는 약 21 또는 22 개 염기쌍이지만, 더 짧거나, 약 29 개 뉴클레오티드까지 더 길 수도 있다. 이중 가닥 RNA 는 표준 기술, 예를 들어 화학적 합성 또는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 키트는, 예를 들어 Ambion (Austin, Tex.) 및 Epicentre (Madison, Wis.) 로부터 이용가능하다.
포유동물 세포에서 dsRNA 를 발현시키는 방법은 Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002; Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al., Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; 및 Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-505 2002 에 기재되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참고로 포함된다.
GST-π 유전자에 "상응하는" 저해성 핵산 분자는 이중-가닥 저해성 핵산 분자의 각 가닥이 표적 GST-π 유전자의 상보적 가닥에 결합할 수 있도록 이중-가닥 유전자의 적어도 단편을 포함한다. 저해성 핵산 분자는 참조 GST-π 서열에 대한 완벽한 대응을 가질 필요는 없다.
하나의 구현예에서, siRNA 는 표적 핵산과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 1-2 개 염기쌍 미스매치를 갖는 19 개 염기쌍 듀플렉스가 본 발명의 방법에서 유용한 것으로 간주된다. 다른 구현예에서, 저해성 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 미스매치를 나타낸다.
본 발명에 의해 제공된 저해성 핵산 분자는 siRNA 에 제한되지 않으나, GST-π 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키기에 충분한 임의의 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 제공된 각각의 DNA 서열은 예를 들어, 치료적 안티센스 핵산 분자의 발견 및 개발에 사용됨으로써 GST-π 의 발현을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 또한 촉매적 RNA 분자 또는 리보자임을 제공한다. 이러한 촉매적 RNA 분자는 GST-π 핵산 분자의 생체내 발현을 저해하는데 사용될 수 있다. 안티센스 RNA 내 리보자임 서열의 포함은 분자에 대해 RNA-절단 활성을 부여함으로써, 구축물의 활성을 증가시킨다. 표적 RNA-특이적 리보자임의 설계 및 용도가 Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988, 및 US 2003/0003469 A1 에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 촉매적 핵산 분자는 헤머헤드 (hammerhead) 또는 헤어핀 모티프에서 형성된다. 이러한 헤머헤드 모티프의 예는 [Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992] 에 의해 기재되어 있다. 헤어핀 모티프의 예는 [Hampel et al., Biochemistry, 28:4929, 1989], 및 [Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990] 에 의해 기재되어 있다. 당업자는 효소 핵산 분자에 필요한 것이, 하나 이상의 표적 유전자 RNA 에 상보적이며 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 기질 결합 부위 내 또는 그 주위 뉴클레오티드 서열을 갖는 특이적 기질 결합 부위라는 것을 인지할 것이다.
표 9 는 GST-π 의 mRNA 코딩 서열을 나타낸다.
표 9: 글루타티온 S-트랜스퍼라아제-π1 mRNA 코딩 서열, NCBI 참조 서열: NM_000852.3, GeneID:2950, Hugo 유전자 명명법 위원회 (Hugo gene Nomenclature Committee): HGNC:4638, 인간 단백질 참조 데이터베이스: HPRD:00614 (SEQ ID NO:287)
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Figure pct00019
GST-π 생성 또는 활성을 억제하는 약물은 높은 특이성 및 낮은 부작용 가능성 면에 있어서, RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, GST-π 를 인코딩하는 DNA 에 대한 DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 발현하는 벡터일 수 있다.
GST-π 의 억제는, GST-π 억제제를 이용하지 않는 경우와 비교하여 세포에서 GST-π 의 발현 또는 활성이 억제되는 것으로써 측정될 수 있다. GST-π 의 발현은 임의의 공지된 기술에 의해 평가될 수 있고; 이의 예는 항-GST-π 항체를 이용하는 면역침강 방법, EIA, ELISA, IRA, IRMA, 웨스턴 블롯 방법, 면역조직화학 방법, 면역세포화학 방법, 유세포측정 방법, GST-π 를 인코딩하는 핵산 또는 이의 고유 단편과 특이적으로 하이브리드화하는 핵산, 또는 상기 핵산의 전사 생성물 (예를 들어 mRNA) 또는 스플라이싱 생성물을 이용하는 다양한 하이브리드화 방법, 노던 블롯 방법, 서던 블롯 방법 및 다양한 PCR 방법을 포함한다.
GST-π 의 활성은, 임의의 공지된 방법, 예컨대 면역침강 방법, 웨스턴 블롯 방법, 질량 분석 방법, 풀-다운 (pull-down) 방법, 또는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 방법에 의해, 예를 들어 Raf-1 (특히 인산화된 Raf-1) 또는 EGFR (특히 인산화된 EGFR) 과 같은 단백질에 대한 결합을 포함하는 GST-π 의 공지된 활성을 분석함으로써 평가할 수 있다.
GST-π 가 특정 세포에서 발현되는지 여부는 세포에서의 GST-π 의 발현을 검출하여 측정될 수 있다. GST-π 의 발현은 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 검출될 수 있다.
돌연변이된 KRAS 의 예는 비제한적으로, KRAS 의 일정한 활성화를 초래하는 돌연변이, 예컨대 내인성 GTPase 를 저해하는 돌연변이 또는 구아닌 뉴클레오티드 교환율을 증가시키는 돌연변이를 갖는 것들을 포함한다. 이러한 돌연변이의 구체적인 예는 비제한적으로, 예를 들어 인간 KRAS 에서 아미노산 12, 13 및/또는 61 에서의 돌연변이 (내인성 GTPase 저해) 및 인간 KRAS 에서 아미노산 116 및/또는 119 에서의 돌연변이 (구아닌 뉴클레오티드 교환률 증가) 를 포함한다 (Bos, Cancer Res. 1989; 49 (17): 4682-9, Levi et al,, Cancer Res. 1991; 51 (13): 3497-502).
본 발명의 일부 구현예에서, 돌연변이된 KRAS 는 인간 KRAS 의 아미노산 12, 13, 61, 116 및 119 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는 KRAS 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 돌연변이된 KRAS 는 인간 KRAS 의 아미노산 12 에서 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 KRAS 는 GST-π 의 과발현을 유도하는 것일 수 있다. 돌연변이된 KRAS 를 갖는 세포는 GST-π 의 과발현을 나타낼 수 있다.
돌연변이된 KRAS 의 검출은 임의의 공지된 기술, 예를 들어, 공지된 돌연변이 서열에 특이적인 핵산 프로브에 의한 선택적 하이브리드화, 효소 미스매치 절단 방법, 서열분석 (Bos, Cancer Res. 1989; 49 (17): 4682-9), 및 PCR-RFLP 방법 (Miyanishi et al., Gasttroenterology. 2001; 121 (4): 865-74) 을 사용하여 실행될 수 있다.
GST-π 발현의 검출은 임의의 공지된 기술을 사용하여 실행될 수 있다. GST-π 가 과발현되는지 여부는, 예를 들어 돌연변이된 KRAS 를 갖는 세포에서 GST-π 의 발현 정도를 정상 KRAS 를 갖는 동일한 유형의 세포에서 GST-π 의 발현 정도와 비교함으로써 평가할 수 있다. 이러한 상황에서, 돌연변이된 KRAS 를 갖는 세포에서 GST-π 의 발현 정도가 정상 KRAS 를 갖는 동일한 유형의 세포에서 GST-π 의 발현 정도를 초과하는 경우, GST-π 는 과발현된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 상기 측면 중 어느 하나의 저해성 핵산 분자를 인코딩하는 벡터를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 조성물로 제형화되는 활성 RNA 간섭 유도 성분의 양은 투여의 이점을 초과하는 역효과를 초래하지 않는 양일 수 있다. 이러한 양은 배양된 세포를 사용하는 시험관내 시험, 또는 마우스, 랫트, 개 또는 돼지 등과 같은 모델 동물에서의 시험에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 시험 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
제형화된 활성 성분의 양은 작용제 또는 조성물이 투여되는 방식에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들어, 복수의 조성물 단위가 하나의 투여에 사용되는 경우, 조성물의 하나의 단위로 제형화될 활성 성분의 양은 하나의 투여에 필요한 활성 성분의 양을 상기 복수의 단위로 나누어 결정될 수 있다.
본 발명은 또한, GST-π 를 억제하기 위한 작용제 또는 조성물의 제조 방법, 및 악성 종양을 감소 또는 수축시키기 위한 작용제 또는 조성물의 생성에 있어서 GST-π 를 억제하는 약물의 용도에 관한 것이다.
RNA 간섭
RNA 간섭 (RNA Interference) (RNAi) 은 짧은 간섭 RNA (siRNA) 에 의해 매개되는 동물에서의 서열-특이적 전사후 유전자 침묵화를 지칭한다. 예를 들어, [Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, Vol. 391, pp. 806811; Sharp, Genes & Development, 1999, Vol. 13, pp. 139-141] 을 참고한다.
세포에서의 RNAi 반응은 이중가닥 RNA (dsRNA) 에 의해 유발될 수 있지만, 그 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않고 있다. 세포에서의 특정 dsRNA 는 다이서 (Dicer) 효소, 리보뉴클레아제 III 효소의 작용을 거칠 수 있다. 예를 들어, [Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Hammond et al., Nature, 2000, Vol. 404, pp. 293-296] 을 참고한다. 다이서는 dsRNA 를 dsRNA 의 더 짧은 조각인 siRNA 로 가공할 수 있다.
일반적으로, siRNA 는 약 21 내지 약 23 개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 약 19 개 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 듀플렉스 부위를 포함할 수 있다.
RNAi 은 RNA 유도되는 침묵화 복합체 (RNA induced silencing complex) (RISC) 로서 알려진 엔도뉴클레아제 복합체를 수반한다. siRNA 는 RISC 복합체에 진입하며 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 RNA 표적의 절단을 매개하는 안티센스 또는 가이드 가닥을 갖는다. siRNA 의 다른 가닥은 패신저 가닥이다. 표적 RNA 의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 부위의 중간에서 일어난다. 예를 들어, [Elbashir et al., Genes & Development, 2001, Vol. 15, pp. 188-200] 을 참고한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "센스 가닥" 은 siRNA 분자의 상응하는 안티센스 가닥의 적어도 일부에 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 핵산 서열과 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안티센스 가닥" 은 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 안티센스 가닥은 siRNA 분자의 상응하는 센스 가닥의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다.
RNAi 분자는 RNA 간섭을 서열-특이적 방식으로 매개함으로써 유전자 발현을 하향 조절 또는 녹다운시킬 수 있다. 예를 들어, Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, Vol. 411, pp. 494-498; Kreutzer et al., WO2000/044895; Zernicka-Goetz et al., WO2001/36646; Fire et al., WO1999/032619; Plaetinck et al., WO2000/01846; Mello et al., WO2001/029058 을 참고한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 발현에 관한 용어들 "저해," "하향-조절," 또는 "감소" 는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 수준, 또는 인코딩된 단백질 중 하나 이상의 활성이 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재 시에 관찰되는 것보다 아래로 감소되는 것을 의미한다. 예를 들어, 발현의 수준, mRNA 의 수준, 또는 인코딩된 단백질 활성의 수준은 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재 시에 관찰되는 것보다 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 90%, 또는 그 이상만큼 감소될 수 있다.
RNAi 분자는 또한 바이러스 유전자 발현을 녹다운시키고, 그에 따라 바이러스 복제에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.
RNAi 분자는 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥: 센스 가닥 또는 패신저 가닥, 및 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로부터 만들어질 수 있다. 가이드 및 패신저 가닥은 적어도 부분적으로 상보적이다. 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 약 15 내지 약 49 개의 염기쌍을 갖는 듀플렉스 부위를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 의 듀플렉스 부위는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49 개의 염기쌍을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 RISC 복합체에서 활성일 수 있으며, RISC 에 대해 활성인 듀플렉스 부위의 길이를 갖는다.
추가 구현예에서, RNAi 분자는 다이서 기질로서 활성이어서, RISC 복합체에서 활성일 수 있는 RNAi 분자로 전환될 수 있다.
일부 측면에서, RNAi 분자는 상보적 가이드 및 패신저 서열 부분을 긴 분자의 대향하는 말단에 가질 수 있으며, 그에 따라 분자는 상보적 서열 부분과 듀플렉스 부위를 형성할 수 있고, 가닥들은 듀플렉스 부위의 하나의 말단에서 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결된다. 예를 들어, 헤어핀 배열, 또는 스템 및 루프 배열. 가닥들과의 링커 상호작용은 공유 결합 또는 비-공유 상호작용일 수 있다.
본 개시물의 RNAi 분자는 핵산의 센스 부위를 핵산의 안티센스 부위에 연결시키는 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 2 개 이상의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 뉴클레오티드 길이의 링커일 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 핵산 압타머 (aptamer) 일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "압타머" 또는 "핵산 압타머" 는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 지칭하며, 여기서 핵산 분자는 그의 자연적 환경에서 표적 분자에 의해 인지되는 서열을 포함하는 서열을 갖는다. 대안적으로, 압타머는 표적 분자에 결합하는 핵산 분자일 수 있으며, 여기서 표적 분자는 핵산에 자연적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 압타머는 단백질의 리간드-결합 도메인에 결합함으로써, 자연 발생적 리간드와 단백질의 상호작용을 방지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, [Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, Vol. 64, pp. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, Vol. 74, pp. 5-13; Hermann et al., Science, 2000, Vol. 287, pp. 820-825] 를 참고한다.
비-뉴클레오티드 링커의 예는 무염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리탄화수소, 또는 다른 중합체 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 예컨대 2 내지 100 개의 에틸렌 글리콜 단위체를 갖는 것들을 포함한다. 일부 예가 Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, Vol. 15, pp. 3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, Vol. 34, pp. 301; Arnold et al., WO1989/002439; Usman et al., WO1995/006731; Dudycz et al., WO1995/011910, 및 Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 4000-4002 에 기재되어 있다.
RNAi 분자는 듀플렉스 부위로부터의 오버행 (overhang) 을 하나 이상 가질 수 있다. 오버행은 비-염기쌍, 단일 가닥 부위이며, 1 내지 8 개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상일 수 있다. 오버행은 3'-말단 오버행일 수 있으며, 여기서 가닥의 3'-말단은 1 내지 8 개 뉴클레오티드의 단일 가닥 부위를 갖는다. 오버행은 5'-말단 오버행일 수 있으며, 여기서 가닥의 5'-말단은 1 내지 8 개 뉴클레오티드의 단일 가닥 부위를 갖는다.
RNAi 분자의 오버행은 동일한 길이를 가질 수 있거나, 또는 상이한 길이를 가질 수 있다.
RNAi 분자는 하나 이상의 블런트 엔드 (blunt end) 를 가질 수 있으며, 여기에서 듀플렉스 부위는 오버행으로 끝나지 않고, 가닥은 듀플렉스 부위의 말단까지 염기쌍을 이룬다.
본 개시물의 RNAi 분자는 하나 이상의 블런트 엔드를 가질 수 있거나, 또는 하나 이상의 오버행을 가질 수 있거나, 또는 블런트 엔드와 오버행 말단의 조합을 가질 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있거나, 또는 오버행에 있을 수 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있거나, 또는 오버행에 있을 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있으며, 한편 3'-말단은 오버행에 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있으며, 한편 5'-말단은 오버행에 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 양쪽 말단은 블런트 엔드이다.
추가 구현예에서, RNAi 분자의 양쪽 말단은 오버행을 갖는다.
5'- 및 3'-말단의 오버행은 상이한 길이를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 블런트 엔드를 가질 수 있으며, 여기서 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다.
추가 구현예에서, RNAi 분자는 블런트 엔드를 가질 수 있으며, 여기서 안티센스 가닥의 3'-말단 및 센스 가닥의 5'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다.
RNAi 분자는 듀플렉스 부위의 염기쌍 형성에 있어서 미스매치를 가질 수 있다.
RNAi 분자의 오버행에서의 임의의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드일 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 5'-말단에 있을 수 있으며, 여기서 RNAi 분자의 다른 가닥의 3'-말단은 오버행을 갖지 않을 수 있거나, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 갖지 않을 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 3'-말단에 있을 수 있으며, 여기서 RNAi 분자의 다른 가닥의 5'-말단은 오버행을 갖지 않을 수 있거나, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 갖지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 오버행 뉴클레오티드 중 하나 이상, 또는 전부는 2'-데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
다이서 (Dicer) 기질 RNAi 분자
일부 측면에서, RNAi 분자는 RISC 활성 RNAi 분자가 생성되도록 가공될 수 있는 다이서 기질로서 적합한 길이의 것일 수 있다. 예를 들어, Rossi et al., US2005/0244858 을 참고한다.
다이서 기질 dsRNA 는 활성 RNAi 분자가 생성되도록 다이서에 의해 가공되기에 충분한 길이의 것일 수 있으며, 하기 특성 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: (i) 다이서 기질 dsRNA 는 비대칭일 수 있음 (예를 들어, 안티센스 가닥에 3' 오버행을 가짐), 및 (ii) 다이서 기질 dsRNA 는 센스 가닥에 변형된 3' 말단을 가져, 다이서 결합 및 dsRNA 의 활성 RNAi 분자로의 가공의 방향을 유도할 수 있음.
RNAi 분자의 사용 방법
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 분자의 직접 적용에 의해, 또는 담체 또는 희석제와 조합된 분자로, 세포 또는 조직에 전달될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 담체 또는 희석제, 또는 세포 내로의 진입을 보조하고, 촉진하거나 용이하게 하도록 작용하는 임의의 다른 전달 비히클, 예를 들어 바이러스 서열, 바이러스 물질, 또는 지질 또는 리포솜 제형과 분자의 직접 적용에 의해 세포, 조직, 기관 또는 대상에 전달 또는 투여될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 양이온성 지질과 복합화되고, 리포솜 내에 패키징되고, 또는 다르게는 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 핵산 또는 핵산 복합체는 직접 진피 적용, 경피 적용 또는 주사를 통해, 생체외, 또는 생체내로 관련 조직에 국소 투여될 수 있다.
전달 시스템은 예를 들어, 수성 및 비수성 겔, 크림, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 리포솜, 연고, 수용액 및 비수용액, 로션, 에어로졸, 탄화수소 베이스 및 분말을 포함할 수 있으며, 가용화제 및 투과 증강제와 같은 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명의 GST-π 저해성 핵산 분자는 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제 내에서, 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 종래의 약학적 실행을 이용하여, 과도한 세포 증식에 의해 초래되는 질환을 앓고 있는 환자에게 화합물을 투여하기 위한 적합한 제형 또는 조성물을 제공할 수 있다. 투여는 환자가 증상을 보이기 전에 시작될 수 있다. 임의의 적절한 투여 경로가 이용될 수 있으며, 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 종양내, 근육내, 두개내, 안와내, 안구, 심실내, 간내, 관절낭내, 척추강내, 수조내, 복강내, 비강내, 에어로졸, 좌제, 또는 경구 투여일 수 있다. 예를 들어, 치료적 제형은 액체 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있고; 경구 투여를 위해서는, 제형은 정제 또는 캡슐 형태일 수 있고; 비강내 제형을 위해서는, 분말, 점비액 또는 에어로졸 형태일 수 있다.
본 개시물의 조성물 및 방법은, 핵산 분자의 발현을 허용하는 방식으로 본 발명의 하나 이상의 RNAi 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 핵산 분자의 일시적 발현이 가능하도록 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.
예를 들어, 벡터는 듀플렉스의 RNAi 분자의 두 가닥 모두, 또는 자가 상보성이며 따라서 RNAi 분자를 형성하는 단일 핵산 분자를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터는 둘 이상의 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 진핵생물 프로모터로부터 세포 내에 발현될 수 있다. 당업자는 임의의 핵산이 적절한 DNA/RNA 벡터로부터 진핵생물 세포에서 발현될 수 있다는 것을 인지하고 있다.
일부 측면에서, 발현 구축물에 의해 인코딩된 dsRNA 구축물의 전사를 위하여, 세포 내로 발현 구축물이 도입되도록 바이러스 구축물을 사용할 수 있다.
지질 제형은 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사, 또는 경구 또는 흡입으로 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 동물에 투여될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 투여하기 위한 약학적으로 허용가능한 제형이 공지되어 있으며 사용될 수 있다.
상기 방법의 하나의 구현예에서, 저해성 핵산 분자는 약 5 내지 500 mg/㎡/일, 예를 들어 5, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 mg/㎡/일의 투약량으로 투여된다.
제형 제조에 대해 당업계에 공지된 방법은 예를 들어, ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000] 에서 밝혀진다.
비경구 투여용 제형은 예를 들어, 부형제, 멸균수, 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 야채 기원의 오일, 또는 수소화된 나프탈렌을 함유할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 사용하여 화합물의 배출을 제어할 수 있다. GST-π 저해성 핵산 분자에 대한 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능 주입 시스템 및 리포솜을 포함한다. 흡입용 제형은 부형제, 예를 들어 락토오스를 함유할 수 있거나, 예를 들어 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있거나, 점비액 형태, 또는 겔로서의 투여용 유성 용액일 수 있다.
제형은 신생물성 질환 또는 병태에 대한 치료요법이 제공되도록, 치료적 유효량 (예를 들어, 병리학적 병태를 예방, 제거 또는 감소시키는 양) 으로 인간 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 올리고머의 바람직한 투약량은 장애의 유형 및 정도, 특정 환자의 전체 건강 상태, 화합물 부형제의 제형, 및 이의 투여 경로와 같은 변수에 따라 좌우될 수 있다.
악성 종양을 감소시키기 위한 상기 모든 방법은 시험관내 방법 또는 생체내 방법일 수 있다. 투약량은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 배양 세포 등을 사용하는 시험관내 시험에 의해 결정될 수 있다. 유효량은 KRAS 관련 종양의 종양 크기를 종양 크기의 10% 이상, 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 최대 100% 로 감소시키는 양일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 KRAS 관련 질환을 치료하는데 있어서 유효할 수 있다. 질환의 예는 비정상 세포 증식으로 인한 질환, KRAS 돌연변이로 인한 질환, 및 GST-π 과발현으로 인한 질환을 포함한다.
비정상 세포 증식으로 인한 질환의 예는 악성 종양, 과다형성, 켈로이드, 쿠싱 증후군, 원발성 알도스테론증, 홍반증, 진성 적혈구 증가증, 백반증, 과증식성 반흔, 편평 태선 및 흑자증을 포함한다.
KRAS 돌연변이로 인한 질환의 예는 악성 종양 (또한 소위 암 또는 악성 신생물) 을 포함한다.
GST-π 과발현으로 인한 질환의 예는 악성 종양을 포함한다.
암의 예는 육종 예컨대 섬유육종, 악성 섬유질 조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 맥관육종, 카포시 육종, 림프관육종, 활막 육종, 연골육종, 및 골육종, 암종 예컨대 뇌 종양, 두경부 암종, 유방 암종, 폐 암종, 식도 암종, 위 암종, 십이지장 암종, 결장 암종, 직장 암종, 간 암종, 췌장 암종, 담낭 암종, 담관 암종, 신장 암종, 요관 암종, 방광 암종, 전립선 암종, 고환 암종, 자궁 암종, 난소 암종, 피부 암종, 백혈병, 및 악성 림프종을 포함한다.
암은 상피성 악성종양 및 비-상피성 악성종양을 포함한다. 암은 신체의 임의 부위, 예를 들어 뇌, 두경부, 가슴, 사지, 폐, 심장, 흉선, 식도, 위, 소장 (십이지장, 공장, 회장), 대장 (결장, 맹장, 충수, 직장), 간, 췌장, 담낭, 신장, 요로, 방광, 전립선, 고환, 자궁, 난소, 피부, 횡문근, 평활근, 활막, 연골, 골, 갑상선, 부신, 복막, 장간막, 골수, 혈액, 혈관계, 림프계 예컨대 림프절, 림프액 등에 존재할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 암은 상기 정의된 바와 같은 돌연변이된 KRAS 를 갖는 암 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 암은 호르몬- 또는 성장 인자-독립적 증식을 나타내는 암 세포를 포함한다. 추가 구현예에서, 암은 GST-π 과발현을 나타내는 암 세포를 포함한다.
실시예
실시예 1: GST-π 에 대해 표적화된 본 발명의 siRNA 는 시험관내에서 유전자 침묵화에 대해 활성인 것으로 밝혀졌다. 유전자 녹다운에 대한 GST-π siRNA 의 용량-의존적 활성은 약 250 피코몰 (pM) 미만, 및 최소 1 pM 의 IC50 을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 siRNA 녹다운 효능을 측정하였다. 표 10 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운이 표 3 의 siRNA 로 관찰되었다.
표 10: A549 세포주에서 GST-π mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운
Figure pct00020
표 10 에서 보여지는 바와 같이, 표 3 의 GST-π siRNA 의 활성은 17-235 pM 범위였으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 적합하다.
실시예 2: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 BU2' (SEQ ID NO:133 및 159) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. 표 11 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 11: 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00021
표 11 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성이 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 예상외로 최대 6-배 만큼 증가하였다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 3, 5 및 7 에, 또는 위치 4, 6 및 8 에 위치하는 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가, 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 11 에서 보여지는 활성은 5 내지 8 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 3: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 A9' (SEQ ID NO:185 및 197) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. 표 12 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 A9' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 12: 구조 A9' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00022
표 12 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 A9' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 최대 24-배 만큼 증가하였다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 4, 6 및 8 에, 또는 위치 1, 3, 5 및 7 에, 또는 위치 3-8 에, 또는 위치 5-8 에, 또는 위치 3, 5 및 7 에 위치하는 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 부위에서 3 내지 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 12 에서 보여지는 활성은 1 내지 15 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 4: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B13' (SEQ ID NO:209 및 224) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. 표 13 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 13: 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00023
표 13 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가하였다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 4, 6 및 8 에 위치하는 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 부위에 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대해 표 13 에서 보여지는 활성은 11 pM 의 피코몰 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 5: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B4' (SEQ ID NO:263 및 275) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. 표 14 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B4' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 14: 구조 B4' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00024
표 14 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B4' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 2-배 초과 만큼 증가하였다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 3-8 에 위치하는 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 부위에 6 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대한 표 14 에서 보여지는 활성은 113 pM 의 피코몰 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 6: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 부위에 위치하는 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 및 유리하게 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B2' (SEQ ID NO:239 및 251) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. 표 15 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B2' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 15: 구조 B2' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00025
표 15 에서 보여지는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 부위에 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B2' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 최대 4-배 만큼 증가하였다.
이들 데이터는 안티센스 가닥의 시드 부위에서 위치 5-8 에, 또는 위치 1, 3, 5 및 7 에, 또는 위치 3, 5 및 7 에 위치하는 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 이 듀플렉스 부위에 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 보여준다.
안티센스 가닥의 시드 부위에 3 내지 4 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대한 표 15 에서 보여지는 활성은 30-100 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 7: 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드를 함유하는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 BU2' (SEQ ID NO:133 및 159) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. 표 16 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 16: 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00026
표 16 에서 보여지는 바와 같이, 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 BU2' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 최대 10-배 만큼 증가하였다.
이들 데이터는 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 보여준다.
하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대한 표 16 에서 보여지는 활성은 3 내지 13 pM 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 8: 하나 이상의 2'-데옥시-2'-플루오로 치환된 뉴클레오티드를 함유하는 GST-π siRNA 의 구조는 시험관내에서 예상외로 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 구조 B13' (SEQ ID NO:209 및 224) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정하였다. 표 17 에서 보여지는 바와 같이, GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 로 관찰되었다.
표 17: 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 A549 세포주에서의 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00027
표 17 에서 보여지는 바와 같이, 비-오버행 위치에 위치하는 3 개의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 B13' 에 기반하는 GST-π siRNA 의 활성은 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 약 3-배 만큼 증가하였다.
이들 데이터는 하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조를 갖는 GST-π siRNA 가 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖지 않는 GST-π siRNA 와 비교할 때 예상외로 증가한 유전자 녹다운 활성을 제공하였다는 것을 보여준다.
하나 이상의 2'-F 데옥시뉴클레오티드를 갖는 GST-π siRNA 에 대한 표 17 에서 보여지는 활성은 6 pM 의 피코몰 범위에 있었으며, 이는 생체내에서 사용될 약물 제제로서를 포함하는 많은 용도에 예외적으로 적합하다.
실시예 9: 동소이식 A549 폐암 마우스 모델. 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 동소이식 폐암 종양의 현저한 감소를 나타낼 수 있다. 이 실시예에서, GST-π siRNA 는 생체내에서 리포솜 제형으로 무흉선 누드 마우스의 동소이식 폐암 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공하였다.
일반적으로, 동소이식 종양 모델은 약물 효능 및 효력에 대한 직접적인 임상 관련성 뿐만 아니라 개선된 예측 능력을 나타낼 수 있다. 동소이식 종양 모델에서, 종양 세포는 세포가 유래되는 장기와 동일한 종류의 장기 내로 직접적으로 이식된다.
처리군 및 비히클 대조군에 대해 부검시 측정된 최종 원발성 종양 중량을 비교함으로써 인간 폐암 A549 에 대한 siRNA 제형의 항종양 효능을 평가하였다.
도 1 은 구조 BU2 (SEQ ID NO:63 및 128) 에 기반하는 GST-π siRNA 에 대한 생체내에서의 동소이식 폐암 종양 저해를 보여준다. 동소이식 A549 폐암 마우스 모델을 2 ㎎/㎏ 의 비교적 낮은 용량의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 와 함께 이용하였다.
이러한 6-주 연구에서 GST-π siRNA 는 유의미하고 예상외로 유리한 폐 종양 저해 효능을 보였다. 도 1 에서 보여지는 바와 같이, 43 일 후에, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 저해 효능을 보였으며, 최종 종양 평균 중량은 대조군과 비교할 때 2.8-배 만큼 유의미하게 감소하였다.
이러한 연구에서, 수컷 NCr nu/nu 마우스, 5-6 주령을 사용하였다. 실험 동물을 실험 기간 동안 HEPA 여과되는 환경에서 유지하였다. siRNA 제형을 사용 전에 4℃ 에서 보관하고, 마우스에 주사하기 10 분 전에 실온으로 가온하였다.
이러한 A549 인간 폐암 동소이식 모델에 대해, 외과적 동소 이식 (SOI) 을 하는 날에, A549 종양 이종이식편을 보유하는 동물의 피하 부위로부터 스톡 (stock) 종양을 수확하고 RPMI-1640 배지에 놓았다. 괴사 조직을 제거하고, 생존가능한 조직을 1.5-2 ㎣ 조각으로 잘랐다. 동물을 이소플루란 흡입으로 마취하고, 수술 부위를 요오드 및 알코올로 멸균하였다. 한 쌍의 외과용 가위를 사용하여 마우스의 왼쪽 가슴 벽에 대략 1.5 ㎝ 길이의 횡행 절개를 수행하였다. 제 3 및 제 4 갈비뼈 사이에서 늑골간 절개를 수행하였고, 왼쪽 폐를 노출시켰다. 하나의 A549 종양 단편을 8-0 외과용 봉합사 (나일론) 를 사용하여 폐의 표면에 이식하였다. 가슴 벽을 6-0 외과용 봉합사 (실크) 로 닫았다. 25 G X 1 ½ 바늘을 갖는 3 cc 주사기를 사용하여 흉내 천자에 의해 폐를 재-팽창시켜 흉강의 남은 공기를 빼냈다. 가슴 벽을 6-0 외과용 실크 봉합사로 닫았다. 위에 기재된 모든 수술 절차를 HEPA 여과되는 층류 후드 하에서 7 x 배율 현미경을 이용하여 수행하였다.
종양 이식 3 일 후에, 모델 종양-보유 마우스를 군 당 10 마리 마우스의 군으로 무작위로 나누었다. 관심군에 대해, 10 마리 마우스의 처리를 종양 이식 3 일 후에 개시하였다.
관심군에 대해, 제형은 (이온화가능 지질:콜레스테롤:DOPE:DOPC:DPPE-PEG-2K:DSPE-PEG-2K), 리포솜 조성물이었다. 리포솜은 GST-π siRNA 를 캡슐화하였다.
연구 종료점을 위해, 처리 개시 42 일 후에 실험 마우스를 희생시켰다. 후속 분석을 위해 원발성 종양을 잘라내고 전자 밸런스에서 계량하였다.
화합물 독성의 추정을 위해, 처리군 및 대조군 내 마우스의 평균 체중을 전체 실험 기간 동안 정상 범위 내에서 유지하였다. 마우스에서 독성의 다른 증상은 관찰되지 않았다.
실시예 10: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 암 이종이식 종양의 현저한 감소를 나타내었다. GST-π siRNA 는 생체내에서 리포솜 제형으로 암 이종이식 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공하였다.
도 2 는 GST-π siRNA (SEQ ID NO:158 및 184) 에 대한 종양 저해 효능을 보여준다. 암 이종이식 모델을 0.75 ㎎/㎏ 의 비교적 낮은 용량의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 와 함께 이용하였다.
GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 저해 효능을 보였다. 36 일 후에, GST-π siRNA 는 현저하게 유리한 종양 저해 효능을 보였으며, 종양 용적은 대조군과 비교할 때 2-배 만큼 감소하였다.
도 3 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 는 종료점 일에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 저해 효능을 입증하였다. 특히, 종양 중량은 2-배 초과 만큼 감소하였다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포솜 제형의 2 회 주사 (제 1 일 및 제 15 일) 로 투여하였다.
암 이종이식 모델에 대해, A549 세포주를 ATCC 로부터 수득하였다. 세포를, 10% 우태 혈청 및 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 배양 배지에서 유지하였다. 세포를 접종 48 시간 전에 분할하여 세포가 수확될 때 로그기 성장에 있게 하였다. 세포를 트립신-EDTA 로 약간 트립신화하고, 조직 배양물로부터 수확하였다. 생존 세포의 수를 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에서 계수하고 측정하였다 (오직 생존 세포만 계수함). 세포를 혈청 없는 배지에 5 x 107/㎖ 의 농도로 재현탁시켰다. 그 후 세포 현탁액을 주사를 위해 얼음 해동된 BD 마트리겔과 1:1 비로 잘 혼합하였다.
마우스는 Charles River Laboratory 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스 (면역-약화된, 6-8 주령, 군 당 7-8 마리의 마우스) 였다.
종양 모델 제조를 위해, 각 마우스에 25 G 바늘 및 주사기를 사용하여 2.5 x 106 개 A549 세포의 0.1 ㎖ 접종물을, 마우스 당 하나의 접종물로, 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 접종을 위해 마취하지 않았다.
종양 용적 측정 및 무작위화를 위해, 종양 크기를 0.1 mm 가까이로 측정하였다. 종양 용적을 다음 식을 사용하여 계산하였다: 종양 용적 = 길이 x 너비2/2. 확립된 종양이 대략 120 - 175 ㎣ 에 도달하고, 평균 종양 용적이 약 150 ㎣ 이 되고나면, 마우스를 다양한 비히클 대조군 및 처리군에 배정하여 처리된 군 내 평균 종양 용적이 비히클 대조군 내 평균 종양 용적의 10% 내이고, 이상적으로, 종양 용적의 CV% 가 25% 미만이 되게 하였다. 동일한 날에, 시험품 및 대조군 비히클을 투약 레지멘 (regimen) 에 따라 투여하였다. 종양 용적을 제 1 주 동안 3 회, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링하였다.
투여량 투여를 위해, 투약 일에, 시험품을 -80℃ 냉동고에서 꺼내고 얼음 위에서 해동시켰다. 주사기에 넣기 전에, 제형을 함유하는 병을 손으로 몇 번 뒤집었다. 모든 시험품을 IV 에 의해 0.75 ㎎/㎏, q2w X 2, 10 ㎖/㎏ 로 투여하였다.
체중에 대해, 마우스를 0.1 g 가까이로 계량하였다. 체중을 첫 번째 용량에 대한 투약 후 7 일 내에 매일 모니터링하고 기록하였다. 체중을 몇 주 동안, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링하고 기록하였다.
종양 수집을 위해, 첫 번째 투약 후 28 일에, 종양 용적을 측정하고, 종양을 중량 측정을 위해 해부하고, PD 바이오마커 연구를 위해 보관하였다. 종양 중량을 기록하였다.
실시예 11: 본 발명의 GST-π siRNA 는 시험관내에서 암 세포의 세포자멸사에 의한 증가한 암 세포사를 입증하였다. GST-π siRNA 는 GST-π 녹다운을 제공하였으며, 이는 세포 생존력의 손실과 관련되는 세포자멸사에 대한 바이오마커인 PUMA 의 상향조절을 야기하였다.
시드 부위에서의 데옥시뉴클레오티드의 조합, 2'-F 치환된 데옥시뉴클레오티드, 및 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드를 함유하는 GST-π siRNA SEQ ID NO:158 및 184 는 예상외로 증가한 암 세포의 세포자멸사를 제공하였다.
GST-π siRNA SEQ ID NO:158 및 184 에 대한 PUMA 의 발현 수준을 도 4 에서 보여지는 바와 같이 측정하였다. 도 4 에서, PUMA 의 발현은 GST-π siRNA 의 트랜스펙션 후 2-4 일로부터 크게 증가하였다.
이들 데이터는 시드 부위에서의 데옥시뉴클레오티드의 조합, 2'-F 치환된 데옥시뉴클레오티드, 및 2'-OMe 치환된 리보뉴클레오티드를 함유하는 GST-π siRNA 의 구조가 예상외로 증가한 암 세포의 세포자멸사를 제공하였다는 것을 보여준다.
PUMA 바이오마커에 대한 프로토콜은 다음과 같았다. 트랜스펙션 1 일 전에, 세포를 96-웰 플레이트에 10% FBS 를 함유하는 100 ㎕ 의 DMEM (HyClone Cat. # SH30243.01) 을 포함하는 웰 당 2 x 103 개의 세포를 플레이팅하고, 공기 중에 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 다음 날, 트랜스펙션 전에 배지를 2% FBS 를 함유하는 90 ㎕ 의 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지 (Life Technologies Cat. # 31985-070) 로 교체하였다. 그 후, 0.2 ㎕ 의 리포펙타민 RNAiMAX (Life Technologies Cat. #13778-100) 를 5 분 동안 실온에서 4.8 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합하였다. 1 ㎕ 의 GST-π siRNA (스톡 농도 1 μM) 를 4 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합하고, RNAiMAX 용액과 조합하고, 그 후 부드럽게 혼합하였다. 혼합물을 10 분 동안 실온에서 인큐베이션하여 RNA-RNAiMAX 복합체가 형성되게 하였다. 10 ㎕ 의 RNA-RNAiMAX 복합체를 웰 당 첨가하여, siRNA 의 최종 농도가 10 nM 이 되게 하였다. 세포를 2 시간 동안 인큐베이션하고, 배지를 2% FBS 를 함유하는 신선한 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지로 교체하였다. 트랜스펙션 후 1, 2, 3, 4, 및 6 일에, 세포를 빙랭 PBS 로 1 회 세정하고, 그 후 50 ㎕ 의 Cell-to-Ct 세포용해 완충액 (Life Technologies Cat. # 4391851 C) 으로 5-30 분 동안 실온에서 용해하였다. 5 ㎕ 의 정지액을 첨가하고, 2 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PUMA (BBC3, Cat# Hs00248075, Life Technologies) mRNA 수준을 qPCR 에 의해 TAQMAN 을 이용하여 측정하였다.
실시예 12: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 암 이종이식 종양의 현저한 감소를 나타낼 수 있다. GST-π siRNA 는 생체내에서 리포솜 제형으로 암 이종이식 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공할 수 있다.
도 5 는 GST-π siRNA (SEQ ID NO:63 및 128) 에 대한 종양 저해 효능을 보여준다. GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 로 생체내에서 GST-π mRNA 의 용량 의존적 녹다운이 관찰되었다. 암 이종이식 모델을 비교적 낮은 용량의, 0.75 mg/kg 의 GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 와 함께 이용하였다.
GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 저해 효능을 보였다. 도 5 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 에 의한 처리는 지질 제형으로 주사 4 일 후 GST-π mRNA 발현의 유의미한 감소를 초래하였다. 4 ㎎/㎏ 의 더 높은 용량에서, 주사 24 시간 후 약 40% 의 유의미한 감소가 검출되었다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포솜 제형의 10 ㎖/㎏ 의 단일 주사로 투여하였다.
암 이종이식 모델에 대해, A549 세포주를 ATCC 로부터 수득하였다. 세포를 10% 우태 혈청 및 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 에서 유지하였다. 세포를 접종 48 시간 전에 분할하여 세포가 수확될 때 로그기 성장에 있게 하였다. 세포를 트립신-EDTA 로 약간 트립신화하고, 조직 배양물로부터 수확하였다. 생존 세포의 수를 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에서 계수하고 측정하였다 (오직 생존 세포만 계수함). 세포를 혈청 없는 RPMI 배지에 4 x 107/㎖ 의 농도로 재현탁시켰다. 그 후 세포 현탁액을 주사를 위해 얼음 해동된 BD 마트리겔과 1:1 비로 잘 혼합하였다.
마우스는 Charles River Laboratory 무흉선 누드 (nu/nu) 암컷 마우스 (면역-약화된, 6-8 주령, 군 당 3 마리의 마우스) 였다.
종양 모델 제조를 위해, 각 마우스에 25 G 바늘 및 주사기를 사용하여 2 x 106 개 A549 세포의 0.1 ㎖ 접종물을, 마우스 당 하나의 접종물로, 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 마우스를 접종을 위해 마취하지 않았다.
종양 용적 측정 및 무작위화를 위해, 종양 크기를 0.1 mm 가까이로 측정하였다. 종양 용적을 다음 식을 사용하여 계산하였다: 종양 용적 = 길이 x 너비2/2. 종양 용적을 1 주 2 회 모니터링하였다. 확립된 종양이 대략 350 - 600 ㎣ 에 도달하고나면, 마우스를 다양한 시점에서 군에 배정하였다. 동일한 날에, 시험품을 투약 레지멘에 따라 투여하였다.
투약량 투여를 위해, 확립된 종양이 대략 350 - 600 ㎣ 에 도달한 날에, 시험품을 4℃ 냉장고에서 꺼냈다. 주사기에 넣기 전에, 제형을 함유하는 병을 손으로 몇 번 뒤집어서 균질한 용액을 만들었다.
체중에 대해, 마우스를 0.1 g 가까이로 계량하였다. 체중을 몇 주 동안, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링하고 기록하였다.
종양 수집을 위해, 동물을 과다투여된 CO2 에 의해 희생시키고, 종양을 투약 후 0, 24, 48, 72, 96 (선택적), 및 168 시간에 해부하였다. 종양을 먼저 습윤 계량하고, 그 후 KD, 분포 및 바이오마커 분석을 위해 3 개의 부분으로 분리하였다. 샘플을 액체 질소 중에 급속 냉동시키고, 가공될 준비가 될 때까지 -80℃ 에서 보관하였다.
실시예 13: 본 발명의 GST-π siRNA 는 생체내에서 췌장암 이종이식 종양을 저해하였다. GST-π siRNA 는 생체내에서 리포솜 제형으로 췌장암 이종이식 종양에 투여될 때 유전자 녹다운 효력을 제공하였다.
이러한 이종이식 모델에서, 각 마우스에 2.5 x 106 개 PANC-1 세포의 0.1 ㎖ 접종물을 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. Charles River 무흉선 누드 암컷 마우스 (6 내지 8 주령) 를 사용하였다. 종양 크기를 0.1 mm 가까이로 측정하였다. 확립된 종양이 대략 150 - 250 ㎣ (평균 종양 용적 약 200 ㎣) 에 도달하고나면, 마우스를 다양한 비히클 대조군 및 처리군에 배정하여 처리된 군 내 평균 종양 용적이 비히클 대조군 내 평균 종양 용적의 10% 내이도록 하였다. 동일한 날에, 시험품 및 대조군 비히클을 투약 레지멘에 따라 투여하였다. 종양 용적을 제 1 주 동안 3 회, 연구 종료일을 포함하여, 나머지 주 동안 2 회 모니터링하였다.
도 6 은 GST-π siRNA (SEQ ID NO:63 및 128) 에 대한 종양 저해 효능을 보여준다. 도 6 에서 보여지는 바와 같이, 0.375 ㎎/㎏ 내지 3 ㎎/㎏ 범위의 용량의, GST-π 에 대해 표적화된 siRNA 로 용량 반응이 수득되었다. GST-π siRNA 는 투여 후 수일 내에 유의미하고 예상외로 유리한 종양 저해 효능을 보였다. 따라서, GST-π siRNA 는 종료점에서 유의미하고 예상외로 유리한 종양 저해 효능을 입증하였다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화가능 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포솜 제형으로 투여하였다.
실시예 14: 본 발명의 GST-π siRNA 는 증가한 혈청 안정성을 나타내었다.
도 7 은 인간 혈청 중 인큐베이션 및 HPLS/LCMS 에 의한 다양한 시점에서의 잔여 siRNA 의 검출을 보여준다. 도 7 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA (SEQ ID NO:63 및 128) 의 센스 가닥 (도 7, 상부) 및 안티센스 가닥 (도 7, 하부) 둘 모두에 대해 혈청 중 반감기 (t½) 는 약 100 분이었다.
실시예 15: 본 발명의 GST-π siRNA 는 혈장 중 제형에서 향상된 안정성을 나타내었다.
도 8 은 혈장 중 제형의 인큐베이션 및 다양한 시점에서의 잔여 siRNA 의 검출을 보여준다. 도 8 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA (SEQ ID NO:63 및 128) 의 제형의 혈장 중 반감기 (t½) 는 100 시간 보다 유의미하게 더 길었다.
GST-π siRNA 를 조성 (이온화 지질: 콜레스테롤: DOPE: DOPC: DPPE-PEG-2K) (25:30:20:20:5) 을 갖는 리포솜 제형으로 제조하였다. 리포솜 나노입자에 관한 z-평균 크기는 40.0 nm 였고, siRNA 는 91% 캡슐화되었다.
제형을 PBS 중 50% 인간 혈청 중 40 분, 1.5 시간, 3 시간, 24 시간 및 96 시간 동안 인큐베이션하였다. GST-π siRNA 의 양을 ELISA-기반 검정에 의해 측정하였다.
실시예 16: 본 발명의 GST-π siRNA 는 패신저 가닥에 의한 감소한 오프 타겟 효과를 나타내었다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:158 및 184) 에 대하여, 도 9 는 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운은 대략 지수적이었다는 것을 보여주며, 이와 비교하여 스크램블된 서열을 사용한 대조군은 효과를 나타내지 않았다. 이러한 siRNA 의 IC50 은 5 pM 에서 측정되었다. 도 10 은 동일한 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운을 보여준다. 도 10 에서 보여지는 바와 같이, GST-π siRNA 에 관한 패신저 가닥 오프 타겟 녹다운은 100-배 초과 만큼 크게 감소되었다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:189 및 201), (SEQ ID NO:191 및 203), 및 (SEQ ID NO:192 및 204) 에 대하여, 도 11 은 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운이 대략 지수적이었다는 것을 보여준다. 이들 siRNA 의 IC50 은 각각 6, 7, 및 5 pM 에서 측정되었다. 도 12 에서 보여지는 바와 같이, 이들 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운은 적어도 10-배 만큼 유의미하게 감소되었다. 이들 GST-π siRNA 는 모두 듀플렉스 부위의 시드 부위에 데옥시뉴클레오티드를 가졌으며, 듀플렉스 부위에 다른 변형은 갖지 않았다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:219 및 234) 에 대하여, 도 13 은 이러한 고활성 GST-π siRNA 의 가이드 가닥에 대한 시험관내 녹다운이 대략 지수적이었다는 것을 보여준다. 이러한 siRNA 의 IC50 은 11 pM 에서 측정되었다. 도 14 에서 보여지는 바와 같이, 이러한 GST-π siRNA 의 패신저 가닥에 대한 시험관내 녹다운은 100-배 초과 만큼 유의미하게 감소되었다. 이러한 GST-π siRNA 는 듀플렉스 부위의 시드 부위에 데옥시뉴클레오티드를 가졌으며, 듀플렉스 부위에 다른 변형은 갖지 않았다.
오프 타겟 효과를 레닐라 루시퍼라아제 (Renilla luciferase) 유전자를 인코딩하는 발현 리포터 플라스미드 psiCHECK-2 (Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega, Cat#:E1960) 를 사용하여 측정하였다. siRNA 농도는 전형적으로 50 pM 이었다. 프로토콜: 제 1 일에, HeLa 세포를 5 내지 7.5 x 103/100㎕/웰로 시딩하였다. 제 2 일에, 세포 밀집도 약 80% 에서 동시트랜스펙션시켰다. 제 3 일에, 루시퍼라아제 활성 측정을 위해 세포를 수확하였다. 루시퍼라아제 활성을, Promega 의 루시퍼라아제 검정 시스템 (E4550) 을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다.
psiCHECK-2 벡터는 레닐라 루시퍼라아제의 리포터 유전자에 융합된 표적 유전자의 발현의 변화를 모니터링하는 것을 가능하게 하였다. siRNA 구축물을 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하고, 벡터를 siRNA 와 함께 HeLa 세포 내로 동시트랜스펙션시켰다. 특이적 siRNA 가 표적 mRNA 에 결합하고 RNAi 과정을 개시하는 경우에, 융합된 레닐라 루시퍼라아제: 구축물 mRNA 는 절단되고 그 후에 분해되어, 레닐라 루시퍼라아제 신호를 감소시킬 것이다.
예를 들어, BU2' 구조를 갖는 siRNA 에 대한 플라스미드 인서트 (insert) 는 다음과 같았다:
PsiCHECK-2 (F) 플라스미드 인서트:
SEQ ID NO: 288
Figure pct00028
PsiCHECK-2 (R) 플라스미드 인서트:
SEQ ID NO: 289
Figure pct00029

실시예 17: 본 발명의 GST-π siRNA 는 유리하게는 감소한 miRNA-유사 오프 타겟 효과를 나타내었으며, 이는 시드-의존적 비의도적 오프 타겟 유전자 침묵화이다.
GST-π siRNA (SEQ ID NO:158 및 184), (SEQ ID NO:189 및 201), (SEQ ID NO:191 및 203), (SEQ ID NO:192 및 204), 및 (SEQ ID NO:219 및 234) 에 대해, miRNA 를 모방하는 오프 타겟 활성은 본질적으로 무시해도 좋은 것으로 밝혀졌다. 이들 GST-π siRNA 에 대한 시드-의존적 비의도적 오프 타겟 유전자 침묵화는 가이드 가닥의 온 타겟 (on-target) 활성보다 적어도 10-배 내지 100-배 더 낮았다.
miRNA-관련 오프 타겟 효과를 시험하기 위해, 안티센스 가닥의 5' 말단의 전체 시드-함유 부위, 위치 1-8 에는 상보적이나, 나머지 비-시드 부위, 위치 9-21 에는 상보적이지 않은 시드-매칭된 표적 서열의 1 내지 4 개의 리피트 (repeat) 를 루시퍼라아제 mRNA 의 3'UTR 에 상응하는 부위 내로 도입하여, 시드-의존적 비의도적 오프 타겟 효과의 효율을 측정하였다. 플라스미드 인서트를 사용하여 miRNA 를 모방함으로써 시드 부위에서 완벽한 매칭 및 비-시드 부위에서 미스매치 (벌지 (bulge)) 를 갖게 하였다.
예를 들어, BU2' 구조를 갖는 siRNA 에 대한 플라스미드 인서트는 다음과 같았다:
PsiCHECK-2 (Fmi1) 플라스미드 인서트:
SEQ ID NO: 290
Figure pct00030
PsiCHECK-2 (Fmi2) 플라스미드 인서트:
SEQ ID NO: 291
Figure pct00031
PsiCHECK-2 (Fmi3) 플라스미드 인서트:
SEQ ID NO: 292
Figure pct00032
PsiCHECK-2 (Fmi4) 플라스미드 인서트:
SEQ ID NO: 293
Figure pct00033

추가적인 정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 당업계에서, 본 발명의 맥락 내에서, 각각의 용어가 사용되는 특정 맥락에서 그의 통상적인 의미를 가지며, 본원에서 용어가 상술되거나 토의되는지 여부에 따라 특정한 유의성은 없을 것이다. 본 개시물의 실시예의 설명은 단지 예시적인 것이며, 결코 본 발명의 범주 및 의미를 제한하지 않는다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 관련되는 당업계의 숙련자에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고문헌이 본 발명에서 사용된 특정 용어의 일반적인 정의를 제공할 수 있다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).
"신조직형성" 은 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 세포자멸사, 또는 둘 모두에 의해 초래되거나 이를 초래하는 임의의 질환을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 암은 신조직형성의 예이다. 암의 예는 백혈병, 예를 들어 급성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수구 백혈병, 급성 골수아세포 백혈병, 급성 전골수구 백혈병, 급성 골수단구 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 만성적 림프구성 백혈병, 진성 적혈구증가증, 림프종 (호지킨 질환, 비-호지킨 질환), 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 및 고형 종양 예컨대 육종 및 암종 (예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 맥관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관유상피육종 (lymphangioepdotheliosarcoma), 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 나일 (nile) 유관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피성 암종, 신경아교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종 (oligodendroglioma), 신경집종, 수막종, 흑색종, 신경교세포종, 및 망막모세포종) 을 포함한다. 림프증식성 장애는 또한 증식성 질환인 것으로 간주된다.
"핵산" 은 리보핵산 또는 데옥시리보핵산의 올리고머 또는 중합체, 또는 그의 유사체를 의미한다. 이러한 용어는 자연발생적 염기, 당, 및 당간 (골격) 결합으로 이루어지는 올리고머 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 비-자연발생적 부분을 갖는 올리고머를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 종종 예를 들어 뉴클레아제의 존재 하 향상된 안정성과 같은 특성으로 인해 원생 형태보다 종종 바람직하다.
"실질적으로 동일한" 은 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나) 에 대해 50% 이상 동일성을 나타내는 단백질 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 비교를 위해 사용되는 서열에 대해 아미노산 수준 또는 핵산이 적어도 60%, 보다 바람직하게는 80% 또는 85%, 보다 더 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, Genetics Computer Group 의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램) 를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 대해 상동성 정도를 배정함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 군 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 측정하기 위한 예시적인 접근법에서, 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 e-3 내지 e- 100 의 확률 점수로, BLAST 프로그램을 사용할 수 있다.
"저해성 핵산" 은, 포유동물 세포에게 투여시 표적 유전자의 발현에 있어서 감소 (예를 들어, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 90-100%) 를 초래하는 단일 또는 이중-가닥 RNA, siRNA (짧은 간섭 RNA), shRNA (짧은 헤어핀 RNA), 또는 안티센스 RNA, 또는 이의 일부, 또는 이의 모방체를 의미한다. 전형적으로, 핵산 저해제는 표적 핵산 분자, 또는 이의 오르토로그 (ortholog) 의 적어도 일부를 포함하거나 이에 상응하거나, 또는 표적 핵산 분자의 상보적 가닥의 적어도 일부를 포함한다.
"안티센스 핵산" 은, RNA-RNA 또는 RNA-DNA 상호작용으로 표적 RNA 에 결합하며 표적 RNA 의 활성을 변경시키는 비-효소 핵산 분자를 의미한다 (검토를 위해, Stein et al. 1993; Woolf et al., 미국 특허 번호 5,849,902 를 참고한다). 전형적으로, 안티센스 분자는 안티센스 분자의 단일 인접 서열에 따른 표적 서열에 상보적이다. 그러나 특정 구현예에서, 안티센스 분자는 기질 분자가 루프를 형성하도록 기질에 결합할 수 있고/있거나 안티센스 분자는 안티센스 분자가 루프를 형성하도록 결합할 수 있다. 따라서, 안티센스 분자는 2 개 (또는 그 이상) 비-인접 기질 서열에 상보적일 수 있거나, 또는 안티센스 분자의 2 개 (또는 그 이상) 비-인접 서열 부분은 표적 서열에 상보적일 수 있거나, 둘 모두 가능하다. 현재 안티센스 전략의 검토를 위해서는, Schmajuk N A et al., 1999; Delihas N et al., 1997; Aboul-Fadl T, 2005 를 참고한다.
용어 "siRNA" 는 소 간섭 RNA 를 지칭하며; siRNA 는 참조 또는 표적 유전자 서열에 "상응하거나" 매치되는 이중가닥 RNA 이다. siRNA 의 각 가닥이 표적 서열의 적어도 일부에 결합할 수 있는 한, 이러한 매치는 완벽할 필요는 없다. siRNA 는 유전자 발현을 저해하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 Bass, 2001, Nature, 411, 428 429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494 498; 및 Zamore et al., Cell 101:25-33 (2000) 을 참고한다.
본원에 기재된 구현예는 제한하고자 하는 것이 아니며, 당업자는 본원에 기재된 변형의 특정 조합이, 개선된 RNAi 활성을 갖는 핵산 분자를 확인하기 위한 과도한 실험 없이 시험될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 수 있다.
본원에 구체적으로 언급된 모든 공개물, 특허 및 문헌은 그의 전체가 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.
본 발명은, 그들이 다양할 수 있으므로, 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 물질 및 시약에 제한되지 않는다는 것이 이해된다. 본원에 사용된 용어가 오직 특정 구현예를 기재하는 목적만을 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 또한 이해될 것이다. 설명의 범주 및 취지에 벗어나지 않고 가변적인 치환 및 변형을 본원에 개시된 설명에 가할 수 있으며 이들 구현예가 이러한 설명 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본원에서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 맥락에서 다르게 명확히 나타내지 않는 한, 단수 형태 "하나", "하나의", 및 "그러한" 은 복수의 언급 대상을 포함한다. 또한, 단수 형태 "하나" (또는 "하나의"), "하나 이상" 및 "적어도 하나" 의 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한 용어 "포함한다", "포함하는", "함유하는", "비롯한" 및 "갖는" 은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 포괄적이고 비제한적으로 판독되어야 한다는 것에 유의미한다.
본원의 값의 범위의 설명은 본원에 다르게 나타내지 않는 한, 단지 범위 내에 포함되는 각각의 별개 값을 개별적으로 지칭하는 약기 방법으로서 역할하는 것으로 의도되며, 각각의 별개 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 마쿠쉬 (Markush) 군에 대해, 당업자는 이러한 설명이 개별적 일원 뿐 아니라 마쿠쉬 군의 일원의 하위군을 포함한다는 것을 인지할 것이다.
추가적인 상세한 설명 없이, 당업자가 상기 설명을 기반으로 하여 본 발명을 그의 최대 정도로 이용할 수 있다고 여겨진다. 따라서 하기 특정 구현예는 단지 예시적이며 본 개시물의 나머지를 어떠한 식으로도 제한하지 않는다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특성은 동일한, 대등한, 또는 유사한 목적에 기여하는 대안적인 특성으로 대체될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING MALIGNANT TUMORS ASSOCIATED WITH KRAS MUTATION <130> ND5123946WO <140> PCT/US15/67559 <141> 2015-12-28 <150> JP2014_266198 <151> 2014-12-26 <150> 62/266,672 <151> 2015-12-13 <150> 62/184,204 <151> 2015-06-24 <160> 293 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3594 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtggctcacc tgtacccagc acttgggaag ccgaggcgtg cagatcacct aagtcaggag 60 ttcgagacca gcccggccaa catggtgaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaatcag 120 ccagatgtgg cacgcaccta tatccaccta ctcgggaggc tgaagcagaa tgcttaaccc 180 gagaggcgga ggttgcagtg agccgcccag atcgcgccac tgcactccag cctgggccac 240 agcgtgagac tactcataaa ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa 300 ataataaaat aaaataaaat aaaataaaat ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa 360 ataaaataaa ataaaagcaa tttcctttcc tctaagcggc ctccacccct ctcccctgcc 420 ctgtgaacgg gggaagctcc ggatcgcagc aattagggaa tttccccccg cgatgtcccg 480 gcgcgccagt tcggcgcaca tctttcgctg cggtcctctt 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21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 17 agacccugcu gucccagaat t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 18 gagcuggaag gaggaggugt t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ugcuguccca gaaccagggt t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 20 cccagaacca gggaggcaat t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 21 ccagaaccag ggaggcaagt t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 22 uuugagaccc ugcuguccct t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 23 gacccugcug ucccagaact t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 24 gaucagggcc agagcuggat t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 25 agccuuuuga gacccugcut t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gccuuuugag acccugcugt t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ccuuuugaga cccugcugut t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 28 cgccuuuuga gacccugcat t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 29 ccuacaccgu ggucuauuut t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 30 ugugggagac cagaucucct t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 31 gcgggaggca gaguuugcct t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ccuuucucca ggaccaauat t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 33 acccugcugu cccagaacct t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 34 ggucuauuuc ccaguucgat t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 35 cccuggugga cauggugaat t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 36 acaucucccu caucuacact t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 37 gcaaggauga cuaugugaat t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ccuucgcuga cuacaaccut t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 39 cuggcagauc agggccagat t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 40 gacggagacc ucacccugut t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 41 cgggcaagga ugacuaugut t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 42 cuuuugagac ccugcuguat t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 43 gagcuggaag gaggagguat t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 44 acccugcugu cccagaacat t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ugcuguccca gaaccaggat t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 46 agccuuuuga gacccugcat t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 47 ccuuuugaga cccugcugat t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ugaagccuuu ugagacccut t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 49 acugaagccu uuugagacct t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 50 aggaugacua ugugaaggct t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 51 ggaugacuau gugaaggcat t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 52 gaugacuaug ugaaggcact t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 53 cucccucauc uacaccaact t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 54 gaagccuuuu gagacccugt t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 55 ucucccucau cuacaccaat t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 56 ccucaucuac accaacuaut t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 57 cccucaucua caccaacuat t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 58 caacugaagc cuuuugagat t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 59 aacugaagcc uuuugagact t 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 60 cugaagccuu uugagaccct t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 61 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21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 66 ccucaucuac accaacuaat t 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 67 accaauaaaa uuucuaagat t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 68 ugccucccug guucugggac a 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 69 gacagcaggg ucucaaaagg c 21 <210> 70 <211> 21 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 74 ggacagcagg gucucaaaag g 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 75 ucugggacag cagggucuca a 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 76 accaccuccu ccuuccagct c 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 77 caccaccucc uccuuccagc t 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 78 cuuccagcuc uggcccugat c 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 79 cugggacagc agggucucaa a 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 80 uccuuccagc ucuggcccug a 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ccaccuccuc cuuccagcuc t 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 82 uucugggaca gcagggucuc a 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 83 caccuccucc uuccagcuct g 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 84 cccugguucu gggacagcag g 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 85 uugccucccu gguucuggga c 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 86 cuugccuccc ugguucuggg a 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 87 gggacagcag ggucucaaaa g 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 88 guucugggac agcaggguct c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 89 uccagcucug gcccugauct g 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 90 agcagggucu caaaaggcut c 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 91 cagcaggguc ucaaaaggct t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 92 acagcagggu cucaaaaggc t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 93 ugcagggucu caaaaggcgt c 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 94 aaauagacca cgguguaggg c 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 95 ggagaucugg ucucccacaa t 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 96 ggcaaacucu gccucccgct c 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 97 uauugguccu ggagaaagga a 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 98 gguucuggga cagcaggguc t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 99 ucgaacuggg aaauagacca c 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 100 uucaccaugu ccaccagggc t 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 101 guguagauga gggagaugua t 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 102 uucacauagu cauccuugcc c 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 103 agguuguagu cagcgaagga g 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 104 ucuggcccug aucugccagc a 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 105 acagggugag gucuccgucc t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 106 acauagucau ccuugcccgc c 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 107 uacagcaggg ucucaaaagg c 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 108 uaccuccucc uuccagcuct g 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 109 uguucuggga cagcaggguc t 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 110 uccugguucu gggacagcag g 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 111 ugcagggucu caaaaggcut c 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 112 ucagcagggu cucaaaaggc t 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 113 agggucucaa aaggcuucag t 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide 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guugguguag augagggaga t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 119 cagggucuca aaaggcuuca g 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 120 uugguguaga ugagggagat g 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 121 auaguuggug uagaugaggg a 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 122 uaguuggugu 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ggaaggacca gcaggaggca gccctggtgg acatggtgaa tgacggcgtg 540 gaggacctcc gctgcaaata catctccctc atctacacca actatgaggc gggcaaggat 600 gactatgtga aggcactgcc cgggcaactg aagccttttg agaccctgct gtcccagaac 660 cagggaggca agaccttcat tgtgggagac cagatctcct tcgctgacta caacctgctg 720 gacttgctgc tgatccatga ggtcctagcc cctggctgcc tggatgcgtt ccccctgctc 780 tcagcatatg tggggcgcct cagtgcccgg cccaagctca aggccttcct ggcctcccct 840 gagtacgtga acctccccat caatggcaac gggaaacagt gagggttggg gggactctga 900 gcgggaggca gagtttgcct tcctttctcc aggaccaata aaatttctaa gagagctaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 986 <210> 288 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 288 ctcgaggggc aactgaagcc ttttgagacc ctgctgtccc aggcggccgc 50 <210> 289 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 289 ctcgagctgg gacagcaggg tctcaaaagg cttcagttgc ccgcggccgc 50 <210> 290 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 290 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctgtccc aggcggccgc 50 <210> 291 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 291 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac cctgctgtcc 60 caggcggccg c 71 <210> 292 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 292 ctcgaggggc aactctacgc aaaacagacc ctgctctacg caaaacagac 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Claims (31)

  1. KRAS 유전자에서의 돌연변이 또는 야생형 KRAS 유전자의 과발현과 관련된 종양의 치료 또는 치료요법을 위한 약학 조성물로서, 조성물이 RNAi 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하고, 여기서 RNAi 분자가 GST-π 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, RNAi 분자가 SEQ ID NO:287 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 듀플렉스 부위를 포함하는 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, RNAi 분자가 SEQ ID NO:184 에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 SEQ ID NO:158 에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, RNAi 분자가 siRNA 또는 shRNA 인 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제가 하나 이상의 지질 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제가 지질 나노입자를 포함하는 약학 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제가 RNAi 분자를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 약학 조성물.
  8. 하기 단계를 포함하는, 그를 필요로 하는 포유동물에서의 KRAS 돌연변이와 관련된 악성 종양의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 방법:
    포유동물에서의 종양 세포를 확인하는 단계로서, 종양 세포는 다음의 것 중 하나 이상을 포함하는 단계: (i) KRAS 유전자의 돌연변이, 및 (ii) KRAS 단백질의 비정상적인 발현 수준; 및
    GST-π 의 발현을 감소시키는데 있어서 활성인 하나 이상의 RNAi 분자를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 포유동물이 인간이고 GST-π 가 인간 GST-π 인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, RNAi 분자가 siRNA 또는 shRNA 인 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, RNAi 분자가 SEQ ID NO:287 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 듀플렉스 부위를 포함하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, RNAi 분자가 SEQ ID NO:184 에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 SEQ ID NO:158 에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, RNAi 분자가 포유동물에서 GST-π 의 발현을 감소시키는 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 투여가 포유동물에서 GST-π 의 발현을 5 일 이상 동안 5% 이상 감소시키는 방법.
  15. 제 8 항에 있어서, 투여가 포유동물에서 악성 종양의 용적을 5% 이상, 또는 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상 감소시키는 방법.
  16. 제 8 항에 있어서, 악성 종양의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 악성 종양의 진행을 지연 또는 종료시키는 방법.
  17. 제 8 항에 있어서, 투여가 대상에서 악성 종양 세포의 성장을 감소시키는 방법.
  18. 제 8 항에 있어서, 투여가 대상에서 2% 이상, 또는 5% 이상, 또는 10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상 악성 종양 세포에 대한 성장을 감소시키는 방법.
  19. 제 8 항에 있어서, 종양 세포가 정상 세포에서와 비교하여 야생형 KRAS 단백질의 증가한 발현 수준을 포함하는 방법.
  20. 제 8 항에 있어서, 종양 세포가 야생형 GST-π RNA 또는 단백질을 과발현하는 방법.
  21. 제 8 항에 있어서, 종양 세포가 잔기 12, 13 및 61 중 하나 이상에서 KRAS 단백질에서의 돌연변이를 포함하는 방법.
  22. 제 8 항에 있어서, 종양 세포가 KRAS 단백질에서의 돌연변이를 포함하며 종양이 폐암, 결장암 및 췌장암에서 선택되는 암인 방법.
  23. 제 8 항에 있어서, 종양 세포가 KRAS 단백질에서의 돌연변이를 포함하며 종양이 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 유관 암종, 및 결장직장 암종으로 이루어지는 군에서 선택되는 육종인 방법.
  24. 제 8 항에 있어서, 악성 종양이 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 유관 암종, 결장직장 암종, 유방암, 및 섬유육종의 군에서 선택되는 육종인 방법.
  25. 제 8 항에 있어서, 악성 종양이 폐, 결장, 췌장, 담낭, 간, 유방 및 이들의 임의의 조합의 군에서 선택되는 해부학상 부위에 위치하는 방법.
  26. 제 8 항에 있어서, 투여가 1 일 당 1 내지 12 회 수행되는 방법.
  27. 제 8 항에 있어서, 투여가 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일의 지속 기간 동안 수행되는 방법.
  28. 제 8 항에 있어서, 투여가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 12 주의 지속 기간 동안 수행되는 방법.
  29. 재 8 항에 있어서, 투여가 최대 12 주의 기간 동안 1 일 당 1 회 이상으로의 0.01 내지 2 mg/kg 의 RNAi 분자 용량인 방법.
  30. 제 8 항에 있어서, 투여가 GST-π RNAi 분자에 대해 1 내지 1000 ㎍*분/㎖ 의 평균 AUC(0-마지막) 및 0.1 내지 50 ㎍/㎖ 의 평균 Cmax 를 제공하는 방법.
  31. 제 8 항에 있어서, 투여가 정맥내 주사, 진피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경구, 국소, 주입 또는 흡입인 방법.
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