CN117085132A - 阻断胸膜间皮细胞cd93的活性物质及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种阻断胸膜间皮细胞CD93的活性物质及其应用。本申请公布了抗胸膜间皮细胞的CD93能促进肺部肿瘤或肺部感染过程中T细胞介导的细胞免疫应答，具有治疗肺部肿瘤或感染的作用，为肺部肿瘤或感染提供了一个新的治疗方案。

Description

阻断胸膜间皮细胞CD93的活性物质及应用
本申请主张中国在先申请，申请号：202210555701.6；申请日：2022年5月20日的优先权，该申请的说明书、附图、权利要求书与以及摘要作为本申请的一部分全部引用参考。
技术领域
本发明涉及CD93的阻断及应用，特别是涉及阻断胸膜间皮细胞CD93在治疗肺癌或肺部感染方面的应用。
背景技术
肺癌的发病率和死亡率位居世界第二，占恶性肿瘤死亡人数的18％。肺是多种癌症中最常见的转移器官之一，包括乳腺癌、黑色素瘤和骨肉瘤(Altorki NK,et al.Thelung microenvironment:an important regulator of tumour growth andmetastasis.Nat Rev Cancer2019,19(1):9-31；Daw NC,et al.Recurrent osteosarcomawith a single pulmonary metastasis:a multi-institutional review.Br J Cancer2015,112(2):278-282)。目前，肺癌主要以手术治疗为主，晚期则以化疗药物治疗为主，然而，化疗药物毒副作用大，易产生耐药性，寻找新的有效治疗方法仍是癌症治疗领域的研究热点。
CD93是新近被揭示的肿瘤治疗靶点。研究表明，阻断内皮细胞中IGFBP7激活的CD93信号，可抑制肿瘤新生血管生成，正常化肿瘤血管，激发抗肿瘤免疫(Sun,Yi etal.Blockade of the CD93 pathway normalizes tumor vasculature to facilitatedrug delivery and immunotherapy.Science translational medicine vol.2021,13(604):8922)，但是CD93是否存在于其他靶细胞上，阻断这些靶细胞上的CD93是否能用于治疗肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等癌症仍需要进一步研究。
发明内容
在研究CD93与肺肿瘤的过程中，本申请意外发现抑制胸膜间皮细胞的CD93能起到抑制肺肿瘤生长的效果。
本发明的第一方面，提供了一种作用于胸膜间皮细胞的CD93的活性物质。
所述物质能抑制胸膜间皮细胞的CD93基因表达，或者，所述物质能使胸膜间皮细胞CD93蛋白的含量降低，或者，所述物质能抑制胸膜间皮细胞CD93蛋白活性。通过抑制胸膜间皮细胞CD93的功能，所述物质有效抑制了肺肿瘤生长。进一步研究发现，所述物质作用于胸膜间皮细胞的CD93后，促进肺部肿瘤或肺部感染细胞特异性的T细胞介导的细胞免疫，因此具有抗肺肿瘤或抗肺感染作用。
优选地，所述T细胞为CD4+和/或CD8+ T细胞。
进一步地，所述物质促进树突状细胞迁移至肺部肿瘤或肺部感染部位，进而引起T细胞介导的细胞免疫。进一步地，所述物质抑制胸膜间皮细胞的CD93后，促进胸膜间皮细胞分泌的CCL21增加，CCL21作用于树突状细胞，促进树突状细胞向肺部肿瘤或肺部感染细胞聚集，进而引起T细胞介导的细胞免疫。进一步地，所述物质特异性抑制C1q/CD93信号传导途径。
本发明的第二方面，提供了所述活性物质在制备治疗肺部肿瘤或肺部感染试剂方面的应用。
在一些实施方式中，在使用所述试剂治疗肺部肿瘤或肺部感染时，通过胸腔注射的方式将所述试剂注射到患者胸腔中，或者通过静脉注射的方式并由靶向胸膜间皮细胞的靶向药物载体将所述物质输送到胸膜间皮细胞。
本发明的第三方面，提供了一种治疗肺部肿瘤或肺部感染的方法。所述方法通过抗胸膜间皮细胞的CD93引起肺部肿瘤或肺部感染细胞特异性的T细胞介导的细胞免疫来实现。
本发明的优势在于：本发明提供了肺癌或肺部感染治疗的新靶点，并进一步公开了一条新的肺癌或肺部感染治疗的作用通路，为肺癌治疗提供了新方向。
在另一方面，本发明提供一种能够治疗肺癌的方法，所述的方法包括如下方案。
一方面，本发明在有需要的受试者中提供了治疗肺肿瘤或者肺炎的方法，其包括向所述受试者施用有效量的特异性抑制C1q/CD93信号传导途径的C1q/CD93阻断剂。
在一些方式中，其中所述C1q/CD93阻断剂阻断C1q/CD93之间的相互作用。
在一些方式中，所述的C1q/CD93阻断剂包含特异性识别CD93的抗体或者抗体片段，或者特异结合或者识别C1q的抗体或者抗体片段。
在一些方式中，所述的阻断剂通过阻断C1q/CD93之间的相互作用，从而让CCL21的表达增多，或者活性增强，从而促进树突状细胞向肺部肿瘤或肺部感染细胞聚集。
在一些方式中，所述抗CD93抗体与CD93的C型凝集素结构域区域结合。
在一些方式中，所述的抗CD93抗体是抗人CD93抗体。所述的抗CD93抗体是全长抗体、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双抗体、三抗体或四抗体。
在一些方式中，所述的CD93是存在于胸膜间皮细胞中。在一些方式中，所述的抗CD93包含在融合蛋白中。
在一些方式中，所述的C1q/CD93阻断剂为多肽或者多肽片段。在一些方式中，所述的多肽是结合并抑制CD93功能的多肽，其结合于CD93的不同胞外结构域。在一些方式中，所述的多肽是可溶性多肽。
在一些方式中，其中所述多肽与CD93的结合亲和力大于与C1q的结合亲和力。或者，多肽与C1q的结合亲和力大于与CD93结合的亲和力。
在另外一方面，本发明提供一种确定候选药剂是否可用于治疗肺癌或者肺部炎症的方法，其包括：确定所述候选药剂是否破坏CD93/C1q相互作用，其中如果所述候选药剂显示特异性破坏CD93/C1q相互作用，则其可用于治疗肺癌或者肺部炎症。
在一些方式中，其中所述方法包括确定所述候选药剂是否破坏细胞表面上CD93与C1q的相互作用。
在一些方式中，其中所述方法包括确定所述候选药剂是否在体外测定系统中特异性破坏CD93和C1q的相互作用。所述的体外系统是是酵母双杂交系统。系统是基于ELISA的测定。
所述的候选药物是抗体、肽、融合肽、肽类似物、多肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer或小分子化合物中的一种或者多种。所述方法包括将所述候选药剂与CD93/C1q复合物接触。
附图说明
图1 EV和肿瘤细胞处理的试验方案流程图(肿瘤接种前注射EV)。
图2按图1方案胸腔注射LLC-EVs后小鼠LLC肺肿瘤大小。
图3按图1方案腹腔、皮下和注射静脉注射LLC-EVs后小鼠LLC肿瘤大小。
图4按图1方案胸腔注射5μgB16F10-EVs后小鼠B16F10-Luci肿瘤大小。
图5按图1方案胸腔注射5μgB16F10-EVs后小鼠LLC-luci肿瘤大小。
图6按图1方案胸腔注射5μg 4T1-EVs小鼠LLC-luci肿瘤大小。
图7第0天向小鼠皮下注射4T1细胞，第16天手术摘除皮下瘤，再于26天、28天、30天、32天、34天分别于胸腔注射5μg 4T1-EVs，在第37天取小鼠肺用H&E染色并定量检测。
图8 EV和肿瘤细胞处理的试验方案流程图(肿瘤移植后再注射EV)。
图9使用LLC-Luci细胞处理小鼠构建肺肿瘤模型后，按图8方案胸腔注射5μgLLC-EVs，第25天时肺肿瘤大小。
图10第0天和第1天在p53fl/flLSL-KrasG12D小鼠鼻内滴注表达Cre重组酶的腺病毒构建自发性肺肿瘤模型，然后在第30天、32天、34天和38天在在该小鼠胸腔注射5μg LLC-EVs，在第41天检测的小鼠肺肿瘤情况。
图11流式细胞仪检测图9LLC肺肿瘤小鼠的TILs(tumor-infiltratingleukocytes，肿瘤浸润白细胞)的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和DC的试验结果。
图12流式细胞仪检测图9LLC肺肿瘤小鼠的TILs的巨噬细胞、中性粒细胞和B细胞的试验结果。
图13用LLC-Luci细胞和5μg LLC-EVs按图8的方案处理CD11c-DTR小鼠，同时用白喉毒素(DT)处理，小鼠肺肿瘤生长情况。
图14用LLC-Luci细胞和5μg LLC-EVs按图8的方案处理CD11c-DTR小鼠，同时用白喉毒素(DT)处理，小鼠肺肿瘤TILs流式细胞仪检测结果。
图15用LLC-Luci细胞和5μg LLC-EVs按图8的方案处理小鼠，同时使用抗CD4抗体或抗CD8抗体，小鼠肺肿瘤生长情况。
图16用LLC-Luci细胞和5μg LLC-EVs按图8的方案处理小鼠，同时使用抗CD8抗体或抗CD8抗体，小鼠肺肿瘤TILs流式细胞仪检测结果。
图17在LLC肺肿瘤小鼠腹侧两边皮下注入分别注入LLC和B16F10细胞，并同时通过胸腔注射LLC-EVs的试验方案示意图。
图18按图17方案处理的小鼠腹侧的LLC和B16F10肿瘤大小。
图19第0天在正常小鼠的腹侧皮下注射LLC细胞，并在第2天、4天、6天、8天和10天胸腔注射5μg LLC-EVs，在第18天用流式细胞仪检测肺部DCs和T细胞的试验结果。
图20同图19处理小鼠，小鼠皮下肿瘤大小。
图21静脉或胸腔注射100μgVivoTrack 680标记的LLC-EVs，LLC-EVs在小鼠体内分布情况。
图22静脉或胸腔注射100μg PKH26标记的LLC-EVs，LLC-EVs在小鼠体内分布情况。
图23 2.5μg ml-1 CFSE标记的LLC-EVs处理p-pMCs和40L细胞24h后用荧光显微法检测p-pMCs和40L细胞摄取EVs的情况。
图24在小鼠胸腔注射20μg CFSE标记的LLC-EVs，24h后用立体显微镜检测进入胸膜的EVs情况。
图25除了在每次胸腔注射EVs前2h胸腔注射0.25mg kg-1Cyto-D，其他同图8的方案，用LLC-Luci细胞和CFSE标记的LLC-EVs处理小鼠，用立体显微镜检测进入胸膜的EVs情况。
图26同图25处理小鼠，用流式细胞仪检测TILs中的DC比例。
图27同图25处理小鼠，用IVIS测定肺肿瘤大小。
图28除了在每次胸腔注射EVs后2h胸腔注射0.25mg kg-1Cyto-D，其他同图8的方案，用LLC-Luci细胞和CFSE标记的LLC-EVs处理小鼠，用立体显微镜检测进入胸膜的EVs情况。
图29同图28处理小鼠，用流式细胞仪检测TILs中的DC比例。
图30同图28处理小鼠，用IVIS测定肺肿瘤大小。
图31用一定浓度的LLC-EVs刺激40L细胞24h，通过CCK8试验测定细胞活力。
图32用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs细胞或40L细胞，24h后通过Transwell趋化试验检测各细胞上清对DCs趋化性的影响。
图33使用特定siRNA转染BMDCs细胞使各趋化因子受体沉默(同时使用与目的基因无同源性的siRNA作为阴性对照，记为NC siRNA)后，通过蛋白免疫印迹法验证沉默效果。
图34在无siRNA沉默(NC siRNA)或有特定siRNA沉默各受体下，用2.5μg ml-1LLC-EV刺激40L细胞，24h后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs趋化性的影响。
图35在特定siRNA沉默ccr7受体的情况下，用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs，24h后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs趋化性的影响。
图36用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs，24h后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs(WT)或Ccr7-/-DCs趋化性的影响。
图37用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs或40L细胞，24h后用ELISA测定细胞上清液中的CCL19和CCL21a水平。
图38用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs或40L细胞，24h后用用real-time PCR测定细胞中的CCL19和CCL21a mRNA水平。
图39在有特定siRNA沉默CCL19或CCL21a的情况下，用2.5μg ml-1LLC-EV刺激40L细胞，24h后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs趋化性的影响(NC siRNA为对照组，未沉默CCL19和CCL21a)。
图40使用特定siRNA转染40L细胞使目标基因沉默后，通过蛋白免疫印迹法验证沉默效果(NC siRNA为对照组，未沉默CCL19或CCL21a)。
图41小鼠胸腔注射5μg ml-1LLC-EVs后24h，用real-time PCR测定胸膜Ccl21amRNA水平。
图42小鼠胸腔注射5μg ml-1LLC-EVs后24h，用蛋白免疫印迹法测定Ccl21a蛋白水平。
图43胸腔注射10μg胆固醇偶联Ccl21a siRNAs 24h后，用real-time PCR检测小鼠胸膜Ccl21a mRNA水平。
图44按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠，并在每次注射EVs前24h在胸腔注射10μg胆固醇偶联Ccl21a siRNAs，用流式细胞仪分析TILs中的DC频率。
图45按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠，并在每次注射EVs前24h在胸腔注射10μg胆固醇偶联Ccl21a siRNAs，用IVIS测定肺肿瘤大小。
图46按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠，用流式细胞仪分析TILs中的CCR7+DC频率。
图47按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理Ccr7-/-小鼠，用流式细胞仪分析TILs中的DC频率。
图48按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理Ccr7-/-小鼠，用IVIS测定肺肿瘤大小。
图49 RNA-Seq分析PBS处理40L细胞(对照)和使用LLC-EV处理过的40L细胞的mRNA水平。
图50与对照相比，使用LLC-EV处理过的40L细胞中|Log2FC|≥2的差异表达基因(DEGs)。
图51 31个DEGs的|Log2FC|和P值(a)以及与Ccl21a表达之间的关联度(b)。
图52 real-time PCR测得各种细胞中Cd93和Ccl21a mRNA水平。
图53 real-time PCR测得健康小鼠和LCC肺荷瘤小鼠胸膜Cd93和Ccl21a mRNA水平。
图54蛋白免疫印迹法验证40L细胞中CD93的沉默效果。
图55 2.5μg ml-1LLC-EVs刺激CD93沉默的40L细胞24h后，使用ELISA测定细胞上清液中CCL21水平。
图56蛋白免疫印迹法检测LLC-EVs刺激的p-pMCs中CD93。
图57在小鼠胸腔注射20μg LLC-EVs 24h后，用免疫荧光印记检测pMCs中的CD93(比例尺：10μm)。
图58real-time PCR检测胸腔注射过胆固醇偶联Cd93 siRNA的小鼠的Cd93 mRNA水平。
图59按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠并在每次注射EV前胸腔注射10μg胆固醇偶联Cd93 siRNA，用real-time PCR检测胸膜Ccl21 mRNA水平。
图60按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠并在每次注射EV前胸腔注射10μg胆固醇偶联Cd93 siRNA，用ELISA检测胸膜间皮细胞分泌的Ccl21蛋白水平。
图61按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠并在每次注射EV前胸腔注射10μg胆固醇偶联Cd93 siRNA，用IVIS检测肺肿瘤大小。
图62按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠并在每次注射EV前胸腔注射10μg胆固醇偶联Cd93 siRNA，用流式细胞仪测定TILs中DC、CD4+ T、CD8+ T细胞的比例。
图63 10μg ml-1蛋白酶K消化LLC-EVs 2h后，用流式细胞仪测定消化效果(以EVs膜蛋白CD9为代表)。
图64用10μg ml-1蛋白酶K消化LLC-EVs 2h后，用蛋白免疫印迹法测定消化效果(以EVs囊腔内蛋白Alix表示)。
图65用LLC-EVs和/或蛋白酶K消化后的LLC-EVs刺激40L细胞24h，通过ELISA测定细胞上清中的CCL21a水平
图66用10μg ml-1RNase I消化后LLC-EVs 2h后测量LLC-EVs中RNA含量。
图67 10μg ml-1RNase I消化2h后的LLC-EVs刺激40L细胞24h后用ELISA检测细胞上清中CCL21a水平。
图68 MLE-12EVs刺激40L细胞24h后用ELISA检测细胞上清中的CCL21a水平。
图69 miRNA array法对MLE-12-EVs和LLC-EVs的miRNA进行富集分析，获得的富集的miRNAs。
图70通过miRDB和TargetScan数据库预测Cd93上游的miRNAs。
图71富集的miRNAs与预测的Cd93上游的miRNAs的比对。
图72 real-time PCR检测转染miR-5110或miR-5107-5p类似物24h后，40L细胞中Cd93mRNA水平。
图73蛋白免疫印迹法检测转染miR-5110或miR-5107-5p类似物24h后，40L细胞中CD93蛋白水平。
图74用real-time PCR检测转染miR-5110或miR-5107-5p类似物24h后，40L细胞中miR-5110或miR-5107-5p类似物的过表达水平。
图75在Cd93 3’-UTR中miR-5110的靶标序列(WT)以及对应的突变序列(MUT)。
图76向40L细胞转入携带有图75中Cd93 3’-UTR WT或MUT片段的荧光素酶质粒(Renilla荧光素酶质粒)和miR-5110类似物，24h后测定荧光素酶活性。
图77 real-time PCR定量检测细胞和EVs中的miR-5110表达。
图78用2.5μg ml-1 LLC-EVs刺激转染了miRNA抑制剂NC、miR-5110抑制剂的40L细胞24h后，用蛋白免疫印迹法检测细胞中CD93水平。
图79 real-time PCR证实转染了miR-5110抑制剂的40L细胞中，miR-5110水平降低。
图80 real-time PCR测得EVs中miRNA-5110水平。
图81用2.5μg ml-1LLC-EVs、LLC-EVs-miR-5110Ins或LLC-EVs-miR-5110Des刺激40L细胞24h后，蛋白免疫印迹法测得细胞中的CD93水平。
图82按图8的方案用LLC-Luci细胞和相应的EVs处理小鼠，第25天时IVIS测得的肿瘤大小。
图83 LLC肺荷瘤小鼠中肿瘤来源的EVs(TT-EVs)或血清EVs(sEVs)中的miR-5110水平和胸膜Cd93 mRNA水平的相关性。
图84 real-time PCR测得人NCI-H2452细胞和HUVECs中Cd93和Ccl21 mRNA水平。
图85 ELISA检测NCI-H2452细胞(CD93被沉默：Cd93 siRNA；CD93没有被沉默：NCsiRNA)上清中的CCL21水平。
图86 Transwell趋化试验检测NCI-H2452细胞(CD93被沉默：Cd93 siRNA；CD93没有被沉默：NC siRNA)上清对DCs(CCR7被沉默：Ccr7 siRNA；CCR7没有被沉默：NC siRNA)趋化作用。
图87蛋白免疫印迹证实NCI-H2452细胞中CD93被沉默。
图88蛋白免疫印迹证实DCs中CCR7被沉默。
图89 real-time PCR定量检测病人TTs和TT-TVs中miR-5193水平。
图90 2.5μg ml-1TT-EVs刺激NCI-H2452细胞24h后，蛋白免疫印迹检测细胞中CD93水平。
图91图89中测得的TT-EV miR-5193水平与图90中CD93蛋白水平的抑制百分比之间的相关性。
图92来自恶性胸腔积液(MPEs)细胞沉淀物代表性的免疫荧光图像。
图93 MPEs中各因子之间的相关性。
图94 TTs中各因子之间的相关性。
图95肺TTs代表性的免疫组化的代表性图像。
图96 TT-EV/miR-5193hi和TT-EV/miR-5193lo肺癌患者的总体生存曲线。
图97蛋白免疫印迹证实在40L细胞或NCI-H2452细胞中C1qA、MMRN2和IGFBP7过表达。
图98 real-time PCR测得C1qA、MMRN2或IGFBP7过表达细胞中Ccl21a mRNA水平。
图99 2μg ml-1重组C1qA刺激40L细胞或NCI-H2452细胞24h后，ELISA检测细胞上清中的CCL21a或CCL21水平。
图100按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天向LLC-Luci荷瘤小鼠胸腔注射5μg C1qA，在第25天用蛋白免疫印迹测得的胸膜CCL21a蛋白水平。
图101按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天向LLC-Luci荷瘤小鼠胸腔注射5μg C1qA，在第25天用IVIS检测的肺肿瘤体积。
图102按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天向LLC-Luci荷瘤小鼠静脉注射100μg胆固醇偶联的C1qa ASOs(cholesterol-conjugated C1qa antisenseoligonucleotide，胆固醇偶联C1qa反义寡核苷酸；C1qa反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示)，在第25天用蛋白免疫印迹测得胸膜CCL21a蛋白水平；同时使用胆固醇偶联的阴性对照基因的反义寡核苷酸处理作为对照(NCASOs，其反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示)。
图103按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天向LLC-Luci荷瘤小鼠静脉注射100μg胆固醇偶联的C1qa ASOs，在第25天用IVIS检测的肺肿瘤体积。
图104 ELISA测得LLC肺荷瘤小鼠和肺癌病人血清中C1qA水平。
图105全长和截短的CD93示意图。
图106将图105所示的全长或截短的CD93片段转入40L细胞中48h后，real-timePCR测得各CD93片段在细胞中的表达水平。
图107将图105所示的全长或截短的CD93片段转入40L细胞中48h后，real-timePCR测得Ccl21a mRNA。
图108将图105所示的全长或截短的CD93片段转入40L细胞中48h后，ELISA测得细胞上清中的CCL21a蛋白水平(CD93ΔCTLD组中，CD93的CTLD结构域被切除)。
图109 ELISA测得M057与小鼠CD93抗原结合的Kd值。
图110使用M057染色WT小鼠或Cd93-/-小鼠的骨髓细胞的结果。
图111静脉注射Alexa Fluor 680标记的M057后24h，用IVIS检测WT小鼠或Cd93-/-小鼠胸膜中M057的分布。
图112用10μg ml-1抗CD93抗体(M057)和/或2μg ml-1 C1qA处理40L细胞和p-pMCs24h后，ELISA测得细胞上清中的CCL21a水平。
图113静脉注射一定剂量M057至LLC肺荷瘤小鼠24h后，real-time PCR测得胸膜中Ccl21a mRNA水平。
图114按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天静脉注射100μg M057至LLC-Luci肺荷瘤小鼠，在第25天蛋白免疫印迹测得胸膜CCL21a蛋白水平。
图115按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天静脉注射100μg M057至LLC-Luci肺荷瘤小鼠，在第25天用IVIS测得肺肿瘤大小。
图116按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天静脉注射100μg M057至LLC-Luci肺荷瘤小鼠，在第25天流式细胞仪测得TILs中DC、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞频率。
图117在LLC-Luci肺荷瘤小鼠的两侧皮下分别接种LLC和B16F10肿瘤，接着在第8天、10天、12天、14天和16天用100μg M057治疗，第10至第18天皮下肿瘤大小情况。
图118按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在没有敲除CCL21a(NC siRNA)和敲除了CCL21a(Ccl21a siRNA)的LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射100μg M057，在第25天用IVIS测得的肺肿瘤大小。
图119每隔一天向健康小鼠静脉注射100μg M057，5次注射后LEISA测得小时血清中的ALT、AST、胆红素和肌酐水平。
图120每隔一天向健康小鼠静脉注射100μg M057，5次注射后用H&E染色(比例尺：40μm)测得小鼠心、肝、脾、肺和肾的组织病理学损伤情况。
图121 10μg ml-1M057和/或2μg ml-1IGFBP7处理小鼠肺原代内皮细胞24h后进行calcein-AM染色，荧光显微法检测到血管生成情况及统计分析数据。
图122按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射100μg M057，第25天取肿瘤组织并对NG2和CD31或者αSMA和CD31进行染色和定量分析。
图123按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射100μg M057，第25天用5mg FITC-dextran(70kDa)灌注测定的肿瘤内皮渗透性。
图124按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射一定量抗VEGFR试剂，第25天用IVIS测得的肺肿瘤大小。
图125按图8方案在第13天、15天、17天、19天和21天在LLC-Luci肺荷瘤WT小鼠静脉注射40μg抗VEGFR试剂并在每次注射抗VEGFR试剂12h后静脉注射100μg M057或IgG，第25天用IVIS观测到的肺肿瘤大小。
图126按图8方案在第13天、15天、17天、19天和21天在LLC-Luci肺荷瘤Ccr7-/-小鼠静脉注射40μg抗VEGFR试剂并在每次注射抗VEGFR试剂12h后静脉注射100μg M057或IgG，第25天用IVIS观测到的肺肿瘤大小。
图127第0天在正常小鼠的腹侧皮下注射LLC细胞，第7天、9天、11天和15天静脉注射40μg抗VEGFR试剂并在每次注射抗VEGFR试剂12h后静脉注射100μg M057或IgG，第10至第18天皮下肿瘤大小情况。
图128按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射40μg抗VEGFR试剂或100μg M057，第25天用IVIS检测到的肺肿瘤大小。
图129按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤Ccr7-/-小鼠静脉注射40μg抗VEGFR试剂或100μg M057，第25天用IVIS检测到的肺肿瘤大小。
图130按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在B16F10和4T1肺荷瘤小鼠静脉注射50μg抗PD-1试剂，同时注射100μg M057或不注射100μg M057，第25天用IVIS检测的肺肿瘤大小。
图131按图8方案在第14天、16天、18天、20天和22天在B16F10和4T1肺荷瘤小鼠静脉注射50μg抗PD-1试剂，同时注射100μg M057或不注射100μg M057，第25天肺H&E染色结果。
图132抗PD-1处理的肺癌病人，在不同sEV/miR-5193和血清C1qA水平下的PFS。
图133是本发明的原理结构示意图。
图134 real-time PCR检测H1N1感染小鼠中胸膜Cd93的表达水平。
图135 real-time PCR检测胸膜CD93敲低小鼠中肺组织H1N1的感染水平。
图136胸膜敲低和未敲低CD93的小鼠在感染H1N1后，肺组织H&E染色结果(标尺，50μm)。
图137胸膜敲低和未敲低CD93的小鼠在感染H1N1后，其总体生存率分析。
详细说明
本发明除了属于具有定义外，其它属于按照本发明的技术领域一般人员所理解的含义。以下说明并不构成对本法的任何限制，本发明的范围由本发明的权利要求所限定。
定义
(1)细胞外囊泡或胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)
EVs是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层磷脂膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。它们广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程，在细胞间成分交换、信号转导和病理发育等方面发挥着重要作用。肿瘤源性胞外囊泡(tumor-derived EVs，TDEVs或TEVs)为肿瘤细胞产生并释放到胞外的一种EVs，被发现与肿瘤微环境和肿瘤发展有关，其与肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞及胞外间质等进行信息交换，影响肿瘤进展。TDEVs可设计为一种具有高靶向性和高渗透性的天然药物载体。
本申请中TT-EVs为肿瘤组织中的细胞外囊泡(EVs from tumor tissues)。
(2)间皮细胞(mesothelial cells，MC或MCs)和胸膜间皮细胞(pleuralmesothelial cells，pMCs)
MCs属于上皮组织中的单层扁平上皮，由中胚层发育而来。间皮是覆盖于胸膜，腹膜和心包膜表面的一层膜，能提供润滑，使器官与器官、器官与胸膜与腹膜间都能得到良好的保护，不会互相磨损受伤。间皮所提供的润滑和保护作用就是靠间皮细胞所分泌的物质来达成，这些物质多半为细胞外基质、玻尿酸类物质。pMCs为覆盖于胸膜上的一层间皮细胞，不仅能够提供一个光滑无黏连的表面以利于肺脏的运动，还具有其它许多重要功能，包括胸水的吸收和物质的转运、分泌黏多糖和表面活性物质、参与炎症反应、征集白细胞、抑制肿瘤的生长与播散、溶解纤维素、以及参与胸膜损伤的修复等。
(3)树突状细胞(dendritic cells，DC或DCs)
DCs在1973年第一次由Steinman和Cohn在单核细胞中分离出来，由于其因其成熟过程中有树突状或伪足样的突起而命名为树突状细胞。DCs是已知体内功能最强、惟一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。在肿瘤免疫中，DCs不能直接杀伤肿瘤细胞，但能通过识别肿瘤细胞特异性抗原，将其信号呈递给具杀伤效应的T细胞来达到监测、杀灭肿瘤的功能。
(4)CCL21(C-C motif chemokine ligand 21)和CCR7(C-C Chemokine receptor7)
CCL21又称exodus-2、次级淋巴组织趋化因子(SLC)，属于CC趋化因子家族的一种小细胞因子，在人类基因组中位于第9号染色体上。CCL21可以在淋巴管起始处和淋巴器官中组成型表达，存在于几种基质细胞和高内皮小静脉(HEV)上，可以与糖胺聚糖(GAG)结合并固定在内皮细胞表面。CCL21与特定的受体CCR7结合才能发挥生物学功能。CCL21可趋化淋巴细胞、巨噬细胞和T细胞等多种免疫细胞，介导应激反应、感染、血管形成及树突状细胞成熟等多种生理及病理过程。
趋化因子受体CCR7是一种包含7个跨膜结构域的G蛋白连接的细胞表面受体，并通过异三聚体G蛋白及其下游效应器参与信号转导。CCR7的独家配体是CCL19、CCL21，分别介导不同的生理学功能。CCR7主要在T细胞、B细胞、活化的NK细胞和树突状细胞等免疫细胞表面表达。另外在一些如肿瘤细胞等的非免疫细胞也有表达。在维持机体稳态或感染时，与其高亲和力的功能性配体之一CCL21结合，诱导淋巴细胞归巢，引起一系列免疫反应。
(5)C1q(Complement 1)和C1QA(complementcomponent 1,q subcomponent，Achain)
补体C1q分子是由6个亚单位组成的异源六聚体，每个亚单位分别由C1QA、C1QB、C1QC基因编码的A、B、C 3条多肽链组成，即C1q由18条多肽链构成。C1q是先天性免疫补体系统经典途径的重要识别分子，能够启动经典途径从而在免疫调节、炎症调节和维持机体平衡等方面发挥重要作用。
C1QA(或C1qA)是补体C1q的其中一条子链，是先天性免疫及适应性免疫系统的重要组成部分，在补体系统经典通路中起重要作用，其通过互补依赖或独立的方式执行多种免疫和非免疫功能，在肿瘤进展中发挥促进或抑制作用。
(6)T细胞介导的细胞免疫
T细胞介导的细胞免疫通过T细胞发挥效应来清除异物。效应T细胞具有抗原识别受体，必需经抗原激发才能活化发挥其效应细胞的作用，是一种特异性细胞免疫。由T细胞介导的细胞的免疫有二种基本形式，它们分别由二类不同的T细胞亚类参予。一种是迟发型超敏性的T细胞(CD4+)，该细胞和抗原起反应后可分泌细胞因子。这些细胞因子再吸引和活化巨噬细胞和其它类型的细胞在反应部位聚集，成为组织慢性炎症的非特异效应细胞。另一种是细胞毒性T细胞(CD8+)，对靶细胞有特异杀伤作用。
具体实施方式
为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。这些说明仅仅是表明本发明是如何实现的，并不能限定本发明的具体范围。本发明的范围在权利要求中限定。
本申请提供了作用于胸膜间皮细胞(pMCs)中CD93的活性物质，该活性物质能抑制胸膜间皮细胞中CD93基因的表达，使CD93 mRNA水平下降或抑制CD93 mRNA转录；或者该活性物质能使CD93蛋白含量降低，除了抑制CD93基因表达外，也可能使CD93蛋白降解；或者所述物质抑制胸膜间皮细胞CD93蛋白活性，如所述物质为CD93抗体时,或者改物质能够影响Cq1与CD93的结合。可以理解，这些活性物质如果能够抑制胸膜间皮细胞中C1q基因的表达，使C1q mRNA水平下降或抑制C1q mRNA转录；或者该活性物质能使C1q3蛋白含量降低，除了抑制C1q基因表达外，也可能使C1q蛋白降解；或者所述物质抑制胸膜间皮细胞C1q蛋白活性，如所述物质为C1q抗体。。
在本申请的一个实施方式中，所述活性物质为TEVs。本申请发现只有胸腔注射TEVs能抑制肺肿瘤生长，而皮下、腹腔或静脉注射TEVs均不能抑制肺肿瘤生长。
进一步研究发现胸腔注射TEVs能作用于pMCs，并促进全身肿瘤特异性T细胞免疫，从而具有肺肿瘤抑制作用。EVs刺激pMCs后，pMCs释放CCL21招募DC，DC对局部肿瘤抗原进行提呈、促进局部抗肿瘤T细胞免疫。肺部的肿瘤特异性T细胞经血液循环，在其他部位(皮下)遇到相同肿瘤抗原刺激后迅速活化，又能抑制其他部位相同肿瘤的生长。
有趣的是，只有在存在肺肿瘤时，胸腔注射TEVs才能引起全身肿瘤特异性T细胞免疫，仅存在皮下肿瘤等其他部位肿瘤时，胸腔注射TEVs不会引起全身肿瘤特异性T细胞免疫，这进一步说明了pMCs是TEVs引起全身肿瘤特异性T细胞免疫的作用位点。另外，在肺部及其他身体部位同时存在同种肿瘤时，例如皮下，使用所述活性物质除了抑制肺肿瘤外也能抑制其他部位的同种肿瘤(同一类别肿瘤但不同位置)。这里的T细胞包括CD4+和CD8+ T细胞，全身肿瘤特异性T细胞免疫是由DCs介导的，胸腔注射TEVs后，会使DCs聚集于肺肿瘤部位，进而为CD4+和CD8+ T细胞呈递抗原。
特别地，TEVs作用于pMCs中的CD93，使CD93表达下降，促进pMCs分泌更多的CCL21。进一步地，CCL21与树突状细胞的CCR7受体结合，从而促进DCs向肺肿瘤部位聚集。需要说明的是，DCs的受体除了CCR7外，还包括CCR1、CCR2、CCR5、CCR6等其他受体，CCR7的配体除了CCL21外，也还有CCL19，本申请发现所述活性物质作用于pMCs中CD93，促进pMCs分泌CCL21且CCL21与DCs的CCR7受体结合，进而引发后续的全身肿瘤特异性T细胞免疫。
在一些实施方式中，所述活性物质特异性抑制C1q/CD93信号传导途径。CN202080075436.0公开了抑制IGFBP7/CD93信号传导途径能促进血管生成从而具有肿瘤抑制作用。不同于CN202080075436.0，本申请的活性物质通过引发全身肿瘤特异性T细胞免疫来抑制肿瘤。尤其是，所述活性物质通过抑制C1q/CD93信号传导途径，进而抑制pMCs的CD93，接着促进pMCs分泌CCL21，CCL21与DCs的CCR7受体结合，导致DCs聚集并引发全身肿瘤特异性T细胞免疫。
需要说明的是，所述活性物质除了作用于C1q/CD93信号传导途径，也可作用于下游的CCL21，例如所述活性物质可以为促进CCL21转运的载体，使CCL21更易达到DCs，可以是促进CCL21与CCR7结合的物质；所述活性物质也可作用于下游的DCs，如使DCs增加或使DCs上的CCR7受体增加。
所述抑制C1q/CD93信号传导途径的活性物质为CD93/C1q阻断剂，该阻断剂可以作用于CD93，也可以作用与C1q，也可以是作用与两者之间的相互关系；该阻断剂可以是抗体、多肽、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或基因编辑系统、融合蛋白、肽类似物、适体、avimer、anticalin、speigelmer或小分子化合物等中的一或多种，与CN202080075436.0类似形式的能阻断C1q/CD93信号传导途径的活性物质都属于本申请的阻断剂范围。
在一些实施方式中，所述阻断剂能与CD93的C型凝集素结构域结合，抑制CD93活性。
在一些实施方式中，本申请发明所述miRNA为miR-5193或miR-5110，或者与miR-5193同源或与miR-5110同源的miR-5193类似物或miR-5110类似物。这里的同源是指现有来源于不同物种中与miR-5193或miR-5110相似且具有相同功能的miRNA，也指具有60％及以上(如70％、72％、80％、90％、99％、100％等)的相同序列且功能相同的人工合成或天然来源的miRNA。
在一些实施方式中，本申请抑制肿瘤的作用仅通过全身肿瘤特异性T细胞免疫进行，具体通过抑制C1q/CD93信号传导途径，进而抑制pMCs的CD93，接着促进pMCs分泌CCL21，CCL21与DCs的CCR7受体结合，导致DCs聚集并引发全身肿瘤特异性T细胞免疫。
在一些实施方式中，本申请的全身肿瘤特异性T细胞免疫可以与CN202080075436.0的促进血管生成同时进行，即所述活性物质在抑制pMCs C1q/CD93信号传导途径的同时具有抑制IGFBP7/CD93信号传导途径的作用，这样可以发挥更好的抗肿瘤作用。
除了上述的肿瘤抑制作用外，本申请发现所述活性物质也能通过引起特异性的T细胞免疫来治疗肺部感染，抗肺部感染的作用方式与抗肿瘤类似，不再一一赘述。
本申请的另一方面提供了所述活性物质在制备治疗肺部肿瘤或肺部感染试剂或药物方面的应用。特别地，所述活性物质在治疗肺部肿瘤的同时也能治疗其他部位的同种肿瘤，尤其适用于发生肺部肿瘤并有肿瘤转移的个体的治疗。
本申请中的同种肿瘤是指相同或相似类型肿瘤细胞引起的肿瘤，肿瘤的位置可以不同，例如在人患有肺部肿瘤后，该肺部肿瘤后面发生了转移，如转移到腹部，这时的腹部肿瘤和肺部肿瘤细胞是类似的，记为同种肿瘤。发生于动物或人体不同部位的同种肿瘤的肿瘤细胞作为抗原时具有相同或相似的性质，因而能产生相同的抗体。
在一些实施方式中，在使用所述试剂治疗肺部肿瘤或肺部感染时，通过胸腔注射的方式将所述试剂注射到患者胸腔中，或者通过静脉注射的方式并由靶向胸膜间皮细胞的靶向药物载体将所述物质输送到胸膜间皮细胞。
当然，所示试剂或药物不限于液体注射制剂，也可以是胶囊、片剂、冻干粉、乳剂等其他类型。所述活性物质可以与赋形剂、稀释剂、缓释成分、防腐剂、助悬剂等其他辅助成分中的一种或多种共同制备成所述试剂或药物。
实施例子
本发明的实施例子仅仅是对如何实现本发明的技术方案的具体示例性的列举，并不能对本发明构成任何的限制。
实施例1胸腔注射TEV通过促进DC聚集及肿瘤特异性T细胞免疫从而抑制肺肿瘤生长
本实施例研究发现胸腔注射TEVs剂量依赖性的抑制肺肿瘤生长，而腹腔注射或皮下注射均不会抑制肺肿瘤生长，静脉注射TEVs反而促进肺肿瘤生长。
此外，胸腔注射TEVs抑制肺肿瘤时，促进DCs向肺肿瘤聚集，使CD4+和CD8+ T细胞增加。胸腔注射TEVs不仅能抑制肺肿瘤也能抑制其他部位的同种肿瘤，而仅存在其他部位肿瘤无肺肿瘤时，胸腔注射TEVs并不能抑制其他部位肿瘤，证实了胸腔注射TEVs引起系统的肿瘤特异性T细胞免疫。肺部肿瘤分为两种，自发性的肿瘤以及别的地方转移到肺部的肿瘤。
为了研究TEVs对胸腔肺转移瘤的作用，我们将能表达荧光素酶的LLC细胞(LLC-Luci)静脉注经胸膜腔注射(尾静脉回输肿瘤细胞模拟经血液转移并定位至肺的肿瘤；摘除4T1皮下瘤促进4T1向肺转移、基因鼠中滴加Ad Cre病毒，模拟自发转移性肺肿瘤)过LLC-EVs(LLC细胞分泌的胞外囊泡)的小鼠，如图1，在第5天静脉注射1×106LLC-Luci肿瘤细胞构建肺转移瘤模型(转移至肺部形成肺肿瘤)，并在第0天、2天、4天、6天和8天胸腔注射不同量(2.5μg、5μg、10μg)的LLC-EVs，在第30天时取小鼠肺进行检测。检测结果如图2，胸腔注射LLC-EVs的小鼠肺部肿瘤体积明显小于控制组(胸腔注射PBS)，并且注射10μgLLC-EVs的肺肿瘤体积小于注射5μg LLC-EVs的，进一步小于注射2.5μg LLC-EVs的，说明胸腔注射LLC-EVs剂量依赖性地抑制LLC肺肿瘤生长。然而，在第5天静脉注射1×106LLC-Luci肿瘤细胞构建肺转移瘤模型，并在第0天、2天、4天、6天和8天经腹腔或皮下或静脉注射5μgLLC-EVs，第30天时测得肺部肿瘤情况如图3，可知腹腔注射或皮下注射LLC-EVs并不会影响LLC肺肿瘤，静脉注射LLC-EVs反而促进LLC肺肿瘤增长。同理，使用B16F10-Luci肿瘤细胞代替LLC-Luci，并用B16F10-EVs(B16F10细胞分泌的胞外囊泡)代替LLC-EVs进行上述试验，结果如图4，说明在胸腔注射B16F10-EVs也可以抑制肺转移B16F10-Luci肿瘤生长。除此以外，在第5天静脉注射LLC-Luci肿瘤细胞，并在第0天、2天、4天、6天和8天胸腔注射5μgB16F10-EVs，第30天观察的肺肿瘤情况如图5；同时，在5天静脉注射LLC-Luci肿瘤细胞，并在第0天、2天、4天、6天和8天胸腔注射5μg4T1-EVs(4T1乳腺癌细胞分泌的EVs)，第30天观察的肺肿瘤情况如图6，由图5-6的结果可知胸腔注射B16F10-EVs或4T1-EVs能抑制LLC-Luci引起的肺转移瘤，这说明这种TEVs抑制肺肿瘤生长的现象并非依赖于肿瘤特异性抗原和MHC I类分子。
为了检测胸腔注射TEVs对自发性肺转移瘤的作用，我们在小鼠皮下植入易转移到肺部的4T1细胞，具体为第0天向小鼠皮下注射4T1细胞，第16天手术摘除肿瘤，再于26天、28天、30天、32天、34天分别于胸腔注射5μg 4T1-EVs，在第37天取小鼠肺进行检测，结果如图7，可知注射4T1-EVs组肺肿瘤面积明显小于控制组(PBS组，用PBS缓冲液代替4T1-EVs),说明在胸腔注射4T1-EVs也能抑制4T1自发性肺转移瘤的生长。
为了检测胸腔注射TEVs是否能治疗肺肿瘤，在肿瘤移植后胸腔注射LLC-EVs，观察肺肿瘤生长情况。具体实验方案如图8，在第0天静脉注射肿瘤细胞，在第14天、16天、18天、20天和22天胸腔注射TEVs，在第25天的时候检测肿瘤生长情况。图9肿瘤细胞为LLC-Luci，TEVs为5μg LLC-EVs时，按图8方案测得的肺肿瘤生长情况，可知胸腔注射TEVs显著抑制肺肿瘤生长，能用于肺肿瘤的治疗。此外，第0天和第1天在p53fl/flLSL-KrasG12D小鼠鼻内滴注表达的Cre重组酶的腺病毒构建自发性肺肿瘤模型，然后在第30天、32天、34天和38天在在该小鼠胸腔注射5μg LLC-EVs，小鼠肺肿瘤生长情况如图10，试验组肺肿瘤面积显著小于控制组，说明自发性肺肿瘤在p53fl/flLSL-KrasG12D小鼠上时，胸腔注射LLC-EVs也显示肿瘤抑制作用。因此，上述这些结果说明胸腔注射TEVs能有效持续抑制肺肿瘤生长，能应用于肺肿瘤的治疗。
为了研究胸腔注射TEVs是怎样抑制肺肿瘤生长的，我们检测了LLC肺肿瘤的肿瘤浸润白细胞(tumor-infiltrating leukocytes，TILs)。进一步地，对上述静脉注射LLC-Luci肿瘤细胞并胸腔注射5μg LLC-EVs治疗的小鼠的TILs进行检测，实验结果如图11-12，发现胸腔注射LLC-EVs使CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和DCs的比例显著升高，而巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞以及B细胞的比例没有改变。因此，我们猜测胸腔注射TEVs能促进DC向肺肿瘤聚集，随后促进肿瘤抗原呈递给CD4+和CD8+ T细胞，从而使CD4+ T细胞、CD8+T细胞和DCs数量增加。
我们使用CD11c白喉毒素受体(CD11c-diphtheria toxin receptor，DTR)小鼠(腹腔注射白喉毒素时可以选择性删除全身DCs)进行LLC-EVs的抗肿瘤试验，用LLC-Luci细胞和5μg LLC-EVs按图8的方案处理CD11c白喉毒素受体小鼠，同时用白喉毒素处理，第25天时肺部肿瘤情况如图13，TILs检测结果如图14，发现剔除DCs后胸腔注射LLC-EVs抑制肺肿瘤生长的现象被显著逆转，胸腔注射LLC-EVs后小鼠TILs中的CD4+和CD8+ T细胞比例和数目也没有增加。此外，用LLC-Luci细胞和5μg LLC-EVs按图8的方案处理小鼠，同时使用抗CD4抗体或抗CD8抗体，第25天时肺部肿瘤情况如图15，TILs检测结果如图16，使用CD4+或CD8+ T细胞阻断抗体阻断CD4+或CD8+ T细胞后，胸腔注射LLC-EVs也不再抑制肿瘤生长,，然而，不管是阻断CD4+ T细胞还是阻断CD8+ T细胞，胸腔注射LLC-EVs依旧可以使TILs中DCs增加。上述结果说明DCs数目的变化导致了CD4+ T细胞和CD8+ T细胞数目变化，即DCs的变化是在CD4+T细胞和CD8+ T细胞之前的。
如图17，在LLC肺肿瘤的小鼠两边腹侧分别注射LLC和B16F10细胞构建多处肿瘤小鼠模型，再通过胸腔注射LLC-EVs，两边腹侧的肿瘤体积如图18所示，腹部LLC肿瘤体积显著小于对照组(PBS组)，可知腹部B16F10肿瘤体积与对照组无显著差异，说明腹部LLC肿瘤均被显著抑制，另一腹侧的B16F10肿瘤未被明显抑制。此外，第0天在正常小鼠的腹侧皮下注射LLC细胞，并在第2天、4天、6天、8天和10天胸腔注射5μg LLC-EVs，在第18天用流式细胞仪检测肺部DCs和T细胞试验结果如图19，皮下肿瘤大小变化如图20，与对照相比DCs显著升高，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞以及肿瘤体积无显著变化，这些结果说明在不存在肺肿瘤的时候，即使观察到肺部DCs增加，胸腔注射LLC-EVs也不能抑制LLC皮下肿瘤生长，同时，胸腔注射LLC-EVs也没有增加CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在肺部的比例。综上，上述结果说明胸腔注射TEVs促进DCs聚集到肺部肿瘤并随后引起系统的肿瘤特异性T细胞免疫。
实施例2 TEV诱导pMCs分泌CCL21a促进DCs向肺部迁移
本实施例研究发现TEVs能作用于pMCs，并使pMCs分泌更多的CCL21，CCL21作用于DCs的CCR7，从而促进DCs聚集和后续的肿瘤特异性T细胞免疫趋化和后续的肿瘤特异性T细胞免疫，从而发挥肿瘤抑制作用。
为了研究胸腔注射TEVs怎样促进DCs的迁移，我们分别通过静脉注射和胸腔注射100μg VivoTrack 680标记的LLC-EVs，观察LLC-EVs在体内分布情况，如图21，两种方式下LLC-EVs在体内的分布情况无明显不同。另外，我们分别通过静脉注射和胸腔注射100μgPKH26标记的LLC-EVs，观察LLC-EVs在体内分布情况，如图22，发现静脉注射的LLC-EVs主要分布在肺部内部，同时不少胸腔注射的LLC-EVs位于肺部边缘。胸膜腔由单层pMCs的胸膜环绕形成。因此，pMCs有可能摄取绝大多数通过胸腔注射的LLC-EVs。实际上，用2.5μg ml-1CFSE标记的LLC-EVs处理原代胸膜间皮细胞(primary pleural mesothelial cells，p-pMCs)和40L细胞24h后用荧光显微法检测p-pMCs和40L细胞摄取EVs的情况如图23所示，说明p-pMCs和40L胸膜间皮瘤细胞在体外试验中能有效的摄取LLC-EVs。此外，在小鼠胸腔注射20μg CFSE标记的LLC-EVs，24h后用立体显微镜检测进入胸膜的EVs情况，如图24LLC-EVs也在胸膜聚集。
按图8的试验方案，使用LLC-Luci细胞和CFSE标记的LLC-EVs处理小鼠，并在每次胸腔注射EVs前2h胸腔注射0.25mg kg-1细胞松弛素D(cytochalasin D，Cyto-D)，用立体显微镜检测进入胸膜的EVs情况如25所示，可知与对照组相比(用DMSO代替Cyto-D)，试验组小鼠LLC-EVs在胸膜的分布无明显差异。用流式细胞仪检测TILs中DCs，结果如图26，与控制组相比(用PBS代替CFSE标记的LLC-EVs)试验组DCs无显著差异。用IVIS测定肺肿瘤大小情况，结果如图27，与控制组相比(用PBS代替CFSE标记的LLC-EVs)试验组肿瘤大小无明显差异。这些结果说明在每次LLC-EVs注射前注射Cyto-D，抑制了LLC-EVs向胸膜的聚集，并使肺肿瘤处的DCs不再增加、且肿瘤抑制作用消失。此外，按图8的试验方案，使用LLC-Luci细胞和CFSE标记的LLC-EVs处理小鼠，并在每次胸腔注射EVs后2h胸腔注射0.25mg kg-1细胞松弛素D(cytochalasin D，Cyto-D)，用立体显微镜检测进入胸膜的EVs情况如28所示，用流式细胞仪检测TILs中DCs的结果如图29所示，用IVIS测定肺肿瘤大小的结果如图30所示，可见LLC-EVs在胸膜聚集、TILs中DCs显著增加以及肺肿瘤明显被抑制，这说明在每次LLC-EVs注射后再注射Cyto-D则仍存在DCs招募增多、肿瘤生长抑制的现象。上述结果说明pMCs摄取TEVs是胸腔注射TEVs介导的肺肿瘤抑制所必需的。
进一步，我们研究了TEVs对pMCs的作用。现有研究表明TEVs引起腹膜MCs的凋亡。然而，我们用一定浓度的LLC-EVs刺激40L细胞24h，通过CCK8试验测定细胞活力，实验结果如图31所示，发现LLC-EVs在5μg ml-1的高浓度下仅能略微增加40L细胞的活性。接着，我们检测了TEVs是否通过MCs影响骨髓源性DCs(bone marrow-derived DCs，BMDCs)的趋化作用，在无mRNA沉默下，用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs细胞或40L细胞，24h后通过Transwell趋化试验检测各细胞上清对DCs趋化性的影响，结果见图32，与控制组(用PBS代替LLC-EV)相比，试验组的细胞数量均显著增加，这说明LLC-EVs刺激的p-pMCs或40L细胞的上清能够增强BMDCs的趋化能力。
已有报道DCs表达的受体有CCR1、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7和CXCR4，因此，我们分别使用特定siRNA转染BMDCs细胞使目标受体沉默(同时使用与目的基因无同源性的siRNA作为阴性对照，记为NC siRNA，本专利所涉及NC siRNA序列均如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示)。
CCR1的siRNA序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；CCR2的siRNA序列如SEQID NO:25和SEQ ID NO:26所示；CCR5的siRNA序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示；CCR6的siRNA序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；CCR7的siRNA序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示；CXCR4的siRNA序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示。
通过蛋白免疫印迹法验证沉默效果，如图33，沉默效果良好。在无mRNA沉默(NCsiRNA)或有特定siRNA沉默各受体下，用2.5μg ml-1LLC-EV刺激40L细胞，24后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs趋化性的影响，结果如图34，与控制组相比，沉默CCR1、CCR2、CCR5、CCR6或CXCR4组，细胞数量均显著增加，而沉默CCR7，细胞数量无明显变化，这说明沉默CCR7而不是其他受体完全消除了TEV诱导40L细胞上清促进BDMCs趋化的作用。
特别地，在特定siRNA沉默CCR7受体下，用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs，24后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs趋化性的影响，试验结果如图35；同时，在无mRNA沉默下，用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs，24后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs(WT)或CCR7-/-DCs趋化性的影响,试验结果如图36。由图35和36的结果可知TEVs不再促进p-pMCs的上清趋化CCR7沉默的或CCR7缺失的BMDCs。CCL19和CCL21a是CCR7的已知配体。用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs或40L细胞，24h后用ELISA测定细胞上清液中的CCL19和CCL21a水平，试验结果见图37；用2.5μg ml-1LLC-EV刺激p-pMCs或40L细胞，24h后用用real-time PCR测定细胞中的CCL19和CCL21a mRNA水平(CCL21 PCR引物序列见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，试验结果见图38。可知，LLC-EVs显著增加了p-pMCs和40L细胞中的CCL19和CCL21a的蛋白和mRNA水平。
然而，在有特定siRNA沉默CCL19或CCL21a下(CCL19的siRNA序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；CCL21a的siRNA序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示)，用2.5μgml-1LLC-EV刺激40L细胞，24h后通过Transwell趋化试验检测细胞上清对DCs趋化性的影响，沉默效果见图40，说明CCL19或CCL21a被沉默，Transwell趋化试验结果见图39，由图中结果可知敲除CCL21a后LLC-EVs刺激的40L细胞上清不再促进BDMCs的趋化作用，敲除CCL19并没有该影响(39-40)。因此，TEVs通过体外pMCs引起CCL21a分泌来促进BMDCs的趋化作用。
随后，我们进行了胸腔注射TEVs是否诱使pMCs分泌CCL21a的体内验证试验。小鼠胸腔注射5μg ml-1LLC-EVs后24h，测定胸膜Ccl21a mRNA和蛋白水平，如图41-42，胸腔注射LLC-EVs使胸膜中CCL21a的mRNA和蛋白水平显著升高。进一步，我们在小鼠胸腔注射10μg胆固醇偶联Ccl21a siRNAs 24h后，用real-time PCR检测小鼠胸膜Ccl21a mRNA水平，如图43，证实胸膜内Ccl21a mRNA水平下降。按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠，并在每次注射EVs前24h在胸腔注射10μg胆固醇偶联Ccl21a siRNAs，流式细胞仪检测TILs中的DCs并IVIS测定肺肿瘤大小，如图44-45，与控制组相比，试验组DCs水平和肺肿瘤大小均无显著差异，这说明一旦沉默了胸膜中的CCL21a，胸腔注射LLC-EVs不再使肺肿瘤中的DC数目增加或不再有肿瘤抑制作用。然后，我们研究确认了CCR7在胸腔注射LLC-EVs后引起的DC聚集上的作用。首先，按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠，用流式细胞仪检测TILs中的CCR7+DC，结果如图46，该结果证实胸腔注射LLC-EVs增加了肺肿瘤中CCR7+DCs的比例。接着，我们按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理Ccr7-/-小鼠，用流式细胞仪检测TILs中的DC并用IVIS测定肺肿瘤大小，如图47-48，发现胸腔注射LLC-EVs不会增加Ccr7-/-小鼠肺肿瘤中DCs比例或者抑制其肺肿瘤。总的来说，这些结果表明胸腔注射TEVs使pMCs分泌的CCL21a增加，进而促进CCR7+DCs向肺肿瘤聚集。
实施例3TEVs使pMCs中CD93水平下降进而促进CCL21a分泌
本实施例研究发现pMCs中CD93特异性高表达，TEVs通过抑制pMCs中CD93的表达来促进pMCS分泌CCL21。
为了研究TEV怎样促进pMCs分泌CCL21a，我们对LLC-EVs处理和未处理的40L细胞进行了RNA-Seq分析，结果在两组间发现109个差异表达基因(differentially expressedgenes，DEGs)(图49)。接着，我们分析了其中|Log2fold change(FC)|≥2的31个DEGs(图50)与Ccl21a的关联并发现Gm13054(上调)和Cd93(下调)与Ccl21a高度相关(相关系数≥0.90)，此外，Cd93的Log2FC值大于Gm13054的Log2FC值(图51)。Cd93多表达于血小板、内皮细胞(endothelial cells，ECs)、造血祖细胞(hematopoietic progenitors)和肺上皮细胞(alveolar epithelial cells)。除了血小板及已知的肿瘤ECs中Cd93 mRNA水平较高，我们用real-time PCR检测各种细胞中Cd93(Cd93 PCR引物序列见SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和Ccl21a mRNA水平，发现p-pMCs的Cd93 mRNA表达水平显著高于正常ECs、骨髓细胞(bonemarrow cells)、MLE-12鼠肺上皮细胞(图52)。荷瘤小鼠胸膜Cd93 mRNA表达水平较正常小鼠上调而Ccl21a mRNA表达没有上调(图53)。使用2.5μg ml-1LLC-EVs刺激CD93沉默的40L细胞(使用siRNA沉默CD93，CD93 siRNA的序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示；沉默效果见图54)24h后，使用ELISA测定细胞上清液中CCL21水平，如图55，CCL21a蛋白水平显著增加，且LLC-EVs不再促进该细胞中CCL21a表达,。因此，这些结果表明CD93负向调节CCL21a，并且CD93在pMCs中显著高表达。
进一步，我们使用LLC-EVs刺激p-pMCs，发现LLC-EVs能使p-pMCs中CD93蛋白的表达减少(图56)，MC标记间皮素试验结果如图57，在小鼠胸腔注射20μg LLC-EVs 24h后，用免疫荧光印记检测pMCs中的CD93，CD93明显减少，这显示胸腔注射LLC-EVs使CD93的原位表达减少。real-time PCR检测胸腔注射过胆固醇偶联Cd93 siRNA的小鼠的Cd93 mRNA水平，如图58，Cd93 mRNA显著下降，说明胆固醇偶联Cd93 siRNA能用于沉默CD93。按图8方案使用LLC-Luci细胞和LLC-EVs处理小鼠，在每次注射EV前胸腔注射10μg胆固醇偶联Cd93 siRNA或NC siRNA，用real-time PCR检测胸膜Ccl21 mRNA水平并用ELISA检测胸膜Ccl21蛋白水平，结果如图59-60；当CD93被沉默后，LLC-EVs处理后胸膜Ccl21 mRNA和蛋白水平无明显变化，这说明在荷瘤小鼠胸腔注射胆固醇偶联Cd93siRNA后，胸腔注射LLC-EVs不再诱导胸膜CCL21a的mRNA和蛋白表达。同时，用IVIS检测肺肿瘤大小，结果见图61，用流式细胞仪检测TILs中DC，结果见图62，LLC-EVs抑制肺肿瘤现象消失，并且DCs、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞比例不再升高。值得注意的是，仅进行CD93沉默就能显著引起CCL21a分泌和抗肿瘤免疫。因此，这些结果表明TEVs通过减低CD93表达来促进CCL21a分泌。
实施例4通过TEV-derived miR-5110下调pMCs的CD93
本实施例研究发现作用于CD93的特异性miRNA-miR-5110，其能显著降低细胞中CD93的mRNA和蛋白水平。使用miR-5110水平更高的TEV具有更好的抗肺肿瘤效果，pMCs中的CD93 mRNA水平更低。
我们探究了TEVs如何下调pMCs中CD93的相关机制。首先，我们通过电穿孔法将LLC-EVs与蛋白酶K共孵育以消化LLC-EVs的总蛋白，具体地，使用10μg ml-1蛋白酶K消化LLC-EVs 2h，用流式细胞仪和蛋白免疫印迹法检测消化效果，分别见图63和图64，说明消化效果好，使用消化好的LLC-EVs刺激40L细胞24h，通过ELISA测定细胞上清中的CCL21a水平，结果见图65，蛋白酶K消化组与未消化组间CCL21a蛋白水平无明显差异，这说明TEV蛋白不参与40L细胞对CCL21a分泌的诱导。接着，我们将LLC-EVs与RNase共孵育并使用电穿孔方式降解囊泡内RNAs，具体地，用10μg ml-1RNase I消化LLC-EVs 2h后测量LLC-EVs中RNA含量，如图66，RNA浓度显著下降，证实LLC-EVs中RNA被消化。使用RNase I消化过的LLC-EVs刺激40L细胞24h后用ELISA检测细胞上清中CCL21a水平，结果见图67，CCL21a无显著升高，证实LLC-EVs不再促进40L细胞的CCL21a分泌。上述结果说明LLC-EVs中的RNAs而不是蛋白在升高CCL21a中发挥着重要作用。
外泌体中富集的miRNAs对于外泌体介导的细胞间通讯至关重要。为了确定miRNAs在TEV诱导pMCs分泌CCL21a中的作用，我们收集了来自MLE-12小鼠肺II型上皮细胞(MLE-12mouse lung epithelial type II cells)的EVs(MLE-12-EVs)，发现使用MLE-12-EVs刺激并不能抑制40L细胞分泌CCL21a(图68)。相较于MLE-12-EVs，我们通过miRNA array发现LLC-EVs中有45个富集的miRNAs(图69)。然后，利用miRDB和TargetScan数据库预测Cd93的上游miRNA，通过两个数据库识别出123个miRNA(图70)。将富集的miRNA与预测的Cd93上游miRNA进行比对，我们发现miR-5110和miR-5107-5p为两组miRNAs的重叠部分(图71)。因此，我们进一步研究这两个miRNAs对CD93表达的作用。我们使用miR-5110或miR-5107-5p类似物(miR-5110类似物和miR-5107-5p类似物的序列分别见SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)转染40L细胞(图74为检测转染miR-5110或miR-5107-5p类似物24h后使用real-time PCR检测40L细胞中miR-5110或miR-5107-5p类似物的表达情况，miR-5110的PCR引物序列见SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10，miR-5107-5p的PCR引物序列见SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，由结果可知miR-5110或miR-5107-5p转染成功)；同时设置控制组(Ctrl)，使用miRNA类似物的阴性对照转染40L细胞(miRNA阴性对照的类似物的序列见SEQ ID NO:19)，再检测CD93的表达情况，如图72-73，与控制组相比，miR-5110类似物组Cd93mRNA和蛋白水平均明显下降，miR-5107-5p类似物组没有显著变化，这说明miR-5110类似物显著降低40L细胞的CD93的mRNA和蛋白水平，而miR-5107-5p类似物没有该作用。然后，我们研究了CD93是否是miR-5110(SEQID NO:17：5’-GGAGGAGGUAGAGGGUGGUGGAAUU-3’)的直接靶标，TargetScan预测了Cd93 3’-UTR的两个miR-5110作用位点，这两个作用位点的序列相同(图75)，荧光素酶报告试验显示这个序列(WT：CCUCCUCA)是miR-5110的靶点，突变序列(MUT：GGAGGAGU)消除了miR-5110类似物荧光素酶活性(图75-76)。
为了检测LLC-EV-derived miR-5110是否下调CD93，我们首先使用real-time PCR定量检测亲代细胞及其对应EVs中的miR-5110水平，结果见图77(miR-5110的PCR引物序列见SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，miR-5110的Taqman探针序列见SEQ ID NO:51)，由图可知EVs中的miR-5110水平明显高于各自对应的亲代细胞，该结果证实与亲代细胞相比，miR-5110显著富集在TEVs中。进一步，我们用2.5μg ml-1LLC-EVs刺激转染了miRNA抑制剂的阴性对照(序列如SEQ ID NO:22)、miR-5110抑制剂(序列如SEQ ID NO:20所示)的40L细胞24h，real-time PCR检测40L细胞的miR-5110，结果见图79，证实40L细胞中的miR-5110被阻断，用蛋白免疫印迹法检测40L细胞中CD93水平，如图78，可知miR-5110阻断或敲除的40L细胞中，LLC-EVs不再使CD93蛋白下降且miR-5110沉默引起了CD93蛋白明显上升。通过分别转染miR-5110类似物和抑制剂至LLC细胞，我们分别得到miR-5110水平升高的LLC-EV(LLC-EVs with an increased miR-5110level，LLC-EVs-miR-5110Ins)和miR-5110水平下降的LLC-EV(LLC-EVs with a decreased miR-5110level，LLC-EVs-miR-5110Des)(图80)。与LLC-EVs相比，LLC-EVs-miR-5110Ins和LLC-EVs-miR-5110Des在40L细胞中下调CD93的能力分别增加和减弱(图81)。此外，按图8的方案用LLC-Luci细胞和相应的EVs处理小鼠，第25天时IVIS检测肿瘤大小，结果见图82，相比LLC-EVs，LLC-EVs-miR-5110Ins组肿瘤面积更小，LLC-EVs-miR-5110Des组肿瘤面积更大，这说明LLC-EVs-miR-5110Ins和LLC-EVs-miR-5110Des分别展现更好的和更差的抑制LLC肿瘤生长作用。因此，TEV-derived miR-5110通过调节pMCs中的CD93来抑制肺肿瘤生长。随后，我们对LLC肺荷瘤小鼠中TT-EVs或EVs中的miR-5110水平与胸膜Cd93 mRNA水平进行了相关性分析，LLC肺荷瘤小鼠的肿瘤组织的EVs和血清EVs(sEVs)中miR-5110水平与这些小鼠pMCs中的Cd93 mRNA水平均呈负相关(图83)。上述结果说明TEV-5110水平与pMCs中的CD93表达呈负相关。
实施例5pMCs中CD93水平下降表明人体T细胞应答增强
本实施例发现肺癌病人恶性肿瘤胸腔积液(malignant pleural effusions，MPEs)中EV miR-5193(miR-5110同源物)水平与CCL21和DC水平呈正相关；肿瘤组织中，TT-EVs miR-5193与CCL21水平、TTs的DCs、CD4+ T细胞以及CD8+ T细胞水平呈正相关，CCL21水平与DCs水平也呈正相关，这进一步证实pMCs中CD93通过促进CCL21介导的DC招募来促进抗肿瘤的T细胞免疫应答。
为了确认人MCs的CD93是否也能调控肺癌患者的抗肿瘤免疫，我们用real-timePCR检测人胸膜间皮瘤细胞(NCI-H2452)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells，HUVECs)中Cd93和Ccl21 mRNA水平，如图84，NCI-H2452中的Cd93和Ccl2的mRNA水平均显著高于HUVEC的，这是首次证明NCI-H2452的CD93和Ccl21 mRNA表达水平高于HUVECs的CD93和Ccl21 mRNA表达水平。进一步，我们用Cd93 siRNA(人Cd93 siRNA序列见SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42)、Ccr7 siRNA(人Ccr7 siRNA序列见SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46)分别沉默NCI-H2452的CD93、DCs的CCR7，图87和图88的蛋白免疫印迹检测结果证实CD93或CCR7蛋白下降，说明CD93或CCR7蛋白被沉默，再用ELISA检测NCI-H2452细胞上清中的CCL21水平以及用Transwell趋化试验检测NCI-H2452细胞上清对DCs的趋化作用，试验结果如图85-86所示，CD93被沉默后CCL21水平显著升高，细胞上清对DCs的趋化作用明显增加，而当DCs的CCR7也被沉默时，细胞上清对DCs的趋化作用无明显变化，这些结果说明沉默NCI-H2452细胞中的CD93会显著促进CCL21分泌；同时，这些细胞上清增加了人DCs的趋化能力，并且当DCs中的CCR7被敲除或沉默时趋化能力不再增加。此外，我们real-time PCR定量检测肺癌病人TTs(tumortissues)和TT-TVs中miR-5193水平(miR-5193的引物序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，miR-5193的Taqman探针序列见SEQ ID NO:52)，13名病人的检测结果见图89，可知TT-EVs中miR-5193RNA水平均显著高于TTs的。进一步我们用2.5μg ml-1各病人的TT-EVs分别刺激NCI-H2452细胞，24h后用蛋白免疫印迹检测的细胞中CD93水平，结果见图90，CD93均明显下降。上述结果说明miR-5193(人的miR-5110同源物)在肺癌病人的TT-EVs中富集，且TT-EVs显著抑制NCI-H2452细胞中CD93的表达。特别地，进一步分析TT-EVs中的miR-5193水平与TT-EV抑制CD93表达的能力的相关性，如图91TT-EVs中的miR-5193水平与TT-EV抑制CD93表达的能力呈正相关，这表明TT-EV-derived miR-5193是人pMCs中CD93水平的一个负相关指标。
我们进一步评价了肺癌病人的pMCs中CD93水平和T细胞应答的关系。由于肺癌病人的MCs难以获得，我们检测了EVs中的miR-5193水平，作为pMCs中CD93水平的替代指标。首先，我们测定了肺癌病人恶性肿瘤胸腔积液(malignant pleural effusions，MPEs)中的CCL21，CD11c+DCs和EV miR-5193浓度(miR-5193检测探针序列见SEQ ID NO:54)，如图92，发现EV miR-5193浓度与CCL21和DC浓度呈正相关，此外，CCL21和DC浓度呈正相关(图93)。接着，我们测定了来自73个肺癌病人的TT-EVs miR-5193水平，发现TT-EVs miR-5193水平(miR-5193检测探针序列见SEQ ID NO:54)与CCL21水平、TTs的CD11c+DCs、CD4+ T细胞和CD8+T细胞呈正相关，CCL21水平与DC数量也呈正相关(图94-95)。除此以外，根据TT-EVs miR-5193水平的高低将73个肺癌病人分为miR-5193水平较高(pMCs中CD93低)和miR-5193水平较低(pMCs中CD93高)的两组，分别记为TT-EV/miR-5193hi(36人)和TT-EV/miR-5193lo(37人)，分别绘制TT-EV/miR-5193hi和TT-EV/miR-5193lo两组肺癌患者的总生存曲线，如图96，TT-EV miR-5193水平高的病人比TT-EV miR-5193水平低的病人的总存活率更高。综上，pMCs中CD93通过促进CCL21介导的DC招募来调节T细胞应答。
实施例6抗CD93(Anti-CD93)通过促进pMCs分泌CCL21抑制肿瘤生长
本实施例研究发现pMC中C1q(而不是IGFBP7)是pMCs中CD93激活的配体。C1qA过表达时，Ccl21a mRNA水平增加，C1qA被抑制时，胸膜CCL21a表达显著降低。本实施例还发现CTLD区域是CD93抑制pMCs中分泌CCL21的功能区域。另外，本实施例提供了一种抗CD93的单克隆抗体M057，M057使胸膜Ccl21a mRNA水平和CCL21a蛋白水平升高，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和DCs升高，引起了全身肿瘤特异性免疫。
由于pMC CD93对调节抗肿瘤免疫至关重要，我们试图找出负责pMCs中CD93激活的配体。C1q、多聚蛋白(multimerin 2，MMRN2)和胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-likegrowth factor binding protein 7，IGFBP7)是CD93的已知配体。使40L和NCI-H2452细胞中C1qA、MMRN2或IGFBP7过表达，用蛋白免疫印迹检测各基因过表达情况。结果如图97，证实两种细胞中C1qA、MMRN2或IGFBP7过表达。进一步用real-time PCR检测C1qA、MMRN2或IGFBP7过表达的40L或NCI-H2452细胞中Ccl21a mRNA水平，结果如图98所示，可知C1qA过表达的细胞(40L或NCI-H2452)中Ccl21amRNA水平显著低于其他各组，其他各组间Ccl21amRNA水平无明显差别，这说明过表达(Overexpression，OE)C1qA能显著抑制Ccl21a mRNA水平，而过表达MMRN2或IGFBP7对Ccl21a mRNA水平无明显影响。此外，用2μg ml-1重组C1qA刺激40L细胞或NCI-H2452细胞，24h后用ELISA检测细胞上清中的CCL21a或CCL21水平，结果见图99，CCL21a或CCL21均显著下降，这说明重组C1qA刺激显著降低40L和NCI-H2452细胞中CCL21a或CCL21的分泌。在0天向小鼠静脉注射1×106LLC-Luci细胞，并在14、16、18、20和22天胸腔注射5μg C1qA，在第25天用蛋白免疫印迹检测胸膜CCL21a蛋白水平且用IVIS检测的肺肿瘤体积，结果分别如图100-101，可知CCL21a蛋白明显下降，注射C1qA后小鼠肺肿瘤面积变大，这说明胸腔注射重组C1qA也使胸膜CCL21a蛋白下降并促进肺肿瘤生长。
C1q主要在肝脏中合成，且胆固醇偶联寡核苷酸具有很好的肝脏靶向性。通过胆固醇偶联C1qa反义寡核苷酸(C1qa的反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示)敲除小鼠肝脏中的C1qA，具体地，在0天向小鼠静脉注射1×106LLC-Luci细胞，并在14、16、18、20和22天静脉注射100μg C1qa ASOs(沉默C1qA)，在第25天用蛋白免疫印迹检测胸膜CCL21a蛋白水平以及用IVIS检测的肺肿瘤体积，如图102-103，CCL21a蛋白明显增加同时肿瘤面积明显小于对照组(阴性对照的反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示)，这说明胸膜CCL21a表达显著增加，同时肺肿瘤增长变慢。此外，用LEISA检测LLC肺荷瘤小鼠和肺癌病人血清中C1qA水平，如图104，肺肿瘤小鼠和肺肿瘤病人血清C1qA水平也明显高于正常个体的。CD93含有1个C型凝集素结构域(C-type lectin domain，CTLD)、1个Sushi结构域、5个表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样结构域和1个Mucin结构域。接着，我们对CD93进行了剪切，获得含有这些结构域中一个或多个的CD93截短体片段(图105)，将这些片段转入40L细胞，48h后用real-time PCR检测各片段的表达情况并检测Ccl21a mRNA水平，如图106-107，与控制组相比，各组Ccl21a mRNA水平均显著下降，该结果说明同转染CD93-WT质粒一样，过表达含CTLD片段的CD93质粒均能有效抑制40L细胞中的Ccl21a mRNA表达。此外，切除CD93的CTLD部分获得CD93ΔCTLD，同上转入40L细胞，48h后用ELISA检测细胞上清中的CCL21a蛋白水平，如图108，CTLD被切除后，CCL21a蛋白水平与对照组无显著差异。因此，过表达CTLD质粒，而不是过表达CTLD缺失的CD93质粒(CD93ΔCTLD)，能显著抑制40L细胞释放CCL21a，并且抑制效果与CD93-WT相似。这些结果表明CD93的CTLD与C1q介导的CCL21抑制相关。综上所述，在CD93调控pMC中CCL21时，C1q是CD93的配体。
因此，我们推测如果抗CD93能消除pMCs中C1q介导的CD93激活，则可以获得治疗肺肿瘤的效果。因而，我们构建了一种抗鼠CD93的兔单克隆抗体(M057)，构建方法为：小鼠CD93抗原免疫实验兔子，其血清多克隆CD93 Ab验证水平后，取脾脏浆细胞扩增其抗体编辑的DNA序列，将DNA序列克隆、重组至质粒载体，通过蛋白纯化方式获取各单克隆的重组CD93抗体，具体见序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，该抗体的恒定区用小鼠IgG替代。M057的解离常数(Kd)是0.24nM(图109)。M057能染色WT小鼠骨髓细胞，而Cd93-/-小鼠骨髓细胞不会被染色(图110)。此外，静脉注射Alexa Fluor 680标记的M057，在WT小鼠胸膜可检测到强信号，但Cd93-/-小鼠胸膜未检测到信号(图111)。这些结果表明M057与CD93特异性结合。
L(轻链):(SEQ ID NO:1)
MGWSCIILFLVATATGVHSELVMTQTPPSLSASVGETVRISCLANEDAYSGISWYQQKPGKPPTLLIYGASHLEAGVPPRFSGSGSGTDYIFTIGGVQPEDAATYYCLGGYSDSTIHLSFGAGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*
H(重链):(SEQ ID NO:2)
MGWSLILLFLVAVATRVLSQQQLMESGGGLVQPGGSLKLSCKASGFDFSSYGVSWVRQAPGKGLEWIGYIDPVFGSTYYASWVNGRFTISSHNAQNTVSLKMTSLTAADTATYFCVRFTGSGSFNLWGPGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK*
说明：
下划线区域是信号肽；
灰色区域可变区；
黑色氨基酸序列没有下划线的是恒定区；
灰色区域内下划线的是CDR区域或者序列。
为验证M057功能，我们用10μg ml-1M057和/或2μg ml-1 C1qA处理40L细胞或p-pMCs，24h后ELISA检测细胞上清中的CCL21a水平，如图112，与控制组相比(IgG组)，使用M057后CCL21a水平显著升高，同时使用M057和C1qA，CCL21a水平也显著升高，但是单独使用M057时CCL21a水平升高更加显著。这说明即使在存在重组C1q的情况下，用M057处理也能显著促进40L细胞和p-pMCs分泌CCL21a，但效果较差。连续给LLC肺肿瘤小鼠一定剂量的M057，发现M057显著提高胸膜Ccl21a mRNA水平且呈剂量依赖性，同时，100μg M057的剂量下效果最优(图113)。在0天向小鼠静脉注射1×106LLC-Luci细胞，并在14、16、18、20和22天静脉注射100μg M057，在第25天通过蛋白免疫印迹检测胸膜CCL21a蛋白水平，用IVIS检测肺肿瘤大小，同时用流式细胞仪检测TILs中的DC、CD4+T细胞和CD8+ T细胞，结果分别如图114、图115和图116所示，可知在该最优M057剂量下，胸膜CCL21a蛋白水平显著升高，LLC肿瘤生长被显著抑制，并且M057显著增加了TILs中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和DCs的比例。此外，在LLC-Luci肺荷瘤小鼠的两侧皮下分别接种LLC和B16F10肿瘤，接着在第8天、10天、12天、14天和16天用100μg M057治疗，第10至第18天皮下肿瘤大小如图117所示，皮下LLC肿瘤被显著抑制，而皮下B16F10无明显差异，这说明M057处理能抑制肺部以外的其他部位的同种肿瘤，M057处理也诱导了全身肿瘤特异性免疫，具有抑制不同部位同种肿瘤的作用。为了研究M057是否通过靶向pMCs中的CD93来抑制肺部肿瘤生长，我们敲除胸膜CCL21a，在0天向敲除了CCL21a小鼠静脉注射1×106LLC-Luci细胞，第14天、16天、18天、20天和22天静脉注射100μg M057，在第25天用IVIS检测肺肿瘤，如图118，对敲除CCL21a肺荷瘤小鼠使用M057仍能抑制其肺肿瘤生长，但是其抑制作用明显明显下降。这些结果说明M057主要通过抑制胸膜CCL21分泌来抑制肺肿瘤生长。
进一步，我研究了M057的体内毒性，每隔一天向健康小鼠静脉注射100μg M057，5次注射后用LEISA检测血清中的ALT、AST、胆红素和肌酐水平并进行小鼠心、肝、脾、肺和肾的的组织病理学检测，如图119-120，与对照组相比(IgG组)，发现M057治疗没有增加血清中谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、天门冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferaseAST、胆红素(bilirubin)和肌酐(creatinine)的水平；M057治疗也未对主要器官(包括心、肝、脾、肺和肾)造成明显的组织病理学损害(图120)，这些结果表明M057具有较好的生物安全性。
实施例7抗CD93比抗VEGFR(anti-VEGFR)拥有更好的抗肺肿瘤作用
本实施例证实抗CD93不仅能通过促进CCL21介导的DC招募来促进抗肿瘤的T细胞免疫应答(阻断C1q/CD93信号通路)，还能通过使肿瘤血管正常化来特异性地抑制肿瘤生长(阻断IGFBP7/CD93信号通路)，且抗CD93的效果更优。
已有报道通过阻断IGFBP7和CD93的相互作用可以通过正常化肿瘤血管来抑制肿瘤生长。鉴于CTLD结构域是CD93促进肿瘤血管生成和诱导MCs分泌CCL21的功能所必需的，并且沉默胸膜CCL21并不能完全消除M057的抗肿瘤作用(图118)，我们猜测M057或许也能通过正常肿瘤血管来抗肺肿瘤。首先，我们用10μg ml-1M057和/或2μg ml-1IGFBP7处理小鼠原发性内皮细胞，24h后进行calcein-AM染色，用荧光显微法检测到血管生成情况，如图121，可知IGFBP7处理血管生成增加，而使用M057+IGFBP7处理血管生成明显被抑制，这说明M057还抑制IGFBP7诱导的体外EC血管生成。
此外，第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射100μgM057，第25天取肿瘤组织并对NG2和CD31或者αSMA和CD31进行染色和定量分析，如图122，尽管M057处理未改变LLC肺肿瘤小鼠CD31+血管密度，但肿瘤组织中平滑肌细胞【用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，αSMA)代替】和周细胞【用神经/胶质抗原2(neural/glial antigen 2，NG2)代替】覆盖的血管比例明显升高。第14天用静脉注射5mg葡聚糖(FITC-dextran，70kDa)以测定肿瘤内皮渗透性，如图124，相反地，与对照组相比，M057处理的小鼠静脉注射FITC-dextran后，肿瘤的泄漏面积(葡聚糖阳性)显著减小。第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射不同量(20μg、40μg、60μg)的抗VEGFR试剂，第25天检测肺肿瘤大小，结果如图124所示，可知注射抗VEGFR试剂抑制肺肿瘤生长且40μg剂量为最佳作用剂量。此外，第13天、15天、17天、19天和21天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠(WT)静脉注射40μg抗VEGFR试剂或IgG，并在12h后静脉注射100μg M057或IgG，第25天检测肺肿瘤大小，如图125，可知使用抗VEGFR试剂后使用M057，具有显著的肿瘤抑制作用，且相对于单独使用抗VEGFR试剂，使用抗VEGFR试剂后再使用M057，肺肿瘤抑制作用增强。这说明虽然CD93位于VEGFR信号下游，但在LLC肺荷瘤小鼠中使用最佳剂量的抗VEGFR试剂阻断VEGFR会减弱M057的抗肿瘤作用，但不能消除M057的抗肿瘤作用。然而，第13天、15天、17天、19天和21天在LLC-Luci肺荷瘤Ccr7-/-小鼠(Ccr7敲除小鼠)静脉注射40μg抗VEGFR试剂并在每次注射抗VEGFR试剂12h后静脉注射100μg M057或IgG，第25天检测肺肿瘤大小，如图126，与注射IgG相比，M057组无显著差异，说明在VEGFR阻断的LLC肺肿瘤Ccr7-/-小鼠中，M057处理不再抑制肿瘤生长。此外，第0天构建LLC皮下荷瘤小鼠(WT)模型，在第7天、9天、11天和15天静脉注射40μg抗VEGFR试剂并在每次注射抗VEGFR试剂或IgG，12h后静脉注射100μg M057或IgG，统计肿瘤体积随时间的变化情况，如图127，在VEGFR阻断的皮下LLC荷瘤WT小鼠中，M057治疗也不能抑制肿瘤生长。这些结果表明M057不仅通过促进CCL21介导的DC迁移，也通过使肿瘤血管正常化来特异性地抑制肿瘤生长。
抗CD93和抗VEGFR均通过正常肿瘤血管抑制皮下肿瘤生长，因此具有相似的抗肿瘤效果。然而，将M057用于肺肿瘤治疗时，其能正常化肿瘤血管系统并促进CCL21介导DC向肿瘤迁移。第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤小鼠静脉注射40μg抗VEGFR试剂或100μg M057，第25天用IVIS检测肺肿瘤大小，如图128，正如预期的那样，我们观察到M057比抗VEGFR试剂具有更好的抑制肺肿瘤生长作用。然而，第14天、16天、18天、20天和22天在LLC-Luci肺荷瘤Ccr7-/-小鼠静脉注射40μg抗VEGFR试剂或100μg M057，第25天用IVIS检测肺肿瘤大小，如图129，在Ccr7-/-小鼠中，M057和anti-VEGFR显示出相当的抑制肺肿瘤生长的能力。这说明增加CCR7+DCs的肿瘤浸润有助于增强M057的抗肺肿瘤作用。
T细胞很少或不存在的“冷肿瘤”会存在抵抗抗PD-1治疗。M057介导的肿瘤血管正常化和DC迁移增强使肿瘤中的T细胞增加。因此，M057治疗可能逆转“冷肿瘤”对抗PD-1治疗的耐药性。第14天、16天、18天、20天和22天在B16F10和4T1肺荷瘤小鼠静脉注射50μg抗PD-1试剂，同时注射100μg M057或不注射100μg M057，第18天用用IVIS检测肿瘤大小并进行肺H&E染色，如图130-131，正如预期的那样，抗PD-1和M057组合使用的肿瘤抑制作用最优，即抗PD-1治疗后的B16F10和4T1肺肿瘤均能被M057抑制。更重要的是，分别统计30名TT-EV/miR-5193hi和TT-EV/miR-5193lo以及C1qA水平较高(记为C1qAhi)和C1qA水平较低(记为C1qAlo)肺癌患者在抗PD-1治疗后无进展生存期(progression-free survival，PFS)，如图132，可知作为CD93的负向或正向调控因子，高sEV衍生的miRNA-5193或C1qA与肺癌患者抗PD-1治疗后无进展生存期的好坏有关。
综上所述，C1q和IGFBP7在肿瘤发展过程中上调。如图133，一方面，C1q/CD93信号通路在pMCs中抑制CCL21的产生，阻止DC向肺迁移和随后的抗肺肿瘤的T细胞免疫应答的激活。另一方面，IGFBP7/CD93信号通路在ECs中促进VEGFR途径激活，导致血管生成和肿瘤生长。在抗CD93存在时，pMCs中的C1q/CD93信号通路和ECs中IGFBP7/CD93信号通路被阻断，分别导致CCL21介导的T细胞免疫应答激活和VEGFR介导的肿瘤血管生成的抑制，从而抑制肿瘤生长。因此，抗CD93表现出强大的抗肺肿瘤免疫。
实施例8抗胸膜CD93对甲型流感病毒(H1N1)引起的肺部感染具有治疗作用
为了研究抗胸膜CD93对肺部感染是否有治疗作用，我们构建了肺部H1N1感染小鼠模型，并在小鼠胸腔注射抗CD93试剂(胆固醇偶联Cd93 siRNA)，发现感染H1N1的小鼠，其胸膜CD93表达显著升高(图134)，敲低胸膜中的Cd93能抑制病毒H1N1的肺部感染(图135)，小鼠肺损伤明显减轻(图136)，生存率明显提高(图137)。
上述具体实施例中的试验材料和方法如下：
1.人源样本来源
肺TTs来自浙江肿瘤医院的生物样本库。MPEs来自肺癌病人，血液样本来自健康志愿者和接受抗PD-1治疗的肺癌病人，以上标本均来自浙江大学医学院第二附属医院。
2.小鼠和细胞株信息
C57BL/6J、BALB/c和裸鼠(6-8周，平均体重20g)购买自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。p53fl/flLSL-KrasG12D小鼠由浙江大学的应颂敏教授捐助。Ccr7-/-由复旦大学的李健华教授捐助。CD11c-DTR小鼠购买自杰克逊实验室(美国，法明顿)。Cd93-/-小鼠由中国科学院苏立波教授捐助。动物饲养在特殊的无病原体调节下，动物试验方案由浙江大学动物实验伦理委员批准。
小鼠4T1乳腺癌和3T3纤维母细胞购自美国ATCC(American TypeCultureCollection)。小鼠LLC-Luci肺癌细胞和B16F10-Luci黑色素瘤细胞购自珀金埃尔默。小鼠pMCs由浙江大学医学院附属第二医院李冰皓提供。小鼠MLE-12肺上皮细胞和内皮细胞(HUVECs)由浙江大学柯越凯教授提供。人NCI-H2452间皮瘤细胞购自宁波明舟生物科技有限公司(浙江，宁波)。
3.抗体
抗体信息如下表所示。
表1抗体来源及相关信息表
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4.EV分离
将FBS在120000×g下离心10h移除EVs，然后加入DMEM至终浓度为10％(v/v)。LLC、4T1和B16细胞在10cm细胞培养皿上培养至大约90％的汇合。肺TTs剪切后于RPMI-1640培养基中用2mg/ml胶原酶IV型(Worthington Biochemical，美国)和0.2mg/ml脱氧核糖核酸酶I(Sigma–Aldrich，美国)进行消化，消化条件包括37℃下振摇1h。加入移除EVs的FBS终止消化。收集培养基、消化液和MPE并在4℃下300×g离心5min(移除细胞)，2000×g离心20min(移除碎屑和凋亡小体)和10000×g离心30min(移除大的EVs)。用0.22μm滤膜进行过滤，取滤液在4℃120000×g下离心70min。EVs中的蛋白含量通过BCA蛋白定量试剂盒(ThermoFisher Scientific)进行测定。
5.EM(Electron Microscope，电子显微镜)
使用辉光放电质谱仪(glow discharge instrument)对200目碳膜进行亲水化处理，以用于阴性EV染色。取EV溶液滴加至200目碳铜网上并室温(RT)放置1h。用滤纸吸取过量得悬浊液并用蒸馏水冲洗网膜两次，EVs用2％乙酸双氧铀(uranyl acetate)在室温下染色1min，移除过量悬浊液并晾干。用EM(Tecnai G2 Spirit 120kV，Thermo FEI,Hillsboro，USA)成像。
6.NTA(Nanoparticle Tracking Analysis，纳米颗粒追踪分析)
为了测量粒度和浓度，用配备有488nm激光和高灵敏度sCMOS相机的NanoSightNS300系统(Malvern PANalytical，上海)对EVs进行NTA。
7.蛋白免疫印迹(Western blotting)
用冰PBS缓冲液清洗总细胞和EVs，在SDS缓冲液中裂解，置于冰上和100℃煮10min。然后，用SDS-PAGE将样品中的蛋白进行分离，并将蛋白转移到PVDF膜(Millipore)上，用相应的一抗和HRP(horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶)偶联的二抗进行检测。用ECL试剂盒(MultiSciences，浙江杭州)对条带进行显色。
8.肺荷瘤小鼠的处理
注射1％戊巴比妥钠(Sigma–Aldrich)麻醉小鼠，在0、2、4、6和8天分别注射5μgLLC-EVs、B16F10-EVs或4T1-EVs至小鼠胸腔(参照Stathopoulos GT,Zhu Z,Everhart MB,Kalomenidis I,Lawson WE,Bilaceroglu S,et al.Nuclear factor-kappaB affectstumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion.Americanjournal of respiratory celland molecular biology 2006,34(2):142-150.)。然后，在第5天注射1×106LLC-Luci或B16F10-Luci细胞构建肺转移性肿瘤。为了构建继发性肺转移瘤模型，0天，在小鼠皮下植入1×106 4T1细胞并在16天进行手术移除。然后，在26、28、30、32和34天，在这些小鼠的胸膜内注入5μg 4T1-EVs。为了评价治疗效果，小鼠在0天静脉注射1×106LLC-Luci细胞，并在2、4、6、8和10天腹腔注射(i.pl.Injection)5μg LLC-EVs。部分试验中，在每次处理前会在这些小鼠腹腔注射10μg siRNAs或40μg anti-VEGFR2(Bio XCell，West Lebanon，NH，USA)。为了引起继发性肺肿瘤，0和1天在小鼠鼻内滴表达Cre重组酶(2×106PFU ml-1)的腺病毒p53fl/flLSL-KrasG12D；然后，在30、32、34和36天胸膜内注射LLC-EVs。为了检测肿瘤负荷，在14天和25天对小鼠进行麻醉处理并在胸膜内注射100μg/每kg体重的荧光素(Promega，北京)获得携带表达荧光素酶的肿瘤的小鼠。注射荧光素10min后，用IVIS(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)获取发光图像，并用Living Image软件(PerkinElmer)分析整个肺区域的光通量。在41天或37天时，将携带原发或转移性肺肿瘤的小鼠处死。然后，用石蜡包埋两侧肺组织，进行H&E染色并用Olympus BX53倒置显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)获取H&E染色图像。通过肿瘤总面积除以肺总面积计算转移性肺肿瘤负荷。
9.肺部感染小鼠的处理
用甲型流感病毒PR8/A/34(H1N1)鼻滴定小鼠，24h后用实时荧光定量PCR测定小鼠胸膜中CD93 mRNA水平以及H1N1 mRNA的表达水平。第5天开始使用10μg胆固醇偶联Cd93siRNA(siRNA订购自上海吉玛生物有限公司，Genepharma))溶解在无RNase的双蒸水中，注射至小鼠胸腔中，隔天注射一次，记录小鼠生存情况。然后，将小鼠处死，取肺用石蜡包埋，进行H&E染色并用Olympus BX53倒置显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)获取H&E染色图像。
10.TILs分离和流式细胞术(Isolation of TILs and flow cytometry)
取肺转移瘤模型的肺组织切开、清洗并进行消化处理，消化处理使用2mg ml-1I型胶原酶(Worthington Biochemical)，2mg ml-1IV型胶原酶(Worthington Biochemical)和0.2mg ml-1脱氧核糖核酸酶I(DNase I，Sigma–Aldrich)在RPMI-1640中、37℃下振摇1h，添加含10％ FBS的RPMI-1640培养基终止消化过程。然后，用70μm细胞过滤网对消化后的细胞悬浊液进行过滤，红细胞(RBCs)是被裂解的。
进行流式细胞术时，首先将单细胞悬浊液和FcR封闭抗体在4℃下孵育30min，接着用偶联荧光基团的第一抗体在4℃下孵育30min。通过Fixable Viability Dye eFluorTM(Thermo Fisher Scientific)染色排除掉死细胞。将样本注入Deflex流式细胞仪(BeckmanCoulter，Brea，CA，USA)进行检测，通过FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR,USA)进行数据分析。
11.BMDC的获得
按已有方法(Shen Y,Guo D,Weng L,Wang S,Ma Z,Yang Y,et al.Tumor-derivedexosomes educate dendritic cells topromote tumor metastasis via HSP72/HSP105-TLR2/TLR4pathway.Oncoimmunology 2017,6(12):e1362527.)获取BMDCs(bone marrowmononuclear cells)。简单来说，取小鼠胫骨和股骨悬浮液，除去红细胞，按2×106个细胞/ml的密度在6孔板上，使用添加有10％FBS、10ng ml-1重组鼠白介素GM-CSF和1ng ml-1鼠IL-4的RPMI 1640培养基进行培养。培养48h后，通过清洗移去骨髓造血细胞，剩下松散附着的细胞簇进一步培养48h后获得小鼠BMDCs。为了获取人单核细胞(mononuclear cells，DCs)，使用-1077(Sigma–Aldrich)密度离心肝素处理的来自健康志愿者的血液获取外周血单核细胞，然后重悬于培养基中并允许黏附于6孔板壁。37℃孵育2h后，移除未黏附细胞，取黏附细胞于含10ng ml-1GM-CSF和1ng ml-1IL-4的3ml培养基中培养。3天后，移除1.5ml培养基并加入新鲜的相同的培养基。7天后，清洗获得人DCs。
12.免疫细胞亚群的移除和VEGFR阻断
按图8方案用LLC细胞和LLC-EVs处理小鼠。为了移除DCs，在2天开始对CD11c-DTR小鼠连续腹腔注射2μg DT，每两天一次。为了移除CD4+或CD8+ T细胞，在2天开始连续腹腔注射60μg抗CD4和16μg抗CD8抗体(Bio X Cell)，每两天一次。为了阻断VEGFR，在2天开始连续静脉注射40μg抗VEGFR2抗体(anti-VEGFR2)，每两天一次。
13.EV标记
按使用说明书，用VivoTrack 680(Fluorescence，北京)、PKH26(Sigma–Aldrich)或CFSE(Thermo Fisher Scientific)对EVs进行标记。对于VivoTrack 680标记，在200μlPBS中使150μg EVs与42μMVivoTrack 680在室温下混合30min。对于PKH26标记，将150μgEVs悬浮于100μl稀释液C中，加入含0.4μl PKH26乙醇染料溶液的100μl稀释液C，然后，混合5min。对于CFSE标记，在200μl PBS中使150μg EVs与7.5μMCFSE在37℃下孵育30min。加入等体积的无外泌体的FBS(exosome-depleted FBS，Thermo Fisher Scientific)并孵育1min终止标记反应。最终，在120000×g下离心70min移除未结合的标记物，并使EV标记物悬浮于200μl PBS中
14.体外和体内EV摄取情况的检测(Detection of EV uptake in vitro and invivo)
为了检测MCs摄取TEVs情况，用2.5μg ml-1 CFSE标记的LLC-EVs处理p-pMCs和40L细胞24h。为了检测TEVs在体内的分布情况，在小鼠静脉或胸膜内注射100μgVivoTrack680-标记的LLC-EVs，24h后将小鼠安乐死，取脑、心、肺、肝、脾、肾和胃肠器官，并用IVIS(PerkinElmer)获取图像。为了检测TEVs在肺部的分布情况，在小鼠静脉或胸膜内注射20μg PKH26标记的LLC-EVs，24h后收集小鼠肺并用Tissue-TekTM Cryo-O.C.T.Compound(Thermo Fisher Scientific)进行包埋处理，获取10μm的组织切片。接着，用0.5μg ml- 1DAPI在室温下处理20min，进行细胞核染色。通过共聚焦显微镜(Olympus IX83-FV3000)观测细胞和染色后的组织切片。为了检测胸膜TEV摄取情况，在小鼠胸膜内注射了20μg CFSE标记的LLC-EVs；部分试验中，在EV注射前2h通过腹腔注射0.25mg kg-1 Cyto-D；24h后取小鼠的胸膜，用立体显微镜(Nikon SMZ18，Tokyo，Japan)进行观察。
15.EV蛋白和RNAs的降解
为了降解EV蛋白，用10μg ml-1蛋白酶K在有电穿孔(electroporation)或无电穿孔情况下分别消化LLC-EVs 2h。为了降解EV RNAs，用10μg ml-1RNase I结合电穿孔(electroporation)消化LLC-EVs 2h。用BTX电穿孔仪(Harvard Biosciences,Cambridge,MA,USA)进行EVs的电穿孔。简单来说，将100μg LLC-EVs和100μl电穿孔缓冲液(HarvardBiosciences)进行混合，在固定电容为100μF的条件下进行典型程序，在0.2cm样品管中效率最佳。
16.p-pMCs的分离
在已有方法(Gilmer J,Serve K,Davis C,Anthony M,Hanson R,Harding T,etal.Libby amphibole-induced mesothelial cell autoantibodies promote collagendeposition in mice.American journal of physiology Lung cellular and molecularphysiology 2016,310(11):L1071-1077)的基础上进行了改进，分离获得鼠p-pMCs。简单来说，小鼠处死后，在无菌条件下移取胸壁。用眼钳将胸膜壁层剥离，用PBS清洗两次以移除血迹，并剪切成1mm2的组织碎片。然后，将胸膜组织接种于含含完全DMEM培养基的25cm2的培养瓶中。次日将未黏附的细胞移除，再培养至72h即可获得MCs。
17.免疫组织化学着色
将鼠肺和人TT组织切片进行脱蜡和再水化处理，用10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复。用5％ BSA阻断处理后，将组织切片与第一抗体再4℃下孵育过夜，再在室温下与HRP偶联的第二抗体孵育30min。随机获取成像数据并用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD，USA)进行分析。
18.趋化性检测(Chemotaxis assay)
为了进行DC趋化性检测，用2.5μg ml-1LLC-EVs刺激p-pMCs和40L细胞24h，用2.5μgml-1A549-EVs刺激NCI-H2452细胞24h。然后，收集上清液，置于3μm孔隙大小的迁移室(Corning Inc.，Corning，NY，USA)的底部小室中，迁移室的上部小室加有DCs，12h后通过流式细胞仪计算迁移细胞数量进而评价DC迁移情况。
19.siRNAs、miRNA类似物和抑制剂的转染
按说明书使用TransIT-TKO转染试剂盒(Mirus Bio，Madison，WI，USA)将Scrambled NC或目标siRNA和miRNA类似物，抑制剂或相应对照(GenePharma，上海)进行转染。
体内实验：将10μg胆固醇偶联siRNAs溶解在无RNase的双蒸水中，并于每次胞外囊泡胸腔注射前24h注射至肺转移性肿瘤小鼠的胸腔中。siRNAs、miRNA类似物及其抑制剂序列见下表2。
20.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
按Trizol试剂说明提取总RNA，并按cDNA合成试剂盒(Toyobo，Osaka，Japan)进行逆转录。对于miRNA逆转录，特异性引物由GenePharma合成。进行相对定量分析时，用SYBRGreen(Vazyme，南京)在罗氏480实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR。对于细胞和组织样品以GAPDH作为内参进行归一化(GAPDH的PCR引物见SEQ ID NO:7和SEQID NO:8)，对于EV样品以U6作为内参进行归一化(U6的PCR引物见SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14)。进行绝对定量时，使用特异性的miRNAs TaqMan探针(GenePharma)和/>Universal U+Probe Master Mix V2(Vazyme)进行实时荧光定量PCR。引物和探针序列见下表。
表2序列表
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21.RNA-Seq分析
提取总RNA并反转录，构建cDNA文库，该文库送至杭州联科生物公司。在IlluminaHiSeq2000平台上进行测序，通过Bowtie2将各reads序列比对至小鼠基因组参考序列(GRCm38)。利用R 4.1.2软件中的“limma”包，以|Log2FC|>1和P值<0.05为标准，分析并筛选PBS和TEVs组之间的差异表达基因(DEGs)。随后，用“gplot”包中的heatmap.2功能绘制DEGs热图，用“corrplot”包计算DEG两两之间的Pearson相关系数。
22.miRNA微阵列测序分析(MiRNA array)
收集LLC-EVs和MLE-12-EVs样本，在安捷伦SurePrint Mouse miRNA8×60Kv.21.0芯片上进行两样本中miRNA的微阵列分析。用特征提取软件v.11.5.1.1(安捷伦)进行数据采集、数据提取和质量控制分析，再用用Gene Spring GX软件对各样本间的信号进行标准化处理。用R 4.1.2软件中的“limma”包，以|Log2FC|>1和P值<0.05为标准，鉴定组间差异表达的miRNA。
23.细胞因子的测量
用2.5μg ml-1LLC-EVs刺激p-pMCs和40L细胞以及用2.5μg ml-1A549-EVs刺激NCI-H2452细胞24h。300×g离心5min移除细胞和残渣。为了检测p-pMCs细胞分泌的细胞因子，将小鼠处死后，取等面积胸膜按上述方法培养24h。通过ELISA测定培养基上层液体中的细胞因子和MPE液体样本中的CCL21水平。为了检测体内的细胞因子，收集小鼠和人体血清，通过ELISA测定C1qA水平。具体按鼠CCL19试剂盒(Absin，上海)，鼠CCL21a、人Exodus 2ELISA试剂盒(Abcam，Cambridge，UK)以及人C1qAELISA试剂盒(Abcam)的说明书进行。
24.ELISA检测EV miRNA含量
在anti-CD63抗体包被的96孔ELISA板中加入等量的TT-EVs和MPE-EVs，在37℃下孵育过夜使其被96孔板吸附。用无RNase的Intracellular Fixation andPermeabilization Buffer(Thermo Fisher Scientific)固定囊泡、破囊泡膜，再用20nM生物素标记抗CD9抗体或miR-5193探针在37℃下孵育1h。洗涤后，每孔加入25μl avidin-HRP并室温孵育1h。最后，加入TMB显色，2M硫酸溶液终止显色，并在450nm波长处测量吸光度。
25.荧光素酶报告基因分析
扩增包含潜在miR-5110结合位点的鼠Cd93 mRNA3’-UTR序列并将其克隆到GP-miRGLO载体(一种含双荧光素酶报告基因的质粒，Genepharma)，构建成含萤光素酶报告基因的WTCd93 3’-UTR载体。同理，通过WT序列的反义链构建突变型Cd93 3’-UTR载体。将WTCd93 3’-UTR载体或突变型Cd93 3’-UTR载体和miRNA类似物或参照物(终浓度60nM)转染40L细胞。24h后收集细胞并裂解，用Duo-Lite Luciferase Assay System(Vazyme)检测荧光素酶活性。
26.重组蛋白和抗体的产生
将C1qA，IGFBP7和MMRN2克隆到带flag标签序列的pcDNA3.1载体中，构建成CD93配体的表达载体。将该表达载体通过JetPEI(Polyplus，上海)转染到CTC细胞中并使CD93配体表达，用anti-FLAG M2磁珠(Sigma-Aldrich)和flag-tag多肽(Yeasen，上海)分离带flag标签的结合蛋白。克隆免疫兔抗体的可变区和鼠IgG1抗体的恒定区序列至pcDNA3.1载体中，构建Anti-mouse CD93 rabbit/mouse IgG1 chimeric mAb(Sino Biological，北京)。克隆M057是增加CCL21a在p-pMCs表达最有效的方式。
27.内皮血管生成试验
用2mg ml-1I型胶原酶(Worthington Biochemical)，2mg ml-1IV型胶原酶(Worthington Biochemical)和0.2mg ml-1脱氧核糖核酸酶I(DNase I，Sigma–Aldrich)在37℃下消化肺组织1h，用含10％ FBS的培养基终止反应。用70μm细胞筛过滤获得单细胞悬浊液。用抗鼠CD31-PE抗体(Biolegend，San Diego，CA，USA)和PE阳性选择试剂盒(StemCel，Vancouver，BC，Canada)分离CD31阳性的原发ECs，使用前在内皮细胞培养基(Procell,Wuhan,China)中培养5天。
用2μgml-1IGFBP7和/或2μgml-1M057处理24h后，将鼠原发性ECs按每孔1×104细胞接种至包被内皮生长因子减少基质的ibidi板(BD Bioscience，Sab Jose，CA，USA)中。用6.25μg/ml钙黄绿素AMZ对鼠原发性ECs进行染色。用倒置荧光显微镜观察获取毛细管生长情况的图像，用ImageJ(NIH)血管生成分析仪插件进行分析。
28.蛋白标记和检测
按使用说明书用蛋白标记试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对M057进行标记。将100μg Alexa Fluor 680-labeled anti-CD93静脉注射至WT和Cd93-/-小鼠，24h后将小鼠处死，收集双侧胸壁，用IVIS(PerkinElmer)观察记录anti-CD93成像情况。
下述列出的为本申请的参考文献，本申请所提供的所有参考文献(例如CN202080075436.0)的内容都属于本申请内容的一部分。
本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里的所谓的“一个”仅仅表示“一”的意思，而不排除仅仅只是包括一个，也可以表示包括2个以上。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。
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35.朱玉文等，用于治疗疾病或病症的方法和组合物，申请公布号CN 114615994A，申请公布日2022.03.10。

Claims (34)

1.一种阻断剂，所述的阻断剂是一种能够特异性抑制C1q/CD93信号传导途径的试剂。
2.根据权利要求1所述的阻断剂，其中，所述的阻断剂能够阻断C1q/CD93之间的相互作用。
3.根据权利要求2所述的阻断剂，其中，所述的阻断剂包括特异性识别CD93的抗体或者抗体片段，或者特异结合或者识别C1q的抗体或者抗体片段；或者能够降低CD93表达的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或基因编辑系统。
4.根据权利要求3所述的阻断剂，其中，所述的阻断剂通过阻断C1q/CD93之间的相互作用，从而让CCL21的表达增多，或者活性增强，从而让树突状细胞向肺部肿瘤或肺部感染细胞聚集。
5.根据权利要求3所述的阻断剂，其中，所述的CD93位于胸膜间皮细胞中。
6.根据权利要求5所述的阻断剂，其中，所述特异性识别CD93的CD93抗体是抗人CD93抗体。
7.根据权利要求6所述的阻断剂，其中，所述的抗人CD93抗体是全长抗体、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双抗体、三抗体或四抗体。
8.根据权利要求6所述的阻断剂，其中，所述的CD93抗体包含在融合蛋白中。
9.根据权利要求3所述的阻断剂，其中，所述的抗体与CD93结合的亲和力大于C1q与CD93结合的亲和力。
10.根据权利要求2所述的阻断剂，其中，阻断剂为多肽或者多肽片段。
11.根据权利要求10所述的阻断剂，其中，所述的多肽是结合并抑制CD93功能的多肽，其结合于CD93的不同胞外结构域。
12.根据权利要求11所述的阻断剂，其中，所述的多肽是可溶性多肽。
13.根据权利要求11所述的阻断剂，所述多肽与CD93的结合亲和力大于与C1q的结合亲和力。
14.一种能够特异性抑制C1q/CD93信号传导途径的阻断剂在用于制备肺癌或者肺部感染试剂上的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述的阻断剂能够阻断C1q/CD93之间的相互作用。
16.根据权利要求14所述的用途，其中，所述的阻断剂至少具有如下功能之一：(1)降低C1q或者CD93的基因表达量；(2)降低C1q或者CD93的蛋白的活性；(3)降低C1q或者CD93的识别或者结合能力。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述的阻断剂是特异结合或者识别CD93的抗体或者抗体片段，或者特异结合或者识别C1q的抗体或者抗体片段；或者能够降低CD93表达的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或基因编辑系统；或者降低C1q表达的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或基因编辑系统。
18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述的阻断剂通过阻断C1q/CD93之间的相互作用，从而让CCL21的表达增多，或者活性增强，从而让树突状细胞向肺部肿瘤或肺部感染细胞的区域聚集。
19.根据权利要求16所述的用途，其中，所述的CD93是胸膜间皮细胞中的。
20.根据权利要求17所述的用途，其中，CD93抗体是抗人CD93抗体。
21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述的抗人CD93抗体是全长抗体、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双抗体、三抗体或四抗体。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述的CD93抗体包含在融合蛋白中。
23.根据权利要求20所述的用途，其中，所述的抗体与CD93结合的亲和力大于C1q与CD93结合的亲和力。
24.根据权利要求16所述的用途，其中，阻断剂为多肽或者多肽片段。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述的多肽是结合并抑制CD93功能的多肽，其结合于CD93的不同胞外结构域。
26.根据权利要求25所述的用途，其中，所述的多肽是可溶性多肽。
27.根据权利要求26所述的用途，所述多肽与CD93的结合亲和力大于与C1q的结合亲和力。
28.根据权利要求26所述的用途，所述的阻断剂能促进全身肿瘤特异性的T细胞介导的细胞免疫，在抗肺部肿瘤的同时具有抗其他部位同种肿瘤的作用。
29.根据权利要求28所述的用途,所述的肺部肿瘤包括肺部原生肿瘤或者其他肿瘤转移到肺部的肿瘤。
30.一种确定候选药剂是否可用于治疗肺癌或者肺部炎症的方法，其包括：确定所述候选药剂是否破坏CD93/C1q相互作用，其中，如果所述候选药剂显示特异性破坏CD93/C1q相互作用，则其可用于治疗肺癌或者肺部炎症。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述方法包括确定所述候选药剂是否破坏细胞表面上CD93与C1q的相互作用。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述方法包括确定所述候选药剂是否在体外测定系统中特异性破坏CD93和C1q的相互作用。
33.根据权利要求30所述的方法，其中，所述的候选药物是抗体、肽、融合肽、肽类似物、多肽、适体、avimer、anticalin、speigelmer或小分子化合物中的一种或者多种。
34.根据权利要求30所述的方法，其中，所述方法包括将所述候选药剂与CD93/C1q复合物接触。
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