JP2018512060A

JP2018512060A - Ｒｎａ干渉組成物及び悪性腫瘍のための方法

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Publication number: JP2018512060A
Application number: JP2017534294A
Authority: JP
Inventors: イン，ウェンビン; 洋司郎新津; 憲二郎味呑; マジェッティ，バラット; ワン，リー; リュー，ジーフア; アダミ，ロジャー
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2018-05-10
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Abstract

本発明は、対象における悪性腫瘍を治療するための活性剤を分配する際に使用するための組成物を提供する。本発明は、対象における悪性腫瘍を治療するための活性剤を分配する際に使用するための組成物を提供する。この組成物は、ヒトp21を標的とするRNAi分子と共に、ヒトGST-πを標的とするRNAi分子及び薬学的に許容される担体を含有する。担体は、イオン化可能な脂質、構造脂質、1つ以上の安定化脂質、及びナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質からなるナノ粒子を含むことができる。本発明はさらに、RNAi組成物の治療有効量を投与することによって悪性腫瘍を予防又は治療するための方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、核酸を基礎とする分子からなる生物医薬品及び治療剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、悪性腫瘍に関する状態及び疾患の影響を予防、治療又は緩和するためのRNA干渉剤を送達するための方法及び組成物に関する。

この出願は、100,000バイトのサイズであるND5123179WO_SL.txtと名付けられた2015年12月20日に作成されたASCIIファイルとして電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

KRAS遺伝子の変異は、例えば肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌及び結腸直腸癌といった悪性腫瘍に関連し得る。最近の所見からは、タンパク質グルタチオンS-トランスフェラーゼ-π（GST-π）のレベル上昇とこのようなKRAS突然変異とが関連していることが示唆される。

いかなる特定の理論に拘泥することを望まないが、細胞内のGST-πの抑制により、細胞周期調節タンパク質p21のレベルが驚くほど上昇することが見出されている。

細胞周期調節タンパク質p21の機能の1つは、アポトーシスを阻害することである。例えば、p21は、インビトロ及びインビボの両方において、化学療法剤によって誘導されるアポトーシスから細胞を保護する効果を有し得る。例えば、Gartel and Tyner、2002、Mol Cancer Ther., 2002、1（8）：639-49； Abbas and Dutta、2009、Nat Rev Cancer., 2009、9（6）：400-14を参照のこと。p21はCDKN1A遺伝子によってコードされ、CIP/KIPファミリーに属する。p21は、サイクリン-CDK複合体を結合することによってG1期及びG2/M期における細胞周期の進行を阻害するように機能することができる。例えば、p21遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子であるp53によって活性化される。DNA損傷によるp53の活性化により、p53はp21を活性化し、細胞周期がG1期及びG2/M期で停止するようにする。

GST-πは6つのアイソザイムのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（IUBMB EC 2.5.1.18）ファミリーのメンバーであり、疎水性化合物と還元型グルタチオンを有する求電子性化合物との結合を触媒することで解毒の役割を果たす。GST-π遺伝子（GSTP1）は、生体異物代謝において機能すると考えられる、機能的に異なる、GSTP1変異タンパク質をコードする多型遺伝子である。GSTP1は、癌の感受性において役割を果たす可能性があり、腫瘍細胞において豊富に発現している。例えば、Aliya S. et al. Mol Cell Biochem., 2003年11月; 253（1-2）：319-327。グルタチオンS-トランスフェラーゼ-πは、ヒトにおいてGSTP1遺伝子によってコードされる酵素である。例えば、Bora PS、et al. （Oct.1991）J. Biol. Chem., 266（25）：16774-16777。GST-πアイソザイムはGSHのいくつかのアルキル化抗癌剤とのコンジュゲーションを触媒することが示されており、これはGST-πの過剰発現が腫瘍細胞抵抗をもたらすことを示唆している。

胃癌、食道癌、結腸癌、膵臓癌、肝細胞癌及び胆道癌を含む様々な消化管悪性腫瘍を有する患者において、血清GST-πレベルの上昇が観察された。ステージIII又はIVの胃癌患者の80％以上及びステージI並びにIIの患者の約50％において、血清GST-πレベルの上昇を示した。例えば、Niitsu Y、et al. Cancer、1989年1月15日; 63（2）：317-23。GST-πは、化学療法後の口腔癌患者における腫瘍の再発を予測するのに有用なマーカーであることが判明した。例えば、Hirata S. et al. Cancer、1992 Nov 15:70（10）：2381-7。

ヒト結腸直腸癌において、KRAS突然変異は、AP-1の活性化を介してGST-πの過剰発現を誘導すると考えられる。例えば、Miyanishiら、Gastroenterology、2001; 121（4）：865-74。

GST-πの発現は、いくつかの抗癌剤に対する耐性に関連し得る種々の癌細胞において増加する。例えば、Banら、Cancer Res., 1996,56（15）：3577-82; Nakajimaら、J Pharmacol Exp Ther., 2003、306（3）：861-9。

GST-πを抑制する薬剤は、細胞内でアポトーシスを誘導するものとして開示されている。しかし、そのような組成物及び技術はまた、オートファジーを引き起こし、種々の薬剤による作用の組み合わせを必要とした。例えば、US2014/0315975A1を参照されたい。さらに、GST-πの抑制は、腫瘍を縮小又は抑制することは見出されていない。例えば、GST-πを過剰発現する癌において、腫瘍の重量はGST-πの抑制によって影響されなかったが、他の効果が観察された。例えば、Hokaiwadoら、Carcinogenesis、2008,29（6）：1134-1138を参照されたい。

GST-π及びp21の発現を阻害するためのsiRNA配列、化合物及び構造のような、悪性疾患を有する患者のための治療法を開発するための方法及び組成物が緊急に必要とされている。

悪性腫瘍を予防又は治療するための方法及び組成物が必要とされている。悪性腫瘍を予防、治療又は低減するためのRNAi分子、及び他の構造並びに組成物に対する継続的な必要性が存在する。

本発明は、ヒトp21を標的とするRNAi分子と組み合わせて、ヒトGST-πを標的とするRNAi分子の組成物及び方法を提供する。この組成物は、薬学的に許容される担体を含む。

本発明は、悪性腫瘍のための生物医薬品及び治療剤で使用するための分子及びその組成物に関する。より詳細には、本発明は、活性薬剤又は薬物化合物を、悪性腫瘍を有する細胞、組織、器官及び被験体に対して送達及び分配するためのナノ粒子を提供するための化合物、組成物及び方法に関する。

必要とする対象者における悪性腫瘍の1つ以上の症状を予防、治療又は改善するための方法が含まれる。この方法は、GST-πを標的とするRNAi分子及びp21を標的とするRNAi分子の組成物の有効量を被験体に投与することを含み得る。

本発明の実施形態は、以下を含む：
ヒトGST-πを標的とするRNAi分子、ヒトp21を標的とするRNAi分子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端から2〜8位のうち1つ以上に2'-デオキシヌクレオチドを含んでいても良い。

担体は、RNAi分子をカプセル化するリポソームナノ粒子を含んでいても良い。リポソームナノ粒子は、RNAi分子をカプセル化し、ヒト血清に1時間暴露した後にカプセル化されたRNAi分子の少なくとも80％を保持することができる。リポソームナノ粒子は、10〜1000nm又は10〜150nmのサイズを有していても良い。

組成物は、肺、結腸、腎臓、膵臓、肝臓、骨、皮膚又は腸を含む任意の器官又は組織に位置し得る悪性腫瘍を治療するために活性であって良い。

リポソームナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、1つ以上の安定化脂質及びナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質から構成されていても良い。このイオン性脂質としては、化合物81、化合物71、化合物57、化合物84、化合物49、化合物76、化合物78及び化合物102の群から選択することができる。

本発明は、さらに、必要とする被験体における悪性腫瘍の1つ以上の症状を予防、治療又は改善するための方法を企図する。該方法は、上記組成物の有効量をその被験体に投与する工程を含んでいても良い。

ある実施形態において、悪性腫瘍がKRAS突然変異と関連していてもよく、この方法は、被験体における腫瘍細胞を同定する工程（腫瘍細胞が(i）KRAS遺伝子の突然変異及び(ii）KRASタンパク質の異常な発現レベル、の少なくとも一方を有する）を更に含んでいる。

特定の実施形態において、悪性腫瘍はGST-πを過剰発現するものであっても良い。

RNAi分子は、被験体におけるGST-π及びp21の発現を減少させることができる。ある実施形態において、投与は、被験体におけるGST-π及びp21の発現を少なくとも5日間少なくとも5％減少させることができる。投与は、被験体における悪性腫瘍の体積を、少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％減少させることができる。この方法は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を軽減するか、又は悪性腫瘍の進行を遅延させるか、又は終了させることができる。

特定の実施形態において、投与は、被験体における悪性腫瘍細胞の増殖を減少させることができる。投与は、被験体の悪性腫瘍細胞の少なくとも2％、又は少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも15％、又は少なくとも20％の増殖を減少させることができる。

ある態様において、悪性腫瘍は、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、線維肉腫、肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌又は結腸直腸癌であっても良い。

本発明の実施形態は、1日1回から12回の投与を行う方法を提供することができる。投与は、1,2,3,4,5,6又は7日間の期間、又は1,2,3,4,5,6,8,10又は12週間の期間実施することができる。

ある実施形態では、投与は、12週間までの期間、1日当たり少なくとも1回、0.01〜2mg/kgのRNAi分子の用量とすることができる。さらなる実施形態では、投与は、GST-πRNAi分子について、1〜1000μg/分/mLの平均AUC（0-最終）及び0.1〜50μg/mLの平均Cmaxを提供することができる。特定の実施形態において、投与は、p21RNAi分子について、1〜1000μg/分/mLの平均AUC（0-最終）及び0.1〜50μg/mLの平均Cmaxを提供することができる。

投与方法は、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経口、局所、点滴又は吸入としても良い。

図1は、本発明のGST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤を使用することで、インビボにおいて癌異種移植片腫瘍が著しく減少したことを示している。GST-πsiRNA及びp21 siRNAは、癌異種移植腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、インビボにおける遺伝子ノックダウン効力を示した。癌異種移植モデルを、GST-πsiRNAについて1.15mg/kg及びp21 siRNAについて0.74mg/kgの比較的低用量で利用した。GST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤は、投与後数日以内に有意な腫瘍阻害効力を示した。30日後、GST-πsiRNA及びp21 siRNAは、対照と比較して腫瘍体積が2倍を超えて減少し、著しく有利な腫瘍阻害効力を示した。図2は、本発明のGST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤を使用することで、インビボにおいて癌異種移植片腫瘍が顕著な減少したことを示している。GST-πsiRNA及びp21 siRNAは、癌異種移植腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、インビボにおける遺伝子ノックダウン効力を示した。癌異種移植片モデルを、各siRNAについて0.75mg/kgで比較的低用量で利用した。GST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤は、投与後数日以内に有意な腫瘍阻害効力を示した。30日後、GST-πsiRNA及びp21 siRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、腫瘍体積は対照と比較して1.7倍減少した。図3は、本発明のGST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤がインビトロにおいて癌細胞のアポトーシスによって癌細胞死を増加させたことを示している。インビトロでの癌細胞のアポトーシスを、細胞生存率の低下に関連するアポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションを観察することによってモニターした。図3に示すように、GST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤に対するPUMAの発現レベルは、GST-πsiRNA及びp21 siRNAのトランスフェクションの約2〜4日後から大幅に増加した。図4は、GST-πを標的とする本発明のsiRNAがインビボにおいて同所性肺癌腫瘍を著しく減少させたことを示している。GST-πsiRNAを、A549同所性肺癌腫瘍を提示する無胸腺ヌードマウスに2mg/kgの用量でリポソーム製剤として投与した。最終原発腫瘍重量は、処置群及びビヒクル対照群の剖検時に測定した。GST-πsiRNAは、この6週間の研究において肺癌腫瘍の阻害に対して有意な効力を示した。図4に示すように、43日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害を示し、最終原発腫瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。図5は、GST-πsiRNAについてインビボにおける腫瘍阻害効力を示している。A549細胞を用いた癌異種移植モデルを、0.75mg/kgで比較的低用量のsiRNAで使用した。GST-πsiRNAは、数日以内に有利な腫瘍阻害を示した。36日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害を示し、最終腫瘍平均体積は対照と比較して約2倍有意に減少した。図6は、本発明のGST-πsiRNAがインビトロにおいてアポトーシスにより癌細胞死を大幅に増加させたことを示している。GST-πsiRNAは、細胞生存率の低下に関連するアポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションを引き起こした。図6に示すように、PUMAの発現は、GST-πsiRNAのトランスフェクションの2〜6日後に大きく増加した。図7は、本発明のGST-πsiRNAがA549異種移植片腫瘍に対するインビボにおけるノックダウン効果を呈することを示している。GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、胸腺欠損ヌード（nu/nu）雌マウス（Charles River）において、GST-πを標的とするsiRNAを用いることで観察された。図7に示すように、4mg/kgの用量では、注入後24時間でGST-πmRNAにおいて約40％の有意な減少が検出された。

本発明は、悪性腫瘍への送達のための治療上の組合せにおいて使用するための化合物及び組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、悪性腫瘍細胞並びに悪性腫瘍を有する組織、器官及び被験体に活性薬剤又は薬物化合物を送達及び分配するためのナノ粒子を提供するための化合物、組成物及び方法に関する。

本発明は、活性薬剤を悪性腫瘍の細胞に送達するための一連のイオン化可能な化合物を提供する。他の用途の中でも、本発明のイオン化可能な化合物は、悪性腫瘍を改善するための活性薬剤を送達及び分配するためのナノ粒子を形成するために使用することができる。

本発明の実施形態は脂質様特性を有する広範囲の化合物を含み、そのような化合物は、悪性腫瘍細胞へ取り込ませる活性薬剤を送達するために使用できる。

本発明の組成物及び方法は、遺伝子発現を抑制する薬剤を分配するために使用することができる。遺伝子発現抑制剤としては、リボザイム、アンチセンス核酸、RNA干渉分子（RNAi分子）などの阻害性核酸分子が挙げられる。

別の態様では、本発明は、被験体における新生物の治療のため、GST-π核酸分子又はポリペプチド及びp21核酸分子又はポリペプチドの発現を減少させる治療組成物を利用する方法を提供する。ここで新生物は、KRAS突然変異を含むか又は異常なKRAS発現レベルを示す細胞と関連している。

本発明の治療組成物は、siRNA、shRNA及びアンチセンスRNAのような阻害性核酸分子、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、PiWi相互作用性RNA（piRNA）及び反復関連siRNA（rasiRNA ）を含む。

KRAS関連悪性腫瘍又はKRAS関連癌は、本明細書において、（a）体細胞KRAS突然変異を含む癌細胞又は腫瘍細胞、若しくは（b）KRASの異常発現レベルを有する癌細胞又は腫瘍細胞であって、特に限定されないが、正常な非癌細胞で見出されるレベルと比較したときの、KRASをコードするDNAの増幅、KRAS遺伝子の過剰発現又はKRAS遺伝子の過小発現を含む癌細胞又は腫瘍細胞、として定義される。

GST-πは、GSTP1遺伝子によってコードされ、グルタチオン抱合を触媒する酵素を示す。GST-πは、ヒトを含む様々な動物に存在し、その配列情報はNCBIデータベースアクセッション番号（例えば、ヒト：NP_000843（NM_000852）、ラット：NP_036709（NM_012577）、マウス：NP_038569（NM_013541）等）で与えられる。

本発明は、GST-πをコードするDNA、リボザイム、アンチセンス核酸、DNA/RNAキメラポリヌクレオチド及びそれらを発現するためのベクターを抑制するRNAi分子、並びにGST-πのドミナントネガティブ変異体を包含する。

p21はヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である（例えば、ヒト：NM_000389.4、NM_078467.2、NM_001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1（NP_001207707.1、NP_001278478 NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1）などであり、数字はNCBIデータベースアクセッション番号であり、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ括弧の外側及び内側に示されている）。一例として、ヒトCDKN1A遺伝子のヌクレオチド配列は、NM_000389.4としてデータベースに登録されている。p21は、上記のように配列情報が複数のアクセッション番号で登録されており、複数の転写変種が存在する。

本発明は、p21をコードするDNAを抑制するRNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、DNA/RNAキメラポリヌクレオチド及びそれらを発現するためのベクター、並びにp21のドミナントネガティブ変異体を包含する。

一般に、KRAS突然変異又はKRAS増幅に関連する、例えば肺癌、腎臓癌又は膵臓癌といった新生物を有すると診断された後、GST-πの抑制を伴う治療方法及びp21が選択される。

ここで、GST-πを抑制する薬剤としては、GST-πの産生及び/又は活性を抑制する薬剤、GST-πの分解及び/又は不活性化を促進する薬剤などが挙げられる。GST-π産生を抑制する薬剤としては、RNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、GST-πをコードするDNAのDNA/RNAキメラポリヌクレオチド又はそれらを発現するベクターが挙げられる。

ここで、p21を抑制する薬剤としては、p21の産生及び/又は活性を抑制する薬剤、p21の分解及び/又は不活性化を促進する薬剤などが挙げられる。p21産生を抑制する薬剤としては、RNAi分子、リボザイム、アンチセンス核酸、p21をコードするDNAのDNA/RNAキメラポリヌクレオチド又はそれを発現するベクターが挙げられる。

RNAi分子
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。

本発明の実施形態は、核酸分子を用いたGST-π発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。

本発明の実施形態は、核酸分子を用いたp21発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。

本発明の実施形態は、核酸分子を用いたGST-π及びp21発現の組み合わせの遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。

RNA干渉を媒介することができる核酸分子としては、例えば、siRNA（低分子干渉RNA）、miRNA（マイクロRNA）、shRNA（ショートヘアピンRNA）、ddRNA（DNA指向性RNA）、piRNA（Piwi相互作用性RNA）又はrasiRNA（リピート関連性siRNA）及びそれらの修飾型などの二本鎖RNAを含むRNA干渉で活性な分子（RNAi分子）が挙げられる。

本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。

本発明の核酸分子及び方法は、GST-πをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートするため及びp21をコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートするためにプールされるか又は組み合わせて使用される。

本発明の組成物及び方法は、１以上の核酸分子を含むことができ、組み合わせが、GST-π及びp21タンパク質及び/又はそれらタンパク質をコードする遺伝子、例えば、悪性腫瘍等の疾患、並びにGST-π及びp21に関連する状態又は疾病の維持及び/又は発症に関与するタンパク質及び/又はそれらタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる。

本発明の組成物及び方法は、GST-π及びp21の例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するGST-π又はp21遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにGST-π若しくはp21遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、GST-π遺伝子、例えばヒトGST-πの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することができる。本発明の組成物及び方法は、p21遺伝子、例えばヒトp21の発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することをさらに企図する。

本発明のRNAi分子は、GST-π又はp21を標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。

ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。

例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なる標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。

ある態様において、本発明の組成物及び方法は、GST-πmRNAの任意の部分に対して活性であるRNAi分子を含む。RNAi分子は、GST-π配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含むことができる。本発明はさらに、p21 mRNAの任意の部分に対して活性であるRNAi分子を含む組成物及び方法を企図する。RNAi分子は、p21配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含むことができる。

ある実施形態において、本開示のRNAi分子は、GST-πRNAに対して活性を有することができる。ここで、RNAi分子は、変異体GST-πをコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知である変異GST-π遺伝子に相補的な配列を含む。ある実施形態では、本開示のRNAi分子は、p21 RNAに対して活性を有することができる。ここで、RNAi分子は、変異体p21をコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知である変異p21遺伝子に相補的な配列を含む。

さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、GST-π遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、p21遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。

GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表1に示す。

表1の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを指す。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジンを意味する。

GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表2に示す。

表2の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。

GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表3に示す。

表3の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。

GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表4に示す。

表4の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。

GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表5に示す。

表5の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。

GST-πmRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表6に示す。

表6の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。

p21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表7に示す。

表7の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジンを意味する。mUは2'-メトキシ-Uである。

p21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表8に示す。

表8の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン（dT= T=t）を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。

ある実施形態では、本発明は、ある範囲の核酸分子を提供し、ここで、a）当該分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、b）当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり、c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、p21をコードするmRNAの配列に相補的であり、d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する。

ある実施形態では、核酸分子は、p21をコードするmRNAの配列に相補的であり、分子の二重鎖領域に位置するアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。

さらなる実施形態では、核酸分子は、p21をコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。

さらなる態様において、本発明の核酸分子は、18〜22ヌクレオチド長である分子の各鎖を有することができる。核酸分子は、19ヌクレオチド長の二重鎖領域を有することができる。

特定の実施形態では、核酸分子は、一本鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、一端でループによって連結された二重鎖領域を形成することができる。

本発明の核酸分子は、平滑末端を有することができ、1つ以上の3 'オーバーハングを有することができる。

本発明の核酸分子は、遺伝子サイレンシングに対して活性であるRNAi分子、例えば遺伝子サイレンシングに対して活性であるdsRNA、siRNA、マイクロRNA又は遺伝子サイレンシングに対して活性なshRNAとすることができ、同様にDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用性RNA（piRNA）及び反復関連siRNA（rasiRNA）とすることができる。

本発明は、p21の発現阻害に対して活性である一連の核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、100pM未満のp21のノックダウンのIC50を有することができる。

さらなる実施形態では、核酸分子は、50pM未満のp21のノックダウンのIC50を有することができる。

本発明はさらに、1つ以上の本発明の核酸分子及び薬学的に許容される担体を含有する組成物を企図する。担体は、脂質分子又はリポソームとすることができる。

本発明の化合物及び組成物は、化合物又は組成物を必要とする被験体に投与することによって、p21関連疾患を予防又は治療するための方法において有用である。

さらなる態様において、本発明は、1つ以上の本発明の核酸分子を含有する組成物を必要とする被験体に投与することによって、p21発現に関連する疾患を治療するための方法を含む。疾患は、とりわけ、p21発現に関連する癌などの疾患に提示され得る悪性腫瘍とすることができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、ある範囲の核酸分子を提供する。ここで、a）当該分子がポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、b）当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチドの長さであり、c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的であり、d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、分子は15〜30ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、分子の二重鎖領域に位置するGST-πをコードするmRNAの配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。

さらなる実施形態では、核酸分子は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的な、アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。

特定の実施形態では、核酸分子の各鎖は、18〜22ヌクレオチドの長さとすることができる。核酸分子の二重鎖領域は、19ヌクレオチド長とすることができる。

別の形態では、核酸分子は、一本鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、一端でループによって連結された二重鎖領域を形成することができる。

本開示の核酸分子のいくつかの実施形態は、平滑末端を有することができる。特定の実施形態では、核酸分子は、1つ以上の3 'オーバーハングを有することができる。

本発明は、遺伝子サイレンシングに対して活性なRNAi分子である一連の核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、DNAサイレンシングに活性なdsRNA、siRNA、マイクロRNA又はshRNA、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用性RNA（piRNA）又は関連するリピート siRNA（rasiRNA）とすることができる。核酸分子は、GST-πの発現阻害に対して活性とすることができる。

本発明の実施形態はさらに、100pM未満のGST-πのノックダウンのIC50を有する核酸分子を提供する。

本発明のさらなる実施形態は、50pM未満のGST-πのノックダウンのIC50を有する核酸分子を提供する。

本発明はさらに、薬学的に許容される担体と共に、本発明の核酸分子の1つ以上を含む組成物を企図する。特定の実施形態では、担体は、脂質分子又はリポソームとすることができる。

本発明の化合物及び組成物は、化合物又は組成物を必要とする被験体に投与することによって、GST-π関連疾患を予防又は治療するための方法において有用である。

本明細書中で使用される場合、RNAi分子は、siRNA（低分子干渉RNA）、miRNA（マイクロRNA）、shRNA（ショートヘアピンRNA）、ddRNA（DNA指向性RNA）、piRNA（Piwi相互作用RNA）、又はrasiRNA（反復関連siRNA）及びその改変形態といった二重RNAを含んでいる。これらのRNAi分子は、市販されているか、又は既知の配列情報などに基づいて設計及び調製され得る。アンチセンス核酸には、RNA、DNA、PNA、又はその複合体が含まれる。本明細書中で使用される場合、DNA/RNAキメラポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を阻害するDNA及びRNAからなる二本鎖ポリヌクレオチドを含む。

一実施形態では、本発明の薬剤は治療剤としてsiRNAを含む。siRNA分子は、約10〜50又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、約15〜45ヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、約19〜40ヌクレオチドの長さを有することができる。siRNA分子は、19〜23ヌクレオチドの長さを有することができる。本発明のsiRNA分子は、標的mRNAに対するRNAiを媒介することができる。Ambion、Inc.（Austin、TX）及びMIT（Cambridge、MA）のWhitehead Institute of Biomedical Researchのような商業的に入手可能な設計ツール及びキットにより、siRNAの設計及び生産が可能である。

悪性腫瘍を治療するための方法
本発明の実施形態は、GST-π及び/又はGST-πタンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用できるRNAi分子と、p21及び/又はp21タンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用できるRNAi分子を提供することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のRNAi分子は、悪性腫瘍など疾患又は状態に関連し得るGST-πハプロタイプ多型から生じるGST-π及び/又はGST-πタンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用することができる。本発明の実施形態はさらに、悪性腫瘍などの疾患又は状態に関連し得るp21ハプロタイプ多型から生じるp21及び/又はp21タンパク質の発現をダウンレギュレート又は阻害するために使用することができるRNAi分子を企図する。

GST-πタンパク質又はmRNAレベル、ならびにp21タンパク質又はmRNAレベルのモニタリングを使用して、遺伝子サイレンシングを特徴づけることができ、本発明の化合物及び組成物の有効性を決定することができる。

本開示のRNAi分子は、1つ以上の遺伝子の発現を調節するために、単独で又は他のsiRNAと組み合わせて使用することができる。

本開示のRNAi分子は、GST-π及びp21に関連する疾患（悪性腫瘍を含む）の予防又は治療、又は症状もしくは症状の改善のために、単独で又は組み合わせて、又は他の既知の薬物と組み合わせて使用することができる。

本発明のRNAi分子は、配列特異的様式でGST-πの発現を調節又は阻害するために使用することができる。また、本発明のRNAi分子を用いて、配列特異的様式でp21の発現を調節又は阻害することができる。

本開示のRNAi分子は、一連の連続したヌクレオチドがGST-πmRNA又はp21 mRNAに少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖を含むことができる。

特定の態様において、悪性腫瘍は、本発明のRNAi分子を用いたRNA干渉によって治療することができる。

悪性腫瘍の治療は、適切な細胞ベースのモデル、ならびにエクスビボ又はインビボの動物モデルにおいて特徴づけることができる。

悪性腫瘍の治療は、冒された組織の細胞におけるGST-πmRNAのレベル又はGST-πタンパク質のレベルを決定することによって特徴づけることができる。悪性腫瘍の治療はまた、罹患組織の細胞におけるp21 mRNAのレベル又はp21タンパク質のレベルを決定することによって特徴づけることができる。

悪性腫瘍の治療は、冒された臓器又は組織の非侵襲的な医学的走査によって特徴づけることができる。

本発明の実施形態は、それを必要とする被験体におけるGST-π及び/又はp21に関連する疾患又は状態の症状を予防、治療、又は改善するための方法を含むことができる。

いくつかの実施形態では、被験体における悪性腫瘍の症状を予防、治療又は改善するための方法は、本発明のRNAi分子を被験体に投与することでGST-π遺伝子及び/又はp21遺伝子の発現を当該被験体又は生物において調節することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させることによって、細胞又は生物におけるGST-π遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を企図する。本発明はさらに、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させることにより、細胞又は生物中のp21遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を企図する。

GST-π及びp21阻害性核酸分子は、遺伝子発現を減少させるために一本鎖又は二本鎖核酸分子として採用されるヌクレオチドオリゴマーであっても良い。1つのアプローチでは、当該阻害性核酸分子は、RNA干渉（RNAi）媒介性の遺伝子発現ノックダウンに使用される二本鎖RNAである。一実施形態では、RNA干渉において活性である二本鎖RNA（dsRNA）分子が作製され、これは本発明のヌクレオチドオリゴマーにおける8〜25（例えば8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25）の連続したヌクレオチドを含むことができる。dsRNAは、二重鎖を有するRNAの2つの相補鎖又は自己二重鎖を有する単一のRNA鎖（小さなヘアピン（sh）RNA）とすることができる。

いくつかの実施形態において、RNA干渉において活性であるdsRNAは、約21又は22塩基対であるが、より短くても長くてもよく、約29ヌクレオチドまでであってもよい。二本鎖RNAは、標準的な技術、例えば化学合成又はインビトロ転写を用いて作製することができる。キットは、例えばAmbion（Austin、Tex.）及びEpicentre（Madison、Wis.）から入手可能である。

哺乳動物細胞においてdsRNAを発現させるための方法は、Brummelkamp et al. Science 296：550-553, 2002; Paddison et al. Genes＆Devel. 16：948-958, 2002; Paulら Nature Biotechnol. 20: 505-508, 2002; Suiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520, 2002; Yuら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99：6047-6052, 2002; Miyagishiら、Nature Biotechnol. 20: 497-500, 2002;及びLeeら、Nature Biotechnol. 20: 500-505 2002を参照されたい。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

GST-π遺伝子に「対応する」阻害性核酸分子は、少なくとも二本鎖遺伝子の断片を含み、二本鎖阻害性核酸分子の各鎖が標的GST-π遺伝子の相補鎖に結合できる。阻害性核酸分子は、参照となるGST-π配列と完全に対応する必要はない。

p21遺伝子に「対応する」阻害性核酸分子は、少なくとも二本鎖遺伝子の断片を含み、二本鎖阻害性核酸分子の各鎖が標的p21遺伝子の相補鎖に結合できる。阻害性核酸分子は、参照となるp21配列と完全に対応する必要はない。

一実施形態において、siRNAは、標的核酸と少なくとも約85％、90％、95％、96％、97％、98％又はさらには99％の配列同一性を有する。例えば、1〜2塩基対のミスマッチを有する19塩基対の二重鎖は、本発明の方法において有用であると考えられる。他の実施形態においては、阻害性核酸分子のヌクレオチド配列は、1, 2, 3, 4, 5又はそれ以上のミスマッチを示す。

本発明によって提供される阻害性核酸分子は、siRNAに限定されず、GST-π又はp21核酸分子又はポリペプチドの発現を減少させるのに十分な任意の核酸分子を含む。本明細書で提供されるDNA配列は、例えば、コードされたタンパク質の発現を減少させるための治療用アンチセンス核酸分子の発見及び開発において使用することができる。本発明はさらに、触媒性RNA分子又はリボザイムを提供する。そのような触媒RNA分子は、インビボで標的核酸分子の発現を阻害するために使用することができる。アンチセンスRNA内にリボザイム配列を含めることにより、RNA切断活性が分子上に付与され、それによって構築物の活性が向上する。標的RNA特異的リボザイムの設計及び使用は、Haseloffら、Nature 334：585-591, 1988及び米国特許出願公開第2003/0003469 A1に記載されている。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の様々な実施形態において、触媒核酸分子は、ハンマーヘッド又はヘアピンモチーフに形成される。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossiら、Aids Research and Human Retroviruses、8：183, 1992に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Hampelら、Biochemistry、28：4929,1989及びHampel et al. Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990に記載されている。当業者であれば、酵素的核酸分子に必要とされるのは、標的遺伝子RNA領域の1つ以上に相補的な特異的基質結合部位であることを認識し、分子にRNA切断活性を付与するその基質結合部位内又はその周囲のヌクレオチド配列を有することを認識する。

標的の抑制は、抑制剤が利用されていない細胞と比較して、細胞中の対応するタンパク質の発現又は活性が抑制されることによって決定され得る。タンパク質の発現は、任意の公知の技術によって評価することができる。これらの例示としては、抗体を利用した方法、EIA、ELISA、IRA、IRMA、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、当該タンパク質又はその固有の断片をコードする核酸又は転写産物（mRNA）又は当該核酸のスプライシング産物と特異的にハイブリダイズする核酸を利用するハイブリダイゼーション方法、ノーザンブロット法、サザンブロット法及び様々なPCR法を挙げることができる。

タンパク質の活性は、例えばRaf-1（特にリン酸化Raf-1）又はEGFR（特にリン酸化EGFR）のようなタンパク質への結合を含むタンパク質の既知の活性を分析することによって評価することができる。これには、例えば、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（SPR）法等を挙げることができる。

突然変異したKRASの例には、特に限定されないが、継続的なKRASの活性化を引き起こし、内在性GTPaseを阻害する突然変異又はグアニンヌクレオチド交換速度を増加させる突然変異が含まれる。そのような突然変異の特定の例には、これらに限定されないが、例えば、ヒトKRASにおけるアミノ酸12, 13及び/又は61の突然変異（内因性GTPaseを阻害する）、及びヒトKRASにおけるアミノ酸116及び/又は119の突然変異（グアニンヌクレオチド交換速度の増加）（Bos、Cancer Res.1989; 49（17）：4682-9、Leviら、Cancer Res. 1991; 51（13）：3497-502）が挙げられる。

本発明のいくつかの実施形態では、突然変異KRASは、ヒトKRASのアミノ酸12, 13, 61, 116及び119の少なくとも1つに突然変異を有するKRASとすることができる。本発明の一実施形態では、突然変異KRASは、ヒトKRASのアミノ酸12に突然変異を有する。いくつかの実施形態において、突然変異KRASは、GST-πの過剰発現を誘導するものであってもよい。突然変異KRASを有する細胞は、GST-πの過剰発現を示してもよい。

突然変異KRASの検出は、任意の公知の技術、例えば、既知の突然変異配列にトクイテキナ核酸プローブ手段により選択的ハイブリダイゼーション、酵素ミスマッチ切断方法、配列決定方法（Bos、Cancer Res.1989; 49 （17）：4682-9）及びPCR-RFLP法（Miyanishiら、Gastroenterology.2001; 121（4）：865-74）を用いて行うことができる。

標的発現の検出は、任意の公知の技術を用いて行うことができる。標的が過剰発現されているか否かは、例えば、KRAS変異を有する細胞における標的の発現の程度を、正常KRASを有する同じタイプの細胞における標的の発現の程度と比較することによって評価することができる。この状況では、突然変異KRASを有する細胞における標的の発現の程度が、正常KRASを有する同型の細胞における標的の発現の程度を超える場合、標的は過剰発現されている。

一態様では、本発明は、上記態様のいずれかの阻害性核酸分子をコードするベクターを特徴とする。特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞における発現に適したプロモーターを含む。

本発明の組成物中に処方される活性RNA干渉誘導成分の量は、投与の利益を上回る副作用を引き起こさない量とすることができる。このような量は、培養細胞を用いたインビトロ試験、マウス、ラット、イヌ、ブタ等のモデル動物又は哺乳動物での試験により測定することができ、これらの試験方法は当業者には明らかである。本発明の方法は、ヒトを含む任意の動物に適用することができる。

配合される活性成分の量は、薬剤又は組成物が投与される様式に依存して変更すれば良い。例えば、組成物の複数の単位が1回の投与に使用される場合、組成物の1単位中に処方される活性成分の量は、1回の投与に必要な有効成分の量を前記複数単位で割ることによって決定することができる。

本発明はまた、GST-π及びp21を抑制する薬剤又は組成物の製造方法、並びにGST-π及びp21を抑制して悪性腫瘍を縮小又は収縮させる組成物の使用に関する。

RNA干渉
RNA干渉（RNAi）は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを意味する。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Fireら、Nature、1998、Vol. 391、806811頁; Sharp、Genes＆Development、1999、Vol. 13、pp. 139-141参照。

細胞内のRNAi応答は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発することができるが、メカニズムはまだ完全には理解されていない。細胞内の特定のdsRNAは、ダイサー酵素、リボヌクレアーゼIII酵素の作用を受けることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Hammondら、Nature、2000、Vol. 404、pp.293-296参照。ダイサーは、dsRNAをsiRNAであるdsRNAのより短い断片に加工することができる。

一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二重鎖領域を含むことができる。

RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。

本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、siRNA分子の対応するアンチセンス鎖の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。

本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のアンチセンス鎖は、siRNA分子の対応するセンス鎖の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含むことができる。

RNAi分子は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現をダウンレギュレート又はノックダウンすることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Elbashirら、Nature、2001、Vol. 411、494〜498頁; Kreutzerら、WO2000/044895; Zernicka-Goetzら、WO2001/36646; Fireら、WO1999/032619; Plaetinckら、WO2000/01846; Melloら、WO2001/029058参照。

本明細書中で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレートする」又は「縮小する」という用語は、遺伝子の発現又は1つ以上のタンパク質をコードするmRNA分子のレベル、若しくは1つ又は複数のコードされたタンパク質の活性が、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも低下することを意味している。例えば、発現のレベル、mRNAのレベル又はコードされたタンパク質活性のレベルが、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも、少なくとも1％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも50％、又は少なくとも90％、又はそれ以上で低下すれば良い。

RNAi分子はまた、ウイルス遺伝子発現をノックダウンするために使用することができ、よってウイルス複製に影響を及ぼす。

RNAi分子は、別個のポリヌクレオチド鎖：センス鎖又はパッセンジャー鎖と、アンチセンス鎖又はガイド鎖とから作製することができる。ガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、少なくとも部分的に相補的である。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、約15〜約49塩基対を有する二重鎖領域を形成することができる。

いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖領域は、17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,又は49個の塩基対を含むことができる。

特定の実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であり、RISCに対して活性な二重鎖領域の長さを有することができる。

さらなる実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であるRNAi分子に変換されるダイサー基質として活性とすることができる。

いくつかの態様では、RNAi分子は、長い分子の対向する末端に相補的なガイドとパッセンジャー配列部分とを有することができ、その結果、分子は相補配列部分において二重鎖領域を形成することができ、各鎖はヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかによって当該二重鎖領域の一端で結合する。例えば、ヘアピン配列ステム及びループ配列である。各鎖とリンカー相互作用は、共有結合又は非共有相互作用とすることができる。

本開示のRNAi分子は、核酸のセンス領域を核酸のアンチセンス領域に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混合リンカーを含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが2ヌクレオチド以上、例えば約3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10ヌクレオチドのリンカーとすることができる。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーとしても良い。本明細書で使用する「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸に天然に結合しなくてよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それにより天然に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用することができる。例えば、Goldら、Annu Rev Biochem、1995、Vol. 64、763-797頁; Brodyら、J.Biotechnol., 2000、Vol. 74、5〜13頁; Hermannら、Science、2000、Vol. 287、pp. 820-825参照。

非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他の高分子化合物、例えば2〜100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールなどの高分子化合物を挙げることができる。いくつかの例は、Seelaら、Nucleic Acids Research、1987、Vol. 15、3113〜3129頁; Cloadら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、6324-6326頁; Jaeschkeら、Tetrahedron Lett.,1993、Vol. 34、301頁; Arnoldら、WO1989/002439; Usmanら、WO1995/006731; Dudyczら、WO1995/011910; 及びFerentzら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、pp. 4000-4002に記載されている。

RNAi分子は、二重鎖領域から1つ以上のオーバーハングを有することができる。オーバーハングは、塩基対形成されていない一本鎖領域であり、長さが1〜8ヌクレオチド又はそれ以上としても良い。オーバーハングは、鎖の3'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する3'末端オーバーハングとしても良い。オーバーハングは、鎖の5'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する5'末端オーバーハングとしても良い。

RNAi分子のオーバーハングは、同じ長さを有していても良いし、異なる長さとしても良い。

RNAi分子は、二重鎖領域がオーバーハングなしで終わり、鎖が二重鎖領域の末端まで塩基対合する、一つ以上の平滑末端を有するものとすることができる。

本開示のRNAi分子は、1つ以上の平滑末端を有することができ、又は1つ以上のオーバーハングを有することができ、若しくは平滑末端とオーバーハングとの組み合わせを有することができる。

RNAi分子の鎖の5'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子の鎖の3'末端は、平滑末端にあってもよく又はオーバーハングにあってもよい。

RNAi分子の鎖の5'末端は平滑末端にあり、3'末端はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子鎖の3'末端は平滑末端にあり、5'末端はオーバーハングにあってもよい。

いくつかの実施形態では、RNAi分子の両端は平滑末端である。

さらなる実施形態において、RNAi分子の両端はオーバーハングを有する。

5'-及び3'-末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。

特定の実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。

さらなる実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端及びセンス鎖の5'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。

RNAi分子は、二重鎖領域における塩基対合においてミスマッチを有していてもよい。

RNAi分子のオーバーハングにおける任意のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとすることができる。

1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは5'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他方の鎖の3'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。

1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは3'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他の鎖の5'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。

いくつかの実施形態において、RNAi分子のオーバーハングヌクレオチドの1つ以上又は全てを2'-デオキシリボヌクレオチドとしてもよい。

ダイサー基質RNAi分子
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシングされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/0244858参照。

ダイサー基質である二本鎖RNA（dsRNA）は、活性RNAi分子を生成するためにダイサーによって処理されるのに十分な長さとすることができ、さらに以下の特性の1つ以上を含んでいてもよい：（i）ダイサー基質dsRNAは、例えば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有するような非対称とすることができ、（ii）ダイサー基質dsRNAは、ダイサー結合の配向を指示し、dsRNAを処理して活性なRNAi分子とするためにセンス鎖上に改変された3'末端を有していてもよい。

RNAi分子の使用方法
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。

本発明の核酸分子及びRNAi分子は、担体又は希釈剤若しくは、ウイルス配列、ウイルス物質又は脂質若しくはリポソーム製剤などの細胞への侵入を補助又は促進するように機能する他の送達ビヒクルを用いた分子の直接的な適用によって、細胞、組織、器官又は被験体に送達又は投与することができる。

本発明の核酸分子及びRNAi分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内にパッケージするか、或いは標的細胞又は組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、直接皮膚適用、経皮適用又は注射によって生体外又は生体内の関連する組織に局所投与することができる。

送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース及び粉末を含んでいても良く、そして可溶化剤及び浸透増強剤等の添加物を含んでいても良い。

本発明の阻害性核酸分子又は組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤の単位剤形で投与することができる。従来の製薬実務を用いて、過度の細胞増殖によって引き起こされる疾患に罹患している患者に化合物を投与するための適切な製剤又は組成物を提供することができる。患者は症状が現れる前に投与を開始することができる。例えば、非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼科、脳室内、肝内、嚢内、髄腔内、膀胱内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐薬、又は経口投与が含まれる。例えば、治療用製剤は、液体溶液又は懸濁液の形態とすることができる。経口投与の場合、製剤は、錠剤又はカプセル剤の形態とすることができる。鼻腔内製剤としては、粉末、点鼻薬又はエアロゾルの形態とすることができる。

本開示の組成物及び方法は、核酸分子の発現を可能にするように、少なくとも1つの本発明のRNAi分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。

本発明の核酸分子及びRNAi分子は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現させることができる。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターとすることができる。核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。

例えば、ベクターは、二重鎖のRNAi分子の両方の鎖をコードする配列、又は自己相補的であってRNAi分子を形成する単一の核酸分子を含んでいても良い。発現ベクターは、2つ以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでいても良い。

核酸分子は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現することができる。当業者は、任意の核酸が、適切なDNA/RNAベクターから真核細胞において発現できることを理解している。

いくつかの態様では、発現コンストラクトを細胞に導入するためにウイルスコンストラクトを使用することができ、これは当該発現コンストラクトによりコードされるdsRNA構築物の転写のためであり、当該dsRNAはRNA干渉において活性である。

脂質製剤は、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射によって、若しくは経口的に又は吸入によって、若しくは当該分野で公知の他の方法によって動物に投与することができる。

オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用することができる。

上記方法の一実施形態では、阻害性核酸分子は、約5〜500mg/m²/日、例えば、5、25、50、100、125、150、175、200、225、250、275又は300mg/m²/日である。

いくつかの実施形態では、本発明の阻害性核酸分子は、約1〜100mg/kg、例えば、1, 5, 10, 20, 25, 50, 75又は100mg/kgの投薬量で全身投与される。

さらなる実施形態において、投薬量は、約25〜500mg/m²/日の範囲とすることができる。

製剤を製造するための当該分野で公知の方法は、例えば、"Remington：The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro、Lippincourt Williams ＆ Wilkins、Philadelphia、Pa., 2000で見つけることができる。

非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油又は水素化ナフタレンを含むことができる。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、化合物の放出を制御することができる。阻害性核酸分子のための他の潜在的に有用な非経口送達システムには、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム及びリポソームが含まれる。吸入のための製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含むことができ、又は例えばポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩及びデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよく、又は点鼻薬の形態で投与する油性溶液であってもよい。

処方物は、新生物の疾患又は状態の治療を提供するために、治療上有効な量（例えば、病的状態を予防、排除又は軽減する量）でヒト患者に投与することができる。本発明のヌクレオチドオリゴマーの好ましい投与量は、障害のタイプ及び程度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物賦形剤の製剤及びその投与経路などの変数に依存することができる。

悪性腫瘍を減少させるための上記の方法の全ては、インビトロ方法又はインビボ方法のいずれであっても良い。投薬量は、当技術分野で知られているように、培養細胞等を用いたin vitro試験によって決定され得る。有効量は、KRAS関連腫瘍における腫瘍サイズを少なくとも10％、少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、最大100％まで縮小する量としても良い。

本発明の医薬組成物は、KRAS関連疾患の治療に有効である。疾患としては、異常細胞増殖による疾患、KRAS突然変異による疾患、GST-π過剰発現による疾患などが挙げられる。

異常細胞増殖による疾患としては、悪性腫瘍、過形成、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、赤血球増加症、真性赤血球増加症、白血球増加症、過形成性瘢痕、扁平苔癬及び白子症が挙げられる。

KRAS突然変異による疾患の例には、悪性腫瘍（癌又は悪性新生物とも呼ばれる）が含まれる。

GST-π過剰発現による疾患の例には、悪性腫瘍が含まれる。

癌の例には、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫及び骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頸部癌腫、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病及び悪性リンパ腫などのがん腫を挙げることができる。

癌は、上皮悪性腫瘍及び非上皮悪性腫瘍を含む。癌は、身体のあらゆる部位に存在することができる。

本発明の一実施形態において、癌は、上記に定義された突然変異KRASを有する癌細胞を含む。別の実施形態では、癌は、ホルモン依存性増殖因子又は増殖因子非依存性増殖を示す癌細胞を含む。さらなる実施形態において、癌は、GST-π過剰発現を示す癌細胞を含む。

GST-πを抑制するためのさらなる活性薬剤又は薬物
GST-piの活性を阻害するためのさらなる活性剤の例には、GST-piに結合する物質、例えばグルタチオン、グルタチオン類似体（例えばWO95/08563、WO96/40205、WO99/54346に開示されたもの）、ケトプロフェン、インドメタシン（例えば、Hall et al., Cancer Res. 1989; 49（22）：6265-8）、エタクリン酸、ピリプロスト（例えば、Tewら、Cancer Res.1988; 48（13）：3622-5）、抗GST-pi抗体及びGST-πのドミナントネガティブ変異体が挙げられる。これらの薬剤は、市販されているか、あるいは公知の技術に基づいて適宜製造することができる。

悪性腫瘍における薬剤の送達のための3つの成分を含む製剤
本明細書中で使用される場合、「脂質」などの製剤の成分は、単一の化合物であってもよく、又は1つ以上の適切な脂質化合物の組み合わせであってもよい。例えば、「安定剤脂質」は、単一の安定剤脂質又は1つ以上の好適な安定剤脂質の組み合わせを意味することができる。当業者であれば、過度の実験をすることなく、本明細書に記載の化合物の特定の組み合わせを使用することができ、化合物の様々な組み合わせが製剤の成分の記載に包含されることを容易に理解することができる。

本発明は、細胞、組織又は器官、生物及び被験体において活性物質を分布させるのに用いるための組成物を提供することができ、組成物は、本発明の1つ以上のイオン化可能な脂質分子を含む。

本発明の組成物は、1つ以上のイオン化可能な脂質分子、構造脂質及び1つ以上のナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質を含むことができる。

本発明のイオン化可能な脂質分子は、本発明の組成物の任意のモル％であり得る。

本発明の組成物のイオン化可能な脂質分子は、組成物の脂質成分の50モル％〜80モル％とすることができる。特定の実施形態では、組成物のイオン性脂質分子は、組成物の脂質成分の55モル％〜65モル％とすることができる。さらなる実施形態において、組成物のイオン性脂質分子は、組成物の脂質成分の約60モル％とすることができる。

本発明の組成物の構造脂質は、組成物の脂質成分の20モル％〜50モル％とすることができる。特定の実施形態では、組成物の構造脂質は、組成物の脂質成分の35モル％〜45モル％とすることができる。

ナノ粒子の免疫原性を低下させるための1種以上の脂質は、組成物の総脂質成分の1モル％〜8モル％とすることができる。特定の実施形態では、ナノ粒子の免疫原性を低下させるための1つ以上の脂質は、組成物の脂質成分の合計1モル％〜5モル％とすることができる。

さらなる態様において、本発明の組成物は、組成物の脂質成分の5モル％〜25モル％の範囲とすることができるカチオン性脂質をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、本発明の組成物は、組成物の脂質成分の5モル％〜15モル％の範囲とすることができるカチオン性脂質をさらに含むことができる。これらの態様において、本発明の組成物のイオン化可能な脂質分子に対するカチオン性脂質の濃度のモル比は、5：80〜25：50とすることができる。

本発明の組成物において、脂質成分の全体は、1つ以上のイオン化可能な脂質分子成分、1つ以上の構造脂質及び1つ以上のナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質を含むことができる。

悪性腫瘍における薬剤の送達のための4つの成分を含む製剤
本発明は、本発明の1つ又は複数のイオン化可能な脂質分子を含む、細胞、組織又は器官、生物及び被験体における活性剤の分配に使用するための組成物を提供することができる。

本発明の組成物は、1つ以上のイオン化可能な脂質分子を、構造脂質、1つ以上の安定化脂質及び1つ以上のナノ粒子の免疫原性を低下させるため脂質と共に含むことができる。

本発明の組成物のイオン化可能な脂質分子は、組成物の脂質成分の15モル％〜40モル％とすることができる。特定の実施形態では、組成物のイオン化可能な脂質分子は、組成物の脂質成分の20モル％〜35モル％とすることができる。さらなる実施形態では、組成物のイオン性脂質分子は、組成物の脂質成分の25モル％〜30モル％とすることができる。

本発明の組成物の構造脂質は、組成物の脂質成分の25モル％〜40モル％とすることができる。特定の実施形態では、組成物の構造脂質は、組成物の脂質成分の30モル％〜35モル％とすることができる。

本発明の組成物の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質成分の25モル％〜40モル％とすることができる。特定の実施形態では、組成物の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質成分の30モル％〜40モル％とすることができる。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、2つ以上の安定剤脂質を含むことができ、安定剤脂質の各々は、個々に、組成物の脂質成分の5モル％〜35モル％とすることができる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、2つ以上の安定剤脂質を含むことができ、安定剤脂質の各々は、個々に、組成物の脂質成分の10モル％〜30モル％とすることができる。

特定の実施形態では、1つ以上の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質の25モル％〜40モル％であってもよく、安定剤脂質の各々は、個々に5モル％〜35モル％とすることができる。

特定の実施形態では、1つ以上の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質の30モル％〜40モル％であってもよく、安定剤脂質のそれぞれは、個々に10モル％〜30モル％とすることができる。

ナノ粒子の免疫原性を低下させるための1種以上の脂質は、組成物の脂質成分の合計1モル％〜8モル％とすることができる。特定の実施形態では、ナノ粒子の免疫原性を低下させるための1つ以上の脂質は、組成物の脂質成分の合計1モル％〜5モル％とすることができる。

さらなる態様において、本発明の組成物は、組成物の脂質成分の5モル％〜25モル％の範囲とすることができるカチオン性脂質をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、本発明の組成物は、組成物の脂質成分の5モル％〜15モル％の範囲とすることができるカチオン性脂質をさらに含むことができる。これらの態様において、本発明の組成物のイオン化可能な脂質分子に対するカチオン性脂質の濃度のモル比は、5：35〜25：15とすることができる。

本発明の組成物において、脂質成分の全体は、イオン化可能な脂質分子成分、1以上の構造脂質、1以上の安定化脂質及び1以上のナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質のうちの1つ以上を含むことができる。

脂質組成物の例
いくつかの実施形態では、3つの脂質様成分、すなわち1つ以上のイオン化可能な分子、構造脂質及び1つ以上のナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質は、組成物の脂質成分の100％とすることができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質を含めることができる。

本発明の組成物の例を表9に示す。

特定の実施形態では、4つの脂質様成分、すなわち1つ以上のイオン化可能な脂質分子、構造脂質、1つ以上の安定化脂質及びナノ粒子の免疫原性を低下させるための1つ以上の脂質は、組成物の脂質成分の100％とすることができる。

本発明の組成物の例を表10に示す。

イオン化可能な脂質様分子
イオン化可能な脂質の例には、式I（Formula I）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は、

ここで、n及びmは1〜2であり; R⁴及び R⁵はそれぞれ独立して、C（12-20）アルキル基又は0〜2個の二重結合を有するC（12-20）アルケニル基であり;
ここで、R³は以下から選択され、

ここで、R⁶は、H、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、アミノアルキルから選択され;
R⁷は、H、アルキル、ヒドロキシアルキルから選択され;
QはO又はNR⁷であり;
pは1〜4である。

イオン化可能な脂質の例としては、以下の化合物が挙げられる：

これは、((2-((3S,4R)-3,4-ジヒドロキシピロリジン-1-イル)アセチル)アザンジイル)ビス(エタン-2,1-ジイル) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-ビス(オクタデカ-9,12-ジエノエート)である。

これは、((2-(3-(ヒドロキシメチル)アゼチジン-1-イル)アセチル)アザンジイル)ビス(エタン-2,1-ジイル)ジテトラデカノアートである。

これは((2-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)アセチル)アザンジイル)ビス(エタン-2,1-ジイル) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-ビス(オクタデカ-9,12-ジエノアート)である。

イオン化可能な脂質の例には、式IV（Formula IV）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は、

であり、
ここでR⁴及びR⁵はそれぞれ独立して、C（12-20）アルキル基又は0〜2個の二重結合を有するC（12-20）アルケニル基であり;
ここで、R³は以下から選択され、

これは、2-((1-(((9Z,12Z)- ヘプタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)-5-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)-1,5-ジオキソペンタン-3-イル)アミノ)-N,N,N-トリメチル-2-オキソエタン-1-アミニウムである。

イオン化可能な脂質の例には、式VI（Formula VI）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹は

であり、
ここでR²及びR⁴はそれぞれ独立して、C（12-20）アルキル基又は0〜2個の二重結合を有するC（12-20）アルケニル基であり;
ここで、R3はアミノアルキル及び第四級アミノアルキルから選択される。

これは2-((9Z,12Z)-N-(3-(ジメチルアミノ)プロピル)オクタデカ-9,12-ジエンアミド)エチル(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノエートである。

これはN,N,N-トリメチル-3-((9Z,12Z)-N-(2-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイル)オキシ)エチル)オクタデカ-9,12-ジエンアミド)プロパン-1-アミニウムである。

イオン化可能な脂質の例には、式IX（Formula IX）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
ここでR4及びR5はそれぞれ独立して、C（12-20）アルキル基又は0〜2個の二重結合を有するC（12-20）アルケニル基であり;
ここで、R³は以下から選択され、

ここで、R⁶は、H、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ及びアミノアルキルから選択され；
R7はH、アルキル及びヒドロキシアルキルから選択され；
QはO又はNR⁷である。

これは、N,N,N-トリメチル-2-(((S)-3-(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)オキシ)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエンアミド)-3-オキソプロピル)アミノ)-2-オキソエタン-1-アミニウムである。

イオン化可能な脂質の例には、式III（Formula III）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
n及びmは1〜2であり； R⁴及びR⁵は互いに独立してC(12-20)のアルキル基又はC(12-20)のアルケニル基であり;
R³はアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルコキシ及びカルボキシアルキルから選択され;
R⁶はNR⁷ ₂、N⁺HR⁷ ₂及びN⁺R⁷ ₃から選択され;
R⁷はH、アルキル及びヒドロキシアルキルから選択される。

イオン化可能な脂質の例には、式IV-B（Formula IV-B）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
R⁴及びR⁵は互いに独立してC(12-20)のアルキル基又はC(12-20)のアルケニル基であり;
ZはS又はOであり;
R³ は以下から選択され、

ここで、それぞれR⁶ は独立して、H、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ及びアミノアルキルから選択され;
R⁷はH、アルキル及びヒドロキシアルキルから選択され;
pは1〜4である。

イオン化可能な脂質の例には、式V（Formula V）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
R⁴及びR⁵は互いに独立して C(12-20)のアルキル基又はC(12-20) のアルケニル基であり;
pは1〜4であり;
R³は以下から選択され、

ここで
それぞれR⁶は独立してH、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ及びアミノアルキルから選択され;
R⁷はH、アルキル及びヒドロキシアルキルから選択され;
QはO又はNR⁷である。

イオン化可能な脂質の例には、式VII（Formula VII）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
n及びmは1〜2であり;
R⁴及びR⁵はそれぞれ独立してC(12-20)のアルキル基又はC(12-20)のアルケニル基であり;
R³はアミノアルキル、第四級アミノアルキル及びアルコキシアルコキシアルキルから選択される。

イオン化可能な脂質の例には、式VIII（Formula VIII）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
ZはNH又はOであり、
R⁴及びR⁵は互いに独立してC(12-20)のアルキル基又はC(12-20)のアルケニル基であり;
R³はアミノ、第四級アミノ、アミノアルキル、第四級アミノアルキル

NHC(=O)(CH₂)_pR⁸及び
NHC(=O)SR⁹から選択され;
R⁸は

カルボキシアルキル;
アミノアルキル;

から選択され
R⁹はアミノアルキルから選択され;
そして、それぞれR⁶は独立してH、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ及びアミノアルキルから選択され;
R⁷はH、アルキル及びヒドロキシアルキルから選択され;
QはO又はNR⁷である。

イオン化可能な脂質の例には、式VIII-B（Formula VIII-B）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
n及びmは1〜2であり;
R⁴及びR⁵は、それぞれ独立してC(12-20)のアルキル基又はC(12-20)のアルケニル基であり;
ZはN又はOであり;
R³は

から選択され、
それぞれR⁶は独立してH、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ及びアミノアルキルから選択され;
R⁷はH、アルキル及びヒドロキシアルキルから選択され;
pは1〜4である。

イオン化可能な脂質の例には、式X（Formula X）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
R⁴及びR⁵はそれぞれ独立してC(12-20)のアルキル基又はC(12-20)のアルケニル基であり;
R³は、アミノ、第四級アミノ、アミノアルキル、第四級アミノアルキル、ヒドロキシアルキルアミノ及び第四級ヒドロキシアルキルアミノから選択される。

イオン化可能な脂質の例には、式XI（Formula XI）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。

ここでR¹及びR²は

であり、
R⁴及びR⁵は、それぞれ独立してC(12-20)のアルキル基又はC(12-20)のアルケニル基であり;
pは1〜4であり;
R³は

から選択され、ここでそれぞれR⁶は独立してH、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルコキシ及びアミノアルキルから選択され;
R⁷はH及びアルキルから選択され;
QはO又はNR⁷である。

構造脂質
構造脂質の例には、コレステロール、ステロール及びステロイドが含まれる。

構造脂質の例には、コラン、コレスタン、エルゴスタチン、カンペスタン、ポルフェリスタチン、スティグマスタイン、ゴルゴスタイン、ラノスタン、ゴナン、エストラン、アンドロスタン、プレグナン及びシクロアルファンが含まれる。

構造脂質の例には、ステロール及びコレステロール、ラノステロール、ザモステロール、ザイモステノール、デスモステロール、スチグマスタノール、ジヒドロラノステロール並びに7-デヒドロコレステロールといった動物ステロールが含まれる。

構造脂質の例には、ペグ化コレステロール及びコレスタン3-オキソ-（C1-22）アシル化合物（例えば、コレステリルアセテート、コレステリルアラキドネート、コレステリルブチレート、コレステリルヘキサノエート、コレステリルミリステート、コレステリルパルミテート、コレステリルベヘネート、コレステリルステアレート、コレステリルカプリル酸、コレステリルn-デカノエート、コレステリルドデカノエート、コレステリルネルボネート、コレステリルペラルゴネート、コレステリルn-バレレート、コレステリルオレエート、コレステリルエライデート、コレステリルエルカート、コレステリルハプタノエート、コレステリルリノレイルネート及びコレステリルリノレート）が含まれる。

構造脂質の例には、ステロール、例えばフィトステロール、ベータ-シトステロール、カンペステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、デルタ-7-スチグマステロール及びデルタ-7-アベナステロールが含まれる。

安定剤脂質
安定剤脂質の例としては、双性イオン性脂質が挙げられる。

安定剤脂質の例としては、リン脂質などの化合物が挙げられる。

リン脂質の例には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン及びオルジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。

安定剤脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミン化合物及びホスファチジルコリン化合物が挙げられる。

安定剤脂質の例としては、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）が挙げられる。

安定剤脂質の例は、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（DPhPE）及び1,2-ジフタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPhPC）が挙げられる。

安定化剤脂質の例には、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DPPE）及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）が含まれる。

安定剤脂質の例には、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロール（DLG）; 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール（DMG）; 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロール（DPG）; 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール（DSG）; 1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DAPC）; 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DLPC）; 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）; 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-O-エチル-3-ホスホコリン（DPePC）; 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DLPE）; 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DMPE）; 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）; 1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン; 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）; 1-パルミトイル-2-リゾ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（P-Lyso-PC）; 1-ステアロイル-2-リゾ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（S-Lyso-PC）が挙げられる。

免疫原性を低下させるための脂質
免疫原性を低下させるための脂質の例には、高分子化合物及びポリマー-脂質複合体が含まれる。

免疫原性を低下させるための脂質の例には、ポリエチレングリコール（PEG）領域を有するペグ化脂質が含まれる。PEG領域は、任意の分子量とすることができる。いくつかの実施形態において、PEG領域は、200、300、350、400、500、550、750、1000、1500、2000、3000、3500、4000又は5000Daの分子量を有することができる。

免疫原性を低下させるための脂質の例には、メトキシポリエチレングリコール領域を有する化合物が含まれる。

免疫原性を低下させるための脂質の例には、カルボニル-メトキシポリエチレングリコール領域を有する化合物が含まれる。

免疫原性を低下させるための脂質の例としては、多分枝PEG領域を有する化合物が挙げられる。

免疫原性を低下させるための脂質の例には、ポリグリセリン領域を有する化合物が含まれる。

免疫原性を低下させるための脂質の例には、DSPE-mPEG、DMPE-mPEG、DPPE-mPEG及びDOPE-mPEG等の高分子脂質が含まれる。

免疫原性を低下させるための脂質の例としては、PEG-リン脂質及びPEG-セラミドが挙げられる。

カチオン性脂質
カチオン性脂質の例には、US 2013/0330401 A1に記載されているカチオン性HEDC化合物が含まれる。カチオン性脂質のいくつかの例は、US 2013/0115274 A1に記載されている。カチオン性脂質のさらなる例は、当技術分野で公知である。

脂質組成物
いくつかの実施形態において、組成物は、イオン化可能な脂質化合物81、構造脂質コレステロール、安定剤脂質DOPC並びにDOPE、及び免疫原性を低下させるための脂質DPPE-mPEGを含むことができる。特定の実施形態において、化合物81は、組成物の15〜25モル％とすることができる; コレステロール、DOPC及びDOPEを合わせて、組成物の75〜85モル％とすることができる; DPPE-mPEGは組成物の5モル％とすることができる。

一実施形態において、化合物81は、組成物の25モル％とすることができる; コレステロールは組成物の30モル％、DOPCは組成物の20モル％、DOPEは組成物の20モル％とすることができる; そしてDPPE-mPEG（2000）は組成物の5モル％とすることができる。

ナノ粒子
本発明の実施形態は、リポソームナノ粒子組成物を提供することができる。本発明のイオン化可能な分子を使用して、脂質様分子の二重層を有することができるリポソーム組成物を形成することができる。

ナノ粒子組成物は、リポソーム構造、二重層構造、ミセル、層状構造又はそれらの混合構造の中に、本発明のイオン化可能な分子の1つ以上を有することができる。

いくつかの実施形態において、組成物は、1つ以上の液体ビヒクル成分を含むことができる。本発明の活性薬剤の送達に適した液体ビヒクルは、薬学的に許容される液体ビヒクルとすることができる。液体ビヒクルは、有機溶媒又は水と有機溶媒との組み合わせを含むことができる。

本発明の実施形態は、10〜1000nmのサイズを有する脂質ナノ粒子を提供することができる。いくつかの実施形態において、リポソームナノ粒子は、10〜150nmのサイズを有することができる。

特定の実施形態では、本発明のリポソームナノ粒子は、RNAi分子をカプセル化し、ヒト血清に1時間暴露した後にカプセル化されたRNAi分子の少なくとも80％を保持することができる。

薬学的組成物
本発明はさらに、本発明の組成物を被験体に投与することによって、悪性腫瘍を処置するための被験体の器官に活性剤を分配する方法を企図する。治療できる臓器には、肺、肝臓、膵臓、腎臓、結腸、骨、皮膚及び腸が含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の組成物を被験体に投与することによって肺悪性腫瘍疾患を治療するための方法を提供する。

さらなる態様において、本発明はある範囲の医薬製剤を提供する。

本明細書の医薬製剤は、薬学的に許容される担体又は希釈剤とともに、本発明の薬物担体又は脂質を含むことができる。一般に、本書における活性薬剤は、任意の阻害性核酸分子及び任意の小分子薬剤を含む、悪性腫瘍のための任意の活性薬剤を含んでいる。阻害性核酸分子の例には、リボザイム、アンチセンス核酸、及びRNA干渉分子（RNAi分子）が含まれる。

抗腫瘍薬及び抗癌剤の例には、癌遺伝子関連因子、腫瘍血管新生因子、転移関連因子、TGF-βなどのサイトカイン、増殖因子、MMPなどのプロテイナーゼ、カスパーゼ及び免疫抑制因子が含まれる。

薬物担体は、組成物を標的化して星状細胞に到達させることができる。薬物担体は、その内部に薬剤を含有していても良いし、薬物含有物資の外側に付着していても良いし、薬物と混合させていても良い。ただしレチノイド誘導体及び/又はビタミンA類似体が薬物担体に含まれており、少なくとも部分的に製剤の外部に露出している。組成物又は調製物は、例えば、腸溶コーティング又は経時的に崩壊する物質などの適切な物質で覆われてもよく、又は適切な薬物放出系に組み込まれてもよい。

本発明の医薬製剤は、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、防腐剤、安定剤、染料、及び懸濁剤の各々の1つ以上を含有することができる。

本発明の化合物及び組成物を処方及び投与するための方法と同様に、いくつかの薬学的担体、希釈剤及び成分は、Remington's Pharmaceutical Sciences、18th Ed., Mack Publishing Co.、Easton、Penn. （1990）に記載されている。

防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸及びp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。

界面活性剤の例には、アルコール、エステル、硫酸化脂肪族アルコールが含まれる。

賦形剤の例には、スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸塩、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム及びカルボキシメチルセルロースカルシウムが含まれる。

懸濁剤の例には、ヤシ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆、酢酸フタル酸セルロース、酢酸メチル-メタクリル酸コポリマー及びフタル酸エステルが含まれる。

遺伝子サイレンシングについて活性な1つ以上の分子を送達する本発明の治療用製剤は、それを必要とする哺乳動物に投与することができる。リポソームにカプセル化することができる製剤及び活性剤の治療有効量を、悪性腫瘍を予防又は治療するために哺乳動物に投与することができる。

投与経路は、局所的又は全身的とすることができる。

本発明の治療上有効な製剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下及び経口を含む様々な経路によって投与することができる。

投与経路には、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、髄腔内注射、ならびに髄腔内、直接的脳室内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含む非経口送達が含まれる。

処方物は、所定の速度での長期及び/又は時限のパルス投与のために、デポー注射、浸透圧ポンプなどを含む持続放出又は制御放出投与形態で投与することもできる。

本発明の組成物は、経口経路及び非経口経路の両方を含む様々な経路によって投与することができ、その例としては、特に限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、鼻内、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、髄内、内リンパ節、リンパ管内、脳内、髄腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内及び子宮内経路が挙げられる。そして、各投与経路に適した剤形に製剤化することができる。そのような剤形及び製剤方法は、任意の既知の剤形及び方法から適宜選択することができる。例えば、Hyojun Yakuzaigaku、Standard Pharmaceutics、Ed. Yoshiteru Watanabeら、南光堂、2003参照。

経口投与に適した剤形の例には、特に限定されないが、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、液体、懸濁液、乳液、ゲル及びシロップが挙げられる。注射を含む非経口投与に適した剤形の例には、注射可能な溶液、注射可能な懸濁液、注射可能なエマルジョン及びすぐに使用できる注射剤が挙げられる。非経口投与のための製剤は、水性又は非水性の等張滅菌溶液又は懸濁液などの形態であってもよい。

例えば、ボーラス注射又は連続点滴などによる非経口投与のための医薬製剤には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、化合物の溶解度を高めて高濃度の溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は剤を含有してもよい。

注射のための処方物は、単位剤形、例えば、アンプル又は複数回投与の容器中で、防腐剤を添加して提供することができる。製剤は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンのような形態をとり、懸濁剤、安定化剤及び/又は分散剤のような処方剤を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で構成するための粉末形態であってもよい。

前述の製剤に加えて、製剤は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用性製剤は、筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、製剤は、適切なポリマー又は疎水性物質、例えば許容される油中のエマルジョン、又はイオン交換樹脂、又は難溶性誘導体、例えば難溶性塩として処方されてもよい。

本発明の組成物及び処方物はまた、局所送達のために処方することができ、局所送達ビヒクルの適用のための任意の適切なプロセスを用いて被験体の皮膚に適用することができる。例えば、製剤は、手動で、アプリケータを用いて、又は両方を含むプロセスによって適用することができる。施用後、処方物は、例えば擦ることによって被験体の皮膚内にに作用することができる。アプリケーションは、1日に複数回又は1日に1回実行することができる。例えば、製剤は、1日1回、1日2回、又は1日複数回、被験体の皮膚に適用してもよく、2日に1回、3日に1回、又は毎週約1回、2週間に1回、又は数週間に1回適用してもよい。

本明細書に記載の製剤又は医薬組成物は、任意の適切な手段によって対象に投与することができる。投与方法の例としては、とりわけ、（a）輸液ポンプ送達を含む注射を介した、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、腔内、嚢内、髄腔内、胸骨内などの投与; （b）活性化合物を生きた組織と接触させるための当業者によって適切であると考えられる、例えばデポー移植による、腎臓又は心臓領域内への直接注射などによる局所投与;を挙げることができる。

医薬組成物の正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。例えば、Goodman ＆ GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics、12th Ed.、Sec. 1, 2011参照。典型的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、患者の体重1kg当たり約0.5〜約1000mgとすることができる。投与量は、患者が必要とするように、1又は複数の日の経過中に与えられた1つ又は一連の2つ以上であってもよい。化合物のヒト投薬量が少なくともいくつかの条件のために確立されている場合、投薬量はほぼ同じか又は確立されたヒト投薬量の約0.1％〜約500％、より好ましくは約25％〜約250％とすることができる。新たに発見された医薬組成物の場合のように、ヒト投薬量が確立されていない場合、適切なヒト投薬量は、毒性研究及び動物における有効性試験によって認定されたED50又はID50値、又はインビトロ又はインビボ研究に由来する他の適切な値から推測することができる。

悪性腫瘍を予防又は治療するための方法
本発明は、さらに、悪性腫瘍の活性又は増殖を制御するための方法であって、有効量の組成物をそれを必要とする被験体に投与する工程を含む方法に関する。ここでいう有効量とは、悪性腫瘍を治療する方法において、その症状を緩和するか、進行を遅延させるか停止させることであり、好ましくは、悪性腫瘍の発症又は再発を予防又は治癒する量である。好ましくは、投与の利益を上回る有害作用を引き起こさない量でもある。このような量は、培養細胞を用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌ、ブタ等のモデル動物や哺乳動物での試験により適宜決定すればよく、そのような試験方法は、当業者には明らかである。さらに、本発明の方法において使用される担体中の活性剤の用量及び活性剤の用量は、当業者に公知であるか、又は上記の試験によって適宜決定することができる。

投与頻度は、使用される組成物の特性及び上記の被験体の状態に依存し、1日に複数回（すなわち、1日あたり2、3、4、5又はそれ以上）とすることができ、1日に1回、数日ごと（すなわち、2、3、4、5、6又は7日ごとなど）、週に数回（たとえば、１週に2、3、4回など）、隔週又は数週間ごと（つまり、2、3、4週ごとなど）に設定することができる。

いくつかの実施形態では、本発明はまた、上記担体を利用することによって、悪性腫瘍細胞に薬物を送達する方法に関する。この方法は、送達されるべき物質を担持する担体を生体内又は培地、例えば肺の細胞外マトリックス産生細胞を含む培地に投与又は添加する工程を含む。これらの工程は、本発明に記載された任意の既知の方法又は方法に従って、適切に達成することができる。また、上記の方法は、インビトロで行う態様と、体内の肺の悪性腫瘍細胞を標的とする態様とを含む。

本発明の治療有効配合物は、活性薬剤の広い生体内分布を提供し得る全身性送達によって投与することができる。

本発明の実施形態は、本発明の治療用分子及び薬学的に許容される担体を含む治療用製剤を提供することができる。

本発明の製剤の有効用量は、1日1回から12回、又は1週間に1回で投与することができる。投与期間は、1、2、3、4、5、6又は7日とすることができ、又は1、2、3、4、5、6、8、10又は12週間とすることができる。

追加の実施形態
被検者における悪性腫瘍を治療するための活性剤を分布させるために使用するた組成物、その組成物はイオン化可能な脂質、構造脂質及びナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質を含んでいる。悪性腫瘍は、肺、結腸、腎臓又は膵臓に位置することができる。悪性腫瘍は、肝臓、骨、皮膚又は腸に位置することができる。イオン化可能な脂質は、組成物の脂質の50モル％〜80モル％、又は組成物の脂質の55モル％〜65モル％とすることができる。構造脂質は、組成物の脂質の20モル％〜50モル％、又は組成物の脂質の35モル％〜55モル％とすることができる。構造脂質は、コレステロール、ステロール、又はステロイドとすることができる。ナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質は、組成物の脂質の1モル％〜8モル％とすることができる。ナノ粒子の免疫原性を減少させるための脂質は、200〜5000Daの分子量を有するポリエチレングリコール（PEG）領域を有することができる。ナノ粒子の免疫原性を低下させる脂質は、DPPE-mPEG、DSPE-mPEG、DMPE-mPEG、又はDOPE-mPEGとすることができる。

本発明はさらに、対象における悪性腫瘍を治療するための活性剤を分布させるのに使用するための組成物であって、イオン化可能な脂質、構造脂質、1つ以上の安定化脂質及びナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質を含む組成物を企図している。イオン化可能な脂質は、組成物の脂質の15モル％〜40モル％、又は組成物の脂質の20モル％〜35モル％とすることができる。構造脂質は、組成物の脂質の25モル％〜40モル％、又は組成物の脂質の30モル％〜35モル％とすることができる。

1つ以上の安定剤脂質の合計は、組成物の脂質の25モル％〜40モル％であってもよく、安定剤脂質の各々は、個々に5モル％〜35モル％である。1つ以上の安定剤脂質は、ホスファチジルエタノールアミン化合物又はホスファチジルコリン化合物とすることができる。

組成物は（化合物81/コレステロール/DOPC/DOPE/DPPE-PEG-2000）を以下の組み合わせの1つとすることができる。ここで、数字は成分のモル％濃度を指す：（25/30/30/10/5）、（25/30/25/15/5）、（25/30/20/20/5）、（25/30/15/25/5）、（25/30/10/30/5）、（25/35/15/20/5）、（25/35/20/15/5）、（30/30/15/20/5）、（30/30/20/15/5）、（35/30/15/15/5）。いくつかの実施形態において、イオン性脂質は化合物81とすることができ、構造脂質はコレステロールとすることができ、安定剤脂質はDOPC及びDOPEとすることができ、ナノ粒子の免疫原性を低下させる脂質はDSPE-mPEG-2000とすることができる。ここで、化合物81が組成物の15〜25モル％を含み、コレステロール、DOPC及びDOPEの合計は組成物の75〜85モル％を含み、DSPE-mPEG-2000が組成物の1〜5モル％を構成し、そして、化合物81、コレステロール、DOPC、DOPE及びDSPE-mPEG-2000を合わせたものは、組成物の実質的に100モル％の脂質を含む。

GST-πを標的とするRNAi分子及びp21を標的とするRNAi分子を活性剤とすることができる。いくつかの実施形態において、活性剤は、GST-πを標的とするRNAi分子及びp21を標的とするRNAi分子を含み、組成物は、RNAi分子をカプセル化するリポソームナノ粒子を含む。特定の実施形態では、活性剤は、GST-πを標的とするRNAi分子及びp21を標的とするRNAi分子を含み、組成物は、RNAi分子をカプセル化し、ヒト血清への曝露後1時間に少なくとも80％のカプセル化RNAi分子を保持する。

本発明はまた、脂質組成物及び活性剤を含む医薬組成物を企図する。活性剤は、1つ以上のRNAi分子とすることができる。悪性腫瘍を治療するためのRNAi分子は、GST-πを標的とするRNAi分子及びp21を標的とするRNAi分子を含むことができる。悪性腫瘍を治療するためのRNAi分子は、例えば、siRNA、shRNA又はマイクロRNA、ならびにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用性RNA（piRNA）及び反復関連siRNA（rasiRNA）とすることができる。

特定の実施形態では、本発明は、GST-πのみを標的とするRNAi分子である悪性腫瘍を治療するためのRNAi分子を含有する医薬組成物を提供する。

本発明の実施形態は、本発明の組成物を被験体に投与することによって、悪性物質を治療するために、活性剤を被験体の器官に分配する方法をさらに含む。悪性腫瘍は、肺、結腸、腎臓又は膵臓に位置することができる。悪性腫瘍は、肝臓、骨、皮膚、又は腸に位置することができる。悪性腫瘍は、頭頸部、脳、乳房、食道、胃、腸、十二指腸、肝臓、胆嚢、胆管、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、精巣、子宮、卵巣、皮膚、骨、骨髄、血液、皮膚、及び上皮層からなる群から選択される解剖学的領域に位置することができる。。

投与は、12週間までの期間、1日当たり少なくとも1回、0.01〜2mg/kgのRNAi分子の用量とすることができる。投与は、1〜1000μg*分/mLの平均AUC（0-最終）及びGST-πRNAi分子について0.1〜50μg/mLの平均Cmaxを提供することができる。投与は、1〜1000μg*分/mLの平均血漿AUC（0-最終）及びp21 RNAi分子の平均血漿Cmax（0.1〜50μg/mL）を提供することができる。

本発明は、それを必要とする哺乳動物又は任意の動物における悪性腫瘍の1つ又は複数の症状を予防、治療又は改善する方法であって、RNAi分子を含む組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含み、RNAi分子の一部はGST-πの発現を減少させる活性があり、RNAi分子の一部はp21の発現を減少させる活性がある。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍は、哺乳動物におけるKRAS突然変異と関連しており、この方法は、哺乳動物の腫瘍細胞を同定することをさらに含み、腫瘍細胞は（i）KRAS遺伝子の突然変異、及び(ii）KRASタンパク質の異常な発現レベル、のうち少なくとも一方を有する。

本発明の方法は、ヒトを含む任意の動物に適用することができる。

哺乳動物はヒトであってもよく、GST-πはヒトGST-πであってもよく、p21はヒトp21であってもよい。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍はGST-πを過剰発現し、GST-πの発現がダウンレギュレーションされる場合、p21のレベルはアップレギュレートされてもよい。RNAi分子は、哺乳類におけるGST-π及びp21の発現を減少させることができる。投与は、少なくとも5日間、哺乳動物におけるGST-π及びp21の発現を少なくとも5％減少させることができる。本方法は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を軽減するか、又は悪性腫瘍の進行を遅延又は終了させるか、又は被験者の悪性腫瘍細胞の増殖を減少させることができる。腫瘍細胞は、正常細胞におけるものと比較して、野生型KRASタンパク質の発現レベルの増加を含み得る。腫瘍細胞は野生型GST-πRNA又はタンパク質を過剰発現しており、GST-πの発現が抑制されると、p21 RNA又はタンパク質のレベルが上昇する可能性がある。

いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、KRASタンパク質に、残基12、13及び61の1つ以上に変異を含むことができる。特定の実施形態において、腫瘍細胞はKRASタンパク質に変異を含むことができる。腫瘍は大腸癌、膵臓癌及び肺癌から選択される癌である。腫瘍は、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の管癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される肉腫とすることができる。悪性腫瘍は、肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌、結腸直腸癌、乳癌及び線維肉腫の群から選択される肉腫とすることができる。悪性腫瘍は、いくつかの実施形態では、肺、肝臓、膵臓、結腸、腎臓、骨、皮膚、腸、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択することができる任意の解剖学的領域に位置することができる。

別の態様において、本発明は、GST-π及びp21のsiRNA阻害剤での処置によって、悪性腫瘍の大きさをインビボで減少させることができる驚くべき発見に関する。さらに、本発明は、腫瘍細胞のアポトーシスを合成致死率のレベルまで増加させることができるといった予想外に有利な結果を提供することで、悪性腫瘍を予防又は治療するための方法及び組成物を提供する。

本発明は、悪性腫瘍の状態及び疾患を予防、治療、又は改善するための様々な器官への送達に使用するための、核酸に基づく治療化合物を組み込む方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、悪性腫瘍に関連する様々な標的の遺伝子サイレンシングのためのRNA干渉分子（RNAi分子）の組成物を提供する。

本発明は、治療用分子の送達のための組成物、及びその使用方法を提供することができる。本発明の種々のRNA系及び薬剤組成物は、悪性腫瘍を予防又は治療するための方法において使用することができる。

いくつかの実施形態において、KRAS突然変異を含む又は異常なKRAS発現レベルを示す悪性腫瘍は、GST-π及びp21の発現を腫瘍細胞の合成致死性を生じるレベルに調節するsiRNA剤での治療することによって減少させることができる。

本発明は、悪性腫瘍に対する核酸に基づく治療化合物のための方法及び組成物に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、GST-π及びp21の発現をサイレンシングできるRNAi分子、構造及び組成物を提供する。本開示の構造及び組成物は、悪性腫瘍のサイズを予防、治療又は縮小に使用することができる。

本発明は、被験体における新生物を治療するために使用できる組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、KRAS関連腫瘍を治療するため、p21核酸分子又はポリペプチドと同様に、GST-π核酸分子又はポリペプチドの発現を低下させることができ治療用組成物を提供する。

いくつかの態様において、本発明は、GST-π核酸分子の少なくともフラグメントに対応するか又はそれに相補的であり、細胞内でGST-π発現を減少させる阻害性核酸分子を含んでいる。さらなる場面において、本発明は、p21核酸分子の少なくともフラグメントに対応するか、又は少なくともそれに相補的であり、細胞内でp21発現を減少させる阻害性核酸分子を含んでいる。

特定の実施形態では、本発明は、siRNA又はshRNAなどのRNAi分子、DNA指向性RNA（ddRNA）、PiWi相互作用性RNA（piRNA）、及び反復関連siRNA（例えば、rasiRNA）を使用して、GST-π及びp21を抑制する。

本発明の方法は、ヒトを含む任意の動物に適用可能であり得る。

いくつかの態様において、本発明は、上記の阻害性核酸分子をコードする1つ以上のベクターを含んでいる。ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターとすることができる。さらなる実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞における発現に適したプロモーターを含むことができる。さらなる実施形態は、KRAS突然変異を含有するか又は異常なKRAS発現レベルを示す癌細胞であって、ベクター又は上記態様のいずれか1つの阻害性核酸分子を含むことができる癌細胞を含んでいる。さらなる実施形態では、細胞はインビボにおける腫瘍性細胞であってもよい。

いくつかの実施形態では、本発明は、KRAS突然変異を含むか又は異常なKRAS発現を示す悪性腫瘍細胞におけるGST-π及びp21発現を減少させる方法を含んでいる。方法は、細胞を阻害性核酸分子の有効料に接触させる工程を含み、ここで阻害性核酸分子はGST-πポリペプチド及びp21ポリペプチドの発現を阻害し、それにより細胞におけるGST-π及びp21発現を減少させる。

さらなる実施形態では、本発明の方法は、悪性腫瘍におけるGST-π及びp21の転写又は翻訳を減少させることができる。

特定の実施形態では、本発明は、悪性腫瘍細胞におけるGST-π及びp21発現を減少させる方法を含み、細胞は、ヒト細胞、腫瘍細胞、インビボ細胞、又はインビトロ細胞であり得る。

本発明の実施形態はまた、KRAS突然変異を含有するか異常なKRAS発現レベルを示す新生物癌細胞を有する被検者を治療する方法を提供することができる。方法は、2つ以上の阻害性核酸分子の有効量を被験体に投与する工程を含み、ここで阻害性核酸分子はGST-π及びp21発現を減少させ、それにより新生物を治療する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療前又は治療なしの新生物のサイズと比較して新生物のサイズを減少させることができる。

様々な実施形態において、阻害性核酸分子は、リポソーム、ポリマー、マイクロスフェア、ナノ粒子、遺伝子治療ベクター、又は裸のDNAベクター中に送達することができる。

さらなる態様において、本発明は、例えば、新生物癌細胞がKRAS突然変異を含有するか又は異常なKRAS発現レベルを示す新生物を有するヒト患者等の被検者を治療する方法を特徴としている。特定の実施形態では、本方法は、阻害性核酸分子の有効量を被験体に投与する工程を含み、ここで阻害性核酸分子がGST-πポリペプチド及びp21ポリペプチドの発現を阻害する、RNA干渉について活性なアンチセンス核酸分子、siRNA、dsRNA又はそれらの組み合わせである。

特定の実施形態では、新生物の細胞はGST-πを過剰発現し、GST-πが抑制される場合、p21のレベルを上昇させることができる。

特定の実施形態では、新生物は、悪性腫瘍、又は肺癌、腎臓癌又は膵臓癌とすることができる。

脂質尾部の構造
本発明の脂質様化合物は、1つ以上のアルキル基又はアルケニル基を含む1つ以上の親油性尾部を有することができる。親油性尾部の例としては、C(14:1(5))アルケニル、C(14:1(9))アルケニル、C(16:1(7))アルケニル、C(16:1(9))アルケニル、C(18:1(3))アルケニル、C(18:1(5))アルケニル、C(18:1(7))アルケニル、C(18:1(9)) アルケニル、C(18:1(11))アルケニル、C(18:1(12))アルケニル、C(18:2(9,12))アルケニル、C(18:2(9,11))アルケニル、C(18:3(9,12,15))アルケニル、C(18:3(6,9,12))アルケニル、C(18:3(9,11,13))アルケニル、C(18:4(6,9,12,15))アルケニル、C(18:4(9,11,13,15))アルケニル、C(20:1(9))アルケニル、C(20:1(11))アルケニル、C(20:2(8,11))アルケニル、C(20:2(5,8))アルケニル、C(20:2(11,14))アルケニル、C(20:3(5,8,11))アルケニル、C(20:4(5,8,11,14))アルケニル、C(20:4(7,10,13,16))アルケニル、C(20:5(5,8,11,14,17))アルケニル、C(20:6(4,7,10,13,16,19))アルケニル、C(22:1(9))アルケニル、C(22:1(13)アルケニル及びC(24:1(9))アルケニルを挙げることができる。

化学的定義
本明細書で使用する用語「アルキル」は、任意の長さを有する飽和脂肪族基のヒドロカルビル基を意味する。アルキル基は、1〜22個の炭素原子を含有する分枝又は非分枝の置換又は非置換脂肪族基とすることができる。この定義はまた、例えば、シクロアルキル、アルコキシ、アルカノイル及びアラルキルのような他の基のアルキル部分にも適用される。

本明細書で使用する「C(1-5)アルキル」といった用語は、C(1)アルキル、C(2)アルキル、C(3)アルキル、C(4)アルキル及びC(5)アルキルを含んでいる。同様に、例えば、用語“C(3-22)アルキル”は、C(1)アルキル、C(2)アルキル、C(3)アルキル、C(4)アルキル、C(5)アルキル、C(6)アルキル、C(7)アルキル、C(8)アルキル、C(9)アルキル、C(10)アルキル、C(11)アルキル、C(12)アルキル、C(13)アルキル、C(14)アルキル、C(15)アルキル、C(16)アルキル、C(17)アルキル、C(18)アルキル、C(19)アルキル、C(20)アルキル、C(21)アルキル及びC(22)アルキルを含んでいる。

本明細書で使用されるアルキル基は、Me（メチル）、Et（エチル）、Pr（任意のプロピル基）、ⁿPr（n-Pr、n-プロピル）、ⁱPr(i-Prイソプロピル)、Bu（任意のブチル基）、ⁿBu (n-Bu、n-ブチル)、ⁱBu（i-Bu、イソブチル）、^sBu（s-Bu、sec-ブチル）及び^tBu（t-Bu、tert-ブチル）といった用語で指定することができる。

本明細書で使用される用語「アルケニル」は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有するヒドロカルビル基を意味する。アルケニル基は、2〜22個の炭素原子及び少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有する分岐又は非分岐、置換又は非置換のヒドロカルビル基とすることができる。

本明細書で使用される「置換された」という用語は、同じであっても異なっていてもよく、水素置換基を含み得る1つ以上の置換又は置換基を有する原子を意味する。したがって、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルカノイル及びアリールという用語は、置換されたバリエーションを含むことができる基を意味する。置換されたバリエーションには、直鎖状、分枝状及び環状のバリエーション、及びその基の任意の炭素原子に結合した1つ以上の水素の１又は複数の置換基を有する基が含まれる。

一般に、化合物は、1つ以上のキラル中心を含むことができる。1つ又は複数のキラル中心を含む化合物は、「異性体」、「立体異性体」、「ジアステレオマー」、「鏡像異性体」、「光学異性体」又は「ラセミ混合物」として記載された化合物を含むことができる。立体化学命名規則、例えばCahn、Ingold及びPrelogの立体異性体命名規則ならびに立体化学及び立体異性体の決定のための慣習は、当技術分野で公知である。例えば、Michael B. Smith及びJerry March、March's Advanced Organic Chemistry、5th edition、2001を参照のこと。本開示の化合物及び構造は、すべての可能な異性体、立体異性体、ジアステレオマー、エナンチオマー及び/又は光学異性体を包含する意味であって、特定の化合物又は構造（任意の混合粒、ラセミ体又はそれ以外のいずれかを含む）について存在すると理解されるであろう。

本発明は、本明細書に開示されている化合物及び組成物のいずれか及びすべての互変異性体、溶媒和物又は非溶媒和物、水和物又は非水和物、ならびにあらゆる原子同位体形態を包含する。

本発明は、本明細書に開示される化合物及び組成物の任意の及びすべての結晶多形又は異なる結晶形を包含する。

インビトロノックダウンのための例示的プロトコル
トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×10³細胞/ウェルで播種し、5％CO₂の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養した。トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に変更した。その後、0.2μlのLipofectamine RNAiMax（Life Technologiesカタログ番号13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合した。次に、1μlのsiRNAを4μlのOpti-MEM Iと混合し、LF2000溶液と混合し、ボルテックスなしで穏やかに混合した。室温で5分後、混合物を室温でさらに10分間インキュベートし、RNA-RNAiMax複合体を形成させた。さらに、10μlのRNA-RNAiMax複合体をウェルに添加し、プレートを手で静かに振盪した。細胞を5％CO₂の空気中で加湿雰囲気を含む37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートした。培地を、2％FBSを含む新鮮なOpti-MEM I還元血清培地に交換した。トランスフェクションの24時間後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄した。細胞を室温で5〜30分間、50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）で溶解した。5μlの停止溶液を加え、室温で2分間インキュベートした。mRNAレベルはTAQMANを用いたRT-qPCRにより直ちに測定した。サンプルは-80℃で凍結し、後にアッセイすることができた。

血清安定性のための例示的プロトコル
0.2mg/mlのsiRNAを37℃で10％ヒト血清とともにインキュベートした。特定の時点（0、5、15及び30分）で、200μlの試料を等分し、抽出溶媒（クロロホルム：フェノール：イソアミルアルコール=24：25：1）200μlで抽出した。サンプルをボルテックスし、室温で10分間、13,000rpmで遠心分離し、次いで、上層溶液を移し、0.45μmのフィルターで濾過した。濾液を300μlのHPLC注入バイアルに移した。LCMSの場合、移動相はMPA：H₂O中100mM HFIP＋7mM TEA、MPB：50％メタノール＋50％アセトニトリルとした。カラム：Waters Acquity OST 2.1×50mm、1.7μmを使用した。

［実施例１］本発明のGST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤は、in vivoで癌異種移植片腫瘍の著しい減少を示した。これらGST-π及びp21 siRNAは、癌異種移植腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、インビボでの遺伝子ノックダウン効力をもたらした。

図1は、GST-π（配列番号61及び126）及びp21（配列番号341及び355、N＝U）siRNAのリポソーム製剤についての腫瘍阻害効力を示している。癌異種移植モデルを、GST-πsiRNAについて1.15mg/kg及びp21 siRNAについて0.74mg/kgの比較的低用量で使用した。

GST-π及びp21 siRNAの製剤化は、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。30日後、GST-π及びp21 siRNAは、対照と比較して腫瘍体積が2倍を超えて減少し、著しく有利な腫瘍阻害効力を示した。

GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤の4回の注射（1日目、8日目、15日目及び22日目）で投与した。

癌異種移植モデルについては、A549細胞株をATCCから得た。10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充した培養培地中で細胞を維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。細胞を、血清を含まない培地中で5×10⁷/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射した。

マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーの胸腺ヌードマウス（nu/nu）雌マウス、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり7〜8匹のマウスとした。

腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及びシリンジを用いて、2.5×10⁵個のA549細胞の接種材料0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。

腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅²/2を用いて計算した。確立された腫瘍が約120〜175mm³に達すると、平均腫瘍体積は約150mm³であり、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群の平均腫瘍体積の10％以内になるように、マウスを様々なビヒクル対照及び処置群に割り当てた。理想的には、腫瘍体積のCV％を25％未満とした。同じ日に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍体積を第1週に3回、研究終了の日を含む残りの週に2回モニターした。

用量投与のために、投薬日に、試験品を-80℃冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した。注射器にアプライする前に、薬剤を含むボトルを手で数回戻した。すべての試験品に10ml/kgのIVを投与した。

体重について、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。体重をモニターし、初回投与の7日以内に毎日記録した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週二回記録した。

腫瘍の収集のために、最初の投与の28日後に、腫瘍体積を測定し、腫瘍を重量測定のために解剖し、PDバイオマーカー研究のために保存した。腫瘍重量を記録した。

［実施例２］本発明のGST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤は、in vivoで癌異種移植片腫瘍の著しい減少を示した。GST-π及びp21 siRNAは、癌異種移植腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、インビボでの遺伝子ノックダウン効力をもたらした。

図2は、GST-π（配列番号156及び182）及びp21（配列番号341及び355、N＝U）siRNAのリポソーム製剤についての腫瘍阻害効力を示す。癌異種移植片モデルを、各siRNAについて0.75mg/kgで比較的低用量で使用した。

GST-π及びp21 siRNAの製剤は、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。30日後、GST-π及びp21 siRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、腫瘍体積は対照と比較して1.7倍減少した。

［実施例３］本発明のGST-πsiRNA及びp21 siRNAの製剤は、in vitroで癌細胞のアポトーシスにより癌細胞死の増加を示した。インビトロでの癌細胞のアポトーシスを、細胞生存率の低下に関連するアポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションを観察することによってモニターした。

GST-π及びp21 siRNAの製剤は、予想外に癌細胞のアポトーシスを増加させた。

図3に示すように、PUMAの発現レベルは、GST-π及びp21 siRNAの製剤（図3、p21（A）＋GSTP（A）、P21配列番号341及び355、N＝U、GSTP配列番号：156及び182）に関して、GST-π及びp21 siRNAのトランスフェクションの約2〜4日後に大きく増加した。

これらのデータは、本発明のGST-π及びp21 siRNAの製剤が予想外に癌細胞のアポトーシスを増加させることを示している。

PUMAバイオマーカーに関するプロトコルは以下の通りとした。トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×10³細胞/ウェルで播種し、5％CO₂の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養した。翌日、トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）と交換した。次いで、0.2μlのLipofectamine RNAiMAX（Life Technologiesカタログ番号13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合した。1μlのsiRNA（ストック濃度1μM）を4μlのOpti-MEM Iと混合し、RNAiMAX溶液と混合し、次いで穏やかに混合した。混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMAX複合体を形成させた。10μlのRNA-RNAiMAX複合体をウェル当たりに添加し、siRNAの最終濃度を10nMとした。細胞を2時間インキュベートし、培地を2％FBSを含む新鮮なOpti-MEM I還元血清培地に交換した。トランスフェクションの1、2、3、4及び6日後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄し、次いで50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）を用いて室温で約5〜30分溶解した。5μlの停止溶液を添加し、室温で2分間インキュベートした。PUMA（BBC3、Cat＃Hs00248075、Life Technologies）のmRNAレベルをTAQMANを用いてqPCRにより測定した。

［実施例４］GST-π及びp21を標的としたsiRNAの二重ノックダウンインビトロ研究は、その組み合わせが両方のタンパク質のmRNAレベルの抑制に関して高活性であることを示した。表11に示すように、GST-π及びp21それぞれのノックダウンレベルは2、10及び50nMの濃度で高かった。

プロトコール：2、10及び50nMでP21 siRNAでトランスフェクトした。1、2、3又は4日後、10nMでGST-πsiRNAでトランスフェクトした。1日後、P21 mRNA及びGST-πmRNAレベルについてRT-PCRにより分析した。

［実施例５］：同所性A549肺癌マウスモデル。本発明のGST-πsiRNAは、インビボで同所性肺癌腫瘍の顕著な減少を示すことができる。この実施例において、GST-πsiRNAは、無胸腺ヌードマウスの同所性肺癌腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、in vivoで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。

一般に、同所性腫瘍モデルは、薬効及び効力、ならびに改善された予測能力に関して直接の臨床的関連性を示すことができる。同所性腫瘍モデルにおいて、腫瘍細胞は、細胞が由来する同種の器官に直接移植される。

ヒト肺癌A549に対するsiRNA製剤の抗腫瘍有効性を、処置群及びビヒクル対照群の剖検時に測定した最終原発腫瘍重量を比較することによって評価した。

図4は、構造BU2（配列番号61及び126）に基づくGST-πsiRNAのインビボでの同所性肺癌腫瘍阻害を示している。同所性A549肺癌マウスモデルを、GST-πを標的とするsiRNAの2mg/kgで比較的低用量で使用した。

GST-πsiRNAは、この6週間の研究において有意で予想外に有利な肺腫瘍阻害効力を示した。図4に示すように、43日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、最終腫瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。

この研究のために、5〜6週齢の雄NCr nu/nuマウスを使用した。実験期間中、実験動物をHEPA濾過環境に維持した。使用前にsiRNA製剤を4℃で保存し、マウスに注射する10分前に室温に温めた。

外科的同所移植（SOI）の日に、このA549ヒト肺癌同所性モデルについて、ストック腫瘍を、A549腫瘍異種移植片を有する動物の皮下部位から採取し、RPMI-1640培地に入れた。壊死組織を除去し、生存組織を1.5〜2mm³に切断した。動物をイソフルラン吸入で麻酔し、手術領域をヨウ素及びアルコールで滅菌した。約1.5cmの横断切開を、マウスの左胸壁に、一対の外科用ハサミを用いて行った。3番目と4番目の肋間に肋間切開を行い、左肺を露出させた。1つのA549腫瘍断片を8-0の外科的縫合糸（ナイロン）で肺の表面に移植した。胸壁は6-0の外科用縫合糸（シルク）で閉じられた。肺は、胸腔内の残りの空気を引き出すために、25G×1/2針の3ccシリンジを使用して胸腔内穿刺により再膨張させた。胸壁は6-0の外科用絹縫合糸で閉じられた。上記操作の全ての手順は、HEPA濾過層流フードの下で7倍の倍率顕微鏡を用いて行った。

腫瘍移植の3日後、モデル担癌マウスを、群当たり10匹のマウスの群に無作為に分けた。目的の群については、腫瘍移植の3日後に10匹のマウスの治療を開始した。

目的の群について、処方物は、（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K：DSPE-PEG-2K）のリポソーム組成物とした。リポソームはGST-πsiRNAをカプセル化した。

試験エンドポイントについては、処置開始後42日で実験マウスを屠殺した。原発腫瘍を切除し、その後の分析のために電子天秤で秤量した。

化合物の毒性の評価について、処置群及び対照群におけるマウスの平均体重は、実験期間全体にわたって正常範囲内に維持された。毒性の他の症状はマウスにおいて観察されなかった。

［実施例６］本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示した。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。

図5は、GST-πsiRNA（配列番号156及び182）の腫瘍阻害効力を示す。癌異種移植モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量で使用した。

GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。36日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、腫瘍体積は対照と比較して2倍減少した。

図5に示すように、GST-πsiRNAは、最終日に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。特に、腫瘍重量は2倍以上減少した。

組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤としてGST-πsiRNAを2回の注射（1日目及び15日目）で投与した。

癌異種移植モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充した培養培地中で細胞を維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。細胞を、血清を含まない培地中で5×10⁷/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。

腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及びシリンジを用いて、2.5×10⁶個のA549細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。

投薬投与のために、投与日に、試験品を-80℃の冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した。注射器にアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回戻した。全ての試験品には、0.75mg/kgでIV、q2wX2、10ml/kgで投与した。

体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。体重をモニターし、初回投与の7日以内に毎日記録した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週に２回記録した。

最初の投薬の28日後に腫瘍を採取するために、腫瘍体積を測定し、重量測定のために腫瘍を切開し、PDバイオマーカー研究のために保存した。腫瘍重量を記録した。

［実施例７］本発明のGST-πsiRNAは、in vitroで癌細胞のアポトーシスにより癌細胞死の増加を示した。GST-πsiRNAはGST-πノックダウンをもたらし、アポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションをもたらし、細胞生存率の低下を伴った。

シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌクレオチド及び2'-OMe置換リボヌクレオチドの組合せを含むGST-πsiRNA配列番号156及び182は、予期せず癌細胞のアポトーシスを増加させた。

GST-πsiRNA配列番号156及び182に対するPUMAの発現レベルを図6に示した。図6に示すように、PUMAの発現は、GST-πsiRNAのトランスフェクションの2〜4日後に大きく増加した。

これらのデータは、シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌクレオチド及び2'-OMe置換リボヌクレオチドの組み合わせを含むGST-πsiRNAの構造が、予想外に癌細胞のアポトーシスを増加させることを示している。

［実施例８］本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示すことができた。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力を提供することができる。

図7は、GST-πsiRNA（配列番号61及び126）の腫瘍阻害効力を示している。GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンは、GST-πを標的とするsiRNAでインビボで観察された。癌異種移植片モデルを、GST-πを標的とするsiRNAと共に使用した。

GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。図7に示すように、GST-πsiRNAで処理すると、脂質製剤に注射してから4日後にGST-πmRNA発現が有意に減少した。4mg/kgの高用量では、注入後24時間で約40％の有意な減少が検出された。

p21 siRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有する10mL/kgのリポソーム製剤として単回注射で投与した。

癌異種移植片モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。細胞を、10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。血清を含まないRPMI培地中で細胞を4×10⁷/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。

マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリー胸腺ヌード（nu/nu）雌マウス、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり3匹のマウスであった。

腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及び注射器を用いて、2×10⁶のA549細胞の接種材料0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。

腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅²/2を用いて計算した。腫瘍容積を週2回モニターした。確立された腫瘍が約350〜600mm³に達すると、マウスを様々な時点で群に割り当てた。同じ日に、試験品を投与レジメンに従って投与した。

投薬投与のために、確立された腫瘍が約350〜600mm³に達した日に、試験品を4℃の冷蔵庫から取り出した。シリンジにアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回戻して均一な溶液を作製した。

体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週2回記録した。

腫瘍の収集のために、動物を過量のCO₂で犠牲にし、投与後0、24、48、72及び96（任意）及び168時間で腫瘍を解剖した。腫瘍を最初に湿潤し、KD、分布及びバイオマーカー分析のために3つの部分に分けた。試料を液体窒素中で急速冷凍し、処理する準備が整うまで-80℃で保存した。

本明細書に記載された実施形態は限定的ではなく、当業者は、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを、改善されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験なしに試験することができることを容易に理解することができる。

本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物、特許及び文献は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。

本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された説明に様々な置換及び変更を加えることができ、これらの実施形態はこの説明及び添付の特許請求の範囲内にあることは、当業者にとって極めて明らかである。

単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（又は「an」）、「1つ以上」及び「少なくとも1つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」及び「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべきである。

本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、それぞれの個別値は個々に記載されているかのように組み入れられる。ここで、マーカッシュグループについては、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュグループのメンバーのサブグループを含むことを認識するであろう。

それ以上の詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。

本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の目的、又は同様の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。

Claims

ヒトGST-πを標的とするRNAi分子と、ヒトp21を標的とするRNAi分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
上記GST-πを標的とするRNAi分子の各々が、アンチセンス鎖：配列番号131及びセンス鎖：配列番号157を有する、請求項１記載の組成物。
上記p21を標的とするRNAi分子の各々が、アンチセンス鎖：配列番号341及びセンス鎖：配列番号355を有する、請求項１記載の組成物。
上記GST-πを標的とするRNAi分子の各々が、アンチセンス鎖：配列番号156及びセンス鎖：配列番号182を有する、請求項１記載の組成物。
上記p21を標的とするRNAi分子の各々が、アンチセンス鎖：配列番号343及びセンス鎖：配列番号357を有する、請求項１記載の組成物。
上記RNAi分子の二重鎖領域中の1つ以上のヌクレオチドが修飾されているか又は化学的に修飾されている、請求項１記載の組成物。
上記修飾された又は上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、2'-デオキシヌクレオチド、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせである、請求項６記載の組成物。
上記RNAi分子の各々が、アンチセンス鎖の5'末端から2〜8位の1つ以上に2'-デオキシヌクレオチドを含む、請求項１記載の組成物。
上記RNAi分子の各々の前記アンチセンス鎖が複数の位置にデオキシヌクレオチドを有し、前記複数の位置が以下のうちの1つである、請求項１記載の組成物。
アンチセンス鎖の5'末端からの位置4、6及び8の各々;
アンチセンス鎖の5'末端からの位置3、5及び7の各々;
アンチセンス鎖の5'末端からの位置1、3、5及び7の各々;
アンチセンス鎖の5'末端からの位置3〜8の各々; 又は
アンチセンス鎖の5 '末端からの位置5〜8の各々
上記組成物は、50pM未満のIC50でもってGST-πmRNAの発現を阻害し及び50pM未満のIC50でもってp21 mRNAの発現を阻害する、請求項１記載の組成物。
上記組成物の単回投与が、インビボでのGST-πmRNAレベルの発現を少なくとも25％阻害する、請求項１記載の組成物。
上記担体が、RNAi分子をカプセル化するリポソームナノ粒子を含む、請求項１記載の組成物。
上記担体が、RNAi分子をカプセル化し、ヒト血清に1時間暴露した後にカプセル化RNAi分子の少なくとも80％を保持するリポソームナノ粒子を含む、請求項１記載の組成物。
上記担体が、10〜1000nm、又は10〜150nmのサイズを有するリポソームナノ粒子を含む、請求項１記載の組成物。
上記組成物が、悪性腫瘍の治療に対して活性である、請求項１記載の組成物。
上記悪性腫瘍が、肺、結腸、腎臓、膵臓、肝臓、骨、皮膚又は腸に位置する、請求項１５記載の組成物。
上記担体が、イオン化可能な脂質、構造脂質、1つ以上の安定剤脂質、及びナノ粒子の免疫原性を低下させるための脂質を含むリポソームナノ粒子を含む、請求項１記載の組成物。
上記イオン化可能な脂質が、化合物81、化合物71、化合物57、化合物84、化合物49、化合物76、化合物78及び化合物102の群から選択される、請求項１７記載の組成物。
請求項１〜１８のいずれか1項記載の組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体における悪性腫瘍の1つ又は複数の症状を予防、治療又は改善する方法。
上記悪性腫瘍がKRAS突然変異と関連しており、前記方法は前記被験体における腫瘍細胞を同定する工程を更に含み、当該腫瘍細胞が少なくともi）KRAS遺伝子の突然変異、及び（ii）KRASタンパク質の異常な発現レベル、のうち１つを含む、請求項１９記載の方法。
上記悪性腫瘍がGST-πを過剰発現する、請求項１９記載の方法。
上記RNAi分子が、被験体におけるGST-π及びp21の発現を減少させる、請求項１９記載の方法。
上記投与が、被験体におけるGST-π及びp21の発現を少なくとも5日間で少なくとも5％減少させる、請求項１９記載の方法。
上記投与が、被験体における悪性腫瘍の体積を、少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％減少させる、請求項１９記載の方法。
上記方法は、悪性腫瘍の1つ以上の症状を軽減するか又は悪性腫瘍の進行を遅延させるか又は停止する、請求項１９記載の方法。
上記投与が、上記被験体における悪性腫瘍細胞の増殖を減少させる、請求項１９記載の方法。
上記投与が、上記被験体における悪性腫瘍細胞の少なくとも2％、又は少なくとも5％、又は少なくとも10％、又は少なくとも15％、又は少なくとも20％の増殖を減少させる、請求項１９記載の方法。
上記悪性腫瘍が結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌又は線維肉腫である、請求項１９記載の方法。
上記悪性腫瘍が、肺腺癌、粘液腺腫、膵管腺癌、又は結腸直腸癌である、請求項１９記載の方法。
上記投与が1日当たり1〜12回行われる、請求項１９記載の方法。
上記投与が、1、2、3、4、5、6又は7日間の期間にわたって行われる、請求項１９記載の方法。
上記投与が、1、2,、3、4、5、6、8、10又は12週間の期間にわたって行われる、請求項１９記載の方法。
上記投与が、12週間までの期間、1日当たり少なくとも1回、RNAi分子の0.01〜2mg/kgの用量である、請求項１９記載の方法。
上記投与が、GST-πRNAi分子について、平均AUC（0-最終）が1〜1000μg*分/mLであり、平均Cmaxが0.1〜50μg/mLである、請求項１９記載の方法。
上記投与が、p21 RNAi分子について、平均AUC（0-最終）が1〜1000μg*分/mLであり、平均Cmaxが0.1〜50μg/mLである、請求項１９記載の方法。
上記投与が、静脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経口、局所、点滴又は吸入である、請求項１９記載の方法。