JP2021515753A

JP2021515753A - 有効成分として抗がんウイルス及びヒドロキシウレアを含むがんを予防又は治療するための医薬組成物

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Publication number: JP2021515753A
Application number: JP2020544934A
Authority: JP
Inventors: テ—ホファン，; テ―ホファン，; モンチョー，
Original assignee: バイオノックスインコーポレイテッド
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2021-06-24
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: AU2019226906A1; CN111818932A; KR20190103979A; EP3760213A1; EP3760213C0; EP3760213B1; EP3760213A4; KR102381952B1; WO2019168346A1; JP7167395B2; US20200405794A1; CA3092441A1; EP4342985A2; KR20210005827A; AU2019226906B2

Abstract

本発明は、有効成分として抗がんウイルス及びヒドロキシウレアを含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物に関する。本発明による有効成分として抗がんウイルス及びヒドロキシウレアを含むがんを予防又は治療するための医薬組成物は、抗がんウイルスのみを投与した従来の場合と比べて優れた腫瘍抑制効果を示し、抗がんウイルスに対して抵抗性のあるがん細胞ですら殺すことができる。したがって、本発明のがんを予防又は治療するための医薬組成物は、がんの治療において有益に使用されうる。【選択図】図１５

Description

本発明は、活性成分として、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物に関する。

腫瘍溶解性ウイルスは、優れた腫瘍特異的ターゲティング能、がん細胞での増殖能、及びがん細胞死滅能を有する。近年、腫瘍溶解性ウイルスに基づく様々な臨床試験が行われている。２０１５年に、進行黒色腫の治療薬として、単純ヘルペスウイルスをベースとした腫瘍溶解性ウイルスであるタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−Ｖｅｃ）の市販化が成功すると、米国及びヨーロッパにおいて、腫瘍溶解性ウイルス分野の時代が始まった。

近年、腫瘍溶解性ウイルスの有用性は、腫瘍溶解性ウイルス自身の有効性を上回っており、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍免疫を活性化し、これは、腫瘍溶解性ウイルスが別の免疫療法薬と併用される治療薬として有望であることを示している。腫瘍溶解性ウイルスの開発の初期段階であった２０００年までは、腫瘍溶解性ウイルスのがん細胞に特異的な増殖が引き起こす直接的な死滅効果が比較的重要であった。しかしながら、その後の臨床試験から、直接的ながん細胞死滅効果よりもむしろ腫瘍免疫の活性化が主要な機作であることが明らかとなった。この知見に基づき、腫瘍溶解性ウイルスと免疫チェックポイント阻害剤などの免疫療法薬とを含む、両者を組み合わせて投与する治療薬が、近年、開発中である。これは、腫瘍溶解性ウイルスが、免疫が抑制されている腫瘍微小環境を免疫療法に適切な腫瘍微小環境に変換することが既知であることが理由である。

しかしながら、これまでは、腫瘍溶解性ウイルスに関する多くの臨床試験において、腫瘍微小環境は見落とされてきた。臨床試験では、腫瘍溶解性ウイルスによる治療によって、急性腫瘍壊死、持続的奏効、又は完全奏効が得られることもあるが、場合によって、進行性疾患又は早期死亡などの予測困難な結果（薬力学的変動）を引き起こすこともある。例として、ワクシニアウイルスをベースとしたＰｅｘａ−ｖｅｃの場合、第１相臨床試験において、腫瘍溶解性ウイルスによる治療後１カ月以内に尚早に患者が死亡した症例がある。

したがって、腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増強するためには、がん細胞と患者の免疫状態と腫瘍溶解性ウイルスとの間の相互作用を理解することが必要であり、この理解に基づき、腫瘍溶解性ウイルスの臨床効果を高めることができる技術に関する研究が必要である。

本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスの抗がん効果を増強させる研究を行った。結果として、本発明者らは、がんを有する個体に腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合に、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与する従来の場合と比べて優れた抗がん効果が得られることを明らかにし、よって、本発明を完成させた。

上記の技術的課題を解決するために、本発明の一態様において、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、活性成分として腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを含む、医薬組成物を提供する。

本発明の別の態様において、がんを有する個体に腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。

活性成分として腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを含むがんを予防又は治療するための本発明の医薬組成物は、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した従来の場合と比べて優れた抗がん効果及び安全性を有し、腫瘍溶解性ウイルスに対して抵抗性のあるがん細胞の成長を抑制することができ、腫瘍溶解性ウイルスが増殖することができるがん細胞を死滅させることができる。したがって、がんを予防又は治療するための本発明の医薬組成物は、がんを治療するために有効に使用されうるものである。

１３種類のがん細胞株を腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）で処理し、次いで、それらの細胞生存率を観察することによって得られた結果を示すグラフである。マウス腎臓がん細胞移植マウス（ＲｅｎｃａＩ）に、腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）、遺伝子組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）及びヒドロキシウレア（ＨＵ）を投与し、次いで、マウスの腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。マウス腎臓がん細胞移植マウス（ＲｅｎｃａＩ）に、腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）、ｒｈＧ−ＣＳＦ、及びＨＵを投与し、次いで、マウスの体重を測定することによって得られた結果を示すグラフである。マウス腎臓がん細胞移植マウス（ＲｅｎｃａＩＩ）において、腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）とＨＵとの併用投与によって得られた抗がん治療効果を確認する実験スケジュールを示す概略図である。腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）及びＨＵを、マウス腎臓がん細胞移植マウス（ＲｅｎｃａＩＩ）に投与し、次いで、マウスの腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＷＲＶＶ^ｔｋ−）及びＨＵを、マウス腎臓がん細胞移植マウス（ＲｅｎｃａＩＩＩ）に全身的に投与し、次いで、マウスの腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）に投与し、次いで、マウスの腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）に投与し、次いで、１８日後に屠殺したマウスの腫瘍表面に現れた結節の数を数えることによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）に投与し、次いで、２１日間、体重の変化を測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及び高用量のＨＵを、マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）に投与し、次いで、腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及び高用量のＨＵを、マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）に投与し、次いで、生存率を測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、ヒト肺がん細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）移植マウスに投与し、次いで、１５日間、腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＣＴ−１１６）移植マウスに投与し、次いで、２８日間、腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＣＴ−１１６）移植マウスに投与し、次いで、投与の１７日後の各群のマウスの腫瘍の写真を比較することによって得られた結果を示す図である。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＣＴ−１１６）移植マウスに投与し、次いで、投与の２８日後の各群のマウスの腫瘍の写真を比較することによって得られた結果を示す図である。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＴ−２９）移植マウスに投与し、次いで、マウス腫瘍全体のＨ＆Ｅ染色を行うことによって得られた写真である。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びＨＵを、ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＴ−２９）移植マウスに投与し、次いで、腫瘍組織のＴＵＮＥＬ染色を行うことによって得られた写真である。単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）及びＨＵを、マウス腎臓がん細胞移植マウスに投与し、次いで、腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。アデノウイルス及びＨＵを、マウス腎臓がん細胞移植マウスに投与し、次いで、腫瘍の大きさを測定することによって得られた結果を示すグラフである。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明の一態様において、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、活性成分として腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを含む、医薬組成物を提供する。

医薬組成物に含有されている腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアは、同時に、逐次的に、又は逆の順序で組み合わせて投与（administered in combination；併用）してもよい。具体的には、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアは、同時に投与してもよい。また、まずヒドロキシウレアを投与し、続いて腫瘍溶解性ウイルスを投与してもよい。さらに、まず腫瘍溶解性ウイルスを投与し、続いてヒドロキシウレアを投与してもよい。また、まずヒドロキシウレアを投与し、続いて腫瘍溶解性ウイルスを投与してもよく、さらにヒドロキシウレアを再度投与してもよい。

本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」」という用語は、がん細胞を破壊する組換えウイルスであって、がん細胞でのみ特異的に増殖するようにウイルスの遺伝子を操作することによって得られた組換えウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はオルソポックスウイルス由来であってもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はアデノウイルス由来でありうる。

ワクシニアウイルスは、ウェスタンリザーブ（ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ）（ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）（ＮｅｗＹｏｒｋＣｉｔｙＢｏａｒｄｏｆＨｅａｌｔｈ；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、ティアンタン（ＴｉａｎＴａｎ）、ＵＳＳＲ、タシケント（Ｔａｓｈｋｅｎｔ）、エバンズ（Ｅｖａｎｓ）、インターナショナルヘルスディビジョン−Ｊ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＨｅａｌｔｈＤｉｖｉｓｉｏｎ−Ｊ）（ＩＨＤ−Ｊ）、又はインターナショナルヘルスディビジョン−ホワイト（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＨｅａｌｔｈＤｉｖｉｓｉｏｎ−Ｗｈｉｔｅ）（ＩＨＤ−Ｗ）ワクシニアウイルス株であってもよいが、それらだけに限定されない。

腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠損している腫瘍溶解性ウイルスであってもよい。腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失している腫瘍溶解性ウイルス、及び変異させた単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ遺伝子が挿入されている腫瘍溶解性ウイルスであってもよい。具体的には、腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ遺伝子が欠損している組換えワクシニアウイルスであってもよい。具体的には、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子が欠損している組換えワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）遺伝子が挿入されている組換えワクシニアウイルスであってもよい。具体的には、腫瘍溶解性ウイルスは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されていない組換えワクシニアウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）、及びチミジンキナーゼ遺伝子が欠損している組換えワクシニアウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）であってもよい。

また、腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠損している組換えワクシニアウイルス、及びヒトＧＭ−ＣＳＦ又はヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子が挿入されている組換えワクシニアウイルスであってもよい。

本明細書で使用される場合、「遺伝子が欠損している」という記述は、ある遺伝子が、該遺伝子の部分的又は完全な欠失又は該遺伝子への外来遺伝子の挿入によって、発現されていないことを意味する。遺伝子が部分的に欠失している場合、発現させるべきポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の幾つかのアミノ酸が欠失されうる。

本明細書で使用される場合、「チミジンキナーゼ（ＴＫ）」という用語は、ヌクレオチドの生合成に関与する酵素を指す。ＴＫは、細胞及びウイルスの両方においてヌクレオチド生合成のために使用される酵素である。この点で、細胞の場合、正常細胞はそれ以上分裂しないため、ＴＫは正常細胞には存在しない。また、毛根細胞などの急速に分裂する細胞であっても、ＴＫの量は、ウイルスが使用するのに十分ではない。これらの知見を用いて、ウイルスのＴＫ遺伝子を欠損させることによって、がん細胞にＴＫが存在する場合にのみ、ウイルスが増殖できるようにし、したがって、ウイルスががん細胞だけを選択的に殺すことができる。

本明細書で使用される場合、「ＧＭ−ＣＳＦ」という用語は、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞によって分泌されたタンパク質である、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を指す。ＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激して、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）及び単球を産生させる。また、ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージの数を急激に増加させ、これにより、免疫応答を誘発する。ＧＭ−ＣＳＦは、ヒト由来ものであってもよく、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５２５７８．１の配列を有するタンパク質であってもよい。

本明細書で使用される場合、「Ｇ−ＣＳＦ」という用語は、炎症又はエンドトキシンによって引き起こされた刺激に対してマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞などが生産したサイトカインである、顆粒球コロニー刺激因子を指す。Ｇ−ＣＳＦは、好中球の生産を促進する。Ｇ−ＣＳＦは、ヒト由来のもの（ｒｈＧＣＳＦ）であってもよく、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ０３０５６．１の配列を有するタンパク質であってもよい。

本明細書で使用される場合、「ヒドロキシウレア」という用語は、次式を有する化合物を指す。

ヒドロキシウレアは、正確な機作は解明されていないものの、ＤＮＡ合成を阻害する抗がん剤として知られている。また、ヒドロキシウレアは、ヒドロキシウレアを含有する市販医薬の形態で、医薬組成物中に含有していてもよい。ヒドロキシウレアを含有する市販医薬は、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）（登録商標）、ハイドレア（Ｈｙｄｒｅａ）（登録商標）、ドロキシア（Ｄｒｏｘｉａ）（商標）、マイロセル（Ｍｙｌｏｃｅｌ）（商標）、シクロス（Ｓｉｋｌｏｓ）（登録商標）、又はハイドリンカプセル（ＨｙｄｒｉｎｅＣａｐｓｕｌｅ）がありうるが、それらだけに限定されない。

腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与の経路及び期間に応じて様々であってもよく、当業者によって適切に選択されうる。患者は、１×１０^５〜１×１０^１８ウイルス粒子、感染ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）の腫瘍溶解性ウイルスを投与されうる。具体的には、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、又はそれより多い、ウイルス粒子、感染ウイルス単位、又はプラーク形成単位の用量で投与してもよく、その間に様々な数及び範囲が含まれていてもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５〜１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与してもよい。より好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５ｐｆｕ以上及び１×１０^９ｐｆｕ以下の用量で投与してもよい。本発明の一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５又は１×１０^７ｐｆｕで投与された。

また、ヒドロキシウレアは、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与してもよい。具体的には、ヒドロキシウレアは、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜９０ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日〜８０ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日〜７０ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日〜６０ｍｇ／ｋｇ／日、又は２０ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与してもよい。本発明の一実施形態において、ヒドロキシウレアは、２０ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、６０ｍｇ／ｋｇ／日、又は９０ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。

がんは、固形がん又は血液がんであってもよい。具体的には、固形がんは、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、及び膵臓がんからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。また、血液がんは、リンパ腫、急性白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。

本発明の医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。また、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の製剤において一般的に使用される好適な賦形剤及び希釈剤をさらに含んでいてもよい。また、本発明の医薬組成物は、従来方法による注射剤の形態で製剤化し、使用してもよい。

医薬組成物は、非経口投与のための製剤であってもよく、滅菌水溶液、非水溶媒、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬などを含んでいてもよい。非水溶媒及び懸濁剤として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注入可能なエステルなどを使用してもよい。座薬用基剤として、ウィテップゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂肪、グリセロゼラチンなどを使用してもよい。

投与経路、投与量、及び投与の頻度に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無に応じて、様々な方法及び量で対象に投与してもよく、最適な投与方法、投与量、及び投与の頻度は、当業者によって適切な範囲内で選択されうる。また、医薬組成物は、治療されるべき疾患について治療効果が既知である他の薬物又は生理学的に活性な物質と組み合わせて投与してもよく、又は他の薬物と混合された製剤の形態で製剤化してもよい。

医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、節内、又は静脈内投与を含む適切な方法などによって、非経口的に投与してもよい。好ましくは、投与は、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与でありうる。一方、医薬組成物の投与量は、投与スケジュール、用量、患者の健康状態などに応じて決定してもよい。

本発明の別の態様において、活性成分として腫瘍溶解性ウイルスを含む第１の組成物、及び活性成分としてヒドロキシウレアを含む第２の組成物を含む、がんを予防又は治療するためのキットを提供する。

腫瘍溶解性ウイルスは、医薬組成物のための上記のようなものである。

活性成分としてヒドロキシウレアを含む第２の組成物は、市販医薬であってもよい。活性成分としてヒドロキシウレアを含む市販医薬は、ヒドロキシウレア（登録商標）、ハイドレア（登録商標）、ドロキシア（商標）、マイロセル（商標）、シクロス（登録商標）、又はハイドリンカプセルであってもよい。

腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与の経路及び継続期間に応じて様々であってもよく、当業者によって適切に選択されうる。患者は、１×１０^５〜１×１０^１８ウイルス粒子、感染ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）の腫瘍溶解性ウイルスを投与されうる。具体的には、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、又はそれより多い、ウイルス粒子、感染ウイルス単位、又はプラーク形成単位の用量で投与されてもよく、その間に様々な数及び範囲が含まれていてもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５〜１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与されてもよい。より好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５ｐｆｕ以上及び１×１０^９ｐｆｕ以下の用量で投与してもよい。本発明の一実施形態において、第１の組成物は、１×１０^５又は１×１０^７ｐｆｕで投与された。

また、第２の組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与してもよい。具体的には、第２の組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜９０ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日〜８０ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日〜７０ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日〜６０ｍｇ／ｋｇ／日、又は２０ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与してもよい。本発明の一実施形態において、第２の組成物は、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、６０ｍｇ／ｋｇ／日、又は９０ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。

第１の組成物及び第２の組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。また、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の製剤において一般的に使用される好適な賦形剤及び希釈剤をさらに含んでいてもよい。また、本発明の医薬組成物は、従来方法による注射剤の形態で製剤化し、使用してもよい。

第１の組成物及び第２の組成物は、非経口投与のための製剤であってもよく、滅菌水溶液、非水溶媒、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬などを含んでいてもよい。非水溶媒及び懸濁剤として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注入可能なエステルなどを使用してもよい。座薬用基剤として、ウィテップゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂肪、グリセロゼラチンなどを使用してもよい。

投与経路、投与量、及び投与の頻度に関して、第１の組成物及び第２の組成物は、患者の状態及び副作用の有無に応じて、様々な方法及び量で対象に投与してもよく、最適な投与方法、投与量、及び投与の頻度は、当業者によって適切な範囲内で選択されうる。また、医薬組成物は、治療されるべき疾患について治療効果が既知である他の薬物又は生理学的に活性な物質と組み合わせて投与してもよく、又は他の薬物と混合された製剤の形態で製剤化してもよい。

第１の組成物及び第２の組成物は、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、節内、又は静脈内投与を含む適切な方法などによって、非経口的に投与してもよい。好ましくは、投与は、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与でありうる。一方、第１の組成物及び第２の組成物の投与量は、投与スケジュール、用量、患者の健康状態などに応じて決定してもよい。

また、第１の組成物は、２回投与してもよく、７〜３０日の間をおいて個体に投与してもよい。具体的には、第１の組成物は、７日、１４日、２１日、又は３０日の間をおいて投与してもよい。

第２の組成物は、第１の組成物の投与の後２４時間以内に投与してもよい。具体的には、第２の組成物は、第１の組成物の投与の３〜５日前から開始して、１日１回、連続的に投与してもよく、第１の組成物の投与の２４時間後から開始して、９〜２８日間、１日１回、連続的に投与してもよい。本発明の一実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の投与の１〜３日前から開始して、１日１回、連続的に投与され、第１の組成物の投与後、１３日間、１７日間、１８日間、又は２８日間、１日１回投与された。

本発明のさらに別の態様において、がんを有する個体に腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。

腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はオルソポックスウイルス由来であってもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はアデノウイルス由来でありうる。

ワクシニアウイルスは、ウェスタンリザーブ（ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（ＮｅｗＹｏｒｋＣｉｔｙＢｏａｒｄｏｆＨｅａｌｔｈ；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター、コペンハーゲン、ティアンタン、ＵＳＳＲ、タシケント、エバンズ、インターナショナルヘルスディビジョン−Ｊ（ＩＨＤ−Ｊ）、又はインターナショナルヘルスディビジョン−ホワイト（ＩＨＤ−Ｗ）ワクシニアウイルス株であってもよいが、それらだけに限定されない。

腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与の経路及び継続期間に応じて様々であってもよく、当業者によって適切に選択されうる。患者は、１×１０^５〜１×１０^１８ウイルス粒子、感染ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）の腫瘍溶解性ウイルスを投与されうる。具体的には、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、又はそれより多い、ウイルス粒子、感染ウイルス単位、又はプラーク形成単位の用量で投与してもよく、その間に様々な数及び範囲が含まれていてもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５〜１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与してもよい。より好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５ｐｆｕ以上及び１×１０^９ｐｆｕ以下の用量で投与してもよい。本発明の一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５又は１×１０^７ｐｆｕで投与された。

また、腫瘍溶解性ウイルスは、２回投与してもよく、７〜３０日の間をおいて個体に投与してもよい。具体的には、腫瘍溶解性ウイルスは、７日、１４日、２１日、又は３０日の間をおいて投与してもよい。

ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与の後２４時間以内に投与してもよい。具体的には、ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３〜５日前から開始して、１日１回、連続的に投与してもよく、腫瘍溶解性ウイルスの投与の２４時間後から開始して、９〜２８日間、１日１回、連続的に投与してもよい。本発明の一実施形態において、ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与の１〜３日前から開始して、１日１回、連続的に投与され、腫瘍溶解性ウイルスの投与後、１３日間、１７日間、１８日間、又は２８日間、１日１回、投与された。

腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアは、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、節内、又は静脈内投与を含む適切な方法などによって、非経口的に投与してもよい。好ましくは、投与は、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与であってもよい。一方、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアの投与量は、投与スケジュール、投与量、患者の健康状態などに応じて決定してもよい。

本明細書で使用される場合、「個体（individual）」という用語は、本発明の医薬組成物の投与によって軽減、抑制、又は治療されうる状態の、がんを患う又は疾患を有するヒトを指す。

本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、適切な方法で有効量の物質を個体へ導入することを指し、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアの投与は、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを標的組織に到達させる一般的な経路を介して達成されうる。

また、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアは、治療されるべき疾患について治療効果が既知である他の薬物又は生理学的に活性な物質と組み合わせて投与してもよく、又は他の薬物と混合された製剤の形態で製剤化してもよい。

本発明のさらにまた別の態様において、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを含むがんを予防又は治療するための組成物の使用を提供する。

本発明のさらにまた別の態様において、がんの予防又は治療用医薬を製造するための、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを含む組成物の使用を提供する。

以下、例により本発明を詳しく説明する。但し、下記の例は本発明を例示するためのものにすぎず、本発明はこれらに限定されるものではない。

調製例１．腫瘍溶解性ウイルスの作製
調製例１．１．シャトルプラスミドベクターの構築
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠失した腫瘍溶解性ウイルスを作製するために、野生型ワクシニアウイルスであるＮＹＣデパートメントヘルス（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈ）種（ワイス株）及びウェスタンリザーブ種をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。組換えのために、ベクターとして、ホタルルシフェラーゼレポーター（ｐ７．５プロモーター）遺伝子を有するシャトルプラスミド、ホタルルシフェラーゼレポーター及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）遺伝子を有するシャトルプラスミド、並びにＧＦＰ遺伝子を有するシャトルプラスミドを使用して、野生型ウイルスにおけるＴＫ部位の置換を行った。

調製例１．２．組換えワクシニアウイルスの作製
組換えウイルスを得るために、６ウェルプレートにＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ）を４×１０^５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ胎仔血清含有ＥＭＥＭ培地で培養した。続いて、０．０５のＭＯＩで野生型ワクシニアウイルスによる処理を行った。２時間後、培地を２％ウシ胎仔血清含有ＥＭＥＭ培地で置換し、次いで、ＸｆｅｃｔＴＭポリマー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ６３１３１７、ＵＳＡ）を使用して、調製例１．１．で構築し線状化したシャトルプラスミドベクター４μｇでトランスフェクションを行った。４時間培養した後、培地を２％ウシ胎仔血清含有ＥＭＥＭ培地で置換し、次いで、細胞をさらに７２時間培養した。最後に、感染細胞を収集し、次いで、冷凍と解凍を３回繰り返した。次いで、この細胞を超音波粉砕によって溶解し、ショ糖クッション法によって分離された組換えワクシニアウイルスを得た。これらのウイルスは、ＶＶ^ｔｋ−、ＷＲＶＶ^ｔｋ−と呼んだ。

その後、変異させたＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス得るために、ＴＫ機能を有していない細胞の選択を可能にする生化学的環境（ＴＫ−選択圧）下で、１０回連続した継代を通して、ＢｒｄＵ（チミジン類似体、１５μｇ／ｍＬ）の存在下で、ＴＫ−骨肉腫（骨肉腫１４３ＴＫ−）細胞株においてＨＳＶ１−ＴＫの変異を誘導した。変異させたワクシニアウイルスのアミノ酸シーケンシングは、Ｍａｃｒｏｇｅｎに依頼した。

結果として、変異させたワクシニアウイルスのＨＳＶ１−ＴＫのＣ末端の４６位のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）をコードするコドン（ｃａａ）が、終止コドンに点変異されていたことが確認された。また、変異させたワクシニアウイルスのＨＳＶ１−ＴＫのＣ末端の４６位の後のアミノ酸残基が欠失していたことが確認された。最終的に、遺伝的安定性が確保されている、ＨＳＶ１−ＴＫ断片を発現する変異型ワクシニアウイルス（ＯＴＳ−４１２）が得られた。

Ｉ．腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）の細胞毒性実験
実験例１．腫瘍溶解性ウイルスの殺腫瘍細胞効果の確認
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）の細胞毒性を確認するために、１０種類のヒトがん細胞株及び３種類のマウスがん細胞株において毒性を評価した。具体的には、ＨｅＬａ、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、Ｒｅｎｃａ、及びＢ１６Ｆ１０がん細胞株において毒性を評価した。ＨｅＬａ、Ａ５４９、４Ｔ１、及びＢ１６Ｆ１０細胞は、ＡＴＣＣ（ＵＳＡ）から得、残りの９種類のがん細胞株は、ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ（ＫＣＬＢ）から得た。

はじめに、各がん細胞株に、０．５のＭＯＩ（０．５ｐｆｕ／細胞）で腫瘍溶解性ウイルスを感染させ、次いで、７２時間培養した。続いて、セルカウンティングキット８（ＣＣＫ８）を使用して細胞毒性を分析した。

結果として、マウスがん細胞株である４Ｔ１、Ｒｅｎｃａ、及びＢ１６Ｆ１０がん細胞株は、８０％以上の生存率を示し、比較的高い抵抗性を示した。しかしながら、残りのがん細胞株のほとんどは、７２時間後、３０％以下の生存率を示し、高い細胞毒性を示したことが確認された（図１）。このことから、腫瘍溶解性ウイルスは、マウスがん細胞株ではほとんど増殖しないことが確認された。

さらに、異なる腫瘍溶解性ウイルス増殖能を有したヒト由来又はマウス由来がん細胞株を、それぞれマウスに移植することによって、ヒトがん細胞移植マウス（異種移植モデル）及びマウスがん細胞移植マウス（同種移植モデル）を作製して、動物実験を行った。特に、マウスがん細胞移植マウスについて、実験は、腫瘍溶解性ウイルスの増殖が制限された状況でヒドロキシウレアと組み合わせて投与された場合に、腫瘍溶解性ウイルスの抗がん効果が高まったかどうかを確認するように設計した。

ＩＩ．マウス腎臓がん細胞移植マウス：ＲｅｎｃａＩにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例２．１マウス腎臓がん細胞移植マウスの作製及び薬物投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、Ｒｅｎｃａがん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ^３〜１５０ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。一方で、ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）は、マウス腎臓がん細胞−移植マウスモデルにおいてほとんど増殖することができなかった。

上記で作製したマウス腎臓がん細胞移植マウスを４群（ｎ＝４）に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ、１×１０^７ｐｆｕ）投与群を陽性対照群として設定した。また、腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ、１×１０^７ｐｆｕ）及び組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、７５μｇ／ｋｇ）投与群、並びに腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−、１×１０^７ｐｆｕ）及びヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に投与し、１回目の投与の１５日後に２回目の投与を行った。ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ又はヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与の４日前から開始して屠殺するまで、腹腔内に投与した。

実施例２．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例２．１の各群のマウスに薬物を投与した。次いで、１６日目にマウスを屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。結果として、腫瘍溶解性ウイルス及びｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ投与群は、陰性対照群及び陽性対照群と同様の腫瘍の大きさを示したこと、並びに、腫瘍の大きさは最初の大きさと比べて１０倍以上増大したことが観察された。これに対して、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した群では、マウスの腫瘍の大きさは陰性対照群、陽性対照群、及びその他の実験群と比べて小さいかったこと、並びに、腫瘍大きさは最初の大きさと比べて約７倍増大したことが観察された（図２）。特に、腫瘍の大きさが陽性対照群と比べて小さかったという観点から、ヒドロキシウレアと腫瘍溶解性ウイルスとを組み合わせて投与した場合では、抗がん効果の増加が得られたことが確認された。

実施例２．３体重の変化の確認
マウスの体重は、投与当日に実施例２．１の対照群及び実験群に各薬物を投与する前、並びに投与の４、１０、及び１５日後に測定した。マウスの体重は、１８日目に体重から腫瘍重量を引いて算出し、腫瘍重量（ｖ）は、ｖ＝ｘ^２ｙ／２（式中、ｘ及びｙは、それぞれ最短及び最長直径である）として算出した。

結果として、陰性対照群並びに腫瘍溶解性ウイルス及びｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ投与群におけるマウスの体重は、約２０％以上減少したのに対し、実験群におけるマウスの体重は、薬物投与前の体重の８５％以上で依然として安定していた（図３）ことが確認された。

ＩＩＩ．マウス腎臓がん細胞移植マウス：ＲｅｎｃａＩＩにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例３．１．マウス腎臓がん細胞移植マウスの作製及び薬物投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、Ｒｅｎｃａがん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ^３〜１５０ｍｍ^３に到達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。一方で、ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）は、マウス腎臓がん細胞移植マウスモデルにおいてほとんど増殖することができなかった。

上記で作製したマウス腎臓がん細胞移植マウスを４群（ｎ＝１３）に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ、１×１０^７ｐｆｕ）又はヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群を陽性対照群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与する群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に１回投与し、１回目の投与の１７日後に２回目の投与を行った。ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日を除き、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３日前から開始し屠殺の前日まで、１日１回、腹腔内に投与した（図４）。

実施例３．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例３．１の各群のマウスに薬物を投与した。次いで、１７日目にマウスを屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。結果として、陰性対照群及び陽性対照群におけるマウスの腫瘍の大きさは１０〜１５倍急速に増大していたのに対し、実験群におけるマウスの腫瘍の大きさは陰性対照群及び陽性対照群のほぼ３分の１であることが確認された（図５）。このことから、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合では、腫瘍溶解性ウイルスがほとんど増殖しない腫瘍モデルですら、大幅に増加した抗がん効果が得られたことが確認された。

ＩＶ．マウス腎臓がん細胞移植マウス：ＲｅｎｃａＩＩＩにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＷＲＶＶ^ｔｋ−）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例４．１．マウス腎臓がん細胞移植マウスの作製及び薬物投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、Ｒｅｎｃａがん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ^３〜１５０ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。一方で、ウェスタンリザーブ種ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＷＲＶＶ^ｔｋ−）は、マウス腎臓がん細胞移植マウスモデルにおいて増殖することができる。

上記で作製したマウス腎臓がん細胞移植マウスを４群（ｎ＝６）に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、腫瘍溶解性ウイルス（ＷＲＶＶ^ｔｋ−、１×１０^７ｐｆｕ）又はヒドロキシウレア（６０ｍｇ／ｋｇ）投与群を陽性対照群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与する群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスは、腹腔内に１回投与した。ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日を除き、腫瘍溶解性ウイルスの投与の１日前から開始し投与の６日後まで、１日１回、腹腔内に投与した。

実施例４．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例４．１の各群のマウスに薬物を投与した。次いで、１４日間、腫瘍の大きさを測定した。結果として、陰性対照群及び陽性対照群におけるマウスの腫瘍の大きさはほぼ８〜１０倍増大していたのに対し、実験群におけるマウスの腫瘍の大きさはほぼ３倍増大していたことが確認された。このことから、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合では、腫瘍成長が著しく抑制されたことが確認された（図６）。

Ｖ．マウス乳がん細胞移植マウス：４Ｔ１Ｉにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例５．１．マウス乳がん細胞移植マウスの作製及び薬物投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、４Ｔ１がん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）２×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ^３〜１５０ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。一方で、ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）は、マウス乳がん細胞移植マウスモデルにおいてほとんど増殖することができなかった。

上記で作製したマウス乳がん細胞移植マウスを４群（ｎ＝４）に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０^７ｐｆｕ）又はヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群を陽性対照群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与する群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に１回、投与した。ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日を除き、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３日前から開始し屠殺の前日まで、１日１回、腹腔内に投与した。

実施例５．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例５．１の各群のマウスに薬物を投与した。次いで、１０日間、腫瘍の大きさを測定した。結果として、陰性対照群及び陽性対照群におけるマウスの腫瘍の大きさはほぼ５倍増大していたのに対し、実験群におけるマウスの腫瘍の大きさはほぼ３倍増大していたことが確認された（図７）。このことから、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合では、各薬物を単独で投与した場合と比べて優れた抗がん効果が得られたことが確認された。

ＶＩ．マウス乳がん細胞移植マウス：４Ｔ１ＩＩにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例６．１．マウス乳がん細胞移植マウスの作製及び薬物投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、４Ｔ１がん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）１×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ^３〜１５０ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。一方で、ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）は、乳がん細胞株移植マウスモデルにおいてほとんど増殖することができなかった。また、４Ｔ１細胞株移植マウスは、肺組織を含む体全体への転移が進行する動物モデルであり、一般的に、転移は、腫瘍表面の結節の数によって評価する。

上記で作製したマウス乳がん細胞移植マウスを４群（ｎ＝５）に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０^７ｐｆｕ）又はヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群を陽性対照群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与する群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスについては、１回目の腫瘍内投与の７日後に２回目の投与を行った。ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日を除き、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３日前から開始し屠殺の３日前まで、１日１回、腹腔内に投与した。

実施例６．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例６．１の各群のマウスに、薬物を投与した。次いで、２１日目にマウスを屠殺し、腫瘍結節の数を数えた。結果として、腫瘍溶解性ウイルスのみ投与した群のマウスでは、結節の数は、陰性対照群の結節の数より１．５倍高かった。これに対して、実験群のマウスでは、生成された結節の数は、著しく少なく２分の１であったことが確認された（図８）。このことから、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合では、他の器官への転移が抑制されたことが確認された。

実施例６．３．反復投与後の安全性の確認
実施例６．１のようにマウス乳がん細胞移植マウスモデルを作製し（ｎ＝１０）、薬物を投与した。次いで、薬物投与の７、１４、１７、及び２１日後に、マウスの体重を測定した。結果として、２週間後、すべての群においてマウスの体重が減少する傾向がみられたが、２１日目では、最も高い体重は実験群のマウスで観察された。その他の３群のマウスでも、２１日目に約１０％の体重の低下が観察された。このことから、腫瘍溶解性ウイルスを繰り返して投与し、ヒドロキシウレアと組み合わせて投与した場合であっても、安全性が確保されていたことが確認された（図９）。

ＶＩＩ．マウス乳がん細胞移植マウス：４Ｔ１ＩＩＩにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及び高用量ヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例７．１．マウス乳がん細胞移植マウスの作製及び薬物投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、４Ｔ１がん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが５０ｍｍ^３〜２００ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。一方で、ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）は、乳がん細胞株移植マウスモデルにおいてほとんど増殖することができなかった。

上記で作製したマウス乳がん細胞移植マウスを４群に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０^７ｐｆｕ）又は高用量ヒドロキシウレア（９０ｍｇ／ｋｇ）投与群を陽性対照群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスと高用量ヒドロキシウレアとを組み合わせて投与する群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に１回投与した。ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日を除き、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３日前から開始し屠殺の前日まで、１日１回、腹腔内に投与した。

実施例７．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例７．１の各群のマウスに薬物を投与した。次いで、１７日間、腫瘍の大きさを測定した。結果として、陰性対照群及び陽性対照群におけるマウスの腫瘍の大きさはほぼ３．５倍増大していたのに対し、実験群におけるマウスの腫瘍の大きさは２．５倍増大していたことが確認された。このことから、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合に、腫瘍溶解性ウイルス又はヒドロキシウレアを単独で投与した場合と比べて腫瘍成長が抑制されたことが確認された（図１０）。

また、２８日目までの各群におけるマウスの生存を調べた。結果として、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した群のマウスは、すべて２１日目に死亡し、陰性対照群では１匹のマウスが生存していた。これに対して、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した群では、マウスは最後まで生存していたことが確認された（図１１）。このことから、高用量ヒドロキシウレアと腫瘍溶解性ウイルスとの併用投与について、安全性及び抗がん効果が確証された。

ＶＩＩＩ．ヒト肺がん細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）移植マウスにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例８．１．ヒト肺がん細胞移植マウスの作製及び投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕマウスを、１間週、順化させ、次いで、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺がん細胞（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）１×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが３００ｍｍ^３〜４００ｍｍ^３に達すると、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）は、肺がん細胞株移植マウスモデルにおいて増殖することができる。

上記で作製したヒト肺がん細胞移植マウスを４群に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、ヒドロキシウレア又は腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０^５ｐｆｕ）投与群を陽性対照群として設定した。腹腔内への腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレア（２０ｍｇ／ｋｇ）投与群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスは、２回投与し、１回目の投与の５日後に２回目の投与を行った。ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日を除き、腫瘍溶解性ウイルスの１回目の投与の前日から開始し屠殺当日まで、１日１回、投与した。

実施例８．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例８．１の各群のマウスに薬物を投与した。次いで、１５日目にマウスを屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。結果として、陰性対照群及び陽性対照群におけるマウスの腫瘍の大きさは、それぞれ１１、９、及び７倍急速に増大していたことが確認された。これに対して、実験群におけるマウスの腫瘍の大きさは、２．５倍増大し、１２日目から減少し始める傾向を示したことが確認された（図１２）。このことから、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合に、腫瘍溶解性ウイルスのみ単独で投与した場合と比べて腫瘍成長が有効に抑制されたことが確認された。

ＩＸ．ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＣＴ−１１６）移植マウスにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例９．１．ヒト結腸直腸がん細胞移植マウスの作製及び投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕマウスを、１間週、順化させ、次いで、ヒト結腸直腸がん細胞株であるＨＣＴ−１１６がん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）２．５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが２０ｍｍ^３〜２５０ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。

上記で作製した結腸直腸がん細胞移植マウスを４群に分けた（ｎ＝５）。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、ヒドロキシウレア又は腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０^７ｐｆｕ）投与群を陽性対照群として設定した。腹腔内への腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ウイルスは、１回投与し、ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日を除き、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３日前から開始し屠殺当日まで、１日１回、投与した。ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２）は、結腸直腸がん細胞株移植マウスモデルにおいて増殖することができる。

実施例９．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例９．１の各群のマウスに薬物を投与した。次いで、２８日目にマウスを屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。結果として、陰性対照群及びヒドロキシウレアのみ投与した群におけるマウスの腫瘍の大きさは、急激に１１倍増大していたことが確認された。腫瘍溶解性ウイルスを単独で投与した群では、腫瘍の大きさは、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３日後から徐々に減少し、最初の腫瘍の大きさにとどまったことが確認された。これに対して、実験群では、腫瘍の大きさは、腫瘍溶解性ウイルスの投与当日から徐々に減少し、腫瘍溶解性ウイルスの投与の１４日後には最初の腫瘍の大きさと比べて減少し始め、２８日目にほぼ消失したことが確認された（図１３）。特に、実験群の２匹の動物において、２８日目に完全な寛解が観察された（図１４及び図１５）。

Ｘ．ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＴ−２９）移植マウスにおける腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例１０．１ヒト結腸直腸がん細胞（ＨＴ−２９）移植マウスの作製及び投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、ヒト結腸直腸がん細胞株であるＨＴ−２９がん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが１５０ｍｍ^３〜２００ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。

上記で作製したヒト結腸直腸がん細胞移植マウスを以下の２群分け、８週間、実験を行った：腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０^７ｐｆｕ）のみ投与する群、及びヒドロキシウレア（２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に追加的に投与する群。第１週から第４週まで、週に２回、腫瘍溶解性ウイルスを各群に投与した。第５週及び第７週では、週１回、腫瘍溶解性ウイルスを投与し、第６週及び第８週では、いずれの群にも腫瘍溶解性ウイルスは投与しなかった。ヒドロキシウレアは、第６週から第８週まで、１日１回、投与した。一方で、ワクシニアウイルス由来腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶ^ｔｋ−）は、結腸直腸がん細胞株移植マウスモデルにおいて増殖することができる。

実施例１０．２．腫瘍の大きさ及び腫瘍組織アポトーシスの確認
第８週の最終日に、各群のマウスを屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。結果として、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレア投与群では、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した群と比べて、腫瘍の大きさが減少し、腫瘍組織の状態が改善したことが確認された（図１６）。

また、ヘマトキシリン及びエオジンを使用して、採取した腫瘍組織のＨ＆Ｅ染色を行った。ここでは、濃くＨ＆Ｅ染色された部分は、生細胞を示している。結果として、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを投与した群では、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した群より、腫瘍全体の大きさは小さく、濃く染色された部分は小さく示されたことが確認された（図１６）。すなわち、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した実験群は、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した対照群と比べて優れたアポトーシス効果を示したことが確認された。

また、採取した腫瘍組織を、Ｈ＆Ｅ染色及びＴＵＮＥＬ染色を行うことによって分析した。ここでは、濃くＨ＆Ｅ染色された部分は生細胞を示し、蛍光染色では、腫瘍溶解性ウイルスは赤色蛍光を示し、死細胞は緑色蛍光を示している。

結果として、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを組み合わせて投与した群の腫瘍組織では、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した群より多くの死細胞が観察された。また、対照群では、死細胞は、染色部分に関して腫瘍溶解性ウイルスと一致しており、これは、腫瘍溶解性ウイルスによって引き起こされたがん細胞死を確認するものであった。これに対して、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを組み合わせて投与した群では、死細胞の部分は、腫瘍溶解性ウイルスの染色部分とは異なっていたことが確認された。これは、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した群では、腫瘍溶解性ウイルスが感染しなかったがん細胞でもアポトーシスが起こったことを確認するものである（図１７）。

ＸＩ．マウス腎臓がん細胞移植マウスにおける単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例１１．１マウス腎臓がん細胞（Ｒｅｎｃａ）移植マウスの作製及び投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週順化させ、次いで、マウス腎臓がん細胞株であるＲｅｎｃａがん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが５０ｍｍ^３〜２００ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。

上記で作製したマウス腎臓がん細胞移植マウスを４群に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を対照群として設定し、ヒドロキシウレア又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、１×１０^６ｐｆｕ）投与群を陽性対照群として設定した。ＨＳＶ１及びヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群を、実験群として設定した。ＨＳＶ１は、ヒドロキシウレアの投与の３日後に１回、腫瘍内に投与し、ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与後２０日間、週に６回、腹腔内に投与した。

実施例１１．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例１１．１の各群のマウスに薬物を投与した。腫瘍の大きさの変化を、薬物投与当日、並びに投与の３、７、１０、１４、及び１７日後に測定した。結果として、実験群は、腫瘍の大きさが最も小さかったことが確認された。このことから、ＨＳＶ１とヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合では、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した場合より腫瘍成長が有効に抑制されたことが確認された（図１８）。

ＸＩＩ．マウス腎臓がん細胞移植マウスにおけるアデノウイルス及びヒドロキシウレアの抗がん治療効果の確認
実施例１２．１．マウス腎臓がん細胞（Ｒｅｎｃａ）移植マウスの作製及び投与
ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）によって供給されたＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を、１間週、順化させ、次いで、マウス腎臓がん細胞株であるＲｅｎｃａがん細胞株（ＫｏｒｅａＣｅｌｌＬｉｎｅＢａｎｋ）５×１０^６細胞を同種移植した。腫瘍の大きさが５０ｍｍ^３〜２００ｍｍ^３に達するまで観察を行い、その後、腫瘍溶解性ウイルスの投与を開始した。

上記で作製したマウス腎臓がん細胞移植マウスを３群に分けた。腫瘍内への生理食塩水投与群を陰性対照群として設定し、腫瘍溶解性ウイルス（アデノウイルス、１×１０^７ｐｆｕ）のみを投与する群を陽性対照群として設定した。アデノウイルス（１×１０^７ｐｆｕ）及びヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群を、実験群として設定した。アデノウイルスは、ヒドロキシウレアの投与の３日後に１回、腫瘍内に投与し、ヒドロキシウレアは、腫瘍溶解性ウイルスの投与後１６日間、週に６回、腹腔内に投与した。

実施例１２．２．腫瘍の大きさの変化の確認
実施例１２．１の各群のマウスに薬物を投与した。腫瘍の大きさの変化を、薬物投与当日、並びに投与の３、７、１０、１４、及び１７日後に測定した。結果として、腫瘍溶解性ウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した群は、腫瘍の大きさが最も小さかったことが確認された。このことから、アデノウイルスとヒドロキシウレアとを組み合わせて投与した場合では、腫瘍溶解性ウイルスのみを投与した場合より腫瘍成長が有効に抑制されたことが確認された（図１９）。

Claims

がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、活性成分として、
腫瘍溶解性ウイルス、及び
ヒドロキシウレア
を含む、医薬組成物。
腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアが、同時に、逐次的に、又は逆の順序で組み合わせて投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はオルソポックスウイルス由来である、請求項１に記載の医薬組成物。
腫瘍溶解性ウイルスが、ワクシニアウイルス由来である、請求項１に記載の医薬組成物。
腫瘍溶解性ウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失している腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１に記載の医薬組成物。
腫瘍溶解性ウイルスが、１×１０^５ｐｆｕ〜１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
ヒドロキシウレアが、０．１ｍｇ／ｋｇ／１日〜９０ｍｇ／ｋｇ／１日の用量で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺圧、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、及びそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
がんを有する個体に、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシウレアを投与するステップを含む、がんを治療する方法。
腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はオルソポックスウイルス由来である、請求項９に記載の方法。
腫瘍溶解性ウイルスが、ワクシニアウイルス由来である、請求項９に記載の方法。
腫瘍溶解性ウイルスが、１×１０^５ｐｆｕ〜１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与される、請求項９に記載の方法。
ヒドロキシウレアが、０．１ｍｇ／ｋｇ／１日〜９０ｍｇ／ｋｇ／１日の用量で投与される、請求項９に記載の方法。
ヒドロキシウレアが、腫瘍溶解性ウイルスの投与の前、投与の間、又は投与の後に、少なくとも１回投与される、請求項９に記載の方法。
ヒドロキシウレアが、腫瘍溶解性ウイルスの投与の３〜５日前から開始して、１日１回、連続的に投与され、腫瘍溶解性ウイルスの投与の２４時間後から開始して９〜２８日間、１日１回、連続的に投与される、請求項９に記載の方法。
腫瘍溶解性ウイルスが、７〜３０日の間をおいて個体に投与される、請求項９に記載の方法。
がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺圧、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、及びそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項９に記載の方法。
腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内に投与される、請求項９に記載の方法。
がんを予防又は治療するための、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
がんの予防又は治療用医薬の製造のための、請求項１に記載の医薬組成物の使用。