KR20100085439A - Ｒａｄ 단백질 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Rad(Ras associated with diabetes) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물 및 Rad 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Rad, 세포 노화, 암, siRNA

Description

Ｒａｄ 단백질 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물{Composition comprising Rad protein inhibitor for cancer treatment}

본 발명은 Rad(Ras associated with diabetes) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물 및 Rad 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Rad(Ras associated with diabetes) 단백질은 타입 II 당뇨병 환자의 골격근에서 과발현되는 것으로 발견된 35 kDa의 Ras-관련 GTPase이다(Reynet C., et al., Science 1993;262:1441-4). Rad 단백질은 주로 심장과 폐에서 발현되며, 세포 증식과 분화, 자가세포사, 세포 주기 조절 및 글루코오스 수송을 포함한 다양한 세포내 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. Rad 단백질은 다른 Ras-관련 GTPase와 달리, 프레닐화 모티프(prenylation motif)를 갖지 않고, GTP-결합 도메인에 비-보존적 변이를 가지며, 아미노 및 카르복시 말단의 연장을 갖는 것을 특징으로 한다(Bilan PJ, et al., Exp Cell Res 1998;242:391-400). 칼모둘린, 칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II, 트로포미오신 및 nm23 등과 상호작용하고 유방암에서 과발현되는 것으로 보고되었으나(Tseng YH, et al., Cancer Res 2001;61:2071-9), 발암의 조절과 관련된 Rad 단백질의 정확한 기능은 규명되지 않았다.

노화(senescence)는 암 치료법의 치료 효과를 결정하는 주요 인자이며(Chang BD, et al., Cancer Res 1999;50:3761-7; te Poele RH, et al., Cancer Res 2002;62:1876-83; 및 Dimri GP, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:9263-7), 발암으로부터 고등 동물을 보호하는 데 있어서 중추적인 역할을 수행한다. 노화는 비가역적인 성장 정지로 정의되며, p53, pRb를 포함한 세포 주기 억제제 및 사이클린-의존성 키아나에 억제제, p21, p27 및 p16 등과 관련되는 것으로 보고되었다(Atadja P, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:8348-52; Stein GH, et al., Science 1990;249:666-9; Hara E, et al., Mol Cell Biol 1996;16:859-67; 및 Alexander K, et al., Mol Cell Biol 2001;21:3616-31).

암세포는 세포주기에 의해 조절되지 않는 무한한 증식을 특징으로 하므로, 암세포의 노화 유도 및 그에 따른 증식 억제는 암의 진행을 억제하고 치료 효과를 가져올 수 있다. 암세포에 독소루비신과 같은 항암제를 처리하면 암세포에서 비가역적인 성장 정지, 세포의 크기 확대 및 편평화, 및 노화-연관 β-갈락토시다아제(SA-노화-β-Gal)를 특징으로 하는 노화-유사 표현형(Senescence-Like Phenotype: SLP)을 유도한다(Chang BD, et al., Cancer Res 1999;50:3761-7). 또한, 암세포가 세포 노화로부터 벗어나는 능력을 획득하면 암의 재발 또는 진행을 유발할 수 있다(Roberson RS, et al., Cancer Res 2005;65:2795-803; 및 Elmore LW, et al., Clin Cancer Res 2005;11:2637-43). 따라서, 세포의 노화에 관여하는 물질이 효과적인 암 치료의 표적 물질이 될 수 있다.

이에, 본 발명자는 세포의 노화에 관여하는 암 치료의 표적 물질을 탐색하는 연구를 수행하여, 암세포에서 Rad 단백질의 발현이 억제되면 암세포의 노화가 유도되어 암세포의 증식 및 암의 진행이 억제된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Rad 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 치료를 위한 Rad 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Rad 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, "Rad 단백질"은 인간 염색체의 16q22에 위치한 유전자에 의해 코딩되는 당뇨병과 연관된 Ras(Ras associated with diabetes)로 알려져 있으며, 심장, 골격근 및 폐에서 발현되는 35 kDa의 Ras-관련 GTPase를 의미한다. Rad 단백질은 프레닐화 모티프(prenylatio motif)의 부재 및 GTP-결합 도메인에서의 비-보존적 변이 및 NH2- 및 COOH-말단 연장과 같은 다른 Ras-관련 GTPase와 구별되는 특징을 갖는다. 본 발명에서 이용되는 Rad 단백질은 포유동물에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들면, Rad 단백질은 인간, 원숭이, 및 설치류로 구성된 군으로부터 유 래된 것일 수 있다. Rad 단백질은 주로 타입 II 당뇨병을 가진 환자에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, 유방암에서 그 발현이 나쁜 예후와 관련되는 것으로 보고된 바 있다(Tseng YH, et al., Cancer Res 2001;61:2071-9). 그러나, Rad 단백질이 암세포에서 세포 주기의 정지(cell cycle arrest) 및 그에 따른 노화를 방지하여 종양형성에서 핵심적인 역할을 수행한다는 것은 보고된 바 없었다. 놀랍게도, 본 발명자는 암세포에서 Rad의 발현은 항암제의 일종인 독소루비신에 의한 노화 유도를 억제하여 암세포의 독소루비신에 대한 내성을 유발한다는 것을 발견하였다. 또한, Rad의 과발현시 암세포의 콜로니 형성 능력 및 텔로머라아제(telomerase) 활성이 높아지고 Rad의 넉다운은 인 비보에서 종양 형성 및 진행을 억제시킨다는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 Rad 단백질이 암세포의 노화 회피를 유도하여 암의 형성 및 진행에 관여한다는 것을 시사한다. 따라서, Rad 단백질의 발현이나 활성을 억제하면 암세포에서 세포 노화가 유도되고, 이에 의해 암세포의 증식 및 암의 진행이 억제되므로, 암을 치료할 수 있다.

본 명세서에서 "Rad 단백질 억제제" 또는 "Rad 억제제"는 Rad 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 의미한다. Rad 단백질 억제제는 정상 세포 또는 대조군 대비 Rad 단백질의 발현량을 감소시키거나 또는 발현된 Rad 단백질의 활성을 저하시켜 Rad 단백질의 작용을 억제한다.

본 발명의 일 양태에서, Rad 단백질은 인간에서 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열(GenBank Accession NP_004156)을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 발현을 억제하는 물질은 Rad 유전자 의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA) 및 shRNA(small hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA 간의 올리고머 헤테로이중체를 형성하는 올리고머를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 대해 완전하거나 또는 근사한 서열 상보성을 가지며, mRNA의 번역을 차단하거나 저해하고 스플라이싱 변이체를 생성하는 mRNA의 가공 과정을 변화시켜 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Rad 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고머일 수 있다.

siRNA는 RNA 간섭 또는 유전자 침묵(gene silencing)을 매개할 수 있는 약 20개의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 이중가닥 RNA를 의미하며, shRNA는 siRNA 표적 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5개 내지 9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 구조의 RNA를 의미한다. siRNA나 shRNA는 상보적인 서열을 갖는 표적 mRNA에 특이적으로 결합하여 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭(RNAi: RNA interference)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA는 Rad를 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 발현을 억제하는 siRNA는 서열번호 4 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 사용되는 siRNA를 제조하는 방법은 siRNA를 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acac Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, shRNA는 siRNA의 고가의 합성 비용, 낮은 형질감염 효율에 따른 RNA 간섭 효과의 짧은 지속시간 등을 극복하기 위해 이용되며, RNA 중합효소 III의 프로모터로부터 아데노바이러스, 렌티 바이러스, 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있다. shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 가공 효소(Dicer 또는 RNaseIII)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 표적 유전자의 침묵을 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 암 치료용 조성물은 Rad 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함하고, 상기 Rad 단백질의 활성을 억제하는 물질은 Rad 단백질의 활성을 특이적으로 억제하는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다.

Rad 단백질의 활성을 억제하는 항체는 Rad 단백질에 특이적으로 결합하여 Rad 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. Rad 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법에 의해 제조하거나, 또는 상업적으로 이용가능한 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 또한, Rad 단백질의 활성을 억제하는 항체는 Rad 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제할 수 있는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 항체의 기능성 단편을 포 함한다. 항체의 기능성 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 암 치료용 조성물은 Rad 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질 외에, 상기 물질과 상승적으로 조합되는 항암제를 더 포함할 수 있다.

Rad 단백질은 세포의 노화를 초래하는 세포 주기의 정지를 회피하게 하여 종양의 형성 및 진행을 촉진하는 것으로 확인되었다. 따라서, Rad 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 암세포에서 노화를 초래하여 궁극적으로 암세포의 증식 및 암의 진행을 저해하여 암을 치료할 수 있다. 또한, Rad 단백질의 발현은 독소루비신과 같은 항암제의 효과를 상쇄시키며, Rad 단백질의 발현이나 활성이 저해되면 암세포의 항암제에 대한 내성이 약화되어 효과가 증진될 수 있다. 따라서, 항암제를 단독으로 투여하는 경우에 비해, Rad 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 함께 투여하는 경우, 상승된 항암제의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질과 상승적으로 조합되는 항암제는 독소루비신 또는 벨케이드일 수 있다.

독소루비신이나 벨케이드를 Rad 단백질의 작용을 억제하는 Rad 억제제와 함께 병용 투여시, 독소루비신이나 벨케이드의 항암 효과를 나타내는 지표인 IC₅₀이 단독 투여시보다 유의성 있게 감소하는 것으로 확인된다.

또한, 본 발명은 Rad 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단 계, 및 상기 세포에서 Rad 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, Rad 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Rad 단백질은 세포 노화의 회피를 통해 암세포의 증식을 촉진하는 것으로 확인되었다. 또한, 암세포에서 Rad의 발현을 억제하면 암세포의 증식이 억제되는 것으로 확인되었다. 따라서, Rad 단백질의 발현이나 활성을 특이적으로 억제하는 물질은 암세포의 증식을 억제하여 암 치료의 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명에 따른 Rad 억제제를 스크리닝하는 방법은 Rad 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 Rad 단백질을 발현하는 세포는 암세포일 수 있고, 상기 암세포는 위암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 결장암 세포, 유방암 세포 및 혈액암 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계는 시험 물질의 형질감염, 형질전환 또는 주입에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 시험 물질과의 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 발현량은 Rad 유전자의 mRNA 또는 Rad 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 Rad 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법은 상기 세포에서 측정된 Rad 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 감소되게 하는 시험 물질을 Rad 단백질의 억제제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 시험 물질의 처리 후에 Rad 단백질의 발현 또는 활성 수준이 더 감소된 경우, 상기 시험 물질은 Rad 단백질의 발현이나 활성을 억제하여 암 치료를 위해 이용될 수 있는 물질로 선별될 수 있다. 상기 대조군은 시험 물질과 접촉시키는 단계를 제외하고는 동일한 조건으로 처리된 세포이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포에서 Rad 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 Rad 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 또는 Rad 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인식하는 프로브 또는 프라이머에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 발현, 즉, mRNA 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 노던 블롯팅 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, Rad 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선 면역분석법, 면역침전법 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지 않는다.

본 발명에 따른 Rad 단백질 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 및 Rad 단백질 억제제를 스크리닝하는 방법을 이용하면, 암을 효과적으로 치료할 수 있다.

실시예 1. Rad에 의한 노화-유사 표현형(SLP)의 유도

전립선암, 위암 및 유방암으로부터 유래된 암세포에 Rad mRNA를 표적으로 하는 siRNA를 투여한 후, 세포의 노화에 대한 효과를 조사하였다.

세포의 노화는 감소된 증식, 편평하고 확대된 세포 형태, 및 노화-연관 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 활성을 포함한 표현형을 특징으로 한다. 암세포에 각각 무작위로 혼합된(scrambled) siRNA인 서열번호 8의 대조군 siRNA(siControl)와 Rad mRNA를 표적으로 하는 서열번호 4 내지 7의 siRNA(siRad)를 형질감염시킨 후에 노화-유사 표현형을 관찰하였다.

ATCC로부터 구입한 전립선암세포인 DU145, LNCaP, PC3, 위암세포인 SNU638, SNU688 및 유방암세포인 MDAMB468을 RPMI1640(Gibco Life Science, Grand Island, NY)에서 배양한 후, Dharamcon(Lafayette, CO)에서 구입한 서열번호 4 내지 7의 Rad에 대한 siRNA(siRad) 및 서열번호 8의 대조군 siRNA(siControl)로 Amaxa 전기천공 시스템(Amaxa, Gaithersburg, MD)을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후에 트립판 블루 염색에 의해 생존 세포를 계수하고 siControl 대비 siRad에 의해 형질감염된 세포들에서의 백분율을 계산하였다.

도 1은 다양한 인간유래 암세포주에 대한 siRad의 영향을 보여준다. 도 1의 A에 따르면, siRad가 전립선암 세포인 DU145, LNCaP 및 PC3, 위암 세포인 SNU638과 SNU668 및 유방암 세포인 MDAMB468에서 증식을 정지시키고 세포의 형태 및 크기를 노화에 특징적인 표현형으로 변화시켰다. 도 1의 B는 PC-3의 증식에 대한 Rad 발현의 효과를 보여준다. 형질 감염 5일 후에 트립판 블루 염색에 의해 살아있는 세포의 수를 계수하고, 4회의 독립적인 실험에서 측정된 값을 평균±표준편차로 표시하였다. Rad 넉다운에 의한 암세포에서의 증식 억제는 기원 조직(tissue of origin), 종양 억제 단백질의 존재 또는 Rad의 내생 수준과 무관하게 일어났다.

siRad에 의해 형질감염된 세포들은 세포 노화에 특징적인 표현형을 보였고, Rad의 넉다운 후에 노화 관련 마커인 PAI-1, 오스테오넥틴 및 트랜스글루타미나아제가 모두 증가된 것으로 확인되었다. 이는 Rad 넉다운은 세포 주기 정지를 통해 조기 노화를 초래하고, 이에 의해 암세포의 증식을 감소시킨다는 것을 보여준다.

실시예 2. 암세포 증식에 대한 Rad 단백질 발현의 효과

Rad 단백질의 발현이 암세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해, 암세포를 Rad 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 Rad mRNA를 표적으로 하는 siRNA에 의해 형질감염시키고, 형질감염된 암세포의 콜로니 형성 능력, 텔로머라아제 활성, 항암제에 의한 암세포의 증식억제에 대한 효과 및 Rad 유전자의 넉다운의 효과를 조사하였다.

(1) 암세포의 형질감염

ATCC로부터 구입한 전립선암세포인 DU145, LNCaP, PC3, 위암세포인 SNU638, SNU688 및 유방암세포인 MDAMB468을 Amaxa 전기천공 시스템(Amaxa, Gaithersburg, MD)을 이용하여 각각 pCMVTaq4C(Invitrogen, Calsbad, CA), pCMVTaq4C_Rad, siControl 및 siRad를 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 형질감염시켜 대조군(Control)과 실험군(pRad 및 siRad)으로 준비하였다. 실험군의 pRad 및 siRad는 각각 Rad 과발현 및 Rad 넉다운의 효과를 조사하기 위해 제조하였다. siControl과 siRad는 각각 서열번호 8과 서열번호 4 내지 7의 서열을 갖는 siRNA이다(Dharmacon, Lafayette, US).

pCMVTaq4C_Rad는 정상 섬유아세포에서 분리된 Rad 유전자의 전장 개방 해독 프레임을 pCMVTaq4C(Invitrogen)에 클로닝시켜 제조하였다. 상기 Rad 유전자의 전장 개방 해독 프레임은 RNeasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정상 섬유아세포의 총 mRNA를 분리하고, 이로부터 MMLV(Molony Murine Leukemia Virus)의 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 제조하고, 상기 cDNA 및 서열번호 2 및 3의 프라이머를 이용한 PCR(94℃에서의 30초, 60℃에서의 30초 및 72℃에서의 30초로 구성된 사이클을 25회 수행함)의해 Rad 유전자의 전장 개방 해독 프레임을 증폭시켜 수득하였다.

(2) 암세포의 콜로니 형성 능력에 대한 Rad 단백질 발현의 효과

Rad 단백질 발현이 전립선암세포 PC-3의 콜로니 형성에 미치는 효과를 조사하였다. 상기 (1)에서 수립된 Rad 유전자를 포함하는 실험군 벡터 또는 대조군 벡터(Rad 유전자를 포함하지 않는 빈 벡터)를 안정적으로 발현하는 형질감염된 PC-3 세포들을 60-mm 디쉬에 디쉬당 1 X 10²개의 세포로 접종하고, 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1 mM NaCO₂, 2 mM L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에 2주 동안 연속 배양하였다. 2주 배양 후에, 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하고, 위상차 현미경 하에서 콜로니의 수를 계수하였다. 이 때, 콜로니는 50개 이상의 세포로 구성된 군으로 정의하였다. 결과가 도 2에 표시된다. 도 2의 상단은 위상차 현미경으로 관찰된 콜로니를 보여준다. Rad 유전자를 포함하는 벡터로 형질감염된 PC-3 세포들은 Rad 유전자의 발현-의존적 방식으로 증가된 콜로니 형성 능력을 보였다. 표시된 값들은 3회의 독립적인 실험의 평균값이다. 도 2의 하단은 안정적으로 형질감염된 PC-3 세포의 용해물을 대상으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 알려진 웨스턴 블롯팅 기법을 이용하여 확인된 Rad 단백질의 발현량을 보여준다. 웨스턴 블롯팅을 위해, 안정적으로 형질감염된 PC-3 세포를 프로테아제 억제제를 함유한 용해 완충액(20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 1 ㎍/ml 루펩틴, 1 ㎍/ml 아프로티닌, 2 mM Na₂VO₄ 및 5 mM NaF)에서 용해시켰다. 상기 세포 용해액을 12% SDS-PAGE에 의해 전개시키고 각각 Rad와 β-액틴에 대한 항체(Santa Cruz) 및 강화 화학발광 시스템(Amersham, Arlington Heights, IL)을 이용하여 분석하였다.

(3) 텔로머라아제 활성에 대한 Rad 단백질 발현의 효과

텔로머라아제는 성장-조절 유전자의 발현을 조절하고 세포 증식을 증진하여 노화 및 암의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다(Smith LL. et al., Nat Cell Biol 2003;5:474-9). Rad의 이소성 발현(ectotic expression)이 텔로머라아제 활성에 영향을 미치는 지 여부를 조사하기 위해, 상기 (1)에서 수립된 Rad를 안정적으로 과발현하는 PC-3 클론 및 Rad를 포함하지 않는 빈 벡터로 형질감염된 대조군 클론을 대상으로 텔로머라아제 활성을 측정하였다. 40 POD(Population Doubling)에서 세포들을 회수하고, Telo TAGGG Telomerase ELISA kit(Roche, Manhein, Germany) 를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 TRAP(Telomere Repeat Amplification Protocol)을 수행하였다. 25℃에서 30분 동안 텔로머라아제 신장 반응을 수행하고 키트에서 제공된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(94℃에서의 30초, 50℃에서의 30초 및 72℃에서의 30초로 구성된 사이클을 30회 수행함). 텔로머라아제의 활성은 Rad-과발현 세포에서 대조군 세포에 비해 유의성 있게, 투여량-의존적으로 높았고, 또한, siRad에 의한 형질감염에 의해 투여량-의존적으로 억제될 수 있었다. 이 결과는 Rad가 PC-3 세포에서 텔로머라아제의 활성을 투여량 의존적으로 조절할 수 있다는 것을 보여준다.

(4) 암세포의 증식에 대한 독소루비신과 Rad 단백질 발현의 효과

독소루비신은 다양한 고형암을 치료하기 위해 빈번하게 이용되는 안트라사이클린계 항암제로서, 토포이소머라아제(topoisomerase) II를 억제한다. 소량의 독소 루비신으로 인간 유래 암세포를 5일간 처리한 경우, DNA-유도 조기 노화(DNA damage-induced premature senescence)가 관찰된 것으로 보고되었다(Chang BD, et al., Cancer Res 1999;50:3761-7).

Rad 단백질 발현의 세포 노화에 대한 효과를 조사하기 위해, Rad 단백질을 과발현하는 세포에 세포 노화를 유도하는 것으로 알려진 독소루비신을 처리하여 Rad 단백질의 과발현과 독소루비신의 처리에 의한 암세포 증식에 대한 효과를 조사하였다.

상기 (1)과 같이, Rad 유전자를 벡터 pCMVTaq4C(Invitrogen)에 클로닝하여 제조된 Rad 유전자 발현 벡터, pCMVTaq4C_Rad(2 mg) 또는 대조군 벡터 pCMVTaq4C(2 mg)를 2 X 10⁶개 PC-3 세포에 형질감염시키고, 세포 배양 디쉬에 플레이팅하고 1일 동안 10% FBS, 1 mM NaCO₂, 2 mM L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 10 nM 독소루비신으로 5일 동안 처리하고, 노화 유도 여부를 확인하기 위해 SA-β-Gal(Senescence-Associated β-Galactosidase) 활성을 평가하였다. 이를 위해, 세포들을 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드에서 10분간 고정시키고 37℃에서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드(1 mg/ml)를 용해시킨, 40 mM 시트르산(pH 6.5), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM NaCl, 및 2 mM MgCl₂를 포함하는 용액에 12시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 후에, 위상차 현미경으로 세포들을 촬영하였다.

도 3A 및 3B는 PC-3 세포의 증식에 대한 독소루비신 및 Rad 단백질 과발현의 효과를 도시한다. 독소루비신을 단독으로 처리한 경우, 세포 증식이 대조군 대비 현저하게 억제되나, 형질감염에 의해 Rad의 발현을 증가시킨 세포에 독소루비신을 처리한 경우에는 독소루비신에 의한 세포의 증식 억제가 독소루비신의 단독 처리 경우보다 낮았다. 이 결과는 Rad 단백질의 과발현이 독소루비신으로 처리된 PC-3 암세포에서 세포 주기 정지 및 조기 노화의 유도를 억제한다는 것을 보여준다.

(5) siRNA에 의한 Rad 단백질 발현 억제의 암세포 증식에 대한 효과

siRNA에 의한 Rad 단백질의 발현 억제가 암세포의 증식에 대해 갖는 효과를 조사하였다.

(5-1) RT-PCR(Reverse Trasncriptase-Polymerase Chain Reaction)

RT-PCR을 통해 서열번호 4 내지 7의 Rad 유전자에 대한 siRNA(이하, siRad라 함)(Dharmacon, Lafayette, US))에 의해 유도된 Rad 유전자의 넉다운 효과를 확인하였다. 상기 (1)에 기재된 바와 같이, PC-3 세포를 siRad로 형질감염시키고 24시간 후에 RT-PCR에 의해 PC-3 세포에서의 Rad 발현을 조사하였다. 배양된 형질감염 PC-3 세포를 회수한 후, RNeasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 총 mRNA를 분리하고, 이로부터 MMLV(Molony Murine Leukemia Virus)의 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 제조하고, 상기 cDNA 및 서열번호 2 및 3의 프라이머를 이용한 PCR(94℃에서의 30초, 60℃에서의 30초 및 72℃에서의 30초로 구성된 사이클을 25 회 수행함)을 수행하였다.

도 4A는 siRNA(100 nM)로 형질감염된 암세포에서 24시간 배양 후 RT-PCR에 의해 확인된 Rad 유전자의 넉다운을 보여준다.

(5-2) 트립판 블루 염색에 의한 생존 세포 분석

도 4B는 PC-3 세포의 증식에 대한 siRad의 효과를 보여준다. PC-3 세포를 상기 (1)에 기재된 바와 같이, siControl (50nM), PBS 또는 siRad(50nM)로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에 트립판 블루로 염색하여 생존 세포의 백분율을 측정하였다.

siRad에 의해 Rad 유전자를 넉다운시킨 경우, 세포의 생존율은 대조군 siRNA에 의해 형질감염시키거나 또는 PBS에 의해 가상-형질감염(mock-transfection)시킨 세포에 비해 약 30% 수준으로 현저하게 감소되었다. 이는 Rad 유전자의 넉다운에 의한 암세포의 증식 억제 가능성을 보여준다.

(5-3) SA-β-Gal(Senescence-Associated β-Galactosidase) 테스트

도 4C는 siRad에 의한 전립선암 세포주(PC-3)의 증식 억제에 대한 Rad 과발현의 효과를 보여준다. -는 siControl로 형질감염된 음성 대조군, siRRAD는 siRad로 형질감염된 실험군, siRRAD+pRRAD는 siRad 및 Rad 유전자 발현 벡터(pRRAD)로 동시에 형질감염된 실험군을 나타낸다.

상기 (1)에 기재된 바와 같이, siControl, siRad 또는 siRad 및 Rad 유전자 를 벡터 pCMVTaq4C(Invitrogen)에 클로닝하여 제조된 Rad 유전자 발현 벡터, pCMVTaq4C_Rad(pRRAD: 2 mg)를 각각 PC-3 세포에 형질감염시키고, 3일 후에, 형질감염된 세포들을 대상으로 SA-β-Gal 활성을 측정하였다.

SiRad 및 pRRAD에 의해 동시에 형질감염된 암세포들은 세포 노화를 나타내는 SA-β-Gal 양성 세포의 비율이 siRad에 의해 형질감염된 세포 대비 20% 수준으로 낮았다. 즉, Rad의 과발현이 siRad에 의해 유도된 세포 증식 억제를 구제한다는 것을 보여준다.

실시예 3. Rad 단백질 억제에 의한 암 치료

(1) Rad 단백질 발현 억제의 효과

누드 마우스를 이용하여 siRad 처리에 의한 인 비보 종양 형성 및 확립된 종양에 대한 효과를 조사하였다.

1.5 X 10⁶ 개의 PC-3 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이, 대조군 siRNA(siControl) 또는 Rad에 대한 siRNA(siRad)로 형질감염시키고, 4주령의 암컷 무흉선 nu/nu 마우스(BALC/cnu/nu, Charles River Lab., Atsugi, Japan)의 측복부에 피하 이식시켰다. 각 군당 10 마리의 마우스를 이용하였다. 절제 직후 각 군을 대표하는 전체 종양에 대한 결과가 도 5A에 도시된다.

한편, 이미 확립된 종양을 갖는 암컷 무흉선 nu/nu 마우스에 PC-3 세포를 이식한 후, 서열번호 4 내지 7의 siRad 또는 서열번호 8의 대조군 siRNA(Dharmacon, Lafayett, US)를 2회 주사하였다. siRad는 100 ㎕의 에펙텐(Effectene)에 담긴 siRad 100 nM의 혼합물로 투여하였다. 각 군은 10마리의 마우스로 구성되었다.

도 5A는 이식된 세포에 의해 형성된 종양 크기에 대한 siRNA 처리의 효과를 보여준다. siRad가 투여된 마우스의 경우, 대조군 대비 형성된 종양의 크기가 작았다. 도 5B는 확립된 종양의 성장에 대한 siRad 주사의 효과를 보여준다. siRad를 주사한 마우스에서는 이미 확립된 종양의 크기가 대조군 대비 크게 감소되었다.

이와 같은 결과는 Rad 단백질 억제제가 종양의 형성을 억제하거나 또는 이미 확립된 종양의 크기를 감소시키는 효과를 가지며, 따라서, 암의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 보여준다.

(2)Rad 단백질 억제제와 항암제의 병용 투여

독소루비신 또는 벨케이드와 같은 항암제와 Rad 단백질의 억제가 암세포 증식의 억제에 대해 상승적 효과를 가져오는지를 확인하기 위해, 독소루비신 또는 벨케이드와 Rad에 대한 siRNA를 전립선암 세포인 PC-3 세포에 병용 투여하였다.

PC-3 세포를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, siControl (50nM), PBS(Phosphate Buffered Saline) 또는 siRad(50nM)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 세포 배양 디쉬에 플레이팅하고 2일 동안 10% FBS, 1 mM NaCO₂, 2 mM L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 대상으로 독소루비신 또는 벨케이드에 대한 IC₅₀ 을 분석하였다. IC₅₀은 암세포의 50%를 사멸시키기 위해 요구되는 농도로서, 그 값이 작을수록 암세포의 증식 억제 효과가 크다는 것을 나타낸다. 도 6의 A와 B는 각각 siRad와 독소루비신 또는 벨케이드가 함께 처리된 암세포의 경우, 대조군 대비 항암제에 대한 IC₅₀이 현저하게 감소된 것을 보여준다. 이 결과는 siRad에 의해 Rad 단백질의 발현이 억제된 암세포에서는 독소루비신이나 벨케이드와 같은 항암제에 대한 민감도가 증가되어 항암제 단독 처리에 비해 암세포의 증식 억제 효과가 상승적으로 증가되므로, 독소루비신이나 벨케이드와 같은 항암제와 Rad 억제제의 병용 투여는 상승된 암 치료효과를 가져올 수 있다는 가능성을 보여준다.

도 1은 다양한 인간 유래 암세포주에 대한 siRad의 영향을 보여준다. A. siRad는 다양한 암세포(전립선암 세포인 PC3, DU145, 및 LNCaP, 위암 세포인 SNU638 및 SNU668과 유방암 세포인 MDA-MB468)에서 성장 정지를 유도하였다. siControl 또는 siRad로 각 세포주를 형질감염시키고 5일 후에 SA-β-Gal 활성을 분석하였다. B. 다양한 암세포주의 성장에 대한 siRad의 효과. 세포들을 siRad 또는 siControl로 형질감염시키고, 5일 후에 트립판 블루 염색에 의해 생존 세포를 계수하였다. 표시된 값은 siControl에 의해 형질감염된 세포 대비 siRad에 의해 형질감염된 세포의 백분율로서, 4회의 독립적인 실험에 대한 평균±표준편차(막대 위의 선)이다.

도 2는 Rad가 PC-3 세포의 장기적인 콜로니 형성을 증진시켰다는 것을 보여준다. 안정된 PC-3 세포 클론(Rad 및 벡터에 의해 형질감염된 세포 클론)을 40 POD(Polulation Doubling)에 회수하였다. 동일한 수의 세포를 60 mm 디쉬에 플레이팅하고 2주의 연속 배양 후에 콜로니-형성 능력을 평가하였다. 안정된 PC-3 세포로부터의 세포 용해물을 대상으로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 Rad 발현을 분석하였다. 표시된 값은 3회의 독립적인 실험의 평균값이다.

도 3은 Rad 단백질의 발현을 통한 세포 생존의 조절을 보여준다. A. Rad 단백질 발현 벡터(pFlag-RAD) 또는 대조군 벡터(vector)로 PC-3 세포를 형질감염시키고 세포 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 다음 날, 상기 세포들에 독소루비신(10 nM)을 처리하고 5일간 배양한 후 SA-β Gal의 활성을 측정하였다. B. PC-3 세포의 증 식에 대한 Rad 발현의 효과를 반영하는 상대적인 세포 계수. Rad- 또는 벡터로 형질감염된 세포들을 형질감염 후 다음 날에 10 nM 독소루비신으로 처리하고 4일차에 세포들을 계수하였다.

도 4는 Rad 단백질의 발현 감소에 따른 암세포의 증식 억제를 보여준다. A. siRNA-매개 Rad의 넉다운: siRad에 의해 PC-3 세포를 형질감염시키고 24시간 후에 RT-PCR에 의해 PC-3 세포에서 Rad의 발현을 조사하였다. B. PC-3 세포의 성장에 대한 siRad의 효과. siRad-, siControl-에 의해 형질감염되거나 또는 PBS에 의해 가상 형질감염(mock-transfection)된 PC-3 세포를 형질감염 3일 후에 트립판 블루 염색에 의해 분석하였다. C. Rad의 과발현에 의한 siRad-유도 세포 증식 억제의 구제. SA-β-Gal 양성 염색에 의해 siRad의 과발현에 의한 siRad-유도 세포 증식 억제의 구제 효과를 확인하였다.

도 5는 Rad 단백질에 의한 인 비보 종양형성/성장의 조절을 보여준다. A: Rad 넉다운에 의한 종양 성장의 억제(siControl과 siRad 이종이식편을 비교하는 t-검정에 대해, P= 0.0131). B. 이미 확립된 종양의 성장에 대한 siRad 주사의 효과. PC3 세포의 주사 후 2회(1일차 및 7일차) siRad 또는 siControl을 투여하였다. SiRad는 각 주사당 100㎕의 에펙텐(Effectene)에 담긴 siRad(50 nM)의 혼합물로 투여하였다. 각 그룹당 10마리의 마우스를 이용하였다. (siControl과 siRad 이종이식편을 비교하는 t-검정에 대해, P= 0.0066; 막대 위의 선은 표준편차를 나타냄).

도 6은 Rad 억제제와 항암제의 병용 투여 효과를 보여준다. A. siRad와 독소루비신의 병용 투여시 상승효과. siRad-, siControl-에 의해 형질감염되거나 또는 PBS에 의해 가상 형질감염(mock-transfection)된 PC-3 세포를 대상으로 형질감염 2일 후에 독소루비신에 대한 IC₅₀ (전체 세포의 1/2이 생존하는 농도)를 분석하였다. B. siRad와 벨케이드의 병용 투여시 상승효과. siRad-, siControl-에 의해 형질감염되거나 또는 PBS에 의해 가상 형질감염된 PC-3 세포를 대상으로 형질감염 2일 후에 벨케이드에 대한 IC₅₀ 를 분석하였다.

<110> Samsung Medical Center <120> Composition comprising Rad protein inhibitor for cancer treatment <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 308 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(308) <223> Ras-associated diabetes(Rad) <400> 1 Met Thr Leu Asn Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ser Arg Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gln Glu Arg Glu Arg Arg Arg Gly Ser Thr Pro Trp Gly Pro Ala 20 25 30 Pro Pro Leu His Arg Arg Ser Met Pro Val Asp Glu Arg Asp Leu Gln 35 40 45 Ala Ala Leu Thr Pro Gly Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly 50 55 60 Thr Gln Gly Pro Arg Leu Asp Trp Pro Glu Asp Ser Glu Asp Ser Leu 65 70 75 80 Ser Ser Gly Gly Ser Asp Ser Asp Glu Ser Val Tyr Lys Val Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Ala Pro Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Ala Arg Ile Phe Gly 100 105 110 Gly Val Glu Asp Gly Pro Glu Ala Glu Ala Ala Gly His Thr Tyr Asp 115 120 125 Arg Ser Ile Val Val Asp Gly Glu Glu Ala Ser Leu Met Val Tyr Asp 130 135 140 Ile Trp Glu Gln Asp Gly Gly Arg Trp Leu Pro Gly His Cys Met Ala 145 150 155 160 Met Gly Asp Ala Tyr Val Ile Val Tyr Ser Val Thr Asp Lys Gly Ser 165 170 175 Phe Glu Lys Ala Ser Glu Leu Arg Val Gln Leu Arg Arg Ala Arg Gln 180 185 190 Thr Asp Asp Val Pro Ile Ile Leu Val Gly Asn Lys Ser Asp Leu Val 195 200 205 Arg Ser Arg Glu Val Ser Val Asp Glu Gly Arg Ala Cys Ala Val Val 210 215 220 Phe Asp Cys Lys Phe Ile Glu Thr Ser Ala Ala Leu His His Asn Val 225 230 235 240 Gln Ala Leu Phe Glu Gly Val Val Arg Gln Ile Arg Leu Arg Arg Asp 245 250 255 Ser Lys Glu Ala Asn Ala Arg Arg Gln Ala Gly Thr Arg Arg Arg Glu 260 265 270 Ser Leu Gly Lys Lys Ala Lys Arg Phe Leu Gly Arg Ile Val Ala Arg 275 280 285 Asn Ser Arg Lys Met Ala Phe Arg Ala Lys Ser Lys Ser Cys His Asp 290 295 300 Leu Ser Val Leu 305 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of Rad cDNA <400> 2 cattgtgtac tcagtgacgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of Rad cDNA <400> 3 gacctagaga accgagaggt 20 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rad siRNA <400> 4 gcaaguucau ugagacauc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rad siRNA <400> 5 cagcagggca caccuauga 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rad siRNA <400> 6 ggacggagaa gaggcauca 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rad siRNA <400> 7 gcucguaaca gccgcaaga 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control siRNA <400> 8 uaaggcuaug aagagauac 19

Claims (13)

1. Rad(Ras associated with diabetes) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 Rad 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 암 치료용 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Rad 단백질의 발현을 억제하는 물질은 Rad 단백질을 코딩하는 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA) 및 shRNA(small hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 암 치료용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 4 내지 7로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진 것인 암 치료용 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Rad 단백질의 활성을 억제하는 물질은 Rad 단백질의 활성을 특이적으로 억제하는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체인 것인 암 치료용 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 전립선암 및 혈액암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 암 치료용 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 상기 유효성분과 상승적으로 작용하는 항암제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신 또는 벨케이드인 것인 암 치료용 조성물.
9. Rad 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계, 및

   상기 세포에서 Rad 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, Rad 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어지는 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 발현량의 측정은 Rad 유전자의 mRNA 또는 Rad 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
12. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 측정된 Rad 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 감소되게 하는 시험 물질을 Rad 단백질의 억제제로 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 대조군은 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계를 제외하고는 동일한 조건으로 처리된 세포인 것인 방법.

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