KR20100045194A - Ｋｉｒ2.2 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 - Google Patents

Ｋｉｒ2.2 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내향성 정류 칼륨 채널(inwardly rectifying K+ channel) Kir 2.2 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료용 조성물 및 Kir2.2 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
칼륨 채널, Kir2.2, 암, siRNA, Kir2.2 단백질 억제제

Description

Ｋｉｒ2.2 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물{Composition comprising Kir 2.2 inhibitor for cancer treatment}
본 발명은 내향성 정류 칼륨 채널(inwardly rectifying K+ channel) Kir 2.2 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 Kir2.2 단백질 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 및 Kir2.2 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암은 세포가 무한히 증식해 정상적인 세포의 기능을 방해하는 질병으로, 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 통제되지 못하고 과다하게 증식하며, 주위 조직이나 장기에 침입하여 정상 조직의 파괴를 초래한다. 암이 발생하는 부위는 제한되지 않으며, 암이 발생하는 원인은 아직도 정확히 밝혀진 바 없다. 지금까지 알려진 바에 따르면 정상적인 세포의 유전자에 돌연변이가 생겨서 나타난다고 알려져 있다.
유전자 발현의 이상은 모든 암의 공통적인 특징인 조절불능의 세포 성장 및 탈분화와 밀접하게 관련되어 있다. 다수의 암 연구에 따르면, 특정 암을 갖는 개체의 게놈에서는 일반적으로 종양 억제유전자로 불리며 정상적으로는 무분별한 세포 의 분열과 과잉 성장을 억제하는 기능을 하는 열성유전자의 발현이 감소되며, 정상 세포를 암세포로 변형시키는 능력을 갖는 종양유전자가 과다발현된다. 따라서, 유전자 발현과 암의 발병 또는 진행과의 관계에 기초하여 정상 세포 대비 암 세포에서 특이적으로 과발현되거나 또는 그 발현이 억제되는 유전자를 탐색하면 암 진단이나 치료의 표적을 개발할 수 있다. 특정 암에 대한 유전적 원인이 규명되고 그에 근거한 진단 및 치료 방법이 개발되고 있으나, 보다 더 효과적인 암의 진단과 치료를 위해서는 표적 유전자에 대한 규명이 필요하다.
칼륨 채널은 세포막 내에 존재하는 단백질 복합체인 이온 채널의 일종으로, 칼륨의 세포막을 통한 흐름을 조절하여 막 전위를 조절한다. 칼륨 채널은 신경계와 근육에 폭넓게 분포하여 신경 세포와 신경 세포 사이, 또는 신경 세포와 근 세포 사이의 신호전달에서 중요한 역할을 수행한다. 칼륨 채널은 아미노산 서열 및 기능을 기준으로 명명되며, 전압 게이트 칼륨 채널 (예를 들면, Kv1, Kv2, Kv3, Kv4) 및 내향성 정류 칼륨 채널(inwardly rectifying K+ channel)(예를 들면, Kir1, Kir2, Kir3, Kir4, Kir5, Kir6) 등이 있다. 주로 칼륨 채널의 기능 이상이나 결함은 신경학적 질환이나 심장 질환과 연관되는 것으로 알려져 있으며, 암의 발병이나 진행과의 관계에 관해서는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자는 암의 발병 및 진행과 연관된 암 치료의 표적 유전자를 탐색하는 연구를 수행하여, 암 세포에서 칼륨 채널 중 하나인 Kir2.2 단백질이 정상 세포에 비해 과발현된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Kir2.2 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Kir2.2 단백질의 발현이나 활성의 측정에 기반한 암 진단 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 치료를 위한 Kir2.2 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Kir2.2 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "Kir2.2 단백질"은 내향성 정류 칼륨 채널로서, 구성적으로 활성인(constitutively active) 채널 타입 중 하나의 서브 타입을 의미한다. 상기 Kir2.2 단백질은 포유동물에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 Kir2.2 단백질은 인간, 원숭이, 및 설치류로 구성된 군으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 Kir2.2 단백질은 인간에서 유래된 서열번호 1 (GenBank Accession No: NP_066292) 또는 랫트인 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)에서 유래된 서열번호 2(GenBank Accession No: X78461)의 아미노산을 가질 수 있다. 상기 Kir2.2 단백질은 위암, 폐암, 전립선암, 결장암, 및 유방암 세포에서 정상세포 대비 높은 발현 수준을 보였다. 도 1은 위, 폐, 전립선, 결장 및 유방에서 분리된 정상 세포와 암세포의 Kir2.2 단백질의 발현 수준을 보여준다. 또한, Kir2.2 단백질의 발현이 억 제되면, 암세포의 증식이 억제되며, Kir2.2 단백질의 발현이 증가되면 암세포의 증식에 대한 항암제의 효과가 약화되는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 Kir2.2단백질의 발현이 암세포의 증식을 촉진하여 암을 진행시키는 데 관여한다는 것을 시사한다. 따라서, Kir2.2 단백질의 발현이나 활성을 억제하면 암세포의 증식이 억제되고 이에 의해 암을 치료할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, Kir2.2는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현을 억제하는 물질은 Kir2.2 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA) 및 shRNA(small hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA 간의 올리고머 헤테로이중체를 형성하는 올리고머를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 대해 완전하거나 또는 근사한 서열 상보성을 가지며, mRNA의 번역을 차단하거나 저해하고 스플라이싱 변이체를 생성하는 mRNA의 가공 과정을 변화시켜 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Kir2.2 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고머일 수 있다.
siRNA는 RNA 간섭 또는 유전자 침묵(gene silencing)을 매개할 수 있는 약 20개의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 이중가닥 RNA를 의미하며, shRNA는 siRNA 표적 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5개 내지 9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 구조의 RNA를 의미한다. siRNA나 shRNA는 상보적인 서열을 갖는 표적 mRNA에 특이적으로 결합하여 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭(RNAi: RNA interference)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA는 Kir2.2를 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현을 억제하는 siRNA는 서열번호 3 내지 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 사용되는 siRNA를 제조하는 방법은 siRNA를 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acac Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, shRNA는 siRNA의 고가의 합성 비용, 낮은 형질감염 효율에 따른 RNA 간섭 효과의 짧은 지속시간 등을 극복하기 위해 이용되며, RNA 중합효소 III의 프로모터로부터 아데노바이러스, 렌티 바이러스, 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있다. shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 가공 효소(Dicer 또는 RNaseIII)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 표적 유전자의 침묵을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 암 치료용 조성물은 Kir2.2 단백질 의 활성을 억제하는 물질을 포함하고, 상기 Kir2.2 단백질의 활성을 억제하는 물질은 Kir2.2 단백질의 활성을 특이적으로 억제하는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다.
Kir2.2 단백질의 활성을 억제하는 항체는 Kir2.2 단백질에 특이적으로 결합하여 Kir2.2 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. Kir2.2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법에 의해 제조하거나, 또는 상업적으로 이용가능한 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 또한, Kir2.2 단백질의 활성을 억제하는 항체는 Kir2.2 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제할 수 있는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 항체의 기능성 단편을 포함한다. 항체의 기능성 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명은 또한, Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체, Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
Kir2.2 단백질은 정상세포 대비 암세포에서 과발현되며, 암세포의 증식을 촉진하는 것으로 확인되었다. 따라서, Kir2.2 단백질의 발현이나 활성 수준을 측정하여 정상세포와 비교하는 것에 암의 발병 또는 진행 여부를 진단할 수 있다. Kir2.2 단백질의 발현이나 활성 수준은 Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 또는 Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인 식하는 프로브 또는 프라이머를 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현 수준은 Kir2.2 유전자의 mRNA 수준을 측정할 수 있는 물질에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 Kir2.2 유전자의 mRNA 수준을 측정할 수 있는 물질은 Kir2.2 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다. 당업자는 공지된 Kir2.2 유전자의 서열로부터 특정 영역을 특이적으로 증폭하거나 인식하는 프라이머 또는 프로브를 설계할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현 수준은 Kir2.2 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 측정될 수 있다. 공지된 아미노산 서열을 갖는 Kir2.2 단백질로부터 이에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 것은 당업자가 공지된 방법을 이용하여 용이하게 수행할 수 있다. Kir2.2 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 재조합 항체를 포함하며, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 적어도 항원 결합 기능을 보유하는 기능성 단편인 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분을 더 포함할 수 있다. 분석 방법이 RT-PCR인 경우, 상기 키트는 Kir2.2에 대한 프라미어쌍 외에, 필요한 용기, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), PCR용 DNA 폴리머라아제, 및 역전사 효소 등을 더 포함할 수 있 다. 또한, 분석 방법이 ELISA인 경우, 결합된 항체 검출용 시약, 예를 들면, 2차 항체, 발색단, 효소 및 그 기질을 더 포함할 수 있다.
체외로 분리된 세포 시료의 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계, 및
상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 세포 대조구에서 측정된 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 암을 진단하는 방법은 체외로 분리된 세포 시료에서 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 Kir2.2 또는 그의 단편, 또는 이들을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인식하는 항체, 프로브 또는 프라이머에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현량, 즉, mRNA 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 노던 블롯팅 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선 면역분석법, 면역침전법 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 암을 진단하는 방법은 세포 시료에서 측정된 Kir2.2 단백질의 발현 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 세포 대조구의 측정값과 비교하 는 단계를 포함한다. 세포 시료에서의 Kir2.2 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 세포 대조구의 수준보다 더 높으면 상기 세포 시료는 암이 발병하거나 또는 진행될 확률이 높은 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 Kir2.2 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계, 및
상기 세포에서 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, Kir2.2 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
Kir2.2 단백질은 정상세포 대비 암세포에서 과발현되며 암세포의 증식을 촉진하는 것으로 확인되었다. 또한, 암세포에서 Kir2.2의 발현을 억제하면 암세포의 증식이 억제되는 것으로 확인되었다. 따라서, Kir2.2 단백질의 발현이나 활성을 특이적으로 억제하는 물질은 암세포의 증식을 억제하여 암 치료의 효과를 발휘할 수 있다. 이와 같은 효과는 Kir2.2 단백질 또는 그 유전자가 암 치료의 표적이라는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 Kir2.2 억제제를 스크리닝하는 방법은 Kir2.2 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 Kir2.2 단백질을 발현하는 세포는 위암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 결장암 세포 및 유방암 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계는 시험 물질의 형질감염, 형질전환 또는 주입에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시험 물질과의 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현량은 Kir2.2 유전자의 mRNA 또는 Kir2.2 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 Kir2.2 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법은 상기 세포에서 측정된 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 감소되게 하는 시험 물질을 Kir2.2 단백질의 억제제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 시험 물질의 처리 후에 Kir2.2 단백질의 발현 또는 활성 수준이 더 감소된 경우, 상기 시험 물질은 Kir2.2 단백질의 발현이나 활성을 억제하여 암 치료를 위해 이용될 수 있는 물질로 선별될 수 있다. 상기 대조군은 시험 물질과 접촉시키는 단계를 제외하고는 동일한 조건으로 처리된 세포이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포에서 Kir2.2 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 또는 Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인식하는 프로브 또는 프라이머에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 발현, 즉, mRNA 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 노던 블롯팅 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Kir2.2 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 웨 스턴 블롯, ELISA, 방사선 면역분석법, 면역침전법 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명에 따른 Kir2.2 단백질 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물, Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체, Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 암 진단 키트 및 Kir2.2 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법을 이용하면, 조기에 암을 진단하여 효과적으로 치료할 수 있다.
실시예 1. 암세포에서의 Kir2.2 단백질의 과발현
위, 폐, 전립선, 결장 및 위에서 유래된 암세포에서 Kir2.2 단백질의 발현을 분석하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. RNeasy 미니 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 ATCC로부터 구입한 위암세포인 MKN45, MKN74, SNU668, 폐암 세포 A549, H661, L132, 전립선암세포인 DU145, LNCaP, PC3, 결장암세포인 KM12C, LoVo, SW480, 유방암세포인 MCF7, SK-BR-3, T47D로부터 전체 RNA를 분리하고 DNase I으로 처리하였다. 인간 전체 RNA Master Panel II (Clontech, Palo Alto, CA)를 정상 RNA 대조구로 이용하였다. mRNA를 올리고-dT 프라이머와 MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사 효소를 이용하여 제1가닥 cDNA로 전사시키고, 인간 Kir2.2 유전자의 cDNA 코딩 영역으로부터 설계된 서열번호 8과 9의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서의 30초, 60℃에서의 30초 및 72℃에서의 30초로 구성된 25회의 사이클 및 72℃에서의 10분간 인큐베이션으로 수행하였다. 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 전기영동 및 뒤이은 EtBr(Etidium Bromide) 염색 및 UV 조사에 의해 분석하였다. 도 1은 상이한 암 조직으로부터 수립된 암세포주에서 대조구 대비 Kir2.2 단백질의 과발현을 보여준다.
실시예 2. 암세포 증식에 대한 Kir2.2 단백질 발현의 효과
Kir2.2 단백질의 발현이 암세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해, 암세포를 Kir2.2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질감염시키고, 형질감염된 암세포의 콜로니 형성 능력, 항암제에 의한 암세포의 증식억제에 대한 효과 및 Kir2.2 유전자의 넉다운의 효과를 조사하였다.
(1) 암세포의 형질감염
ATCC로부터 구입한 전립선 암세포인 PC-3 세포, 유방암 세포인 MDA-MB 468, MCF7, SK-BR-3, 및 T47D와 위암 세포인 MKN74 및 SNU668에 각각 pCMVTaq4C(Invitrogen) 및 pCMVTaq4C_Kir2.2를 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 형질감염시켜 대조군(Control)과 실험군(Kir2.2)으로 준비하였다. pCMVTaq4C_Kir2.2는 정상 섬유아세포의 총 mRNA로부터 역전사-PCR에 의해 Kir2.2 유전자의 전장 maspin 개방 해독 프레임을 증폭시키고, 이를 pCMVTaq4C(Invitrogen)의 XhoI-BamHI 부위로 클로닝시켜 제조하였다.
(2) 암세포의 콜로니 형성 능력에 대한 Kir2.2 단백질 발현의 효과
Kir2.2 단백질 발현이 전립선암세포 PC-3의 콜로니 형성에 미치는 효과를 조사하였다. 상기 (1)에서 수립된 Kir2.2 유전자를 포함하는 실험군 벡터 또는 대조군 벡터(Kir2.2 유전자를 포함하지 않음)를 안정적으로 발현하는 형질전환된 PC-3 세포들을 60-mm 디쉬에 디쉬당 1 X 102개의 세포로 접종하고, 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1 mM NaCO2, 2 mM L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 37℃, 5% CO2 조건 하에 2주 동안 연속 배양하였다. 2주 배양 후에, 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하고, 위상차 현미경 하에서 콜로니의 수를 계수하였다. 이 때, 콜로니는 50개 이상의 세포로 구성된 군으로 정의하였다. 결과가 도 2에 표시된다. 도 2의 상단은 위상차 현미경으로 관찰된 콜로니를 보여준다. 형질전환된 암세포들은 Kir2.2 유전자의 발현-의존적 방식으로 증가된 콜로니 형성 능력을 보였다. 표시된 값들은 3회의 독립적인 실험의 평균값이다.
(3) 암세포의 증식에 대한 독소루비신과 Kir2.2 단백질 발현의 효과.
Kir2.2 단백질을 과발현하는 세포에 항암제인 독소루비신을 처리하여 Kir2.2 단백질의 과발현과 독소루비신의 처리에 의한 암세포 증식에 대한 효과를 조사하였 다.
상기 (1)과 같이, Kir2.2 유전자를 벡터 pCMVTaq4C(Invitrogen)에 클로닝하여 제조 된 Kir2.2 유전자 발현 벡터, pCMVTaq4C_Kir2.2(2 mg) 또는 대조구 벡터 pCMVTaq4C(2 mg)를 2 X 106개 PC-3 세포에 형질감염시키고, 세포 배양 디쉬에 플레이팅하고 1일 동안 10% FBS, 1 mM NaCO2, 2 mM L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 10 nM 독소루비신으로 5일 동안 처리하고, SA-b-Gal(Senescence-Associated b-Galactosidase) 활성을 평가하였다. 이를 위해, 세포들을 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드에서 10분간 고정시키고 37℃에서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드(1 mg/ml)를 용해시킨, 40 mM 시트르산(pH 6.5), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM NaCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 용액에 12시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 후에, 위상차 현미경으로 세포들을 촬영하였다.
도 3A 및 3B는 PC-3 세포의 증식에 대한 독소루비신, Kir2.2 단백질 발현 및 BaCl2 처리의 효과를 도시한다. 독소루비신을 단독으로 처리한 경우, 세포 증식이 대조구 대비 현저하게 억제되나, 형질감염에 의해 Kir2.2의 발현을 증가시킨 세포에 독소루비신을 처리한 경우에는 독소루비신에 의한 세포의 증식 억제가 독소루비신의 단독 처리 경우보다 낮았다. 포타슘 채널의 이온 채널로서의 작용을 효과적으 로 억제하는 것으로 잘 알려져 있는 바륨 (BaCl2, 0.5 mM)을 처리하여 포타슘 채널 기능을 억제하여도 Kir2.2 단백질 발현이 독소루비신의 세포 독성을 저해하는 것으로 확인되었다. 이 결과는 Kir2.2 단백질에 의한 암세포의 생존 증가가 이온 채널과는 별개의 기능에 의한 것일 가능성을 시사한다.
(4) siRNA에 의한 Kir2.2 단백질 발현 억제의 암세포 증식에 대한 효과
siRNA에 의한 Kir2.2 단백질의 발현 억제가 암세포의 증식에 대해 갖는 효과를 조사하였다.
(4-1) 웨스턴 블롯팅
웨스턴 블롯팅을 통해 서열번호 3 내지 6의 Kir2.2 유전자에 대한 siRNA(이하, siKir2.2라 함)(Dharmacon, Lafayette, US)에 의해 유도된 Kir2.2 유전자의 넉다운 효과를 확인하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Amexa 전기천공 시스템(Amaxa, Gaithersburg, MD)을 이용하여 암세포에 siRNA를 형질감염시켰다. 표준 기법을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 요약하면, 전립선암)(PC-3), 유방암(MDA-MB 468, MCF7, SK-BR-3 및 T47D) 및 위암(MKN74 및 SNU668)에서 유래되고, 서열번호 7의 대조군 siRNA인 siControl 또는 서열번호 3 내지 6의 siKir2.2로 형질전환된 암세포들을 프로테아제 억제제를 함유한 용해 완충액(20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 1 ㎍/ml 루펩틴, 1 ㎍/ml 아프로티닌, 2 mM Na2VO4 및 5 mM NaF)에서 용해시켰다. 상기 세포 용해액을 12% SDS-PAGE에 의해 전개시키고 각각 Kir2.2와 β-액틴에 대한 항체(Sigma) 및 강화 화학발광 시스템(Amersham, Arlington Heights, IL)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 4A는 siRNA(100 nM)로 형질감염된 암세포에서 48시간 배양 후 웨스턴 블롯팅에 의해 확인된 Kir2.2 유전자의 넉다운을 보여준다.
(4-2) MTT 분석
도 4B는 전립선암세포 PC-3의 증식에 대한 siKir2.2의 효과를 보여준다. PC-3 세포를 상기 (1)에 기재된 바와 같이, siControl (50nM) 또는 siKir2.2(50nM)로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후에 MTT 분석법에 의해 생존 세포의 백분율을 측정하였다. MTT 분석은 하기와 같이 수행하였다.
MTT 분석법을 위해, 세포들을 96-웰 플레이트에서 0.1 ml의 최종 부피로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 각 웰에 0.025 ml MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로미드) 용액(PBS에 담긴 5 mg/ml)을 첨가하였다. 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션 한 후, 0.1 ml 염료(dye) 추출 완충액(20% SDS, 50% 디메틸포름아미드)을 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시키고, 상기 추출 완충액을 블랭크로 하여, 96-웰 멀티스캐너 자동판독기(96-well multiscanner autoreader)를 이용하여, 590 nm에서 OD(optical density)를 측정하였다. 세포 생존율은 (실험군의 OD/대조구의 OD) x 100을 이용하여 백분율로 표시 하였다. 표시된 값은 3회의 독립적인 실험으로부터 수득된 평균값이다.
siKir2.2에 의해 Kir2.2 유전자를 넉다운시킨 경우, 세포의 생존율은 대조구에 비해 20% 수준으로 현저하게 감소되었다. 이는 Kir2.2 유전자의 넉다운에 의한 암세포의 증식 억제 가능성을 보여준다.
(4-3) SA-B-Gal(Senescence-Associated b-Galactosidase) 테스트
도 5는 전립선암 세포주(PC-3), 유방암 세포주(MDA-MB468, MCF7, SK-BR-3 및 T47D) 및 위암 세포주(MKN74 및 SNU668)의 증식에 대한 siKir2.2의 효과를 보여준다.
상기 (1)에 기재된 바와 같이, 100 nM siControl 또는 siKir2.2를 각각의 세포주에 형질감염시키고, 5일 후에, Kir2.2 넉다운 세포들을 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드에서 10분간 고정시키고 37℃에서 40 mM 시트르산(pH 6.5), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM NaCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 용액에 용해시킨 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드(1 mg/ml)와 12시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 후, 위상차 현미경으로 세포들을 촬영하였다.
SiKir2.2에 의해 형질감염된 암세포들은 그 증식이 대조구에 비해 억제된 것으로 확인되었다.
실시예 3. Kir2.2 발현 억제에 의한 암 치료
누드 마우스를 이용하여 확립된 종양에 대한 siKir2.2 처리의 효과를 조사하였다. 1.5 X106 개의 PC-3 세포를 대조구 siRNA 또는 Kir2.2에 대한 siRNA로 형질감염시키고, 4주령의 암컷 무흉선 nu/nu 마우스(BALC/cnu/nu, Charles River Lab., Atsugi, Japan)의 측복부에 피하 이식시켰다. 각 군당 10 마리의 마우스를 이용하였다. 절제 직후 각 군을 대표하는 전체 종양에 대한 결과가 도 6A에 도시된다. 도 6A는 이식된 세포에 의해 형성된 종양 크기에 대한 siRNA 처리의 효과를 보여준다.
도 6B는 확립된 종양의 성장에 대한 siKir2.2 주사의 효과를 보여준다.
암컷 무흉선 nu/nu 마우스에 PC-3 세포를 이식한 후, 서열번호 3 내지 6의 siKir2.2 또는 서열번호 7의 대조구 siRNA(Dharmacon, Lafayett, US)를 2회 투여하였다. siKir2.2는 100 ㎕의 에펙텐(Effectene)에 담긴 siKir2.2 100 nM의 혼합물로 투여하였다. 각 군은 4마리의 마우스로 구성되었다.
도 1은 상이한 암조직으로부터 수립된 암세포주에서 Kir2.2 단백질의 과발현을 보여주는 도면이다.
도 2는 암세포 콜로니 형성의 Kir2.2 단백질-매개 조절을 보여주는 도면이다. Kir2.2 단백질 발현 벡터 또는 대조구 벡터로 형질감염된 PC-3 세포를 2주 동안 배양하여 PC-3 세포의 과다증식으로 인한 암세포 콜로니 형성에 대한 Kir2.2 단백질 발현의 효과를 조사하였다.
도 3은 Kir2.2 단백질의 발현을 통한 세포 증식의 조절을 보여주는 도면이다. Kir2.2 단백질 발현 벡터 또는 대조구 벡터로 형질감염된 PC-3 세포에 독소루비신을 5일 동안 처리하여 PC-3 세포의 증식에 대한 Kir2.2 단백질 발현의 효과를 조사하였다.
도 4는 Kir2.2 단백질의 발현 감소에 따른 암세포의 증식 억제를 보여주는 도면이다. A는 siRNA에 의해 형질감염된 PC-3에서 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 Kir2.2 단백질의 발현을 보여주고, B는 siKir2.2의 PC-3 세포 증식에 대한 효과를 보여준다.
도 5는 전립선암 세포주(PC-3), 유방암 세포주(MDA-MB468, MCF7, SK-BR-3 및 T47D) 및 위암 세포주(MKN74 및 SNU668)의 성장에 대한 siKir2.2의 효과를 보여준다.
도 6는 Kir2.2 단백질에 의한 인 비보 종양형성의 조절을 보여주는 도면이다. A와 B는 각각 무흉선 nu/nu 마우스에 대조구 siRNA(siControl) 또는 Kir2.2에 대한 siRNA(siKir2.2)에 의해 형질감염된 PC-3 세포를 이식하여 관찰된 종양 크기(A) 및 siKir2.2 주사에 의한 종양 억제 정도(B)를 보여준다.
<110> Samsung Medical Center <120> Composition comprising Kir 2.2 inhibitor for cancer treatment <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 433 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ala Ala Ser Arg Ala Asn Pro Tyr Ser Ile Val Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Asp Gly Leu His Leu Val Thr Met Ser Gly Ala Asn Gly Phe Gly 20 25 30 Asn Gly Lys Val His Thr Arg Arg Arg Cys Arg Asn Arg Phe Val Lys 35 40 45 Lys Asn Gly Gln Cys Asn Ile Glu Phe Ala Asn Met Asp Glu Lys Ser 50 55 60 Gln Arg Tyr Leu Ala Asp Met Phe Thr Thr Cys Val Asp Ile Arg Trp 65 70 75 80 Arg Tyr Met Leu Leu Ile Phe Ser Leu Ala Phe Leu Ala Ser Trp Leu 85 90 95 Leu Phe Gly Ile Ile Phe Trp Val Ile Ala Val Ala His Gly Asp Leu 100 105 110 Glu Pro Ala Glu Gly Arg Gly Arg Thr Pro Cys Val Met Gln Val His 115 120 125 Gly Phe Met Ala Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Thr Gln Thr Thr Ile 130 135 140 Gly Tyr Gly Leu Arg Cys Val Thr Glu Glu Cys Pro Val Ala Val Phe 145 150 155 160 Met Val Val Ala Gln Ser Ile Val Gly Cys Ile Ile Asp Ser Phe Met 165 170 175 Ile Gly Ala Ile Met Ala Lys Met Ala Arg Pro Lys Lys Arg Ala Gln 180 185 190 Thr Leu Leu Phe Ser His Asn Ala Val Val Ala Leu Arg Asp Gly Lys 195 200 205 Leu Cys Leu Met Trp Arg Val Gly Asn Leu Arg Lys Ser His Ile Val 210 215 220 Glu Ala His Val Arg Ala Gln Leu Ile Lys Pro Arg Val Thr Glu Glu 225 230 235 240 Gly Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asp Val Gly Phe Asp 245 250 255 Lys Gly Leu Asp Arg Ile Phe Leu Val Ser Pro Ile Thr Ile Leu His 260 265 270 Glu Ile Asp Glu Ala Ser Pro Leu Phe Gly Ile Ser Arg Gln Asp Leu 275 280 285 Glu Thr Asp Asp Phe Glu Ile Val Val Ile Leu Glu Gly Met Val Glu 290 295 300 Ala Thr Ala Met Thr Thr Gln Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Asn Glu 305 310 315 320 Ile Leu Trp Gly His Arg Phe Glu Pro Val Leu Phe Glu Glu Lys Asn 325 330 335 Gln Tyr Lys Ile Asp Tyr Ser His Phe His Lys Thr Tyr Glu Val Pro 340 345 350 Ser Thr Pro Arg Cys Ser Ala Lys Asp Leu Val Glu Asn Lys Phe Leu 355 360 365 Leu Pro Ser Ala Asn Ser Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Leu Ala Phe Leu 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Glu Asp Glu Ala Asp Gly Asp Gln Asp Gly Arg Ser 385 390 395 400 Arg Asp Gly Leu Ser Pro Gln Ala Arg His Asp Phe Asp Arg Leu Gln 405 410 415 Ala Gly Gly Gly Val Leu Glu Gln Arg Pro Tyr Arg Arg Glu Ser Glu 420 425 430 Ile <210> 2 <211> 427 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Thr Ala Ala Ser Arg Ala Asn Pro Tyr Ser Ile Val Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Asp Gly Leu His Leu Val Thr Met Ser Gly Ala Asn Gly Phe Gly 20 25 30 Asn Gly Lys Val His Thr Arg Arg Arg Cys Arg Asn Arg Phe Val Lys 35 40 45 Lys Asn Gly Gln Cys Asn Ile Glu Phe Ala Asn Met Asp Glu Lys Ser 50 55 60 Gln Arg Tyr Leu Ala Asp Met Phe Thr Thr Cys Val Asp Ile Arg Trp 65 70 75 80 Arg Tyr Met Leu Leu Ile Phe Ser Leu Ala Phe Leu Ala Ser Trp Leu 85 90 95 Leu Phe Gly Ile Ile Phe Trp Val Ile Ala Val Ala His Gly Asp Leu 100 105 110 Glu Pro Ala Glu Gly Arg Gly Arg Thr Pro Cys Val Leu Gln Val His 115 120 125 Gly Phe Met Ala Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Thr Gln Thr Thr Ile 130 135 140 Gly Tyr Gly Leu Arg Cys Val Thr Glu Glu Cys Pro Val Ala Val Phe 145 150 155 160 Met Val Val Ala Gln Ser Ile Val Gly Cys Ile Ile Asp Ser Phe Met 165 170 175 Ile Gly Ala Ile Met Ala Lys Met Gly Arg Pro Lys Lys Arg Ala Gln 180 185 190 Thr Leu Leu Phe Ser His Asn Ala Val Val Ala Leu Arg Asp Gly Lys 195 200 205 Leu Cys Leu Met Trp Arg Val Gly Asn Leu Arg Lys Ser His Ile Val 210 215 220 Glu Ala His Val Arg Ala Gln Leu Ile Lys Pro Arg Val Thr Glu Glu 225 230 235 240 Gly Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asp Val Gly Phe Asp 245 250 255 Lys Gly Leu Asp Arg Ile Phe Leu Val Ser Pro Ile Thr Ile Leu His 260 265 270 Glu Ile Asp Glu Ala Ser Pro Leu Phe Gly Ile Ser Arg Gln Asp Leu 275 280 285 Glu Thr Asp Asp Phe Glu Ile Val Val Ile Leu Glu Gly Met Val Glu 290 295 300 Ala Thr Ala Met Thr Thr Gln Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Asn Glu 305 310 315 320 Ile Leu Trp Gly His Arg Phe Glu Pro Val Leu Phe Glu Glu Lys Asn 325 330 335 Gln Tyr Lys Ile Asp Tyr Ser His Phe His Lys Thr Tyr Glu Val Pro 340 345 350 Ser Thr Pro Arg Cys Ser Ala Lys Asp Leu Val Glu Asn Lys Phe Leu 355 360 365 Leu Pro Ser Ala Asn Ser Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Leu Ala Phe Leu 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Glu Asp Glu Val Ala Thr Asp Arg Asp Gly Arg Ser 385 390 395 400 Pro Gln Pro Glu His Asp Phe Asp Arg Leu Gln Ala Ser Ser Gly Ala 405 410 415 Leu Glu Arg Pro Tyr Arg Arg Glu Ser Glu Ile 420 425 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kir2.2 siRNA <400> 3 aagaauggcc agugcaaca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kir2.2 siRNA <400> 4 acgagaaguc acagcgcua 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kir2.2 siRNA <400> 5 ucauguggcg uguggguaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kir2.2 siRNA <400> 6 gugcgaagga ucugguaga 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control siRNA <400> 7 uaaggcuaug aagagauac 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of Kir2.2 cDNA <400> 8 tgctggtgaa tgccctctac t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of Kir2.2 cDNA <400> 9 cggtcattcc caggttctct a 21

Claims (16)

  1. Kir2.2 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Kir2.2 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 것인 암 치료용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Kir2.2 단백질의 발현을 억제하는 물질은 Kir2.2 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA) 및 shRNA(small hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 암 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 3 내지 6로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진 것인 암 치료용 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Kir2.2 단백질의 활성을 억제하는 물질은 Kir2.2 단백질의 활성을 특이적으로 억제하는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체인 것인 암 치료용 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 전립선암, 결장암 및 유 방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 암 치료용 조성물.
  7. Kir2.2 단백질 또는 그의 단편에 대한 항체, Kir2.2 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산을 포함하는 암 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Kir2.2 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산은 프로브 또는 프라이머인 것인 암 진단용 키트.
  9. 체외로 분리된 세포 시료의 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계, 및
    상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 세포 대조구에서 측정된 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암을 진단하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Kir2.2 단백질의 발현량을 측정하는 단계는 Kir2.2 유전자의 mRNA 또는 Kir2.2 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 mRNA 양의 측정은 상기 mRNA에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수행되는 것인 방법.
  12. Kir2.2 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계, 및
    상기 세포에서 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, Kir2.2 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어지는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 발현량의 측정은 Kir2.2 유전자의 mRNA 또는 Kir2.2 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 방법은 상기 측정된 Kir2.2 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 감소되게 하는 시험 물질을 Kir2.2 단백질의 억제제로 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 대조군은 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계를 제외하고는 동일한 조건으로 처리된 세포인 것인 방법.
KR1020080104267A 2008-10-23 2008-10-23 Ｋｉｒ2.2 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 KR101062167B1 (ko)

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