CN112739382A

CN112739382A - 使用了hsp47的抑制物质的化疗剂敏感性的增强

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Publication number: CN112739382A
Application number: CN201980061932.8A
Authority: CN
Inventors: 米田明弘; 田村保明; 武井则雄; 泽田香织
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2021-04-30
Also published as: US20210260095A1; JP7453145B2; EP3848050A4; JPWO2020040185A1; WO2020040185A1; EP3848050A1

Abstract

本说明书提供一种用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的包含HSP47的抑制物质的药物。

Description

使用了HSP47的抑制物质的化疗剂敏感性的增强

技术领域

本发明涉及用于增强癌患者的化疗剂敏感性的药物及其方法。

背景技术

对癌的治疗方法存在外科治疗、放射治疗、粒子束治疗、化疗和分子靶向治疗等。其中，基于化疗剂的治疗在癌治疗中有重要的定位，但癌中存在对化疗剂具有耐性的情况，另外还存在若大量地给药化疗剂则产生副作用的情况。

在癌治疗中，也进行将具有不同优点的1种以上的化疗剂组合给药的并用疗法。在癌的并用疗法中，例如使用顺铂和5-氟尿嘧啶等。但是，仍然存在大量难以通过化疗剂进行治疗的癌，需要新的治疗方法。

专利文献1中记载了使用靶向HSP47的分子来治疗恶性肿瘤的方法，但未记载靶向HSP47的分子能够增强癌患者的化疗剂敏感性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2017/0218365号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于增强癌患者的化疗剂敏感性。

用于解决课题的手段

本发明者们为了解决上述课题进行了深入研究，其中发现，在给药靶向HSP47的分子和顺铂或5-氟尿嘧啶的情况下，与单独给药靶向HSP47的分子的情况相比，或者与单独给药顺铂或5-氟尿嘧啶的情况相比，能够显著抑制各种癌细胞的增殖，即靶向HSP47的分子能够增强癌患者的化疗剂敏感性，从而完成了本发明。具有DNA合成抑制、DNA损伤等作用的化疗剂能够诱导内质网应激而诱导细胞死亡。可预想HSP47的抑制物质抑制由HSP47引起的内质网应激缓和效果，使细胞内的内质网应激增大。

即，本发明涉及以下方案。

(1)一种用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的药物，其包含HSP47的抑制物质。

(2)根据(1)所述的药物，其中，HSP47的抑制物质是针对HSP47的干扰核酸、核酶、反义核酸、微小RNA、短链发夹RNA、表达它们的载体、或由它们转化的细胞。

(3)根据(2)所述的药物，其中，针对HSP47的干扰核酸为siNA或siRNA。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的药物，其中，癌患者是乳腺癌、大肠癌、结肠癌或胰腺癌的患者。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的药物，其中，化疗剂为烷化剂、代谢拮抗剂、抗肿瘤性抗生素、生物碱、激素疗法剂、铂络合物、血管新生抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、或微管作用剂。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的药物，其中，化疗剂为顺铂(CDDP)或5-氟尿嘧啶(5-FU)。

(7)一种用于治疗癌的药物，其包含HSP47的抑制物质和化疗剂。

(8)HSP47的抑制物质在制造用于治疗癌的药物中的用途，其中，所述治疗是将化疗剂与HSP47的抑制物质并用给药的治疗。

(9)一种用于癌治疗中的用途的组合物，其包含HSP47的抑制物质，所述治疗是将化疗剂与HSP47的抑制物质并用给药的治疗。

(10)一种用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的方法，其特征在于，对癌患者给药有效量的HSP47的抑制物质。

(11)根据(10)所述的方法，其还包含对需要利用包含HSP47的抑制物质的药物进行处置的患者进行鉴定的工序。

(12)根据(11)所述的方法，其中，所述工序是对从癌患者分离的肿瘤组织中的HSP47表达进行定量的工序。

(13)一种癌的治疗方法，其特征在于，对癌患者给药有效量的HSP47的抑制物质和化疗剂。

(14)一种在体外对癌细胞进行处置的方法，其包含使用有效量的HSP47的抑制物质和化疗剂在体外对癌患者来源的癌细胞进行处置。

发明效果

本发明的药物通过抑制癌细胞中的HSP47的表达(包含HSP47 mRNA和蛋白这两者或任一个的表达)，能够增强各种癌患者的化疗剂敏感性。

通过本发明的并用疗法，能够有效地抑制各种癌细胞的增殖，对癌进行处置或治疗。

根据本发明，在癌治疗中，能够大幅降低化疗剂的给药量，能够在降低由化疗剂引起的副作用风险的同时进行抗癌治疗。

附图说明

图1表示对沉默了HSP47的人癌细胞进行顺铂(CDDP)处理后的人癌细胞的存活率。对MIA-PaCa-2细胞和MDA-MB-231细胞转染对照siRNA(siControl、10nM)和3个批次(A、B和C)中的任一个HSP47 siRNA(siHSP47、10nM)，培养48小时。从siRNA转染开始48小时后，用0、1、5、10、20或50μM浓度的顺铂(CDDP)对细胞进行处理，培养24小时。在用CDDP处理24小时后，通过色素排除法(Dye-exclusion assay)确定细胞的存活率。纵轴表示细胞存活率(％)，横轴表示顺铂的浓度(μM)。

图2表示用CDDP处理后的HSP47敲除人癌细胞的存活率。用0、1、5、10、20或50μM浓度的顺铂(CDDP)对人癌细胞(Mock)和HSP47敲除(KO)癌细胞进行处理。在用CDDP处理24小时后，通过色素排除法确定细胞的存活率。纵轴表示细胞存活率(％)，横轴表示顺铂的浓度(μM)。

图3表示用5-FU处理后的HSP47敲除人癌细胞的存活率。用0、1、5、10、20或50μM浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)对人癌细胞(Mock)和HSP47敲除(KO)癌细胞进行处理。在用5-FU处理24小时后，通过色素排除法确定细胞的存活率。纵轴表示细胞存活率(％)，横轴表示5-氟尿嘧啶的浓度(μM)。

具体实施方式

在本说明书中，提供一种用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的包含HSP47的抑制物质的药物、使用该药物的方法和试剂盒、以及包含给药HSP47的抑制物质的用于增强对化疗剂的敏感性的方法(以下有时称为化疗剂敏感性增强方法)、包含给药HSP47的抑制物质和化疗剂的癌的治疗方法(以下有时称为并用疗法)。

本发明的药物、方法及试剂盒的特征在于，使用与HSP47的转录体RNA(包含pre-mRNA及mRNA)、例如序列号1所例示的HSP47的转录体RNA结合的核酸分子(例如短链干扰核酸(siNA)、短链干扰RNA(siRNA)、双链(double-stranded)RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短链发夹RNA(shRNA))，或者使用基因组编辑技术敲除HSP47基因，例如使用利用HSP47基因组特异性的单链引导RNA(sgRNA、gRNA)(例如序列号8)的CRISPR-Cas9。

另外，本发明的药物、方法及试剂盒的特征还可以在于，除了使用上述的与HSP47的转录体RNA结合的核酸分子(例如短链干扰核酸(siNA)、短链干扰RNA(siRNA)、双链(double-stranded)RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短链发夹RNA(shRNA))、或者使用基因组编辑技术敲除HSP47基因、例如使用除了利用HSP47基因组特异性的单链引导RNA(sgRNA、gRNA)(例如序列号8)的CRISPR-Cas9以外，还可以并用化疗剂。

1.本发明的药物

本发明的一个方面涉及一种用于增强癌患者的化疗剂敏感性的药物，其包含HSP47的抑制物质，例如包含HSP47的表达的抑制剂。

HSP47基因的碱基序列和氨基酸序列在本技术领域中是公知的，在本发明中，HSP47的mRNA序列由序列号1表示。

在本发明中，HSP47的转录体RNA例如可以是来源于人、且由序列号1所示的碱基序列或在该各碱基序列中包含1个或多个核苷酸的缺失、替换、附加或插入的碱基序列、或者与上述的各碱基序列具有70％以上、80％以上或90％以上、优选95％以上、进一步优选98％以上或99％以上的序列同源性的碱基序列。

在本说明书中，“多个”是指2～10个、优选2～5个、更优选2～3个碱基数。另外，序列同源性可以使用例如BLAST等公知的算法来确定。

在本发明中，HSP47的表达的抑制剂可以是抑制HSP47的表达的成分、或抑制HSP47蛋白的功能的成分，例如包含具有RNA干扰(RNAi)作用的、siRNA(例如包含正义链的siHSP47-A：5’-CUACGACGACGAGAAGGAAtt-3’(序列号2)或siHSP47-B：5’-AGCCCUCUUCUGACACUAAtt-3’(序列号4)或siHSP47-C：5’-GGACAGGCCUCUACAACUAtt-3’(序列号6)、或者包含反义链的siHSP47-A：5’-UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta-3’(序列号3)或siHSP47-B：5’-UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg-3’(序列号5)或siHSP47-C：5’-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt-3’(序列号7))或其前体RNA(例如shRNA)、或它们的修饰RNA、或者编码针对HSP47基因的转录体RNA的siRNA的DNA的载体。另外，在本发明中，HSP47的表达的抑制剂例如可以是siNA、核酶、shRNA、miRNA等。载体可以包含反义RNA或反义DNA、编码该反义RNA的DNA或该反义DNA。在本发明中，载体例如优选包含5’-CCGACTGTACGGACCCAGCTCAG-3’(序列号8)的序列，包含该序列号8的序列的载体优选还包含Cas9序列(序列号9)。

在本发明中，siRNA可以是具有包含与HSP47基因的转录体RNA的一部分实质上互补的18～25个核苷酸、优选20～24个核苷酸、进一步优选21～23个核苷酸的反义RNA、且具有RNAi(RNA干扰)作用的由正义RNA和反义RNA构成的双链RNA。

在本发明中，“互补”是指核酸可以通过经典的Watson-Crick型或其他非经典的类型与其他核酸序列形成氢键。

另外，在本发明中，“实质上互补”不仅包括核酸序列的全部连续的残基与其他核酸序列中的相同数量的连续的残基形成氢键的情况，还包括核酸序列的全部残基中的例如70％、80％和90％的残基与其他核酸序列的残基形成氢键的情况。

因此，在本发明中，siRNA可以具有包含由与HSP47基因的转录体RNA的一部分100％互补的核苷酸进行了多个碱基变更的核苷酸的反义RNA。

另外，在本发明中，在正义RNA和反义RNA各自的3’末端可以具有2～5个核苷酸、优选2个核苷酸的突出末端。另外，在本发明中，siRNA也可以是修饰siRNA。

在本发明中，HSP47的抑制物质例如可以是包含正义链和反义链的siRNA的组合，例如优选以下的组合。

正义链的5’-CUACGACGACGAGAAGGAAtt-3’(序列号2)与反义链的5’-UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta-3’(序列号3)的组合(siHSP47-A)(Ambion)

正义链的5’-AGCCCUCUUCUGACACUAAtt-3’(序列号4)与反义链的5’-UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg-3’(序列号5)的组合(siHSP47-B)(Ambion)

正义链的5’-GGACAGGCCUCUACAACUAtt-3’(序列号6)与反义链的5’-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt-3’(序列号7)的组合(siHSP47-C)(日东电工株式会社制成)

对于HSP47的抑制物质向细胞的导入，可以使用任意已知的导入方法，例如，没有限定，可以使用Lipofectamine法、脂转染法、磷酸钙法、超声波导入法、电穿孔法、粒子枪法、利用病毒载体(例如腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体等)的方法、或微注射法等。

在使用病毒载体的情况下，作为病毒的滴度，可以以1×10³～1×10¹⁵p.f.u.(斑块形成单位)，优选1×10⁵～1×10¹³，更优选1×10⁷～1×10¹¹，进一步优选1×10⁸～1×10¹⁰使用。

上述核酸分子可以作为裸核酸使用，也可以组装在各种核酸构建物或载体中使用。作为载体，可以利用质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、病毒载体等公知的任意载体。核酸构建体或载体优选至少包含例如由哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因诱导的适当的转录或翻译控制序列。该控制序列包含基因表达中具有调节作用的序列，例如转录启动子或增强子、用于调节转录的操纵序列、编码信使RNA内部的核糖结合部位的序列、以及调节转录、翻译开始或转录结束的适当的序列。

本发明的药物由于包含上述的HSP47的抑制物质，因此能够增强癌患者的化疗剂敏感性，作为药物的有效成分是有用的。本发明的药物除了HSP47的抑制物质以外，还可以含有化疗剂。本发明的药物可以包含上述的HSP47的抑制物质、和1种或2种以上的药学上可容许的表面活性剂、载体、稀释剂和/或赋形剂。药学上可容许的载体、稀释剂等在医药领域是熟知的，例如记载于Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA(1990)等，将其整体援引于本说明书。

上述药物依赖于其构成要素，例如可以用于对化疗剂的敏感性的增强，更详细而言，可以用于伴随对化疗剂的敏感性的增强而进行的癌治疗。

并用HSP47的抑制物质时，对化疗剂的敏感性是否增加通过在与不使用HSP47的抑制物质而将癌细胞的存活率诱导至50％所需的化疗剂的浓度进行比较时，是否能够以更低的浓度诱导50％存活率来进行判断。在将不使用HSP47的抑制物质而将癌细胞的存活率诱导至50％所需的化疗剂的浓度的相对值设为100时，当化疗剂浓度的相对值小于100时可以说敏感性增加，当小于50时可以说显著增加。当化疗剂浓度的相对值小于50时，能够在降低由化疗剂引起的副作用的风险的同时进行抗癌治疗。

癌细胞的存活率在将使用HSP47的抑制物质或化疗剂处理前的癌细胞的数量记为100％时，以存活的癌细胞的数量的相对值(％)表示，可以通过色素排除法(Dye-exclusionassay)进行测定。色素排除法(Dye-exclusion assay)例如可以根据有无台盼蓝染色来判断细胞的生死，测定存活细胞数。利用台盼蓝染色的色素排除法例如可以通过以下方式来进行：将0.4％台盼蓝溶液(销售商：富士胶片和光纯药株式会社、商品代码：20717081)、和使细胞悬浮在培养用培养基而得到的细胞悬浮液等量混合，在血细胞计数盘上对染色后的细胞和未染色的细胞的数量进行计数。

作为本发明的对象的癌，只要表达HSP47的转录体RNA就没有限定，例如可举出纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤等肉瘤、脑肿瘤、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌等、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌、皮肤癌等癌瘤、以及白血病、恶性淋巴瘤等。其中优选固体癌，更优选乳腺癌、大肠癌、结肠癌、肺癌、及胰腺癌。

癌细胞是否表达HSP47可通过基因水平检测HSP47的转录体RNA的表达来判断。具体而言，就基因水平而言，例如可以通过Northern Blotting(免疫印迹)法、RNase保护试验、RT-PCR、实时PCR等PCR法、原位杂交法、体外转录法等任意公知的基因表达分析法进行检测，优选通过实时PCR进行检测。另外，癌细胞是否表达HSP47还可以通过蛋白水平检测HSP47的表达来判断。具体而言，例如可以通过免疫沉降法、EIA(enzyme immunoassay，酶免疫分析法)(例如ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫分析法)等)、RIA(radio immuno assay，放射免疫分析法)(例如IRMA(immunoradiometric assay，免疫放射测定法)、RAST(radioallergosorbent test，放射过敏原吸附试验)、RIST(radioimmunosorbent test，放射免疫吸附试验)等)、Western Blotting(蛋白印迹)法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、流式细胞法进行检测。HSP47的转录体RNA在癌细胞中表达，但在正常细胞、通常除了成纤维细胞、肌成纤维细胞以外，实质上没有表达。在本发明中，癌细胞表达HSP47蛋白。

在本发明的1个方式中，本发明的药物包含用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的HSP47的抑制物质。在本发明的另一方式中，本发明的药物还可以进一步包含对处置作为对象的疾病有用的其他化疗剂。

作为化疗剂，优选细胞透过性抗癌剂等用于癌治疗的化疗剂，作为细胞透过性抗癌剂，没有限定，可举出具有杀细胞作用或增殖抑制作用等细胞抑制作用的化疗剂，例如烷化剂、代谢拮抗剂(例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨)、抗肿瘤性抗生素、生物碱、激素疗法剂、铂络合物(例如顺铂)、血管新生抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、以及微管作用药等。其中，烷化剂、代谢拮抗剂、抗肿瘤性抗生素、铂金属或拓扑异构酶是能够诱导DNA合成抑制或DNA损伤、并诱导内质网应激的化疗剂，从特别增强由化疗剂带来的抗癌作用的角度出发，优选与HSP47的抑制物质并用。在本发明的药物中，最优选HSP47的抑制物质与顺铂或5-氟尿嘧啶的组合。将它们组合给药时，HSP47的抑制物质的优选浓度的最终浓度为1nM～100nM，顺铂和5-氟尿嘧啶的优选浓度为5μM～100μM。

在本发明的药物中，在将HSP47的抑制物质与化疗剂组合使用的情况下，可以将它们包含在单一的组合物中，也可以分别包含在多个组合物中、将它们分别使用，也可以组合使用。

在本发明的各种方式中，上述药物也可以担载于各种药物递送载体来使用。作为该载体，没有限定，例如可举出聚合物纳米粒子、聚合物胶束、树枝状聚合物、脂质体、病毒纳米粒子、碳纳米管等(参见Cho K.et al.,Clin Cancer Res.2008Mar 1；14(5)：1310-6等)。

本发明的药物可以通过包含经口和非经口这两者的各种途径，例如，不是进行限定，经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、直肠、肿瘤内、动脉内、门静脉内、骨髓内、牙髓内、舌下、口腔内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺内及子宫内等途径给药，也可以制成适于各给药途径的剂型。该剂型及制剂方法可以适当采用任意的公知方法(例如参见《標準薬剤学》、渡辺喜照ら編、南江堂、2003年，上述Remington's Pharmaceutical Sciences等)。

例如，作为适于经口给药的剂型，不是进行限定，可举出散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外作为适于非经口给药的剂型，可举出溶液性注射剂、悬浮性注射剂、乳浊性注射剂、用时制备型注射剂等注射剂。非经口给药用制剂可以是水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态。

2.本发明的试剂盒

本发明还涉及包含单独或组合包含本发明的药物中可含有的活性成分(例如HSP47的抑制物质)和根据需要的化疗剂的1个或2个以上容器的组合物的制备试剂盒、以及以这种试剂盒的形式提供的药物的必要构成要素。本发明的试剂盒除了上述以外，还可以包含记载有本发明的药物的制备方法、给药方法等的说明，例如说明书、CD、DVD等电子记录介质等。

3.本发明的方法

本发明的一个方式涉及一种用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的方法(化疗剂敏感性增强方法)，其特征在于，给药HSP47的抑制物质。

本发明的另一方式涉及一种癌的治疗方法(并用疗法)，其特征在于，给药HSP47的抑制物质和化疗剂。

在本发明的方法中，被给药的患者典型的是需要利用化疗剂进行治疗的癌患者。作为这样的患者，没有限定，例如是患有与上述的HSP47的高表达相关的癌、或被诊断具有这些癌、或发生这些癌的风险高的患者。因此，本发明的方法还可以包含鉴定需要利用本发明的包含HSP47的抑制物质的药物进行处置的患者的工序。上述工序例如是对从癌患者分离的肿瘤组织中的HSP47的mRNA或蛋白的表达进行定量的工序。癌的具体例如上文涉及药物时所述的。

在本发明的方法中，也可以将本发明的药物与对处置作为对象的癌有用的其他作用物质或处置方法并用。本发明的方法中，作为处置方法，可以与放射治疗等物理疗法、外科手术等外科治疗等并用。在通过外科治疗治疗癌患者的情况下，可以在本发明的术前化学疗法和术后化学疗法中的任一方或双方中应用。

本发明的治疗或处置方法中的有效量是指例如使疾病的症状降低、或者使疾病的进展延缓或停止的量，优选抑制疾病、或治愈疾病的量。另外，优选不会产生超过给药所带来的益处的不良影响的量。所述量可以通过使用了培养细胞等的体外试验、在小鼠、大鼠、狗或猪等模型动物中的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术人员熟知的。另外，本发明的处置方法中使用的药物的用量可以是本领域技术人员公知的、或者可以是通过上述试验等适当确定的。在本发明中，顺铂和5-氟尿嘧啶等化疗剂的优选浓度为5μM～100μM。

在本说明书所记载的本发明的方法中给药的活性成分(例如HSP47的抑制物质)的具体用量可以考虑与需要处置的对象相关的各种条件、例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给药的时期及频率、并用的医药、对治疗的反应性、剂型、以及对治疗的依从性等来确定。本发明的方法中使用的活性成分的用量优选在人的情况下为每1次、且成人每1kg体重以换算为siRNA分子计例如为0.1mg～1,000mg。本发明的处置方法中使用的药物的浓度优选在siRNA的情况下为5nM～180μM。

作为给药途径，包括包含经口和非经口这两者的各种途径，例如经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肿瘤内、直肠、动脉内、门静脉内、骨髓内、牙髓内、舌下、口腔内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺内及子宫内等途径。

给药频率根据所使用的药剂或组合物的性状、包括上述在内的对象的条件的不同而不同，例如可以为1天多次(即1天2、3、4次或5次以上)、1天1次、每几天(即每2、3、4、5、6、7天等)、每1周、每几周(即每2、3、4周等)。

在本发明的并用疗法中，可以将HSP47的抑制物质和化疗剂分别给药，也可以同时给药，在分别给药的情况下，优选先给药HSP47的抑制物质。在HSP47的抑制物质给药后给药化疗剂的情况下，化疗剂的给药优选为HSP47的抑制物质的给药的1小时～70小时后，更优选为2小时后～60小时后，特别优选为4小时后～50小时后。从HSP47的抑制物质的给药起，若在4小时后～50小时后给药化疗剂，则能够在充分地发挥HSP47的蛋白的表达降低的状态下利用化疗剂进行癌治疗，因此能够显著降低癌细胞的存活率。

在本说明书中使用的情况下，用语“患者”是指任意的生物个体，例如为动物、哺乳动物或人个体。在本发明中，“患者”典型地是指需要利用化疗剂进行治疗的癌患者。

另外，用语“处置”在本说明书中使用的情况下，包含以疾病的治愈、暂时缓解或预防等为目的的医学上可容许的全部种类的预防和/或治疗性介入。例如，“处置”这一用语包含包括疾病进展的延缓或停止、病变的退缩或消失、发病的预防或复发的防止等在内的各种目的的医学上可容许的介入。

这次本发明人发现，本发明的药物通过抑制HSP47的转录体RNA(序列号1)的表达，能够在乳腺癌、大肠癌、结肠癌、或胰腺癌的细胞株中增强对化疗剂的敏感性，其结果可进行癌的并用疗法。

另外，根据本发明，在癌治疗中，能够大幅降低化疗剂的给药量，能够在降低由化疗剂引起的副作用风险的同时进行抗癌治疗。

因此，本发明还涉及包含HSP47的抑制物质的用于提供上述作用的医药、在用于提供上述作用的药物的制造中的用途、以及HSP47的抑制物质的用于提供上述作用的用途。

实施例

通过下述的实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不限定于这些实施例。

例1：细胞株的获得和培养

本申请说明书中使用的全部人癌细胞株(MDA-MB-231、HCT116、SW480、PANC-1、Suit2和MIA-PaCa-2)购自American Type Culture Collection。将MDA-MB-231细胞、HCT116细胞、SW480细胞、Suit2细胞和MIA-PaCa-2细胞用补充了10％胎牛血清(FBS,Invitrogen Life Technologies)的Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)培养。PANC-1细胞用补充了10％FBS的RPMI1640培养基培养。

例2：siRNA的转染

使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen Life Technologies)用对照siRNA(siControl,Ambion,Foster City,CA)、HSP47-A siRNA(siHSP47-A,正义链:5’-CUACGACGACGAGAAGGAAtt-3’(序列号2)；反义链：5’-UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta-3’(序列号3))、HSP47-B siRNA(siHSP47-B,正义链:5’-AGCCCUCUUCUGACACUAAtt-3’(序列号4)；反义链：5’-UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg-3’(序列号5))或HSP47-C siRNA(siHSP47-C，正义链：5’-GGACAGGCCUCUACAACUAtt-3’(序列号6)；反义链：5’-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt-3’(序列号7))转染癌细胞，在大气中37℃下培养5小时。用siRNA转染5小时后，用补充了10％FBS的DMEM培养细胞。

例3：HSP47^-/-细胞的建立

pCG SapI载体(由信州大学研究生院医学系研究科樱井博士转让)包含用于插入Cas9序列(序列号9)和目标gRNA序列(序列号8)的克隆部位(Uemura et al.,SciRep.2016Oct 26；35861,Takei et al.,Sci.Rep.2017Aug 24 7(1)；9389)。将针对人HSP47基因组的外显子2特异性地设计的gRNA序列(5’-CCGACTGTACGGACCCAGCTCAG-3’(序列号8))插入到pCG SapI载体中。将构建的靶向载体及pcDNA3.1(+)使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)共转染给癌细胞(SW480、HCT116、PANC1、Suit2、MIA-PaCa-2、MDA-MB-231)。使用用10％FBS和G418(1000μg/mL)补充了的DMEM培养基培养细胞，选择稳定地使HSP47沉默的细胞株。通过DNA测序分析，评价单个细胞克隆，检测目标等位基因中的Indel(插入/缺失)。另外，通过Western Blotting法确认所选择的克隆中的HSP47蛋白的表达水平。对照细胞克隆(mock)通过转染空载体而制成。

例4：用抗癌剂处理后的细胞的存活率

将例2、3中转染的癌细胞用1、5、10、20、50μM浓度的顺式-二胺二氯铂(II)(CDDP，Sigma-Aldrich)、或1、5、10、20、50μM浓度的5-氟尿嘧啶(Wako Pure Chemical，Tokyo，Japan)处理24小时。处理后的细胞的存活率通过色素排除法(Dye-exclusion assay)确定。

将结果示于图1～3。全部数据以平均±标准偏差表示。组间的差异使用Student t检验或方差分析(ANOVA)对统计学上的显著性进行试验。统计学上的显著性由P＜0.05确定。

示出了本发明的药物通过抑制HSP47的表达而增强乳腺癌、大肠癌、结肠癌、胰的腺癌(Pancreatic adenocarcinoma)、或胰腺癌(Pancreatic cancer)等各种癌细胞的化疗剂敏感性。

在图1中，当将不使用HSP47的抑制物质的(siControl的组)时的将癌细胞的存活率诱导为50％所需的化疗剂的浓度相对值记为100时，在使用了HSP47的抑制物质的情况下(siHSP47-A、siHSP47-B、siHSP47-C)，化疗法相对值均小于50，敏感性显著增加。

序列表

<110> 日东电工株式会社

<120> 使用了HSP47的抑制物质的化疗剂敏感性的增强

<130> PCT2954ND

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2208

<212> RNA

<213> 人类

<400> 1

ucuuuggcuu uuuuuggcgg agcuggggcg cccuccggaa gcguuuccaa cuuuccagaa 60

guuucucggg acgggcagga gggggugggg acugccauau auagaucccg ggagcagggg 120

agcgggcuaa gaguagaauc gugucgcggc ucgagagcga gagucacguc ccggcgcuag 180

cccagcccga cccaggccca ccguggugca cgcaaaccac uuccuggcca ugcgcucccu 240

ccugcuucuc agcgccuucu gccuccugga ggcggcccug gccgccgagg ugaagaaacc 300

ugcagccgca gcagcuccug gcacugcgga gaaguugagc cccaaggcgg ccacgcuugc 360

cgagcgcagc gccggccugg ccuucagcuu guaccaggcc auggccaagg accaggcagu 420

ggagaacauc cuggugucac ccgugguggu ggccucgucg cuagggcucg ugucgcuggg 480

cggcaaggcg accacggcgu cgcaggccaa ggcagugcug agcgccgagc agcugcgcga 540

cgaggaggug cacgccggcc ugggcgagcu gcugcgcuca cucagcaacu ccacggcgcg 600

caacgugacc uggaagcugg gcagccgacu guacggaccc agcucaguga gcuucgcuga 660

ugacuucgug cgcagcagca agcagcacua caacugcgag cacuccaaga ucaacuuccg 720

cgacaagcgc agcgcgcugc aguccaucaa cgagugggcc gcgcagacca ccgacggcaa 780

gcugcccgag gucaccaagg acguggagcg cacggacggc gcccugcuag ucaacgccau 840

guucuucaag ccacacuggg augagaaauu ccaccacaag augguggaca accguggcuu 900

cauggugacu cgguccuaua ccgugggugu caugaugaug caccggacag gccucuacaa 960

cuacuacgac gacgagaagg aaaagcugca aaucguggag augccccugg cccacaagcu 1020

cuccagccuc aucauccuca ugccccauca cguggagccu cucgagcgcc uugaaaagcu 1080

gcuaaccaaa gagcagcuga agaucuggau ggggaagaug cagaagaagg cuguugccau 1140

cuccuugccc aagggugugg uggaggugac ccaugaccug cagaaacacc uggcugggcu 1200

gggccugacu gaggccauug acaagaacaa ggccgacuug ucacgcaugu caggcaagaa 1260

ggaccuguac cuggccagcg uguuccacgc caccgccuuu gaguuggaca cagauggcaa 1320

ccccuuugac caggacaucu acgggcgcga ggagcugcgc agccccaagc uguucuacgc 1380

cgaccacccc uucaucuucc uagugcggga cacccaaagc ggcucccugc uauucauugg 1440

gcgccugguc cggccuaagg gugacaagau gcgagacgag uuauagggcc ucagggugca 1500

cacaggaugg caggaggcau ccaaaggcuc cugagacaca ugggugcuau ugggguuggg 1560

ggggagguga gguaccagcc uuggauacuc cauggggugg ggguggaaaa acagaccggg 1620

guucccgugu gccugagcgg accuucccag cuagaauuca cuccacuugg acaugggccc 1680

cagauaccau gaugcugagc ccggaaacuc cacauccugu gggaccuggg ccauagucau 1740

ucugccugcc cugaaagucc cagaucaagc cugccucaau caguauucau auuuauagcc 1800

agguaccuuc ucaccuguga gaccaaauug agcuaggggg gucagccagc ccucuucuga 1860

cacuaaaaca ccucagcugc cuccccagcu cuaucccaac cucucccaac uauaaaacua 1920

ggugcugcag ccccugggac caggcacccc cagaaugacc uggccgcagu gaggcggauu 1980

gagaaggagc ucccaggagg ggcuucuggg cagacucugg ucaagaagca ucgugucugg 2040

cguugugggg augaacuuuu uguuuuguuu cuuccuuuuu uaguucuuca aagauaggga 2100

gggaaggggg aacaugagcc uuuguugcua ucaauccaag aacuuauuug uacauuuuuu 2160

uuuucaauaa aacuuuucca augacauuuu guuggagcgu ggaaaaaa 2208

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<400> 2

cuacgacgac gagaaggaat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<400> 3

uuccuucucg ucgucguagt a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<400> 4

agcccucuuc ugacacuaat t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<400> 5

uuagugucag aagagggcug g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<400> 6

ggacaggccu cuacaacuat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<400> 7

uaguuguaga ggccugucct t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HSP47 gRNA

<400> 8

ccgactgtac ggacccagct cag 23

<210> 9

<211> 4140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cas9

<400> 9

atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600

atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260

gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980

cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040

gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280

atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340

atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400

gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520

atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000

tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240

gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540

tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080

gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgtga 4140

Claims

1.一种用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的药物，其包含HSP47的抑制物质。

2.根据权利要求1所述的药物，其中，HSP47的抑制物质是针对HSP47的干扰核酸、核酶、反义核酸、微小RNA、短链发夹RNA、表达它们的载体、或由它们转化的细胞。

3.根据权利要求2所述的药物，其中，针对HSP47的干扰核酸为siNA或siRNA。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的药物，其中，癌患者是乳腺癌、大肠癌、结肠癌或胰腺癌的患者。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的药物，其中，化疗剂为烷化剂、代谢拮抗剂、抗肿瘤性抗生素、生物碱、激素疗法剂、铂络合物、血管新生抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、或微管作用剂。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的药物，其中，化疗剂为顺铂(CDDP)或5-氟尿嘧啶(5-FU)。

7.一种用于治疗癌的药物，其包含HSP47的抑制物质和化疗剂。

8.HSP47的抑制物质在制造用于治疗癌的药物中的用途，其中，所述治疗是将化疗剂与HSP47的抑制物质并用给药的治疗。

9.一种用于癌治疗中的用途的组合物，其包含HSP47的抑制物质，所述治疗是将化疗剂与HSP47的抑制物质并用给药的治疗。

10.一种用于增加癌患者对化疗剂的敏感性的方法，其特征在于，对癌患者给药有效量的HSP47的抑制物质。

11.根据权利要求10所述的方法，其还包含对需要利用包含HSP47的抑制物质的药物进行处置的患者进行鉴定的工序。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述工序是对从癌患者分离的肿瘤组织中的HSP47表达进行定量的工序。

13.一种癌的治疗方法，其特征在于，对癌患者给药有效量的HSP47的抑制物质和化疗剂。

14.一种在体外对癌细胞进行处置的方法，其包含使用有效量的HSP47的抑制物质和化疗剂在体外对癌患者来源的癌细胞进行处置。