JP5651331B2 - 結腸直腸癌の治療におけるプロガストリン阻害剤 - Google Patents
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Description
ガストリンは古典的な腸のペプチドホルモンであり、元々は胃酸分泌の刺激物質として同定された。ガストリンは、主に胃幽門洞のG細胞によって産生され、種々の程度で小腸上部に、また、はるかに少量が結腸および膵臓に産生される。最近数年にわたり、結腸直腸発癌におけるペプチドのガストリンファミリーの役割に対する関心が増大している。特に、以前は不活性であると考えられていたガストリンの前駆形態(プロガストリンおよびグリシン伸長ガストリン)が、結腸直腸癌の発現にある役割を果たしている証拠が蓄積している(上記の解説を参照)。ガストリンは種々の分子形態で見出される。ヒトCOOH末端アミド化ガストリン、G17およびG34は、101-アミノ酸前駆体分子であるプレプロガストリンから翻訳後修飾によって生じる。プレプロガストリンは、小胞体へと同時翻訳的に転座し、そこでシグナルペプチドが迅速に開裂して、プロガストリンが生じる。プロガストリンは引き続き、プロホルモンのコンバターゼおよびカルボキシペプチダーゼEにより開裂して、COOH末端グリシン残基を有するペプチド、すなわち、G34-Glyが生じ、さらに開裂してペプチドG17-Glyが生じる。G34-Glyは、ペプチジルアルファアミド化モノオキシゲナーゼにより、COOH末端アミド化ペプチドG34へと変換することができ、同様に開裂してG17が生じ得る。G17またはGアミドは、ガストリンの主な洞性形態であり、非アミド化前駆体(プロガストリン、グリシン伸長ガストリン)は、ヒトにおける全分泌ペプチドの10%未満を一般に含む。しかし、処理過程が損なわれている一定の臨床状況においては、より高い割合の非アミド化ガストリンが分泌される。例えば、上記の結腸直腸癌に罹っている一部の患者では、プロガストリンの組織中濃度および血漿中濃度が上昇する(Ciccotostoら、1995年;Konturekら、2002年;Siddheshwarら、2001年;Van Solingeら、1993年)。
siRNA hPG:
センス:5'-GAAGAAGCCUAUGGAUGGATT-3'(配列番号27)
アンチセンス:5'-UCCAUCCAUAGGCUUCUUCTT-3'(配列番号28)
siRNA mPG:
センス:5'-GAAGAGGCCUACGGAUGGTT-3'(配列番号29)
アンチセンス:5'-CCAUCCGUAGGCCUCUUCTT-3'(配列番号30)
クローン細胞におけるプロガストリンの発現を下方制御することができるshRNAの例は、以下の配列の1つを含む核酸分子である:
shRNA hPG:
センス:5'GAAGAAGCCTATGGATGGATTCAAGAGAAGGTAGGTATCCGAAGAAGTTTTTT3'(配列番号1)
アンチセンス:5'AATTAAAAAACTTCTTCGGATACCTACCTTCTCTTGAATCCATCCATAGGCTTCTTCGGCC3'(配列番号2)。
本発明の一実施形態において、該抗体またはその生物学的活性断片もしくは誘導体は、プロガストリンのCOOH末端の10アミノ酸残基またはプロガストリンのCOOH末端の15アミノ酸残基に結合する。プロガストリンのCOOH末端の10アミノ酸残基の例は、FGRRSAEDEN(配列番号31)である。代替の一実施形態において、該抗体またはその生物学的活性断片もしくはその誘導体は、プロガストリンのNH2末端の40アミノ酸残基に結合する。一般的に、該抗体またはその生物学的活性断片もしくはその誘導体は、SWKPRSQQPDAPLGT(配列番号32)に結合し得る。これらのアミノ酸配列は、ガストリン形態G17、G17-gly、G34およびG34-Glyに存在しないため、プロガストリンに特異的である。
本発明の一実施形態は、プロガストリンのCOOH末端の15アミノ酸残基、またはプロガストリンのNH2末端の40アミノ酸残基に結合する抗体またはその生物学的活性断片もしくは誘導体を含む医薬に関する。
a)ベータカテニン/Tcf-4媒介転写経路が構成的に活性であるプロガストリン分泌細胞を提供する工程と、
b)スクリーニングする化合物を加える工程と、
c)ICAT発現を誘導する化合物を選択する工程と
を含む方法が提供される。
a)プロガストリン感受性細胞を提供する工程と、
b)該細胞を含有する培地に、プロガストリンを加える工程と、
c)スクリーニングする化合物を加える工程と、
d)ICAT発現を誘導する化合物を選択する工程と
を含む方法が提供される。
以下の説明において、詳細なプロトコルが提供されていないすべての分子生物学の実験は、標準的プロトコルに従って実施される。
背景および目的:β-カテニン/Tcf-4転写複合体の異常な活性化は、結腸クリプトにおける分化から増殖へバランス移動する結腸直腸発癌に関する初期事象となる。ここで、本発明者らは、この複合体の標的遺伝子にコードされる内因性プロガストリンが、次いで、APC変異細胞におけるβ-カテニン/Tcf-4活性を調節できるかどうかを評価し、インビボで腸の腫瘍増殖に及ぼす局所のプロガストリン欠失の影響を分析した。
プロガストリンを過剰発現するが、アミド化またはグリシン伸長ガストリンは過剰発現しないヒト腫瘍細胞およびヘテロ接合Apc変異(APCΔ14)を有するマウスにおいて、GAST遺伝子の安定なまたは一時的なRNAサイレンシングを導入した。
内因性プロガストリン産生の欠失は、腫瘍細胞において、構成的β-カテニン/Tcf-4活性の著しい阻害により、インビボでの腸の腫瘍増殖を大きく低下させる。この作用は、プロガストリン欠失細胞におけるインテグリン結合キナーゼ(ILK)の下方制御に起因するβ-カテニンおよびTcf-4の阻害物質(ICAT)のデノボ発現により媒介された。したがって、ICATの下方制御は、ヒト結腸直腸腫瘍におけるプロガストリンの過剰発現およびTcf-4標的遺伝子の活性化に関連しており、ICAT抑制は、腫瘍傾向性のプロガストリン過剰発現マウスの結腸上皮に検出された。APCΔ14マウスにおいて、siRNAに媒介されたプロガストリン欠失により、腸腫瘍のサイズおよび数が減少しただけでなく、残留腺腫におけるゴブレット系分化および細胞アポトーシスが増加した。
したがって、内因性プロガストリンの欠失は、ICAT発現を促進し、それによってTcf-4活性に対抗することにより、インビボでAPC変異CRC細胞の腫瘍形成を阻害する。プロガストリン標的化方法は、結腸直腸癌の分化療法に関して、大いに有望な見通しを提供するはずである。
腫瘍細胞の分化誘導によって腫瘍の発達を減少させることを目指す種々の方法が近年開発されており、動物モデルおよびヒト患者においてきわめて有望な結果を提供している。特に、全トランスレチン酸の使用は、急性前骨髄球性白血病の治療にきわめて有用であることが実証されており(Lallemand-Breitenbachら、2005年;WangおよびChen、2000年)、進行した甲状腺癌において腫瘍分化させる有望な方法と考えられている(Coelhoら、2005年)。腸においては、細胞の増殖と分化の制御に関与する2つの主要な経路、すなわち、NotchカスケードおよびWnt/β-カテニン/Tcf-4経路を調節する薬剤に対して、大きな希望が寄せられている(RadtkeおよびClevers、2005年;van EsおよびClevers、2005年)。
プロガストリン欠失は、インビボで、APC変異により誘導された腫瘍増殖を反転させる。
既存腫瘍における内因性プロガストリンの選択的標的化を目指す方法が、インビボで、Tcf-4に促進された腫瘍増殖に拮抗することができるかどうかを評価するために、結腸直腸細胞系SW480からのBalbc/ヌードマウス異種移植(Morinら、1997年)、ならびに自然発生腸腫瘍形成のマウスモデル、APCΔ14(Colnotら、2004年)を用いた。大多数のヒト結腸直腸腫瘍に見られる(Korinekら、1997年)のと同様に、これら2種の実験モデルは、APCの変異を有し、その結果、β-カテニン/Tcf-4経路の構成的活性化を示す。
プロガストリン標的化により、2つの異なるAPC変異腸腫瘍モデルにおける腫瘍増殖が抑制されたことを示したので、この効果が、APC変異によって構成的に活性化されることが知られているβ-カテニン/Tcf-4転写複合体の活性レベルを調節するプロガストリンの能力によるものであったと本発明者らは仮定した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写によって定量化されたこの活性(TOP/FOP)(Korinekら、1997年)は、対照細胞(SW480/βgal(-))において実際に上昇したが、プロガストリン欠失クローン(図2A)においては、β-カテニンまたはTcf-4レベルの検出可能な調節なしで(図S2)、有意に阻害された。同様な結果が以前に確立された(Hollandeら、2003年)アンチセンスGAST cDNAを発現するDLD-1細胞において得られた(図S2)。5nMの組換えプロガストリン、また、SW480/GAST(-)クローンにおけるコドン最適化したshRNA非感受性プレプロガストリン構築体の発現によって産生された内因性プロガストリンによる処理によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の高レベルの転写回復が見られ、プロガストリンがこの転写経路を刺激する能力があることが確認された(図2A)。また、SW480/GAST(-)細胞におけるTcf-4および脱リン酸化β-カテニンの核量の顕著な減少および5nMの組換えプロガストリンによるこれらの細胞の処理に関連したβ-カテニン/Tcf-4活性の減少によって、β-カテニンおよびTcf-4の核区画化が部分的に回復することが、免疫蛍光染色により示された(図2B)。同様に、いくつかのTcf-4標的遺伝子(c-myc、サイクリンD1、Sox-9およびクローディン-1)(Blacheら、2004年;van de Weteringら、2002年)の発現が、プロガストリン欠失後に強く下方制御され、プロガストリンの再発現または組換えペプチドによる処理により有意に刺激された(図2CおよびS3)。対照的に、アミド化またはグリシン伸長ガストリン17またはアミド化ガストリン(CCK-B)受容体アンタゴニストL365、260による処理は、これらの細胞におけるβ-カテニン/Tcf-4活性に影響を与えることはなく(図S2)、ガストリンの短い処理形態は、これらの細胞におけるプロガストリンによるβ-カテニン/Tcf-4活性の調節を模することができないことが示されている。
使用されるCRC細胞におけるAPC遺伝子の変異状態から考えて、また、Tcf-4およびβ-カテニンの核区画化がプロガストリン欠失細胞において有意に変化すること(図2A)から、β-カテニン/Tcf-4活性の減少は、β-カテニンとそのもう一方のパートナーとの相互作用の増加に起因し得ると本発明者らは仮定した。これらのパートナーの1つ、ICAT(β-カテニンおよびTcf-4の阻害物質)は、これら2種のタンパク質間結合の直接的阻害物質として最近同定され(Tagoら、2000年)、DLD-1細胞およびSW480細胞において過剰発現された場合、増殖減少および細胞死増加の原因である(Sekiyaら、2002年)。プロガストリンの欠失により、SW480/GAST(-)細胞におけるICATのmRNAおよびタンパク質の強力な発現が誘導された(図3AおよびB)が、β-カテニンのもう一方の結合パートナーであるE-カドヘリンの発現は影響を受けなかった(データは示していない)。shRNA非感受性プレプロガストリンcDNAの再発現(図3AおよびB)により、ならびに5nMの組換えプロガストリンによる処理後(データは示していない)、ICATのデノボ抑制が誘導された。
結腸の腫瘍形成におけるβ-カテニン/Tcf-4転写活性の構成的活性化によって果たされる必須の役割から考えて、また、プロガストリン欠失腫瘍細胞において、ICATの再発現がTcf-4媒介転写減少の原因であることを本発明者らの結果が示したことから、本発明者らはさらに、プロガストリンの腫瘍促進活性の必須要素としてのICAT抑制の役割を、インビトロおよびインビボで調べた。
プロガストリンは最近、腸細胞におけるホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3k)経路を活性化することがインビトロで(Hollandeら、2003年)、およびインビボで(Ferrandら、2005年)示されているため、この酵素の活性化が、SW480細胞におけるプロガストリンに誘導されたICAT抑制およびβ-カテニン/Tcf-4活性の刺激にとって必要であるかどうかを本発明者らは判定した。まず、選択的PI3k阻害物質LY294002とSW480/β-Gal(-)細胞のインキュベーションが、ICATの発現誘導に(図7A)、およびβ-カテニン/Tcf-4転写活性の減少に(図S7)十分であること(図7A)を本発明者らは見出し、これら2つの経路間の以前不明であった関連性を解明した。対照的に、10μMのPP2または1μMのPD98059をそれぞれ用いた、Src経路またはERK1/2経路の薬理学的阻害によって、ICAT発現またはβ-カテニン/Tcf-4活性は影響を受けなかった(データは示していない)。また、LY294002は、組換えプロガストリンによるSW480/GAST(-)クローンの処理によって誘導されたICATの下方制御を無効にし(図7A)、PI3kの活性化がプロガストリンによるICATの抑制にとって必須であることを示した。したがって、PI3kの下流標的であるAkt/PKBのセリン473-リン酸化は、プロガストリン欠失SW480/GAST(-)細胞において著しく減少したが、5nMの組換えプロガストリンとのインキュベーション後に復活した(図7A)。
Wnt/β-カテニン/Tcf-4経路は腸クリプト下部における細胞の幹/前駆表現型の維持にとって重要であると考えられ、また、細胞の増殖と分化との間の分子スイッチとして広く認められている(RadtkeおよびClevers、2005年;van de Weteringら、2002年)ため、次に本発明者らは、プロガストリン欠失CRC細胞におけるその下方制御が、これらの細胞を分化へと駆動できたかどうかを判定した。
本研究から、プロガストリン産生のブロックにより、ヒトCRC細胞における「構成的」ベータカテニン/Tcf-4転写活性が有意に阻害され、インビトロでのそれらのアンカー非依存性増殖ならびにヌードマウスにおけるそれらの腫瘍形成能力が減少し、それらの分化およびアポトーシスが促進されることが実証される。プロガストリンの欠失により、元はアフリカツメガエルにおいて同定され、ベータカテニンとTcf-4との相互作用を阻害することが示されていた小型ペプチドである「ベータカテニンおよびTcf-4の阻害物質」(ICAT)の再発現がもたらされた(GottardiおよびGumbiner、2004年;Tagoら、2000年)。また、組換えプロガストリンによる処理により、GAS遺伝子発現のスイッチが先に切られていた細胞において、ICATが下方制御され、ベータカテニン/Tcf-4活性が増加したことから、慢性的なプロガストリン分泌が、CRC細胞系におけるこの経路に関する高い活性化レベルの維持に関与していることが確認された。慢性的なプロガストリン分泌とICAT抑制との間の本明細書において解明された関連の生理学的関係性が、CRCを有する16名の患者群における結腸直腸腫瘍内のこれら2つの事象間の緊密な関連性を示す結果により、また、腫瘍になりやすいプロガストリン過剰発現マウスの結腸上皮においてICAT発現が下方制御された実証(Cobbら、2004年)により、インビボで強調された。
細胞および細胞培養条件
結腸直腸癌細胞系DLD1およびSW480を、10%のウシ胎仔血清(Eurobio、フランス国、Les Ulis)、1%のL-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中、37℃で維持した。
以下の一次抗体を用いた:マウス抗脱リン酸化ベータカテニン(クローン8E4;AG.Scientific)、マウス抗ベータカテニンおよび抗Eカドヘリン(Transduction Laboratories)、ヤギ抗Tcf-4(Santa Cruz Biotechnology)、ウサギ抗ICAT(C.Gottardi博士より恵与;(GottardiおよびGumbiner、2004年))、ポリクローナル抗PTEN(Upstate)、ウサギ抗ホスホセリン(Zymed)、ウェスタンブロット用(Cell Signaling)および免疫沈降用(Upstate)ウサギ抗ILK、マウス抗インテグリンβ1(Chemicon)、ウサギ抗Akt、抗Ser473リン酸化Akt、抗活性化カスパーゼ3(Cell Signaling)、抗Muc2モノクローナル抗体(Neomarkers)。
フランス政府の法令および地域委員会の指針に従って切除後、16名の患者からの結腸腫瘍および組織学的に正常な上皮(該腫瘍から有意な距離において採取)の検体を、病理学者から得られた。患者全員からインフォームドコンセントを得た。組織サンプルは、さらなる使用まで液体窒素中に保存した。
液体窒素凍結腫瘍サンプルから組織切片を調製し、ヘマトキシリン/エオシン染色を行って、それらの品質、組織内の方向、および上皮含量を評価した。ベータカテニン、Tcf-4、c-mycおよびICATの免疫蛍光検出を、顕微切開に用いた切片に隣接した切片に対して実施した。Arcturus(Alphelys、フランス国、Plaisir)のPixCell(登録商標)IIe顕微切開器を用いて、1サンプル当たり、4切片から6切片に対して、レーザー捕捉顕微切開(LCM)を実施した。以下のレーザービーム設定を用いた:265mV、45mWh、直径15μm、18ms。次いで、顕微切開した組織を直接RNA溶解緩衝液中に採取し、RNAeasy Microkit(Qiagen、フランス国、Courtaboeuf)を用い、製造元の使用説明書に従ってRNAを調製した。回収したRNAの品質および量をRNA pico Labchips(Agilent Technologies、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて評価した。
DLD1細胞系へのガストリン遺伝子アンチセンスおよび対照cDNAのトランスフェクションは、(Hollandeら、2003年)に記載されている。プロガストリンshRNAを作出するために、以下のオリゴヌクレオチドをpサイレンサーベクター(Ambion)内にクローン化し、SW480細胞にトランスフェクトした:センス:5'-GAAGAAGCCTATGGATGGATTCAAGAGAAGGTAGGTATCCGAAGAAGTTTTTT-3'(配列番号1)およびアンチセンス:5'-AATTAAAAAACTTCTTCGGATACCTACCTTCTCTTGAATCCATCCATAGGCTTCTTCGGCC3'(配列番号2)。対照shRNAの作出に用いられたβガラクトシダーゼオリゴヌクレオチドは:センス:5'GATCCCAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTCAAGAGAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTTTTTTGGAAA3'(配列番号3);アンチセンス:5'AGCTTTTCCAAAAAAAGGCCAGACGCCAATTATTTTCTCTTGAAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTGG3'(配列番号4)。5×104細胞/ウェルを接種し、24時間後、500ngのpサイレンサー/プロガストリン-shRNAまたはpサイレンサー/βガラクトシダーゼ-shRNA、50ngのpCDNA-3、および5μl/ウェルのExgen500(Euromedex)をトランスフェクトした。選択はネオマイシン(500ng/μl)により行った。SW480/GAS(-)細胞におけるICATまたはルシフェラーゼshRNAのレトロウイルス媒介トランスフェクション。ICATに関するshRNAオリゴヌクレオチド(センス5'GATCCGGATGGGATCAAACCTGACATTTTCAAGAGAAATGTCAGGTTTGATCCCATCTTTTTTG3'(配列番号5)およびアンチセンス5'AATTCAAAAAAGATGGGATCAAACCTGACATTTCTCTTGAAAATGTCAGGTTTGATCCCATCCG3'(配列番号6)およびルシフェラーゼ(センス5'GATCCGACATTAAGAAGGGCCCAGCTTTTCAAGAGAGCTGGGCCTTAATCTTTTTT3'(配列番号7)、およびアンチセンス5'AATTGATTAAGGCCCAGCTCTCTTGAAAAGCTGGGCCCTTCTTAATGTCG3'(配列番号8)を、pSIREN-retroQ(Clontech)にクローン化した。アンホトロピックパッケージング細胞系(ΦNX;Garry Nolan博士、スタンフォード大学、カリフォルニア州、スタンフォード)に、Pearらによって記載されたとおり(Pesrら、1993年)トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、ウイルス含有培地を取り出し、1500rpmで5分間遠心分離し、細胞デブリをペレット化した。ウイルスを含有する2mlの遠心分離培地を、ポリブレン(8μg/ml)の存在下、標的細胞(6ウェルプレートにおける2.105/ウェル)に感染させた。陽性クローンを選択するために、感染細胞をプロマイシン(5μg/ml)で処理した。
トランスフェクションの前日、SW480細胞を24ウェルプレートに接種した(5×104細胞/ウェル)。製造元の使用説明書に従って、細胞に、100pモルのローダミンタグ付きGAS特異的またはβガラクトシダーゼ特異的shRNA、および5μl/ウェルのExgen500(Euromedex)をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間または72時間後、細胞を溶解させる(免疫ブロットおよびPCRのため)か、または免疫染色のために1%のパラホルムアルデヒドに固定した。
トランスフェクションの72時間後、カバーグラス上の細胞をPBSで洗浄し、アルシアンブルー(3%の酢酸中10g/l)と共に30分間インキュベートした。水中で細胞をすすぎ、カバーグラスをモウイオール(mowiol)中のガラススライド上に乗せ、使用するまで4℃で保存した。
2.5μgの総RNAをDNアーゼRQ1(Promega)と共に、37℃で30分間予備処理し、M-MLV逆転写酵素(Invitrogen)による逆転写に用いた。LightCycler FastStart DNA MasterPlus SYBR Green Iキット(Roche Diagnostics、フランス国、Meylan)を用い、以下の条件下で定量的PCRを実施した。アクチン:95℃で10分間変性、増幅50サイクル:95℃で10秒、58℃で6秒、72℃で11秒。融解曲線:95℃で0秒、68℃で30秒、95℃で0秒および40℃で2分間の冷却。c-myc、ILK、クロモグラニンAおよびGAPDH増幅:95℃で10分間の変性、50サイクルの増幅:70℃で10秒、58℃で6秒、72℃で13秒。融解曲線は、95℃で0秒、80℃で30秒、95℃で0秒および冷却は40℃で2分間。プロガストリン、Muc-2、ALPおよびICAT増幅:95℃で10分間変性、50サイクルの増幅:70℃で10秒、95℃で6秒、72℃で11秒。融解曲線は、95℃で0秒、80℃で30秒、70℃で0秒および冷却は40℃で2分間。選択された遺伝子増幅に用いるプライマーは以下のものであった。GAPDH-センス:5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3'(配列番号9)アンチセンス:5'GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3'(配列番号10);アクチン-センス:5'CGGGAATCTGCGTGACAT3'(配列番号11);アンチセンス:5'AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3'(配列番号12);ILK-センス:5'ATGACTGCCCGAATTAGCATG3'(配列番号13);アンチセンス:5'GCTACCCAGGCAGGTGCATA3'(配列番号14);ICAT-センス:5'GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3'(配列番号15);アンチセンス:5'GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3'(配列番号16);c-myc-センス:5'CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3'(配列番号17);アンチセンス:5'TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3'(配列番号18);ヒトプロガストリン-センス:5'AGAGGATCCAAATGCAGCGACTATGTGTGTATG3'(配列番号19);アンチセンス:5'GGCGAATTCCTAGGATTGTTAGTTCTCATCCTCAG3'(配列番号20);Muc-2-センス:5'TGGGTGTCCCTCGTCTCCTACA3'(配列番号21);アンチセンス:5'TGTTGCCAAACCGGTGGTA3'(配列番号22);アルカリホスファターゼ-センス:5'CTCCAACATGGACATTGACG3'(配列番号23);アンチセンス:5'CAGTGCGGTTCCACACATAC3'(配列番号24);クロモグラニンA-センス:5'ATCACCGCCACTGCCACCACCA3'(配列番号25);アンチセンス:5'CACCTTAGTGTCCCCTTTTGTCATAGGGCT3'(配列番号26)。
10%のウシ胎仔血清、1%のグルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM-F12中、0.2%の寒天に1×105細胞を再懸濁し、固化下層を含有する(増殖培地中0.5%の寒天)6cmのペトリ皿に播いた。播いてから8日後、細胞を0.02%のクリスタルバイオレット中で染色し、コロニーのサイズおよび数を顕微鏡下で定量化した。クローンはすべて三重に接種し、各々について10の視野をカウントした。
実験動物試験に関するフランス国の指針(Direction des Services Veterinaires、Ministere de l'Agriculture、Agreement NoB34-172-27)に従い、実験的腫瘍形成における動物の福祉に関するUKCCCR指針を満たして、インビボ実験を実施した。2×106細胞を6週齢の無胸腺BALB/c-nu/nu(ヌード)マウスに皮下注射した。以後、腫瘍増殖を定期的に追跡した(予測腫瘍容積=(長さ×幅×厚さ)/2)。
TCF/LEF-1の転写活性測定に用いられるプロトコルは以前に記載されている(Morinら、1997年)。簡単に述べると、細胞に、500ngのTCF/LEF-1レポーター(pTOP-FLASH)、または対照ベクター(pFOP-FLASH)、および25ngのpCMV-Renillaをトランスフェクトした。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega)を用いて、ルシフェラーゼ活性を定量化し、Renillaの活性に対して正規化した。
以前記載された(Hollandeら、2003年)とおりに免疫蛍光染色を実施した。次いで、×40油浸レンズを有するレーザー走査LEICA sp2共焦点顕微鏡を用いて、スライドを観察した。
ヒトGAS遺伝子に関して遺伝子導入(Tg/Tg)したFVB/Nマウスまたは野生型同腹仔から、パラフィン組織切片を調製した(Cobbら、2004年)。脱蝋および水和の後、切片を、室温で20分間、ペルオキシダーゼにより予備処理した。サンプルを、10mMのトリス-1mMのEDTA、pH9中、20分間煮沸することにより抗原を回収した。スライドを室温まで放冷し、PBS +0.05%のBSA中、抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。すべての場合で、第2の試薬として、Envision+キット(DAKO)を用いた。DAB(Sigma)を用いて染色を展開し、ヘマトキシリンまたはヌクレアファーストレッド(Nuclear Fast Red)により、スライドを対比染色しマウントした。
以前記載された(Hollandeら、2003年)とおり、タンパク質ライセート、免疫沈降および免疫ブロットを実施した。ECL Plus(Amersham Biosciences)を用いてタンパク質を可視化し、ImageJ 1.32J(NIH、メリーランド州、ベセスダ)を用いるデンシトメトリーにより、バンドを定量化した。
1チューブ当たり、0.5μgのATP(250mMのATP、1μCi[γ-32P]ATP)と共に、25μlのキナーゼ緩衝液(50mMのHepes pH7.0、1mMのMnCl2、1mMのオルトバナジン酸Na、2mMのNaF、5μgのミエリン塩基性タンパク質(Myelin Basic Protein)(Sigma))を加えることにより、該反応を開始させ、30℃で20分間インキュベートした。10μlの4×サンプル緩衝液の添加により該反応を終了させた。該チューブを、10,000gで1分間遠心分離し、該タンパク質を14%のSDS-pageゲル上で分離した。該基質のリン酸化を、オートラジオグラフィーにより可視化した(Marottaら、2003年)。
以前記載された(Hollandeら、1997年)とおり、細胞上清中のGAS遺伝子産物プロガストリン、グリシン伸長ガストリン(G-gly)およびアミド化ガストリン(G-NH2)を、放射免疫アッセイによって定量化した。
統計解析はすべて、Windows(Cary、米国、ノースカロライナ州)に関するSAS版9.1を用いて実施した。組換えプロガストリンによる処理の有無で、対照細胞とプロガストリン欠失細胞との間の差異の統計的有意性を判定するために、スチューデントのt検定を用いた。ヒト腫瘍におけるGASとICAT遺伝子発現との間の関連性を判定するために、ピアソンの相関係数(r)を判定する前に、変数を、それらの自然対数値を用いて正規化した。
プロガストリンに対する選択的抗体は、ICAT発現に対するプロガストリン抑制を反転し、c-myc発現の減少を誘導する。
本実施例は、プロガストリンに対する独立して作出された2つのポリクローナル抗体の特徴を記載し、それらが、完全長プロガストリン(1〜80)ペプチドを選択的に認識するが、アミド化ガストリン、グリシン伸長ガストリン、および6つのアミノ酸C末端フランキングペプチド(CFTP)など、ヒト血中に存在する可能性のある処理ペプチドは認識しないことを実証することを目的としている。この特徴づけは、ELISAアッセイを用いインビトロで実施した。
該N末端配列は:SWKPRSQQPDAPLGT(配列番号32)であった。
該C末端配列は:FGRRSAEDEN(配列番号31)であった。
−抗体選択性:抗体の選択性を、方法の節で記載されたELISA試験によって評価した。結果(図10)は、双方のポリクローナル抗体とも、プロガストリンならびにそれらの産生に関する免疫原として用いられたそれぞれのペプチドを選択的に認識することを示している。それらは、グリシン伸長ガストリン、アミド化ガストリン、またはプロガストリンの成熟過程に由来し、ヒト血清中に検出される他のペプチドであるC末端フランキングペプチド(CTFP)(配列:SAEDEN)(Smith KA、Gastroenterology、2006年)には結合しない。
−プロガストリン抗体の中和活性:プロガストリンによるICATの抑制を阻害し、その結果、ベータカテニン/Tcf-4複合体の転写活性減少を誘導するプロガストリン抗体の能力を、SW480結腸直腸癌細胞において扱った。双方とも1/5000希釈の、プロガストリン(1〜80)のN末端対象物またはC末端対象物に特異的なウサギポリクローナル抗体の存在下で、細胞を30時間インキュベートした場合、ICAT mRNAの発現は大きく増加したが、c-MycおよびサイクリンD1のものは、同一濃度の非特異的ウサギポリクローナル抗体によって処理された細胞に比較して、著しく減少した。C-mycおよびサイクリンD1は、ベータカテニン/Tcf-4転写活性の認められた標的であり、それらの発現減少は、ベータカテニン/Tcf-4活性の減少の結果であると考えられる(図11)。
ICAT発現のプロガストリン阻害は選択的抗体に対するその結合によって反転させることができ、構成的ベータカテニン/Tcf-4活性の阻害がもたらされることを、これらの結果はインビトロで実証している。したがって本発明は、ICATおよびベータカテニン/Tcf-4活性を介して生じるプロガストリンの腫瘍形成促進作用をブロックするためにプロガストリン抗体を用いることができるというコンセプトの証明を初めて提供している。
ELISA
抗原をPBS中、指示された濃度に希釈し、その抗原100μlでマルチソルブ96ウェルプレートを4℃で一晩被覆した。翌日、ウェルを200μlのPBS/1% Tweenにより3回洗浄し、100μlのブロッキング溶液(PBS/1% Tween/0.1%BSA)を22℃で2時間加えた。PBS/1% Tweenによりさらに3回洗浄後、一次抗体をブロッキング溶液中で希釈し、100μlを22℃で2時間、該ウェルに加えた。抗体濃度は図に示されている。二次抗体を同じブロッキング緩衝液に希釈し、3回洗浄後、100μlを22℃で2時間、該ウェルに加えた。最後に、ウェルを、PBS/1% Tweenによって再度洗浄し、100μlのOPD溶液基質を22℃で20分間加えた。4NのH2SO4 50μlによって反応を停止させ、492nmにおいて読取りを行った。
10%のウシ胎仔血清(Eurobio、フランス国、Les Ulis)、1%のL-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中、CRC細胞系SW480を37℃で維持した。SW480細胞を10%のFBS、1%の抗生物質および1%のグルタミンを含有するDMEM中、6ウェルプレートに播き(200,000細胞/ウェル)、37℃、5%CO2で一晩増殖させ、次いで、24時間血清不足にした。翌朝、該培地を、1/5,000希釈の対照またはプロガストリン選択的ポリクローナル抗体を含有しFBSなしのDMEMと置換し、引き続き、37℃、5%CO2でインキュベーションを行った。抗体を含有する培地は12時間後に取り替えた。30時間後、細胞をPBSで洗浄し、RNA抽出キット細胞溶解緩衝液によって細胞溶解させた。
RNeasy Protect Minikit(Qiagen France SA、フランス国、91974 Courtaboeuf)を用いて、SW480細胞からRNAを調製した。回収したRNAの品質および量を、RNA pico Labchips(Agilent Technologies、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて評価した。逆転写には、各サンプルから2.5μgの総RNAをDNアーゼRQ1(Promega)により、37℃で30分間予備処理し、M-MLV(InVitrogen)と共にインキュベートした。LightCycler FastStart DNA MasterPlus SYBR Green Iキット(Roche Diagnostics)を用いて、1サンプル当たり2μlのcDNAから定量的PCRを実施した。GAPDH mRNAの発現を用いて、RNAローディングを検量した。
−c-mycおよびGAPDH増幅に関して:95℃で10分間の変性、50サイクルの増幅:95℃で10秒、58℃で6秒、72℃で13秒。融解曲線は、95℃で0秒、80℃で30秒、95℃で0秒、冷却は、40℃で2分。
−ICAT増幅に関して:95℃で10分間の変性、50サイクルの増幅:95℃で10秒、60℃で6秒、72℃で11秒。融解曲線は、95℃で0秒、80℃で30秒、70℃で0秒、冷却は、40℃で2分。
−サイクリンD1増幅:95℃で10分間、50サイクルの増幅:95℃で10秒、70℃で6秒、72℃で11秒。融解曲線は、95℃で0秒、80℃で30秒、95℃で0秒、冷却は、40℃で2分。
GAPDH-センス:5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3'(配列番号33)
GAPDH-アンチセンス:5'GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3'(配列番号34)
ICAT-センス:5'GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3'(配列番号35)
ICAT-アンチセンス:5'GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3'(配列番号36)
c-Myc-センス:5'CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3'(配列番号37)
c-Myc-アンチセンス;5'TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3'(配列番号38)
サイクリンD1-センス:5'-CCGTCCATGGGGAAGATC-3'(配列番号39)
サイクリンD1-アンチセンス:5'-ATGGCCAGCGGGAAGAC-3'(配列番号40)
ヒト結腸直腸腫瘍細胞のプロガストリン欠失により、構成的ベータカテニン/Tcf-4活性を有する細胞の分化およびアポトーシスが誘導されるため、ヒト結腸直腸腫瘍細胞のプロガストリン欠失により腫瘍形成が反転することを実証する十分かつ必要なデータが初めて提供される。これらの作用はプロガストリンに特異的である。これは、インビトロで2つの細胞系(DLD-1およびSW480)ならびにインビボでヌードマウスに移植した同じこれらの細胞系において、およびヒト腫瘍形成を再利用するマウスモデルにおいて示されている。実際、このマウスモデル(APCΔ14)において、apc遺伝子は、ベータカテニン/Tcf-4経路の活性化を導く変異を有し、マウスは自然に腺腫および腺癌を発現する。プレプロガストリンのmRNAを標的にするsiRNAにより、これらのマウスをインビボで処理した。これによって、腫瘍形成の反転がもたらされ、分化およびアポトーシスにより腫瘍の縮退に至った。この処理により、構成的ベータカテニン/Tcf-4活性が著しく阻害されることが示されている。したがって、apc遺伝子の変異によって開始された腫瘍形成の反転が示されるのはこれがまさに初めてである。プロガストリンの欠失はベータカテニン/Tcf-4転写活性の内因性阻害物質であるICATの再発現を誘導するため、プロガストリン欠失が抗腫瘍作用を有することが分子レベルで示されている。
(参考文献)
Claims (3)
- 結腸直腸癌を治療および/または予防するための医薬の製造における、プロガストリンに結合する抗体または抗体結合断片の使用であって、前記抗体または抗体結合断片が、FGRRSAEDEN(配列番号31)に結合する、抗体または抗体結合断片の使用。
- 治療される結腸直腸癌のベータカテニン/Tcf-4媒介転写経路が構成的に活性である、請求項1に記載の抗体または抗体結合断片の使用。
- 治療される結腸直腸癌の細胞が、大腸腺腫性ポリポーシス(APC)腫瘍サプレッサー遺伝子および/またはベータカテニン遺伝子の変異を含む、請求項1に記載の抗体または抗体結合断片の使用。
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