JP2021031420A - Ｍｙｈ９の阻害物質を用いた、がん転移抑制 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、高悪性度かつ高転移能の癌の転移を抑制することを課題とする。【解決手段】本明細書において、ＭＹＨ９の阻害物質を含む、癌転移抑制剤が提供される。【選択図】図２
Description
本発明は、癌の転移を抑制するための医薬およびその方法に関する。
癌治療においては、癌細胞死の誘導による治療、癌細胞の増殖抑制による治療および癌組織の除去による治療が主流であるが、これらの治療と組み合わせて、癌細胞の転移抑制の治療を行うことは、癌の進行や癌の再発防止の観点で重要である。しかし、癌細胞の転移を抑制するための有効な治療が実現化されていない。そのため、癌治療において、癌細胞の転移を抑制する手法の確立が望まれている。癌治療の手法としては、特許文献１には、heat shock protein 47（ＨＳＰ４７）を標的化する分子を用いて、腫瘍の増殖を抑制することで、腫瘍を治療することが記載されている。非特許文献１には、小胞体膜タンパク質であるInositol-Requiring Enzyme 1-ALPHA（ＩＲＥ１α）のドミナントネガティブ形態においてグリオーマ細胞の遊走が促進されることが示唆されている。non-muscle myosin IIA; NMIIA （ＭＹＨ９）は、細胞運動の重要な因子であり、がん細胞で発現することが知られているが、ＭＹＨ９の発現を阻害することによる癌転移抑制効果については確認されていない。また、非特許文献２には、ＨＳＰ４７およびＭＹＨ９の強制発現がトリプルネガティブ乳癌の転移能を増強することが記載されているが、ＭＹＨ９の発現を阻害することによる癌転移抑制効果については確認されていない。
トリプルネガティブ乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、およびヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の発現が陰性であり、高転移能を有していることから、従来の乳癌治療法（化学療法、ホルモン療法、分子標的治療）の効果がほとんど発揮されず、現状、それに対する解決策は皆無である。例えば、近年、乳癌治療の分子標的薬としてＨＥＲ２を標的とする抗体医薬が使用されているが、トリプルネガティブ乳癌はＨＥＲ２が陰性であるため、このような分子標的薬によって、細胞死や増殖抑制を誘導することが困難である。また、トリプルネガティブ乳癌には、ホルモン療法が奏効しない。トリプルネガティブ乳癌を外科的に除去する治療が可能であるが、外科的に癌組織を除去したとしても、癌細胞の一部が体内から除去しきれない場合がある。トリプルネガティブ乳癌は遠隔組織への転移能が非常に高いため、外科的な処置を施したとしても、残存するリスクを考慮して、転移を抑制する治療を併せて行うことが望ましい。しかしながら、一般的に、癌細胞の転移を抑制するための有効な治療は確立されていない。このように、乳癌、特にトリプルネガティブ乳癌についても高転移能の獲得機序は未解明であり、転移の制御・抑制を行える治療法も無い。
Journal of Cell Science 125, 4278-4287
Akihiro Yoneda et. al., P-2149 "HSP47 augments a metastatic potential of triple negative breast cancer", 第７７回日本癌学会学術総会
本発明は、高悪性度かつ高転移能の癌の転移を抑制することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、トリプルネガティブ乳癌において、その細胞集団がＭＹＨ９を高発現していること、トリプルネガティブ乳癌および非トリプルネガティブ乳癌において、その細胞集団がＩＲＥ１αを高発現していること、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α陽性トリプルネガティブ乳癌細胞は非常に転移能が高いこと、そして、トリプルネガティブヒト乳癌において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現を抑制することにより、その転移能を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、本発明者らは、ＨＳＰ４７タンパク質が、ＩＲＥ１αを介して、細胞運動の重要な因子であるnon-muscle myosin IIA; NMIIA (MYH9)に結合し、ＨＳＰ４７とＩＲＥ１αとＭＹＨ９とが複合体を形成することを新たに見出している。ＨＳＰ４７は、ＩＲＥ１αを介して、細胞運動に重要な因子に結合して、細胞運動制御に関与しており、ＨＳＰ４７、ＩＲＥ１α、またはＭＹＨ９のいずれかの阻害物質は、ＨＳＰ４７、ＩＲＥ１α、またはＭＹＨ９の発現阻害を介して、細胞運動を抑制することが予想される。
さらに、本発明者らは、ＨＳＰ４７タンパク質が、ＩＲＥ１αを介して、細胞運動の重要な因子であるnon-muscle myosin IIA; NMIIA (MYH9)に結合し、ＨＳＰ４７とＩＲＥ１αとＭＹＨ９とが複合体を形成することを新たに見出している。ＨＳＰ４７は、ＩＲＥ１αを介して、細胞運動に重要な因子に結合して、細胞運動制御に関与しており、ＨＳＰ４７、ＩＲＥ１α、またはＭＹＨ９のいずれかの阻害物質は、ＨＳＰ４７、ＩＲＥ１α、またはＭＹＨ９の発現阻害を介して、細胞運動を抑制することが予想される。
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
（１）ＭＹＨ９の阻害物質を含む、癌転移抑制剤。
（２）癌が乳癌である、（１）に記載の癌転移抑制剤。
（３）癌が、ホルモン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、（２）に記載の癌転移抑制剤。
（４）ホルモン受容体が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体である、（３）に記載の癌転移抑制剤。
（５）癌細胞が、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、（３）または（４）に記載の癌転移抑制剤。
（６）ＭＹＨ９の阻害物質が、ＭＹＨ９に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクター、またはこれらで形質転換された細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
（７）ＩＲＥ１αの阻害物質をさらに含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の癌転移抑制剤を含む医薬組成物。
（９）癌を処置するための、（８）に記載の医薬組成物。
（１０）転移性肺癌を処置するための、（９）に記載の医薬組成物。
（１１）癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＭＹＨ９の阻害物質の使用。
（１２）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１１）に記載の使用。
（１３）癌の転移の抑制における使用のための、ＭＹＨ９の阻害物質を含む組成物。
（１４）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１３）に記載の組成物。
（１５）有効量のＭＹＨ９の阻害物質を癌患者に投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法。
（１６）前記癌患者が乳癌患者であって、前記有効量のＭＹＨ９の阻害物質の投与前に、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程を含む、（１５）に記載の癌の転移抑制方法。
（１７）前記有効量のＭＹＨ９の阻害物質の投与前に、前記癌患者の癌組織がＭＹＨ９を発現しているか否かを確認する工程を含む、（１５）または（１６）に記載の癌の転移抑制方法。
（１８）外科的治療、放射線治療、粒子線治療、化学療法、及び分子標的治療からなる群より選択される治療と共に行われる、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の癌の転移抑制方法。
（１９）癌患者由来の癌細胞を、有効量のＭＹＨ９の阻害物質を用いてインビトロで処置することを含む、インビトロで癌の転移を抑制する方法。
（１）ＭＹＨ９の阻害物質を含む、癌転移抑制剤。
（２）癌が乳癌である、（１）に記載の癌転移抑制剤。
（３）癌が、ホルモン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、（２）に記載の癌転移抑制剤。
（４）ホルモン受容体が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体である、（３）に記載の癌転移抑制剤。
（５）癌細胞が、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、（３）または（４）に記載の癌転移抑制剤。
（６）ＭＹＨ９の阻害物質が、ＭＹＨ９に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクター、またはこれらで形質転換された細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
（７）ＩＲＥ１αの阻害物質をさらに含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の癌転移抑制剤を含む医薬組成物。
（９）癌を処置するための、（８）に記載の医薬組成物。
（１０）転移性肺癌を処置するための、（９）に記載の医薬組成物。
（１１）癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＭＹＨ９の阻害物質の使用。
（１２）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１１）に記載の使用。
（１３）癌の転移の抑制における使用のための、ＭＹＨ９の阻害物質を含む組成物。
（１４）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１３）に記載の組成物。
（１５）有効量のＭＹＨ９の阻害物質を癌患者に投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法。
（１６）前記癌患者が乳癌患者であって、前記有効量のＭＹＨ９の阻害物質の投与前に、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程を含む、（１５）に記載の癌の転移抑制方法。
（１７）前記有効量のＭＹＨ９の阻害物質の投与前に、前記癌患者の癌組織がＭＹＨ９を発現しているか否かを確認する工程を含む、（１５）または（１６）に記載の癌の転移抑制方法。
（１８）外科的治療、放射線治療、粒子線治療、化学療法、及び分子標的治療からなる群より選択される治療と共に行われる、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の癌の転移抑制方法。
（１９）癌患者由来の癌細胞を、有効量のＭＹＨ９の阻害物質を用いてインビトロで処置することを含む、インビトロで癌の転移を抑制する方法。
本発明の癌転移抑制剤は、癌細胞におけるＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現を阻害することにより、癌の転移を抑制することができる。本発明の方法は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与することにより、癌の転移を抑制することができる。
ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αの発現パターンは、トリプルネガティブ乳癌および非トリプルネガティブ乳癌におけるように癌種において異なるため、その発現パターンに合わせて、ＭＹＨ９の阻害物質およびＩＲＥ１αの阻害物質を併用することにより、乳癌を含む幅広い癌種に対して転移抑制効果を発揮することが可能である。
ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αの発現パターンは、トリプルネガティブ乳癌および非トリプルネガティブ乳癌におけるように癌種において異なるため、その発現パターンに合わせて、ＭＹＨ９の阻害物質およびＩＲＥ１αの阻害物質を併用することにより、乳癌を含む幅広い癌種に対して転移抑制効果を発揮することが可能である。
本明細書において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を含む癌転移抑制剤、これを含む医薬組成物およびキット、ならびにＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与することを含む癌の転移を抑制するための方法が提供される。
本発明の癌転移抑制剤、医薬組成物、キットおよび方法は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの転写体ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、例えば配列番号１または２によって例示されるＭＹＨ９またはＩＲＥ１αのｍＲＮＡに結合する核酸分子（例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖（double-stranded）ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を使用すること、あるいは、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α遺伝子をゲノム編集技術を使用してノックアウトすることを特徴とする。
１．本発明の癌転移抑制剤
本発明の一側面は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を含む癌転移抑制剤、例えば、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現の阻害剤を含む、癌転移抑制剤に関する。
ＭＹＨ９およびＩＲＥ１α遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり、本発明において、ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αのｍＲＮＡ配列は、Accession No. NM_002473およびAccession No. NM_001433（それぞれ配列番号１および２）によって示される。
本発明の一側面は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を含む癌転移抑制剤、例えば、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現の阻害剤を含む、癌転移抑制剤に関する。
ＭＹＨ９およびＩＲＥ１α遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり、本発明において、ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αのｍＲＮＡ配列は、Accession No. NM_002473およびAccession No. NM_001433（それぞれ配列番号１および２）によって示される。
本発明において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの転写体ＲＮＡは、例えば、ヒト由来であり、配列番号１または２で示される塩基配列またはこの各塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む塩基配列、或いは、上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。
本明細書において、「数個」とは、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個の塩基数をいう。また、配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる。
本明細書において、「数個」とは、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個の塩基数をいう。また、配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる。
本発明において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現の阻害剤は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現を阻害する成分、或いは、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αタンパク質の機能を阻害する成分であってもよく、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）、又はそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。また、本発明において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現の阻害剤は、例えば、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどであってもよい。ベクターは、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含んでいてもよい。
本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に実質的に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは、２１〜２３ヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ、を有し、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡであってもよい。
本発明において、「相補的」とは、核酸が、他の核酸配列と、古典的なワトソン−クリック型か、または他の非古典的なタイプにより水素結合を形成できることを意味する。
また、本発明において、「実質的に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、他の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成する場合のみならず、核酸配列の全ての残基のうち、例えば、７０％、８０％、および９０％の残基が、他の核酸配列の残基と水素結合を形成する場合も含む。
したがって、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に１００％相補的なヌクレオチドから数塩基変更されているヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡを有していてもよい。
また、本発明において、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。また、本発明において、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡであってもよい。
例えば、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＭＹＨ９ ｓｉＲＮＡ、例えば、センス鎖の5’- GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt -3’（配列番号３）とアンチセンス鎖の5’- AUCGGUCACAUUGAUACCCaa -3’（配列番号４）の組合せ（siMYH9-A）、センス鎖の5’- CCACCAACCUCACAGAAGAtt -3’（配列番号５）とアンチセンス鎖の5’- UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg -3’（配列番号６）の組合せ（siMYH9-B）、センス鎖の5’- CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt -3’（配列番号７）とアンチセンス鎖の5’- UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc -3’（配列番号８）の組合せ（siMYH9-C）（日東電工において作成）であってもよい。
例えば、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＭＹＨ９ ｓｉＲＮＡに加えて、ＩＲＥ１α ｓｉＲＮＡ、例えば、センス鎖の5’- GAAACUUCCUUUUACCAUCtt -3’（配列番号９）とアンチセンス鎖の5’- GAUGGUAAAAGGAAGUUUCgt -3’（配列番号１０）の組合せ（siIRE1α-A）、センス鎖の5’- CAGGACAUCUGGUAUGUUAtt -3’（配列番号１１）とアンチセンス鎖の5’- UAACAUACCAGAUGUCCUGtt -3’（配列番号１２）の組合せ（siIRE1α-B）（日東電工において作成）を含んでいてもよい。
また、本発明において、癌転移抑制剤は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質に加えて、ＨＳＰ４７の阻害物質、例えば、センス鎖の5’- CUACGACGACGAGAAGGAAtt -3’（配列番号１３）とアンチセンス鎖の5’- UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta -3’（配列番号１４）の組合せ（siHSP47-A）(Ambion)、センス鎖の5’- AGCCCUCUUCUGACACUAAtt -3’（配列番号１５）とアンチセンス鎖の5’- UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg -3’（配列番号１６）の組合せ（siHSP47-B）(Ambion)、センス鎖の5’- GGACAGGCCUCUACAACUAtt -3’（配列番号１７）とアンチセンス鎖の5’- UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt -3’（配列番号１８）の組合せ（siHSP47-C）（日東電工において作成）を含んでいてもよい。あるいは、本発明において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質に加えて、ＨＳＰ４７の阻害物質として、Ｏｒｉｇｅｎ社から購入したＨＳＰ４７ ｓｈＲＮＡ、または、ＨＳＰ４７ ｓｈＲＮＡを含むプラスミドベクターを使用することができる。あるいは、本発明において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質に加えて、ＨＳＰ４７の阻害物質として、ｇＲＮＡ配列(例えば、5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号１９）)をコードするプラスミドを使用するゲノム編集技術を使用してＨＳＰ４７遺伝子をノックアウトすることもできる。
本発明において、「相補的」とは、核酸が、他の核酸配列と、古典的なワトソン−クリック型か、または他の非古典的なタイプにより水素結合を形成できることを意味する。
また、本発明において、「実質的に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、他の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成する場合のみならず、核酸配列の全ての残基のうち、例えば、７０％、８０％、および９０％の残基が、他の核酸配列の残基と水素結合を形成する場合も含む。
したがって、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に１００％相補的なヌクレオチドから数塩基変更されているヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡを有していてもよい。
また、本発明において、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。また、本発明において、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡであってもよい。
例えば、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＭＹＨ９ ｓｉＲＮＡ、例えば、センス鎖の5’- GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt -3’（配列番号３）とアンチセンス鎖の5’- AUCGGUCACAUUGAUACCCaa -3’（配列番号４）の組合せ（siMYH9-A）、センス鎖の5’- CCACCAACCUCACAGAAGAtt -3’（配列番号５）とアンチセンス鎖の5’- UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg -3’（配列番号６）の組合せ（siMYH9-B）、センス鎖の5’- CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt -3’（配列番号７）とアンチセンス鎖の5’- UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc -3’（配列番号８）の組合せ（siMYH9-C）（日東電工において作成）であってもよい。
例えば、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＭＹＨ９ ｓｉＲＮＡに加えて、ＩＲＥ１α ｓｉＲＮＡ、例えば、センス鎖の5’- GAAACUUCCUUUUACCAUCtt -3’（配列番号９）とアンチセンス鎖の5’- GAUGGUAAAAGGAAGUUUCgt -3’（配列番号１０）の組合せ（siIRE1α-A）、センス鎖の5’- CAGGACAUCUGGUAUGUUAtt -3’（配列番号１１）とアンチセンス鎖の5’- UAACAUACCAGAUGUCCUGtt -3’（配列番号１２）の組合せ（siIRE1α-B）（日東電工において作成）を含んでいてもよい。
また、本発明において、癌転移抑制剤は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質に加えて、ＨＳＰ４７の阻害物質、例えば、センス鎖の5’- CUACGACGACGAGAAGGAAtt -3’（配列番号１３）とアンチセンス鎖の5’- UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta -3’（配列番号１４）の組合せ（siHSP47-A）(Ambion)、センス鎖の5’- AGCCCUCUUCUGACACUAAtt -3’（配列番号１５）とアンチセンス鎖の5’- UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg -3’（配列番号１６）の組合せ（siHSP47-B）(Ambion)、センス鎖の5’- GGACAGGCCUCUACAACUAtt -3’（配列番号１７）とアンチセンス鎖の5’- UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt -3’（配列番号１８）の組合せ（siHSP47-C）（日東電工において作成）を含んでいてもよい。あるいは、本発明において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質に加えて、ＨＳＰ４７の阻害物質として、Ｏｒｉｇｅｎ社から購入したＨＳＰ４７ ｓｈＲＮＡ、または、ＨＳＰ４７ ｓｈＲＮＡを含むプラスミドベクターを使用することができる。あるいは、本発明において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質に加えて、ＨＳＰ４７の阻害物質として、ｇＲＮＡ配列(例えば、5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号１９）)をコードするプラスミドを使用するゲノム編集技術を使用してＨＳＰ４７遺伝子をノックアウトすることもできる。
ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αまたはＨＳＰ４７の阻害物質の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リポフェクタミン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３〜１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５〜１×１０１３、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８〜１×１０１０で用いることができる。
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３〜１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５〜１×１０１３、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８〜１×１０１０で用いることができる。
上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。
２．本発明の医薬組成物
本発明はまた、上記の癌転移抑制剤を含む医薬組成物に関する。上記の癌転移抑制剤は、癌細胞の運動能の低減、および、癌の転移の抑制が可能であるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、上記のＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
本発明はまた、上記の癌転移抑制剤を含む医薬組成物に関する。上記の癌転移抑制剤は、癌細胞の運動能の低減、および、癌の転移の抑制が可能であるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、上記のＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、癌細胞の運動能および癌の転移を顕著に抑制することができ、例えば、スクラッチアッセイによって測定される細胞運動能が、例えば、２分の１、３分の１以下まで顕著に抑制される。本発明の医薬組成物は、癌細胞の運動能を抑制する結果として、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与しない場合と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上、癌の転移の領域を減少させることができる。
本発明の医薬組成物が対象とする癌としては、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの転写体ＲＮＡが発現している限り限定されないが、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられ、これらの中でも、固形癌の癌が好ましく、膵癌、大腸癌、乳癌がより好ましく、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌が特に好ましい。特にトリプルネガティブ乳癌は、ＭＹＨ９タンパク質の発現も高く、非トリプルネガティブ乳癌よりも運動能が高い癌種となっており、本発明は、トリプルネガティブ乳癌のように、運動能の高くなっている癌種に特に好適に適用できる。また、本発明の医薬組成物が対象とする転移性癌としては、例えば、転移性肺癌が挙げられる。
癌細胞がＭＹＨ９およびＩＲＥ１αを発現しているか否かは、ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αの転写体ＲＮＡの発現を、遺伝子レベルで検出することにより判断できる。具体的には、遺伝子レベルでは、例えば、ノーザンブロッティング法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、in vitro転写法等の任意の公知の遺伝子発現解析法により検出することができる。また、癌細胞がＭＹＨ９およびＩＲＥ１αを発現しているか否かは、ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αの発現を、タンパク質レベルで検出することにより判断できる。具体的には、例えば、免疫沈降法、ＥＩＡ（enzyme immunoassay）（例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）など）、ＲＩＡ（radio immuno assay）（例えば、ＩＲＭＡ（immunoradiometric assay）、RAST（radioallergosorbent test）、RIST（radioimmunosorbent test）など）、ウエスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法により検出することができる。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの転写体ＲＮＡが発現している細胞である。ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αの転写体ＲＮＡは、一般的に、正常細胞で発現している。本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αのタンパク質を発現している癌細胞が好ましく、ＭＹＨ９およびＩＲＥ１αのタンパク質に加えて、ＨＳＰ４７タンパク質を発現している細胞がより好ましい。ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α陽性トリプルネガティブ乳癌は、ＨＳＰ４７タンパク質も発現している。従って、本発明の医薬組成物は、ＭＹＨ９および／またはＩＲＥ１αの阻害物質に加えて、ＨＳＰ４７の阻害物質を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、ＭＹＨ９、ＩＲＥ１α、およびＨＳＰ４７の遺伝子のいずれか１つの転写を阻害することで、これらの遺伝子の１以上を発現する癌種に対して転移抑制効果を発揮することができるし、あるいは、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＭＹＨ９、ＩＲＥ１α、およびＨＳＰ４７の遺伝子の発現パターンとは発現パターンが異なる癌種に対しても、その発現パターンに合わせてＭＹＨ９の阻害物質、ＩＲＥ１αの阻害物質、およびＨＳＰ４７の阻害物質を併用することにより、転移抑制効果を効果的に発揮することができる。
本発明の別の態様において、本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体）陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブヒト乳癌細胞である。トリプルネガティブ乳癌の診断は、生検により採取した腫瘍組織の病理検査（主に免疫組織染色）および遺伝子発現解析を必要とする。2つのホルモン受容体（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）、およびＨＥＲ２の病理検査と遺伝子発現解析を行い、これら全てにおいて陰性の場合、トリプルネガティブ乳癌であると診断する。
本発明の別の態様において、本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体）陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブヒト乳癌細胞である。トリプルネガティブ乳癌の診断は、生検により採取した腫瘍組織の病理検査（主に免疫組織染色）および遺伝子発現解析を必要とする。2つのホルモン受容体（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）、およびＨＥＲ２の病理検査と遺伝子発現解析を行い、これら全てにおいて陰性の場合、トリプルネガティブ乳癌であると診断する。
本発明の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の化学療法剤をさらに含んでもよい。化学療法剤としては、限定されずに、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド、ホルモン療法剤、白金錯体、血管新生阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および微小管作用薬などが挙げられる。
本発明の医薬組成物において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を、他の化学療法剤と組み合わせて用いる場合、これらを単一の組成物に含めてもよく、複数の組成物に別々に含ませ、それらを別々に用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
本発明の種々の態様において、上記の医薬組成物は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。
本発明の医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（たとえば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、上記Remington's Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であり得る。
３．本発明のキット
本発明は、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物に含まれ得る活性成分（例えば、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質）を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む転移抑制剤または医薬組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される癌転移抑制剤または医薬組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。
本発明は、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物に含まれ得る活性成分（例えば、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質）を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む転移抑制剤または医薬組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される癌転移抑制剤または医薬組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。
４．本発明の癌の転移抑制方法
本発明の一態様は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法に関する。本方法において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与しない場合とＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与する場合とを比較すると、スクラッチアッセイによって測定する場合、癌細胞の運動能が、例えば、２分の１、３分の１以下まで低下している。また、本方法において、癌細胞の運動能を抑制する結果として、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上、癌の転移の領域を減少させることができる。
本発明の一態様は、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法に関する。本方法において、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与しない場合とＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を投与する場合とを比較すると、スクラッチアッセイによって測定する場合、癌細胞の運動能が、例えば、２分の１、３分の１以下まで低下している。また、本方法において、癌細胞の運動能を抑制する結果として、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上、癌の転移の領域を減少させることができる。
本発明の方法において、投与される患者は、典型的には、癌治療を必要とする患者である。かかる患者としては、限定されずに、例えば、上記のＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの発現に関連する癌を患っているか、これらの癌を有すると診断されたか、これらの癌を発症するリスクが高い患者である。したがって、本発明の方法は、本発明のＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を含む癌転移抑制剤または医薬組成物による処置を必要としている患者を同定する工程、例えば、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程をさらに含んでもよい。乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程は、生検により採取した腫瘍組織の病理検査（主に免疫組織染色）および遺伝子発現解析を行う工程、より詳細には、2つのホルモン受容体（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）、およびＨＥＲ２の病理検査と遺伝子発現解析を行い、これら全てにおいて陰性の場合、トリプルネガティブ乳癌を有すると決定する工程を含む。癌の具体例は、医薬組成物に関して上記したとおりである。
本発明の方法においては、本発明の医薬組成物を、対象とする癌を処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することもできる。本発明の方法は、処置方法として、放射線治療、粒子線治療などの物理療法、外科手術などの外科的治療、化学療法、及び分子標的治療などと併用することができる。本発明の方法は、他の作用物質として、上記のような化学療法剤を併用することができ、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド、ホルモン療法剤、白金錯体、血管新生阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および微小管作用薬などが挙げられる。本発明の方法は、このような構成を採用することにより、癌細胞除去、細胞死誘導、または細胞増殖抑制などの一般的な治療を行いながら、これらの治療と共に、癌の転移を抑制することができる。したがって、本発明の方法により、多面的に癌の治療を行うことができ、癌治療の効果を向上させることができる。
本発明の癌の転移抑制方法における有効量とは、例えば、癌細胞の運動能を低下させる量、または、癌の転移の領域を減少させる量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
本明細書に記載される本発明の方法において投与する活性成分（例えば、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質）の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。本発明の方法に用いる活性成分の用量は、好ましくは、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたりｓｉＲＮＡ分子に換算して例えば０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇである。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
本明細書で用いる場合、用語「患者」は、任意の生物個体を意味するが、例えば、動物、哺乳動物、またはヒト個体である。本発明において、「患者」は、典型的には癌に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
今回本発明者により、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物が、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１α（配列番号１または２）の発現を抑制することにより、トリプルネガティブ乳癌の細胞運動能を抑制し、結果として、転移性肺癌を抑制できることが明らかになった。
したがって、本発明はまた、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を含む、上記作用を提供するための癌転移抑制剤および医薬組成物、上記作用を提供するための医薬の製造における使用、ならびに、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質の上記作用を提供するための使用にも関する。
したがって、本発明はまた、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質を含む、上記作用を提供するための癌転移抑制剤および医薬組成物、上記作用を提供するための医薬の製造における使用、ならびに、ＭＹＨ９またはＩＲＥ１αの阻害物質の上記作用を提供するための使用にも関する。
本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。
例１：細胞株の取得および培養
本願明細書中で使用した全てのヒト乳癌細胞株（MDA-MB-468, MDA-MB-231, MCF7, BT474）は、American Type Culture Collectionから購入した。これらの細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
本願明細書中で使用した全てのヒト乳癌細胞株（MDA-MB-468, MDA-MB-231, MCF7, BT474）は、American Type Culture Collectionから購入した。これらの細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
例２：ＭＹＨ９ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたトリプルネガティブ細胞のインビトロ増殖
ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）細胞を、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Life Technologies)を使用して、以下のsiRNAでトランスフェクトし、大気中３７℃で５時間培養した。
対照siRNA(siControl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、
MYH9-A siRNA (siMYH9-A, センス鎖: 5’-GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt-3’（配列番号３）; アンチセンス鎖: 5’-AUCGGUCACAUUGAUACCCaa-3’（配列番号４）)、
MYH9-B siRNA (siMYH9-B, センス鎖: 5’-CCACCAACCUCACAGAAGAtt-3’（配列番号５）; アンチセンス鎖: 5’-UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg-3’（配列番号６）)、または、
MYH9-C siRNA (siMYH9-C, センス鎖: 5’-CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt-3’（配列番号７）; アンチセンス鎖: 5’-UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc-3’（配列番号８）)
siRNAでのトランスフェクションの５時間後、細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
トリプルネガティブヒト乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）におけるＭＹＨ９タンパク質の発現をReal time-PCRにて検出した。結果を図１Ａに示す。試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）におけるＭＹＨ９ ｍＲＮＡの発現は、siControl群におけるＭＹＨ９ ｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。
また、これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図１Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。
また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図２Ａに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞運動能が、５分の１〜３分の１程度に有意に減少していた。
さらに、これらの細胞を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図２Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞浸潤能が、４分の１〜３分の１程度に有意に減少していた（図２Ｂ）。したがって、癌細胞におけるＭＹＨ９発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。
ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）細胞を、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Life Technologies)を使用して、以下のsiRNAでトランスフェクトし、大気中３７℃で５時間培養した。
対照siRNA(siControl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、
MYH9-A siRNA (siMYH9-A, センス鎖: 5’-GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt-3’（配列番号３）; アンチセンス鎖: 5’-AUCGGUCACAUUGAUACCCaa-3’（配列番号４）)、
MYH9-B siRNA (siMYH9-B, センス鎖: 5’-CCACCAACCUCACAGAAGAtt-3’（配列番号５）; アンチセンス鎖: 5’-UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg-3’（配列番号６）)、または、
MYH9-C siRNA (siMYH9-C, センス鎖: 5’-CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt-3’（配列番号７）; アンチセンス鎖: 5’-UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc-3’（配列番号８）)
siRNAでのトランスフェクションの５時間後、細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
トリプルネガティブヒト乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）におけるＭＹＨ９タンパク質の発現をReal time-PCRにて検出した。結果を図１Ａに示す。試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）におけるＭＹＨ９ ｍＲＮＡの発現は、siControl群におけるＭＹＨ９ ｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。
また、これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図１Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。
また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図２Ａに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞運動能が、５分の１〜３分の１程度に有意に減少していた。
さらに、これらの細胞を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図２Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞浸潤能が、４分の１〜３分の１程度に有意に減少していた（図２Ｂ）。したがって、癌細胞におけるＭＹＨ９発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。
例３：ＩＲＥ１α ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたトリプルネガティブ細胞のインビトロ増殖
ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）細胞を、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Life Technologies)を使用して、以下のsiRNAでトランスフェクトし、大気中３７℃で５時間培養した。
対照siRNA(siControl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、
IRE1α-A siRNA (siIRE1α-A, センス鎖: 5’- GAAACUUCCUUUUACCAUCtt -3’（配列番号９）; アンチセンス鎖: 5’- GAUGGUAAAAGGAAGUUUCgt -3’（配列番号１０）)、または、
IRE1α-B siRNA (siIRE1α-B, センス鎖: 5’- CAGGACAUCUGGUAUGUUAtt -3’（配列番号１１）; アンチセンス鎖: 5’- UAACAUACCAGAUGUCCUGtt -3’（配列番号１２）)
siRNAでのトランスフェクションの５時間後、細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
トリプルネガティブヒト乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）におけるＩＲＥ１αタンパク質の発現をReal time-PCRにて検出した。結果を図３Ａに示す。試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）におけるＩＲＥ１α ｍＲＮＡの発現は、siControl群におけるＩＲＥ１α ｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。
また、これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図３Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）では、siControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。
また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図４Ａに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）では、siControl群と比較して、細胞運動能が、５分の１〜３分の１程度に有意に減少していた。
さらに、これらの細胞を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図４Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）では、siControl群と比較して、細胞浸潤能が、４分の１〜２分の１程度に有意に減少していた（図４Ｂ）。したがって、癌細胞におけるＩＲＥ１α発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。
ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）細胞を、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Life Technologies)を使用して、以下のsiRNAでトランスフェクトし、大気中３７℃で５時間培養した。
対照siRNA(siControl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、
IRE1α-A siRNA (siIRE1α-A, センス鎖: 5’- GAAACUUCCUUUUACCAUCtt -3’（配列番号９）; アンチセンス鎖: 5’- GAUGGUAAAAGGAAGUUUCgt -3’（配列番号１０）)、または、
IRE1α-B siRNA (siIRE1α-B, センス鎖: 5’- CAGGACAUCUGGUAUGUUAtt -3’（配列番号１１）; アンチセンス鎖: 5’- UAACAUACCAGAUGUCCUGtt -3’（配列番号１２）)
siRNAでのトランスフェクションの５時間後、細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
トリプルネガティブヒト乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）におけるＩＲＥ１αタンパク質の発現をReal time-PCRにて検出した。結果を図３Ａに示す。試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）におけるＩＲＥ１α ｍＲＮＡの発現は、siControl群におけるＩＲＥ１α ｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。
また、これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図３Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）では、siControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。
また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図４Ａに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）では、siControl群と比較して、細胞運動能が、５分の１〜３分の１程度に有意に減少していた。
さらに、これらの細胞を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図４Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siIRE1α-A、siIRE1α-B）では、siControl群と比較して、細胞浸潤能が、４分の１〜２分の１程度に有意に減少していた（図４Ｂ）。したがって、癌細胞におけるＩＲＥ１α発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。
例４：ＭＹＨ９はトリプルネガティブ乳癌で発現され、ＩＲＥ１αはトリプルネガティブ乳癌および非トリプルネガティブ乳癌の両方で発現される
トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-468)および非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MCF7, BT474)におけるＭＹＨ９またはＩＲＥ１αタンパク質の発現をウエスタンブロット法にて検出した。結果を図５Ａに示す。
トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるＭＹＨ９タンパク質の発現は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類における発現と比較して、顕著に高かった。詳細には、ＭＹＨ９タンパク質は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類において実質的に発現していなかった。しかしながら、トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるＩＲＥ１αタンパク質の発現は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類における発現と同程度であった。
また、MYH9発現の誘導が、MYH9ではなくHSP47が発現される非トリプルネガティブ乳癌細胞（MCF7）の転移能を増強するか否かを決定するために、MYH9を安定して発現する非トリプルネガティブ乳癌細胞株(Mock+MYH9-GFP)を作製した（図５Ｂ）。また、MYH9（別名NMIIA）を発現するプラスミドとして、pCMV-NMIIA-GFPプラスミド（Origene）を入手し、これを使用した。
また、HSP47の発現をノックアウトした（KO）MCF7細胞（HSP47 KO）を以下のとおり作製した（図５Ｂ）。HSP47 KO細胞は、信州大学の桜井博士より譲り受けた、Cas9配列およびgRNA配列についてのクローニング部位を含むpCG:SapIプラスミドを使用して作製した（Sakurai, T. et al. (2014) BMC Biotechnol. 14, 69、および、Sakurai, T. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 20011を参照）。ヒトHSP47ゲノムのエキソン５について設計されたgRNA配列(5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号１３）)をpCG:SapIプラスミドに挿入した。pP2A-mCherry-N1プラスミド(Addgege)を使用して、P2A-mCherry cDNAのDNAフラグメントを増幅した。構築された標的化ベクターおよびpcDNA3.1(+)(Promega)をLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を使用してMCF7細胞株に同時トランスフェクトした。処理した細胞を10%FBSおよびG418(1000μg/mL, Thermo Fisher Scientific)を補充したDMEM中で培養し、細胞クローンを選択した。細胞クローンから抽出したHSP47ゲノムDNAのDNA配列決定を実施して、HSP47遺伝子の下流部位へのP2A-mCherry遺伝子の挿入を確認した。単一細胞クローンは、DNA配列分析によって評価して、標的アレルにおける挿入欠失を検出した。
Mock群およびHSP47 KO群におけるＭＹＨ９、ＩＲＥ１αおよびＨＳＰ４７タンパク質の発現をウエスタンブロット法にて検出した。結果を図５Ｂに示す。
ＩＲＥ１αタンパク質は、Mock群およびHSP47 KO群の両方で発現していた。ＭＹＨ９は、これを発現するプラスミドを導入した細胞株でのみ発現していた。HSP47 KO細胞では、HSP47は発現がノックアウトされていた。
トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-468)および非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MCF7, BT474)におけるＭＹＨ９またはＩＲＥ１αタンパク質の発現をウエスタンブロット法にて検出した。結果を図５Ａに示す。
トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるＭＹＨ９タンパク質の発現は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類における発現と比較して、顕著に高かった。詳細には、ＭＹＨ９タンパク質は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類において実質的に発現していなかった。しかしながら、トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるＩＲＥ１αタンパク質の発現は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類における発現と同程度であった。
また、MYH9発現の誘導が、MYH9ではなくHSP47が発現される非トリプルネガティブ乳癌細胞（MCF7）の転移能を増強するか否かを決定するために、MYH9を安定して発現する非トリプルネガティブ乳癌細胞株(Mock+MYH9-GFP)を作製した（図５Ｂ）。また、MYH9（別名NMIIA）を発現するプラスミドとして、pCMV-NMIIA-GFPプラスミド（Origene）を入手し、これを使用した。
また、HSP47の発現をノックアウトした（KO）MCF7細胞（HSP47 KO）を以下のとおり作製した（図５Ｂ）。HSP47 KO細胞は、信州大学の桜井博士より譲り受けた、Cas9配列およびgRNA配列についてのクローニング部位を含むpCG:SapIプラスミドを使用して作製した（Sakurai, T. et al. (2014) BMC Biotechnol. 14, 69、および、Sakurai, T. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 20011を参照）。ヒトHSP47ゲノムのエキソン５について設計されたgRNA配列(5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号１３）)をpCG:SapIプラスミドに挿入した。pP2A-mCherry-N1プラスミド(Addgege)を使用して、P2A-mCherry cDNAのDNAフラグメントを増幅した。構築された標的化ベクターおよびpcDNA3.1(+)(Promega)をLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を使用してMCF7細胞株に同時トランスフェクトした。処理した細胞を10%FBSおよびG418(1000μg/mL, Thermo Fisher Scientific)を補充したDMEM中で培養し、細胞クローンを選択した。細胞クローンから抽出したHSP47ゲノムDNAのDNA配列決定を実施して、HSP47遺伝子の下流部位へのP2A-mCherry遺伝子の挿入を確認した。単一細胞クローンは、DNA配列分析によって評価して、標的アレルにおける挿入欠失を検出した。
Mock群およびHSP47 KO群におけるＭＹＨ９、ＩＲＥ１αおよびＨＳＰ４７タンパク質の発現をウエスタンブロット法にて検出した。結果を図５Ｂに示す。
ＩＲＥ１αタンパク質は、Mock群およびHSP47 KO群の両方で発現していた。ＭＹＨ９は、これを発現するプラスミドを導入した細胞株でのみ発現していた。HSP47 KO細胞では、HSP47は発現がノックアウトされていた。
Claims (19)
- ＭＹＨ９の阻害物質を含む、癌転移抑制剤。
- 癌が乳癌である、請求項１に記載の癌転移抑制剤。
- 癌が、ホルモン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、請求項２に記載の癌転移抑制剤。
- ホルモン受容体が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体である、請求項３に記載の癌転移抑制剤。
- 癌細胞が、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、請求項３または４に記載の癌転移抑制剤。
- ＭＹＨ９の阻害物質が、ＭＹＨ９に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクター、またはこれらで形質転換された細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤。
- ＩＲＥ１αの阻害物質をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤を含む医薬組成物。
- 癌を処置するための、請求項８に記載の医薬組成物。
- 転移性肺癌を処置するための、請求項９に記載の医薬組成物。
- 癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＭＹＨ９の阻害物質の使用。
- 癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１１に記載の使用。
- 癌の転移の抑制における使用のための、ＭＹＨ９の阻害物質を含む組成物。
- 癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１３に記載の組成物。
- 有効量のＭＹＨ９の阻害物質を癌患者に投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法。
- 前記癌患者が乳癌患者であって、前記有効量のＭＹＨ９の阻害物質の投与前に、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程を含む、請求項１５に記載の癌の転移抑制方法。
- 前記有効量のＭＹＨ９の阻害物質の投与前に、前記癌患者の癌組織がＭＹＨ９を発現しているか否かを確認する工程を含む、請求項１５または１６に記載の癌の転移抑制方法。
- 外科的治療、放射線治療、粒子線治療、化学療法、及び分子標的治療からなる群より選択される治療と共に行われる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の癌の転移抑制方法。
- 癌患者由来の癌細胞を、有効量のＭＹＨ９の阻害物質を用いてインビトロで処置することを含む、インビトロで癌の転移を抑制する方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019151138A JP2021031420A (ja) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | Ｍｙｈ９の阻害物質を用いた、がん転移抑制 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2019151138A JP2021031420A (ja) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | Ｍｙｈ９の阻害物質を用いた、がん転移抑制 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021031420A true JP2021031420A (ja) | 2021-03-01 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2021031420A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11236337B2 (en) | 2016-11-01 | 2022-02-01 | The Research Foundation For The State University Of New York | 5-halouracil-modified microRNAs and their use in the treatment of cancer |
-
2019
- 2019-08-21 JP JP2019151138A patent/JP2021031420A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11236337B2 (en) | 2016-11-01 | 2022-02-01 | The Research Foundation For The State University Of New York | 5-halouracil-modified microRNAs and their use in the treatment of cancer |
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