KR20170098929A - Hsp47 를 표적으로 하는 rnai 분자를 이용하는 악성 종양에 대한 치료적 조성물 및 방법 - Google Patents

Hsp47 를 표적으로 하는 rnai 분자를 이용하는 악성 종양에 대한 치료적 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170098929A
KR20170098929A KR1020177020894A KR20177020894A KR20170098929A KR 20170098929 A KR20170098929 A KR 20170098929A KR 1020177020894 A KR1020177020894 A KR 1020177020894A KR 20177020894 A KR20177020894 A KR 20177020894A KR 20170098929 A KR20170098929 A KR 20170098929A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hsp47
artificial sequence
sirna
administration
rnai molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020177020894A
Other languages
English (en)
Inventor
웬빈 잉
아키히로 요네다
야스아키 다무라
겐지로우 미노미
바라트 마제티
지화 리우
Original Assignee
닛토덴코 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 닛토덴코 가부시키가이샤 filed Critical 닛토덴코 가부시키가이샤
Publication of KR20170098929A publication Critical patent/KR20170098929A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/0059—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence
    • A61B5/0071—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence by measuring fluorescence emission
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/28—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only
    • C07D311/30—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only not hydrogenated in the hetero ring, e.g. flavones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6533—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/35—Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/53—Methods for regulating/modulating their activity reducing unwanted side-effects

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

본 발명은 RNAi 분자를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 것에 의한 상기 포유동물에서 악성 종양의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 RNAi 분자는 Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성일 수 있거나, 또는 Hsp47 과 p21 에 대해 활성인 RNAi 분자들의 조합일 수 있다.

Description

HSP47 및 P21 를 표적으로 하는 RNAI 분자를 이용하는 악성 종양에 대한 치료적 조성물 및 방법 {THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR MALIGNANT TUMORS WITH RNAI MOLECULES TARGETED TO HSP47 AND P21}
본 발명은 핵산 기반 분자로 이루어진 생물약제학 및 치료학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 악성 종양을 포함하는 병태 및 질환의 작용을 예방, 치료 또는 완화하기 위한 RNA 간섭제를 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원서에는 크기가 100,000 바이트이고, 본원에서 그 전체가 인용 삽입되어 있는 ND5123767WO_SL.txt 명의 2015 년 12 월 20 일에 제작된 ASCII 파일로 전자적으로 제출된 서열 목록이 포함되어 있다.
악성 종양의 성장은 세포외 기질 (ECM) 과 관련된다. 분자 샤페론 "열충격" 단백질 Hsp47 은 ECM 유전자 전사 네트워크 조절에 관여한다.
Hsp47 발현은 유방암 및 기타 암에서 활성화될 수 있다. Hsp47 을 감소시키는 것은 유방암 세포의 성장을 감소시킬 수 있고 종양 성장을 제한시킬 수 있다.
Hsp47 의 증가된 발현은 유방암 환자의 열악한 예후 결과의 인자일 수 있다. Hsp47 발현은 부분적으로는 ECM 단백질을 증가시킴으로써 암 진행을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어 문헌 [암 Res, 2015, 75(8); 1580-91] 참조.
Hsp47 는 췌장암에서 고발현될 수 있다. Hsp-47 는 경구 암 검출을 위한 유용한 특이적 마커일 수 있다.
Hsp47 또는 그의 상동성 유전자 서열은 예를 들어 GenBank 접근 번호 AB010273 (인간), X60676 (마우스), 또는 M69246 (래트, gp46) 로서 개시되어 있다.
Hsp47 을 억제하기 위한 작용제가 섬유증 저해에 대해 개시된 바 있다. 예를 들어, US 8,173,170 B2, 및 US 8,710,209 B2 를 참조한다. 그러나, 악성 종양 발달, 진행 및 성장에서 Hsp47 을 저해하는 효과와 관련하여 제한된 정보가 존재한다.
p21 는 CDKN1A 유전자에 의해 인코딩되고, CIP/KIP 패밀리에 속하는 세포 주기-조절 단백질이다. 이 단백질은 사이클린-CDK 복합체의 작용을 그 복합체와의 결합을 통해 저해함으로써 G1 상 및 G2/M 상에서 세포 주기 진행을 저해하는 기능을 갖는다. 구체적으로, p21 유전자는 종양 억제자 유전자 중 하나인 p53 에 의한 활성화를 겪는다. DNA 손상 등으로 인한 p53 의 활성화 시, p53 은 p21 을 활성화시켜, 세포주기가 G1 상 및 G2/M 상에서 저지된다는 점이 보고되어 있다.
p21 은 전립선, 자궁 경부, 유방 및 평편 세포 암종을 비롯한 다양한 인간 암에서 과발현되고, 많은 경우, p21 상향조절은 종양 등급, 침습성 및 공격성과 긍정적으로 상호관련있다. 예를 들어, 문헌 [Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96] 을 참고한다. 또한, p21 의 상향 조절은 뇌, 전립선, 난소, 유방, 및 식도 세포 암을 비롯한 많은 형태의 암에서 종양 형성 및 예후가 열악한 것과 연관 있는 것으로 보고된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Winters et al., Breast 암 Research, 2003, Vol. 5, No. 6, pp. R242-R249] 을 참고한다. 또한, 이 질환은, 죽상동맥경화증, 알츠하이머병, 아밀로이드증, 및 관절염을 포함해, 연령과 관련된 질환일 수 있다. 예를 들어 문헌 [Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 8, pp. 4291-96] 을 참고한다.
악성 종양이 있는 환자를 위한 치료요법을 개발하기 위한 방법, 및 조성물, 예컨대 Hsp47 및 p21 의 발현 저해를 위한 siRNA 서열, 화합물 및 구조가 시급히 요구된다.
필요한 것은 악성 종양을 예방 또는 치료하기 위한 방법 및 조성물이다. 악성 종양을 예방, 치료 또는 감소시키기 위한 Hsp47, p21 및 기타 구조을 표적으로 하는 RNAi 분자 및 조성물이 지속적으로 요구된다.
본 발명의 개요
본 발명은 p21 의 억제제와 조합되는 Hsp47 의 siRNA 저해제, 및 Hsp47 의 억제제를 이용한 치료에 의해 생체 내에서 악성 종양 크기가 줄어들을 수 있다는 놀라운 발견과 관련된다.
본 발명은 악성 종양의 병태 및 질환을 예방, 치료 또는 완화하기 위해 다양한 기관으로 전달하는데 이용되는 핵산 기반 치료학적 화합물을 혼입하고 있는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 악성 종양과 관련된 각종 표적들의 유전자 침묵을 위한 RNA 간섭 분자 (RNAi 분자) 의 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료학적 분자의 전달을 위한 조성물뿐 아니라 이의 이용 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 각종 RNA-기반 및 약물 조성물이 악성 종양 예방 또는 치료 방법에 이용될 수 있다.
본 발명은 악성 종양에 대항하는 핵산 기반 치료학적 조성물에 대한 방법 및 조성물과 관련된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 Hsp47 뿐 아니라 Hsp47 및 p21 의 발현을 침묵화할 수 있는 RNAi 분자, 구조 및 조성물을 제공한다. 이 개시의 구조 및 조성물은 악성 종양 크기를 예방, 치료 또는 감소시키는데 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Hsp47 를 억제시키기 위한 siRNA 또는 shRNA 와 같은 RNAi 분자인 이중-가닥 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 구현예는 또한 p21 을 억제시키기 위한 RNAi 분자를 제공할 수도 있다.
특정 구현예에서, 저해성 핵산 분자는 안티센스 핵산 분자, 소 간섭 RNA (siRNA), 또는 이중-가닥 RNA (dsRNA) 일 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는 유전자 침묵화에 대해 활성일 수 있고, 그 예는 유전자 침묵화에 대해 활성인 dsRNA, 유전자 침묵화에 활성인 siRNA, 마이크로-RNA, 또는 shRNA 뿐 아니라 DNA-유도된 RNA (ddRNA), Piwi-상호작용 RNA (piRNA), 및 반복 관련 siRNA (rasiRNA) 이 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 방법은 악성 종양에서 Hsp47 및/또는 p21 의 전사 또는 번역을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 악성 종양 세포에서 Hsp47 및 p21 의 발현을 감소시키거나, 또는 Hsp47 의 발현을 감소시키는 방법을 포함하며, 여기서 세포는 인간 세포, 신생물 세포, 생체 내 세포 또는 시험관 내 세포일 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 신생물을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공할 수 있는데, 이때 신생물 암 세포는 이상 (aberrant) Hsp47 발현 수준을 보인다. 이 방법은 대상체에 유효량의 저해성 핵산 분자를 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 저해성 핵산 분자가 Hsp47 발현을 감소시키거나, 또는 RNAi 분자의 조합이 Hsp47 및 p21 의 발현을 줄임으로써 신생물이 치료된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 치료 이전과 또는 치료 부재 하에서 신생물 크기에 비해 신생물 크기를 감소시킬 수 있다.
각종 구현예에서, 저해성 핵산 분자는 리포솜, 중합체, 마이크로스피어, 나노입자, 유전자 치료 벡터 또는 네이키드 DNA 벡터로 전달될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 신생물을 갖는 대상체, 예를 들어 인간 환자의 치료 방법을 특징으로 하며, 여기서 신생물 암 세포는 Hsp47 을 발현한다. 특정 구현예에서, 방법은 유효량의 저해성 핵산 분자를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 저해성 핵산 분자는 Hsp47 폴리펩티드의 발현을 억제하거나, 또는 Hsp47 폴리펩티드 또는 p21 폴리펩티드 양자 모두의 발현을 억제하는, 안티센스 핵산 분자, 또는 RNAi 분자, 또는 그 조합이다.
특정 구현예에서, 신생물의 세포는 Hsp47 를 과발현한다.
특정 구현예에서, 신생물은 악성 종양, 또는 폐 암, 또는 췌장암일 수 있다.
본 발명의 구현예는 악성 종양 치료를 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 이때 상기 조성물은 RNAi 분자를 캡슐화하는 나노입자를 포함하고, 여기서 RNAi 분자는 Hsp47 을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 악성 종양 치료를 위한 대상체에 활성제 (active agent) 를 분배시키는 방법을 포함하고, 이때 상기 방법은 대상체에 상기 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명은 악성 종양의 치료를 위한 약학적 조성물을 포함하고, 이때 상기 조성물은 RNAi 분자를 캡슐화하는 나노입자를 포함하고, 여기서 RNAi 분자의 일부는 Hsp47 을 표적으로 하고, RNAi 분자의 일부는 p21 을 표적으로 한다.
본 발명은 또한 필요로 하는 포유동물에서 악성 종양의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화시키는 방법에 대한 것으로, 이 방법은 포유동물에 치료학적 유효량의, Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성인 RNAi 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 포유동물에서 악성 종양의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화시키는 방법을 포함하며, 이때 상기 방법은 포유동물에 치료적 유효량의, RNAi 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 RNAi 분자의 일부는 Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성이고, RNAi 분자의 일부는 p21 의 발현을 감소시키는데 활성이다.
특정 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 포유동물에서 암 줄기 세포의 성장 속도 또는 증식을 감소시키는 방법을 포함하며, 이때 상기 방법은 포유동물에 치료적 유효량의 RNAi 분자 포함 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 RNAi 분자의 일부는 Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성이고, RNAi 분자의 일부는 p21 의 발현을 감소시키는데 활성이다.
본 발명의 추가적인 구현예는 대상체에서 악성 종양의 치료를 위한 활성제를 분배시키는데 이용되기 위한 조성물을 제공할 수 있고, 여기서 상기 조성물은 리포솜 나노입자를 포함한다. 이 조성물은 악성 종양 치료를 위해 대상체의 기관에 활성제를 분배시키는 방법에서 이용될 수 있다.
도 1: 도 1 은 Hsp47 을 단일 표적으로서 이용하여 종양 성장 저해를 시험하는데 수행된 췌장암 모델의 생체 내 연구 결과를 나타낸다. 도 1 에서 나타낸 바와 같이, Hsp47 siRNA (2M) 를 함유하는 제형으로 치료된 그룹의 경우, 종양은 연구 과정 동안 성장 한다면 서서히 성장하였다. 검사된 체중 감량은 없었다. 반대로, 비히클 대조군 그룹의 종양은 22 일 만에 두배가 되었다. 결론적으로, Hsp47 siRNA 는 0.75 mpk 의 투여량에서 종양 성장을 완벽하게 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이는 Hsp47 siRNA 를 함유하는 제형이 강력한 항암 치료제인 것을 나타낸다.
도 2: 도 2 는 인간 암 세포주에서 Hsp47, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV 의 유전자 발현을 나타낸다.
도 3: 도 3 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 대한 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 4: 도 4 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 5: 도 5 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 6: 도 6 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 7: 도 7 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 8: 도 8 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 9: 도 9 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 10: 도 10 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정의 결과를 나타낸다. 수직 축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 삼각형 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 11: 도 11 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 빈 (open) 동그라미는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 채워진 동그라미 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 12: 도 12 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 13: 도 13 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 14: 도 14 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 15: 도 15 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정의 결과를 나타낸다. 수직축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료된 샘플이다. 상승 곡선에서 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. 평평한 곡선에서의 빈 동그라미 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 16: 도 16 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 상승 곡선에서 빈 동그라미는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. 평평한 곡선에서 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. 채워진 동그라미 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 17: 도 17 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 18: 도 18 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 19: 도 19 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 20: 도 20 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 21: 도 21 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 22: 도 22 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 23: 도 23 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 24: 도 24 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료된 샘플이다. 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. 삼각형 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 25: 도 25 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 빈 동그라미는 Hsp47 를 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 채워진 동그라미 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 26: 도 26 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 27: 도 27 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 28: 도 28 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 29: 도 29 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 30: 도 30 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 31: 도 31 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 32: 도 32 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 33: 도 33 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료된 샘플이다. 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. X 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 34: 도 34 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 빈 동그라미는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 빈 네모 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
도 35: 도 35 는 siRNA 의 트랜스펙션 후 2 일 째에 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 결장 암 세포 SW480 에서 아넥신 (annexin) V 및 PI 을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다.
도 36: 도 36 은 siRNA 의 트랜스펙션 후 2 일 째에 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 결장 암 세포 HCT116 에서 아넥신 V 및 PI 을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다.
도 37: 도 37 은 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 SW480 결장 암 세포에서 프로카스파아제-3 및 Hsp47 단백질의 발현을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다.
도 38: 도 38 은 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 HepG2 간암 세포에서 프로카스파아제-3 및 Hsp47 단백질의 발현을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다.
도 39: 도 39 는 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 A549 폐 암 세포에서 프로카스파아제-3 및 Hsp47 단백질의 발현을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다.
도 40: 도 40 은 Hsp47 siRNA 및 p21 siRNA 로 트랜스펙션된 결장 암 세포 SW480 에서 카스파아제-3/7 활성을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다. 이들 데이타는 결장암 세포에서 Hsp47 siRNA 및 p21 siRNA 의 조합물을 이용하면 카스파아제의 수준이 예상치 않게 유리하게 증가하고 세포가 놀랍게도 세포 사멸을 증가시킨다는 것을 보여준다.
본 발명은 대상체에서 신생물 치료를 위해 Hsp47 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키는 치료학적 조성물을 이용하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 신생물의 치료를 위한 Hsp47 핵산 분자 또는 폴리펩티드 및 p21 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키는 치료학적 조성물의 이용 방법을 제공한다.
추가적인 양태에서, 본 발명의 구현예는 암 줄기 세포 성장의 속도 또는 증식을 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명은 Hsp47 의 siRNA 저해제, 및 p21 의 저해제와 조합된 Hsp47 의 저해제를 이용한 치료에 의해 생체 내에서 암 줄기 세포의 성장 또는 증식이 억제될 수 있다는 놀라운 효과에 관한 것이다.
본 발명의 치료적 조성물은 siRNA, shRNA, 및 안티센스 RNA 와 같은 RNAi 분자를 비롯한 저해성 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명은 Hsp47 를 인코딩하는 DNA 를 억제하기 위한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이들을 발현하기 위한 벡터, 및 Hsp47 의 지배적인 음성 변이체를 포함한다.
일반적으로, 대상체가 폐암 또는 췌장암과 같은 신생물이 있는 것으로 진단받은 후, Hsp47 및 p21 의 억제, 및 Hsp47 의 억제를 포함하는 치료 방법이 선택된다.
본원에서 이용되는 바와 같은 Hsp47 을 억제하는 작용제의 예에는 Hsp47 생성 및/또는 활성을 억제하는 약물, 및 Hsp47 분해 및/또는 불활성화를 촉진하는 약물을 포함한다. Hsp47 생성을 억제하는 약물의 예에는 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, Hsp47 을 인코딩하는 DNA 에 대한 DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 발현하는 벡터를 포함한다.
본원에서 이용되는 바와 같은 p21 을 억제하는 작용제의 예에는 p21 생성 및/또는 활성을 억제하는 약물 및 p21 분해 및/또는 불활성화를 촉진하는 약물을 포함한다. p21 생성을 억제하는 약물의 예는 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, p21 을 인코딩하는 DNA 에 대한 DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 발현하는 벡터를 포함한다.
RNAi 분자
당업자는 보고된 서열이 경시적으로, 및 그에 따라 본원의 핵산 분자에 필요한 임의의 변화를 포함하도록 변화할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 구현예는 작은 핵산 분자를 사용하는 Hsp47 발현의 유전자 침묵화를 위한 조성물 및 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 추가적인 구현예는 작은 핵산 분자를 이용하는 Hsp47 발현 및 p21 발현의 유전자 침묵화를 위한 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
예를 들어 유전자 침묵화에 활성인 dsRNA, siRNA, 마이크로-RNA, 또는 유전자 침묵화에 대해 활성인 shRNA, 나아가 DNA-유도된 RNA (ddRNA), Piwi-상호작용 RNA (piRNA), 및 반복 관련 siRNA (rasiRNA) 과 같은, 본 발명의 RNAi 분자는 유전자 침묵화에 활성일 수 있다. 이러한 분자는 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
본원에서 개시된 조성물 및 방법은 대상체에서 각종 종류의 악성 종양을 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 방법은 Hsp47 을 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하고, Hsp47 및 p21 을 일제히 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하기 위해 조합되어 사용되거나 또는 풀링 (pool) 될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은, 악성 종양과 같은 Hsp47 과 관련된 병태 또는 장애뿐 아니라 질환의 유지 및/또는 발달과 관련되는 단백질 및/또는 단백질을 인코딩하는 유전자뿐 아니라, p21 단백질 및/또는 그 단백질을 인코딩하는 하는 유전자의 발현을 조정 또는 조절할 수 있는 핵산 분자, 또는 Hsp47 단백질 및/또는 그 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 조정 또는 조절할 수 있는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 Hsp47 및 p21 의 예시 서열을 참조하여 기재된다. 당업자는 본 발명의 다양한 측면 및 구현예가 임의의 관련된 Hsp47 또는 p21 유전자, 서열, 또는 변이체, 예컨대 동족체 유전자 및 전사 변이체, 및 다형성 (임의의 Hsp47 또는 p21 유전자와 연관된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 를 포함) 에 대한 것이라는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 RNAi 분자는 예를 들어 상보적 서열을 이용하거나, 또는 비표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 동요 (wobble) 염기쌍 (추가적인 표적 서열을 제공할 수 있음) 을 혼입함으로써, Hsp47 또는 p21 및 임의의 상동성 서열을 표적으로 할 수 있다.
미스매치가 확인되는 경우에, 비표준적 염기쌍, 예를 들어 미스매치 및/또는 동요 염기를 사용하여, 하나 초과의 유전자 서열을 표적으로 하는 핵산 분자를 생성할 수 있다.
예를 들어, UU 및 CC 염기쌍과 같은 비-표준적 염기쌍을 사용하여, 서열 상동성을 공유하는 상이한 표적에 대한 서열을 표적으로 할 수 있는 핵산 분자를 생성할 수 있다. 따라서, RNAi 분자는 상동성 유전자 사이에 보존되는 뉴클레오티드 서열을 표적으로 할 수 있으며, 단일 RNAi 분자를 사용하여 하나 초과의 유전자 발현을 저해할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 Hsp47 mRNA 의 임의 일부에 대해 활성인 RNAi 분자를 포함한다. RNAi 분자는 Hsp47 서열을 인코딩하는 임의의 mRNA 에 상보성인 서열을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명의 조성물 및 발명은 p21 mRNA 의 임의 일부에 대해 활성인 RNAi 분자를 포함한다. RNAi 분자는 p21 서열을 인코딩하는 임의의 mRNA 에 상보성인 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 RNAi 분자는 Hsp47 RNA 에 대항하여 활성을 가질 수 있고, 여기서, RNAi 분자는 예를 들어 악성 종양과 관련된 것으로 당업계에 공지되어 있는 돌연변이 Hsp47 유전자와 같은 변이체 Hsp47 인코딩 서열을 갖는 RNA 에 상보적인 서열을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 Hsp47 또는 p21 유전자 발현의 침묵화를 매개할 수 있는 뉴클리오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 바와 같이, RNAi 분자는 RNA 간섭, 예컨대 듀플렉스 RNA 예컨대 siRNA (소 간섭 RNA), miRNA (마이크로 RNA), shRNA (짧은 헤어핀 RNA), ddRNA (DNA-유도된 RNA), piRNA (Piwi-상호작용 RNA), 또는 rasiRNA (반복 관련 siRNA) 및 이의 변형된 형태를 초래하는 임의의 분자를 나타낸다. 이들 RNAi 분자는 상업적으로 입수가능하거나 공지된 서열 정보 등을 기반으로 설계되고 제조될 수 있다. 안티센스 핵산은 RNA, DNA, PNA, 또는 이의 복합체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 발현을 저해하는 DNA 및 RNA 로 구성된 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 작용제는 치료제로서 siRNA 를 함유한다. siRNA 분자는 약 10-50 개 이상 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 약 15-45 개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 약 19-40 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 19-23 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 표적 mRNA 에 대하여 RNAi 를 매개할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 설계 도구 및 키트, 예컨대 Ambion, Inc. (Austin, TX), 및 Whitehead Institute of Biomedical Research at MIT (Cambridge, MA) 에서 입수가능한 것들이 siRNA 의 설계 및 생성을 가능하게 한다.
악성 종양의 치료 방법
본 발명의 구현예는 Hsp47 및/또는 Hsp47 단백질의 발현을 하향 조절 또는 저해할뿐 아니라 p21 및/또는 p21 단백질의 발현을 하향 조절 또는 저해하는데 이용될 수 있는 RNAi 분자를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNAi 분자는 악성 종양과 같은 질환 또는 병태와 연관될 수 있는 Hsp47 일배체형 (haplotype) 다형태로부터 야기된 Hsp47 및/또는 Hsp47 단백질의 발현을 하향 조절 또는 저해할 수 있다.
Hsp47 단백질 또는 mRNA 수준, 및/또는 p21 단백질 또는 mRNA 수준의 모니터링이 유전자 침묵화를 특성화하고, 본 발명의 화합물 및 조성물의 효능을 측정하는데 이용될 수 있다.
본 개시의 RNAi 분자는 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하기 위해 기타 siRNA 와 조합되거나 또는 개별적으로 이용될 수 있다.
본 개시의 RNAi 분자는 악성 종양을 비롯하여, Hsp47 과 연관된 병태 또는 장애의 증상을 완화하거나 질환을 예방 또는 치료하기 위한 기타 공지의 약물과 함께 또는 조합되어 또는 개별적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 RNAi 분자는 서열-특이적 방식으로 Hsp47 또는 p21 의 발현을 조정 또는 저해하는데 이용될 수 있다.
본 개시의 RNAi 분자는 일련의 인접한 뉴클레오티드가 Hsp47 mRNA 또는 p21 mRNA 에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 가이드 가닥을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 악성 종양은 본 발명의 하나 이상의 RNAi 분자를 이용하는 RNA 간섭에 의해 치료될 수 있다.
악성 종양의 치료는 생체 외 또는 생체 내 동물 모델뿐 아니라 적합한 세포-기반 모델에서 특성화될 수 있다.
악성 종양의 치료는 발병된 조직의 세포에서 Hsp47 mRNA 의 수준 또는 Hsp47 단백질의 수준을 측정하고/하거나 발병된 조직의 세포에서 p21 mRNA 의 수준 또는 p21 단백질의 수준을 측정함으로써 특성화될 수 있다.
악성 종양의 치료는 발병된 기관 또는 조직의 비침습성 의학 스캐닝에 의해 특성화될 수 있다.
본 발명의 구현예는 이를 필요로 하는 대상체에서 Hsp47 과 관련된 질환 또는 병태의 증상을 예방, 치료 또는 완화하는 방법을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, Hsp47 siRNA 및 p21 siRNA 의 조합은 암 세포 사망의 뜻밖에도 유리한 증가를 제공할 수 있다. 추가 구현예에서, Hsp47 siRNA 및 p21 siRNA 의 조합은 암 세포 증식에서 뜻밖의 유리한 감소를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 악성 종양의 증상을 예방, 치료 또는 완화하는 방법은 대상체에 본 발명의 RNAi 분자를 투여하여 대상체 또는 유기체에서 Hsp47 유전자 및/또는 p21 유전자의 발현을 조정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 RNAi 분자와 세포 또는 유기체를 접촉함으로써, 세포 또는 유기체 내 Hsp47 유전자의 발현을 하향 조절하는 방법을 고려한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 2 이상의 RNAi 분자와 세포 또는 유기체를 접촉함으로써, 세포 또는 유기체 내 Hsp47 유전자 및 p21 유전자의 발현을 하향 조절하는 방법을 고려한다.
저해성 핵산 분자는 유전자 발현이 감소되도록 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 분자로서 이용될 수 있는 뉴클레오티드 올리고머일 수 있다. 한 접근 방식에서, 유전자 저해성 핵산 분자는 유전자 발현의 RNA 간섭 (RNAi)-매개 녹다운에 사용되는 이중-가닥 RNA 이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 올리고머의 8 내지 25 개 (예를 들어, 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 개) 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자가 생성된다. dsRNA 는 듀플렉스화된 RNA 의 2 개 상보적 가닥, 또는 자가-듀플렉스화된 단일 RNA 가닥 (소 헤어핀 (sh)RNA) 일 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 는 약 21 또는 22 개 염기쌍이지만, 더 짧거나, 약 29 개 뉴클레오티드까지 더 길 수도 있다. 이중 가닥 RNA 는 표준 기술, 예를 들어 화학적 합성 또는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 키트는, 예를 들어 Ambion (Austin, Tex.) 및 Epicentre (Madison, Wis.) 로부터 이용가능하다.
포유동물 세포에서 dsRNA 를 발현시키는 방법은 Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002; Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al., Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; 및 Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-505 2002 에 기재되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참고로 포함된다.
Hsp47 유전자에 "상응하는" 저해성 핵산 분자는 이중-가닥 저해성 핵산 분자의 각 가닥이 표적 Hsp47 유전자의 상보적 가닥에 결합할 수 있도록 이중-가닥 유전자의 적어도 단편을 포함한다. 저해성 핵산 분자는 참조 Hsp47 서열에 대한 완벽한 대응을 가질 필요는 없다.
하나의 구현예에서, siRNA 는 표적 핵산과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 1-2 개 염기쌍 미스매치를 갖는 19 개 염기쌍 듀플렉스가 본 발명의 방법에서 유용한 것으로 간주된다. 다른 구현예에서, 저해성 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 미스매치를 나타낸다.
본 발명에 의해 제공된 저해성 핵산 분자는 siRNA 에 제한되지 않으나, Hsp47 또는 p21 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키기에 충분한 임의의 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 제공된 DNA 서열은 예를 들어, 치료적 안티센스 핵산 분자의 발견 및 개발에 사용됨으로써 인코딩된 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 또한 촉매적 RNA 분자 또는 리보자임을 제공한다. 이러한 촉매적 RNA 분자는 표적 핵산 분자의 생체내 발현을 저해하는데 사용될 수 있다. 안티센스 RNA 내 리보자임 서열의 봉입물은 분자에 대해 RNA-절단 활성을 부여함으로써, 구축물의 활성을 증가시킨다. 표적 RNA-특이적 리보자임의 설계 및 용도가 [Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988], 및 US 2003/0003469 A1 에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 촉매적 핵산 분자는 헤머헤드 (hammerhead) 또는 헤어핀 모티프에서 형성된다. 이러한 헤머헤드 모티프는 [Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992] 에 의해 기재되어 있다. 헤어핀 모티프의 예는 [Hampel et al., Biochemistry, 28:4929, 1989], 및 [Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990] 에 의해 기재되어 있다. 당업자는 효소 핵산 분자에 필요한 것이, 하나 이상의 표적 유전자 RNA 에 상보적이며 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 기질 결합 부위 내 또는 이를 둘러싸고 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 특이적 기질 결합 부위라는 것을 인지할 것이다.
표적의 억제는, 억제제를 이용하지 않는 세포와 비교하여 세포에서 상응하는 단백질의 발현 또는 활성이 억제되는 것으로써 측정될 수 있다. 단백질의 발현은 임의의 공지된 기술에 의해 평가될 수 있고; 이의 예는 항체를 이용하는 면역침강 방법, EIA, ELISA, IRA, IRMA, 웨스턴 블롯 방법, 면역조직화학 방법, 면역세포화학 방법, 유세포측정 방법, 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 이의 고유 단편과 특히 하이브리드화하는 핵산, 또는 상기 핵산의 전사 생성물 (예를 들어 mRNA) 또는 스플라이싱 생성물을 이용하는 다양한 하이브리드화 방법, 노덧 블롯 방법, 서던 블롯 방법 및 다양한 PCR 방법을 포함한다.
단백질의 활성은, 임의의 공지된 방법, 예컨대 면역침강 방법, 웨스턴 블롯 방법, 질량 분석 방법, 풀-다운 (pull-down) 방법, 또는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 방법에 의해, 예를 들어 Raf-1 (특히 인산화된 Raf-1) 또는 EGFR (특히 인산화된 EGFR) 과 같은 단백질에 대한 결합을 포함하는 단백질의 공지된 활성을 분석함으로써 평가할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 상기 양태들 중 임의의 저해성 핵산 분자를 인코딩하는 벡터를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 포유동물 세포에서 발현에 적합한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 조성물로 제형화되는 활성 RNA 간섭 유도 성분의 양은 투여의 이점을 초과하는 역효과를 초래하지 않는 양일 수 있다. 이러한 양은 배양된 세포를 사용하는 시험관내 시험, 또는 마우스, 랫트, 개 또는 돼지 등과 같은 모델 동물 또는 포유동물에서의 시험에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 시험 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
제형화된 활성 성분의 양은 작용제 또는 조성물이 투여되는 방식에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들어, 복수의 조성물 단위가 하나의 투여에 사용되는 경우, 조성물의 하나의 단위로 제형화될 활성 성분의 양은 하나의 투여에 필요한 활성 성분의 양을 상기 복수의 단위로 나누어 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 Hsp47 또는 p21 를 억제하기 위한 작용제 또는 조성물의 제조 방법, 및 Hsp47 을 억제하거나 또는 Hsp47 과 p21 을 억제하는 조성물의 악성 종양을 감소 또는 수축시키기 위한 용도에 관한 것이다.
RNA 간섭
RNA 간섭 (RNA Interference) (RNAi) 은 짧은 간섭하는 RNA (siRNA) 에 의해 매개되는 동물에서의 서열-특이적 전사후 유전자 침묵화를 지칭한다. 예를 들어, [Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Fire et al., Nature, 1998, Vol. 391, pp. 806811; Sharp, Genes & Development, 1999, Vol. 13, pp. 139-141] 을 참고한다.
세포에서의 RNAi 반응은 이중가닥 RNA (dsRNA) 에 의해 유발될 수 있지만, 그 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않고 있다. 세포에서의 특정 dsRNA 는 다이서 (Dicer) 효소, 리보뉴클레아제 III 효소의 작용을 받을 수 있다. 예를 들어, [Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Hammond et al., Nature, 2000, Vol. 404, pp. 293-296] 을 참고한다. 다이서는 dsRNA 를 dsRNA 의 더 짧은 조각인 siRNA 로 가공할 수 있다.
일반적으로, siRNA 는 약 21 내지 약 23 개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 약 19 개 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 듀플렉스 영역을 포함할 수 있다.
RNAi 은 RNA 유도되는 침묵화 복합체 (RNA induced silencing complex) (RISC) 로서 알려진 엔도뉴클레아제 복합체를 수반한다. siRNA 는 RISC 복합체에 진입하여 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 RNA 표적의 절단을 매개하는 안티센스 또는 가이드 가닥을 갖는다. siRNA 의 다른 가닥은 패신저 (passenger) 가닥이다. 표적 RNA 의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 영역의 중간에서 일어난다. 예를 들어, [Elbashir et al., Genes & Development, 2001, Vol. 15, pp. 188-200] 을 참고한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "센스 가닥" 은 siRNA 분자의 대응하는 안티센스 가닥의 적어도 일부분에 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 핵산 서열과 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안티센스 가닥" 은 표적 핵산 서열의 적어도 일부분에 부분적으로 또는 전체적으로 상보적인 siRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. siRNA 분자의 안티센스 가닥은 siRNA 분자의 대응하는 센스 가닥의 적어도 일부분에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다.
RNAi 분자는 RNA 간섭을 서열-특이적 방식으로 매개함으로써 유전자 발현을 하향 조절 또는 녹 다운할 수 있다. 예를 들어, [Zamore et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33; Elbashir et al., Nature, 2001, Vol. 411, pp. 494-498; Kreutzer et al., WO2000/044895; Zernicka-Goetz et al., WO2001/36646; Fire et al., WO1999/032619; Plaetinck et al., WO2000/01846; Mello et al., WO2001/029058] 을 참고한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 발현에 관한 용어들 "저해," "하향-조절," 또는 "감소" 는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 수준, 또는 인코딩된 단백질 중 하나 이상의 활성이 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재시에 관찰되는 것보다 아래로 감소되는 것을 의미한다. 예를 들어, 발현의 수준, mRNA 의 수준, 또는 인코딩된 단백질 활성의 수준은 본 발명의 RNAi 분자 또는 siRNA 의 부재시에 관찰되는 것보다 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 90%, 또는 그 이상 만큼 감소될 수 있다.
RNAi 분자는 또한 바이러스 유전자 발현을 녹 다운하고, 그에 따라 바이러스 복제에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.
RNAi 분자는 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥: 센스 가닥 또는 패신저 가닥, 및 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로부터 만들어질 수 있다. 가이드 및 패신저 가닥은 적어도 부분적으로 상보적이다. 가이드 가닥 및 패신저 가닥은 약 15 내지 약 49 개의 염기쌍을 갖는 듀플렉스 영역을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 의 듀플렉스 영역은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49 개의 염기쌍을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 RISC 복합체에서 활성일 수 있으며, RISC 에 관해 활성인 듀플렉스 영역의 길이를 갖는다.
추가 구현예에서, RNAi 분자는 다이서 기질로서 활성이어서, RISC 복합체에서 활성일 수 있는 RNAi 분자로 전환될 수 있다.
일부 양태에서, RNAi 분자는 상보적 가이드 및 패신저 서열 부분을 긴 분자의 대향하는 말단들에 가질 수 있으며, 그에 따라 분자는 상보적 서열 부분들로 듀플렉스 영역을 형성할 수 있고, 가닥들은 듀플렉스 영역의 하나의 말단에 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결된다. 예를 들어, 헤어핀 배열, 또는 스템 및 루프 배열. 가닥들과의 링커 상호작용은 공유 결합 또는 비-공유 상호작용일 수 있다.
본 공개의 RNAi 분자는 핵산의 센스 영역을 핵산의 안티센스 영역에 연결시키는 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 2 개 이상의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 뉴클레오티드 길이의 링커일 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 핵산 압타머 (aptamer) 일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "압타머" 또는 "핵산 압타머" 는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 지칭하며, 여기서 상기 핵산 분자는 그것의 자연적 환경에서 표적 분자에 의해 인지되는 서열을 포함하는 서열을 갖는다. 대안적으로, 압타머는 표적 분자에 결합하는 핵산 분자일 수 있으며, 여기에서 표적 분자는 핵산에 자연적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 압타머는 단백질의 리간드-결합 도메인에 결합하여, 이로써 천연 발생 리간드와 단백질의 상호작용을 방지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, [Gold et al., Annu Rev Biochem, 1995, Vol. 64, pp. 763-797; Brody et al., J. Biotechnol., 2000, Vol. 74, pp. 5-13; Hermann et al., Science, 2000, Vol. 287, pp. 820-825] 를 참고한다.
비-뉴클레오티드 링커의 예는 무염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리탄화수소, 또는 다른 폴리머 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 예컨대 2 내지 100 개의 에틸렌 글리콜 단위체를 갖는 것들을 포함한다. 일부 예가 [Seela et al., Nucleic Acids Research, 1987, Vol. 15, pp. 3113-3129; Cload et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 6324-6326; Jaeschke et al., Tetrahedron Lett., 1993, Vol. 34, pp. 301; Arnold et al., WO1989/002439; Usman et al., WO1995/006731; Dudycz et al., WO1995/011910, and Ferentz et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, Vol. 113, pp. 4000-4002] 에 기재되어 있다.
RNAi 분자는 듀플렉스 영역으로부터의 오버행을 하나 이상 가질 수 있다. 오버행은 비-염기쌍, 단일 가닥 영역이며, 1 내지 8 개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상일 수 있다. 오버행은 3'-말단 오버행일 수 있으며, 여기서 가닥의 3'-말단은 1 내지 8 개 뉴클레오티드의 단일 가닥 영역을 갖는다. 오버행은 5'-말단 오버행일 수 있으며, 여기서 가닥의 5'-말단은 1 내지 8 개 뉴클레오티드의 단일 가닥 영역을 갖는다.
RNAi 분자의 오버행은 동일한 길이를 가질 수 있거나, 또는 상이한 길이를 가질 수 있다.
RNAi 분자는 하나 이상의 블런트 엔드 (blunt end) 를 가질 수 있으며, 여기에서 듀플렉스 영역은 오버행으로 끝나지 않고, 가닥들은 듀플렉스 영역의 말단까지 염기쌍을 이룬다.
본 공개의 RNAi 분자는 하나 이상의 블런트 엔드를 가질 수 있거나, 또는 하나 이상의 오버행을 가질 수 있거나, 또는 블런트 엔드와 오버행 말단의 조합을 가질 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있거나, 또는 오버행에 있을 수 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있거나, 또는 오버행에 있을 수 있다.
RNAi 분자의 가닥의 5'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있으며, 한편 3'-말단은 오버행에 있다. RNAi 분자의 가닥의 3'-말단은 블런트 엔드에 있을 수 있으며, 한편 5'-말단은 오버행에 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 양쪽 말단은 블런트 엔드이다.
추가 구현예에서, RNAi 분자의 양쪽 말단은 오버행을 갖는다.
5'- 및 3'-말단의 오버행은 상이한 길이를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 분자는 블런트 엔드를 가질 수 있으며, 여기에서 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다.
추가 구현예에서, RNAi 분자는 블런트 엔드를 가질 수 있으며, 여기에서 안티센스 가닥의 3'-말단 및 센스 가닥의 5'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다.
RNAi 분자는 듀플렉스 영역의 염기 쌍형성에서 미스매치를 가질 수 있다.
RNAi 분자의 오버행에서의 임의의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드일 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 5'-말단에 있을 수 있으며, 여기에서 RNAi 분자의 다른 가닥의 3'-말단은 오버행을 갖지 않을 수 있거나, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 갖지 않을 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드는 3'-말단에 있을 수 있으며, 여기에서 RNAi 분자의 다른 가닥의 5'-말단은 오버행을 갖지 않을 수 있거나, 또는 데옥시리보뉴클레오티드 오버행을 갖지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자의 오버행 뉴클레오티드 중 하나 이상, 또는 전부는 2'-데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
다이서 기질 RNAi 분자
일부 양태에서, RNAi 분자는 가공되어 RISC 활성 RNAi 분자를 초래할 수 있는, 다이서 기질로서 적합한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, Rossi 등, US2005/0244858 을 참고한다.
다이서 기질 dsRNA 은 다이서에 의해 가공되어 활성 RNAi 분자를 생산하기에 충분한 길이를 가질 수 있고, 추가로 하기 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 다이서 기질 dsRNA 는 비대칭일 수 있으며, 예를 들어, 3' 오버행을 안티센스 가닥에 갖고, (ii) 다이서 기질 dsRNA 는 활성 RNAi 분자로의 dsRNA 의 다이서 결합 및 가공의 방향을 지시하는 수식된 3' 말단을 센스 가닥에 가질 수 있다.
p21 에 대한 RNAi 분자
p21 mRNA 을 표적으로 하는 본 발명의 RNAi 분자의 예를 표 1 에 나타낸다.
표 1: p21 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
표 1 에서의 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 를 지칭한다. 소문자 a, g, c, t 는 각각 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C 및 티미딘을 나타낸다. mU 는 2'-메톡시-U 이다.
p21 mRNA 를 표적으로 하는 본 발명의 RNAi 분자의 예는 표 2 에 나타낸다.
표 2: p21 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00003
표 2 에 대한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 을 지시한다. 소문자 a, u, g, c, t 는 2'-데옥시-A, 2'-데옥시-U, 2'-데옥시-G, 2'-데옥시-C, 및 데옥시티미딘 (dT = T = t) 를 각각 지시한다. 밑줄은 2'-OMe-치환된, 예를 들어, U 를 지시한다. N 은 A, C, G, U, U, a, c, g, u, t, 또는 수식된, 역전된 또는 화학적으로 수식된 뉴클레오티드이다.
본원에서 이용되는 바, RNAi 분자는 RNA 간섭, 예컨대 듀플렉스 RNA 예컨대 siRNA (소 간섭 RNA), miRNA (마이크로 RNA), shRNA (짧은 헤어핀 RNA), ddRNA (DNA-유도된 RNA), piRNA (Piwi-상호작용 RNA), 또는 rasiRNA (반복 관련 siRNA) 및 이의 변형된 형태를 초래하는 임의의 분자를 나타낸다. 이들 RNAi 분자는 상업적으로 입수가능하거나 공지된 서열 정보 등을 기반으로 설계되고 제조될 수 있다. 안티센스 핵산은 RNA, DNA, PNA, 또는 이의 복합체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 발현을 저해하는 DNA 및 RNA 로 구성된 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 작용제는 치료제로서 siRNA 를 함유한다. siRNA 분자는 약 10-50 개 이상 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 약 15-45 개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 약 19-40 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. siRNA 분자는 19-23 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 표적 mRNA 에 대하여 RNAi 를 매개할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 설계 도구 및 키트, 예컨대 Ambion, Inc. (Austin, TX), 및 Whitehead Institute of Biomedical Research at MIT (Cambridge, MA) 에서 입수가능한 것들이 siRNA 의 설계 및 생성을 가능하게 한다.
p21 는 인간을 포함해 각종 동물에 존재한다. 인간 CDKN1A (p21) 에 대한 서열 정보는 다음에서 찾아진다: NM_000389.4, NM_078467.2, NM_001291549.1, NM_001220778.1, NM_001220777.1 (NP_001207707.1, NP_001278478.1, NP_001207706.1, NP_510867.1, NP_000380.1).
예의 표적 p21 mRNA 의 핵산 서열은 GenBank 접근 번호 NM_000389.4 (CDKN1A) 에 개시되어 있고, 이는 2175 뉴클레오티드 길이이다.
Hsp47 에 대해 표적으로 하는 RNAi 분자
일부 구현예에서, 본 발명은 열 충격 단백질 47 (Hsp47), 콜라겐-특이적 분자 샤페론 (세포내 수송 및 성숙을 위한 것) 의 발현을 조정하기 위한 다양한 RNAi 분자 및 조성물을 제공할 수 있다.
Hsp47 에 대한 siRNA 의 일부 예가 본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 인용 삽입되어 있는 US 8,710,209 에 제공되어 있다.
Hsp47 또는 그의 상동성 유전자 서열은 예를 들어 GenBank 접근 번호 AB010273 (인간), X60676 (마우스), 또는 M69246 (래트, gp46) 로서 개시되어 있다.
Hsp47 을 억제하기 위한 작용제가 섬유증 저해에 대해 개시된 바 있다. 예를 들어, 본원에서 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 통합되어 있는 US 8,173,170 B2 를 참조한다. 그러나, 악성 종양 발달, 진행 및 성장에 있어서 Hps47 의 저해 작용에 대한 정보는 제한되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자의 각 가닥은 뉴클레오티드 길이가 15 내지 60 일 수 있거나, 또는 15 내지 40, 또는 19 내지 25 일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Hsp47 을 표적으로 하는 RNAi 분자인 악성 종양 치료용 RNAi 분자 함유 약학적 조성물을 제공한다.
Hsp47 mRNA 을 표적으로 하는 본 개시의 RNAi 분자의 예는 표 3 에 나타낸다.
표 3: Hsp47 에 대한 RNAi 분자 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
표 3 에 대한 기호설명: 대문자 A, G, C 및 U 는 각각 리보-A, 리보-G, 리보-C 및 리보-U 에 대한 것이다. 소문자 d 는 “데옥시”를 나타낸다.
Hsp47 을 표적으로 하는 본 개시의 RNAi 분자의 추가적인 예는 표 4 에 나타낸다.
표 4: Hsp47 에 대한 RNAi 분자 서열 및 대조군
Figure pct00006
표 4 에 대한 기호설명: 명칭: rX 는 리보뉴클레오티드를 나타내고, mX 는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드를 나타내고, 25rX 는 2'-5' 연결을 갖는 리보뉴클레오티드를 나타내고, C3 는 1,3-프로판디올 스페이서를 나타내고, idAB 는 역전위 1,2-디데옥시-D-리보오스를 나타내고, P 는 3'-말단 상 포스페이트기를 나타낸다.
RNAi 분자의 이용 방법
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 분자의 직접 적용에 의해, 또는 담체 또는 희석제와 조합된 분자로, 세포 또는 조직에 전달될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 담체 또는 희석제, 또는 세포 내로의 진입을 보조하고, 촉진하거나 용이하게 하도록 작용하는 임의의 다른 전달 비히클, 예를 들어 바이러스 서열, 바이러스 물질, 또는 지질 또는 리포솜 제형과 분자의 직접 적용에 의해 세포, 조직, 기관 또는 대상에 전달 또는 투여될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 양이온성 지질과 복합화되고, 리포솜 내에 패키징되고, 또는 다르게는 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 핵산 또는 핵산 복합체는 직접 진피 적용, 경피 적용 또는 주사를 통해, 생체외, 또는 생체내로 관련 조직에 국소 투여될 수 있다.
전달 시스템은 예를 들어, 수성 및 비수성 겔, 크림, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 리포솜, 연고, 수용액 및 비수용액, 로션, 에어로졸, 탄화수소 베이스 및 분말을 포함할 수 있으며, 가용화제 및 투과 증강제와 같은 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명의 저해성 핵산 분자 또는 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제 내에, 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 종래의 약학적 실행을 이용하여, 과도한 세포 증식에 의해 초래되는 질환을 앓고 있는 환자에게 화합물을 투여하기 위한 적합한 제형 또는 조성물을 제공할 수 있다. 투여는 환자가 증상을 보이기 전에 시작될 수 있다. 임의의 적절한 투여 경로가 이용될 수 있으며, 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 종양내, 근육내, 두개내, 안와내, 안구, 심실내, 간내, 관절낭내, 척수강내, 수조내, 복강내, 비강내, 에어로졸, 좌제, 또는 경구 투여일 수 있다. 예를 들어, 치료적 제형은 액체 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있고; 경구 투여를 위해서는, 제형은 정제 또는 캡슐 형태일 수 있고; 비강내 제형을 위해서는, 분말, 점비액 또는 에어로졸 형태일 수 있다.
본 개시물의 조성물 및 방법은, 핵산 분자의 발현을 허용하는 방식으로 본 발명의 하나 이상의 RNAi 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 RNAi 분자는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 핵산 분자의 일시적 발현이 가능하도록 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.
예를 들어, 벡터는 듀플렉스의 RNAi 분자의 두 가닥 모두, 또는 자가 상보성이며 따라서 RNAi 분자를 형성하는 단일 핵산 분자를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터는 둘 이상의 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 진핵생물 프로모터로부터 세포 내에 발현될 수 있다. 당업자는 임의의 핵산이 적절한 DNA/RNA 벡터로부터 진핵생물 세포에서 발현될 수 있다는 것을 인지하고 있다.
일부 양태에서, 발현 구축물에 의해 인코딩된 dsRNA 구축물의 전사를 위하여, 세포 내로 발현 구축물이 도입되도록 바이러스 구축물을 사용할 수 있다.
지질 제형은 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사, 또는 경구 또는 흡입으로 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 동물에 투여될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 투여하기 위한 약학적으로 허용가능한 제형이 공지되어 있으며 사용될 수 있다.
상기 방법의 하나의 구현예에서, 저해성 핵산 분자는 약 5 내지 500 mg/m2/일, 예를 들어 5, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 mg/m2/일의 투여량으로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 저해성 핵산 분자는 약 1 내지 100 mg/kg 의 투여량으로, 예를 들어 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75, 또는 100 mg/kg 로 전신 투여된다.
추가 구현예에서, 투여량은 약 25 내지 500 mg/m2/일의 범위일 수 있다.
제형 제조에 대해 당업계에 공지된 방법은 예를 들어, ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000] 에서 밝혀진다.
비경구 투여용 제형은 예를 들어, 부형제, 멸균수, 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기원의 오일, 또는 수소화된 나프탈렌을 함유할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 사용하여 화합물의 배출을 제어할 수 있다. 저해성 핵산 분자에 대한 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능 주입 시스템 및 리포솜을 포함한다. 흡입용 제형은 부형제, 예를 들어 락토오스를 함유할 수 있거나, 예를 들어 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있거나, 점비액 형태, 또는 겔로서의 투여용 유성 용액일 수 있다.
제형은 신생물성 질환 또는 병태에 대한 치료요법이 제공되도록, 치료적 유효량 (예를 들어, 병태를 예방, 제거 또는 감소시키는 양) 으로 인간 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 올리고머의 바람직한 투여량은 장애의 유형 및 정도, 특정 환자의 전체 건강 상태, 화합물 부형제의 제형, 및 이의 투여 경로와 같은 변수에 따라 좌우될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 Hsp47 관련 질환 치료에 유효할 수 있다. 이질환의 예는 비정상 세포 증식으로 인한 질환, 및 Hsp48 과발현을 나타내는 질환을 포함한다.
악성 종양을 감소시키기 위한 상기 모든 방법은 시험관내 방법 또는 생체내 방법일 수 있다. 투여량은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 배양 세포 등을 사용하는 시험관내 시험에 의해 결정될 수 있다. 유효량은 종양 크기를 종양 크기의 10% 이상, 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 최대 100% 로 감소시키는 양일 수 있다. 유효량은 암 세포 증식을 대조군과 비교할 때 10% 이상, 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 최대 100% 까지 감소시키는 양일 수 있다.
비정상 세포 증식으로 인한 질환의 예는 악성 종양, 과다형성, 켈로이드, 쿠싱 증후군, 원발성 알도스테론증, 홍반증, 진성 적혈구 증가증, 백반증, 과증식성 반흔, 편평 태선 및 흑자증을 포함한다.
Hsp47 과발현으로 인한 질환의 예는 악성 종양을 포함한다.
암의 예는 육종 예컨대 섬유육종, 악성 섬유질 조직구종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 맥관육종, 카포시 육종, 림프관육종, 활막 육종, 연골육종, 및 골육종, 암종 예컨대 뇌 종양, 두경부 암종, 유방 암종, 폐 암종, 식도 암종, 위 암종, 십이지장 암종, 충수 암종, 결장 암종, 직장 암종, 간 암종, 췌장 암종, 담낭 암종, 담관 암종, 항문 암종, 신장 암종, 요관 암종, 방광 암종, 전립선 암종, 고환 암종, 자궁 암종, 난소 암종, 피부 암종, 백혈병, 및 악성 림프종을 포함한다.
암은 상피성 악성종양 및 비-상피성 악성종양을 포함한다. 암은 신체의 임의 부위, 예를 들어 뇌, 두경부, 가슴, 사지, 폐, 심장, 흉선, 식도, 위, 소장 (십이지장, 공장, 회장), 대장 (결장, 맹장, 충수, 직장), 간, 췌장, 담낭, 신장, 요로, 방광, 전립선, 고환, 자궁, 난소, 피부, 횡문근, 평활근, 활막, 연골, 골, 갑상선, 부신, 복막, 장간막, 골수, 혈액, 혈관계, 림프계 예컨대 림프절, 림프액 등에 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 암은 호르몬- 또는 성장 인자-독립적 증식을 나타내는 암 세포를 포함한다. 추가 구현예에서, 암은 Hsp47 과발현을 나타내는 암 세포를 포함한다.
나노입자
본 발명의 구현예는 리포솜 나노입자 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 이온화 분자가 지질-유사 분자의 이중층을 가질 수 있는 리포솜 조성물을 형성하는데 사용될 수 있다.
나노입자 조성물은 본 발명의 이온화 분자 중 하나 이상을 리포솜 구조, 이중층 구조, 미셀, 라멜라 구조 또는 그 혼합물로 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 비히클 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 활성제의 전달에 적합한 액체 비히클은 약학적으로 허용가능한 액체 비히클일 수 있다. 액체 비히클은 유기 용매, 또는 물과 유기 용매의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예는 크기가 10 내지 1000 nm 인 지질 나노입자를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 나노입자는 크기가 10 내지 150 nm 일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 리포솜 나노입자는 RNAi 분자를 캡슐화할 수 있고, 인간 혈청에 1 시간 노출 후 캡슐화된 RNAi 분자 적어도 80% 를 보유할 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 본 발명의 조성물을 대상체에 투여함으로써 악성 종양을 치료하기 위한 대상체의 기관에 활성제를 분배시키는 방법을 추가로 고려한다. 표적이 될 수 있는 기관은 폐, 간, 췌장, 결장, 심장, 뼈, 피부, 창자 및 관절을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 대상체에 투여함으로써 폐 악성 종양 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 다양한 약학적 제형을 제공한다.
본원에서 약학적 제형은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께, 본 발명의 약물 담체 또는 지질뿐 아니라 활성제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 설명서에서의 활성제는 siRNA, 악성 종양용 활성제, 나아가 임의의 소형 분자 약물을 포함한다.
약물 담체는 별세포에 다다르는 조성물을 표적으로 할 수 있다. 약물 담체는 그 내부에 약물을 포함할 수 있거나, 또는 약물-함유 물질의 외부에 부착되어 있을 수 있거나, 또는 레티노이드 유도체 및/또는 비타민 A 유사체가 약물 담체에 포함되어 있고 적어도 부분적으로 억제제의 외부에 노출되어 있는 한 약물과 혼합될 수 있다. 조성물 또는 작용제는 적절한 물질로 예를 들어 장용 코팅 또는 시간 경과에 따라 붕괴되는 물질 또는 적절한 약물 방출 시스템에 혼입될 수 있는 물질로 피복될 수 있다.
본 발명의 약학적 제형은 하기 각각 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 표면 활성제, 희석제, 부형제, 보존제, 안정화제, 염료 및 현탁제.
약학적 제형을 위한 일부 약학적 담체, 희석제 및 성분뿐 아니라 본 발명의 화합물 및 조성물을 제형화하고 투여하는 방법이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990)] 에 기술되어 있다.
보존제의 예는 나트륨 벤조에이트, 아스코르브산, 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다.
표면 활성제의 예는 알코올, 에스테르, 술페이트화 지방족 알코올을 포함한다.
부형제의 예는 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 결정화 셀루ㅊㄹ로오스, 만니톨, 경질 무수 실리케이트, 마그네슘 알루미네이트, 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트, 합성 알루미늄 실리케이트, 칼슘 카르보네이트, 나트륨산 카르보네이트, 칼슘 히드로겐 포스페이트 및 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한다.
현탁제의 예는 코코넛 오일, 올리브 오일, 참깨 오일, 땅콩 오일, 콩, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 메틸아세테이트-메타크릴레이트 공중합체 및 에스테르 프탈레이트를 포함한다.
유전자 침묵화에 활성인 하나 이상의 분자의 전달을 위한 본 발명의 치료적 제형은 그를 필요로 하는 포유동물에 투여될 수 있다. 리포솜에 캡슐화될 수 있는 제형 및 활성제의 치료적 유효량이 악성 종양의 예방 또는 치료를 위해 포유동물에 투여될 수 있다.
투여 경로는 국소 또는 전신일 수 있다.
본 발명의 치료적 유효량의 제형이 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 및 경구를 비롯한 각종 경로에 의해 투여될 수 있다.
투여 경로는 예를 들어 근육내, 피하, 정맥내, 골수내 주사뿐 아니라 척수강내, 직접 심실내, 복강내, 비강내, 또는 안내 주사를 비롯한 비경구 전달을 포함할 수 있다.
제형은 또한 데폿 (depot) 주사, 삼투 펌프 등을 비롯해 지속적 또는 제어적 방출 투여 형태로, 연장되고/되거나 일정시간 동안 지속적 또는 제어적 방출 투여 형태로, 소정의 속도로 간헐적 투여로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 및 비경구 경로를 비롯하여 다양한 경로를 통해 투여될 수 있고, 그 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 경구, 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 폐내, 기도내, 기관내, 기관지내, 코, 직장, 동맥내, 내문, 심실내, 골수내, 림프절내, 림프관내, 뇌 내, 척수강내, 뇌실내, 점막관통, 경피, 비강내, 복강내, 및 자궁내 경로를 포함하고, 각 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제형될 수 있다. 이러한 투여 형태 및 제형 방법은 임의 공지된 투여 형태 및 방법으로부터 적절한 경우 선택될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Hyojun Yakuzaigaku, Standard Pharmaceutics, Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003] 을 참조한다.
경구 투여에 적합한 투여 형태의 예에는 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함되고: 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액체, 현탁물, 에멀젼, 겔 및 시럽; 비경구 투여에 적합한 투여 형태의 예에는 주사용 용액, 주사용 현탁물, 주사용 에멀젼 및 바로쓸 수 있는 주사와 같은 주사를 포함한다. 비경구 투여용 제형은 수성 및 비수성 등장성 멸균액 또는 현탁물과 같은 형태일 수 있다.
예를 들어 볼루스 주사 또는 지속 주입에 의한 비경구 투여를 위한 약학적 제형은 수용성 형태의 활성 제형의 수성 용액을 포함한다. 활성 화합물의 현탁물은 적절한 오일 주사 현탁물로서 제조될 수 있다. 수성 주사 현탁물은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 텍스트란과 같은 현탁물의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 임의로는, 현탁물은 적합한 안정화제 또는 고농축 용액 제조를 허용하는 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수도 있다.
주사용 제형이 예를 들어 앰플 또는 다투여 용기와 같이, 단위 투여 형태로 보존제를 첨가하여 제공될 수 있다. 제형은 현탁물, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 오일 또는 수성 비히클 내에 취할 수 있고, 현탁, 가용화 및/또는 분산제와 같은 제형 작용제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 이용 전에 예를 들어 멸균의 발열원-미함유 물과 구성되기 위한 분말 형태일 수 있다.
앞서 기술된 제제에 더하여, 제형은 또한 데폿 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 오래 작용하는 제형은 근육내 주사로써 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 제형은 적합한 중합체계 또는 소수성 물질을 이용하여, 예를 들어 이온 교환 수지 또는 허용가능한 오일 내 에멀젼으로서 또는 드물게 용해가능한 유도체로서, 예를 들어 드물게 용해가능한 염으로서 제형될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 제형은 또한 국소 전달을 위해 제형화될 수 있고 국소 전달 비히클의 적용에 대한 임의의 적합한 방법을 이용하여 대상체의 피부에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제형은 수동적으로, 어플리케이터를 이용하여 또는 양자를 모두 포함하는 방법을 이용해 적용할 수 있다. 적용 후, 제형을 대상체의 피부 내에서 예를 들어 문지름으로써 작용시킬 수 있다. 적용은 여러 회 매일 또는 일일 1 회 기반으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 제형은 대상체의 피부에 1 일 1 회, 1 일 2 회 또는 1 일 수 회 적용될 수 있거나, 또는 이틀마다 1 회, 3 일 마다 1 회, 또는 매주 약 1 회, 2 주 마다 1 회, 또는 수 주 마다 1 회 적용될 수 있다.
본원에 기재된 제형 또는 약학적 조성물은 임의의 적합한 수단으로써 대상체에 투여될 수 있다. 투여 방법의 예는 특히 하기를 포함한다: (a) 피하, 복강내, 정맥내, 근육내, 피내, 안와내, 피막내, 척수내, 흉골내 등 주입 펌프 전달을 포함해 주사를 통한 투여; (b) 국소 투여, 예컨대 직장 또는 심장 영역에 직접 주사, 예를 들어 데폿 이식; 뿐만 아니라 활성 화합물을 생조직과 접촉되게 하기 위해 당업자에게 적절하다고 여겨지는 것.
약학적 조성물의 정확한 제형화, 투여 방법 및 투약은 환자 병태의 관점에서 각 의사에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th Ed., Sec. 1, 2011] 을 참고한다. 전형적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 투여 범위는 약 0.5 내지 약 1000 mg/환자의 체중 kg 일 수 있다. 투여량은 환자가 필요로 함에 따라 1 일 이상의 과정 동안 단독 1 회 또는 연속되는 2 회 이상이 제공될 수 있다. 화합물에 대한 인간 투여량이 적어도 일정한 병태에 맞게 확립되어진 경우, 그 투여량은 거의 동일하거나 또는 확립된 인간 투여량의 약 0.1% 내지 약 500%, 더욱 바람직하게 약 25% 내지 약 250% 인 투여량일 것이다. 새롭게 발견된 약학적 조성물에 대한 경우이어서, 인간 투여량이 학립되지 않은 경우, 적합한 인간 투여량은 ED50 또는 ID50 값으로부터 또는 동물에서의 독성 연구 및 효능 연구에 의해 정량화된 시험관 내 생체 내 연구에서 얻은 기타 적합한 값으로부터 추론할 수 있다.
악성 종양의 예방 또는 치료 방법
본 발명은 나아가 악성 종양의 활성 또는 성장을 제어하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 악성 종양을 치료하는 방법에서 여기서 지칭되는 유효량이란 그의 증상을 완화시키거나 또는 그 진행을 지연 또는 멈추게 하고 바람직하게는 악성 종양의 개시 또는 재발을 막거나 또는 이를 치유하는 양이다. 또한 바람직하게 이것은 투여로부터 얻은 이익을 초과하는 부작용을 야기하지 않는 양이다. 그러한 양은 배양된 세포를 이용한 시험관 내 시험에 의해 또는 마우스, 래트, 개 또는 돼지와 같은 모델 동물 또는 포유류에서 시험으로써 적절하게 측정될 수 있고, 이러한 시험 방법은 당업자아게 익히 공지되어 있다. 더욱이, 담체 내 활성제의 투여량 및 본 발명의 방법에서 이용되는 활성제의 투여량은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 상술된 시험들에 의해 적절하게 측정될 수 있다.
투여 주기는 대상체의 상술된 병태 및 사용된 조서물의 특성에 좌우될 수 있고, 일일 복수의 횟수 (즉, 1 일 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 횟수), 1 일 1 회, 며칠마다 (즉, 매 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 마다, 등), 매 주 수 회 (예, 매 주 2, 3, 4 회 등), 2주 마다 또는 몇주마다 (즉, 매 2, 3, 4 주 마다, 등) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 상기 담체를 이용하는 것에 의한 악성 종양 세포에 약물을 전달하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 폐에서 세포외 기질-생성 세포를 함유하는 배양 배지와 같은 배지 또는 생체에 전달 운반될 물질을 갖는 담체를 투여 또는 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 단계는 임의 공지된 방법 또는 본 발명에 기술된 방법에 따라 적절히 달성될 수 있다. 나아가, 상술된 방법은 몸의 내부에서 폐 내 악성 종양이 표적되는 모드로 및 시험관 내에서 실시되는 모드를 포함한다.
본 발명의 치료적 유효량의 제형은 활성제의 넓은 생체분배를 제공할 수 있는 전신 전달에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 구현예는 치료적 제형을 제공할 수 있는데, 이는 본 발명의 치료적 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 제형의 유효량은 1 일 1 내지 12 회, 또는 주 1 회 투여될 수 있다. 투여 지속기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일일 수 있거나, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 12 주일 수 있다.
실시예
실시예 1: 단일 표적으로 HSP47 을 이용하는 종양 성장 저해를 시험하기 위해 생체 내 연구를 수행했다. PANC-1 로부터 유래된 췌장암 모델을, 표 5 에서 나타낸 바와 같이 콜라겐 단백질 풍부 때문에 선택했다.
표 5: 단일 표적으로서 HSP47 을 이용하는 종양 성장 저해 시험을 위한 생체 내 연구
Figure pct00007
연구 방법:
PANC-1 세포를, 암컷의 무흉선 누드 마우스의 우측 옆구리에 피하 접종했다.
종양 크기를 측정하고 하기 식을 이용해 산출했다: 종양 부피 = 길이 x 너비2/2. 확립된 종양이 약 200 ㎣ 에 도달할 때, 마우스를 무작위로 추출하여 시험 물품 주입을 위해 할당했다.
HSP47-siRNA (2M) 를 함유하는 제형을 동물에게 0.75 mg/kg, q1w 및 총 4 회 정맥내 주사했다.
동물 체중 및 종양 부피를 1 주일에 2 회 모니터링했다.
결과 및 결론: 종양은 이 PANC-1 모델에서 서서히 성장하였고, 비히클 군에 대해서 배가 시간은 22 일이었다. 검사된 체중 감량은 없었다. 화합물 81 을 기반으로 하고 HSP47-siRNA (2M) 를 함유하는 제형은, 0.75 mpk 의 투여량에서 완전히 종양 성장을 억제하는 것으로 관찰되었다. 전반적으로, Hsp47 억제는 종양 성장을 저해하였고, 이는 이 제형이 강력한 항암 치료제라는 것을 나타낸다.
결과 및 결론: 도 1 은 Hsp47 을 단일 표적으로서 이용하여 종양 성장 저해를 시험하는데 수행된 췌장암 모델의 생체 내 연구 결과를 나타낸다. 도 1 에서 나타낸 바와 같이, Hsp47 siRNA (2M) 를 함유하는 제형으로 치료된 그룹의 경우, 종양 부피는 연구 과정 동안 성장 한다면 서서히 성장하였다. 검사된 체중 감량은 없었다. 반대로, 비히클 대조군 그룹의 종양 부피는 22 일 만에 두배가 되었다. 결론적으로, Hsp47 siRNA 는 0.75 mpk 의 투여량에서 종양 성장을 완벽하게 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이는 Hsp47 siRNA 를 함유하는 제형이 강력한 항암 치료제인 것을 나타낸다.
실시예 2: 인간 암 세포주 A549, MCF7, MDA-MB-231, HCT116, M7609, COLO230HSR, SW480, PANC-1, SW1990, MIA-PaCa-2, HepG2, HT1080, 및 HaLa 에서 Hsp47, 콜라겐 I, 및 콜라겐 IV 의 유전자 발현을 도 2 에 나타낸다. 발현은 SW480 및 HepG2 에서 두드러졌다.
실시예 3: Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법의 결과를 도 3 내지 11 에 나타낸다.
도 3 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 대한 비치료된 샘플을 나타낸다. 도 4 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하기 위한 방법에서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 5 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 6 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 7 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 8 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 9 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 4 와 7, 5 와 8, 및 6 와 9 의 비교는, Hsp47 를 표적으로 하는 활성 siRNA 가 SW480 결장 암 세포를 억제하는 것을 나타낸다.
도 10 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정의 결과를 나타낸다. 수직 축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 삼각형 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 11 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 빈 동그라미는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 채워진 동그라미 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
실시예 4: Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법의 결과를 도 12 ~ 16 에 나타낸다.
도 12 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 비치료된 샘플을 나타낸다. 도 13 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 14 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 12, 13 및 14 의 비교는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 가 HCT116 결장 암 세포를 억제한다는 점을 나타낸다.
도 15 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정의 결과를 나타낸다. 수직축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료된 샘플이다. 상승 곡선에서 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. 평평한 곡선에서의 빈 동그라미 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 16 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HCT116 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 상승 곡선에서 빈 동그라미는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. 평평한 곡선에서 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. 채워진 동그라미 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
실시예 5: Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법의 결과는 도 17 ~ 25 에 나타낸다.
도 17 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 비치료된 샘플을 나타낸다. 도 18 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 19 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 20 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 21 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 22 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 23 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 SW480 결장 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 18 과 21, 19 과 22, 및 20 과 23 의 비교는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 가 A549 폐 암 세포를 억제하는 것을 나타낸다.
도 24 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료된 샘플이다. 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. 삼각형 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 25 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 빈 동그라미는 Hsp47 를 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 채워진 동그라미 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
실시예 6: Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 A549 폐 암 세포의 증식을 억제하는 방법의 결과를 도 26 ~ 34 에 나타낸다.
도 26 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 비치료된 샘플을 나타낸다. 도 27 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 28 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 29 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 음성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 30 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 10 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 31 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 50 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다. 도 32 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 100 nM 에서의 활성 siRNA 의 효과를 나타낸다.
도 27 과 30, 28 과 31, 및 29 과 32 의 비교는, Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 가 HepG2 간암 세포를 억제한다는 점을 나타낸다.
도 33 은 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 성장 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 세포수 x 104 이다. 채워진 동그라미는 비치료된 샘플이다. 빈 동그라미 마커는 음성 siRNA 이다. X 마커는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플을 나타낸다.
도 34 는 Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 로 HepG2 간암 세포의 증식을 억제하는 방법에 있어서 염료 배제 검정 결과를 나타낸다. 수직축은 죽은 세포의 퍼센트이다. 빈 동그라미는 Hsp47 을 표적으로 하는 활성 siRNA 로 치료된 샘플이다. X 마커는 음성 siRNA 이다. 빈 네모 마커는 비치료된 샘플을 나타낸다.
실시예 7: Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 결장 암 세포 (SW480, HCT116) 에서 아넥신 V 및 PI 의 검출 방법의 결과를 도 35 ~ 36 에 나타낸다.
도 35 는 siRNA 의 트랜스펙션 후 2 일 째에 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 결장 암 세포 SW480 에서 아넥신 V 및 PI 을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다. 도 36 은 siRNA 의 트랜스펙션 후 2 일 째에 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 결장 암 세포 HCT116 에서 아넥신 V 및 PI 을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다.
실시예 8: Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 암 세포에서 프로카스파아제-3 및 Hsp47 단백질의 발현을 검출하는 방법의 결과를 도 37 ~ 39 에 나타낸다.
도 37 은 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 SW480 결장 암 세포에서 프로카스파아제-3 및 Hsp47 단백질의 발현을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다. 도 38 은 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 HepG2 간암 세포에서 프로카스파아제-3 및 Hsp47 단백질의 발현을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다. 도 39 는 활성 Hsp47 siRNA 로 트랜스펙션된 A549 폐 암 세포에서 프로카스파아제-3 및 Hsp47 단백질의 발현을 검출하는 방법의 결과를 나타낸다.
실시예 9: Hsp47 siRNA 및 p21 siRNA 로 트랜스펙션된 결장 암 세포 (SW480) 에서 카스파아제-3/7 활성을 검출하는 방법의 결과를 도 40 에 나타낸다. 이들 데이타는 결장암 세포에서 Hsp47 siRNA 및 p21 siRNA 의 조합물을 이용하면 카스파아제의 수준이 예상치 않게 유리하게 증가한다는 점을 나타낸다. 암 세포에서 카스파아제의 수준의 놀라운 증가는 세포가 놀랍게도 세포 사멸을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 10: A549 세포주에서 시험관 내 트랜스펙션을 실시하여 siRNA 녹다운 효능을 측정하였다. Hsp47 을 표적으로 하는 RNAi 분자를 함유하는 본 발명의 제형을 이용하여, Hsp47 mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운을 관찰하였다.
시험관 내 녹다운에 관한 프로토콜: 트랜스펙션 전 1 일에, 세포를 96-웰 플레이트에 10% FBS 를 함유하는 100 ㎕ 의 DMEM (HyClone Cat. # SH30243.01) 을 함유하는 웰 마다 2 x 103 개의 세포를 플레이팅하고, 공기 중에 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 배양한다. 트랜스펙션 전에, 배지를 2% FBS 를 함유하는 90 ㎕ 의 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지 (Life Technologies Cat. # 31985-070) 로 교체한다. 0.2 ㎕ 의 리포펙타민 RNAiMax (Life Technologies Cat. # 13778-100) 를 5 분 동안 실온에서 4.8 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합한다. 1 ㎕ 의 siRNA 를 4 ㎕ 의 Opti-MEM I 와 혼합하고, LF2000 용액과 조합한 다음, 볼텍스하지 않으면서 부드럽게 혼합한다. 실온에서 5 분 대기한다. 혼합물을 10 분 동안 실온에서 인큐베이션하여, RNA-RNAiMax 복합체가 형성되게 한다. 10 ㎕ 의 RNA-RNAiMax 복합체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 손으로 부드럽게 진탕한다. 세포를 공기 중에 5% CO2 의 가습된 분위기를 함유하는 37℃ 인큐베이터에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 배지를 2% FBS 를 함유하는 신선한 Opti-MEM I 감소된 혈청 배지 (Life Technologies Cat. # 31985-070) 로 교체한다. 트랜스펙션 후 24 시간에, 세포를 빙랭 PBS 로 1 회 세정한다. 세포를 50 ㎕ 의 Cell-to-Ct 세포용해 버퍼 (Life Technologies Cat. # 4391851 C) 로 5-30 분 동안 실온에서 용해한다. 5 ㎕ 의 정지액을 첨가하고, 그것을 2 분 동안 실온에서 인큐베이션한다. mRNA 수준을 RT-qPCR 에 의해 TAQMAN 을 이용하여 즉시 측정한다. 대안적으로는, 샘플을 -80 ℃ 에서 동결하여 나중에 분석할 수 있다.
실시예 11: Hsp47 siRNA 에 대한 종양 저해 효능. Hsp47 을 표적으로 하는 siRNA 0.75 mg/kg 의 상대적으로 낮은 용량으로 췌장암 이종이식 모델을 활용했다. 결합된 siRNA 는 28 일째에 유의미하고 예기치 않게 유리한 종양 저해 효능을 나타낸다.
이 실험에서, A549 및 PANC-1 세포주는 ATCC 로부터 얻었다. 세포 현탁물을 얼음 해동된 BD 매트리젤 (matrigel) 과 1:1 의 비율로 주사를 위해 잘 혼합한다. 각각의 마우스, 무흉선 누드 암컷 마우스 (Charles River; 6 내지 8 주) 를 우측 옆구리에 25 G 바늘 및 주사기 (마우스 당 1 개의 접종물) 을 이용하여, 2× 106 (A549) 또는 2.5 × 106 (PANC-1) 세포 접종물 0.1 ml 로 피하 접종한다. 마우스는 접종을 위해 마취시킨다. 확립된 종양이 대략 250 - 350 ㎣ (A549) 또는 150 - 250 ㎣ (PANC-1) 에 도달하는 당일에, 동물에 볼루스 주사를 꼬리 정맥을 통해 적용한다. 동물을 과량의 CO2 로 희생시키고, 투여 후 상이한 시점에서 종양을 해부한다. 종양을 먼저 적셔 칭량한 다음 Hsp47 녹다운 측정, siRNA 의 생분배 및 바이오마커 분석을 위해 세 부분으로 분리한다. 샘플을 액체 질소에서 급속 동결하고, 생체 분석을 위해 처리할 준비가 될 때까지 -80℃ 에서 보관한다.
실시예 12: 동소 (orthotopic) A549 폐 암 마우스 모델에 대한 리포솜 제형에 캡슐화된 siRNA 의 효능 평가
실험 동물: 5-6 주령의 총 60 마리의 수컷 NCr nu/nu 마우스를 연구에 사용한다. 실험 동물은 AntiCancer Inc. 에서 사육 및 키웠다. 이들을 실험 기간 동안 HEPA 필터 환경에서 유지시킨다. 케이지, 식품 및 침구류는 오토클레이브 처리된다. 동물 사료는 Harlan Teklad (Madison, WI) 로부터 수득된다.
리포솜 제형 제조: 제형을 제조하고 4℃ 에서 보관한다. 이것들을 마우스에 주사하기 10 분전에 실온으로 가온시킨다.
A549 인간 폐 암 동소 모델 (SOI): SOI 당일에, 스톡 종양을 A549 종양 이종이식편을 갖는 동물의 피하 부위로부터 수확하고 RPMI-1640 배지에 넣는다. 괴사성 조직을 제거하고, 생존가능 조직을 1.5 -2 ㎣ 조각으로 절단한다. 동물을 이소플루란 흡입으로 마취시키고, 수술 영역은 요오드 및 알코올로 멸균한다. 약 1.5 cm 길이의 횡단 절개를 수술용 가위를 사용하여 마우스의 왼쪽 가슴 벽에서 행한다. 3 번째와 4 번째 늑골 사이에서 늑간 절개를 행하고 왼쪽 폐를 노출시킨다. 1 개의 A549 종양 단편을 8-0 수술용 봉합선 (나일론) 으로 폐 표면에 이식한다. 가슴벽을 6-0 수술용 봉합선 (실크) 으로 봉합한다. 폐를 25 G X 1 ½ 바늘이 달린 3 cc 주사기를 이용하여 흉곽 내 천공으로써 다시 팽창시켜 흉강 내 남아 있는 공기를 빼낸다. 가슴벽을 6-0 수술용 실크 봉합선으로 봉합한다. 상기 기술된 조작 절차는 HEPA 필터 층판류 후드 하 7 x 확대 현미경 (Olympus) 으로 수행한다.
종양 이식 3 일 후에, 종양-보유 마우스를 그룹 당 10 마리의 그룹으로 무작위로 나눈다. 마우스의 각 그룹에 대한 치료를 종양 이식 3 일 후에 개시한다.
종점 (endpoint) : 실험 마우스를 치료 개시 42 일 후 희생시킨다. 원발성 종양을 절제하고 후속의 분석을 위해 전자 저울에서 칭량한다.
인간 폐 암 A549 에 대한 제형의 항-종양 효능은 각 치료 그룹과 비히클 대조군 그룹 사이에서 부검 시 측정된 최종적인 원발성 종양 중량을 비교함으로써 평가한다. 각 그룹에서 평균 종양 중량을 측정한다.
화합물 독성의 평가: 치료된 그룹 및 대조군 그룹에서 마우스의 평균 체중 중량은, 전체 실험 기간 동안 통상의 범위 내에서 유지된다. 독성의 다른 증상은 또한 마우스의 전반 관찰로써 검출되지 않았다.
결론: 실험 마지막에 수득된 최종적인 종양 중량을 비교함으로써, 치료 그룹에서 2 mg/kg 의 Hsp47 siRNA 을 함유하는 제형으로의 치료가 대조군과의 비교에 의해 인간 폐 암 A549 의 종양 성장 및 종양 부파를 유의미하게 그리고 놀랍게 감소시킨다는 결론에 도달한다. 독성은 관찰되지 않았다.
실시예 13: 융모막요막 (CAM) 검정에서 혈관신생 및 누드 마우스에서의 A549 세포 성장에 대한 Hsp47 을 표적으로 하는 소 간섭 RNA (siRNA) 의 효과. 3 쌍의 Hsp47 siRNA-플라스미드 및 비(非)침묵-플라스미드를 구축하고, 각각 LIPOFECTAMINE 2000 를 통해 A549 세포로 트랜스펙션시킨다. Hsp47 siRNA-플라스미드의 가장 유효한 쌍은 ELISA 및 실시간 RT-PCR 에 의해 선택된다. A549 세포를 선택된 Hsp47 siRNA-플라스미드로 트랜스펙션시키고, A549 세포를 비침묵-플라스미드로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션하지 않은 A549 세포를 누드 마우스에 각각 접종한다. 병아리 배아를 4 그룹으로 무작위로 나누고, CAM 을 48 시간 동안 상이한 용액: 음성 대조군 그룹으로서 배양 배지 DMEM, 양성 대조군 그룹으로서 비트랜스펙션된 A549 세포 배양 상청액, Hsp47 siRNA 그룹으로서 Hsp47 siRNA A549 세포 배양 상청액 및 비침묵 siRNA 그룹으로서 비침묵 siRNA A549 세포 배양 상청액에 의해 처리한다. CAM 을 현미경 검정을 위해 제 12 일에 수확하였다.
대조군 그룹과 비교하면, Hsp47 siRNA-플라스미드는 Hsp47 mRNA 감소를 동반하는 A549 세포에 의한 Hsp47 분비 감소를 유도한다. 비침묵 siRNA 그룹과 비교하면, 쥣과동물 이종이식편의 평균 종양 부피는 Hsp47 siRNA 그룹에서 감소하고; 이종이식편이 50 ㎣ 으로 성장하기 위한 시간은 지연된다. 이종이식편에서 Hsp47 함량은 감소된다. CAM 검정에서, Hsp47 함량은 음성 대조군에서 0 이고, Hsp47 siRNA 그룹에서는 비침묵 siRNA 그룹 또는 양성 그룹과 비교하면 20-70% 감소되고; Hsp47 siRNA 그룹 또는 비침묵 siRNA 그룹 또는 양성 그룹에서의 CAM 혈관 분기점이 음성 그룹과 비교시 증가되고; Hsp47 siRNA 그룹에서 CAM 의 전체 혈관 길이는 음성 그룹과 비교시 증가되는 반면; 비침묵 siRNA 그룹 또는 양성 그룹에서 이는 증가된다. 음성 대조군 그룹과 비교하면, Hsp47 siRNA 그룹에서는 세포 배양 상청액에 Hsp47 이 첨가되어 있는 경우 미세혈관의 증식이 증가되고, 비침묵 siRNA 그룹 또는 양성 그룹에서는 유의미하게 증식된 혈관이 관찰된다.
실시예 14: 세포 배양. 인간 비소 (non-small) 세포 폐 암종 세포주, A549 를, 5% CO2 로의 가습 분위기에서 37℃ 에서 10% FBS (FBS, Invitrogen) 가 보충된 F-12K 배지 (ATCC) 에서 배양한다. 대조군 또는 Hsp47 siRNA 를 안정적으로 발현하는 세포를 제조사 지침에 따라 (Sigma-Aldrich) 각 렌티바이러스 형질도입 입자로 A549TR 세포를 형질도입함으로써 제조한다. 내성 클론을 12 일 동안 2.5 μg/mL 퓨로마이신 (Invivogen) 에서 선택하고, 클로닝 실린더를 이용하여 단리하고, 후속해서 퓨로마이신-함유 배지에서 확장 및 유지한다.
실시예 15: Hsp47 표적화된 siRNA 는 생체 내 종양 부피의 심한 퇴행을 초래한다.
지질 제형을 scid 마우스에서 인간 A549 폐 암 세포의 이종이식편에 나노입자 중 siRNA 를 캡슐화 및 전달하는데 이용한다. 이종이식편을 시험해 정상 세포와 비교하여 KRAS 돌연변이의 존재 또는 비정상 발현 수준을 동정한다. 종양이 확립되면 (>100 ㎣), 마우스를 2 주 동안 2일 간격으로 Hsp47 표적화된 siRNA 또는 대조군 (비특이적) siRNA 로 처리한다. 대조군 그룹을 안락사해야 하는 경우 임상 시험을 중단한다.
결과: Hsp47 표적화된 siRNA 로의 처리는 종양 팽창이 방지되고 그 결과 극적인 종양 부피 감소가 초래된다.
회수된 종양들을 절단하고 TUNEL 염색으로써 시각화한다. Hsp47 표적화된 siRNA-처리 종양은 현저하게 더 높은 수준의 세포사멸을 나타낸다. RNA 를 종양으로부터 추출하고, 실시간 PCR 을 실시하여 Hsp47 의 특이적 녹다운을 조사한다.
결과: Hsp47 표적화된 siRNA 으로의 처리는 극적으로 생체 내 Hsp47 의 발현을 감소시킨다.
실시예 16: p21 을 표적으로 하는 본 발명의 siRNA 는 시험관 내 유전자 침묵화에 활성인 것으로 밝혀졌다. 유전자 녹다운에 대한 p21 siRNA 의 용량-의존적 활성은 약 3 picomolar (pM) 미만이고 1 pM 만큼 낮은 IC50 을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
시험관 내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행하여 siRNA 녹다운 효능을 측정했다. p21 mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운을 표 1 의 siRNA 로 표 6 에 나타낸 바와 같이 관찰하였다.
표 6: A549 세포주에서 p21 mRNA 에 대한 용량 의존적 녹다운
Figure pct00008
표 6 에서 나타낸 바와 같이, 표 1 의 p21 siRNA 의 활성은 0.3-10 pM 의 범위이며, 이는 생체 내에서 사용되는 약물 작용제를 비롯해 많은 용도에 적합하다.
실시예 17: siRNA 의 안티센스 가닥의 시드 (seed) 영역에 위치된 데옥시뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 p21 siRNA 의 구조는 예상밖으로 유리하게 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공하였다.
시험관 내 트랜스펙션을 A549 세포주에서 수행해 구조 1735' (SEQ ID NOs:57 및 71) 기반 p21 siRNA 에 대한 녹다운 효능을 측정했다. p21 mRNA 의 용량 의존적 녹다운을, 표 7 에서 나타낸 바와 같이 구조 1753' 기반의 p21 siRNA 로 관찰했다.
표 7: 구조 1735' 기반 p21 siRNA 에 있어서 A549 세포주에서 p21 mRNA 의 용량 의존적 녹다운
Figure pct00009
표 7 에서 나타내는 바와 같이, 안티센스 가닥의 시드 영역에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 구조 1735' 기반의 p21 siRNA 의 활성은 놀랍고도 예상치 않게 듀플렉스 영역에서 데옥시뉴클레오티드가 없는 p21 siRNA 와 비교시 최대 300 배 증가되었다.
이들 데이타는 안티센스 가닥의 시드 영역에서 데옥시뉴클레오티드를 지닌 구조의 p21 siRNA 가 듀플렉스 영역에서 데옥시뉴클레오티드가 없는 p21 siRNA 와 비교할 때 놀랍게도 증가된 유전자 녹다운 활성을 제공한다는 점을 나타낸다.
안티센스 가닥의 시드 영역에서 3 개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 p21 siRNA 에 대한 표 7 에 나타낸 활성은 0.001 내지 0.1 pM 범위이고, 이는 생체 내에서 사용되는 약물 작용제로서 용도를 비롯해 많은 용도에서 예외적으로 적합하다.
본원에 기재된 구현예는 제한하고자 하는 것이 아니며, 당업자는 본원에 기재된 변형의 특정 조합이, 개선된 RNAi 활성을 갖는 핵산 분자를 확인하기 위한 과도한 실험 없이 시험될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
본원에 구체적으로 언급된 모든 공개물, 특허 및 문헌은 그의 전체가 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.
본 발명은, 그들이 다양할 수 있으므로, 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 물질 및 시약에 제한되지 않는다는 것이 이해된다. 본원에 사용된 용어가 오직 특정 구현예를 기재하는 목적만을 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 또한 이해될 것이다. 설명의 범주 및 취지에 벗어나지 않고 가변적인 치환 및 변형을 본원에 개시된 설명에 가할 수 있으며 이러한 구현예가 이러한 설명 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본원에서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 맥락에서 다르게 명확히 나타내지 않는 한, 단수 형태 "하나", "하나의", 및 "그러한" 은 복수의 언급 대상을 포함한다. 또한, 단수 형태 "하나" (또는 "하나의"), "하나 이상" 및 "적어도 하나" 의 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한 용어 "포함한다", "포함하는", "함유하는", "비롯한" 및 "갖는" 은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 포괄적이고 비제한적으로 판독되어야 한다는 것에 유의한다.
본원의 값의 범위의 설명은 본원에 다르게 나타내지 않는 한, 단지 범위 내에 포함되는 각각의 별개 값을 개별적으로 지칭하는 약기 방법으로서 역할하는 것으로 의도되며, 각각의 별개 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 마쿠쉬 (Markush) 군에 대해, 당업자는 이러한 설명이 개별적 일원 뿐 아니라 마쿠쉬 군의 일원의 하위군을 포함한다는 것을 인지할 것이다.
추가적인 상세한 설명 없이, 당업자가 상기 설명을 기반으로 하여 본 발명을 그의 최대 정도로 이용할 수 있다고 여겨진다. 따라서 하기 특정 구현예는 단지 예시적이며 본 개시물의 나머지를 어떠한 식으로도 제한하지 않는다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특성은 동일한, 대등한, 또는 유사한 목적에 기여하는 대안적인 특성으로 대체될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> NITTO DENKO CORPORATION <120> THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR MALIGNANT TUMORS WITH RNAI MOLECULES TARGETED TO HSP47 AND P21 <130> ND5123767WO <140> PCT/US15/67558 <141> 2015-12-28 <150> JP2014_266198 <151> 2014-12-26 <150> 62/266,670 <151> 2015-12-13 <150> 62/184,195 <151> 2015-06-24 <160> 134 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 1 cuuagugacu uuacuuguau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 2 cagaccagca ugacagauuu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 3 ugaucuucuc caagaggaau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 4 guucauugca cuuugauuau u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 5 cauugcacuu ugauuagcau u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 6 agcgauggaa cuucgacuuu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 7 gcgauggaac uucgacuuuu u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 8 gggaagggac acacaagaau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 9 ucuaccucag gcagcucaau u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 10 ggugcucaau aaaugauucu u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 11 caucaucaaa aacuuuggau u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 12 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 13 gugcugggca uuuuuauuuu u 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 14 gccggcuuca ugccagcuau u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 15 gggcaucauc aaaaacuuuu u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 16 gaagggcacc cuaguucuau u 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 17 caguucauug cacuuugauu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 18 acaaggaguc agacauuuuu u 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 19 uggaggcacu gaagugcuuu u 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 20 gcagggacca cacccuguau u 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 21 cuguacuguu cugugucuuu u 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 22 uuaaacaccu ccucauguau u 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 23 agacucucag ggucgaaaau u 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 24 caugacagau uucuaccacu u 21 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 25 agauuucuac cacuccaaau u 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 26 ccaagaggaa gcccuaaucu u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 27 gacagcagag gaagaccauu u 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 28 cucccacaau gcugaauauu u 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 29 uacaaguaaa gucacuaagu u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 30 aaucugucau gcuggucugu u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 31 uuccucuugg agaagaucau u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 32 uaaucaaagu gcaaugaacu u 21 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 33 ugcuaaucaa agugcaaugu u 21 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 34 aagucgaagu uccaucgcuu u 21 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 35 aaagucgaag uuccaucgcu u 21 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 36 uucuugugug ucccuucccu u 21 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 37 uugagcugcc ugagguagau u 21 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 38 gaaucauuua uugagcaccu u 21 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 39 uccaaaguuu uugaugaugu u 21 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 40 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 41 aaauaaaaau gcccagcacu u 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 42 uagcuggcau gaagccggcu u 21 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 43 aaaguuuuug augaugcccu u 21 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 44 uagaacuagg gugcccuucu u 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 45 aucaaagugc aaugaacugu u 21 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 46 aaaaugucug acuccuuguu u 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 47 aagcacuuca gugccuccau u 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 48 uacagggugu ggucccugcu u 21 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 49 aagacacaga acaguacagu u 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 50 uacaugagga gguguuuaau u 21 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 51 uuuucgaccc ugagagucuu u 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 52 gugguagaaa ucugucaugu u 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 53 uuuggagugg uagaaaucuu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 54 gauuagggcu uccucuuggu u 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 55 auggucuucc ucugcugucu u 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxy-nucleotide <400> 56 auauucagca uugugggagu u 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> a, c, t, g, u, unknown or other <400> 57 aaggagucag acauuuuaan n 21 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 58 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(15) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 59 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 60 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(15) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 60 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 61 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 61 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 62 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 63 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 64 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 65 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 66 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 67 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 68 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 69 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 70 aaggagucag acauuuuaau u 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> a, c, t, g, u, unknown or other <400> 71 uuaaaauguc ugacuccuun n 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 72 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 73 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 74 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 75 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 76 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 77 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 78 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 79 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 80 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-OMe-nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 81 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 82 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 82 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 83 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 84 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe-nucleotide <400> 84 uuaaaauguc ugacuccuuu u 21 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 cgagaacagu uuguacaagu u 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 86 caggccucua caacuacuat t 21 <210> 87 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 gagcacucca agaucaacuu ccgcg 25 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 88 ggacaggccu cuacaacuat t 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 89 gagcacucca agaucaacut t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 90 gaacacucca agaucaacut t 21 <210> 91 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 caggccucua caacuacuac gacga 25 <210> 92 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 gaacacucca agaucaacuu ccgag 25 <210> 93 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 ggacaggccu cuacaacuac uacga 25 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 94 caggccucua caacuacuat taaaaa 26 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 caggccucua caacuacua 19 <210> 96 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 96 caggccucua caacuacuat taaaaaaaaa aaa 33 <210> 97 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 97 aaaaacaggc cucuacaacu acuatt 26 <210> 98 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 98 caggccucua caacuacuat taaaaaaaa 29 <210> 99 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 99 aaaaaaaaca ggccucuaca acuacuatt 29 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 100 caggccucua caacuacuat taaaaaaaaa aaa 33 <210> 101 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 101 aaaaaaaaaa aaaaaacagg ccucuacaac uacuatt 37 <210> 102 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 102 caggccucua caacuacuat taaaaaaaaa aaaaaaa 37 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 103 caggccucua caacuacuat t 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 104 ggacaggccu guacaacuat t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 105 ggacaggccu cuacaacuat t 21 <210> 106 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 cuuguacaaa cuguucucgu u 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 107 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 108 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 cgcggaaguu gaucuuggag ugcucuu 27 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 109 uaguuguaga ggccugucct t 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 110 aguugaucuu ggagugcuct t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 111 aguugaucuu ggaguguuct t 21 <210> 112 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 ucgucguagu aguuguagag gccuguu 27 <210> 113 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 cucggaaguu gaucuuggag uguucuu 27 <210> 114 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 ucguaguagu uguagaggcc uguccuu 27 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 115 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 116 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 117 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 118 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 119 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 120 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 121 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 122 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 123 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 124 uaguaguugu agaggccugt t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 125 uaguuguaca ggccugucct t 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 126 uaguuguaga ggccugucct t 21 <210> 127 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5'-Inverted 1,2-dideoxy-D-Ribose <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <223> 3'-C3 spacer <400> 127 acuccaagau caacuuccu 19 <210> 128 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-C3 spacer <400> 128 aggaaguuga ucuuggagu 19 <210> 129 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5'-Inverted 1,2-dideoxy-D-Ribose <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3 spacer <400> 129 uccugagaca cauggguga 19 <210> 130 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-C3 spacer <400> 130 ucacccaugu gucucagga 19 <210> 131 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5'-Inverted 1,2-dideoxy-D-Ribose <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <223> 3'-C3-spacer-phosphate <400> 131 gagacacaug ggugcuaua 19 <210> 132 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-C3-spacer <400> 132 uauagcaccc augugucuc 19 <210> 133 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5'-Inverted 1,2-dideoxy-D-Ribose <220> <221> modified_base <222> (2)..(3) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(15) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-spacer <400> 133 cuuacgcuga guacuucgu 19 <210> 134 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 2'-5' linkage between nucleotides <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-O-Methyl ribonucleotide <220> <223> 3'-C3-C3-spacer <400> 134 acgaaguacu cagcguaag 19

Claims (77)

  1. 악성 종양 치료를 위한 약학적 조성물로서, 조성물은 RNAi 분자를 캡슐화하는 나노입자를 포함하고, 여기서 RNAi 분자는 Hsp47 을 표적으로 하는, 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 조성물은 인간 혈청에 1 시간 노출 후 캡슐화된 RNAi 분자의 적어도 80% 의 활성을 보유하는, 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 악성 종양을 치료하기 위한 RNAi 분자는 siRNA 또는 shRNA 인, 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 각 RNAi 분자는 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 듀플렉스 영역은 Hsp47 mRNA 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  5. 악성 종양 치료를 위해 대상체에 활성제를 분배시키는 방법으로서, 방법은 제 1 항의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 악성 종양 치료를 위한 약학적 조성물로서, 조성물은 RNAi 분자를 캡슐화하는 나노입자를 포함하고, 여기서 RNAi 분자의 일부는 Hsp47 을 표적으로 하고, RNAi 분자의 일부는 p21 을 표적으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 조성물은 인간 혈청에 1 시간 노출 후 캡슐화된 RNAi 분자의 적어도 80% 의 활성을 보유하는, 약학적 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 악성 종양 치료를 위한 RNAi 분자는 siRNA 또는 shRNA 인, 약학적 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서, Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성인 RNAi 분자의 일부에 있어서, 각 RNAi 분자는 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 듀플렉스 영역은 Hsp47 mRNA 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  10. 제 6 항에 있어서, p21 의 발현을 감소시키는데 활성인 RNAi 분자의 일부에 있어서, 각 RNAi 분자는 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 듀플렉스 영역은 p21 mRNA 의 표적 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  11. 악성 종양을 치료하기 위해 대상체에 활성제를 분배시키는 방법으로서, 방법은 제 6 항의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 악성 종양은 폐, 결장, 또는 췌장, 간, 심장, 뼈, 피부, 또는 창자에 위치된, 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 투여는 12 주 이하의 기간 동안 1 일 적어도 1 회 RNAi 분자 0.01 내지 2 mg/kg 의 투여량인, 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 투여는 Hsp47 RNAi 분자에 대해서 1 내지 1000 ug*min/mL 의 평균 AUC(0-last) 및 0.1 내지 50 ug/mL 의 평균 Cmax 를 제공하는, 방법.
  15. 악성 종양의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 포유동물에서 악성 종양의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화하는 방법으로서, 방법은 치료적 유효량의, Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성인 RNAi 분자를 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 포유동물은 인간이고, Hsp47 은 인간 Hsp47 인, 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 악성 종양은 Hsp47 을 과발현하는, 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, RNAi 분자는 포유동물에서 Hsp47 의 발현을 감소시키는, 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 투여는 적어도 5 일 동안 포유동물에서 Hsp47 의 발현을 적어도 5% 감소시키는, 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 투여는 포유동물에서 악성 종양의 부피를 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50% 감소시키는, 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 방법은 악성 종양의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 또는 악성 종양의 진행을 지연 또는 종료시키는, 방법.
  22. 제 15 항에 있어서, 투여는 대상체에서 악성 종양 세포의 성장을 감소시키는, 방법.
  23. 제 15 항에 있어서, 투여는 대상체에서 적어도 2%, 또는 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20% 의 악성 종양 세포에 대한 성장을 감소시키는, 방법.
  24. 제 15 항에 있어서, 종양 세포는 야생형 Hsp47 RNA 또는 단백질을 과발현하는, 방법.
  25. 제 15 항에 있어서, 종양은 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 도관 암종 및 결장직장 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 육종인, 방법.
  26. 제 15 항에 있어서, 악성 종양은 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 도관 암종, 결장직장 암종, 유방암, 및 섬유육종의 군으로부터 선택된 육종인, 방법.
  27. 제 15 항에 있어서, 악성 종양은 폐, 간, 췌장, 결장, 신장, 심장, 뼈, 피부, 창자 및 관절, 및 그들의 임의 조합의 군으로부터 선택된 해부학적 영역에 위치된, 방법.
  28. 제 15 항에 있어서, 투여는 1 일 1 내지 12 회 수행되는, 방법.
  29. 제 15 항에 있어서, 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일의 지속기간 동안 수행되는, 방법.
  30. 제 15 항에 있어서, 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 12 주의 지속기간 동안 수행되는, 방법.
  31. 제 15 항에 있어서, 투여는 12 주 이하의 기간 동안 1 일 적어도 1 회 RNAi 분자 0.01 내지 2 mg/kg 의 투여량인, 방법.
  32. 제 15 항에 있어서, 투여는 Hsp47 RNAi 분자에 대해서 1 내지 1000 ug*min/mL 의 평균 AUC(0-last) 및 0.1 내지 50 ug/mL 의 평균 Cmax 를 제공하는, 방법.
  33. 제 15 항에 있어서, 투여는 정맥내 주사, 피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경구, 국소, 주입, 또는 흡입인, 방법.
  34. 악성 종양의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 포유동물에서 악성 종양의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 완화하는 방법으로서, 방법은 치료적 유효량의, RNAi 분자를 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 RNAi 분자의 일부는 Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성이고, RNAi 분자의 일부는 p21 의 발현을 감소시키는데 활성인, 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 포유동물은 인간이고, Hsp47 은 인간 Hsp47 인, 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, 악성 종양은 Hsp47 을 과발현하는, 방법.
  37. 제 34 항에 있어서, RNAi 분자는 포유동물에서 Hsp47 및 p21 의 발현을 감소시키는, 방법.
  38. 제 34 항에 있어서, 투여는 적어도 5 일 동안 포유동물에서 Hsp47 및 p21 의 발현을 적어도 5% 감소시키는, 방법.
  39. 제 34 항에 있어서, 투여는 포유동물에서 악성 종양의 부피를 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50% 감소시키는, 방법.
  40. 제 34 항에 있어서, 방법은 악성 종양의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 또는 악성 종양의 진행을 지연 또는 종료시키는, 방법.
  41. 제 34 항에 있어서, 투여는 대상체에서 악성 종양 세포의 성장을 감소시키는, 방법.
  42. 제 34 항에 있어서, 투여는 대상체에서 적어도 2%, 또는 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20% 의 악성 종양 세포에 대한 성장을 감소시키는 방법.
  43. 제 34 항에 있어서, 종양 세포는 야생형 Hsp47 RNA 또는 단백질을 과발현하는, 방법.
  44. 제 34 항에 있어서, 종양은 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 도관 암종 및 결장직장 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 육종인, 방법.
  45. 제 34 항에 있어서, 악성 종양은 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 도관 암종, 결장직장 암종, 유방암, 및 섬유육종의 군으로부터 선택된 육종인, 방법.
  46. 제 34 항에 있어서, 악성 종양은 폐, 간, 췌장, 결장, 신장, 심장, 뼈, 피부, 창자 및 관절, 및 그들의 임의 조합의 군으로부터 선택된 해부학적 영역에 위치된, 방법.
  47. 제 34 항에 있어서, 투여는 1 일 1 내지 12 회 수행되는, 방법.
  48. 제 34 항에 있어서, 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일의 지속기간 동안 수행되는, 방법.
  49. 제 34 항에 있어서, 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 12 주의 지속기간 동안 수행되는, 방법.
  50. 제 34 항에 있어서, 투여는 12 주 이하의 기간 동안 1 일 적어도 1 회 RNAi 분자 0.01 내지 2 mg/kg 의 투여량인, 방법.
  51. 제 34 항에 있어서, 투여는 Hsp47 RNAi 분자에 대해서 1 내지 1000 ug*min/mL 의 평균 AUC(0-last) 및 0.1 내지 50 ug/mL 의 평균 Cmax 를 제공하는, 방법.
  52. 제 34 항에 있어서, 투여는 정맥내 주사, 피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경구, 국소, 주입, 또는 흡입인, 방법.
  53. 암 줄기 세포의 성장 속도 또는 증식의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 암 줄기 세포의 성장 속도 또는 증식을 감소시키는 방법으로서, 방법은 치료적 유효량의, RNAi 분자를 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 RNAi 분자의 일부는 Hsp47 의 발현을 감소시키는데 활성이고, RNAi 분자의 일부는 p21 의 발현을 감소시키는데 활성인, 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 포유동물은 인간이고, Hsp47 가 인간 Hsp47 인, 방법.
  55. 제 53 항에 있어서, RNAi 분자는 포유동물에서 Hsp47 및 p21 의 발현을 감소시키는, 방법.
  56. 제 53 항에 있어서, 투여는 포유동물에서 Hsp47 및 p21 의 발현을 적어도 5 일 동안 적어도 5% 감소시키는, 방법.
  57. 제 53 항에 있어서, 투여는 포유동물에서 악성 종양의 부피를 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50% 감소시키는, 방법.
  58. 제 53 항에 있어서, 투여는 대상체에서 적어도 2%, 또는 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20% 의 암 줄기 세포에 대한 성장을 감소시키는, 방법.
  59. 제 53 항에 있어서, 암 세포는 야생형 Hsp47 RNA 또는 단백질을 과발현하는, 방법.
  60. 제 53 항에 있어서, 암 세포는 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 도관 암종 및 결장직장 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 육종에 있는, 방법.
  61. 제 53 항에 있어서, 암 세포는 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 도관 암종, 결장직장 암종, 유방암, 및 섬유육종의 군으로부터 선택된 육종에 있는, 방법.
  62. 제 53 항에 있어서, 암 세포는 폐, 간, 췌장, 결장, 신장, 심장, 골수, 피부, 창자, 눈, 및 그들의 임의 조합의 군으로부터 선택된 해부학적 영역에 위치된, 방법.
  63. 제 53 항에 있어서, 투여는 1 일 1 내지 12 회 수행되는, 방법.
  64. 제 53 항에 있어서, 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일의 지속기간 동안 수행되는, 방법.
  65. 제 53 항에 있어서, 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 12 주의 지속기간 동안 수행되는, 방법.
  66. 제 53 항에 있어서, 투여는 12 주 이하의 기간 동안 1 일 적어도 1 회 RNAi 분자 0.01 내지 2 mg/kg 의 투여량인, 방법.
  67. 제 53 항에 있어서, 투여는 Hsp47 RNAi 분자에 대해서 1 내지 1000 ug*min/mL 의 평균 AUC(0-last) 및 0.1 내지 50 ug/mL 의 평균 Cmax 를 제공하는, 방법.
  68. 제 53 항에 있어서, 투여는 정맥내 주사, 피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 경구, 국소, 주입, 또는 흡입인, 방법.
  69. 대상체에서 악성 종양 치료에 사용되기 위한 조성물로서, 조성물은 Hsp47 을 표적으로 하는 RNAi 분자를 캡슐화하는 리포솜 나노입자를 포함하는, 조성물.
  70. 제 69 항에 있어서, 악성 종양은 폐, 결장, 또는 췌장에 위치된, 조성물.
  71. 제 69 항에 있어서, 악성 종양은 간, 심장, 뼈, 피부, 또는 창자에 위치된, 조성물.
  72. 제 69 항에 있어서, 조성물은 10 내지 1000 nm 의 크기를 갖는 리포솜 나노입자를 포함하는, 조성물.
  73. 제 69 항에 있어서, 조성물은 10 내지 150 nm 의 크기를 갖는 리포솜 나노입자를 포함하는, 조성물.
  74. 제 69 항에 있어서, RNAi 분자의 일부는 Hsp47 을 표적으로 하고, RNAi 분자의 일부는 p21 을 표적으로 하는, 조성물.
  75. 제 74 항에 있어서, 리포솜 나노입자는 인간 혈청에 1 시간 노출 후 캡슐화된 RNAi 분자를 적어도 80% 보유하는, 조성물.
  76. 악성 종양 치료를 위해 대상체의 기관에 활성제를 분배시키는 방법으로서, 방법은 제 69 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  77. 제 76 항에 있어서, 악성 종양은 폐, 결장, 신장, 췌장, 간, 골수, 피부, 눈 또는 창자에 위치된, 방법.
KR1020177020894A 2014-12-26 2015-12-28 Hsp47 를 표적으로 하는 rnai 분자를 이용하는 악성 종양에 대한 치료적 조성물 및 방법 Withdrawn KR20170098929A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014266198 2014-12-26
JPJP-P-2014-266198 2014-12-26
US201562184195P 2015-06-24 2015-06-24
US62/184,195 2015-06-24
US201562266670P 2015-12-13 2015-12-13
US62/266,670 2015-12-13
PCT/US2015/067558 WO2016106403A2 (en) 2014-12-26 2015-12-28 Therapeutic compositions and methods for malignant tumors with rnai molecules targeted to hsp47 and p21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170098929A true KR20170098929A (ko) 2017-08-30

Family

ID=56151549

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177020894A Withdrawn KR20170098929A (ko) 2014-12-26 2015-12-28 Hsp47 를 표적으로 하는 rnai 분자를 이용하는 악성 종양에 대한 치료적 조성물 및 방법
KR1020177020901A Withdrawn KR20170093988A (ko) 2014-12-26 2015-12-28 Gst-pi 유전자 조정을 위한 rna 제제
KR1020177020898A Active KR102527430B1 (ko) 2014-12-26 2015-12-28 Gst-pi 유전자 조정을 위한 rna 간섭 제제
KR1020177020900A Withdrawn KR20170096199A (ko) 2014-12-26 2015-12-28 Kras 돌연변이와 관련된 악성 종양을 치료하기 위한 방법 및 조성물

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177020901A Withdrawn KR20170093988A (ko) 2014-12-26 2015-12-28 Gst-pi 유전자 조정을 위한 rna 제제
KR1020177020898A Active KR102527430B1 (ko) 2014-12-26 2015-12-28 Gst-pi 유전자 조정을 위한 rna 간섭 제제
KR1020177020900A Withdrawn KR20170096199A (ko) 2014-12-26 2015-12-28 Kras 돌연변이와 관련된 악성 종양을 치료하기 위한 방법 및 조성물

Country Status (10)

Country Link
US (14) US10264976B2 (ko)
EP (9) EP3236973A4 (ko)
JP (10) JP2018512373A (ko)
KR (4) KR20170098929A (ko)
CN (7) CN108064155B (ko)
AU (4) AU2015369592B2 (ko)
BR (2) BR112017013597B1 (ko)
CA (4) CA2972268A1 (ko)
RU (4) RU2017126601A (ko)
WO (7) WO2016106406A2 (ko)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
ES2789049T3 (es) * 2014-12-26 2020-10-23 Nitto Denko Corp Agentes de interferencia de ARN para modulación génica de GST-pi
US20180002702A1 (en) * 2014-12-26 2018-01-04 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
US11045488B2 (en) 2014-12-26 2021-06-29 Nitto Denko Corporation RNA interference agents for GST-π gene modulation
US10792299B2 (en) 2014-12-26 2020-10-06 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
CN107708739A (zh) 2015-06-24 2018-02-16 日东电工株式会社 可电离化合物、组合物及它们的用途
AU2016371624B2 (en) 2015-12-13 2020-08-27 Nitto Denko Corporation siRNA structures for high activity and reduced off target
CN109477146B (zh) 2016-05-10 2023-09-19 国立大学法人东京医科齿科大学 炎症促进因子表达抑制剂、其有效成分的筛选方法、对该方法有用的表达盒、诊断药和诊断方法
JP2019508379A (ja) * 2017-02-16 2019-03-28 日東電工株式会社 悪性腫瘍に対する治療方法及び治療用組成物
CN117105811A (zh) * 2017-11-06 2023-11-24 日东电工株式会社 用于递送生物活性分子的膜融合化合物
JP7376873B2 (ja) * 2017-11-09 2023-11-09 国立大学法人 東京医科歯科大学 がん促進因子発現抑制剤、その有効成分のスクリーニング方法、該方法に有用な発現カセット、診断薬、及び診断方法
CN109777798A (zh) * 2017-11-13 2019-05-21 深圳华大生命科学研究院 一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用
JP6952594B2 (ja) * 2017-12-15 2021-10-20 洋司郎 新津 細胞増殖抑制剤及びそれを含むがんの治療若しくは予防用医薬組成物
CN108486011B (zh) * 2018-03-27 2020-05-05 山东大学 一种三联苯化合物、制备方法及其应用
JP7432929B2 (ja) * 2018-05-31 2024-02-19 コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション マイクロｒｎａの非正規標的を抑制するｒｎａ干渉誘導核酸およびその用途
WO2020009189A1 (ja) * 2018-07-05 2020-01-09 洋司郎 新津 Ｂｒａｆ阻害剤によるがん細胞の逆説的増殖を抑制する薬剤
WO2020040185A1 (ja) * 2018-08-22 2020-02-27 日東電工株式会社 Ｈｓｐ４７の阻害物質を用いた、化学療法剤感受性の増強
CN112739381A (zh) * 2018-08-22 2021-04-30 日东电工株式会社 使用了hsp47的抑制物质的癌转移抑制
EP4365289A3 (en) * 2018-11-16 2024-07-10 Nitto Denko Corporation Rna interference delivery formulation and methods for malignant tumors
US20220016156A1 (en) * 2018-12-05 2022-01-20 Nitto Denko Corporation Rnai molecule for treating cancer
US20220202846A1 (en) 2019-01-10 2022-06-30 Osaka University Immunostimulating composition
EP3950005A4 (en) * 2019-03-28 2023-03-29 Nitto Denko Corporation RNAI MOLECULE
JP2019116507A (ja) * 2019-04-25 2019-07-18 有限会社オービット Ｈｓｐ４７の発現促進剤、脱毛抑制方法、Ｈｓｐ４７の発現促進剤の製造方法及び飲食物の製造方法
CA3143404C (en) * 2019-07-02 2024-03-05 Argonaute RNA Limited Apolipoprotein b antagonist
US20220267778A1 (en) * 2019-07-30 2022-08-25 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid drug targeting murf1
US20230061751A1 (en) * 2020-01-17 2023-03-02 University Of Massachusetts Universal dynamic pharmacokinetic-modifying anchors
CN112280800B (zh) * 2020-10-19 2022-06-07 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种构建体及其在制备动物衰老细胞示踪和衰老细胞清除药物中的应用
KR20230126725A (ko) * 2020-12-28 2023-08-30 1이 테라퓨틱스 엘티디. 침묵화를 위한 P21 mRNA 표적 부위
KR20230133859A (ko) 2020-12-28 2023-09-19 1이 테라퓨틱스 엘티디. p21 mRNA 표적화 DNA자임
KR102732910B1 (ko) * 2021-12-29 2024-11-20 의료법인 명지의료재단 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 대장암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법
KR102732912B1 (ko) * 2021-12-29 2024-11-20 의료법인 명지의료재단 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 선암종의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법
KR102732913B1 (ko) * 2021-12-29 2024-11-20 의료법인 명지의료재단 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 흑색종의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법
KR102732911B1 (ko) * 2021-12-29 2024-11-20 의료법인 명지의료재단 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 유방암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법
KR102732909B1 (ko) * 2021-12-29 2024-11-20 의료법인 명지의료재단 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 유두상 선암종의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법
EP4516905A1 (en) * 2022-04-27 2025-03-05 Kyoto University Epicardial cell regeneration promoter and method for promoting epicardial cell regeneration

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT88550A (pt) 1987-09-21 1989-07-31 Ml Tecnology Ventures Lp Processo para a preparacao de reagentes de ligacao nao nucleotidicos para sondas nucleotidicas
US5204241A (en) 1990-10-22 1993-04-20 Oxi-Gene Inc. Glutathione-S-transferase mu as a measure of drug resistance
US5786336A (en) 1991-04-29 1998-07-28 Terrapin Technologies, Inc. Target-selective protocols based on mimics
US5658780A (en) 1992-12-07 1997-08-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Rel a targeted ribozymes
ATE227342T1 (de) 1993-09-02 2002-11-15 Ribozyme Pharm Inc Enzymatische nukleiksaüre die nicht-nukleotide enthaltet
ES2127948T3 (es) 1993-10-27 1999-05-01 Ribozyme Pharm Inc Oligonucleotidos modificados en la posicion 2'-amido y 2'-peptido.
ATE280582T1 (de) 1995-06-07 2004-11-15 Telik Inc Stoffwechseleffekt von bestimmten glutation analogen
US5968737A (en) 1996-11-12 1999-10-19 The University Of Mississippi Method of identifying inhibitors of glutathione S-transferase (GST) gene expression
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
KR20010042752A (ko) 1998-04-16 2001-05-25 야스이 쇼사꾸 글루타티온 유도체 및 이의 투여 형태
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2005019453A2 (en) * 2001-05-18 2005-03-03 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20070083945A1 (en) 2000-03-10 2007-04-12 Byrum Joseph R Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US20030144236A1 (en) * 2000-03-29 2003-07-31 Weiss Robert H Novel specific inhibitor of the cyclin kinase inhibitor p21 (wafl/cip1)
IL154129A0 (en) 2000-07-28 2003-07-31 Compugen Inc Oligonucleotide library for detecting rna transcripts and splice variants that populate a transcriptome
EP1873259B1 (en) 2000-12-01 2012-01-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. RNA interference mediated by 21 and 22nt RNAs
US20030099974A1 (en) 2001-07-18 2003-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20040029275A1 (en) * 2002-08-10 2004-02-12 David Brown Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs
EP2305813A3 (en) * 2002-11-14 2012-03-28 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
WO2004055165A2 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 St. Jude Children's Research Hospital Glutathione-s-transferase test for susceptibility to parkinson's
AU2003224132A1 (en) * 2003-04-24 2004-11-19 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
US20050142596A1 (en) 2003-11-14 2005-06-30 Krolewski Andrzej S. Methods of diagnosing renal and cardiovascular disease
JP5243789B2 (ja) 2004-03-15 2013-07-24 シティ・オブ・ホープ 二本鎖ｒｎａによる遺伝子発現の特異的阻害のための方法及び組成物
WO2005111211A2 (en) * 2004-05-14 2005-11-24 Rosetta Genomics Ltd. Micronas and uses thereof
PT2386640E (pt) * 2004-08-26 2015-05-18 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Distribuição de ácidos nucleicos funcionais a células de mamífero através de minicélulas intactas, bacterialmente derivadas
US9393315B2 (en) * 2011-06-08 2016-07-19 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing siRNA activity
KR101454286B1 (ko) 2004-12-22 2014-10-27 닛토덴코 가부시키가이샤 섬유화 억제를 위한 약물 담체 및 약물 담체 키트
CA2605068A1 (en) 2005-04-15 2006-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Delivery of sirna by neutral lipid compositions
US20070134687A1 (en) * 2005-09-12 2007-06-14 Aurelium Biopharma Inc. Focused microarray and methods of diagnosing cancer
ES2324128A1 (es) * 2005-09-29 2009-07-30 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Metodo para el diagnostico de carcinoma hepatocelular mediante el empleo de marcadores moleculares.
US20090220956A1 (en) 2005-10-25 2009-09-03 Dimitry Serge Antoine Nuyten Prediction of Local Recurrence of Breast Cancer
AU2006308716A1 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi inhibition of influenza virus replication
RU2448974C2 (ru) * 2005-11-01 2012-04-27 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. РНКи-ИНГИБИРОВАНИЕ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСА ГРИППА
CA2628300C (en) 2005-11-02 2018-04-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified sirna molecules and uses thereof
CA2630214A1 (en) 2005-11-17 2007-05-31 Children's Medical Center Corporation Methods to predict and prevent resistance to taxoid compounds
US7729737B2 (en) 2005-11-22 2010-06-01 Isense Corporation Method and apparatus for background current arrangements for a biosensor
ES2419106T3 (es) 2005-12-01 2013-08-19 Pronai Therapeutics, Inc. Formulación de liposomas anfóteros
JP5342834B2 (ja) * 2008-09-05 2013-11-13 日東電工株式会社 骨髄線維症処置剤
US9572886B2 (en) * 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
WO2007130604A2 (en) * 2006-05-04 2007-11-15 Baylor Research Institute Anti-tumor activity of an oncolytic adenovirus-delivered oncogene sirna
EP3578656B1 (en) 2006-05-11 2021-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
US8067390B2 (en) 2007-03-02 2011-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Therapeutic targeting of interleukins using siRNA in neutral liposomes
TWI407971B (zh) 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
WO2008124634A1 (en) 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Polymer-encapsulated reverse micelles
ES2428009T3 (es) 2007-07-05 2013-11-05 Novartis Ag ARNds para tratar infecciones virales
JP2010537639A (ja) * 2007-08-27 2010-12-09 ボストン バイオメディカル， インコーポレイテッド 非対称性干渉ｒｎａの組成物およびその使用
WO2009033284A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Mcmaster University Inhibitors of collagen biosynthesis as anti-tumor agents
EP2268628B1 (en) * 2008-03-06 2012-05-16 Rottapharm S.p.A. 2-aryl and 2 -heteroaryl 4h-1-benzopyran-4-one-6-amidino derivatives for the treatment of arthritis, cancer and related pain
CA2732229C (en) 2008-07-25 2023-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Enhancement of sirna silencing activity using universal bases or mismatches in the sense strand
RU2505315C2 (ru) * 2008-07-30 2014-01-27 Нитто Денко Корпорейшн Носители лекарственных средств
RU2573409C2 (ru) * 2009-11-04 2016-01-20 Дзе Юниверсити Оф Бритиш Коламбиа Содержащие нуклеиновые кислоты липидные частицы и относящиеся к ним способы
TWI465238B (zh) 2009-12-09 2014-12-21 Nitto Denko Corp Ｈｓｐ４７表現之調節
WO2011106549A2 (en) 2010-02-24 2011-09-01 Bodysync, Inc. Methods for determining gene-nutrient interactions
WO2011112954A1 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 The Wistar Institute Inhibition of p21 and use thereof for inducing tissue regeneration
US8372819B2 (en) 2010-04-11 2013-02-12 Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for targeting skip
WO2011131472A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Institut Gustave Roussy Compounds and uses thereof to induce an immunogenic cancer cell death in a subject
AU2011249406B2 (en) 2010-05-06 2015-05-14 Stem Cell Medicine Ltd. Stem cell bank for personalized medicine
JP5950428B2 (ja) * 2010-08-05 2016-07-13 日東電工株式会社 線維化組織から正常組織を再生するための組成物
CN103221055A (zh) 2010-09-30 2013-07-24 日东电工株式会社 Timp1和timp2表达的调节
CN110123830A (zh) 2010-11-09 2019-08-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法
CN103857654B (zh) * 2011-06-08 2017-03-15 日东电工株式会社 用于定向药物输送和增强siRNA活性的化合物
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US9011903B2 (en) * 2011-06-08 2015-04-21 Nitto Denko Corporation Cationic lipids for therapeutic agent delivery formulations
CN103619355A (zh) * 2011-06-21 2014-03-05 日东电工株式会社 细胞凋亡诱导剂
US20140351961A1 (en) * 2011-08-31 2014-11-27 Alexzander A. Asea Compositions and methods for treatment of metastatic cancer
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
JP6093775B2 (ja) 2011-11-17 2017-03-08 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 自動認識治療用ｒ／ｄｎａキメラナノ粒子（ｎｐ）
HK1208361A1 (en) * 2012-05-16 2016-03-04 Aadigen, Llc Multi-target modulation for treating fibrosis and inflammatory conditions
US20140134158A1 (en) 2012-05-22 2014-05-15 Alberto Bardelli Kras mutations and resistance to anti-egfr treatment
LT2858974T (lt) * 2012-06-08 2018-12-10 Nitto Denko Corporation Lipidai, skirti terapinio agento pristatymo kompozicijoms
US9907828B2 (en) 2012-06-22 2018-03-06 The University Of Vermont And State Agricultural College Treatments of oxidative stress conditions
US9066938B2 (en) * 2012-07-02 2015-06-30 Fibrostein, S.L. GPBP-1 inhibition and its therapeutic use
WO2014022739A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
JP6340162B2 (ja) * 2012-12-20 2018-06-06 日東電工株式会社 アポトーシス誘導剤
CN105164102B (zh) 2013-03-08 2017-12-15 诺华股份有限公司 用于传递活性成分的脂质和脂质组合物
CN103695421B (zh) * 2013-12-09 2016-06-15 浙江大学 一种特异抑制p21基因表达的siRNA及其应用
US10792299B2 (en) * 2014-12-26 2020-10-06 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
US20180002702A1 (en) 2014-12-26 2018-01-04 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
US20160187319A1 (en) 2014-12-26 2016-06-30 Nitto Denko Corporation Cell death-inducing agent, cell growth-inhibiting agent, and pharmaceutical composition for treatment of disease caused by abnormal cell growth
CN113577290B (zh) * 2014-12-26 2023-10-24 日东电工株式会社 细胞死亡诱导试剂、细胞增殖抑制试剂及用于治疗由细胞增殖异常导致的疾病的医药组合物
AU2016371624B2 (en) * 2015-12-13 2020-08-27 Nitto Denko Corporation siRNA structures for high activity and reduced off target
JP6899201B2 (ja) 2016-06-23 2021-07-07 日東電工株式会社 細胞死誘導剤、細胞増殖抑制剤及び細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018513104A (ja) 2018-05-24
RU2719185C2 (ru) 2020-04-17
JP6457645B2 (ja) 2019-01-23
CN107108686B (zh) 2021-07-16
EP3236969A2 (en) 2017-11-01
EP3683309A1 (en) 2020-07-22
EP3236975A2 (en) 2017-11-01
WO2016106400A3 (en) 2016-09-01
USRE49431E1 (en) 2023-02-28
BR112017013597B1 (pt) 2024-01-16
JP2018513668A (ja) 2018-05-31
AU2015369596A1 (en) 2017-07-27
CA2972265A1 (en) 2016-06-30
EP3236945A2 (en) 2017-11-01
US9580710B2 (en) 2017-02-28
KR20170096199A (ko) 2017-08-23
US10047110B2 (en) 2018-08-14
CN108064153A (zh) 2018-05-22
EP3240796A1 (en) 2017-11-08
WO2016106404A3 (en) 2016-09-15
JP2022036954A (ja) 2022-03-08
RU2756253C2 (ru) 2021-09-28
AU2015369592B2 (en) 2021-05-06
EP3240796B1 (en) 2020-12-16
JP2018513669A (ja) 2018-05-31
JP2018512110A (ja) 2018-05-17
WO2016106401A3 (en) 2016-09-15
RU2017126613A3 (ko) 2019-06-05
EP3236974B9 (en) 2020-08-05
JP6730285B2 (ja) 2020-07-29
WO2016106403A2 (en) 2016-06-30
CA2972268A1 (en) 2016-06-30
WO2016106406A2 (en) 2016-06-30
US20160215286A1 (en) 2016-07-28
CN107106564A (zh) 2017-08-29
US20220087531A1 (en) 2022-03-24
JP2018512060A (ja) 2018-05-10
JP6793649B2 (ja) 2020-12-02
CN107108686A (zh) 2017-08-29
WO2016106406A3 (en) 2016-11-03
CA2971881C (en) 2023-04-04
USRE49229E1 (en) 2022-10-04
WO2016106400A2 (en) 2016-06-30
RU2017126610A (ru) 2019-01-28
JP6865169B2 (ja) 2021-04-28
RU2017126601A (ru) 2019-01-28
WO2016106404A2 (en) 2016-06-30
AU2015369592A1 (en) 2017-08-10
KR102527430B1 (ko) 2023-05-02
EP3236976A4 (en) 2018-10-31
EP3236973A2 (en) 2017-11-01
US10023597B2 (en) 2018-07-17
US20160208256A1 (en) 2016-07-21
US10264976B2 (en) 2019-04-23
US10047111B2 (en) 2018-08-14
JP2025102833A (ja) 2025-07-08
EP3236945B1 (en) 2021-02-17
EP3236975A4 (en) 2018-09-12
CA2972270A1 (en) 2016-06-30
US20160376296A1 (en) 2016-12-29
EP3240796A4 (en) 2018-08-08
JP7307137B2 (ja) 2023-07-11
US9695206B2 (en) 2017-07-04
WO2016106405A1 (en) 2016-06-30
CN107106591A (zh) 2017-08-29
CN107106591B (zh) 2020-09-01
US20160186182A1 (en) 2016-06-30
AU2015369595A1 (en) 2017-07-27
CN108064155A (zh) 2018-05-22
AU2015369598A1 (en) 2017-07-27
WO2016106403A3 (en) 2016-08-18
JP2023123743A (ja) 2023-09-05
BR112017013597A2 (pt) 2018-03-06
US20160186183A1 (en) 2016-06-30
US20160208265A1 (en) 2016-07-21
EP3798308A1 (en) 2021-03-31
KR20170100010A (ko) 2017-09-01
WO2016106402A1 (en) 2016-06-30
CA2971881A1 (en) 2016-06-30
EP3236945A4 (en) 2018-09-12
US20170298086A1 (en) 2017-10-19
USRE48887E1 (en) 2022-01-11
CN107106592B (zh) 2021-04-27
WO2016106401A2 (en) 2016-06-30
JP2018512041A (ja) 2018-05-10
JP7655971B2 (ja) 2025-04-02
EP3236976B1 (en) 2021-07-21
EP3236969A4 (en) 2018-06-13
KR20170093988A (ko) 2017-08-16
RU2017126610A3 (ko) 2019-07-17
CN108064155B (zh) 2021-06-08
CN108024961A (zh) 2018-05-11
JP2018512373A (ja) 2018-05-17
RU2017126613A (ru) 2019-01-28
EP3236974B1 (en) 2020-02-26
EP3236976A1 (en) 2017-11-01
US20160208254A1 (en) 2016-07-21
US20160208255A1 (en) 2016-07-21
EP3236974A4 (en) 2018-06-13
EP3236973A4 (en) 2018-09-12
US9771582B2 (en) 2017-09-26
US10405749B2 (en) 2019-09-10
US20170218365A1 (en) 2017-08-03
CN107106592A (zh) 2017-08-29
BR112017013599A2 (pt) 2018-03-06
RU2017126598A (ru) 2019-01-28
EP3236974A2 (en) 2017-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3236945B1 (en) Therapeutic compositions and methods for malignant tumors with rnai molecules targeted to hsp47 and p21
JP6457704B2 (ja) 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造
JP6978561B2 (ja) ＧＳＴ−π遺伝子を調節するためのＲＮＡ干渉剤
JP2019033741A (ja) 悪性腫瘍に対する治療方法及び治療用組成物
TW201717970A (zh) 使用標靶Ｈｓｐ４７和ｐ２１之ＲＮＡｉ分子之針對惡性腫瘤的治療性組成物和方法
ES2862187T3 (es) Composiciones terapéuticas y métodos para tumores malignos con moléculas de iARN dirigidas a Hsp47 y p21
TW201718853A (zh) 用於麩胱甘肽Ｓ轉移酶Ｐｉ（ＧＳＴ－π）基因調控之ＲＮＡ干擾劑

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20170725

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PC1203 Withdrawal of no request for examination