CN113677373A

CN113677373A - RNAi分子

Info

Publication number: CN113677373A
Application number: CN202080023714.8A
Authority: CN
Inventors: 田中洋行; 高桥博一; 高木义和; 味吞宪二郎
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2021-11-19
Also published as: EP3950005A1; US20220170022A1; JPWO2020196736A1; WO2020196736A1; EP3950005A4

Abstract

本发明涉及在反义链中包含序列号1的核苷酸序列的RNAi分子、包括将有效量的所述RNAi分子施予至需要其的对象的步骤的处置疾病的方法。

Description

RNAi分子

技术领域

本公开文本涉及RNAi分子、利用该RNAi分子的疾病的处置方法等。

背景技术

对癌的化学疗法而言，最初使用烷基化剂等以细胞非特异性方式呈现细胞毒性的药剂，但近年来，关注逐渐集中于对癌细胞以外的细胞影响较小、以癌特有的分子作为靶标的分子靶向药。对于上述情况，已报道了BcL-XL在若干种癌症中被上调(非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Sarosiek and Leta,FEBS J.2016；283(19):3523-3533

发明内容

发明要解决的课题

虽然细胞增殖抑制剂的开发在世界范围内正在推进，但仍然需要有效性高的药剂。

用于解决课题的手段

本公开文本的一部分方式涉及以下内容。

[1]RNAi分子，其在反义链中包含序列号1的核苷酸序列。

[2][1]所述的RNAi分子，其中，序列号1的核苷酸序列被配置在反义链的自5’起第2～8位。

[3][1]或[2]所述的RNAi分子，其抑制BcL2家族的蛋白质表达。

[4][3]所述的RNAi分子，其中，BcL2家族为BcL-XL。

[5][1]～[4]中任一项所述的RNAi分子，其中，反义链包含序列号21的核苷酸序列。

[6][1]～[5]中任一项所述的RNAi分子，其中，序列号1的核苷酸序列选自序列号5～7的核苷酸序列。

[7]医药组合物，其含有[1]～[6]中任一项所述的RNAi分子、及任选的药学上可允许的添加物。

[8][1]～[6]中任一项所述的RNAi分子或[7]所述的组合物，其用于癌的处置。

[9][8]所述的RNAi分子或组合物，其中，癌表达了BcL-XL。

[10][9]所述的RNAi分子或医药组合物，其中，癌选自由脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、大肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌、皮肤癌、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病组成的组。

[11]癌的处置方法，其包括将有效量的[1]～[6]、[8]～[10]中任一项所述的RNAi分子、或[7]～[10]中任一项所述的组合物施予至需要其的对象的步骤。

发明效果

基于本公开文本的RNAi分子根据其方式能够实现以下之中一种或两种以上的效果。

(1)能够抑制细胞的增殖。

(2)能够在细胞中诱导凋亡。

(3)除原本靶向的BcL-XL以外，至少抑制选自BcL-2、Smad1、P21、MRS2及RFC1中的特定基因的表达。

(4)较之以BcL-XL为靶标的其他RNAi分子，细胞增殖抑制能力高。

(5)较之以BcL-XL为靶标的其他RNAi分子，细胞杀伤能力高。

附图说明

图1：图1为对以BcL-XL为靶标的siRNA的癌细胞增殖抑制能力进行比较而得的图。纵轴示出以对照组(化合物Z)为1时的存活率的相对值。

图2-1：图2-1为对以BcL-XL作为靶标的siRNA在A549细胞中的癌细胞增殖抑制能力及癌细胞杀伤能力进行比较而得的图。上图示出以对照组(化合物Z)为1时的存活率相对值，下图示出将死细胞数量除以活细胞数量而得的数值。

图2-2：图2-2为对以BcL-XL作为靶标的siRNA在SW1990细胞中的癌细胞增殖抑制能力及癌细胞杀伤能力进行比较而得的图。上图示出以对照组(化合物Z)为1时的存活率的相对值，下图示出将死细胞数量除以活细胞数量而得的数值。

图2-3：图2-3为对以BcL-XL作为靶标的siRNA在SUIT-2细胞中的癌细胞增殖抑制能力及癌细胞杀伤能力进行比较而得的图。上图示出以对照组(化合物Z)为1时的存活率相对值，下图示出将死细胞数量除以活细胞数量而得的数值。

图3：图3为对以BcL-XL作为靶标的siRNA对其他特定基因的表达抑制能力进行比较而得的图。纵轴示出基于GADPH的表达量对各基因的表达量进行标准化、并以对照组(化合物Z)为1时得到的相对值。

图4：图4为示出含有CUGACUC的siRNA的凋亡诱导活性的图。

图5：图5为示出含有CUGACUC的siRNA的体内抗肿瘤效果的图。纵轴示出肿瘤尺寸(mm³)。

图6：图6为显示含有CUGACUC的siRNA的体内抗肿瘤效果的图。

图7：图7为对含有CnGACnC的siNA的各种基因的表达抑制能力进行比较而得的图。纵轴示出基于GSTP1的表达量对各种基因的表达量进行标准化、并以对照组(化合物Z)为100％时的相对值。化合物名称仅记载符号。

图8：图8为示出含有CnGACnC的siNA对细胞的存活产生的影响的照片。化合物名称仅记载符号。

图9：图9为示出含有CnGACnC的siNA对细胞的存活产生的影响的图。纵轴示出对照组(化合物Z)中的以GSTP1的表达量为100％时的存活率的相对值。化合物名称仅记载符号。

具体实施方式

除非在本说明书中另有定义，本说明书中使用的所有技术用语及科学用语均具有与本领域技术人员通常理解的意思相同的含义。本说明书中提到的所有专利、申请及其他出版物(包括网络信息)的全部内容均通过引用并入本说明书中。另外，本说明书包含于2019年3月28日申请的、作为本申请主张优先权的基础的日本专利申请(日本特愿2019-064443号)的说明书及附图中记载的内容。

本公开文本的一个方式中，涉及在反义链(或反义区域)中包含序列号1(CnGACnC)的核苷酸序列的RNAi分子(下面，有时称为“本公开文本的RNAi分子”)。

序列号1的核苷酸序列由6个RNA和1个DNA组成，“CnGACnC”的n表示U(尿嘧啶)或t(胸腺嘧啶)，C、G、A表示RNA或DNA。即，序列号1的核苷酸序列包括以下7种核苷酸序列：序列号2(cUGACUC)、序列号3(CtGACUC)、序列号4(CUgACUC)、序列号5(CUGaCUC)、序列号6(CUGAcUC)、序列号7(CUGACtC)和序列号8(CUGACUc)。上述核苷酸序列中，序列号5～7是优选的，序列号5和6是更优选的，序列号5是特别优选的。

需要说明的是，在本说明书中，除非另外记载，在核苷酸序列中，大写字母表示RNA，小写字母表示DNA。

RNAi分子表示能够引起RNA干扰的任何分子。典型地，RNA干扰表示双链核酸分子所诱导的靶RNA序列特异性分解的现象。双链核酸分子进入细胞内后，根据其长度而被Dicer切割，然后其中一条链(称为反义链或向导链)被摄入进包含Argonaute(AGO)蛋白的RNA诱导沉默复合体(RISC)中。RISC被具有与靶RNA互补的序列的反义链(向导链)引导识别靶RNA并对靶RNA进行切割。靶RNA为mRNA的情况下，其将不再表达mRNA所编码的蛋白质等(基因沉默)。

作为本公开文本的RNAi分子，没有特别限定，可举出例如siRNA(小分子干扰RNA)等siNA(小分子干扰核酸)、shRNA等。siNA典型地指小分子核酸，其具有与靶序列具有互补性的反义链、和与反义链具有互补性的正义链，且双方的链至少部分地形成双链。

siNA中的反义链及正义链可以各自独立地为长度15～49个核苷酸(例如长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸)、约17～35个核苷酸、约17～30个核苷酸、约15～25个核苷酸、约18～25个核苷酸、约18～23个核苷酸、约19～21个核苷酸、约25～30个核苷酸、或约26～28个核苷酸。另外，双链区域可以为长度约15～49个核苷酸(例如长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸)、约15～35个核苷酸、约15～30个核苷酸、约15～25个核苷酸、约17～25个核苷酸、约17～23个核苷酸、约17～21个核苷酸、约25～30个核苷酸、或约25～28个核苷酸。

一些方式中，siNA的正义链及反义链为分开的多核苷酸链。所述方式中，反义链及正义链可介由氢键、如沃森-克里克碱基配对，或通过彼此经共价键合连接来形成双链结构。其他方式中，正义链及反义链为具有正义区域及反义区域的单一的多核苷酸链的一部分，所述方式中，多核苷酸链可具有发夹结构。

siNA可具有平末端或突出末端。突出末端可具有约1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸的悬臂。悬臂可以存在于反义链及/或正义链的5’末端或3’末端中的任一者、或者反义链或正义链的5’末端及3’末端这两者。即，悬臂可以存在于反义链的5’末端、反义链的3’末端、反义链的5’末端和3’末端这两者、正义链的5’末端、正义链的3’末端、正义链的5’末端和3’末端这两者、反义链的5’末端和正义链的5’末端这两者、或、反义链的3’末端和正义链的3’末端这两者。siNA的末端可以为对称的，也可以为不对称的。作为末端为对称的siNA(下面，有时称为“对称siNA”)，可举出例如各末端为平末端的情况、反义链和正义链在同一侧具有相同悬臂的情况(例如，在反义链的5’末端和正义链的5’末端这两者具有相同数量的核苷酸的悬臂的情况、在反义链的3’末端和正义链的3’末端这两者具有相同数量的核苷酸的悬臂的情况)等。作为末端为非对称的siNA(下面，有时称为“非对称siNA”)，可举出例如一个的末端为平末端、另一个的末端为突出末端的情况、两个末端均为突出末端、但悬臂的位置、长度及/或种类不同的情况等。作为两个末端均为突出末端的、末端为非对称的siNA，可举出例如在反义链和正义链的5’末端和3’末端这两者具有悬臂的情况、反义链和正义链均在同一侧(即，5’末端或3’末端)具有悬臂、但其长度及/或种类不同的情况等。悬臂的种类不同是指，例如，构成悬臂的核苷酸的种类不同。构成悬臂的核苷酸包含RNA、DNA，及具有后述的各种修饰的核酸。因此，仅由未修饰RNA构成的悬臂与包含修饰RNA的悬臂种类不同，由某修饰RNA构成的悬臂与由其他的修饰RNA构成的悬臂种类不同。

其他的方式中，siNA的末端可具有环结构。例如，siNA可以具有一端为环结构、另一端为平末端的发夹结构(于1条多核苷酸中具有正义链和反义链)，也可以具有一端为环结构、另一端为突出末端(例如具有约1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸的悬臂)的发夹结构。后一情况下，悬臂可以为3’悬臂或5’悬臂，悬臂可以位于正义链或反义链中。

一些方式中，siNA的正义链可包含1个以上的切口(nick)。所述方式中，正义链被切口分开，反义链被RISC摄入后，正义链形成于切口的位置处分开的片段。

siNA可包含非修饰核苷酸及/或修饰核苷酸。本说明书中，有时将非修饰核苷酸及修饰核苷酸统一简称为“核苷酸”。非修饰核苷酸是指天然存在的构成DNA、RNA的核苷酸，即，由核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶)、糖(核糖、脱氧核糖)、和磷酸基构成的核苷酸。由非修饰核苷酸构成的非修饰核酸分子中，相邻的两个非修饰核苷酸之间通常经由磷酸二酯键而将一个非修饰核苷酸的3’位与另一个非修饰核苷酸的5’位连接。一个方式中，非修饰核苷酸为非修饰核糖核苷酸，非修饰核酸分子由非修饰核糖核苷酸构成。

修饰核苷酸是指含有对非修饰核苷酸的化学修饰的核苷酸。修饰核苷酸可以是人工合成的，也可以是天然存在的。修饰核苷酸包括对其核酸碱基、糖、骨架(核苷酸间的键合)、5’末端及/或3’末端进行修饰而得到的核苷酸。修饰核苷酸不仅包括对上述部位中的任一者进行修饰而得到的核苷酸，还包括对上述部位中的2处以上进行修饰而得到的核苷酸。

作为针对核酸碱基的修饰，没有限定，可举出例如2,4-二氟甲苯甲酰基、2,6-二氨基、5-溴、5-碘、2-硫、二氢、5-丙炔基、及5-甲基修饰、脱碱基等。另外，作为修饰核酸碱基，没有限定，可举出例如黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤及鸟嘌呤的6-甲基衍生物及其他烷基衍生物、通用碱基、腺嘌呤及鸟嘌呤的2-丙基衍生物及其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶及5-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶及6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、氨基、硫醇、硫代烷基、羟基及其他的8-取代腺嘌呤及鸟嘌呤、5-三氟甲基及其他的5-取代尿嘧啶及5-取代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、无环核苷酸、去氮嘌呤、嘌呤及嘧啶的杂环取代类似物、例如氨基乙氧基吩噁嗪、嘌呤及嘧啶的衍生物(例如1-烷基衍生物、1-链烯基衍生物、杂芳环衍生物及1-炔基衍生物)及其互变异构体、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-二氮杂黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶、4,4-乙醇胞嘧啶、非嘌呤碱基及非嘧啶碱基、例如2-氨基吡啶及三嗪、无碱基核苷酸、脱氧无碱基核苷酸、倒位无碱基核苷酸、倒位脱氧无碱基核苷酸等。

作为针对糖的修饰，没有限定，可举出例如：2’位的修饰，例如2’-O-烷基修饰(例如，2’-O-甲基修饰、2’-O-乙基修饰等)、2’-甲氧基乙氧基修饰、2’-甲氧基乙基修饰、2’-脱氧修饰、2’-卤代修饰(2’-氟修饰、2’-氯修饰、2’-溴修饰等)、2’-O-烯丙基修饰、2’-氨基修饰、2’-S-烷基修饰、2’-O-[2(甲基氨基)-2-氧代乙基]修饰、2’-烷氧基修饰、2’-O-2-甲氧基乙基、2’-烯丙氧基(-OCH₂CH＝CH₂)、2’-炔丙基、2’-丙基、2’-O-(N-甲基氨基甲酸酯)修饰、2’-O-(2,4-二硝基苯基)修饰、2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖基修饰等；4’位的修饰，例如4’硫代修饰、4’-C-羟基甲基修饰等；以及，乙炔基、乙烯基、丙烯基、CF、氰基、咪唑、羧酸酯、硫代酸酯(thioate)、C₁～C₁₀低级烷基、取代低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF₃、OCN、O-、S-或N-烷基、O-、S-或N-链烯基、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基或取代甲硅烷基等。作为上述以外的修饰糖，可举出例如锁核酸(LNA)、氧杂环丁烷-LNA(OXE)、非锁核酸(UNA)、亚乙基桥联核酸(ENA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)等。

本公开文本中，烷基包括饱和脂肪族基团，其包括直链烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷(脂环式)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代环烷基。一些方式中，直链或支链烷基在其骨架中具有6个或小于6个的碳原子(例如，就直链而言为C₁～C₆，就支链而言为C₃～C₆)，更优选具有4个或小于4个的碳原子。同样地，优选的环烷基可在其环结构中具有3～8个碳原子，更优选可在环结构中具有5个或6个碳。用语C₁～C₆包括含有1～6个碳原子的烷基。烷基也可以是取代烷基、例如在烃骨架的1个或2个以上的碳上具有对氢进行取代的取代基的烷基部分。该取代基可包括例如链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基(phosphinate)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基及脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯基、硫酸盐、烷基亚磺酰基、磺酸酯基、氨基磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳香族部分或杂环式芳香族部分。

本公开文本中，烷氧基包括与氧原子经共价键合连接的取代及非取代烷基、链烯基及炔基。烷氧基的例子包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基及戊氧基。取代烷氧基的例子包括卤代烷氧基。烷氧基可被例如链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基羰基氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基及脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯基、硫酸盐、烷基亚磺酰基、磺酸酯基、氨基磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳香族部分或杂环式芳香族部分取代。卤代烷氧基的例子没有限定，包括氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。

本公开文本中，卤素包括氟、溴、氯、碘。

作为修饰骨架，没有限定，可举出硫代磷酸酯、硫代磷酸-D-核糖体、三酯、硫代酸酯、2’-5’键合(也称为5’-2’或2’5’核苷酸或者2’5’核糖核苷酸)、PACE、PNA、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧次膦酸酯、硼烷磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或5’-)氨基磷酰胺酯、氢膦酸酯、膦酸酯、硼烷基磷酸酯、磷酰胺酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯修饰、烷基磷酸三酯、磷酸三酯基磷键、5’-乙氧基磷酸二酯、P-烷基氧基磷酸三酯、甲基膦酸酯、吗啉基等、及非含磷键、例如碳酸盐、氨基甲酸酯、甲硅烷基、硫、磺酸酯、磺酰胺基、甲缩醛(formacetal)、硫代甲乙酰基、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基及亚甲基氧基甲基亚氨基等。

作为5’末端及/或3’末端修饰，可举出例如向5’末端及/或3’末端附加帽(capping)部分、5’末端及/或3’末端的磷酸基的修饰、例如[3～3’]-倒位脱氧核糖、脱氧核糖核苷酸、[5’-3’]-3’-脱氧核糖核苷酸、[5’-3’]-核糖核苷酸、[5’-3’]-3’-O-甲基核糖核苷酸、3’-甘油基、[3’-5’]-3’-脱氧核糖核苷酸、[3’-3’]-脱氧核糖核苷酸、[5’-2’]-脱氧核糖核苷酸及[5-3’]-二脱氧核糖核苷酸等。作为帽部分的非限定例子，可举出例如无碱基核苷酸、脱氧无碱基核苷酸、倒位(脱氧)无碱基核苷酸、烃(烷基)部分及其衍生物、镜像核苷酸(L-DNA或L-RNA)、LNA及包括亚乙基桥联核酸的桥联核酸、键修饰核苷酸(例如，PACE)及碱基修饰核苷酸、甘油基、二核苷酸、非环式核苷酸、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、甲氧基、咪唑、羧酸酯、硫代酸酯、C₁～C₁₀低级烷基、取代低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF₃、OCN、O-、S-或N-烷基、O-、S-或N-链烯基、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基或取代甲硅烷基等。帽部分也可作为非核苷酸突出来发挥功能。

本公开文本中的修饰核苷酸中包括：2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸、通用碱基核苷酸、非环式核苷酸、5-C-甲基核苷酸、含有生物素基、及末端甘油基及/或倒位脱氧无碱基残基的核苷酸、含有空间位阻分子、例如荧光分子等的核苷酸、含有3’-脱氧腺苷(虫草素)、3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-二脱氧肌苷(ddI)、2’,3’-二脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)、2’,3’-二脱氢-2’,3’-二脱氧胸苷(d4T)、及3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’,3’-二脱氧-3’-硫杂胞苷(3TC)或2’,3’-二脱氢-2’,3’-二脱氧胸苷(d4T)的核苷酸、具有Northern构象的核苷酸、2’-甲基硫代乙基、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧-2’-氯核苷酸、2’-叠氮基核苷酸、及2’-O-甲基核苷酸、6元环核苷酸类似物(例如，WO 2006/047842等中记载的含有己糖醇及阿卓糖醇核苷酸单体的核苷酸类似物)、镜像核苷酸(例如，L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像dA)、L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像dC)、L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像dG)、L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸酯(镜像胸苷))及L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像rA)、L-核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像rC)、L-核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像rG)、L-核糖尿嘧啶-3’-磷酸酯(镜像dU)等)。

修饰核苷酸的非限定例子也记载于例如Gaglione和Messere，Mini RevMedChem.2010；10(7)：578-95、Deleavey和Damha，Chem Biol.2012；19(8)：937-54、Bramsen和Kjems，J.Front Genet.2012；3：154等中。

一个方式中，反义链中所含的CnGACnC序列包含RNA和DNA。特定的方式中，反义链中所含的CnGACnC序列包含非修饰RNA和DNA。

shRNA为包含彼此具有互补性的反义区域及正义区域、和介入二者之间的环区域的单链RNA分子，其介由反义区域和正义区域的配对来形成双链区域，呈现发夹状的三维结构。shRNA在细胞内被dicer切割，生成双链siRNA分子，所述分子被RISC摄入，引起RNA干扰。本公开文本中的shRNA在分子中包含至少1个DNA。

本公开文本的RNAi分子为shRNA的情况下，涉及siNA中反义链的记载适用于shRNA的反义区域，涉及siNA中正义链的记载适用于shRNA的正义区域。因此，本公开文本的shRNA在反义区域中包含CnGACnC序列。另外，本公开文本的shRNA的反义区域及正义区域可以各自独立地为长度约15～49个核苷酸、约17～35个核苷酸、约17～30个核苷酸、约15～25个核苷酸、约18～25个核苷酸、约18～23个核苷酸、约19～21个核苷酸、约25～30个核苷酸、或约26～28个核苷酸。另外，双链区域可以为长度约15～49个核苷酸、约15～35个核苷酸、约15～30个核苷酸、约15～25个核苷酸、约17～25个核苷酸、约17～23个核苷酸、约17～21个核苷酸、约25～30个核苷酸、或约25～28个核苷酸。另外，环区域的长度只要能够通过dicer切割即可，没有特殊的限制，例如，可以为约2～100个核苷酸、约3～80个核苷酸、约4～70个核苷酸、约5～60个核苷酸、约6～50个核苷酸等。

一个方式中，本公开文本的RNAi分子抑制BcL2家族的蛋白质表达。优选的方式中，BcL2家族为凋亡抑制性BcL2家族。凋亡抑制性BcL2家族包括BcL-2、BcL-XL、BFL1、BcL-W等。特别优选的方式中，BcL2家族分子为BcL-XL。凋亡抑制性BcL2家族分子被认为通过与凋亡促进性BcL2家族分子(例如，BAX、BOK、BAK等多结构域蛋白质、BIM、BAD、BID、NOXA、PUMA(Bbc3)、BMF、HRK、BIK等仅具有BH3的蛋白质(BH3-only protein))的相互作用来抑制凋亡。在特定的方式中，本公开文本的RNAi分子抑制BcL-XL的表达。

更优选的方式中，除BcL-XL以外，本公开文本的RNAi分子至少抑制选自MRS2、RFC1、BcL-2、Smad1、P21、TJP2、SIKE1、GPANK1、HSPA12A及TYW3的一种以上的基因的表达。在特定的方式中，本公开文本的RNAi分子至少抑制包含以下的基因组合的基因的表达：BcL-XL及MRS2；BcL-XL及RFC1；BcL-XL及BcL-2；BcL-XL及Smad1；BcL-XL及P21；BcL-XL及TJP2；BcL-XL及SIKE1；BcL-XL及GPANK1；BcL-XL及HSPA12A；BcL-XL及TYW3；BcL-XL、MRS2及RFC1；BcL-XL、BcL-2及Smad1；BcL-XL、BcL-2及P21；BcL-XL、BcL-2及MRS2；BcL-XL、Smad1及P21；BcL-XL、Smad1及MRS2；BcL-XL、P21及MRS2；BcL-XL、Smad1、P21及MRS2。

对基因表达或蛋白质表达的抑制可例如通过对经本公开文本的RNAi分子作用的细胞与未经作用的细胞中的基因或蛋白质的表达量加以比较来评价。基因的表达量可利用任何已知手段，例如，通过利用与编码该基因的核酸分子或其特有的片段特异性地杂交的核酸的各种杂交法、Northern印迹法、Southern印迹法、各种PCR法等检测所述核酸分子来确定。另外，蛋白质表达量可利用已知的蛋白质检测方法来确定，例如但不限于利用了抗体的免疫沉淀法、EIA(酶免疫测定法，enzyme immunoassay)(例如，ELISA(酶联免疫吸附测定法，emzyme-linked immunosorbent assay)等)、RIA(放射免疫分析法，radio immunoassay)(例如，IRMA(免疫放射分析法，immunoradiometric assay)、RAST(放射过敏原吸附试验，radioallergosorbent test)、RIST(放射免疫吸附试验，radioimmunosorbent test)等)、Western印迹法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、流式细胞术等。

一个方式中，本公开文本的RNAi分子以编码BcL-XL的BcL2L1为靶标。BcL2L1的序列是已知的，人BcL2L1的mRNA序列被登录为例如登录号NM_138578.3(序列号9)、NM_001317919.1(序列号10)、NM_001317920.1(序列号11)、NM_001317921.1(序列号12)、NM_001322239.1(序列号13)、NM_001322240.1(序列号14)、NM_001322242.1(序列号15)。本公开文本的RNAi分子的反义链包含序列号1的核苷酸序列，因此，本公开文本的RNAi分子典型地是以BcL2L1中的包含与序列号1具有互补性的序列(GAGTCAG、序列号16)的区域作为靶标。“具有互补性的”或“互补的”意指某一核酸分子与其他核酸分子能够通过形成经典的沃森-克里克型、或其他的非经典型的方式来形成氢键。“互补性百分比”表示能与某一核酸分子形成氢键(例如，沃森-克里克碱基对)的其他核酸分子的核苷酸的百分率。例如，第一多核苷酸的合计10个核苷酸中的5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸与具有10个核苷酸的第二核酸分子形成碱基对的情况下，互补性百分比分别为50％、60％、70％、80％、90％或100％。“完全互补的”或“具有完全的互补性”意指某一核酸分子的全部核苷酸与其他核酸分子中的相同数目的连续的核苷酸以氢键键合。一个方式中，本公开文本的RNAi分子的反义链与靶核酸分子或其部分完全互补。

优选的方式中，本公开文本的RNAi分子于反义链(或反义区域)的5’末端起第2～8位具有序列号1的核苷酸序列。特别优选的方式中，本公开文本的RNAi分子具有包含以下序列的反义链(或反义区域)。需要说明的是，靶标部位显示的是NM_138578.3(序列号2)中的位置。

[表1]

表1示例的反义链的序列

序列号	序列(5′至3′)	长度	靶标部位
				17	ACnGACnCCAGCUGU	15	446-460
18	ACnGACnCCAGCUGUA	16	445-460
				19	ACnGACnCCAGCUGUAU	17	444-460
20	ACnGACnCCAGCUGUAUC	18	443-460
				21	ACnGACnCCAGCUGUAUCC	19	442-460
22	ACnGACnCCAGCUGUAUCCU	20	441-460
				23	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUU	21	440-460
24	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUU	22	439-460
				25	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUC	23	438-460
26	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCU	24	437-460
				27	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUG	25	436-460
28	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGG	26	435-460
				29	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGG	27	434-460
30	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGA	28	433-460
				31	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGAA	29	432-460
32	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGAAA	30	431-460
				33	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGAAAG	31	430-460
34	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGAAAGC	32	429-460
				35	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGAAAGCU	33	428-460
36	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGAAAGCUU	34	427-460
				37	ACnGACnCCAGCUGUAUCCUUUCUGGGAAAGCUUG	35	426-460

本公开文本的RNAi分子可与已知的任意的递送担载体(其对于向作用部位的递送具有辅助、促进或简单化的作用)一同递送或施予，也可无需上述递送担载体而直接进行递送或施予。作为递送担载体，可使用病毒载体或非病毒载体。

作为病毒载体，可不受限制地举出基于腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、慢病毒、疱疹病毒等的载体。病毒载体可以是溶瘤性的。溶瘤性病毒载体在癌的处置中是特别有用的。

作为非病毒载体，可不受限制地举出例如聚合物粒子、脂质粒子、无机粒子等粒子状担载体、细菌载体等。作为粒子状担载体，可使用大小为纳米水平的纳米粒子。作为聚合物粒子，没有限定，可举出例如含有阳离子性聚合物、聚酰胺胺(PAMAM)、脱乙酰壳多糖、环糊精、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸己内酯共聚物(PLCA)、聚(β氨基酯)、去端胶原蛋白(atelocollagen)等聚合物的聚合物粒子。脂质粒子包括脂质体、非脂质体型脂质粒子等。脂质体是具有被脂质双层膜包围的内腔的小泡，非脂质体型脂质粒子是不具有这样的结构的脂质粒子。作为无机粒子，可举出例如金纳米粒子、量子点、二氧化硅纳米粒子、氧化铁纳米粒子(例如，超顺磁氧化铁纳米粒子(SPION))、纳米管(例如，碳纳米管(CNT))、纳米金刚石、富勒烯等。作为细菌载体，可不受限制地举出例如基于李斯特菌、双歧杆菌、沙门氏菌等的载体。

本公开文本的RNAi分子可介由皮肤施用、经皮施用或注射(静脉注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射、动脉注射、点滴注射等)，进行全身施予、或者以离体(ex vivo)或体内(in vivo)的方式局部施予至相关的组织。

本公开文本的RNAi分子可利用适合目的的递送系统来递送。递送系统可包括例如水性及非水性的凝胶、霜、复合乳液、微乳液、脂质体、软膏、水性及非水性的溶液、洗剂、气雾剂、烃基剂及粉末等，并且可含有赋形剂、例如增溶剂、促渗透剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪族醇及氨基酸等)及亲水性聚合物(例如，聚卡波非及聚乙烯吡咯烷酮等)。一个方式中，药学上可允许的担载体为脂质体或经皮促进剂。

递送系统也可包括贴片、片剂、栓剂、阴道栓剂、凝胶及霜，并且可含有赋形剂、例如增溶剂及促进剂(例如丙二醇、胆汁酸盐及氨基酸等)、及其他媒介物(vehicle)(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯及衍生物、及亲水性聚合物、例如羟丙基甲基纤维素及透明质酸等)。

可用于递送本公开文本的RNAi分子的方法、系统记载于例如Rettig和Behlke，MolTher.2012；20(3)：483-512、Kraft等，J Pharm Sci.2014；103(1)：29-52、Hong和Nam，Theranostics.2014；4(12)：1211-32、Kaczmarek等，Genome Med.2017；9(1)：60等中。

本公开文本的一些方式涉及含有本公开文本的RNAi分子的组合物(以下有时称为本公开文本的组合物)。本公开文本的组合物不仅可含有本公开文本的RNAi分子，也可含有上述的任意的担载体、稀释剂、递送媒介物、递送系统等。本公开文本的组合物可用于处置癌等的疾病。因此，本公开文本的组合物可以成为用于处置癌等疾病的医药组合物(以下，有时称为本公开文本的医药组合物)。本公开文本的医药组合物可含有1种或2种以上药学上可允许的添加物(例如，表面活性剂、担载体、稀释剂、赋形剂等)。药学上可允许的添加物在医药领域中是熟知的，记载于例如全部内容被本说明书引用的Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)等中。

一些方式中，本公开文本的RNAi分子和医药组合物可用于能够通过BcL-XL的抑制而改善的疾病的处置。作为能够通过BcL-XL的抑制而改善的疾病，例如可举出细胞增殖性疾病等。细胞增殖性疾病的非限定例包括癌、淋巴增殖性疾病、真性红细胞增多症、肺动脉高压、增生症、瘢痕瘤、库欣综合症、原发性醛固酮增多症、红斑症、白斑症、增生性瘢痕、扁平苔癣及黑子病。癌包含上皮性恶性肿瘤及非上皮性恶性肿瘤。作为成为处置的对象的癌，没有限定，可举出例如脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、大肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌、皮肤癌、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等。癌可以位于任意的部位，例如脑、头颈部、胸部、四肢、肺、心脏、胸腺、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)大肠(结肠、盲肠、阑尾、直肠)、肝脏、胰腺、胆囊、肛门、肾、输尿管、膀胱、前列腺、阴茎、精巢、子宫、卵巢、外阴、阴道、皮肤、横纹肌、平滑肌、滑膜、软骨、骨、甲状腺、肾上腺、腹膜、肠系膜、骨髓、血液、血管系统、淋巴结等淋巴系统、淋巴液等中。

在特定的方式中，本公开文本的RNAi分子及医药组合物可用于处置与表达了BcL-XL的细胞的增殖相关的疾病，例如，可用于处置表达了BcL-XL的癌。优选的方式中，细胞或癌中的BcL-XL被过量表达。某一细胞或癌症是否表达BcL-XL、或是否过量表达BcL-XL可以基于文献等来了解，或者可以通过检测细胞或构成癌的癌细胞中的BcL-XL的表达来进行确定。对于BcL-XL的表达而言，可利用已知的任何手段来进行确定，例如，通过利用与编码BcL-XL的核酸分子(BcL2L1)或其特有的片段特异性地杂交的核酸的各种杂交法、Northern印迹法、Southern印迹法、各种PCR法等来检测所述核酸分子；通过利用已知的蛋白质检测方法、例如但不限于利用了抗体的免疫沉淀法、EIA(例如，ELISA等)、RIA(例如，IRMA、RAST、RIST等)、Western印迹法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、流式细胞术等来检测BcL-XL。对于细胞中的BcL-XL的过量表达而言，由于存在由BcL2L1基因的扩增导致的情况，因此可以将BcL2L1基因的扩增作为BcL-XL的过量表达的一个指标。据报道，在膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、胃癌、子宫癌等中观察到了BcL2L1基因的扩增(Campbell and Tait,OpenBiol.2018；8(5):180002)。

成为利用本公开文本的RNAi分子处置的对象的细胞或癌优选除BcL-XL外还表达选自MRS2、RFC1、BcL-2、Smad1、P21、TJP2、SIKE1、GPANK1、HSPA12A及TYW3的一种以上的基因。在特定的方式中，成为利用本公开文本的RNAi分子处置的对象的细胞或癌至少表达包含以下的基因组合的基因：BcL-XL及MRS2；BcL-XL及RFC1；BcL-XL及BcL-2；BcL-XL及Smad1；BcL-XL及P21；BcL-XL及TJP2；BcL-XL及SIKE1；BcL-XL及GPANK1；BcL-XL及HSPA12A；BcL-XL及TYW3；BcL-XL、MRS2及RFC1；BcL-XL、BcL-2及Smad1；BcL-XL、BcL-2及P21；BcL-XL、BcL-2及MRS2；BcL-XL、Smad1及P21；BcL-XL、Smad1及MRS2；BcL-XL、P21及MRS2；BcL-XL、Smad1、P21及MRS2。

本公开文本中，“处置”包括以疾病的治愈、暂时性缓解或预防等为目的的、医学上允许的所有种类的预防性及/或治疗性介入。例如，“处置”包括医学上允许的出于各种目的的介入，所述目的包括：疾病发展的延迟或停止、病变的缩减或消失、该疾病发病的预防或复发的防止等。因此，前述RNAi分子及医药组合物可用于疾病的治疗及/或预防。

本公开文本的RNAi分子及医药组合物还可用于处置起因于凋亡的异常的疾病，例如起因于细胞的异常增殖的疾病等。作为起因于细胞的异常增殖的疾病，包括但不限于例如良性或者恶性肿瘤、增生症、瘢痕瘤、库欣综合症、原发性醛固酮增多症、红斑症、真性红细胞增多症、肺动脉高压、白斑症、增生性瘢痕、扁平苔癣及黑子病等。

本公开文本的RNAi分子及医药组合物还可用于处置起因于BcL-XL的表达的疾病，例如起因于与BcL-XL的表达相伴的细胞的异常增殖的疾病等。作为起因于细胞的异常增殖的疾病，包括但不限于例如良性或者恶性肿瘤、淋巴增殖性疾病等。

本公开文本的RNAi分子或医药组合物可通过包括口服及非口服这两者的各种途径(例如，口服、颊侧、口腔内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、局部、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻腔内、腹腔内、气管内、肺内及子宫内等途径，不受限定)进行施予，也可制备为适于各施予途径的剂型。所述剂型及制剂方法可适当采用任意的已知剂型及制剂方法(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)等)。

例如，作为适于口服施予的剂型，没有限定，可举出例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外，作为适于非口服施予的剂型，可举出溶液性注射剂、悬浮性注射剂、乳浊性注射剂、使用前配制型注射剂等注射剂。非口服施予用制剂可以是水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态。

本公开文本涉及的组合物可通过任意形态来供给，从保存稳定性的观点考虑，可以以能够在使用前配制的形态提供，例如，可以以能够由医师及/或药剂师、护士或其他辅助医务人员等在医疗现场或其附近进行配制的形态提供。这种情况下，前述组合物以其必需构成要素中的至少1种包含于1个或2个以上的容器中的形式被提供，可在使用之前、例如24小时前以内、优选3小时前以内、并且更优选在即将使用之前进行配制。配制时，可适当使用在配制场所通常能够获得的试剂、溶剂、配药器具等。

本公开文本的另一其他方式还涉及：用于处置疾病的试剂盒或包(pack)，其包含本公开文本涉及的RNAi分子或组合物或其构成要素，用于制备前述RNAi分子或组合物；以及，以所述试剂盒或包的形式提供的前述RNAi分子或组合物、或其必要构成要素。所述试剂盒或包中所含的RNAi分子或组合物的各构成要素如上文中关于前述RNAi分子或组合物所述。本试剂盒除了上述以外还可包含关于RNAi分子或组合物的制备方法、使用方法(例如，施予方法等)等的指示，例如使用说明书、记录有关于使用方法的信息的介质、例如软盘、CD、DVD、蓝光碟片、内存卡、U盘等。另外，所述试剂盒或包可包含用于完成RNAi分子或组合物的全部构成要素，但并非必须包含全部构成要素。因此，前述试剂盒或包可以不包含在医疗现场、实验机构等通常能够获得的试剂、溶剂、例如无菌水、生理盐水、葡萄糖溶液等。

本公开文本的另一方式涉及对能够通过BcL-XL的抑制而改善的疾病、起因于凋亡的异常的疾病或起因于BcL-XL的表达的疾病进行处置的方法(以下有时称为“本公开文本的处置方法”)，该方法包括将有效量的本公开文本涉及的RNAi分子或医药组合物施予至需要处置的对象的步骤。此处，有效量是指例如预防该疾病的发病及复发、或治愈该疾病的量。此外，本公开文本的处置方法中的“能够通过BcL-XL的抑制而改善的疾病”、“起因于凋亡的异常的疾病”、“起因于BcL-XL的表达的疾病”、“处置”的各个术语如上述针对本公开文本的RNAi分子所述。

前述处置方法中施予至对象的RNAi分子或医药组合物的具体用量可考虑与需要施予的对象相关的下述各种条件而确定：例如，靶标的种类、方法的目的、治疗内容、疾病的种类、症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、膳食、施予的时期及频率、合用的医药、对于治疗的反应性、及对于治疗的依从性等。前述RNAi分子或医药组合物的每天的总施予量没有限定，可以是例如以RNAi分子的量计约1μg/kg～约1000mg/kg体重、约10μg/kg～约100mg/kg体重、约100μg/kg～约10mg/kg体重。或者，施予量可基于患者的表面积来计算。

作为施予途径，包括包含口服及非口服这两者在内的各种途径，例如，口服、颊侧、口腔内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、局部、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻腔内、腹腔内、气管内、肺内及子宫内等。

对于施予频率而言，根据使用的制剂或组合物的性状、如上所述的对象的条件的不同而不同，例如，可以是每天多次(即每天2、3、4次或5次以上)、每天1次、每数天(即每2、3、4、5、6、7天等)、每周数次(例如，每周2、3、4次等)、每周、每数周(即每2、3、4周等)。

本公开文本中，用语“对象”表示任意的生物个体，优选为动物，更优选为哺乳动物，进一步优选为人类的个体。对象可以是健康的(例如，未患有特定或任意的疾病)，也可患有某种疾病，但在谋求对与靶核酸分子相关的疾病的处置等时，典型地表示患有该疾病或具有罹患该疾病的风险的对象。

本公开文本的其他方面涉及本公开文本的RNAi分子在用于能够通过BcL-XL的抑制而改善的疾病、起因于凋亡的异常的疾病及/或起因于BcL-XL的表达的疾病的处置的药物的制造中的用途(以下有时称为“本公开文本的用途”)。

本公开文本的用途中的“能够通过BcL-XL的抑制而改善的疾病”、“起因于凋亡的异常的疾病”、“起因于BcL-XL的表达的疾病”、“处置”的各个术语如上述针对本公开文本的RNAi分子所述。

实施例

通过以下例子更详细地说明本公开文本的一些方式，但这些例子仅出于示例的目的，并非对前述方式的范围进行限定。

例1：对以BcL-XL为靶标的siRNA的癌细胞增殖抑制能力的验证

作为以BcL-XL作为靶标的siRNA，使用以下siRNA进行实验。

化合物X(反义链中包含CUGACUC序列)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACUGACUCCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号39)

化合物Y(反义链中不包含CUGACUC序列)

正义链：5’-GGUAUUGGUGAGUCGGAUCtt-3’(序列号40)

反义链：5’-GAUCCGACUCACCAAUACCtt-3’(序列号41)

化合物Z(对照，Allstars阴性对照siRNA(QIAGEN公司))

在37℃、5％CO₂的条件下，针对大肠癌细胞株HCT116使用McCOY’s 5A培养基(Sigma-Aldrich公司)，针对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、皮肤癌细胞株A375、大肠癌细胞株SW480使用DMEM培养基(Sigma-Aldrich公司)(所述培养基分别含有经过失活处理的胎牛血清(FBS)10％、且含有100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素作为抗生素)进行培养。

siRNA(化合物X～Z)的转染按以下操作进行。在转染的前一天，将HCT116、A375以成为0.25×10⁵个/孔的方式、将MDA-MB-231、SW480以成为0.5×10⁵个/孔的方式接种至6孔组织培养塑料皿中。向125μL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen)中添加27.5pmol siRNA，轻柔地进行混合。然后，将3μL的Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)稀释于125μL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中，轻柔地进行混合。合并稀释而得的siRNA和稀释而得的Lipofectamine RNAiMAX，轻柔地进行混合后，于室温孵育15分钟。期间，将培养基更换为2.5mL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium。孵育15分钟后，将siRNA和Lipofectamine RNAiMAX的复合物加入至细胞，于37℃、包含5％CO₂的空气中进行孵育。孵育5小时后，更换为3mL的加入了10％FBS的培养基。转染后，于第3天测量细胞数量。如图1的结果所示，在任一种癌细胞中，化合物X均比化合物Y更强地抑制增殖。

例2：对以BcL-XL为靶标的siRNA的癌细胞增殖抑制能力和癌细胞杀伤能力的验证

在37℃、5％CO₂的条件下，针对肺癌细胞株A549使用DMEM培养基(Sigma-Aldrich公司)、针对胰腺癌细胞株SUIT-2使用MEM培养基(Sigma-Aldrich公司)、针对胰腺癌细胞株SW1990使用RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich公司)(所述培养基均分别含有经过失活处理的胎牛血清(FBS)10％、且含有100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素作为抗生素)进行培养。

siRNA(化合物X～Z)的转染按以下操作进行。在转染的前一天，将A549、SUIT-2的细胞以成为0.15×10⁴个/孔的方式、将SW1990的细胞以成为0.45×10⁴个/孔的方式，接种至96孔组织培养塑料皿中。向5μL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中添加1.1pmolsiRNA，轻柔地进行混合。然后，将0.12μL的Lipofectamine RNAiMAX稀释于4.88μL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中，轻柔地进行混合。合并稀释而得的siRNA和稀释而得的Lipofectamine RNAiMAX，轻柔地进行混合后，于室温孵育15分钟。期间，将培养基更换为100μL的Opti-MEM I Reduced Serum Medium。孵育15分钟后，将siRNA和LipofectamineRNAiMAX的复合物加入至细胞，于37℃、包含5％CO₂的空气中进行孵育。

孵育5小时后，更换为3mL的加入了10％FBS的各培养基。于转染后第4天，将Hoechst 33342(Thermo Fisher公司，#H3570)和碘化丙啶(Wako公司，#169-26281)分别以最终浓度成为5μg/mL、2μg/mL的方式添加至培养基中，在Celigo^(R)Image Cytometer(Nexcelom Bioscience公司，#Celigo-106-0448)中，将被Hoechst33342染色的细胞作为活细胞数量和死细胞数量的总和，将被碘化丙啶染色的细胞作为死细胞数量，测量活细胞数量、死细胞数量。如图2-1～2-3的结果所示，在任一种癌细胞中，化合物X均比化合物Y更强地抑制增殖，就细胞死亡的比例而言，化合物X也高于化合物Y。

例3：基于化合物X的、对BcL-XL以外的基因表达的影响

将siRNA与例1同样地导入HCT116细胞，进行孵育后，回收RNA，逆转录为cDNA。使用所获得的cDNA，通过7300Real Time PCR System(Applied Bio Systems)，以定量PCR法定量BCL2、SMAD1、P21、MRS2的mRNA量。如图3的结果所示，化合物Y不抑制BCL2、SMAD1、P21、MRS2的表达，与之相对，化合物X抑制所有这些基因的表达。

例4：化合物X的凋亡诱导活性的验证

除细胞的接种密度为0.2×10⁵个/孔以外，将siRNA与例1同样地导入HCT116细胞，进行孵育。于孵育后第3天制备细胞提取液，通过Western印迹分析作为凋亡信号的活化Caspase 3以及活化PARP的表达变化。

按以下操作进行Western印迹。细胞用冰冷的PBS洗涤后，添加TNE裂解缓冲液(1％NP-40、50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、complete Mini EDTA-free(Roche公司)、PhosSTOP(Roche公司)、pH7.5)，在冰冷条件下孵育30分钟进行溶解。然后，在15000rpm、4℃的条件下离心15分钟，将上清液作为细胞提取液。所获得的细胞提取液用Micro BCAProtein Assay Kit(Thermo Scientific)进行蛋白质的定量，向10μg的细胞提取液中添加Red Loading Buffer Pack(New England Biolabs公司)，热处理(100℃、5分钟)使其变性，通过使用了SuperSep^TM Ace(Wako公司)的SDS-PAGE，将蛋白质进行分离。分离后，使用半干式印迹仪(Bio-Rad公司)，转印至PVDF印迹膜(Immobilon-P：Millipore)。膜用添加了5％脱脂奶/0.05％吐温20的PBS(以下简称PBS-T)于室温下孵育1小时，进行封闭。之后，使用以PBS-T稀释的各种一抗(Bcl-xL(54H6)兔mAb#2764(CST公司)、PARP抗体#9542(CST公司)、经剪切的Caspase-3(Asp175)(5A1E)兔mAb#9664(CST公司)、抗GAPDH抗体[6C5](abcam公司))于4℃孵育16小时。用PBS-T洗涤后，与相应的结合了HRP的抗小鼠或兔IgG(CST公司)一同在室温下孵育60分钟，然后用PBS-T洗涤，使其与SuperSignal^TM West Femto MaximumSensitivity Substrate(Thermo Scientific)反应后，使用chemidoc(Bio-Rad公司)对化学发光进行检测。各步操作之间的洗涤利用PBS-T，振荡5分钟，实施3次。如图4的结果所示，利用化合物X，观察到作为凋亡信号的活化Caspase-3以及活化PARP，表明凋亡被诱导。另一方面，利用化合物Y则没有观察到活化Caspase-3，仅观察到少量的活化PARP。

例5：对化合物X的体内抗肿瘤效果的验证

向BALB/c nu/nu小鼠(6～8周龄、雌性、n＝4、自日本CLEA公司购入)中皮下接种1.0×10⁵个大肠癌细胞系HCT1116细胞，使其成为荷癌小鼠。自接种后第14天开始，将化合物X或化合物Z按每1g小鼠体重1mg的用量每周2次施予至肿瘤内，用卡尺测定肿瘤的体积。需要说明的是，对于各化合物的递送，使用LipoTrust^TM EX Oligo<in vivo>(北海道SystemScience公司)。并且，于接种后第35天将小鼠安乐死，测定肿瘤重量。肿瘤体积的推移示于图5，肿瘤重量的比较示于图6。由两图可知，化合物X在体内也显著地抑制了肿瘤的增殖。

例6：将CUGACUC序列的核苷酸变更为DNA导致的癌细胞增殖抑制能力的增强

评价使将CUGACUC序列的核苷酸变更为DNA而得的siNA作用时的细胞增殖抑制能力。

除化合物X以外，作为siNA使用由以下核苷酸序列组成的siNA。

化合物D1(反义链中包含序列号2)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-AcUGACUCCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号42)

化合物D2(反义链中包含序列号3)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACtGACUCCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号43)

化合物D3(反义链中包含序列号4)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACUgACUCCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号44)

化合物D4(反义链中包含序列号5)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACUGaCUCCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号45)

化合物D5(反义链中包含序列号6)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACUGAcUCCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号46)

化合物D6(反义链中包含序列号7)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACUGACtCCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号47)

化合物D7(反义链中包含序列号8)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACUGACUcCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号48)

化合物D8(反义链中包含CUgAcUc序列)

正义链：5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUtt-3’(序列号38)

反义链：5’-ACUgAcUcCAGCUGUAUCCtt-3’(序列号49)

在37℃、5％CO₂的条件下，针对肺癌细胞株A549使用含有经过失活处理的胎牛血清(FBS)10％、且含有100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素作为抗生素的DMEM培养基(10％FBS/DMEM)进行培养。在6孔板的各个孔中，混和500μL含有50pmol siNA的Opti-MEM IReduced Serum Medium与500μL含有15μL Lipofectamine RNAiMAX的Opti-MEM，于室温放置15分钟。向其中加入2mL的0.25x10⁵个/mL的A549，于37℃进行培养。1天后或6天后，以倒置显微镜拍摄明视野图像后，回收RNA，逆转录为cDNA，然后使用7300Real Time PCRSystem(Applied BioSystems)，以定量法定量BcL-XL、MRS2及RFC1的mRNA量。图7示出的结果显示为基于GSTP1的表达量对得到的数值进行标准化、并以对照(化合物Z)为100％时的相对值。基于稳定表达的GSTP1的扩增量评价细胞存活率。结果示于图8～9中。将CUGACUC序列的核苷酸变更为DNA而得的siNA均导致了细胞存活率的降低。将自反义链5’末端侧起第5、6或7位的核苷酸变更为DNA而得的siNA的细胞增殖抑制效果特别高。

本领域技术人员理解，在不脱离本发明宗旨的情况下可进行多种多样的改变。因此，本说明书记载的本发明的方案仅为示例，其不应理解为具有对本发明的范围进行限定的意图。

Claims

1.RNAi分子，其在反义链中包含序列号1的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的RNAi分子，其中，序列号1的核苷酸序列被配置在反义链的自5’起第2～8位。

3.如权利要求1或2所述的RNAi分子，其抑制BcL2家族的蛋白质表达。

4.如权利要求3所述的RNAi分子，其中，BcL2家族为BcL-XL。

5.如权利要求1～4中任一项所述的RNAi分子，其中，反义链包含序列号21的核苷酸序列。

6.如权利要求1～5中任一项所述的RNAi分子，其中，序列号1的核苷酸序列选自序列号5～7的核苷酸序列。

7.医药组合物，其含有权利要求1～6中任一项所述的RNAi分子、及任选的药学上可允许的添加物。

8.如权利要求1～6中任一项所述的RNAi分子或权利要求7所述的组合物，其用于癌的处置。

9.如权利要求8所述的RNAi分子或组合物，其中，癌表达了BcL-XL。

10.如权利要求9所述的RNAi分子或医药组合物，其中，癌选自由脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、大肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌、皮肤癌、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病组成的组。

11.癌的处置方法，其包括将有效量的权利要求1～6、8～10中任一项所述的RNAi分子、或权利要求7～10中任一项所述的组合物施予至需要其的对象的步骤。