CN108064155B - 用于p21基因调节的rna剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用RNA干扰来调节人p21的表达的化合物、组合物和方法。RNA干扰分子可用于预防或治疗诸如恶性肿瘤的疾病的方法。核酸分子可具有a)多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；b)所述分子的每条链的长度为15至30个核苷酸；c)所述反义链的15至30个核苷酸的连续区域与编码p21的mRNA的序列互补；以及d)所述有义链的至少一部分可以与所述反义链的至少一部分互补，并且所述分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区域。

Description

用于P21基因调节的RNA剂
技术领域
本发明涉及由基于核酸的分子构成的生物药物和治疗剂领域。更特别地，本发明涉及利用RNA干扰(RNAi)来调节人p21的表达的化合物和组合物。
序列表
本申请包括于2015年12月23日创建的命名为ND5123458WO_SL.txt的作为ASCII文件以电子方式提交的序列表，其大小为1,311,243字节，该序列表通过引用整体并入本文。
发明背景
p21是细胞周期调节蛋白，其由CDKN1A基因编码，并且属于CIP/KIP家族。该蛋白具有通过结合复合物而对细胞周期蛋白CDK复合物的作用加以抑制、从而在G1期和G2/M期抑制细胞周期进展的功能。具体来说，p21基因会被肿瘤抑制基因之一p53激活。据报道，由于DNA损伤等激活p53后，p53激活p21，使得细胞周期停滞在G1期和G2/M期。
p21在多种人类癌症中过表达，包括前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌和鳞状细胞癌，并且在许多情况下，p21上调与肿瘤级别、侵袭性和攻击性正相关。参见例如Chang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,第97卷,No.8,第4291-96页。另据报道，p21的上调与许多形式的癌症(包括脑癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和食道细胞癌)的致瘤性和不良预后相关。参见例如Winters等，Breast Cancer Research，2003，第5卷，No.6，第R242-R249页。此外，疾病可以是年龄相关疾病，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、淀粉样变性和关节炎。参见例如Chang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,第97卷，No.8，第4291-96页。
用于抑制p21表达的治疗剂将需要高效的siRNA序列和结构。
人们需要用于抑制p21表达的siRNA序列、化合物和结构。
发明内容
本发明涉及使用RNA干扰来调节人p21表达的化合物、组合物和方法。
在一些实施方案中，本发明提供了用于对p21进行RNA干扰基因沉默的分子。
在另一些实施方案中，本发明的结构、分子和组合物可用于预防或治疗与p21相关的疾病、或改善与p21相关的病症或障碍(包括恶性肿瘤)的症状的方法。
本发明的实施方案包括以下内容：
一种核酸分子，其中a)所述分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；b)所述分子的每条链的长度为15至30个核苷酸；c)所述反义链的15至30个核苷酸的连续区域与编码p21的mRNA的序列互补；和d)所述有义链的至少一部分与所述反义链的至少一部分互补，并且所述分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区域。
在一些实施方案中，所述核酸分子可具有：与编码p21的mRNA的序列互补并且位于所述分子的双链体区域中的、反义链的15至30个核苷酸的连续区域。
在另外一些实施方案中，所述核酸分子可具有：与编码p21的mRNA的序列互补、并且选自SEQ ID NO：1中的人p21 mRNA的序列的、反义链的15至30个核苷酸的连续区域。
本发明的实施方案提供了具有与编码p21的mRNA的序列互补并且选自人p21的序列的反义链的15至30个核苷酸的连续区域的核酸分子，其中所述人p21的序列选自SEQ IDNO：1的第1至125位、SEQ ID NO：1的第126至620位、以及SEQ ID NO：1的第621至2175位。
在某些实施方案中，核酸分子可具有含有选自SEQ ID NO：2033至4063的序列的反义链。在另一些实施方案中，核酸分子可具有含有选自SEQ ID NO：4092至4119的序列的反义链。
本发明的核酸分子可以由选自以下的组的有义链和反义链的对构成：SEQ ID NO：4066和4094、SEQ ID NO：4067和4095、SEQ ID NO：4068和4096、SEQ ID NO：4073和SEQ IDNO：4101、SEQ ID NO：4075和4103、SEQ ID NO：4080和4108、SEQ ID NO：4084和4112、SEQ IDNO：4085和4113、SEQ ID NO：4088和4116以及SEQ ID NO：4091和4119。
在另一些方面，本发明的核酸分子中，分子的每条链的长度可以为18至22个核苷酸。核酸分子可具有长度为19个核苷酸的双链体区域。
在某些实施方案中，核酸分子可具有作为单链连接、并且形成在一端通过环连接的双链体区域的多核苷酸有义链和多核苷酸反义链。
本发明的核酸分子可具有平末端，并且可具有一个或更多个3'悬挂。
本发明的核酸分子可以是有基因沉默活性的RNAi分子，例如有基因沉默活性的dsRNA、siRNA、微RNA或有基因沉默活性的shRNA以及DNA指导的RNA(ddRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)和重复相关siRNA(rasiRNA)。
本发明提供了对抑制p21表达有活性的一系列核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子可具有小于100pM的、针对p21敲低的IC 50。
本发明还涵盖包含一种或更多种本发明的核酸分子和可药用运载体的组合物。所述运载体可以是脂质分子或脂质体。
在另一些方面，本发明包括通过向有需要的受试者施用含有一种或更多种本发明核酸分子的组合物来治疗与p21表达相关的疾病的方法。该疾病可以是恶性肿瘤，其可以呈现为诸如与p21表达相关的癌症等疾病。
附图简述
图1：图1示出SEQ ID NO：1，其是GenBank登录号NM_000389.4(CDKN1A)中公开的示例性靶标p21 mRNA的核酸序列，其长度为2175个核苷酸。
图2：图2示出针对p21 siRNA在A549细胞中下调p21 mRNA的能力进行的测试。在转染前24小时将A549细胞以2000个/孔铺板。然后用0.1、1和10nM浓度的p21 siRNA转染细胞24小时。使用qRT-PCR(n＝3)测量p21表达水平的倍数变化。
发明详述
本发明涉及用于调节p21表达的基于核酸的治疗剂的化合物、组合物和方法。
在一些实施方案中，本发明提供了在RNA干扰中有活性的分子，以及能沉默p21表达的结构和组合物。
本公开的结构和组合物可用于预防或治疗各种疾病，例如恶性肿瘤。
在另一些实施方案中，本发明提供了用于递送和摄取本发明的一种或更多种治疗性RNAi分子的组合物及其使用方法。本发明的基于RNA的组合物可用于预防或治疗恶性肿瘤(例如癌症)的方法。
本发明的治疗组合物包括在RNA干扰中有活性的核酸分子。治疗性核酸分子可以靶向用于基因沉默的CDKN1A(p21)。
在各种实施方案中，本发明提供了可以作为小干扰RNA(siRNA)起作用并且可以调节或沉默p21表达的一系列分子。
本发明的siRNA可用于预防或治疗恶性肿瘤。
本发明的一些实施方案还提供了用于将本发明的siRNA递送至需要预防或治疗恶性肿瘤的受试者的介质、制剂或脂质纳米颗粒制剂。本发明还涉及向哺乳动物施用siRNA作为治疗剂的方法。
通过向有需要的受试者施用化合物或组合物，本发明的治疗性分子和组合物可用于针对预防或治疗p21相关疾病的RNA干扰。
本发明的方法可以利用本发明化合物来预防或治疗恶性肿瘤。恶性肿瘤可以呈现为各种疾病，例如高度表达p21的癌症、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、癌、脑肿瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、结肠直肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、白血病、恶性淋巴瘤、上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤。
在某些实施方案中，本发明的治疗性分子的组合可用于沉默或抑制p21基因表达。
本发明提供了一系列RNAi分子，其中每个分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；所述分子的每条链长度为15至30个核苷酸；反义链的15至30个核苷酸的连续区域与编码p21的mRNA的序列互补；并且所述有义链的至少一部分与所述反义链的至少一部分互补，并且所述分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区域。
本发明的RNAi分子可具有与编码p21的mRNA的序列互补的反义链的15至30个核苷酸的连续区域，所述连续区域位于分子的双链体区域。
在一些实施方案中，RNAi分子可具有与编码p21的mRNA的序列互补的反义链的15至30个核苷酸的连续区域。
本发明的一些实施方案可进一步提供用于在有需要的哺乳动物中预防、治疗或改善恶性肿瘤的一种或更多种症状、或降低发生恶性肿瘤的风险、或延缓恶性肿瘤的发作的方法。
P21和RNAi分子
p21存在于包括人在内的各种动物中。人CDKN1A(p21)的序列信息可见于：NM_000389.4、NM_078467.2、NM_001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1(NP_001207707.1、NP_001278478.1、NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1)。
图1示出在GenBank登录号NM_000389.4(CDKN1A)中公开的长度为2175个碱基对(SEQ ID NO：1)的示例性靶标人p21 mRNA的核酸序列。
本领域普通技术人员将理解，已被报道的序列可能因时间而有所变化，因此，相应地，本文所述核酸分子中需要进行的任何变化也涵盖在本发明内。
本发明的实施方案可以提供使用小核酸分子进行p21表达的基因沉默的组合物和方法。核酸分子的实例包括在RNA干扰(RNAi分子)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子以及DNA指导的RNA(ddRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)和重复相关siRNA(rasiRNA)中有活性的分子。这样的分子能够介导针对p21基因表达的RNA干扰。
本文公开的组合物和方法还可用于治疗受试者中的各种恶性肿瘤。
本发明的核酸分子和方法可用于下调编码p21的基因的表达。
本发明的组合物和方法可以包括一个或更多个核酸分子，其可以独立地或组合地对p21蛋白和/或编码p21蛋白的基因、编码与p21相关的疾病、病症或障碍(例如恶性肿瘤)的维持和/或发生相关的p21的基因和/或蛋白质的表达加以调节或调控。
参考p21的示例性序列描述本发明的组合物和方法。本领域普通技术人员将理解，本发明的各个方面和实施方案涉及任何相关的p21基因、序列或变体，例如同源基因和转录变体，以及多态性，包括与任何p21基因相关的单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法可提供下调p21基因(例如，人CDKN1A)表达的双链短干扰核酸(siRNA)分子。
本发明的RNAi分子可以靶向p21和任何同源序列，例如使用互补序列或通过并入非典型(canonical)碱基对例如错配和/或摆动(wobble)碱基对(其可提供额外的靶序列)。
在鉴定错配的情况下，可以使用非典型碱基对，例如错配和/或摆动碱基来产生靶向多于一个基因序列的核酸分子。
例如，非典型碱基对(例如UU和CC碱基对)可用于产生能够靶向共享序列同源性的不同p21靶标的序列的核酸分子。因此，RNAi分子可以靶向同源基因之间保守的核苷酸序列，单个RNAi分子可用于抑制多于一个基因的表达。
在一些方面，本发明的组合物和方法包括对p21 mRNA有活性的RNAi分子，其中RNAi分子包括与编码p21序列的任何mRNA互补的序列。
在一些实施方案中，本公开的RNAi分子可具有针对p21RNA的活性，其中RNAi分子包括与具有变体p21编码序列的RNA互补的序列，例如本领域已知的与恶性肿瘤相关的突变体p21基因。
在另一些实施方案中，本发明的RNAi分子可以包括可与p21基因的核苷酸序列相互作用并介导p21基因表达沉默的核苷酸序列。
靶向p21 mRNA的本发明的RNAi分子的实例示于表1和表2中。
表1：针对p21的RNAi分子序列
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表1备注：大写的A、G、C和U分别表示ribo-A、ribo-G、ribo-C和ribo-U。小写字母a、g、c、t分别表示2'-脱氧-A、2'-脱氧-G、2'-脱氧-C和胸苷。mU是2'-甲氧基-U。
表2：针对p21的RNAi分子序列
Figure BDA0001331958360000712
Figure BDA0001331958360000721
表2备注：大写的A、G、C和U分别表示ribo-A、ribo-G、ribo-C和ribo-U。小写字母a、g、c、t分别表示2'-脱氧-A、2'-脱氧-G、2'-脱氧-C和胸苷。mU是2'-甲氧基-U。
例如，本发明的siRNA可具有SEQ ID NO：4103的反义链和SEQ ID NO：4075的有义链，或它们的经化学修饰的链。
例如，本发明的siRNA可具有SEQ ID NO：4119的反义链和SEQ ID NO：4091的有义链，或它们的经化学修饰的链。
化学修饰可以包括在链中任何位置的任何核苷酸上的2'-OMe取代基，以及本领域已知的其它修饰。
用于调节p21和治疗恶性肿瘤的方法
本发明的实施方案可提供可用于下调或抑制p21和/或p21蛋白表达的RNAi分子。
在一些实施方案中，本发明的RNAi分子可用于下调或抑制由可能与诸如恶性肿瘤的疾病或病症相关的CDKN1A单元型多态性引起的CDKN1A和/或p21蛋白的表达。
可以使用p21蛋白或mRNA水平的监测来表征基因沉默，并确定本发明的化合物和组合物的效力。
本公开的RNAi分子可以单独使用或与其他siRNA组合用于调节一种或更多种基因的表达。
本公开的RNAi分子可以单独使用，或组合使用，或与其它已知用于预防或治疗与p21相关的疾病、或改善与p21相关的病症或障碍(包括恶性肿瘤)的症状的药物联用。
本发明的RNAi分子可用于以序列特异性方式调节或抑制p21的表达。
本公开的RNAi分子可以包括引导链，对其而言，一系列连续核苷酸与p21 mRNA至少部分互补。
在某些方面，可以使用本发明的RNAi分子通过RNA干扰治疗恶性肿瘤。
可以在合适的基于细胞的模型以及离体或体内动物模型中表征恶性肿瘤的治疗。
可以通过测定受影响组织的细胞中p21 mRNA的水平或p21蛋白的水平来表征恶性肿瘤的治疗。
可以通过对受影响的器官或组织的非侵袭性医学扫描来表征恶性肿瘤的治疗。
本发明的一些实施方案可以包括用于预防、治疗或改善有此需要的受试者中p21相关疾病或病症的症状的方法。
在一些实施方案中，用于预防、治疗或改善受试者恶性肿瘤症状的方法可包括向受试者施用本发明的RNAi分子以调节受试者或生物体中CDKN1A基因(p21)的表达。
在一些实施方案中，本发明涵盖通过使细胞或生物体与本发明的RNAi分子接触来下调细胞或生物体中CDKN1A基因(p21)的表达的方法。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中的序列特异性转录后基因沉默。参见例如Zamore等,Cell,2000,第101卷,第25-33页；Fire等,Nature,1998,第391卷,第806811页；Sharp,Genes&Development,1999,第13卷,第139-141页。
细胞中的RNAi应答可以通过双链RNA(dsRNA)来触发，虽然该机制尚未完全理解。细胞中的某些dsRNA可以经历Dicer酶、核糖核酸酶III酶的作用。参见例如Zamore等，Cell，2000，第101卷，第25-33页；Hammond等，Nature，2000，第404卷，第293-296页。Dicer可以将dsRNA加工成dsRNA的较短片段，其为siRNA。
通常，siRNA的长度可以为约21至约23个核苷酸，并且包括长度为约19个核苷酸的碱基对双链体区域。
RNAi涉及被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。siRNA具有进入RISC复合物并介导对具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA靶标加以切割的反义链或引导链。siRNA的另一条链是乘客链(passenger strand)。对靶标RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部。参见例如Elbashir等，Genes&Development，2001，第15卷，第188-200页。
本文所用术语“有义链”是指与siRNA分子的相应反义链的至少一部分部分或完全互补的siRNA分子的核苷酸序列。siRNA分子的有义链可以包括与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。
本文所用术语“反义链”是指与靶核酸序列的至少一部分部分或完全互补的siRNA分子的核苷酸序列。siRNA分子的反义链可以包括与siRNA分子的相应有义链的至少一部分互补的核酸序列。通过以序列特异性方式介导RNA干扰，RNAi分子可以下调或敲低基因表达。参见例如Zamore等,Cell,2000,第101卷,第25-33页；Elbashir等,Nature,2001,第411卷,第494-498页；Kreutzer等,WO2000/044895；Zernicka-Goetz等,WO2001/36646；Fire等,WO1999/032619；Plaetinck等,WO2000/01846；Mello等,WO2001/029058。
本文所用术语“抑制”、“下调”或“减少”相对于基因表达意为基因的表达或编码一种或更多种蛋白质的mRNA分子的水平或一种或更多种编码的蛋白质的活性降低到低于不存在本发明的RNAi分子或siRNA时观察到的活性。例如，从不存在本发明的RNAi分子或siRNA的情况下观察到的，表达水平、mRNA水平或编码的蛋白质活性水平可以降低至少1％、或至少10％、或至少20％、或至少50％、或至少90％或更多。
RNAi分子也可用于敲低病毒基因表达，由此影响病毒复制。
RNAi分子可以由分离的多核苷酸链构成：有义链或乘客链，以及，反义链或引导链。引导链和乘客链至少部分互补。引导链和乘客链可形成具有约15至约49个碱基对的双链体区域。
在一些实施方案中，siRNA的双链体区域可具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个碱基对。
在某些实施方案中，RNAi分子可以在RISC复合物中是活性的，其具有具RISC活性的双链体区域的长度。
在另外一些实施方案中，RNAi分子可以作为Dicer底物起作用，转化为可在RISC复合物中有活性的RNAi分子。
在另外一些方面，RNAi分子可以在长分子的相对端具有互补的引导序列部分和乘客序列部分，使得分子可以与互补序列部分形成双链体区域，并且链在核苷酸或非核苷酸接头的双链体区域的一端连接。例如，发夹布置、或茎和环布置。与链的接头的相互作用可以是共价键或非共价相互作用。
本公开的RNAi分子可以包括将核酸的有义区连接到核酸的反义区的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸接头。核苷酸接头可以是长度为≥2个核苷酸的接头，例如长度为约3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的接头。核苷酸接头可以是核酸适体。本文所用的“适体”或“核酸适体”是指特异性结合靶分子的核酸分子，其中核酸分子具有包含靶分子在其天然环境中识别的序列的序列。或者，适体可以是结合不天然地结合核酸的靶分子的核酸分子，。例如，适体可用于结合蛋白质的配体结合结构域，从而防止天然配体与蛋白质的相互作用。参见例如，Gold等，Annu Rev Biochem，1995，第64卷，第763-797页；Brody等，J.Biotechnol.，2000，第74卷，第5-13页；Hermann等.，Science，2000，第287卷，第820-825页。
非核苷酸接头的实例包括脱碱基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其它聚合物，例如聚乙二醇，例如具有2至100个乙二醇单元的聚乙二醇。一些实例描述于Seela等，Nucleic Acids Research，1987，第15卷，第3113-3129页；Cload等，J.Am.Chem.Soc.，1991，第113卷，第6324-6326页；Jaeschke等，Tetrahedron Lett.，1993，第34卷，第301页；Arnold等，WO1989/002439；Usman等，WO1995/006731；Dudycz等，WO1995/011910和Ferentz等，J.Am.Chem.Soc.,1991，第113卷，第4000-4002页。
RNAi分子可具有来自双链体区域的一个或更多个悬挂。作为非碱基配对的单链区域的悬挂长度可以为1至8个核苷酸，或更长。悬挂可以是3’端悬挂，其中链的3’端具有1至8个核苷酸的单链区域。悬挂可以是5'端悬挂，其中链的5'-末端具有1至8个核苷酸的单链区域。
RNAi分子的悬挂可具有相同的长度，或可以是不同的长度。
RNAi分子可具有一个或更多个平末端，其中双链体区域末端没有悬挂，所述的链与双链体区域的末端碱基配对。
本公开的RNAi分子可具有一个或更多个平末端，或者可具有一个或更多个悬挂，或者可具有平末端和悬挂的组合。
RNAi分子的链的5'-端可以是平末端，或者可以是悬挂。RNAi分子的链的3'端可以是平末端，或者可以是悬挂。
RNAi分子的链的5'端可以是平末端，而3'端为悬挂。RNAi分子的链的3'端可以是平末端，而5'-端是悬挂。
在一些实施方案中，RNAi分子的两端都是平末端。
在另一些实施方案中，RNAi分子的两端具有悬挂。
在5'和3'端的悬挂可具有不同的长度。
在某些实施方案中，RNAi分子可具有平末端，其中反义链的5'端和有义链的3'端不具有任何悬挂的核苷酸。
在另一些实施方案中，RNAi分子可具有平末端，其中反义链的3'端和有义链的5'端不具有任何悬挂的核苷酸。
RNAi分子在双链体区域的碱基配对中可能有错配。
RNAi分子悬挂的任何核苷酸均可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
一个或更多个脱氧核糖核苷酸可以在5'端，其中RNAi分子的另一条链的3'端可能不具有悬挂，或者可能不具有脱氧核糖核苷酸悬挂。
一个或更多个脱氧核糖核苷酸可以在3'端，其中RNAi分子的另一条链的5'-端可能没有悬挂，或可能不具有脱氧核糖核苷酸悬挂。
在一些实施方案中，RNAi分子的一个或更多个或全部悬挂核苷酸可以是2'-脱氧核糖核苷酸。
Dicer底物RNAi分子
在一些方面，RNAi分子可具有适合作为Dicer底物的长度，其可被加工成产生RISC活性RNAi分子。参见例如Rossi等，US2005/0244858。
作为Dicer底物的双链RNA(dsRNA)可具有足以使得其由Dicer加工成产生活性RNAi分子的长度，并且还可以包括以下特性中的一个或更多个：(i)Dicer底物RNA可以是不对称的，例如，在反义链上具有3'悬挂，和(ii)Dicer底物RNA可以在有义链上具有经修饰的3'端以指导Dicer结合的取向和dsRNA加工成活性RNAi分子。
在某些实施方案中，Dicer底物RNA中最长链的长度可以为24至30个核苷酸。
Dicer底物RNA可以是对称的或不对称的。
在一些实施方案中，Dicer底物RNA可具有22至28个核苷酸的有义链和24至30个核苷酸的反义链。
在某些实施方案中，Dicer底物RNA可在反义链的3'端具有悬挂。
在另一些实施方案中，Dicer底物RNA可具有长度为25个核苷酸的有义链和长度为27个核苷酸的反义链，具有2碱基3'悬挂。悬挂的长度可以为1、2或3个核苷酸。有义链也可具有5'磷酸根。
不对称的Dicer底物RNA可以在有义链的3'端具有两个脱氧核糖核苷酸来代替两个核糖核苷酸。
Dicer底物RNA的有义链的长度可以为约22至约30、或约22至约28、或约24至约30、或约25至约30、或约26至约30、或约26和29、或约27至约28个核苷酸。
Dicer底物RNA的有义链的长度可以为22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在某些实施方案中，Dicer底物RNA可具有长度为至少约25个核苷酸且长度不超过约30个核苷酸的有义链和反义链。
在某些实施方案中，Dicer底物RNA可具有长度为26至29个核苷酸的有义链和反义链。
在某些实施方案中，Dicer底物RNA可具有长度为27个核苷酸的有义链和反义链。
Dicer底物RNA的有义链和反义链可以与平末端长度相同，或者与悬挂长度不同，或者可具有平末端和悬挂。
Dicer底物RNA可具有长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的双链体区域。
Dicer底物RNA的反义链Dicer底物可具有在生物条件下(例如在真核细胞的细胞质内)与有义链的至少一部分序列退火的任何序列。
具有有义链和反义链的Dicer底物可以通过第三结构(例如接头基团或接头寡核苷酸)连接。接头连接dsRNA的两条链，例如使得在退火时形成发夹。
Dicer底物的有义链和反义链通常是互补的，但在碱基配对中可能错配。
在一些实施方案中，Dicer底物dsRNA可以是不对称的，使得有义链具有22至28个核苷酸，反义链具有24至30个核苷酸。
Dicer底物dsRNA的一条链，特别是反义链的区域可具有至少19个核苷酸的序列长度，其中这些核苷酸位于邻近于反义链3'端的21个核苷酸的区域并且与从靶基因产生的RNA的核苷酸序列充分互补。
Dicer底物dsRNA的反义链可以在5'端具有1至9个核糖核苷酸，得到22至28个核苷酸的长度。当反义链具有21个核苷酸的长度时，可以在3'端加入1至7个核糖核苷酸或2至5个核糖核苷酸或4个核糖核苷酸。加入的核糖核苷酸可具有任何序列。
Dicer底物dsRNA的有义链可具有24至30个核苷酸。有义链可以与反义链基本上互补，以在生物条件下与反义链退火。
RNAi分子的使用方法
本发明的核酸分子和RNAi分子可通过直接施用分子或与运载体或稀释剂组合的分子递送至细胞或组织。
本发明的核酸分子和RNAi分子可以通过直接施用分子与运载体或稀释剂或辅助、促使或促进进入细胞的任何其它递送介质来递送或施用于细胞、组织、器官或受试者，例如病毒序列、病毒物质或脂质或脂质体制剂。
本发明的核酸分子和RNAi分子可与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，或以其它方式递送至靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以通过直接皮肤施、透皮施用或注射离体或体内局部施用于相关组织。
递送系统可包括例如水性和非水性凝胶、乳膏、乳剂、微乳剂、脂质体、软膏、水性和非水性溶液、洗剂、气溶胶、烃基和粉末，并且可以含有赋形剂例如增溶剂和渗透促进剂。
本公开的组合物和方法可包括以允许核酸分子表达的方式包含编码本发明的至少一种RNAi分子的核酸序列的表达载体。
本发明的核酸分子和RNAi分子可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。可以使用提供核酸分子的瞬时表达的病毒载体。
例如，载体可以包含编码双链体的RNAi分子的两条链或者自身互补的因此形成RNAi分子的单个核酸分子的序列。表达载体可包括编码两个或更多个核酸分子的核酸序列。
核酸分子可以在细胞内由真核启动子表达。本领域技术人员认识到任何核酸均可在真核细胞中从适当的DNA/RNA载体表达。
在一些方面，病毒构建体可用于将表达构建体引入细胞，用于由表达构建体编码的dsRNA构建体的转录。
脂质制剂可以通过静脉内、肌内或腹膜内注射或口服或通过吸入或本领域已知的其它方法施用于动物。
用于施用寡核苷酸的可药用制剂是已知的并且可以使用。
实施例
实施例1：使用p21 siRNA进行体外敲低。
图2示出针对p21 siRNA在A549细胞中下调p21 mRNA的能力进行的测试。将A549细胞在转染前24小时以2000个/孔铺板。然后用0.1、1和10nM浓度的p21 siRNA转染细胞24小时。使用qRT-PCR(n＝3)测量p21表达水平的倍数变化。图2中的所有p21 siRNA在A549细胞中实现了对p21 mRNA的显著敲低。
实施例2：体外敲低的方案。
在转染前一天，用100μl含有10％FBS的DMEM(HyClone Cat.#SH30243.01)将细胞以2×103个细胞/孔于96孔板中铺板，并在空气中含有5％CO2的加湿气氛的37℃培养箱中培养。在转染前，将培养基更换为90μl含有2％FBS的Opti-MEM I还原血清培养基(LifeTechnologies Cat.#31985-070)。在室温下将0.2μl Lipofectamine RNAiMax(LifeTechnologies Cat.#13778-100)与4.8μl Opti-MEM I混合5分钟。将1μl siRNA与4μlOpti-MEM I混合，并与LF2000溶液混合，然后轻轻混匀，不进行涡旋。在室温下等待5分钟。在室温下孵育混合物10分钟，以形成RNA-RNAiMax复合物。将10μl RNA-RNAi Max复合物加入到孔中，用手轻轻摇板。将细胞在空气中含有5％CO2的加湿气氛的37℃培养箱中孵育2小时。将培养基更换为含有2％FBS的新鲜-MEM I还原血清培养基(Life Technologies Cat.#31985-070)。转染24小时后，用冰冷的PBS洗涤细胞一次。在室温下用50μl Cell-to-Ct裂解缓冲液(Life Technologies Cat.#4391851C)裂解细胞5至30分钟。加入5μl终止液，室温孵育2分钟。立即用TAQMAN通过RT-qPCR测量mRNA水平。或者，可以在-80℃冷冻样品并在其后进行测定。
用于筛选测量的阳性对照是具有SEQ ID NO：4120和4121(Ref.Pos.830)(Ambion，Austin)的有义链和反义链对的分子。
SEQ ID NO：4120
有义：TCCTAAGAGTGCTGGGCATmUmU
SEQ ID NO：4121
反义：AUGCCCAGCACUCUUAGGAmUmU。
实施例3.发现靶向p21的本发明的siRNA在体外有基因沉默活性。发现p21 siRNA对于基因敲低的剂量依赖性活性显示出低于约3皮摩尔(pM)的IC 50和低至1pM的IC 50。
在A549细胞系中进行体外转染以测定siRNA敲低效力。如表3所示，用表1的siRNA观察对于p21 mRNA的剂量依赖性敲低。
表3：A549细胞系中p21 mRNA的剂量依赖性敲低
P21 siRNA结构 IC50(pM)
1735(SEQ ID NOs:4075和4103) 0.3
2042(SEQ ID NOs:4091和4119) 10
如表3所示，表1的p21 siRNA的活性在0.3至10pM范围内，其适用于许多用途，包括作为体内使用的药剂。
本文描述的实施方案不是限制性的，并且本领域技术人员可以容易地理解，可以不进行过度实验而测试本文所述修饰的特定组合以鉴定具有改进的RNAi活性的核酸分子。
出于所有目的，本文特别提及的所有出版物、专利和文献通过引用整体并入本文。
应当理解，本发明不限于所述特定方法、方案、材料和试剂，因为它们可能变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本说明书的范围和宗旨的情况下，可以对本文所公开的描述进行各种替换和修改，并且这些实施方案在本说明书和所附权利要求的范围内。
必须指出，本文和所附权利要求中所使用的单数形式包括复数指称，上下文另有明确说明除外。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一个或更多个(一种或更多种)”和“至少一个/种”在本文可以互换使用。另外要注意，术语“包括”、“包含”、“含有”、“含”和“具有”可以互换使用，并且应该被广义、无限制地解释。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的记载仅仅意在作为对单独提到落入该范围的每个单独的值的速记法，每个单独的值均被并入说明书中，如同它们被单独记载于本文中一样。对于马库什组，本领域技术人员将认识到，该描述包括个体成员以及马库什组成员的亚组。
即使没有进一步的阐述，本领域技术人员亦可基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，所附的具体实施方案应被解释为仅是说明性的，而不是以任何方式限制本公开的其余部分。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合而联用。本说明书中公开的每个特征可以由服务于相同、等同或相似目的的替代特征来代替。

Claims (4)

1.一种核酸分子，其中：
所述分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；
所述反义链是SEQ ID NO：4103，所述有义链是SEQ ID NO：4075，或是它们的任何位置的任何核苷酸经2'-OMe取代的链。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述多核苷酸有义链和所述多核苷酸反义链以单链连接，并形成在一端通过环连接的双链体区域。
3.一种组合物，其包含权利要求1或2所述的一种或更多种核酸分子和可药用运载体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述运载体是脂质分子或脂质体。
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