WO2020145350A1 - 免疫賦活用組成物 - Google Patents

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WO2020145350A1
WO2020145350A1 PCT/JP2020/000482 JP2020000482W WO2020145350A1 WO 2020145350 A1 WO2020145350 A1 WO 2020145350A1 JP 2020000482 W JP2020000482 W JP 2020000482W WO 2020145350 A1 WO2020145350 A1 WO 2020145350A1
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WO
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double
stranded rna
base sequence
sequence represented
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/000482
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English (en)
French (fr)
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智之 西川
安史 金田
邦彦 山下
理乃 鈴木
和宏 寺居
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国立大学法人大阪大学
株式会社ダイセル
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Publication date
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Priority to US17/310,002 priority patent/US20220202846A1/en
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
    • A61M5/178—Syringes
    • A61M5/20—Automatic syringes, e.g. with automatically actuated piston rod, with automatic needle injection, filling automatically
    • A61M5/2046—Media being expelled from injector by gas generation, e.g. explosive charge
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
    • A61M5/178—Syringes
    • A61M5/30—Syringes for injection by jet action, without needle, e.g. for use with replaceable ampoules or carpules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present disclosure relates to an immunostimulatory composition.
  • a nucleic acid drug using an antisense nucleic acid is one of them.
  • compositions have been developed for use in delivering active agents to treat malignancies, examples of which are lung, kidney, pancreas, liver, bone, skin, intestine (colon).
  • malignant tumors located in (Patent Documents 1, 2, 3).
  • Non-patent Documents 1 to 4 reports that HVJ-E activates natural killer (NK) cells.
  • Sendai virus-derived RNA IVT-B2-RNA
  • RNA is involved in activation of natural killer (NK) cells.
  • An object of the present disclosure is at least to provide a technique for activating immunity of mammals.
  • a double-stranded RNA consisting of an RNA having a base sequence represented by the following sequence A and an RNA having a base sequence represented by the following sequence B.
  • each base of the (N) 13-25 portion in the base sequence represented by the sequence A and the base sequence represented by the sequence B may be complementary or not complementary
  • all the bases of the (N) 5-10 portion are complementary bases
  • the (N) 5-10 portion of the base sequence is The Tm value is 20° C. or higher.
  • Sequence A 5'- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N) 13-25 (N) 5-10 -3' (SEQ ID NO: 1)
  • Sequence B 5'- (N) 5-10 (N) 13-25 AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3' (SEQ ID NO: 2)
  • [2] The double-stranded RNA according to [1], wherein all the bases of the (N) 13-25 portion are not complementary bases.
  • [3] The double-stranded RNA according to [1], wherein all the bases of the (N) 13-25 portion are complementary bases.
  • [4] The double-stranded RNA according to any one of [1] to [3], wherein the Tm value is 20°C.
  • each base of the (N) 13-25 portion in the base sequence represented by the sequence A and the base sequence represented by the sequence B may be complementary or not complementary, In the base sequence represented by the sequence A and the base sequence represented by the sequence B, all the bases of the (N) 5-10 portion are complementary bases, and the (N) 5-10 portion of the base sequence is The Tm value is 20° C. or higher.
  • the present disclosure can have at least the effect of providing a technique for activating immunity of mammals.
  • One embodiment is a double-stranded RNA consisting of RNA having the base sequence represented by the following sequence A and RNA having the base sequence represented by the following sequence B.
  • the upper limit of the following (N) 13-25 portion may exceed 25, as long as it has an activity of stimulating immunity of the mammal to which the double-stranded RNA is administered. It may be 13 or more.
  • Sequence A 5'- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N) 13-25 (N) 5-10 -3' (SEQ ID NO: 1)
  • Sequence B 5'- (N) 5-10 (N) 13-25 AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3' (SEQ ID NO: 2)
  • Each of the bases of the (N) 13-25 portion in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 stimulates immunity of the mammal to which the double-stranded RNA is administered.
  • the base may be a complementary base or may not be a complementary base as long as it has the activity of
  • (N) 13-25 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 means when the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 form a double-stranded RNA.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 form a double-stranded RNA.
  • it is carried out it is not particularly limited as long as it has an activity of stimulating the immunity of the mammal to which the double-stranded RNA is administered, but one preferable embodiment is (N) 25 .
  • the (N) 13-25 portion of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a double-stranded RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the preferred embodiment is the base sequence represented by the following Sequence C. Sequence C: 5'-UCCAGGUACCGCGGAGCUUCGAUCG -3' (SEQ ID NO: 3)
  • the base sequence of the (N) 13-25 portion of the base sequence represented by No. 2 is the base sequence represented by Sequence D below. Sequence D: 5'- CGAUCGAAGCUCCGCGGUACCUGGA -3' (SEQ ID NO: 4)
  • the base represented by SEQ ID NO: 2 The base sequence of the (N) 13-25 portion of the base sequence shown in the above is when the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 form a double-stranded RNA.
  • it has an activity of stimulating immunity of a mammal to which the double-stranded RNA has been administered, it is not particularly limited, and examples thereof include a base sequence represented by the following sequence E. Sequence E: 5'- UACGACUGUGGAUAUAUAUAAAUAU -3' (SEQ ID NO: 5)
  • the "immunostimulation” in one embodiment means that immunity is stimulated in a mammal when the double-stranded RNA is administered, rather than when the double-stranded RNA is not administered.
  • a double-stranded RNA is referred to as “a double-stranded RNA having an activity of activating mammalian immunity”, a “double-stranded RNA having an immunostimulatory activity”, or the like.
  • a preferred embodiment is that in mammals, when the double-stranded RNA is administered is more natural than when the double-stranded RNA is not administered.
  • Killer (NK) cells are activated.
  • Activation of natural killer (NK) cells can be confirmed by a conventional method. For example, it can be confirmed by an immunostaining method using a natural killer (NK) cell activation marker as an antigen. Specifically, for example, there is flow cytometry.
  • NK natural killer
  • the immunostaining method can also be performed in pathological analysis or the like after administration of the double-stranded RNA.
  • the extracted tissue can be subjected to pathological analysis using the immunostaining method.
  • “immunostimulation” in one embodiment means that, in a preferred embodiment, the double-stranded RNA is administered to a mammal having cancer or tumor more than when the double-stranded RNA is not administered. When it is carried out, it means that the growth of cancer cells or tumor cells is suppressed. Suppressing the growth of cancer cells or tumor cells means that the rate of increase in tumor diameter decreases, and a preferable embodiment is that the rate becomes zero or close to zero. The tumor diameter can be measured by a conventional method.
  • cancer cells or tumor cells in one embodiment include skin cancer (for example, malignant melanoma), colon cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, kidney cancer, liver cancer. , Cancer cells or tumor cells in pancreatic cancer, gastric cancer, uterine cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, tongue cancer, glioma, retinoblastoma, lymphoma and the like.
  • skin cancer for example, malignant melanoma
  • colon cancer for example, malignant melanoma
  • lung cancer ovarian cancer
  • prostate cancer breast cancer
  • kidney cancer liver cancer
  • Cancer cells or tumor cells in pancreatic cancer gastric cancer, uterine cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, tongue cancer, glioma, retinoblastoma, lymphoma and the like.
  • the term “mammal” includes, for example, humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters (eg, Chinese hamsters), monkeys (eg, African green monkey), and the like.
  • (N) 5-10 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 means when the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 form a double-stranded RNA.
  • it is not particularly limited, but one preferable embodiment is (N) 7 .
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 form a double-stranded RNA.
  • the double-stranded RNA is not particularly limited as long as it has an activity of stimulating immunity of the mammal to which the double-stranded RNA has been administered, but one preferable embodiment is (N) 7 .
  • the base sequence of the (N) 5-10 portion in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the base sequence represented by the following sequence. Sequence: 5'- UUCUGCA -3'
  • the base sequence of the (N) 5-10 portion in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the base sequence represented by the following sequence. Sequence: 5'- UGCAGAA -3'
  • the Tm value of the (N) 5-10 portion is usually 20° C. or higher as long as it has an activity of stimulating the immunity of a mammal to which the double-stranded RNA is administered, and a preferred embodiment is 20° C. Is.
  • the upper limit is not particularly limited as long as it has an activity of activating the immunity of the mammal to which the double-stranded RNA has been administered, but is, for example, 50° C. or lower.
  • the Tm value (°C) is 4°C per pair of guanine (G) and cytosine (C), and 2°C per pair of adenine (A) and uracil (U). As the sum.
  • Both the RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be produced by known genetic engineering techniques or molecular biology techniques. It may also be produced by nucleic acid synthesis.
  • Another aspect of the present disclosure is an immunostimulatory drug containing the double-stranded RNA.
  • the natural killer (NK) cells are activated more when the double-stranded RNA is administered than when the double-stranded RNA is not administered.
  • the medicament of this aspect can be used for the treatment of diseases that can be treated by activation of natural killer (NK) cells. For example, treatment of cancer or tumor is mentioned.
  • the growth of cancer cells or tumor cells is suppressed more when the double-stranded RNA is administered than when the double-stranded RNA is not administered. Therefore, the medicament of the present aspect can be used for treating a disease that can be treated by suppressing the growth of cancer cells or tumor cells. For example, treatment of cancer or tumor is mentioned.
  • the cancer or tumor includes, for example, skin cancer (for example, malignant melanoma), colon cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, Uterine cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, tongue cancer, glioma, retinoblastoma, lymphoma and the like.
  • skin cancer for example, malignant melanoma
  • colon cancer for example, malignant melanoma
  • lung cancer ovarian cancer
  • prostate cancer breast cancer
  • kidney cancer renal cancer
  • liver cancer pancreatic cancer
  • gastric cancer Uterine cancer
  • laryngeal cancer pharyngeal cancer
  • tongue cancer glioma, retinoblastoma, lymphoma and the like.
  • the drug of this embodiment may be formulated by using the double-stranded RNA alone as an active ingredient, or may be formulated with a known pharmacologically acceptable carrier or the like in addition to the double-stranded RNA. You may formulate by adopting a well-known formulation method.
  • formulation material examples include a surfactant, an excipient, a coloring agent, a flavoring agent, a preservative, a stabilizer, a buffering agent, a suspending agent, an isotonicity agent, a binder, a disintegrating agent, a lubricant, and a flow agent.
  • a surfactant examples include sex promoters and flavoring agents.
  • known carriers can be used. Specifically, light anhydrous silicic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl acetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium-chain fatty acid triglyceride, Examples include sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • the drug of this embodiment may be in the form of powder or liquid, and other than these, an appropriate dosage form can be selected.
  • a liquid the content of the double-stranded RNA with respect to the total amount of the pharmaceutical agent of the present embodiment is not particularly limited as long as it has an activity of activating the immunity of the mammal to which the double-stranded RNA is administered, but it may be dissolved or stored.
  • the total amount of the double-stranded RNA is preferably 1 ⁇ g or more, another preferred embodiment is 2 ⁇ g or more, and still another preferred embodiment is 3 ⁇ g or more.
  • a preferred embodiment is 6 ⁇ g or less, another preferred embodiment is 5 ⁇ g or less, and yet another preferred embodiment is 4 ⁇ g or less.
  • the concentration when used as a liquid may be adjusted appropriately.
  • the method for applying the medicament of the present aspect to mammals may be oral administration or parenteral administration, but one preferred embodiment is parenteral administration, and another preferred embodiment is injection administration.
  • the injection administration include intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection and the like, which can be administered systemically or locally. Further, the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be appropriately selected depending on the patient's age, body weight, symptoms, administration route, administration schedule, formulation form, strength of immunostimulatory activity, and the like.
  • the daily dose may be administered once a day or may be divided into several doses.
  • each base of the (N) 13-25 portion in the base sequence represented by the sequence A and the base sequence represented by the sequence B may be complementary or not complementary.
  • all the bases of the (N) 5-10 portion are complementary bases
  • the (N) 5-10 portion of the base sequence is The Tm value is 20° C. or higher.
  • Sequence A 5'- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N) 13-25 (N) 5-10 -3' (SEQ ID NO: 1)
  • Sequence B 5'- (N) 5-10 (N) 13-25 AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3' (SEQ ID NO: 2)
  • a salt with a pharmacologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • a base eg, alkali metal salt
  • a pharmacologically acceptable acid addition salt examples include salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like, and the like.
  • These pharmacologically acceptable salts can be produced by a known method.
  • the present disclosure also includes the following other aspects.
  • a method for treating a disease that can be treated by immunostimulation comprising the step of administering a double-stranded RNA or an immunostimulatory drug to a mammal.
  • a double-stranded RNA in the manufacture of a medicament for suppressing the growth of cancer cells or tumor cells.
  • Use of double-stranded RNA for suppressing the growth of cancer cells or tumor cells Use of double-stranded RNA for suppressing the growth of cancer cells or tumor cells.
  • a method for suppressing the growth of mammalian cancer cells or tumor cells which comprises the step of administering a double-stranded RNA or a drug for suppressing the growth of cancer cells or tumor cells to the mammal.
  • a disease that can be treated by suppressing the growth of cancer cells or tumor cells including the step of administering a double-stranded RNA or a drug for suppressing the growth of cancer cells or tumor cells to a mammal Method of treatment.
  • Another aspect of the present disclosure is to inject a solution containing a biomolecule from the injector body without performing injection through the predetermined structure in a state where the predetermined structure is inserted into an injection target.
  • An injector for injecting into a target which has a container for containing a solution containing biomolecules, and an injection port through which a solution containing pressurized biomolecules flows and is injected into the target to be injected.
  • a nozzle part, and the solution containing the biomolecule is a solution containing the double-stranded RNA, the drug, or a solution containing the double-stranded RNA or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It is a vessel.
  • the injector according to the present aspect is such that a solution containing a biomolecule is injected from the injector body into the injection target without performing injection through the predetermined structure in a state where the predetermined structure is inserted into the injection target. Is to be injected into.
  • the injector is one that guides a solution containing biomolecules from the injector body to the injection target when the distance from the injector body to the injection target is large, for example, a predetermined structure such as a catheter. May be included. Therefore, the injector may or may not include such a predetermined structure, but in the case where the predetermined structure is included, the predetermined structure is inserted in the injection target. The solution containing the biomolecule is not injected into the injection target.
  • the drive unit for pressurizing the solution containing the biomolecule is not particularly limited.
  • the pressurization may be, for example, the pressure generated when the pressure of the compressed gas is released, or the pressure generated by the combustion of the explosive charged by the ignition device.
  • the pressure may be electric energy of the piezoelectric element or mechanical energy of a spring or the like, which is used as the injection energy, or the pressure may be the injection energy generated by appropriately combining these forms of energy.
  • One preferred embodiment is a mode in which at least the pressure generated by the combustion of the explosive ignited by the igniter is used, and it may be used in combination with either or both of the other two pressurizing modes.
  • the explosive includes, for example, explosive (ZPP) containing zirconium and potassium perchlorate, titanium hydride and perchloric acid.
  • ZPP explosive
  • the explosive containing any one of the explosive containing (AMO), the explosive containing aluminum and copper oxide (ACO), the explosive containing aluminum and iron oxide (AFO), or the explosive including a plurality of combinations thereof may be used. ..
  • the gas generant is a single-base smokeless explosive, or various gases used in gas generators for airbags and gas generators for seat belt pretensioners. It is also possible to use a generator.
  • the solution containing the biomolecule is not contained in the filling chamber from the beginning, but is accommodated by sucking the solution containing the biomolecule into the filling chamber through the nozzle having the ejection port. ..
  • the syringe part is configured to be removable.
  • a syringe 1 (needleless injector) will be described below as an example of the injector in this embodiment with reference to the drawings.
  • the configurations and the combinations thereof in each embodiment are examples, and addition, omission, replacement, and other changes of the configurations can be appropriately made without departing from the spirit of the present invention.
  • the present invention is not limited by the embodiments, but only by the scope of the claims. This also applies to the examples described later. It should be noted that the terms “front end side” and “base end side” are used as terms representing the relative positional relationship in the longitudinal direction of the syringe 1.
  • the “distal end side” represents a position closer to the distal end of the syringe 1 described later, that is, a position closer to the ejection port 31a, and the “proximal end side” is a direction opposite to the “distal end side” in the longitudinal direction of the syringe 1, That is, the direction on the drive unit 7 side is shown.
  • the present example is an example in which the combustion energy of the explosive ignited by the ignition device is used as the injection energy, and the medicine (injection drug) is used as the solution containing the biomolecule, but the present embodiment is not limited to this. Not a thing.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a syringe 1, and is also a cross-sectional view of the syringe 1 taken along its longitudinal direction.
  • the syringe 1 includes a syringe assembly 10 in which a subassembly including a syringe portion 3 and a plunger 4 and a subassembly including a syringe body 6, a piston 5 and a drive portion 7 are integrally assembled. , And is attached to the housing (syringe housing) 2.
  • the syringe assembly 10 is configured to be detachable from the housing 2.
  • the filling chamber 32 formed between the syringe portion 3 and the plunger 4 included in the syringe assembly 10 is filled with a medicine (injection drug), and the syringe assembly 10 injects the medicine (injection drug). It is a unit that is thrown away each time.
  • the housing 2 side includes a battery 9 that supplies electric power to an igniter 71 included in the drive unit 7 of the syringe assembly 10. Power is supplied from the battery 9 to the electrode on the housing 2 side and the electrode on the drive unit 7 side of the syringe assembly 10 via wiring when the user presses the button 8 provided on the housing 2. Will be held between.
  • the shape and position of the electrodes on the housing 2 side and the electrodes on the drive section 7 side of the syringe assembly 10 are designed so that they automatically contact each other when the syringe assembly 10 is attached to the housing 2. ing.
  • the housing 2 is a unit that can be used repeatedly as long as the battery 9 has power that can be supplied to the drive unit 7. In the housing 2, when the battery 9 runs out of power, only the battery 9 may be replaced and the housing 2 may be continuously used.
  • the igniter 71 is used in order to adjust the pressure transition applied to the medicine (injection medicine) via the piston 5, the igniter 71 is used. It is also possible to dispose a gas generating agent or the like that combusts with a combustion product generated by the explosive combustion to generate a gas in the igniter 71 or the through hole of the injector body 6.
  • the configuration of disposing the gas generating agent in the igniter 71 is a known technique as disclosed in International Publication No. 01-031282, Japanese Patent Laid-Open No. 2003-25950 and the like.
  • the gas generating agent As an example of the gas generating agent, a single base smokeless explosive consisting of 98% by mass of nitrocellulose, 0.8% by mass of diphenylamine and 1.2% by mass of potassium sulfate can be mentioned. It is also possible to use various gas generating agents used in gas generators for airbags and gas generators for seat belt pretensioners. It is possible to change the combustion completion time of the gas generating agent by adjusting the size, size, and shape of the gas generating agent, particularly the surface shape when the gas generating agent is placed in the through hole.
  • the transition of the pressure applied to the (injection drug) can be a desired transition, that is, a transition in which the drug (injection drug) can be appropriately injected into the injection target.
  • the gas generating agent and the like used as needed are also included in the drive unit 7.
  • RNA having the base sequence represented by the following sequence F and RNA having the base sequence represented by the following sequence G was entrusted to GeneDesign, Inc and acquired.
  • the base sequence represented by the following sequence F and the base sequence represented by the following sequence G are sequences in which the respective bases of the (N) 13-25 portion are not complementary bases, and (N) 5- The Tm value of 10 parts is 20°C.
  • Sequence F 5'- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACUUCCAGGUACCGCGGAGCUUCGAUCGUUCUGCA -3' (SEQ ID NO: 6)
  • Sequence G 5'- UGCAGAAUACGACUGUGGAUAUAUAUAAAUAUAGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3' (SEQ ID NO: 7)
  • Double-stranded RNA consisting of RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:6 and RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:7 was prepared. Specifically, RNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or RNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 was dissolved in PBS (final concentration 0.1 ⁇ g/ ⁇ l). An equal amount of the other RNA was mixed there, heated at 95° C. for 5 minutes using a heat block, and allowed to stand until the temperature dropped to room temperature. Thereafter, it was stored at -20°C until use.
  • B16F10 cell Mouse malignant melanoma B16F10 strain (hereinafter sometimes referred to as “B16F10 cell”) is derived from ATCC (American Type Culture Collection (address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)). obtained. B16F10 cells, 37 ° C., at 5% C0 2 incubator, 10% FBS-containing DMEM medium (Code #. 08458-16, Nacalai Tesque) were cultured according to a conventional method using a.
  • Tumor cell growth inhibition test C57BL/6NJcl mice (female, 7 weeks old) were seeded with 1.0 ⁇ 10 6 cells/50 ⁇ l of mouse malignant melanoma (B16F10 cells) in the dorsal skin, and when the longest diameter of the intradermal tumor reached 5 mm, the Administration of double-stranded RNA was started. 30 ⁇ l (0.1 ⁇ g/ ⁇ l) of double-stranded RNA was loaded into the injector and directly administered to tumors derived from intradermally seeded B16F10 cells. The injector is the injector shown in FIG. 1, and ZPP, which is the ignition charge, was set under the condition of 30 mg. The double-stranded RNA was administered three times on days 0, 2, and 4, and the tumor diameter was measured up to 14 days on the day of administration and every other day after administration to calculate the tumor volume.
  • Example 2 Same as Example 1 except that double-stranded RNA consisting of RNA consisting of the base sequence represented by the following sequence H and RNA consisting of the base sequence represented by the following sequence I was used. I chose The base sequence represented by the following sequence H and the base sequence represented by the following sequence I are sequences in which each of the bases in the (N) 13-25 part is a complementary base, and (N) The Tm value of part 5-10 is 20°C.
  • Sequence H 5'- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACUUCCAGGUACCGCGGAGCUUCGAUCGUUCUGCA -3' (SEQ ID NO: 8)
  • Sequence I 5'- UGCAGAACGAUCGAAGCUCCGCGGUACCUGGAAGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3' (SEQ ID NO: 9)
  • Example 1 The same procedure as in Example 1 was repeated except that PBS was used instead of the double-stranded RNA.

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Abstract

本発明の課題は、少なくとも、哺乳動物の免疫を賦活する技術の提供であり、該課題を、下記配列Ａで表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、下記配列Ｂで表される塩基配列からなるＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡで解決する。　ただし、前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基は相補的であっても相補的でなくてもよく、　前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）５－１０部分の各塩基はすべて相補的な塩基であって、該（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃以上である。　配列Ａ：5'- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N)13-25(N)5-10-3'（配列番号１）　配列Ｂ：5'- (N)5-10(N)13-25AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3'（配列番号２）

Description

免疫賦活用組成物
　本開示は、免疫賦活用組成物に関する。
　がんの診断や治療はいまも進歩を続けており、がん治療のための様々な医薬が開発されている。アンチセンス核酸を用いた核酸医薬もその一つである。例えば、悪性腫瘍を治療するための活性剤を分配する際に使用される組成物が開発されており、その悪性腫瘍の例として、肺、腎臓、膵臓、肝臓、骨、皮膚、腸（結腸）に位置する悪性腫瘍が挙げられている（特許文献１、２、３）。
　本発明者らは、がんや腫瘍を治療するための様々な分子治療法の開発を行ってきた。
　その一つとして、本発明者らは、不活性化したセンダイウイルス（hemagglutinating virus of Japan, HVJ）粒子をもとにして、遺伝子やsiRNAを導入することができるベクターHVJ envelope vector (HVJ-E)を開発し、HVJ-E自身が抗腫瘍効果を奏することを見出した（非特許文献１～４）。特に、非特許文献１では、HVJ-Eがナチュラルキラー（NK）細胞を活性化することを報告している。
　また、本発明者らは、センダイウイルス由来ＲＮＡ（IVT-B2-RNA）が抗腫瘍免疫を活性化し、選択的にがん細胞の細胞死を誘導すること、また、これには、IVT-B2-RNAによるナチュラルキラー（NK）細胞の活性化が関与していることを報告している（非特許文献５）。
　このように、がんや腫瘍の治療に有用な核酸医薬の開発が進められている。
特表２０１８－５１２０６０号公報 特開２０１８－１４３２４８号公報 再表２０１７／０３３９１２号公報
Cancer Res., 67:227-236 (2007) Cancer Immunol. Immunother., 57:73-84 (2008) Int. J. Cancer, 124: 2478-2487 (2009) Int. J. Cancer, 126:1982-1991 (2010) Mol. Therapy, 24(1):135-45 (2016)
　本開示の課題は、少なくとも、哺乳動物の免疫を賦活する技術の提供にある。
〔１〕下記配列Ａで表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、下記配列Ｂで表される塩基配列からなるＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ。
　ただし、前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基は相補的であっても相補的でなくてもよく、
　前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）５－１０部分の各塩基はすべて相補的な塩基であって、該（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃以上である。
　配列Ａ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N)13-25(N)5-10-3’（配列番号１）
　配列Ｂ：5’- (N)5-10(N)13-25AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号２）
〔２〕前記（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基でない、〔１〕に記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔３〕前記（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基である、〔１〕に記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔４〕前記Ｔｍ値は２０℃である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔５〕前記（Ｎ）１３－２５が（Ｎ）２５である、〔１〕に記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔６〕前記（Ｎ）２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基でない、〔５〕に記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔７〕前記（Ｎ）２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基である、〔５〕に記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔８〕前記（Ｎ）５－１０が（Ｎ）７である、〔５〕～〔７〕のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔９〕前記Ｔｍ値は２０℃である、〔８〕に記載の二本鎖ＲＮＡ。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡを含む、免疫賦活用医薬。
〔１１〕前記免疫賦活が、ナチュラルキラー細胞の活性化である、〔１０〕に記載の医薬。
〔１２〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡを含む、がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬。
〔１３〕下記配列Ａで表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、下記配列Ｂで表される塩基配列からなるＲＮＡからなる、免疫賦活活性を有する、又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する、二本鎖ＲＮＡ又はその薬理学的に許容される塩。
　ただし、前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基は相補的であっても相補的でなくてもよく、
　前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）５－１０部分の各塩基はすべて相補的な塩基であって、該（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃以上である。
　配列Ａ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N)13-25(N)5-10-3’（配列番号１）
　配列Ｂ：5’- (N)5-10(N)13-25AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号２）
〔１４〕注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、
　生体分子を含む溶液を収容する収容部と、
　加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、
　を備え、
　前記生体分子を含む溶液が、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡを含む溶液、〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載の医薬、又は〔１３〕に記載の二本鎖ＲＮＡ若しくはその薬理学的に許容される塩を含む溶液である、
　注入器。
　本開示は、少なくとも、哺乳動物の免疫を賦活する技術を提供するという効果を奏しうる。
一実施態様に係る、注入器の概略構成を示す図。 一実施態様に係る、腫瘍細胞の増殖抑制試験の結果を示すグラフ。
　ある実施態様は、下記配列Ａで表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、下記配列Ｂで表される塩基配列からなるＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡである。ただし、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、下記（Ｎ）１３－２５部分は、その上限が２５を超えてもよい。１３以上であってもよい。
　配列Ａ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N)13-25(N)5-10-3’（配列番号１）
　配列Ｂ：5’- (N)5-10(N)13-25AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号２）
　前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基は、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、相補的な塩基であってもよいし、相補的な塩基でなくてもよい。
　前記配列番号１で表される塩基配列における（Ｎ）１３－２５は、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とが二本鎖ＲＮＡを成したときに、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、特に制限されないが、好ましい一実施態様は（Ｎ）２５である。
　また、前記配列番号２で表される塩基配列における（Ｎ）１３－２５は、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とが二本鎖ＲＮＡを成したときに、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、特に制限されないが、好ましい一実施態様は（Ｎ）２５である。
　前記配列番号１で表される塩基配列における（Ｎ）１３－２５部分の塩基配列は、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とが二本鎖ＲＮＡを成したときに、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、特に制限されないが、好ましい一実施態様は、下記配列Ｃで表される塩基配列である。
　配列Ｃ：5’- UCCAGGUACCGCGGAGCUUCGAUCG -3’（配列番号３）
　このとき、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基である場合には、前記配列番号２で表される塩基配列の（Ｎ）１３－２５部分の塩基配列は、下記配列Ｄで表される塩基配列である。
　配列Ｄ：5’- CGAUCGAAGCUCCGCGGUACCUGGA -3’（配列番号４）
　また、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基でない場合、前記配列番号２で表される塩基配列の（Ｎ）１３－２５部分の塩基配列としては、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とが二本鎖ＲＮＡを成したときに、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、特に制限されないが、例えば、下記配列Ｅで表される塩基配列が挙げられる。
　配列Ｅ：5’- UACGACUGUGGAUAUAUAUAAAUAU -3’（配列番号５）
　一実施態様における「免疫賦活」とは、哺乳動物において、当該二本鎖ＲＮＡが投与されなかった場合よりも、当該二本鎖ＲＮＡが投与された場合の方が、免疫が賦活されることをいう。本明細書では、このような二本鎖ＲＮＡを、「哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する二本鎖ＲＮＡ」や「免疫賦活活性を有する二本鎖ＲＮＡ」等と記載する。
　一実施態様における「免疫賦活」とは、好ましい一実施態様は、哺乳動物において、当該二本鎖ＲＮＡが投与されなかった場合よりも、当該二本鎖ＲＮＡが投与された場合の方が、ナチュラルキラー（NK）細胞が活性化していることをいう。
　ナチュラルキラー（NK）細胞の活性化は、常法に従って確認することができる。例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞活性化マーカーを抗原とした免疫染色法などで確認できる。具体的には、例えば、フローサイトメトリーなどがある。また、標的がん細胞とナチュラルキラー（NK）細胞とを共培養し、ナチュラルキラー（NK）細胞が、がん細胞を傷害する能力を測定するナチュラルキラー（NK）細胞傷害性解析を行うことで確認できる。当該免疫染色法は、当該二本鎖ＲＮＡ投与後の病理解析等においても行うことができる。例えば、摘出した組織に対して当該免疫染色法を用いて病理解析をすることができる。
　また、一実施態様における「免疫賦活」とは、好ましい一実施態様は、がん又は腫瘍を有する哺乳動物において、当該二本鎖ＲＮＡが投与されなかった場合よりも、当該二本鎖ＲＮＡが投与された場合の方が、がん細胞又は腫瘍細胞の増殖が抑制されることをいう。がん細胞又は腫瘍細胞の増殖の抑制とは、腫瘍径の増大する速さが小さくなることであり、好ましい一実施態様はその速さがゼロ又はゼロに近くなることである。腫瘍径は常法により測定することができる。
　一実施態様における、がん細胞又は腫瘍細胞としては、例えば、皮膚がん（例えば、悪性黒色腫）、大腸がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、腎がん、肝がん、膵がん、胃がん、子宮がん、喉頭がん、咽頭がん、舌がん、神経膠腫、網膜芽細胞腫、リンパ腫等における、がん細胞又は腫瘍細胞が挙げられる。
　一実施態様における、「哺乳動物」とは、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター（例えば、チャイニーズハムスターなど）、サル（例えば、アフリカミドリザルなど）等が挙げられる。
　また、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とにおける（Ｎ）５－１０部分の各塩基はすべて相補的な塩基である。
　前記配列番号１で表される塩基配列における（Ｎ）５－１０は、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とが二本鎖ＲＮＡを成したときに、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、特に制限されないが、好ましい一実施態様は（Ｎ）７である。
　また、前記配列番号２で表される塩基配列における（Ｎ）５－１０は、前記配列番号１で表される塩基配列と前記配列番号２で表される塩基配列とが二本鎖ＲＮＡを成したときに、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、特に制限されないが、好ましい一実施態様は（Ｎ）７である。
　前記配列番号１で表される塩基配列における（Ｎ）５－１０部分の塩基配列は、好ましい一実施態様は、下記配列で表される塩基配列である。
　配列：5’- UUCUGCA -3’
　このとき、前記配列番号２で表される塩基配列における（Ｎ）５－１０部分の塩基配列は、下記配列で表される塩基配列である。
　配列：5’- UGCAGAA -3’
　また、当該（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り、通常２０℃以上であり、好ましい一実施態様は２０℃である。一方で上限は、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り特に制限されないが、例えば、５０℃以下である。
　尚、本開示では、Ｔｍ値（℃）は、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対が１対当たり４℃、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）の塩基対が１対当たり２℃として、その和とする。
　配列番号１で表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、配列番号２で表される塩基配列ともに、公知の遺伝子工学的手法や分子生物学的手法により製造することができる。また、核酸合成により製造してもよい。
　本開示の他の態様は、前記二本鎖ＲＮＡを含む、免疫賦活用医薬である。
　上記の通り、哺乳動物において、当該二本鎖ＲＮＡが投与されなかった場合よりも、当該二本鎖ＲＮＡが投与された場合の方が、ナチュラルキラー（NK）細胞が活性化していることから、本態様の医薬は、ナチュラルキラー（NK）細胞の活性化によって治療され得る疾患の治療に使用することができる。例えば、がん又は腫瘍の治療が挙げられる。
　また、がん又は腫瘍を有する哺乳動物において、当該二本鎖ＲＮＡが投与されなかった場合よりも、当該二本鎖ＲＮＡが投与された場合の方が、がん細胞又は腫瘍細胞の増殖が抑制されることから、本態様の医薬は、がん細胞又は腫瘍細胞の増殖が抑制されることによって治療され得る疾患の治療に使用することができる。例えば、がん又は腫瘍の治療が挙げられる。
　がん又は腫瘍とは、例えば、皮膚がん（例えば、悪性黒色腫）、大腸がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、腎がん、肝がん、膵がん、胃がん、子宮がん、喉頭がん、咽頭がん、舌がん、神経膠腫、網膜芽細胞腫、リンパ腫等が挙げられる。
　本態様の医薬は、有効成分として前記二本鎖ＲＮＡを単独で用いて製剤化してもよいし、前記二本鎖ＲＮＡに加えて、公知の薬理学的に許容される担体等と配合するという公知の製剤化方法を採用することで製剤化してもよい。
　製剤素材としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。
　また、公知の担体が使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等が挙げられる。
　本態様の医薬は、粉末状でも液状でもよく、それら以外にも適当な剤形が選択できる。液状の場合、本態様の医薬全量に対する前記二本鎖ＲＮＡの含有量は、当該二本鎖ＲＮＡが投与された哺乳動物の免疫を賦活する活性を有する限り特段限定されないが、溶解や保存等の都合から、前記二本鎖ＲＮＡとして、総量で、好ましい一実施態様は1 μg以上であり、別の好ましい一実施態様は2 μg以上であり、さらに別の好ましい一実施態様は3 μg以上であり、一方で、好ましい一実施態様は6 μg以下であり、別の好ましい一実施態様は5 μg以下であり、さらに別の好ましい一実施態様は4 μg以下である。尚、液体として用いる場合の濃度は適宜調整すればよい。
　本態様の医薬の哺乳動物への適用方法は、経口投与でも非経口投与でもよいが、好ましい一実施態様は非経口投与であり、別の好ましい一実施態様は注射投与である。注射投与としては、例えば、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等が挙げられ、これにより全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
　投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、免疫賦活活性の強さなどにより適宜選択できる。例えば、１日に投与する量を、１日に１回で投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。
　本開示の態様は、下記配列Ａで表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、下記配列Ｂで表される塩基配列からなるＲＮＡからなる、免疫賦活活性を有する、又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する、二本鎖ＲＮＡ又はその薬理学的に許容される塩である。
　ただし、前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基は相補的であっても相補的でなくてもよく、
　前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）５－１０部分の各塩基はすべて相補的な塩基であって、該（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃以上である。
　配列Ａ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N)13-25(N)5-10-3’（配列番号１）
　配列Ｂ：5’- (N)5-10(N)13-25AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号２）
　詳細は、前記態様の説明を援用する。
　薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）や、塩基（例えば、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、好ましい一実施態様は薬理学的に許容される酸付加塩である。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。これらの薬理学的に許容される塩は公知の方法で製造することができる。
　また、本開示は、下記の他の態様を含む。
〔１〕免疫賦活用医薬の製造における、二本鎖ＲＮＡの使用。
〔２〕免疫賦活のための、二本鎖ＲＮＡの使用。
〔３〕免疫賦活に用いられる、二本鎖ＲＮＡ。
〔４〕免疫賦活によって治療され得る疾患の治療に用いられる、二本鎖ＲＮＡ。
〔５〕二本鎖ＲＮＡ又は免疫賦活用医薬を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物の免疫を賦活する方法。
〔６〕二本鎖ＲＮＡ又は免疫賦活用医薬を哺乳動物に投与する段階を含む、免疫賦活によって治療され得る疾患の治療方法。
〔７〕がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬の製造における、二本鎖ＲＮＡの使用。
〔８〕がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制するための、二本鎖ＲＮＡの使用。
〔９〕がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制に用いられる、二本鎖ＲＮＡ。
〔１０〕がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制することによって治療され得る疾患の治療に用いられる、二本鎖ＲＮＡ。
〔１１〕二本鎖ＲＮＡ又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物のがん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
〔１２〕二本鎖ＲＮＡ又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬を哺乳動物に投与する段階を含む、がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制することによって治療され得る疾患の治療方法。
　本開示の他の態様は、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、生体分子を含む溶液を収容する収容部と、加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、前記生体分子を含む溶液が、前記二本鎖ＲＮＡを含む溶液、前記医薬、又は前記二本鎖ＲＮＡ若しくはその薬理学的に許容される塩を含む溶液である、注入器である。
　本態様における注入器は、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入するものである。該注入器は、例えば、注入器本体から注入対象までの距離が大きい場合等に、生体分子を含む溶液を注入器本体から注入対象まで誘導するもの、例えば、カテーテル等のような所定の構造物を含んでもよい。したがって、該注入器とは、そのような所定の構造物を含んでも含まなくてもよいが、所定の構造物を含む場合には、該所定の構造物が注入対象内に挿入された状態で生体分子を含む溶液が該注入対象に注入されるものではない。
　本態様における注入器において、生体分子を含む溶液を加圧するための駆動部は特に制限されない。加圧は、例えば、圧縮ガスの圧力が解放される際に生じる圧力によってもよいし、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力によってもよい。また、圧電素子等の電気的エネルギーやばね等の機械的エネルギーを射出エネルギーとして利用した圧力によってもよく、これらの形態のエネルギーを適宜組み合わせることで生成した射出エネルギーを利用した圧力によってもよい。好ましい一実施態様は、少なくとも、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力を用いる態様であり、さらには、上記他の２つの加圧態様のいずれか、または両者と併用してもよい。
　加圧として、点火装置によって点火される火薬の燃焼により生じる圧力を用いる態様を採用する場合、火薬としては、例えば、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）、水素化チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴＨＰＰ）、チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴｉＰＰ）、アルミニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＡＰＰ）、アルミニウムと酸化ビスマスを含む火薬（ＡＢＯ）、アルミニウムと酸化モリブデンを含む火薬（ＡＭＯ）、アルミニウムと酸化銅を含む火薬（ＡＣＯ）、アルミニウムと酸化鉄を含む火薬（ＡＦＯ）のうち何れか一つの火薬、又はこれらのうち複数の組み合わせからなる火薬であってもよい。これらの火薬の特徴としては、その燃焼生成物が高温状態では気体であっても常温では気体成分を含まないため、点火後燃焼生成物が直ちに凝縮を行う。
　また、ガス発生剤の発生エネルギーを射出エネルギーとして利用する場合、ガス発生剤としては、シングルベース無煙火薬や、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。
　本態様における注入器では、充填室には当初から生体分子を含む溶液が収容されているのではなく、射出口を有するノズルを介して生体分子を含む溶液を充填室内に吸引することにより収容する。このように、充填室への充填操作を必要とする構成を採用することで、必要とする任意の生体分子を含む溶液を注入対象に注入することが可能となる。そのため、該注入器では、シリンジ部は着脱可能に構成されている。
　以下に、図面を参照して本態様における注入器の例として、注射器１（無針注射器）について説明する。各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本発明は、実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。このことは、後述する実施例についても同様である。なお、注射器１の長手方向における相対的な位置関係を表す用語として、「先端側」及び「基端側」を用いる。当該「先端側」は、後述する注射器１の先端寄り、すなわち射出口３１ａ寄りの位置を表し、当該「基端側」は、注射器１の長手方向において「先端側」とは反対側の方向、すなわち駆動部７側の方向を表している。また、本例示は、点火装置によって点火される火薬の燃焼エネルギーを射出エネルギーとして、また、医薬（注射薬）を、生体分子を含む溶液として用いる例示であるが、本態様はこれに限定されるものではない。
（注射器１の構成）
　図１は、注射器１の概略構成を示す図であり、注射器１のその長手方向に沿った断面図でもある。注射器１は、シリンジ部３とプランジャ４とで構成されるサブ組立体と、注射器本体６とピストン５と駆動部７とで構成されるサブ組立体とが一体に組み立てられた注射器組立体１０が、ハウジング（注射器ハウジング）２に取り付けられることで構成される。
　上記の通り、注射器組立体１０は、ハウジング２に対して脱着自在となるように構成されている。注射器組立体１０に含まれるシリンジ部３とプランジャ４との間に形成される充填室３２には医薬（注射薬）が充填され、そして、当該注射器組立体１０は、医薬（注射薬）の射出を行う度に使い捨てられるユニットである。一方で、ハウジング２側には、注射器組立体１０の駆動部７に含まれる点火器７１に電力供給するバッテリ９が含まれている。バッテリ９からの電力供給は、ユーザがハウジング２に設けられたボタン８を押下する操作を行うことで、配線を介してハウジング２側の電極と、注射器組立体１０の駆動部７側の電極との間で行われることになる。なお、ハウジング２側の電極と注射器組立体１０の駆動部７側の電極とは、注射器組立体１０がハウジング２に取り付けられると、自動的に接触するように両電極の形状および位置が設計されている。またハウジング２は、バッテリ９に駆動部７に供給し得る電力が残っている限りにおいて、繰り返し使用することができるユニットである。なお、ハウジング２においては、バッテリ９の電力が無くなった場合には、バッテリ９のみを交換しハウジング２は引き続き使用してもよい。
　また、図１に示す注射器本体６内には、特に追加的な火薬成分は配置されていないが、ピストン５を介して医薬（注射薬）にかける圧力推移を調整するために、点火器７１での火薬燃焼によって生じる燃焼生成物によって燃焼しガスを発生させるガス発生剤等を、点火器７１内や注射器本体６の貫通孔内に配置することもできる。点火器７１内にガス発生剤を配置する構成は、国際公開公報０１－０３１２８２号や特開２００３－２５９５０号公報等に開示されているように既に公知の技術である。また、ガス発生剤の一例としては、ニトロセルロース９８質量％、ジフェニルアミン０．８質量％、硫酸カリウム１．２質量％からなるシングルベース無煙火薬が挙げられる。また、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。貫通孔内に配置されるときのガス発生剤の寸法や大きさ、形状、特に表面形状を調整することで、該ガス発生剤の燃焼完了時間を変化させることが可能であり、これにより、医薬（注射薬）にかける圧力推移を所望の推移、すなわち注入対象に医薬（注射薬）が適切に注入され得る推移とすることができる。本態様では、必要に応じて使用されるガス発生剤なども駆動部７に含まれるものとする。
　以下に実施例を記載するが、いずれの実施例も、限定的な意味として解釈される実施例ではない。
〔実施例１〕
（RNAの調製）
　下記配列Ｆで表される塩基配列からなるRNA、及び下記配列Ｇで表される塩基配列からなるRNAの合成を、GeneDesign,Incに委託し、取得した。
　尚、下記配列Ｆで表される塩基配列と下記配列Ｇで表される塩基配列とは、（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基でない配列であり、（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃である配列である。
　配列Ｆ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACUUCCAGGUACCGCGGAGCUUCGAUCGUUCUGCA -3’（配列番号６）
　配列Ｇ：5’- UGCAGAAUACGACUGUGGAUAUAUAUAAAUAUAGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号７）
（RNAのアニーリング）
　配列番号６で表される塩基配列からなるRNA、及び配列番号７で表される塩基配列からなるRNAからなる二本鎖RNAを調製した。具体的には、配列番号６で表される塩基配列からなるRNA又は配列番号７で表される塩基配列からなるRNAをPBSに溶解した（終濃度0.1 μg/μl）。そこへ他方のRNAを等量混合し、ヒートブロックを用いて95℃で5分間加熱し、そのまま放置して室温まで温度が下がるのを待った。その後、使用まで-20℃で保存した。
（マウス悪性黒色腫B16F10株の培養）
　マウス悪性黒色腫B16F10株（以下、「B16F10細胞」と称することがある。）は、ATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所：12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America））から入手した。B16F10細胞は、37℃、５％C02インキュベーター内にて、10%FBS含有DMEM培地（Code #. 08458-16, ナカライテスク）を用いて常法に従って培養した。
（腫瘍細胞の増殖抑制試験）
　C57BL/6NJclマウス（雌性、7週齢）の背部皮内にマウス悪性黒色腫（B16F10細胞）を1. 0×106cells/50μl播種し、皮内腫瘍の長径が5 mmに達したところで二本鎖RNAの投与を開始した。30 μl (0.1 μg/μl)の二本鎖RNAを注入器に充填し、背部皮内に播種したB16F10細胞に由来する腫瘍に直接投与した。尚、該注入器は、図１に記載された注入器であり、点火薬であるZPPが30 mgの条件にセットされたものである。当該二本鎖RNAは、0, 2, 4日の3回投与し、投与日及び投与後1日置きに14日まで腫瘍径を計測し、腫瘍の容積を算出した。
〔実施例２〕
　二本鎖RNAとして、下記配列Ｈで表される塩基配列からなるRNA、及び下記配列Ｉで表される塩基配列からなるRNAからなる二本鎖RNAを用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
　尚、下記配列Ｈで表される塩基配列と、下記配列Ｉで表される塩基配列とは、（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基である配列であり、（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃である配列である。
　配列Ｈ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACUUCCAGGUACCGCGGAGCUUCGAUCGUUCUGCA -3’（配列番号８）
　配列Ｉ：5’- UGCAGAACGAUCGAAGCUCCGCGGUACCUGGAAGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号９）
〔参考例１〕
　凍結HVJ (10，000 HAU)を溶解後、99 ｍJ/cm2のUV照射にて不活性化を行った。この不活化HVJ-E溶液を遠心（20,400 g, 10 min, 4 ℃）した後、上清を取り除き、ペレット（HVJ-E）をPBS (150 μl)に懸濁して調製した（2,000 HAU/30 μl）。このように調製したHVJ-E溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
〔比較例１〕
　二本鎖RNAの代わりにPBSを用いたこと以外は、実施例１と同様にした。
〔結果〕
　腫瘍径を示したグラフを図２に示す。比較例１では日数とともに腫瘍径が増大したが、実施例１、実施例２では、参考例１と同等に腫瘍径の増大を抑制し、かつ、いずれの場合も比較例１との間で有意差（p < 0.05）を示した。
　１・・・・注射器
　２・・・・ハウジング
　３・・・・シリンジ部
　４・・・・プランジャ
　５・・・・ピストン
　６・・・・注射器本体
　７・・・・駆動部
　８・・・・ボタン
　９・・・・バッテリ
　１０・・・・注射器組立体
　３１・・・・ノズル部
　３１ａ・・・射出口
　３２・・・・充填室
　７１・・・・点火器 

Claims (14)

  1. 　下記配列Ａで表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、下記配列Ｂで表される塩基配列からなるＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ。
    　ただし、前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基は相補的であっても相補的でなくてもよく、
    　前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）５－１０部分の各塩基はすべて相補的な塩基であって、該（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃以上である。
    　配列Ａ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N)13-25(N)5-10-3’（配列番号１）
    　配列Ｂ：5’- (N)5-10(N)13-25AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号２）
  2. 　前記（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基でない、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  3. 　前記（Ｎ）１３－２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  4. 　前記Ｔｍ値は２０℃である、請求項１～３のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  5. 　前記（Ｎ）１３－２５が（Ｎ）２５である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  6. 　前記（Ｎ）２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基でない、請求項５に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  7. 　前記（Ｎ）２５部分の各塩基がすべて相補的な塩基である、請求項５に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  8. 　前記（Ｎ）５－１０が（Ｎ）７である、請求項５～７のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  9. 　前記Ｔｍ値は２０℃である、請求項８に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡを含む、免疫賦活用医薬。
  11. 　前記免疫賦活が、ナチュラルキラー細胞の活性化である、請求項１０に記載の医薬。
  12. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡを含む、がん細胞又は腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬。
  13. 　下記配列Ａで表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び、下記配列Ｂで表される塩基配列からなるＲＮＡからなる、免疫賦活活性を有する、又はがん細胞若しくは腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する、二本鎖ＲＮＡ又はその薬理学的に許容される塩。
    　ただし、前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）１３－２５部分の各塩基は相補的であっても相補的でなくてもよく、
    　前記配列Ａで表される塩基配列と前記配列Ｂで表される塩基配列とにおける（Ｎ）５－１０部分の各塩基はすべて相補的な塩基であって、該（Ｎ）５－１０部分のＴｍ値は２０℃以上である。
    　配列Ａ：5’- UUGUCAUAUGGACAAGUCCAAGACU(N)13-25(N)5-10-3’（配列番号１）
    　配列Ｂ：5’- (N)5-10(N)13-25AGUCUUGGACUUGUCCAUAUGACAA -3’（配列番号２）
  14. 　注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、
    　生体分子を含む溶液を収容する収容部と、
    　加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、
    　を備え、
    　前記生体分子を含む溶液が、請求項１～９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡを含む溶液、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の医薬、又は請求項１３に記載の二本鎖ＲＮＡ若しくはその薬理学的に許容される塩を含む溶液である、
    　注入器。
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