ES2727306T3 - Inhibidores de progastrina en el tratamiento del cáncer de colon - Google Patents

Inhibidores de progastrina en el tratamiento del cáncer de colon Download PDF

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Abstract

Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo que se une específicamente a la progastrina, para su utilización en el tratamiento del cáncer colorrectal.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de progastrina en el tratamiento del cáncer de colon.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para el tratamiento y la prevención de cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa y metástasis.
Antecedentes de la invención
La tumorigénesis del colon humano implica en el 66% de los casos mutaciones somáticas del gen supresor de tumores adenomatous polyposis coli (APC) o en el gen de beta-catenina (valor medio calculado a partir del siguiente listado de referencias: (Conlin et al., 2005; De Filippo et al., 2002; Huang et al., 1996; Johnson et al., 2005; Kim et al., 2003; Luchtenborg et al., 2005; Mikami et al., 2006; Morin et al., 1997; Powell et al., 1992; Rowan et al., 2000; Segditsas y Tomlinson, 2006; Shitoh et al., 2004; Smith et al., 2002; Sparks et al., 1998; Suraweera et al., 2006; Takayama et al., 2001)). Estas mutaciones son consideradas como un suceso temprano de la carcinogénesis colorrectal que aparece en pacientes con cáncer colorrectal esporádico. Las mutaciones germinales en el gen apc también son responsables de la poliposis coli familiar, un síndrome hereditario asociado con un riesgo elevado de cáncer intestinal. Estas mutaciones dan como resultado una regulación defectuosa del conjunto citoplásmico de la proteína de uniones adherentes beta-catenina, dando como resultado una activación constitutiva de la ruta transcripcional mediada por Tcf-4. Esta activación constitutiva da como resultado un nivel elevado de transcripción de los genes diana de Tcf4, tales como c-myc o ciclina D1. Otra diana potencial de esta ruta es el gen GAST, que codifica la prohormona progastrina.
Se mostró que la transcripción de este gen está incrementada tras la activación del complejo de beta-catenina/Tcf4 in vitro (Koh et al., 2000).
Un papel para la progastrina en la carcinogénesis del colon se sugirió por primera vez hace alrededor de 15 años, cuando se detectó progastrina en extractos de tumor colorrectal (Finley et al., 1993; Kochman et al., 1992; Nemeth et al., 1993), y cuando se mostró que los niveles plasmáticos de progastrina eran elevados en alrededor de 75% de los pacientes que poseían un tumor colorrectal, mientras que eran indetectables en los controles (Ciccotosto et al., 1995; Konturek et al., 2002; Siddheshwar et al., 2001; Van Solinge et al., 1993). Sobre la base de estas observaciones, se ha investigado tanto in vitro como in vivo la teoría de que la progastrina podría estar implicada en la tumorigénesis del colon. Los estudios comenzaron en primer lugar mostrando que la gastrina extendida con glicina (uno de los productos de la maduración de progastrina) tuvo un efecto positivo sobre la proliferación (Hollande et al., 1997; Koh et al., 1999; Litvak et al., 1999; Singh et al., 1994; Stepan et al., 1999). Mientras tanto, se mostró que la sobreexpresión de progastrina en el hígado, en el que no se puede producir la maduración en péptidos más pequeños, induce mitogénesis en el epitelio intestinal (Wang et al., 1996). Estos mismos ratones transgénicos se usaron para demostrar que la sobreexpresión de progastrina induce una susceptibilidad a carcinogénesis inducida por azoximetano (Singh et al., 2000). Sin embargo, esta observación se cuestionó cuando se mostró que la genorreducción del gen de gastrina también indujo la misma susceptibilidad a carcinogénesis (Cobb et al., 2002). Sin embargo, los efectos proliferativos de progastrina se demostraron adicionalmente in vitro en la estirpe celular intestinal de rata IEC6 (Brown et al., 2003), e in vivo en un modelo de ratón transgénico que presenta sobreexpresión intestinal de progastrina bajo el control del promotor fabp (Cobb et al., 2004). Sin embargo, una desventaja importante de este modelo de ratón es que la progastrina se sobreexpresa en las células diferenciadas del epitelio intestinal, y no en las proliferativas. En 2003 y en 2005, Ottewell et al proporcionaron datos sobre el hecho de que la progastrina estimula la mitosis epitelial colónica murina tras el daño del ADN, y sobre el hecho de que los restos de 26 aminoácidos COOH terminales de la progastrina son suficientes para la estimulación de la mitosis en epitelio colónico murino in vivo (Ottewell et al., 2005; Ottewell et al., 2003).
Sobre la base de estos datos que proceden mayoritariamente de los experimentos de sobreexpresión, la progastrina fue aceptada como un “factor de crecimiento” en células epiteliales intestinales. Por el contrario, solamente tres estudios han intentado agotar células in vitro y uno in vivo. In vitro, 2 estirpes celulares productoras de progastrina se transfectaron con un antisentido del gen de gastrina, y se mostró que se disminuyó la formación de colonias así como la implantación tumoral en ratones atímicos (Singh et al., 1996). Sin embargo, de forma importante, no se demostró a qué producto del gen de gastrina se atribuyeron estos efectos bloqueantes. Un estudio más reciente demostró que el agotamiento de progastrina permitió la restauración de uniones adherentes y firmes estables en células epiteliales intestinales, relacionando la progastrina con la activación de la migración (Hollande et al., 2003). Finalmente, el último estudio in vitro se centró en el papel de la gastrina 17 extendida con glicina, un producto de maduración de la progastrina, puesto que las células usadas en ese trabajo segregan grandes cantidades de este péptido pero muy poca progastrina (Hollande et al., 1997). In vivo, los ratones KO, como se menciona anteriormente, fueron más susceptibles a la tumorigénesis.
De forma importante, los únicos dos estudios que dieron a conocer una conexión entre el complejo de betacatenina/Tcf4 y la familia de péptidos de la gastrina demostraron in vitro solamente que la activación de la ruta transcripcional de Tcf4 (Koh et al., 2000), particularmente en correlación con Ras (Chakladar et al., 2005), conduce a la activación del promotor del gen de gastrina y a una mayor transcripción del gen. Por el contrario, antes de los datos proporcionados en la presente memoria, nada se conocía con respecto a la naturaleza real del péptido derivado del gen de gastrina segregado en el colon con la activación anormal de la ruta de beta-catenina/Tcf4, ningún informe mencionó la posibilidad de invertir la activación de esta ruta a través de un bloqueo de la función de progastrina, y no se ha establecido ninguna correlación en pacientes con cáncer colorrectal humano entre aquellos que presentan una activación de esta ruta en su tumor y aquellos que tienen expresión elevada del gen de gastrina. En consecuencia, parece que ningún dato previo proporcionó las pruebas científicas suficientes para mostrar que el agotamiento de progastrina podría invertir la tumorigénesis colorrectal inducida por la activación constitutiva de beta-catenina/Tcf4. Tales datos se proporcionan a continuación.
Gastrina y progastrina
La gastrina es una hormona peptídica del intestino clásica, que se identificó originalmente como un estimulante de la secreción de ácido gástrico. Es producida principalmente por las células G del antro gástrico y, en un grado variable, en el intestino delgado superior, con cantidades mucho menores en el colon y en el páncreas. A lo largo de años recientes, ha habido un interés creciente en el papel de la familia de péptidos de la gastrina en la carcinogénesis colorrectal. En particular, se acumulan pruebas de que las formas precursoras de gastrina (progastrina y gastrina extendida con glicina), que se pensó previamente que eran inactivas, desempeñan un papel en el desarrollo de cáncer colorrectal (ver comentarios anteriores). La gastrina aparece en diversas formas moleculares. Las gastrinas terminalmente amidadas de COOH humanas, G17 y G34, se generan a partir de una molécula precursora de 101 aminoácidos, la preprogastrina, mediante modificaciones postraduccionales. La preprogastrina se transloca cotraduccionalmente en el retículo endoplasmático, en el que el péptido señal se escinde rápidamente para dar lugar a la progastrina. La progastrina es escindida subsiguientemente por prohormona convertasas y por carboxipeptidasa E para dar lugar a un péptido con un resto de glicina COOH-terminal, a saber, G34-Gly, y una escisión adicional genera el péptido G17-Gly. G34-Gly se puede convertir en el péptido terminalmente amidado de COOH G34 mediante peptidil alfa-amidante monooxigenasa, y se puede escindir de forma similar para generar G17. G17 o Gamide es la forma antral predominante de las gastrina, comprendiendo generalmente los precursores no amidados (progastrina, gastrina extendida con glicina) menos del 10% del péptido segregado total en seres humanos. Sin embargo, en ciertas situaciones clínicas en las que el procesamiento está alterado, se segrega una mayor proporción de gastrina no amidada. Por ejemplo, las concentraciones tisulares y plasmáticas de progastrina son elevadas en algunos pacientes con carcinoma colorrectal, como se menciona anteriormente (Ciccotosto et al., 1995; Konturek et al., 2002; Siddheshwar et al., 2001; Van Solinge et al., 1993).
En el documento WO 99/19353, se sugiere un método de tratamiento de una afección asociada con hiperactividad de estimulación autocrina de proliferación de células de la mucosa gastrointestinal. El método comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un antagonista de la unión de progastrina a receptores intracelulares de gastrina/CCK-C u otros receptores de progastrina, a un mamífero que necesite de tal tratamiento.
La patente US n° 6.165.990 describe métodos para el tratamiento de cáncer de colon. La expresión de gastrina por los cánceres de colon es inhibida mediante el uso de la expresión de gastrina antisentido.
En el documento WO 2004/089976 A, se describen métodos y composiciones para el tratamiento de afecciones asociadas con niveles elevados de gastrina no amidada. En un aspecto, el método comprende la etapa de administrar, a un mamífero que necesite de tal tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto que tiene la capacidad para inhibir la unión de iones férricos a uno cualquiera o más de gastrina 17 extendida con glicina, progastrina o péptidos derivados de progastrina, pero que no inhibe la actividad de gastrina amidada, y de ese modo inhibir la actividad de gastrinas no amidadas. El dato se proporciona para apoyar la reivindicación de que la capacidad para inhibir la unión de iones férricos a gastrina 17 extendida con glicina no reduce su actividad biológica, pero no se proporciona ningún dato con respecto a los efectos sobre la actividad biológica de progastrina.
El documento WO 2006/032980 A tiene como objeto proteger moléculas que se unen a progastrina que se unen selectivamente a progastrina, en el que la molécula no se une a gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina-17 extendida con glicina (G17-Gly), o gastrina-34 extendida con glicina (G34-Gly), en particularmente anticuerpos monoclonales selectivos para progastrina, e hibridomas que los producen. Se describe un método para cuantificar los niveles de progastrina en fluidos biológicos usando los anticuerpos mencionados anteriormente, pero esta reivindicación no está apoyada por ningún dato con respecto a la capacidad de estos anticuerpos para detectar selectivamente progastrina en cualquier fluido biológico. También se describe un método de prevención o tratamiento de una enfermedad o afección promovida por gastrina que comprende la administración de anticuerpos, pero sin datos para apoyar la reivindicación de que estos anticuerpos demuestran cualquier actividad selectiva para alterar la actividad biológica de progastrina. Este documento solamente proporciona métodos para establecer la especificidad de tales anticuerpos.
Hasta la fecha, las vías eficaces y específicas para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, metástasis y poliposis adenomatosa son escasas. Por lo tanto, se proporciona en la presente memoria un método mejorado para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, metástasis o poliposis adenomatosa.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas, y cualesquiera otros aspectos o formas de realización expuestos en la presente memoria son únicamente informativos.
Se proporciona en la presente memoria un método para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que provienen de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión a beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) a un individuo que lo necesite.
También se proporciona un método para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, comprendiendo dicho método la etapa de administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) a un individuo que lo necesita.
Se describe en la presente memoria por primera vez que el agotamiento de progastrina, y no cualquiera de los otros productos del gen GAST, es capaz de invertir la tumorigénesis actuando directamente sobre la activación constitutiva de la actividad de beta-catenina/Tcf4. Esta inversión implica la regulación de la expresión de ICAT, baja en un contexto de progastrina elevada, alta en el contexto de agotamiento de progastrina. Cuando ICAT es elevado, la activación constitutiva de la actividad de beta-catenina/Tcf4 está profundamente disminuida debido al hecho de que ICAT secuestra la vía de beta-catenina de Tcf4.
Por lo tanto, por primera vez, se demuestra que el agotamiento de progastrina es una terapia muy eficiente para cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis provenientes de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, y para cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa. De este modo, la población de esos tumores colorrectales humanos, poliposis adenomatosa o metástasis que tienen una baja expresión de ICAT, una actividad constitutiva mediada por beta-catenina/Tcf-4, y una expresión elevada de progastrina, se puede seleccionar para la terapia antiprogastrina.
También se proporciona un método para determinar si un paciente que sufre cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis es sensible a un tratamiento terapéutico con un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT), comprendiendo dicho método la etapa de determinar si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis proviene de células que segregan progastrina en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa.
También se proporciona un método que combina la selección de una población específica de pacientes que probablemente son sensibles al régimen de tratamiento, con el tratamiento y/o prevención de cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis.
También se proporciona el uso de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que provienen de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa.
También se proporciona el uso de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa.
También se proporciona en la presente memoria un método para cribar compuestos para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que provienen de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa.
Descripción detallada de la invención
Se proporciona un método para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, comprendiendo dicho método la etapa de administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) a un individuo que lo necesite.
También se proporciona el uso de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa.
Típicamente, las células que segregan progastrina y las células en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 son células colónicas.
Típicamente, las células que segregan progastrina y las células en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 está constitutivamente activa pueden ser las mismas.
También se proporciona un método para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que provienen de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, comprendiendo dicho método la etapa de administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) a un individuo que lo necesite.
Típicamente, las células que segregan progastrina son células colónicas.
También se proporciona el uso de un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT) en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis provenientes de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa.
Las metástasis de cáncer de colon son una causa importante de muerte para pacientes, y raramente se operan, debido a que son difíciles de acceder, o debido a que tal eliminación quirúrgica presentaría riesgos críticos para la supervivencia inmediata del paciente. Este es especialmente el caso cuando la masa metastásica ha crecido muy próximamente a una arteria vital. El tratamiento descrito en la presente memoria induce una regresión de tales metástasis, y por lo tanto es extremadamente útil, ya sea extirpando completamente el cuerpo de las metástasis, o por lo menos permitiendo la eliminación quirúrgica forzando a las metástasis a contraerse lejos de la arteria. Además, la disminución de la síntesis de progastrina en células de cáncer colorrectal restaura la capacidad adhesiva de células tumorales colorrectales y conduce a una reducción de su potencial de migración (Hollande et al., 2003). Típicamente, las metástasis tratadas pueden no ser quirúrgicamente eliminables. La metástasis se puede originar a partir de un tumor primario para el cual se desconoce el estado de activación de la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4. Típicamente, el tumor primario a partir del que se origina la metástasis es un tumor de colon.
Por individuo, se quiere decir un animal o ser humano.
Por ruta transcripcional constitutivamente activa mediada por beta-catenina/Tcf-4, se quiere decir una activación permanente, y desregulada, de la ruta que conduce a la formación de un complejo transcripcional entre betacatenina y Tcf-4, conduciendo a una mayor transcripción de genes diana de Tcf-4 debido a la falta de degradación de beta-catenina citoplásmica.
Los ejemplos de células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa son células en las que el gen supresor de tumores adenomatous polyposis coli (APC) está mutado, o células en las que el gen de beta-catenina está mutado de una manera que evita una degradación normal de beta-catenina.
Típicamente, antes de aplicar un método de tratamiento como se describe en la presente memoria a un paciente que sufre cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis, se ha de llevar a cabo una prueba diagnóstica con el fin de determinar si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis provienen de células que segregan progastrina en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, o si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa. Al llevar a cabo tal prueba diagnóstica antes del tratamiento, es posible determinar si un paciente sería sensible a un método de tratamiento descrito en la presente memoria.
El experto tiene la capacidad para llevar a cabo tal prueba diagnóstica.
Típicamente, los niveles plasmáticos de progastrina en la sangre de los pacientes se pueden determinar con el fin de tratar solamente aquellos pacientes que tienen un nivel elevado de progastrina en el plasma. También se puede usar un estudio de progastrina plasmática para detectar una recidiva eventual del tumor y/o de las metástasis. A lo largo de su vida, los tumores colorrectales segregan factores que promueven la génesis de nuevos vasos sanguíneos (tales como VEGF), asegurando de ese modo que el tumor recibe una cantidad suficiente de nutrientes para lograr el crecimiento máximo (Wray et al 2004). La presencia de estos nuevos vasos también permite que el tumor libere diversos factores en el torrente sanguíneo, y este es especialmente el caso para la progastrina. Por lo tanto, la terapia dirigida contra la progastrina puede incluir la medida de los niveles de progastrina plasmática.
Alternativamente, o adicionalmente, se pueden detectar mutaciones del gen APC o del gen de beta-catenina, o se puede determinar el nivel anormal de transcripción de genes diana de Tcf, tales como, por ejemplo, c-Myc y ciclina D1, tiñendo estos marcadores en portaobjetos de tejidos tomados del paciente o usando por ejemplo tecnologías de micromatrices.
También se proporciona un método para determinar si un paciente que sufre cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis es sensible a un tratamiento terapéutico con un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT), comprendiendo dicho método la etapa de determinar si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis provienen de células que segregan progastrina en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, o si el cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa.
Típicamente, la etapa de determinar si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis provienen de células que segregan progastrina en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, o si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, comprende la etapa de medir los niveles plasmáticos de progastrina de dicho paciente. Adicionalmente, o alternativamente, la etapa de determinar si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis provienen de células que segregan progastrina en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, o si el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa o la metástasis presentan células que segregan progastrina y células en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, comprende la etapa de detectar una mutación del gen APC o del gen de beta-catenina, o un nivel anormal de la transcripción de los genes diana de Tcf.
Típicamente, el ensayo de progastrina puede ser un ensayo inmunofluorométrico resuelto en el tiempo (TR-IFMA), como se describe para proGRP (Nordlund et al, 2007). Este tipo de ensayo permite la cuantificación en el intervalo de 16 ng/l a 20,000 ng/l, valores en el intervalo de niveles plasmáticos de progastrina medidos en pacientes que poseen un tumor colorrectal. Se pueden usar dos anticuerpos monoclonales, uno dirigido contra el término N de progastrina y el otro contra el término C. El anticuerpo N-ter puede estar biotinilado, y se puede usar como el anticuerpo de fase sólida. El anticuerpo C-ter puede estar marcado con Eu3+, y se puede usar como el anticuerpo trazador.
Los ejemplos de inhibidores de la represión inducida por progastrina de ICAT se pueden seleccionar dentro de entre el grupo que consiste en agentes que disminuyen la expresión de progastrina en células colónicas, anticuerpos contra progastrina, inhibidores de fosfatidilinositol 3 cinasa (PI3K), e inhibidores de cinasa ligada a integrinas (ILK).
Por ejemplo, el inhibidor de la represión inducida por progastrina de ICAT es un agente que disminuye la expresión de progastrina en células colónicas. Típicamente, un agente que disminuye la expresión de progastrina en células colónicas comprende un ácido nucleico que interfiere con la expresión de progastrina.
Los ejemplos de tales agentes son moléculas antisentido, o vectores que comprenden dichas moléculas antisentido. Las moléculas antisentido son hebras complementarias de pequeños segmentos de ARNm. Los métodos para diseñar moléculas antisentido eficaces son bien conocidos (ver, por ejemplo, la patente US n° 6.165.990), y el experto en la materia tiene la capacidad para diseñar moléculas antisentido capaces de disminuir la expresión de progastrina en células colónicas. Ejemplos adicionales de agente que disminuye la expresión de progastrina son moléculas de interferencia del ARN (ARNi) tales como, por ejemplo, ARN interferentes cortos (ARNic), y ARN de horquilla cortos (ARNhc). ARNi se refiere a la introducción de ARN bicatenario homólogo para dirigirlo específicamente contra un producto de un gen, en el presente caso, progastrina, que da como resultado un fenotipo nulo o hipomórfico. Los métodos para diseñar moléculas de ARNi eficaces son bien conocidos (ver, para revisión, Hannon y Rossi Nature, 16 de septiembre de 2004; 431(7006):371-8), y el experto en la materia tiene la capacidad para diseñar moléculas de a Rní capaces de disminuir la expresión de progastrina en células colónicas.
Los ejemplos de los ARNic capaces de disminuir la expresión de progastrina en células colónicas son moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una de las siguientes secuencias:
ARNic hPG:
Sentido: 5'-GAAGAAGCCUAUGGAUGGATT-3' (SEC ID N°27)
Antisentido: 5'-UCCAUCCAUAGGCUUCUUCTT-3' (SEC ID N°28)
ARNic mPG:
Sentido: 5'-GAAGAGGCCUACGGAUGGTT-3' (SEC ID N°29)
Antisentido: 5'-CCAUCCGUAGGCCUCUUCTT-3' (SEC ID N°30)
Los ejemplos de ARNhc capaces de disminuir la expresión de progastrina en células colónicas son moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una de las siguientes secuencias:
ARNhc hPG:
Sentido: 5'-GAAGAAGCCTATGGATGGATTCAAGAGAAGGTAGGTATCCGAAGAAGTTTTTT-3' (SEC ID N°1)
Antisentido: 5'-AATTAAAAAACTTCTTCGGATACCTACCTTCTCTTGAATCCATCCATAGGCTTCTTCGGCC-3' (SEC ID N°2)
Una forma de realización de la presente descripción se refiere a un medicamento que comprende un ARNic que comprende una de las secuencias seleccionadas de entre el grupo de SEC ID N°27, SEC ID N°28, SEC ID N°29 y SEC ID N°30. Típicamente, el medicamento puede comprender un par de ARNic. Los ejemplos de pares de ARNic son un primer ácido nucleico que comprende SEC ID N°27 y un segundo ácido nucleico que comprende SEC ID N°28, o un primer ácido nucleico que comprende SEC ID N°29 y un segundo ácido nucleico que comprende SEC ID N°30.
Una forma de realización de la presente descripción se refiere a un medicamento que comprende un ARNhc que comprende una de las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en SEC ID N°1 y SEC ID N°2. Típicamente, el medicamento puede comprender un par de ARNhc. Los ejemplos de pares de ARNhc son un primer ácido nucleico que comprende SEC ID N°1 y un segundo ácido nucleico que comprende SEC ID N°2.
En una forma de realización de la invención, el inhibidor de la represión inducida por progastrina de ICAT es un anticuerpo contra progastrina, o un fragmento biológicamente activo o derivado del mismo, que no reconoce formas amidadas y extendidas con glicina de gastrina. El experto en la materia tendrá conocimiento de los métodos estándar para producir tal anticuerpo específico. Por ejemplo, los anticuerpos específicos, o sus fragmentos biológicamente activos o derivados, se pueden generar inmunizando un animal con progastrina o fragmentos de progastrina, y seleccionando los anticuerpos que se unen a progastrina y que no reconocen formas amidadas y extendidas con glicina de gastrina. En una forma de realización preferida, los fragmentos de progastrina son secuencias de aminoácidos que son específicas para progastrina. La longitud de estas secuencias puede estar comprendida entre 8 y 15 aminoácidos. Estas secuencias pueden comprender restos de aminoácidos COOH-terminales o restos de aminoácidos NH2-terminales de progastrina que no están presentes en las formas G17 y G35-Gly de gastrina. Estas secuencias pueden comprender el sitio de escisión de prohormona convertasa o de carboxipeptidasa E.
En una forma de realización de la presente invención, el anticuerpo o fragmento biológicamente activo o derivado del mismo se une a los restos de 10 aminoácidos COOH-terminales de progastrina, o a los restos 15 aminoácidos COOH-terminales de progastrina. Un ejemplo de restos de 10 aminoácidos COOH-terminales de progastrina es FGRRSAEDEN (SEC ID N°31). En una forma de realización alternativa, el anticuerpo, fragmento biológicamente activo o derivado del mismo, se une a los restos de 40 aminoácidos NH2-terminales de progastrina. Típicamente, el anticuerpo, fragmento biológicamente activo o derivado del mismo, se puede unir a SWKPRSQQPDAPLGT (SEC ID N°32). Estas secuencias de aminoácidos son específicas para progastrina, ya que no están presentes en las formas G17, G17-Gly, G34 y G34-Gly de gastrina.
El experto en la materia tendrá conocimiento de los métodos estándar para producir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales y sus fragmentos biológicamente activos y derivados. Por fragmento biológicamente activo o derivado del mismo, se quiere hacer referencia a capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo, en el presente caso, un epítopo de progastrina. Los fragmentos de anticuerpo, particularmente fragmentos Fab y otros fragmentos que retienen la capacidad y especificidad de unión al epítopo, también son bien conocidos, como lo son los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos “humanizados”, en los que las regiones estructurales (que no determinan la especificidad por el antígeno) del anticuerpo se sustituyen por regiones análogas o similares procedentes de otras especies. De este modo, los anticuerpos generados en ratones se pueden “humanizar” para reducir los efectos negativos que pueden aparecer al administrarlos a sujetos humanos. Los anticuerpos quiméricos son modalidades terapéuticas aceptadas actualmente, conociéndose varios en el mercado. Por lo tanto, la presente invención comprende la utilización de un anticuerpo específico para progastrina, que incluye los fragmentos de anticuerpo F(ab')2, F(ab)2, Fab, Fv y Fd, anticuerpos quiméricos en los que una o más regiones se han sustituido por porciones humanas o no humanas homólogas. El experto en la materia también tendrá conocimiento de que se pueden preparar derivados de anticuerpo biológicamente activos, tales como, por ejemplo, fragmentos ScFv y moléculas de tipo ScFv divalentes, usando métodos recombinantes. El anticuerpo se puede marcar con un marcador detectable, que es adecuadamente un marcador radioactivo, tal como yodo radioactivo, o puede ser un marcador fluorescente o quimioluminiscente. El experto en la materia será capaz de seleccionar marcadores radioactivos, fluorescentes o quimioluminiscentes adecuados.
Una forma de realización de la presente invención se refiere a un medicamento que comprende un anticuerpo o fragmento biológicamente activo o derivado del mismo, que se une a los restos de 15 aminoácidos COOH-terminales o a los restos de 40 aminoácidos NH2-terminales de progastrina.
Típicamente, el anticuerpo o fragmento biológicamente activo o derivado del mismo se une a FGRRSAEDEN (SEC ID N°31) o a SWKPRSQQPDAPLGT (SEC ID N°32).
En seres humanos sanos, la progastrina comprende menos de 10% de las gastrinas en circulación, y no se ha asociado ningún papel fisiológico a la progastrina. En consecuencia, seleccionando específicamente como diana a la progastrina con anticuerpos o fragmentos biológicamente activos o derivados de los mismos, se disminuyen, si no se evitan, los efectos secundarios del tratamiento.
En una forma de realización adicional de la presente descripción, el inhibidor de la represión inducida por progastrina de ICAT es un inhibidor de PI3K. Los inhibidores de PI3K son bien conocidos. LY294002, wortmanina y quercetina son inhibidores de PI3K usados habitualmente. Los documentos US2006058321 y WO2004052373, por ejemplo, describen familias de inhibidores de PI3K.
También se pueden usar como inhibidores de PI3K antisentido, moléculas de ARNi, formas dominante negativas de PI3K, anticuerpos contra PI3K, fragmentos biológicamente activos y derivados de los mismos.
En una forma de realización adicional de la presente descripción, el inhibidor de la represión inducida por progastrina de ICAT es un inhibidor de ILK. Los inhibidores de ILK son bien conocidos. KP-392 y QLT-0267 son inhibidores de ILK usados habitualmente. Por ejemplo, los inhibidores de ILK de tipo molécula pequeña se describen en el documento US6214813. Los inhibidores antisentido de ILK se describen en el documento US6177273. Las moléculas de ARNi, las formas dominante negativas de ILK, y los anticuerpos contra ILK, fragmentos biológicamente activos y derivados de los mismos, también se pueden usar como inhibidores de ILK.
Típicamente, los medicamentos según la descripción comprenden un inhibidor de la represión inducida por progastrina del inhibidor de la unión de beta-catenina y Tcf-4 (ICAT), junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un experto en la materia tendrá conocimiento de los vehículos adecuados. Las formulaciones adecuadas para la administración mediante cualquier vía deseada se pueden preparar mediante métodos estándar, por ejemplo mediante referencia a textos bien conocidos tales como Remington; The Science and Practice of Pharmacy.
En otra forma de realización de la presente descripción, se proporciona un método para cribar compuestos para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que provienen de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar células que segregan progastrina en las que la ruta transcripcional mediada por betacatenina/Tcf-4 está constitutivamente activa; y
b) añadir el compuesto que se debe cribar; y
c) seleccionar el compuesto que induce la expresión de ICAT.
En una forma de realización alternativa de la presente descripción, se proporciona un método para cribar compuestos para tratar y/o prevenir cáncer colorrectal, poliposis adenomatosa o metástasis que provienen de células que segregan progastrina, en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está constitutivamente activa, que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar células sensibles a progastrina; y
b) añadir progastrina al medio que contiene las células; y
c) añadir el compuesto que se debe cribar; y
d) seleccionar el compuesto que induce la expresión de ICAT.
Típicamente, las células que segregan progastrina o las células sensibles a progastrina son células colónicas.
Por células sensibles a progastrina, se pretende hacer referencia a células en las que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 está activa cuando la progastrina está presente en el medio de cultivo.
El experto en la materia tendrá conocimiento de métodos estándar para poner en práctica estos métodos. Típicamente, la expresión de ICAT se puede determinar mediante RT-PCr cuantitativa.
Leyendas de las figuras
Figura 1. El agotamiento de progastrina disminuye la tumorigenicidad de estirpes celulares de CRC humanas en ratones atímicos Balb/c, e inhibe el desarrollo espontáneo de tumores en el intestino de ratones APCA14. (A) El histograma muestra la cuantificación de ARNm de GAST en células SW480/pgalH y SW480/GASTH (clones [1] y [2], que expresan o no un ADNc de preprogastrina insensible a ARNhc (cPG)). Los resultados se expresan como un porcentaje de niveles encontrados en SW480/pgalH (*, p < 0.05 en comparación con SW480/GASTH, n = 3). Tabla inferior, cuantificación mediante RIA (pmol/l/24h) de progastrina, gastrina extendida con glicina, y gastrina amidada, segregadas por células SW480/pgalH y SW480/GASTH. (B) Evolución del volumen tumoral a lo largo del tiempo tras la inyección subcutánea de células DLD-1/VO, DLD-1/ASG, SW480/GASTH o SW480/pgal(-) en ratones atímicos BALB/c. Media /- s.e.m. de 2 clones/estirpe celular (4 ratones/clon), (*, p<0.05 en comparación con células DLD-1/VO o SW480/pgal(-), prueba de la t de Student). (C-D) Ratones APCA14 de 3 meses se trataron durante dos semanas con ARNic dirigidos contra el gen Gast murino o el gen de luciferasa (9 ratones/grupo). Los resultados se expresan como una relación entre la expresión del gen Gast en mucosa tumoral/sana en el íleon (C) o en el colon (D) (paneles izquierdos), cuantificada usando RT-QPCR. El número y tamaño de adenomas se cuantificaron tras la tinción con azul de metileno en el íleon (C) y en el colon (D), y se expresan como número total de tumores para cada grupo de tamaño (paneles derechos). ARNic de GAST fracasó a la hora de reducir los niveles de expresión del gen Gast en la muestra A (C), recogida en un ratón con un número elevado de tumores intestinales. “B” y “C” corresponden a ratones que no poseían ningún tumor de colon o del íleon, respectivamente (D).
Figura 2. Progastrina estimula la actividad de B-catenina/Tcf-4 en células de CRC humanas (A) La actividad transcripcional de Tcf-4 se cuantificó usando el ensayo de gen informador de luciferasa TOP/FOP (Morin et al., 1997) en células SW480/pgal(-) y SW480/GAST(-) no tratadas (clones [1] y [2]) (barras en negro), o en las mismas células tratadas con 5 nM de progastrina recombinante durante 72 h (rPG, barras gris claro), o transfectadas con ADNc de preprogastrina insensible a ARNhc (cPG, barras gris oscuro). Los valores son la media ± s.e.m. de cuatro experimentos similares (*, p < 0.05 en comparación con células SW480/GASTH). Los niveles de Tcf-4 y de p-catenina desfosforilada fueron similares en todas estas células, como se muestra en la figura S2. (B) Imágenes confocales independientes y superpuestas de p-catenina (verde), Tcf-4 (rojo), y DAPI (azul) en células SW480/pgalH y células SW480/GASTH con o sin tratamiento de progastrina 5 nM durante 72 h. Las barras representan 40 |im. Se usa un mayor aumento para las células tratadas con progastrina, para proporcionar una mejor visualización de la inversión parcial. (C) Los clones [1] y [2] de SW480/GASTH se trataron o no como en A. Los niveles de expresión de actina y proteínas codificadas por el gen diana de Tcf-4 c-Myc, ciclina-D1, Sox-9 y CLDN1, se cuantificaron mediante inmunotransferencia, usando células SW480/pgalH como controles (ver también las expresiones de ARNm en la figura S3 suplementaria). Los valores (estandarizados usando actina como un control de carga) son la media ± s.e.m. procedente de tres experimentos independientes. Prueba de la t de Student, p < 0.05 (*)comparado con células SW480/GASTH.
Figura 3. Progastrina disminuye la expresión de ICAT in vitro e in vivo. (A-B) Células SW480/GASTH sin progastrina (clones [1] y [2]) se transfectaron o no con un ADNc de preprogastrina insensible a ARNhc con codones optimizados (cPG). Los niveles de ARNm de ICAT se cuantificaron entonces mediante RT-QPCR (A) en comparación con células SW480/pgalH, y la expresión de la proteína ICAT se analizó mediante inmunotransferencia (B) en SW480/GASt h antes (barras gris claro) o después de la transfección transitoria con cPG (barras grises), en comparación con SW480/p-galH (barras negras). (C) La expresión de ICAT se analizó mediante inmunohistoquímica y tinción inmunofluorescente en secciones tisulares obtenidas a partir de epitelio colónico de ratones que presentan sobreexpresión específica del intestino de progastrina (Tg/Tg) (Cobb et al., 2004), así como en ratones de control procedentes del mismo antecedente genético (tipo salvaje). Las barras representan 40 |im.
Figura 4. La expresión de ICAT de novo es responsable de la menor actividad de p-catenina-Tcf-4 en células de CRC sin progastrina. (A) Panel superior: inmunoprecipitados de p-catenina desfosforilada procedentes de SW480/pgalH y SW480/GASTH /- progastrina recombinante (rPG, 5 nM, 72 h) se sondaron para p-catenina desfosforilada, Tcf-4, e ICAT. Panel inferior, cuantificación a partir de 3 experimentos similares llevados a cabo sobre 2 clones independientes (##p < 0.01 y *p < 0.05 comparado con SW480/pgalH y SW480/GASTH, respectivamente, prueba de la t de Student). (B) Imágenes confocales independientes y superpuestas de pcatenina, ICAT, y DAPI en células SW480/pgalH y células SW480/GASTH tratadas o no con progastrina 5 nM durante 72 h. Las barras representan 40 |im. (C-D) El ensayo informador de luciferasa de Tcf-4 (TOP/FOP) (C), y la cuantificación de ARNm y proteína de c-Myc (parte superior) y ciclina D1 (parte inferior) (D), se llevaron a cabo en células SW480/GASTH/LucH y SW480/Ga STh/ iCa Th con o sin la expresión nuevamente de ADNc de ICAT insensible a ARNhc (+cICAT).
Figura 5. La expresión de ICAT se correlaciona de forma inversa con los niveles de progastrina y la expresión del gen diana de p-catenina-Tcf-4 en tumores murinos y humanos. (A). Ratones APCA14 de 3 meses se trataron durante dos semanas con ARNic dirigido contra el gen GAST murino o contra el gen de luciferasa, como se muestra en la figura 1. Los adenomas intestinales se procesaron para la extracción de ARN, y la expresión de ARNm de ICAT se cuantificó (Ad) con respecto a la expresión en epitelio equivalente (Ep) procedente de los mismos animales (n = 5). (B) La expresión de las dianas de Tcf-4 ciclina D1, CD44 y C-Myc se analizó usando inmunotransferencia Western en adenomas (Ad) y epitelio macroscópicamente intacto (Ep) procedente de los mismos animales, en comparación con epitelio intestinal de ratones de control procedentes del mismo antecedente genético (ver la cuantificación en la figura S5 suplementaria). (C) Los adenomas procedentes de animales APCA14 tratados con ARNic específico para Luc o para GAST se embebieron en parafina y se procesaron para la detección inmunohistoquímica de c-Myc e ICAt . Se proporcionan imágenes representativas de adenomas de GAST- y Luc(- recogidos en el íleon. Las barras representan 20 |im. (D) Expresiones de ARNm de GAST e ICAT en tumores microdisecados (barras negras) procedentes de 23 pacientes con CRC, expresadas con respecto a las cantidades encontradas en su epitelio sano equivalente respectivo (barras blancas), que se normalizaron a 1 para cada paciente. Los valores son la media ± s.e.m. de tres experimentos independientes. Inserto: los valores logarítmicos de la expresión de GAST y de ICAT se representaron gráficamente unos contra otros, con la curva de regresión y su intervalo de confianza. El coeficiente de correlación de Spearman (r) se proporciona con su grado de significancia (p). (E) Panel superior: inmunotransferencia de progastrina (IB) en muestras sanas (H) o tumorales (T) procedentes de 4 pacientes con CRC. Panel inferior: inmunohistoquímica (IHC) representativa para pacientes de ICAT, c-Myc, claudina-1, y CD44 con expresión de progastrina tumoral elevada (paciente 4) o baja (paciente 22) (el control positivo en WB fue progastrina recombinante (rPG); el tiempo de exposición fue 20 s para el control positivo, y 10 min. para muestras humanas). Se obtuvieron resultados similares de IB e IHC en muestras procedentes de los 11 pacientes ensayados. La barra representa 20 |im.
Figura 6. La represión de ICAT es esencial para el papel promotor de tumores de progastrina en células de CRC humanas. (A) Panel superior: la disminución de ICAT invierte la tasa de crecimiento disminuida de células sin progastrina en agar blando, como se muestra mediante las diferencias notables en el tamaño de las colonias entre células SW480/pgal«, SW480/GASTH, SW480/GAST«/ICAT(-> y SW480/GAST(->/Luc«. Panel inferior: cuantificación de 3 experimentos similares, expresado como una media ± s.e.m. de 10 campos escogidos aleatoriamente por clon. (B) Células SW480/g As Th/Luch y SW480/GASTh/ICATh se inyectaron en la pata posterior de ratones atímicos BALB/c, y se midió regularmente el crecimiento tumoral. Media ± s.e.m. de 4 clones cada uno. *, p < 0.05 comparado con células SW480/GASTH/LucH, prueba de la t de Student.
Figura 7. La activación de la ruta PI3K/ILK es esencial para la represión de ICAT por progastrina. (A) La activación de PI3K es esencial para la represión de ICAT inducida por progastrina en células de CRC humanas. La expresión de ARNm de ICAt se midió como se describió anteriormente (izquierda), y la fosforilación de Akt/PKB se analizó mediante transferencia Western (derecha) en células SW480/pgalH y SW480/GASTH con o sin tratamiento con progastrina 5 nM (PG) y/o el inhibidor de PI3Cinasa LY-294002 (LY), como se indica. (B) La expresión y actividad de ILK están reducidas en células de CRC humanas sin progastrina. Panel superior, se analizó la expresión de ILK (transferencia Western) y la actividad enzimática (fosforilación in vitro de Proteína Básica de Mielina (MBP)) tras la inmunoprecipitación de ILK a partir de lisados de células SW480/pgalH y SW480/GASTH, con o sin tratamiento con progastrina recombinante (5 nM, 72 h). El panel central muestra la cuantificación de la actividad de ILK, llevada a cabo en tres experimentos independientes tras corregir las variaciones de la expresión de ILK en células descritas anteriormente. En el panel inferior, se analizó la fosforilación de la diana de ILK, la p1-integrina, sondando secuencialmente inmunoprecipitados de p1-integrina con un anticuerpo anti-fosfoserina y un anticuerpo contra p1-integrina. ILK, p1-integrina, y la fosforilación de MBP nunca se detectaron cuando los lisados se inmunoprecipitaron con suero de conejo preinmunitario (no representado). (C) La activación de ILK es esencial para la represión de ICAT mediada por progastrina en células de CRC humanas. La expresión de ARNm de ICAT (panel izquierdo) y la fosforilación de Akt/PKB en Ser473 (panel derecho) se cuantificaron en células SW480/pgalH y SW480/GASTH transfectadas o no con un ILK dominante negativo (AN-ILK), y con o sin tratamiento con progastrina exógena 5 nM (PG) según se indicó. Para todos los paneles, p < 0.05 comparado con células SW480/pgalH (#), SW480/GASTH (*), o SW480/GAST*' > (°) tratadas con progastrina.
Figura 8. El agotamiento de progastrina induce diferenciación y apoptosis de células de CRC humanas in vitro, y promueve la diferenciación tumoral en el intestino de ratones APCA14 in vivo. (A) Experimento representativo que muestra la localización nuclear de PTEN en dos clones de células SW480/GASTH pero no en células SW480/pgalH. (B) Cuantificación de la expresión de Muc-2, de fosfatasa alcalina intestinal (ALP), y de ARNm de cromogranina A (CgA) en células SW480 48 h después de la transfección con los ARNic dirigidos contra GAST o p-galactosidasa. (C) Expresión de Muc-2 y activación de caspasa-3 en células de CRC SW480 tras la transfección transitoria con los ARNic específicos de GAST pero no específicos de p-galactosidasa. Las células se transfectaron con los ARNic etiquetados con rodamina (rojo) dirigidos contra GAST (flechas) o pgalactosidasa (puntas de flecha), y se trataron o no con progastrina recombinante 5 nM. La expresión de Muc-2 (A488, verde) y caspasa-3 activada (Cy-5, mostrada en la presente memoria en rojo) se detectaron mediante tinción inmunofluorescente, y los núcleos de las células se tiñeron con DAPI (azul). Se obtuvieron resultados similares con células DLD-1. Las barras representan 20 |i m. (D). Ratones APCA14 de 3 meses se trataron durante dos semanas con ARNic dirigido contra el gen GAST murino o contra el gen de luciferasa, como en la figura 1. Los adenomas intestinales se embebieron en parafina y se procesaron para la detección inmunohistoquímica de células productoras de moco (Muc2 y Alcian blue) y células implicadas en la ruta apoptótica (caspasa 3 activada, puntas de flecha negras). Se proporcionan imágenes representativas de adenomas de GAST(-) y Luc(-) recogidos en el íleon. Las barras representan 20 |i m.
Figura 9. Ruta de señalización que conecta el agotamiento de progastrina con una menor activación del complejo transcripcional de p-catenina/Tcf-4 en células de carcinoma colorrectal con APC mutado. (A). Células de CRC producen y segregan progastrina endógena, que actúa a su vez sobre células tumorales para activar PI3 cinasa e ILK, induciendo de ese modo una represión de ICAT y facilitando la amplificación de la actividad transcripcional de p-catenina/Tcf-4 iniciada por la mutación de APC. Este proceso da como resultado una transcripción máxima de los genes diana, tal como el gen que codifica progastrina, creando así un bucle de activación que se autoamplifica. (B) La inhibición de la acción de progastrina, tal como la inducida por silenciamiento del gen GAST por ARNic (© ), reduce notablemente la actividad de PI3 cinasa y de ILK (@), dando como resultado un fuerte aumento de ICAT (@). La competición de este pequeño inhibidor con Tcf-4 por la unión a p-catenina es suficiente para disminuir fuertemente la transcripción de dianas de Tcf-4 en células tumorales (© ).
Figura 10. Se revistieron concentraciones crecientes de antígeno sobre placas de 96 pocillos como se indica (para detalles, ver la sección “Métodos”), seguido de la incubación con anticuerpos selectivos contra las extremidades N-terminal (panel superior) o C-terminal (panel inferior) de progastrina (1-80). Los antígenos ensayados fueron los inmunógenos originales usados para generar los anticuerpos (panel superior: SWKPRSQQPDAPLGT, panel inferior: FGRRSAEDEN), gastrina17 amidada, gastrina17 extendida con glicina, el péptido de flanqueo C-terminal de progastrina (SAEDEN), y hemocianina de lapa californiana (KLH), que se usó como proteína portadora durante el proceso de inmunización. Los resultados se expresan como lecturas directas a 492 nm tras la incubación con anticuerpos secundarios y sustrato de OPD.
Figura 11. Células de carcinoma colorrectal SW480 se trataron durante 30 horas con un anticuerpo de control o con anticuerpos dirigidos contra las extremidades C-terminal o N-terminal de progastrina (dilución 1/5,000), como se describe en la sección de Métodos. Tras la lisis celular, se cuantificó la expresión del ARNm para ICAT, c-Myc y ciclina D1, usando RT-qPCR. Los resultados se expresan como relación entre la expresión en células tratadas con anticuerpos antiprogastrina C-terminal (barras grises) o N-terminal (barras blancas) y células tratadas con el anticuerpo de control, en las que cada nivel de expresión génica se fijó a un valor de 1 (representado en la presente memoria mediante el eje horizontal).
Figura S1. Sobreexpresión de progastrina en los adenomas de ratones APCA14, y falta de respuesta proinflamatoria después de un tratamiento de dos semanas con ARNic selectivo para el gen GAST murino. (A) Niveles de gastrina amidada y de gastrina extendida con glicina en la mucosa intestinal sana y en los adenomas de ratones APCA14 de 3.5 meses, cuantificados mediante radioinmunoensayo. (B) Inmunotransferencia representativa de progastrina en extractos proteicos de mucosa intestinal sana y de adenoma (50 |i g) procedentes de ratones APCA14 de 3.5 meses tratados con ARNic específico del gen Luc o del gen GAST, en comparación con ratones de control del mismo antecedente genético (actualmente no hay ningún RIA para cuantificar progastrina murina). Las películas se expusieron durante 30 min. Histograma, cuantificación de PG en adenomas recogidos en el colon y el íleon de 4 animales por grupo, expresado con respecto a colon e íleon de animales C57/BL6 (para cada segmento intestinal, p < 0.05 comparado con valores respectivos en in C57/BL6# o en APCA14 Lue(-)*). (C) Células de CRC murino Colo-26 y células de colon de ratón adulto joven (YAMC) se transfectaron con ARNic dirigido contra la secuencia de GAST murina (ARNic de mGAST) o humana (ARNic de hGAST), y la expresión de ARNm de GAST se cuantificó usando RT-QPCR. (D) Gráfica de dispersión que resume los niveles de IL-6 (negro) y TNFa (blanco) en plasma en ratones tratados con ARNic de Luc o GAST. No se observaron diferencias significativas entre estos dos grupos, en el que los niveles de ambas citocinas reflejan la ausencia de inflamación.
Figura S2. Progastrina, pero no gastrina amidada o gastrina extendida con glicina, estimula la actividad transcripcional de p-catenina/Tcf-4 en células de CRC. (A) (Panel superior) la actividad transcripcional de Tcf-4 se cuantificó usando el ensayo de gen informador de luciferasa t Op /FOP (31) en células DLD-1/VO, DLD-1/ASG (clones [1] y [2]), SW480/pgalH y SW480/GASTH (clones [1] y [2]). Los valores son la media ± s.e.m. de 4 experimentos similares. Los niveles de p-catenina desfosforilada (panel central) y de Tcf-4 (panel inferior) fueron similares en todas estas estirpes celulares, como se muestra mediante inmunotransferencia (usando actina como un control de carga). (B) ARNm del receptor de gastrina amidada humano (CCK-B) se detectó mediante RT-PCR en muestras de células COS-7 transfectadas con el constructo del receptor de CCK-B, pero no en células DLD-1 y SW480 o en el control negativo (COS-7/CCK-B sin transcripción inversa).
Figura S3. La expresión de ARNm de los genes diana de Tcf-4, c-Myc, ciclina D1, Sox-9 y CLDN1, está regulada por progastrina en células de CRC humanas. Los clones [1] y [2] de SW480/GAS7T) se trataron o no con progastrina 5 nM (rPG) durante 72 h, o se transfectaron con un ADNc de preprogastrina insensible a ARNhc con codones optimizados (cPG). La expresión de ARNm de las dianas de Tcf-4 c-Myc, ciclina D1, Sox-9 y claudina-1 (en (9) hay disponible una lista de genes diana de Tcf-4) se cuantificó mediante RT-QPCR, usando como controles células SW480/pgalH. Los valores son la media ± s.e.m. de tres experimentos independientes. Prueba de la t de Student, p<0.05 (*) comparado con células SW480/GAS7T).
Figura S4. Modulación experimental de la expresión de ICAT en células de CRC. El ARNm (A) y los niveles proteicos (B) de ICAT se cuantificaron en dos clones, cada uno de células de CRC sin progastrina (SW480/gAS7T), barras blancas), transfectadas o no con ARNhc de control (SW480/GAS7t')/LucH, barras grises) o con ARNhc selectivo para ICAT (células (SW480/GAS7T)/ICATH, barras negras), así como en células SW480/GAS7t')/ICATH transfectadas transitoriamente con un ADNc de ICAT insensible a ARNhc con codones optimizados (+c.ICAT) (barras gris oscuro). (p < 0.05 comparado con SW480/GAS7t')/LucH (*), o comparado con SW480/GAS7«/ICAT(->(#>, prueba de la t de Student, n = 3).
Figura S5. La expresión elevada de genes diana de Tcf-4 en adenomas intestinales procedentes de ratones APCA14 se reduce tras el tratamiento con ARNic dirigido contra progastrina. Ratones APCA14 de 3 meses se trataron durante dos semanas con ARNic dirigido contra el gen Ga S I murino o el gen de luciferasa, como en la figura 1. Los adenomas intestinales se procesaron para la extracción proteica, y la expresión de las dianas de Tcf-4 ciclina D1 (parte superior), c-Myc (parte central) y CD44 (parte inferior) se cuantificó tras la inmunotransferencia Western en adenomas (Ad) y epitelio macroscópicamente intacto (Ep) procedente de los mismos animales, en comparación con epitelio intestinal de ratones de control procedente del mismo antecedente genético (en la figura 5B se muestra la inmunotransferencia representativa). Los valores representan medias ± sem de adenomas de 4 animales/grupo. Para cada segmento intestinal, p < 0.05 comparado con los valores respectivos en C57/BL6# o en APCA14 Luc(-)*).
Figura S6. Población de pacientes usada para la microdisección por captura activada por láser de muestras de colon. (A) Microfotografías representativas de tejidos de colon sanos y tumorales típicos antes de (original) y después de la microdisección por captura activada por láser (microdiseccionado). (B) Características de la población de pacientes usada para determinar los niveles de expresión del gen G A S I e ICAI, incluyendo la puntuación de patología de su tumor según la clasificación TNM. La localización del tumor se representa como PC (colon proximal), MC (colon central), DC (colon distal), colon sigmoideo, o recto. La metástasis en el momento de la cirugía (MS), la metástasis en una etapa posterior (M), y pacientes fallecidos (DC) se proporcionan con el siguiente código (0: No; 1: Sí).
Figura S7. La inhibición farmacológica de PI3K inhibe la actividad transcripcional de Tcf-4 en células SW480/pgalH. Células SW480/pGalH se trataron o no con LY294002 10 |i M, y se cuantificó la actividad de Tcf-4 como se describió anteriormente. Los valores son la media ± s.e.m. de tres experimentos independientes. Prueba de la t de Student, p < 0.05 (*) comparado con células SW480/pgalH sin tratar.
Ejemplos
Ejemplo 1
En la siguiente descripción, todos los experimentos de biología molecular para los cuales no se proporciona un protocolo detallado se llevan a cabo según el protocolo estándar.
Sumario
Antecedentes y objetivos: La activación aberrante del complejo transcripcional de p-catenina/Tcf-4 representa un suceso iniciador para la carcinogénesis colorrectal, desplazando el balance desde la diferenciación hacia la proliferación en criptas colónicas. En la presente memoria, se evaluó si la progastrina endógena, codificada por un gen diana de este complejo, fue capaz a su vez de regular la actividad de p-catenina/Tcf-4 en células con APC mutado, y se analizó el impacto del agotamiento de progastrina tópica en el crecimiento de tumor intestinal in vivo.
Métodos: Se indujo el silenciamiento estable o transitorio del gen GAST mediante ARN en células tumorales humanas y en ratones portadores de una mutación heterocigota de Apc (APCA14), que sobreexpresan progastrina pero no gastrina amidada o gastrina extendida con glicina.
Resultados: El agotamiento de la producción de progastrina endógena disminuyó fuertemente el crecimiento de tumor intestinal in vivo, a través de una notable inhibición de la actividad constitutiva de p-catenina/Tcf-4 en células tumorales. Este efecto estaba mediado por la expresión de novo del inhibidor de p-catenina y Tcf-4 (ICAT), que resulta de una disminución de cinasa ligada a integrina (ILK) en células sin progastrina. En consecuencia, la disminución de ICAT correlacionó con la sobreexpresión de progastrina y la activación de los genes diana de Tcf-4 en tumores colorrectales humanos, y se detectó represión de ICAT en el epitelio de colon de ratones que sobreexpresan progastrina propensos a tumores. En ratones APCA14, el agotamiento de progastrina mediado por ARNic no solo redujo el tamaño y los números de tumores intestinales, sino también incrementó la diferenciación de la estirpe de células calciformes y aumentó la apoptosis celular en los adenomas restantes.
Conclusiones: De este modo, el agotamiento de progastrina endógena inhibe in vivo la tumorigenicidad de células de CRC con APC mutado al promover la expresión de ICAT, contrarrestando de ese modo la actividad de Tcf-4. Las estrategias dirigidas contra progastrina deberían proporcionar una perspectiva excitante para la terapia de diferenciación de cáncer colorrectal.
Introducción
En años recientes se han desarrollado diversas estrategias dirigidas a reducir el desarrollo tumoral a través de la inducción de la diferenciación de las células tumorales, proporcionando resultados muy prometedores en modelos de animales y en pacientes humanos. En particular, el uso de ácido todo-trans-retinoico ha demostrado ser extremadamente útil en el tratamiento de leucemia promielocítica aguda (Lallemand-Breitenbach et al., 2005; Wang y Chen, 2000), y se considera como un enfoque prometedor para forzar la diferenciación tumoral en cáncer de tiroides avanzado (Coelho et al., 2005). En el intestino, se han puesto grandes esperanzas en agentes que modulen dos rutas principales implicadas en el control de la proliferación y diferenciación celulares, a saber, la cascada Notch y la ruta de Wnt/B-catenina/Tcf-4 (Radtke y Clevers, 2005; van Es y Clevers, 2005).
Sin embargo, puesto que una interacción ajustada finamente entre la activación de Notch y la activación de Wnt es esencial para la homeostasis de las criptas intestinales, es probable que los enfoques dirigidos a seleccionar directamente como dianas estas rutas de señalización en tumores de colon tengan efectos adversos sobre la fisiología intestinal global. De forma ideal, tales estrategias se beneficiarían enormemente de la capacidad para identificar dianas que están selectivamente activadas, o fuertemente estimuladas, en células tumorales, mientras que están ausentes o inactivas en tejidos circundantes. Entre las dianas específicamente activadas en células tumorales intestinales, los productos del gen de gastrina (GAST) parcialmente procesados, tales como gastrina extendida con glicina y progastrina, ofrecen una perspectiva interesante para la selección selectiva como diana del crecimiento tumoral. De hecho, el propio gen GAST es una diana tanto de Tcf-4 como de K-Ras (Chakladar et al., 2005; Koh et al., 2000), dos rutas que están frecuentemente activadas y que actúan sinérgicamente en cánceres colorrectales (Janssen et al., 2006), y estos péptidos derivados de GAST parecen estimular la proliferación vía un bucle autocrino/paracrino en células tumorales (Hollande et al., 1997; Hollande et al., 2003). El efecto proliferativo de Ggly se descubrió durante los últimos pocos años (Seva et al., 1994), y más recientemente, se mostró que progastrina estimula la proliferación (Ottewell et al., 2005; Singh et al., 2000) y modula la adhesión célula/célula y la migración de células epiteliales (Hollande et al., 2003; Hollande et al., 2005). Además, surgieron resultados opuestos de experimentos que usan animales con una supresión buscada del gen GAST. De hecho, esta supresión potenció enormemente la tumorigénesis inducida mediante un carcinógeno químico, el azoximetano (Cobb et al., 2002), mientras que dio como resultado un menor número de pólipos en el antecedente genético de ratones APc+/min (Koh et al., 2000). Además, proporcionaron poca información relativa al potencial para tratamientos que alteran la función de estos péptidos para ralentizar o invertir el crecimiento de tumores preexistentes. Críticamente, la prograstrina es producida y segregada en cantidades significativas por casi el 80% de tumores colorrectales humanos y estirpes celulares tumorales, mientras que su secreción cae prácticamente por debajo de los niveles de detección en condiciones fisiológicas (Ciccotosto et al., 1995; Konturek et al., 2002; Siddheshwar et al., 2001; Van Solinge et al., 1993). Por lo tanto, puesto que la activación constitutiva de la ruta de señalización de Wnt representa un signo distintivo de CRC esporádico, así como de la afección hereditaria de poliposis adenomatosa (Fodde et al., 2001), y puesto que el propio gen GAST es una diana de Tcf-4, se investigó si la progastrina fue capaz, a su vez, de modular la tumorigénesis motivada por la mutación de APC, y si la selección como diana de progastrina podría representar una estrategia relevante para reducir el crecimiento de tumores intestinales.
Se muestra que el agotamiento de progastrina mediado por la interferencia por ARN fue capaz de inhibir el crecimiento tumoral inducido por una mutación del gen APC in vivo. Se demuestra entonces que esta inhibición reflejó la capacidad de progastrina para modular el nivel de actividad transcripcional de p-catenina/Tcf-4 en células tumorales, a pesar de su activación constitutiva disparada por la mutación de APC. La expresión de novo del inhibidor de la unión de p-catenina y Tcf-4 (ICAT) fue decisiva para inhibir la ruta transcripcional de p-catenina/Tcf-4 y para disminuir la tumorigenicidad en células tumorales sin progastrina, mientras que se detectó represión de ICAT en mucosa colónica de ratón que sobreexpresa progastrina, y en tumores intestinales humanos y de ratón. Finalmente, el tratamiento con ARNic específico de GAST indujo una diferenciación terminal con respecto a la estirpe de células calciformes, no solo de células de CRC humanas in vitro, sino también de los adenomas intestinales que segregan progastrina de ratones portadores de una mutación heterocigota del gen Apc.
Resultados
El agotamiento de progastrina invierte el crecimiento tumoral inducido por mutaciones de APCin vivo
Para evaluar si una estrategia dirigida a actuar selectivamente sobre progastrina endógena en tumores preexistentes sería capaz de antagonizar in vivo el crecimiento tumoral promovido por Tcf-4, se usaron xenoinjertos de ratones atímicos Balb/c procedentes de la estirpe celular colorrectal SW480 (Morin et al., 1997), así como un modelo de ratón de tumorigénesis intestinal espontánea, APCA14 (Colnot et al., 2004). Similar a lo que se encuentra en una mayoría de tumores colorrectales humanos (Korinek et al., 1997), estos dos modelos experimentales son portadores de mutaciones de APC, y en consecuencia presentan una activación constitutiva de la ruta de p-catenina/Tcf-4.
Se mostró que las células del control SW480/pgalH y DLD-1/VO expresan niveles elevados de progastrina, pero poco de las formas amidada y extendida con glicina de gastrina (Tabla 1). Dentro de las 7 semanas de inyección subcutánea en ratones atímicos Balb/c, estas células produjeron tumores grandes (figura 1B). Por el contrario, la capacidad para formar tumores en el mismo período de tiempo se redujo enormemente cuando la secreción de progastrina se disminuyó mediante la expresión estable de a Rn de horquilla corto (ARNhc), dirigido contra el gen GAST (células SW480/GAS7t'), Figura 1A-B). Se obtuvieron resultados similares tras la inyección de células de cáncer colorrectal DLD-1 previamente caracterizadas (Hollande et al., 2003) que expresan ADNc del gen GAST antisentido (figura 1B).
Tabla 1:
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A continuación, se demostró que la inhibición de progastrina disminuyó el crecimiento de tumores intestinales preexistentes en un contexto patológicamente más relevante, usando ratones APCA14. Estos animales tienen una mutación truncante similar del gen Apc a la encontrada en poliposis adenomatosa familiar humana y en pacientes con cáncer colorrectal esporádico. También recapitulan parcialmente el fenotipo de epitelio intestinal encontrado en estos pacientes, puesto que desarrollan tumores espontáneos en el íleon, pero también más tumores de colon que el modelo APCmin+/_ (Colnot et al., 2004). Los ratones APCA14 de tres meses siempre presentan múltiples adenomas en el íleon y el colon (dato no mostrado), y se encontró que los niveles de progastrina, pero no los de gastrina amidada o de gastrina extendida con glicina, son elevados en estos adenomas (figura S1). Por lo tanto, estos animales nos proporcionan un modelo in vivo ideal para estudiar específicamente el papel de la modulación de progastrina en el crecimiento tumoral promovido por Tcf-4.
El tratamiento diario durante dos semanas con ARNic dirigido contra el gen GAST murino (APCA14/GAS7t')), que se mostró previamente que es eficaz en células de ratón (figura S1), indujo una reducción en la expresión del gen GAST y de progastrina en adenomas intestinales, en comparación con la encontrada tras el tratamiento con un ARNic específico de luciferasa (APCA14/LucH) (figura 1C-D, y S1). En correlación con la expresión reducida de GAST, se detectó una reducción significativa en el tamaño tumoral en el intestino de animales APCA14/GASTt'), en comparación con los controles (chi cuadrado, p < 0.0001, n = 9 por grupo). Esta reducción era particularmente señalada en el íleon (figura 1C), pero fue visible una tendencia similar en el colon, aunque sin alcanzar significancia debido al número más pequeño de tumores situados en esta área (prueba exacta de Fischer, p = 0.228) (figura 1D). Además, se detectó en general una disminución del 20% en el número total de tumores intestinales en ratones APCAM/GAST^, en comparación con animales del control. En particular, esta reducción fue drástica en dos animales del grupo APCAM/GAST^, en los que se encontró que el íleon o el colon estaban libres de tumores. Por el contrario, el tratamiento con ARNic específico de GAST fracasó a la hora de disminuir los niveles del gen GAST en un ratón del mismo grupo, y este animal presentó un número y tamaño similar de tumores a los encontrados en los controles (figura 1C). Por lo tanto, aunque la eficiencia de la disminución mediada por ARNic de la producción de progastrina varió entre los animales APCAM/GAST^, los tamaños y números de tumores se redujeron consistentemente en ratones que presentan niveles reducidos de progastrina.
Tomados juntos, estos resultados muestran que la secreción de progastrina es esencial para la tumorigenicidad de células de CRC humanas con APC mutado, y que un tratamiento que inhibe la producción de progastrina in vivo disminuyó fuertemente el crecimiento tumoral en un modelo de ratón que recapitula las etapas tempranas de poliposis adenomatosa y tumorigénesis colorrectal humana.
La progastrina modula el nivel de actividad transcripcional de p-catenina/Tcf-4 en células tumorales intestinales con APC mutado.
Puesto que se mostró que la selección de progastrina como diana inhibió el crecimiento tumoral en dos modelos de tumor intestinal con APC mutado diferentes, se postula que este efecto fue debido a la capacidad de la progastrina para modular los niveles de actividad del complejo transcripcional de p-catenina/Tcf-4, que se sabe que está activado constitutivamente por la mutación de APC. Esta actividad, cuantificada mediante transcripción de un gen informador de luciferasa (TOP/FOP) (Korinek et al., 1997), fue de hecho elevada en células del control (SW480/pgalH), pero se inhibió significativamente en clones sin progastrina (figura 2A), sin modulación detectable de los niveles de p-catenina o Tcf-4 (figura S2). Se obtuvo un resultado similar en células DLD-1 previamente establecidas (Hollande et al., 2003) que expresan un ADNc de GAST antisentido (figura S2). Se encontró que el tratamiento con progastrina recombinante 5 nM, pero también progastrina endógena producida mediante expresión de un constructo de preprogastrina insensible a ARNhc con codones optimizados en clones SW480/GASTH, restauran un fuerte nivel de transcripción del gen informador de luciferasa, confirmando que la progastrina es capaz de estimular esta ruta transcripcional (figura 2A). Además, la tinción inmunofluorescente indicó que la reducción de la actividad de p-catenina/Tcf-4 correlacionó con una marcada reducción en las cantidades nucleares de Tcf-4 y p-catenina desfosforilada en células SW480/GASTH, y el tratamiento de estas células con progastrina recombinante 5 nM restauró parcialmente la compartimentación nuclear de p-catenina y Tcf-4 (figura 2B). De forma similar, la expresión de varios genes diana de Tcf-4 (c-myc, ciclina D1, Sox-9 y claudina-1) (Blache et al., 2004; van de Wetering et al., 2002) se redujo considerablemente tras el agotamiento de progastrina, y se estimuló significativamente mediante la reexpresión de progastrina o mediante tratamiento con el péptido recombinante (figuras 2C y S3). Por el contrario, el tratamiento con gastrina17 amidada o extendida con glicina, o con el antagonista L365, 260, del receptor de gastrina amidada (CCK-B), no afectó la actividad de p-catenina/Tcf-4 en estas células (figura S2), indicando que las formas procesadas cortas de gastrina fueron incapaces de imitar la regulación de la actividad de p-catenina/Tcf-4 por progastrina en estas células.
Los datos anteriores demuestran claramente que la progastrina producida mediante células de CRC SW480 estimula la actividad del complejo de p-catenina/Tcf-4. También muestra que el bloqueo de la producción de gastrina da como resultado una fuerte inhibición de esta ruta transcripcional, a pesar de su activación constitutiva en células con APC mutado.
El inhibidor de p-catenina y Tcf-4 (ICAT) es el interruptor molecular que media la modulación de la activación de pcatenina/Tcf-4 por progastrina.
A partir del estado mutado del gen APC en las células de CRC usadas, y puesto que la compartimentación nuclear de Tcf-4 y p-catenina se alteró significativamente en células sin progastrina (figura 2A), se teorizó que la menor actividad de p-catenina/Tcf-4 podría resultar de una mayor interacción de p-catenina con otra de sus parejas. Una de estas parejas, ICAT (inhibidor de p-catenina y Tcf-4), se identificó recientemente como un inhibidor directo de la asociación entre estas dos proteínas (Tago et al., 2000), y es responsable de la menor proliferación y mayor muerte celular cuando se sobreexpresa en células DLD-1 y SW480 (Sekiya et al., 2002). El agotamiento de progastrina indujo una fuerte expresión de ARNm y de proteína de ICAT en células SW480/GASTH (figura 3A y B), mientras que la expresión de otra pareja de unión de p-catenina, la E-cadherina, no se vio afectada (dato no representado). La represión de novo de ICAT fue inducida por la reexpresión del ADNc de preprogastrina insensible a ARNhc (figura 3A y B), así como después del tratamiento con progastrina recombinante 5 nM (dato no representado).
Además, la expresión de ICAT fue mucho más débil en el epitelio colónico de ratones transgénicos que presentan sobreexpresión intestinal específica de tejidos de progastrina humana (Tg/Tg) (Cobb et al., 2004) que la detectada en sus compañeros de camada de tipo salvaje (figura 3C). Puesto que la progastrina expresada por estos ratones está mutada, y por lo tanto es insensible a enzimas de procesamiento (Cobb et al., 2004), este resultado demuestra que la progastrina de longitud completa es también capaz de disminuir in vivo la expresión de ICAT.
De este modo, progastrina endógena es capaz de reprimir la expresión de ICAT in vitro e in vivo, y el agotamiento de progastrina en células de CRC es suficiente para inducir una fuerte expresión de novo de este inhibidor.
Por lo tanto, se investigó si ICAT fue ciertamente la diana molecular implicada en la regulación de p-catenina/Tcf-4 por progastrina en células de CRC. Usando coinmunoprecipitación, se detectó un incremento significativo en la asociación entre p-catenina desfosforilada e ICAT en células SW480/GASTH sin progastrina (figura 4A), en paralelo con la aparición de colocalización citoplásmica de estas dos proteínas (figura 4B). Por el contrario, la cantidad de Tcf-4 que coinmunoprecipita con p-catenina desfosforilada disminuyó significativamente en comparación con SW480/p-galH (figura 4A). A su vez, p-catenina se unió de nuevo preferentemente a Tcf-4 después del tratamiento de las células SW480/GASTH con progastrina recombinante, mientras que se redujo la unión a ICAT y la colocalización de estas dos proteínas (figura 4A-B).
Para confirmar que la represión de ICAT en células sin progastrina era funcionalmente responsable de la inhibición de la actividad transcripcional de p-cat/Tcf-4, se evitó experimentalmente la expresión de novo de ARNm y de proteína de ICAT en células SW480/GAS7T), usando la expresión de ARNhc conducida por retrovirus (figura S4). Se encontró que la activación del complejo transcripcional de p-catenina/Tcf-4 se restauró en las células SW480/GAS7T)/ICATH resultantes (figura 4C), que también presentaron una mayor expresión de genes diana de Tcf-4 (figura 4D). A su vez, este incremento se evitó mediante la sobreexpresión de una versión con codones optimizados de ADNc de ICAT en células SW480/GAS7T)/ICATH (figuras 4C, 4D y S4), demostrando en este proceso la especificidad de ICAT.
Estos resultados indican que la modulación de los niveles de expresión de ICAT es el suceso molecular principal que subyace a la regulación de la actividad de pcatalizador/Tcf-4 por progastrina.
In vivo, se detectaron niveles bajos de ICAT (figura 5A y 5C) y una expresión elevada de los genes diana de Tcf-4 (figura 5B-C, y figura S5) en los tumores intestinales que sobreexpresan progastrina de animales APCA14. Por el contrario, la expresión de ICAT estaba significativamente incrementada en adenomas recogidos de ratones tratados con los ARNic específicos de GAS7- (figura 5A-C), concomitantemente con una fuerte expresión de genes diana de Tcf-4. De forma interesante, se encontró que la expresión de ciclina D1, c-Myc y CD44 en el epitelio macroscópicamente sano de ratones APC3,14/LucH es elevada cuando se compara con animales GAS7~\ sugiriendo que la mutación de un único alelo de Apc es suficiente para incrementar parcialmente la expresión de genes diana en los intestinos de APCA14, y que el agotamiento de progastrina ya es eficaz para reducir la actividad de Tcf-4 en este marco precanceroso (figura 5B y figura S5).
Además, los niveles de ARNm de GAST en tumores de colon humanos microdiseccionados y en muestras sanas equivalentes obtenidas de 23 pacientes con CRC (figura S6) aumentaron hasta diversos grados en los tumores de 78% de pacientes estudiados (18/23) (figura 5D, gráfica superior), mientras que la expresión de ICAT se redujo en las muestras tumorales correspondientes (figura 5D, gráfica inferior). Se encontró una correlación estadística significativa en general entre la mayor expresión del gen GAST y la represión de ICAT (coeficiente de correlación de Spearman: r = -0.46, p = 0.027), corroborando la relevancia de la represión de ICAT inducida por progastrina in vivo (figura 5D, inserto). Esta correlación se confirmó mediante inmunohistoquímica en muestras de pacientes con expresión baja (por ejemplo paciente 22) o alta (por ejemplo paciente 4) de progastrina, que muestra que ICAT estaba reprimido, y que la inmunorreactividad para los genes diana de Tcf-4 fue fuerte en tumores que expresan niveles elevados de progastrina, mientras que estos patrones de expresión se invirtieron en tumores con baja progastrina (figura 5E). Se obtuvieron resultados similares en muestras de CRC procedentes de los 11 pacientes ensayados mediante inmunohistoquímica, y esta correlación refleja la correlación inversa entre los niveles de ICAT y la actividad de p-catenina/Tcf-4 observada in vitro.
En general, estos resultados demuestran que, a pesar de la activación constitutiva del complejo de p-catenina/Tcf-4 en células con APC mutado, la actividad de esta ruta se puede inhibir mediante agotamiento de progastrina a través de una reexpresión del inhibidor ICAT, in vivo e in vitro. Por lo tanto, estos resultados también proporcionan la primera demostración de una regulación hormonal de ICAT, un pequeño inhibidor de la unión de p-catenina a Tcf-4 (Tago et al., 2000) descrito previamente como un supresor de tumores (Daniels y Weis, 2002).
La restauración de la expresión de ICAT es responsable de la menor tumorigenicidad inducida por agotamiento de progastrina en células de CRC.
A partir del papel esencial desempeñado por la activación constitutiva de la actividad transcripcional de pcatenina/Tcf-4 en la tumorigénesis del colon, y puesto que los presentes resultados indican que la reexpresión de ICAT fue la responsable de la menor transcripción mediada por Tcf-4 en células tumorales sin progastrina, se investigó in vitro e in vivo el papel de la represión de ICAT como un componente esencial de la actividad promotora de tumores de progastrina.
In vitro, se encontró que la inhibición de la reexpresión de ICAT en células SW480/GAS7t')/ICAT(') potencia su capacidad para el crecimiento, independiente del anclaje, en un ensayo de crecimiento en agar blando, hasta un nivel similar al encontrado para células SW480/p-GalH (figura 6A). In vivo, la capacidad de las células SW480/GAS7t')/ICAT(') para formar tumores tras la inyección en ratones atímicos BALB/c fue mucho mayor que aquella de las células SW480/GAS7t')/Luc(') (figura 6B), y fue similar a las células SW480/p-GalH (ver la figura 1B).
En general, estos resultados demuestran claramente que la represión de ICAT por progastrina endógena en células de CRC es fundamental para la actividad promotora de tumores de esta prohormona. Críticamente, también muestran que la expresión de novo de ICAT inducida por el agotamiento de progastrina es suficientemente fuerte para inducir una inhibición significativa de la actividad de p-catenina/Tcf-4 y disminuir de ese modo el crecimiento tumoral in vitro e in vivo.
La activación de cinasa ligada a integrina mediada por fosfatidilinositol 3 cinasa es responsable de la represión de ICAT y de la modulación de la ruta de p-catenina/Tcf-4 por progastrina.
Puesto que se mostró recientemente que progastrina activa la ruta de fosfatidilinositol 3 cinasa (PI3K) en células intestinales in vitro (Hollande et al., 2003) e in vivo (Ferrand et al., 2005), se determinó si la activación de esta enzima fue necesaria para la represión de ICAT inducida por progastrina y para la estimulación de la actividad de P-catenina/Tcf-4 en células SW480.
En primer lugar, se encontró que la incubación de células SW480/pgalH con el inhibidor selectivo de PI3K LY294002 fue suficiente para inducir la expresión de ICAT (figura 7A), y para reducir la actividad transcripcional de P-catenina/Tcf-4 (figura S7), resolviendo así una relación previamente desconocida entre estas dos rutas. Por el contrario, la inhibición farmacológica de la ruta de Src o de ERK1/2 usando PP2 10 |iM o PD98059 1 |iM, respectivamente, no afectó a la expresión de ICAT o a la actividad de P-catenina/Tcf-4 (dato no mostrado). Además, LY294002 anuló la disminución de ICAT inducida mediante un tratamiento de clones de SW480/GAS7W con progastrina recombinante (figura 7A), mostrando que la activación de PI3K es esencial para la represión de ICAT por progastrina. En consecuencia, la fosforilación de serina 473 de Akt/PKB, una diana aguas abajo de PI3K, disminuyó notablemente en células SW480/GAS7t') sin progastrina, pero se restableció tras la incubación con progastrina recombinante 5 nM (figura 7A).
Es conocido que Ser473 de Akt/PKB es una diana de fosforilación directa de cinasa ligada a integrina (ILK) (Delcommenne et al., 1998). Para determinar si la activación de ILK fue la relación molecular perdida entre progastrina y la represión de ICAT, se evaluó en primer lugar si la expresión y/o actividad de ILK estaban reguladas por progastrina en células SW480. Tanto la expresión como la actividad de ILK estaban significativamente disminuidas en células SW480/GAS7t'), y esta inhibición se invirtió parcialmente tras el tratamiento con progastrina recombinante 5 nM (figura 7B). Estos resultados se corroboran mediante datos que muestran una reducción drástica en la fosforilación de serina de integrina P1, una diana aguas abajo de ILK (Mulrooney et al., 2000) en clones de SW480/GAS7« (figura 7B).
Además, se encontró que la expresión transitoria de ILK dominante negativa (DN-ILK), que se confirmó que reprime la fosforilación de Akt/PKB, fue capaz de inducir la expresión de ICAT en células SW480/pgalH (figura 7C), indicando que esta enzima está implicada en la ruta de señalización que controla la expresión del gen de ICAT. La inhibición farmacológica de PI3K en estas células SW480/pgalH/DN-ILK no incrementó la expresión de ICAT más allá, indicando que las dos enzimas están implicadas en la misma ruta, o en rutas redundantes, en la regulación de la expresión del gen de ICAT (dato no representado).
Además, la represión de ARNm y proteína de ICAT, y la mayor fosforilación de Akt/PKB, inducida por el tratamiento de células SW480/GAS7t') sin progastrina con progastrina recombinante, se evitó mediante la inhibición dominante negativa de ILK (figura 7C). Por el contrario, la represión de ICAT mediada por ARNhc en células SW480/GAS7t') (como se muestra en la figura S4) no alteró la expresión o actividad de ILK (dato no representado), confirmando que ICAT está situado aguas abajo de ILK en la señalización mediada por progastrina.
Estos resultados demuestran claramente que las activaciones de PI3K y de ILK son fundamentales para la represión de ICAT mediada por progastrina en células de CRC.
El agotamiento de progastrina in vitro e in vivo induce la diferenciación terminal de células tumorales intestinales a lo largo de la estirpe celular de células calciformes productora de moco.
Puesto que se considera que la ruta de Wnt/B-catenina/Tcf-4 es esencial para el mantenimiento del fenotipo de células madre/progenitoras en la parte inferior de la cripta intestinal, y es vista ampliamente como un interruptor molecular entre la proliferación y diferenciación celulares (Radtke y Clevers, 2005; van de Wetering et al., 2002), se determinó a continuación si su disminución en células de CRC sin progastrina fue capaz de llevar a estas células a la diferenciación.
A partir de este papel recientemente descrito como un promotor temprano de la diferenciación celular (Chung y Eng, 2005), se analizó en primer lugar la localización de PTEN (homólogo de fosfatasa y tensina suprimido del cromosoma 10) en clones estables de SW480/GAS7t'). En sorprendente contraste con su localización predominantemente citoplásmica en células SW480/pgalH, PTEN se encontró mayoritariamente en el núcleo de clones de SW480/GAS7t') (figura 8A), una localización que se pensó que estaba asociada con su papel en la diferenciación celular (Lian y Di Cristofano, 2005).
Puesto que se espera que el proceso de desarrollar clones estables sin progastrina seleccione las células menos diferenciadas y no apoptóticas, se cuantificó en células SW480 la expresión de genes asociados con estirpes celulares intestinales terminalmente diferenciadas, tras la transfección transitoria con oligonucleótidos de ARNic etiquetados con rodamina dirigidos contra el gen G A S I o el de P-galactosidasa. Se detectó una inducción significativa en la expresión del gen Muc-2 específico de células calciformes en células SW480/GAS7t'), pero no en células SW480/p-galH, sin alteraciones detectables de los genes que codifican cromogranina A (expresada en células enteroendocrinas) o fosfatasa alcalina específica de enterocitos (figura 8B). Finalmente, la detección de la activación de caspasa-3 en células GAS7~\ y el hallazgo de que las células positivas para caspasa-3 activada también eran positivas para Muc-2 (figura 8C), indicó que el agotamiento de progastrina fue capaz de diferenciar células de CRC hacia una estirpe secretora, antes de promover su apoptosis in vitro. El tratamiento con progastrina recombinante durante 48 h invirtió estos fenotipos (figura 8C), mientras que las gastrinas amidada y extendida con glicina no tuvieron ningún efecto (no representado). Se obtuvieron resultados similares con células DLD-1 transfectadas con oligonucleótidos de ARNic específicos de GAST (no representado). De este modo, el agotamiento de progastrina fue capaz de conducir a las células de CRC hacia una diferenciación terminal y apoptosis in vitro.
Además, se buscó demostrar que la reducción de los niveles de progastrina in vivo sería suficiente también para inducir la diferenciación de tumores intestinales inducidos mediante una activación constitutiva de la ruta de pcatenina/Tcf-4. La inmunohistoquímica en muestras recogidas de ratones APCA14 tratados con los ARNic específicos de luciferasa o de GAST (verla figura 1) demostró que los pequeños adenomas intestinales y colónicos remanentes de animales APCA14/GAS7T) presentaron números enormemente incrementados de células positivas para Muc-2 y Alcina-blue en comparación con los controles (figura 8D), en línea con la mayor expresión de ICAT y la expresión reducida de c-Myc en las mismas muestras (ver la figura 5A-C). Finalmente, mientras que las células que se tiñen para caspasa 3 activada fueron muy escasas en los animales del control, se encontró que sus números eran enormemente elevados en adenomas de animales APCA14/GAS7T) (figura 8D). Estos resultados demuestran que la disminución mediada por ARNic del gen GAST es capaz de conducir a las células tumorales a la diferenciación terminal y apoptosis in vivo. Los adenomas intestinales desarrollados por ratones APCA14 no expresan formas extendidas con glicina o amidadas de gastrina. Puesto que nunca se detectaron intermedios de procesamiento de alto peso molecular mediante inmunotransferencia usando anticuerpos policlonales dirigidos contra progastrina recombinante, y puesto que se mostró que progastrina recombinante de longitud completa regula la diferenciación de células de CRC in vitro, se concluye que la diferenciación de células tumorales y el crecimiento tumoral reducido tras el tratamiento con ARNic específico de GAST son debidos mayoritariamente a concentraciones reducidas de progastrina de longitud completa.
Discusión
El presente trabajo proporciona la demostración de que el bloqueo de la producción de progastrina inhibe significativamente la “actividad transcripcional constitutiva de beta-catenina/Tcf-4 en células de CRC humanas, reduce su crecimiento independiente del anclaje in vitro así como su capacidad para formar tumores en ratones atímicos, y promueve su diferenciación y apoptosis. El agotamiento de progastrina dio como resultado la reexpresión del “inhibidor de beta-catenina y Tcf-4” (ICAT), un pequeño péptido identificado originalmente en Xenopus y que se muestra que inhibe la interacción de beta-catenina con Tcf-4 (Gottardi y Gumbiner, 2004; Tago et al., 2000). Además, el tratamiento con progastrina recombinante disminuyó ICAT e incrementó la actividad de beta-catenina/Tcf-4 en células en las que la expresión del gen GAS se había apagado previamente, confirmando que la secreción crónica de progastrina estaba implicada en el mantenimiento de un nivel elevado de activación para esta ruta en estirpes celulares de CRC. La relevancia fisiológica de la conexión descubierta en la presente memoria entre la secreción crónica de progastrina y la represión de ICAT se subrayó in vivo mediante resultados que muestran una estrecha correlación entre estos dos sucesos en tumores colorrectales en un panel de 16 pacientes con CRC, y mediante la demostración de que la expresión de ICAT disminuyó en el epitelio colónico de ratones que sobreexpresan progastrina susceptibles a tumores (Cobb et al., 2004).
Este dato es consistente con la observación previa de que la progastrina promueve el desarrollo de tumores colorrectales, y proporciona una explicación molecular para la fuerte reducción en el número y tamaño de adenomas observada en ratones APCmin+/' con deficiencia de gastrina (Koh et al., 2000). Además, el perfil de expresión de genes diana en células parietales gástricas procedentes de ratones con una mutación nula en el gen g As , en comparación con ratones de tipo salvaje de un antecedente similar, mostró que 20% de genes expresados diferencialmente también se sabía que eran genes diana para Wnt y Myc, subrayando la conexión entre estas dos rutas de señalización (Jain et al., 2006).
Es de señalar que, aunque la mayor expresión de progastrina en CRC está bien documentada (Ciccotosto et al., 1995; Konturek et al., 2002; Siddheshwar et al., 2001; Van Solinge et al., 1993), la represión de ICAT descrita en el presente trabajo entra en conflicto con el único informe previo referido a este campo (Koyama et al., 2002). Esta discrepancia podría ser debida al hecho de que la mayor expresión de ICAT dada a conocer por Koyama et al. fue medida usando RT-PCR semicuantitativa en tejido no microdiseccionado. Los presentes resultados, que permiten una comparación directa de la expresión de ICAT por células de origen epitelial en la mucosa sana y en tumores, parecen ser más consistentes con el papel descrito para ICAT como un supresor de tumores. De hecho, la represión de ICAT mediada por progastrina aparece esencial para el crecimiento tumoral, puesto que se mostró que ICAT nuevamente sintetizado en células de CRC sin progastrina compite con Tcf-4 por la unión a betacatenina, dando como resultado una menor actividad transcripcional de Tcf-4 y una menor tumorigenicidad, de acuerdo con datos previamente dados a conocer referidos a este péptido (Sekiya et al., 2002).
La capacidad para restablecer, si bien incompletamente, la represión de ICAT, y la activación de la ruta de betacatenina/Tcf-4 mediante tratamiento con progastrina exógena, avala la existencia de un bucle autocrino/paracrino mediado por un receptor de membrana. El análisis de los sucesos de señalización implicados en la modulación mediada por ICAT de la actividad de beta-catenina/Tcf-4 por progastrina permitió identificar una nueva conexión entre las rutas de beta-catenina/Tcf-4 y PI3Cinasa/ILK en células de CRC. De hecho, la inhibición farmacológica de PI3K y la interrupción de la señalización de ILK inducida de forma dominante negativa incrementó la expresión de ICAT y evitó la represión de este péptido mediada por progastrina. Los resultados previos por Tan et al. (Tan et al., 2001) demostraron que la inhibición de ILK suprimió la transcripción dependiente de beta-catenina-Tcf/Lef, a través de la represión de Snail, incrementando de ese modo la expresión de E-cadherina y el reclutamiento de beta-catenina en la membrana en células de carcinoma de colon humanas con APC mutado. Los resultados del presente trabajo indican que incluso en células no confluentes, en las que el reclutamiento membránico de betacatenina es bajo, la señalización de ILK mediada por progastrina es capaz de modular la actividad de betacatenina/Tcf-4 a través de un control de la expresión de ICAT.
Finalmente, los presentes resultados también muestran que los agentes que antagonizan las funciones de progastrina proporcionan nuevas opciones terapéuticas para apoyar el presente enfoque quirúrgico en cáncer colorrectal. Los resultados presentados en la presente memoria muestran que la inhibición de la señalización de progastrina proporciona una alternativa terapéutica específica para el manejo de cáncer de colon. Puesto que progastrina parece ser segregada únicamente por el tumor y no por el epitelio sano, tal estrategia debería contrarrestar el efecto de las mutaciones frecuentes de APC y disminuir la activación de la señalización de betacatenina/Tcf-4 próxima a niveles fisiológicos, promoviendo de ese modo la conservación de la integridad de la cripta normal.
Métodos
Células y condiciones de cultivo celular
Las estirpes celulares de cáncer colorrectal DLD1 y SW480 se mantuvieron a 37°C en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Eurobio, Les Ulis, Francia), 1% de L-glutamina y penicilina/estreptomicina.
Materiales
Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-beta-catenina desfosforilada de ratón (clon 8E4; AG. Scientific), anti-beta-catenina y anti-E-cadherina de ratón (Transduction Laboratories), anti-Tcf-4 de cabra (Santa Cruz Biotechnology), anti-ICAT de conejo (un regalo generoso de Dr C. Gottardi; (Gottardi y Gumbiner, 2004)), anti-PTEN policlonal (Upstate), anti-fosfoserina de conejo (Zymed), anti-ILK de conejo para transferencia western (Cell Signaling) y para inmunoprecipitación (Upstate), anti-integrina p i de ratón (Chemicon), anti-Akt de conejo, anti-Akt fosforilada en Ser473, anti-caspasa-3 activada (Cell Signaling), anticuerpo monoclonal Anti-Muc2 (Neomarkers),
Recogida de tejido humano
Los especímenes de tumores de colon y de epitelio histológicamente normal (tomado a una distancia significativa del tumor) procedentes de 16 pacientes se obtuvieron del patólogo tras la extirpación según las normas del gobierno francés y directrices de los comités locales. Se obtuvo la autorización por escrito de todos los pacientes. Las muestras tisulares se almacenaron en nitrógeno líquido hasta el uso posterior.
Secciones tisulares, microdisección y reparación del ARN
Las secciones tisulares se prepararon a partir de muestras tumorales congeladas en nitrógeno líquido, y se llevó a cabo la tinción con hematoxilina/eosina para evaluar su calidad, orientación dentro del tejido, y contenido epitelial. La detección inmunofluorescente de beta-catenina, Tcf-4, c-myc e ICAT se llevó a cabo en secciones adyacentes a las usadas para microdisección.
Se llevó a cabo la microdisección por captura activada por láser (LCM) en cuatro a seis secciones por muestra usando un microdiseccionador PixCell® IIe de Arcturus (Alphelys, Plaisir, Francia). Se usaron los siguientes ajustes del haz del láser: 265 mV, 45 mWh, diámetro de 15fam, 18 ms. Los tejidos microdiseccionados se recogieron entonces directamente en amortiguador de lisis de ARN, y se preparó ARN usando el RNAeasy Microkit (Qiagen, Courtaboeuf, Francia), según las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad del ARN recuperado se evaluaron usando RNA pico Labchips (Agitent Technologies, Palo Alto, California).
Transfección estable
La transfección del ADNc antisentido del gen de gastrina y del ADNc de control en estirpes celulares DLD1 se describió en (Hollande et al., 2003). Con el fin de generar ARNhc de progastrina, se clonaron los siguientes oligonucleótidos en el vector pSilencer (Ambion), y se transfectaron en células SW480: sentido: 5'-GAAGAAGCCTATGGATGGATTCAAGAGAAGGTAGGTATCCGAAGAAGTTTTTT-3' (SEC ID N°1) y antisentido: 5'-AATTAAAAAACTTCTTCGGATACCTACCTTCTCTTGAATCCATCCATAGGCTT CTTCGGCC 3' (SEC ID N°2).
Los oligonucleótidos de p-galactosidasa usados para generar ARNhc de control fueron: sentido: 5' GATCCCAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTCAAGAGAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTTTTTTG GAAA-3' (SEC ID N°3); antisentido: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAAGGCCAGACGCGAATTATTTTCTCTTGAAAAATAATTCGCGTCTGGCCT TGG-3' (SEC ID N°4). Se sembraron 5 X 104 células/pocillo y se transfectaron 24 h más tarde con 500 ng de pSilencer/ARNhc de progastrina o con pSilencer/ARNhc de p-galactosidasa, 50 ng de pCDNA-3, y 5 |il/pocillo de Exgen 500 (Euromedex). La selección se llevó a cabo con neomicina (500 ng/p.1).
Transfección mediada por retrovirus de ARNhc de ICAT o luciferasa en células SW480/GASH. Los oligonucleótidos de ARNhc para ICAT sentido 5' GATCCGGATGGGATCAAACCTGACATTTTCAAGAGAAATGTCAGGTTTGATC CCATCTTTTTTG 3' (SEC ID N°5) y antisentido 5' AATTCAAAAAAGATGGGATCAAACCTGACATTTCTCTTGAAAATGTCAGGTTTGATCCCATCCG 3' (SEC ID N°6), y para luciferasa (sentido 5'GATCCGACATTAAGAAGGGCCCAGCTTTTCAAGAGAGCTGGGCCTTAATCTTTTTT 3' (SECID N°7), y antisentido S'AATTGATTAAGGCCCAGCTCTCTTGAAAAGCTGGGCCCTTCTTAATGTCG 3' (SEC ID N°8), se clonaron en pSIREN-retroQ (Clontech). La estirpe celular de empaquetamiento anfotrópico (ONX; Dr Garry Nolan, Stanford University, Stanford, California) se transfectó como se describió por Pear et al (Pear et al., 1993). El medio que contiene el virus se eliminó 48 h después de la transfección, y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min. para sedimentar el desecho celular. Las células diana (2.105/pocillo, en placas de 6 pocillos) se infectaron en presencia de polibreno (8 |ig/ml) con 2 ml del medio centrifugado que contiene el virus. Las células infectadas se trataron con puromicina (5 |ig/ml) con el fin de seleccionar clones positivos.
Transfecciones transitorias
El día anterior a la transfección, se sembraron células SW480 en placas de 24 pocillos (5 x 104 células/pocillo). Las células se transfectaron con 100 pmol de ARNhc específico de GAS o específico de p-galactosidasa, etiquetado con rodamina, y 5 |il/pocillo de Exgen 500 (Euromedex), según las instrucciones del fabricante. 48 h o 72 h después de la transfección, las células se lisaron (para inmunotransferencia y PCR), o se fijaron en paraformaldehído al 1% para inmunotinción.
Tinción con Alcian blue
72 h después de la transfección, las células en un cubreobjetos se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 min. con Alcian blue (10 g/l en ácido acético al 3%). Tras aclarar las células en agua, los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos de vidrio en mowiol, y se almacenaron a 4°C hasta el uso.
RT-PCR cuantitativa
Se pretrataron 2.5 |ig de ARN total con DNAse RQ1 (Promega) durante 30 min. a 37°C y se usaron para la transcripción inversa con transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen). La PCR cuantitativa se llevó a cabo usando el kit LightCycler FastStart DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche Diagnostics, Meylan, Francia), en las siguientes condiciones:
Actina: desnaturalización durante 10 min. a 95°C, amplificación durante 50 ciclos: 10 s a 95°C, 6 s a 58°C, 11 s a 72°C. Curva de fusión: 0 s a 95°C, 30 s a 68°C, 0 s a 95°C, y el enfriamiento se realizó durante 2 min. a 40°C. Amplificación de c-myc, ILK, cromogranina A y GAPDH: desnaturalización durante 10 min. a 95°C, amplificación durante 50 ciclos: 10 s a 70°C, 6 s a 58°C, 13 s a 72°C. La curva de fusión fue 0 s a 95°C, 30 s a 80°C, 0 s a 95°C, y el enfriamiento se realizó durante 2 min. a 40°C. Amplificación de progastrina, Muc-2, ALP e ICAT: desnaturalización durante 10 min. a 95°C, amplificación durante 50 ciclos con: 10 s a 70°C, 6 s a 95°C, 11 s a 72°C. La curva de fusión fue 0 s a 95°C, 30 s a 80°C, 0 s a 70°C, y el enfriamiento se realizó durante 2 min. a 40°C. Los cebadores usados para la amplificación de los genes seleccionados fueron: GAPDH-sentido: 5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3' (SEC ID N°9) antisentido: 5'GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3' (SEC ID N°10); actina-sentido: 5'CGGGAATCTGCGTGACAT3' (SEC ID N°11); antisentido: 5'AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3' (SEC ID N°12); ILK-sentido: 5'ATGACTGCCCGAATTAGCATG3' (SEC ID N°13); antisentido: 5'GCTACCCAGGCAGGTGCATA3' (SEC ID N°14); ICAT-sentido 5'GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3' (SEC ID N°15); antisentido: 5'GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3' (SEC ID N°16) c-myc-sentido: 5'CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3' (SEC ID N°17); antisentido 5'TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3' (SEC ID N°18); progastrina humana-sentido 5'AGAGGATCCAAATGCAGCGACTATGTGTGTATG3' (SEC ID N°19); antisentido 5'GGCGAATTCCTAGGATTGTTAGTTCTCATCCTCAG3' (SEC ID N°20); Muc-2-sentido 5'TGGGTGTCCCTCGTCTCCTACA3' (SEC ID N°21); antisentido: 5'TGTTGCCAAACCGGTGGTA3' (SEC ID N°22); fosfatasa alcalina-sentido: 5'CTCCAACATGGACATTGACG3' (SEC ID N°23); antisentido: 5'CAGTGCGGTTCCACACATAC3' (SEC ID N°24); cromogranina A-sentido: 5'ATCACCGCCACTGCCACCACCA3' (SEC ID N°25); antisentido: 5'CACCTTAGTGTCCCCTTTTGTCATAGGGCT3' (SEC ID N°26).
Ensayo de formación de colonias en agar blando
Se suspendieron 1 X 105 células en agar al 0.2% en DMEM-F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de glutamina y penicilina/estreptomicina, y se sembraron en una cápsula de Petri de 6 cm que contiene una capa inferior solidificada (agar al 0.5% en medio de crecimiento). 8 días después de la siembra en placas, las células se tiñeron con violeta de cristal al 0.02%, y el tamaño y número de colonias se cuantificaron en un microscopio. Todos los clones se sembraron por triplicado, y se contaron diez campos para cada uno.
Estudios in vivo
Se llevaron a cabo experimentos in vivo siguiendo las directrices francesas para estudios con animales experimentales (Direction des Services Vétérinaires, Ministére de l'Agriculture, Agreement N° B34-172-27), y cumplieron las directrices UKCCCR para el bienestar de animales en neoplasia experimental. Se inyectaron subcutáneamente 2 X 106 células en ratones BALB/c-nu/nu (atímicos) atímicos de 6 semanas. El crecimiento tumoral fue seguido de forma regular posteriormente (volumen tumoral estimado = (longitud x anchura x grosor)/2).
Ratones APCA14 se enjaularon en condiciones convencionales y se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos. El primer grupo (n = 9) se trató una vez al día mediante administración intraperitoneal de 250 |i g/kg de ARNic contra el ARNm de GAST murino. Los ratones del control (n = 9) se trataron con una dosis similar de ARNic contra luciferasa (secuencia de ARNic en la figura S7 en línea). El diseño de los ARNic incorporó salientes en 3', y no incorporó una secuencia 5'UGUGU3', para minimizar la respuesta proinflamatoria y la degradación in vivo (Judge et al., 2005; Marques et al., 2006). Después de un tratamiento durante 10 días, los ratones se sacrificaron, se recogió su sangre, y se diseccionaron sus intestinos. La puntuación de los adenomas en el intestino y el colon se describió en (Colnot et al., 2004). Las muestras de mucosa intestinal sana, así como de adenomas intestinales y de colon, se fijaron en PFA al 4% y se embebieron en parafina, o se congelaron en nitrógeno líquido, para transferencia Western, IHC o extracción de ARN. El plasma se preparó y evaluó para IL-6 y TNFa usando el sistema FACSarray (Becton Dickinson).
Ensayo de gen informador de luciferasa
El protocolo usado para medir la actividad transcripcional de TCF/LEF-1 se describe anteriormente (Morin et al., 1997). De manera breve, las células se transfectaron con 500 ng de informador de TCF/LEF-1 (pTOP-FLASH), o con vector de control (pFOP-FLASH) y con 25 ng de pCMV-Renilla. La actividad de luciferasa se cuantificó usando el sistema de ensayo informador de luciferasa dual (Promega), y se normalizó con respecto a la actividad de Renilla.
Tinción inmunofluorescente
La tinción inmunofluorescente se llevó a cabo como se describe anteriormente (Hollande et al., 2003). Los portaobjetos se observaron entonces usando un microscopio confocal LEICA sp2 de barrido por láser, con una lente de inmersión en aceite de x40.
Inmunohistoquímica en secciones tisulares en parafina
Se prepararon secciones tisulares de parafina a partir de ratones FVB/N que eran transgénicos para el gen GAS humano (Tg/Tg) o sus compañeros de camada de tipo salvaje (Cobb et al., 2004). Tras el desparafinado y la hidratación, las secciones se pretrataron con peroxidasa durante 20 min. a temperatura ambiente. El antígeno se recuperó hirviendo las muestras durante 20 min. en 10 mM de Tris - 1 mM de EDTA, pH 9. Los portaobjetos se dejaron enfriar hasta la temperatura ambiente, y se incubaron toda la noche a 4°C con anticuerpos en PBS 0.05% de BSA. En todos los casos, el kit Envision+ (DAKO) se usó como reactivo secundario. Las tinciones se desarrollaron usando DAB (Sigma), y los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina o con rojo nuclear sólido, y se montaron.
Lisados proteicos, inmunoprecipitación, SDS-PAGE, e inmunotransferencia Western
Los lisados proteicos, las inmunoprecipitaciones y la inmunotransferencia se llevaron a cabo como se describió anteriormente (Hollande et al., 2003). Las proteínas se visualizaron usando ECL Plus (Amersham Biosciences), y las bandas se cuantificaron mediante densitometría usando ImageJ 1.32J (NIH, Bethesda, MD).
Ensayos de cinasa del complejo inmunitario
Esta reacción se inició mediante adición de 25 |il de amortiguador de cinasa (Hepes 50 mM pH 7.0, MnCh 1 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, NaF 2 mM, 5 |ig de proteína básica de mielina (Sigma)) con 0.5 |ig de ATP (ATP 250 mM, 1 |iC¡ de [y-32P]ATP) por tubo, y se incubó a 30°C durante 20 min. La reacción se terminó mediante adición de 10 |il de amortiguador de muestra 4X. Los tubos se centrifugaron a 10,000 g durante 1 min., y las proteínas se resolvieron en un gel de SDS-page al 14%. La fosforilación del sustrato se visualizó mediante autorradiografía (Marotta et al., 2003).
Radioinmunoensayo
Los productos del gen GAS, progastrina, gastrina extendida con glicina (G-gly), y gastrina amidada (G-NH2), en los sobrenadantes celulares se cuantificaron mediante radioinmunoensayo, como se describió anteriormente (Hollande et al., 1997).
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando SAS versión 9.1 para Windows (Cary, NC, USA). Se usó la prueba de la t de Student con el fin de determinar la significancia estadística de las diferencias entre células del control y células sin progastrina, con o sin tratamiento con progastrina recombinante. Con el fin de determinar la asociación entre las expresiones de los genes GAS e ICAT en tumores humanos, las variables se normalizaron usando sus valores logarítmicos naturales antes de determinar el coeficiente de correlación de Pearson (r).
Ejemplo 2
Los anticuerpos selectivos contra progastrina invierten la represión de progastrina en la expresión de ICAT, e inducen una reducción en la expresión de c-myc.
Introducción
El presente ejemplo describe la caracterización de dos anticuerpos policlonales generados independientemente contra progastrina, con el objetivo de demostrar que reconocen selectivamente el péptido de progastrina de longitud completa (1-80) pero no los péptidos procesados potencialmente presentes en la sangre humana, tales como gastrina amidada, gastrina extendida con glicina, y el péptido de flanqueo C-terminal (CFTP) de seis aminoácidos. Esta caracterización se llevó a cabo in vitro usando un ensayo ELISA.
La segunda etapa descrita a continuación fue la validación de la prueba de concepto de que los efectos de progastrina sobre la expresión de ICAT y sobre la actividad de beta-catenina/Tcf4 se pueden bloquear mediante un anticuerpo selectivo. Con el fin de demostrar esta actividad así llamada neutralizante de los anticuerpos antiprogastrina, se usaron células de tumor colorrectal SW480 humanas, que presentan una mutación en el gen apc y desempeñan secreción de progastrina endógena debido a la actividad constitutiva de beta-catenina/Tcf4. En la tabla I se describe la capacidad de estas células para segregar cantidades elevadas de progastrina y niveles muy bajos de gastrina amidada y gastrina extendida con glicina.
Estas células se trataron independientemente con dos anticuerpos policlonales diferentes, uno dirigido contra la secuencia N-terminal de progastrina, el otro contra la secuencia C-terminal.
La secuencia N-terminal fue: SWKPRSQQPDAPLGT (SEC ID N°32)
La secuencia C-terminal fue: FGRRSAEDEN (SEC ID N°31)
Resultados
- Selectividad del anticuerpo: La selectividad de los anticuerpos se evaluó mediante una prueba de ELISA descrita en la sección de Métodos. Los resultados (figura 10) muestran que ambos anticuerpos policlonales reconocen selectivamente progastrina y los péptidos respectivos usados como inmunógenos para su producción. No se unen a gastrina extendida con glicina, a gastrina amidada, o al péptido de flanqueo C-terminal (CTFP) (secuencia: SAEDEN), otro péptido derivado del proceso de maduración de progastrina y detectado en el suero humano (Smith KA, Gastroenterology 2006).
- Actividad neutralizante de anticuerpos antiprogastrina: La capacidad de los anticuerpos antiprogastrina para inhibir la represión de ICAT por progastrina y para inducir una disminución resultante en la actividad transcripcional del complejo de beta-catenina/Tcf4 se abordó en células de carcinoma colorrectal SW480. Cuando las células se incubaron durante 30 horas en presencia de anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra el extremo N-terminal o C-terminal de progastrina (1-80), ambos a una dilución 1/5000, la expresión de ARNm de ICAT aumentó enormemente, mientras que disminuyó notablemente la de c-Myc y la de ciclina D 1, en comparación con células tratadas con la misma concentración de un anticuerpo policlonal de conejo no específico. C-myc y ciclina D1 son dianas reconocidas de la actividad transcripcional de beta-catenina/Tcf4, y se considera que la disminución en su expresión es una consecuencia de la disminución en la actividad de beta-catenina/Tcf4 (figura 11).
Conclusión
Estos resultados demuestran in vitro que la inhibición de la expresión de ICAT por progastrina se puede invertir mediante su unión a un anticuerpo selectivo, dando como resultado una inhibición de la actividad constitutiva de beta-catenina/Tcf4. De este modo, por primera vez se proporciona en la presente memoria la prueba de concepto de que un anticuerpo antiprogastrina se puede usar para bloquear los efectos protumorigénicos de progastrina que aparecen vía ICAT y la actividad de beta-catenina/Tcf4.
Métodos
Elisa
Los antígenos se diluyeron a la concentración indicada en PBS, y se revistieron 100 |il de placas de 96 pocillos Multisorb a 4°C toda la noche. Al día siguiente, los pocillos se lavaron 3 veces con 200 |il de PBS/Tween 1%, y se añadieron 100 |il de la disolución de bloqueo (PBS/Tween 1%/BSA 0.1%) durante 2 horas a 22°C. Después de otros 3 lavados con PBS/Tween al 1%, los anticuerpos primarios se diluyeron en la disolución de bloqueo, y se añadieron 100 |il a los pocillos durante 2 horas a 22°C. La concentración de los anticuerpos se indica en las figuras. Los anticuerpos secundarios se diluyen en el mismo amortiguador de bloqueo, y después de 3 lavados, se añaden 100 |il a los pocillos durante 2 horas a 22°C. Finalmente, los pocillos se lavaron de nuevo con PBS/Tween 1%, y se añadieron 100 |il de sustrato de disolución de OPD durante 20 minutos a 22°C. La reacción se detuvo con 50 |il de H2SO44N, y la lectura se llevó a cabo a 492 nm.
Cultivo celular y tratamiento con anticuerpos selectivos para progastrina
La estirpe celular de CRC SW480 se mantuvo a 37°C en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Eurobio, Les Ulis, Francia), 1% de L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Las células SW480 se sembraron en placas de 6 pocillos (200,000 células/pocillo) en DMEM que contiene 10% de FBS, 1% de antibióticos y 1% de glutamina, se dejaron crecer toda la noche a 37°C, 5% de CO2, y después se privaron de suero durante 24 horas. A la mañana siguiente, el medio se sustituyó por DMEM sin f Bs que contiene una dilución 1/5,000 de anticuerpos policlonales de control o anticuerpos policlonales selectivos para progastrina, seguido de la incubación a 37°C, 5% de CO2. El medio que contiene los anticuerpos se renovó 12 horas más tarde. Después de 30 horas, las células se lavaron con PBS, y se lisaron con el amortiguador de lisis del kit de extracción de ARN.
Preparación de ARN y RT-PCR cuantitativa
Se preparó ARN a partir de células SW480 usando el RNeasy Protect Minikit (Qiagen France SA, 91974 Courtaboeuf, Francia). La calidad y cantidad del ARN recuperado se evaluaron usando RNA pico Labchips (Agilent Technologies, Palo Alto, California). Para la transcripción inversa, se pretrataron 2.5 |ig de ARN total procedente de cada muestra con DNAse RQ1 (Promega) durante 30 min. a 37°C, y se incubaron con M-MLV (InVitrogen). La PCR cuantitativa se llevó a cabo a partir de 24 de ADNc por muestra, usando el kit LightCycler FastStart DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche Diagnostics). Para calibrar la carga de ARN, se usó la expresión de ARNm de GAPDH.
Condiciones de los ciclos para PCR cuantitativa
- Para la amplificación de c-myc y GAPDH: desnaturalización durante 10 min. a 95°C, amplificación durante 50 ciclos: 10 s a 95°C, 6 s a 58°C, 13 s a 72°C. La curva de fusión fue 0 s a 95°C, 30 s a 80°C, 0 s a 95°C, y el enfriamiento se realizó durante 2 min. a 40°C.
- Para la amplificación de ICAT: desnaturalización durante 10 min. a 95°C, amplificación durante 50 ciclos con: 10 s a 95°C, 6 s a 60°C, 11 s a 72°C. La curva de fusión fue 0 s a 95°C, 30 s a 80°C, 0 s a 70°C, y el enfriamiento se realizó durante 2 min. a 40°C.
- Para la amplificación de ciclina D1: 10 min. a 95°C, amplificación durante 50 ciclos con: 10 s a 95°C, 6 s a 70°C, 11 s a 72°C. La curva de fusión fue 0 s a 95°C, 30 s a 80°C, 0 s a 95°C, y el enfriamiento se realizó durante 2 min. a 40°C.
Cebadores para la PCR cuantitativa en secuencias humanas:
GAPDH-sentido: 5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3' (SEC ID N°33)
GAPDH-antisentido: 5'GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3' (SEC ID N°34)
ICAT-sentido: 5'GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3' (SEC ID N°35)
ICAT-antisentido: 5'GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3' (SEC ID N°36)
c-Myc-sentido: 5'CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3' (SEC ID N°37)
c-Myc-antisentido: 5'TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3' (SEC ID N°38)
Ciclina Di-sentido: 5'-CCGTCCATGGGGAAGATC-3' (SEC ID N°39)
Ciclina Dl-antisentido: 5'-ATGGCCAGCGGGAAGAC-3' (SEC ID N°40)
Conclusiones generales sobre los ejemplos 1 y 2
Por primera vez, se proporcionan datos suficientes y necesarios que demuestran que el agotamiento de progastrina de células de tumor colorrectal humanas invierte la tumorigénesis, al igual que induce la diferenciación y apoptosis de células que tienen actividad constitutiva de beta-catenina/Tcf4. Estos efectos son específicos de progastrina. Esto se muestra in vitro en dos estirpes celulares (DLD-1 y SW480), así como in vivo con las mismas estirpes celulares injertadas en ratones atímicos y en un modelo de ratón que recapitula la tumorigénesis humana. De hecho, en este modelo de ratón (APCA14), el gen apc posee una mutación que conduce a la activación de la ruta de beta-catenina/Tcf4, y los ratones desarrollan espontáneamente adenomas y adenocarcinomas. Estos ratones se trataron in vivo con un ARNic dirigido contra el ARNm de preprogastrina. Esto dio como resultado una inversión de la tumorigénesis, conduciendo la diferenciación y la apoptosis a la contracción del tumor. Se muestra que este tratamiento inhibe profundamente la actividad constitutiva de beta-catenina/Tcf4. Por lo tanto, es la primera vez que se muestra que se invierte la tumorigénesis iniciada por una mutación del gen apc. A nivel molecular, se muestra que el agotamiento de progastrina tiene efectos antitumorales debido a que induce la reexpresión de ICAT, un inhibidor endógeno de la actividad transcripcional de beta-catenina/Tcf4.
En cáncer colorrectal humano, se demuestra por primera vez la aparición de una correlación entre hiperactivación de la ruta de beta-catenina/Tcf4, niveles elevados de expresión del gen de gastrina y niveles bajos de expresión de ICAT. Además, se mostró la sobreexpresión de la propia progastrina en muestras tumorales en las que los niveles del gen diana de Tcf4 están elevados. En adenomas intestinales que surgen espontáneamente de ratones APCA14, también se detectaron niveles elevados de progastrina (y no de gastrina extendida con glicina ni de gastrina amidada), y una baja expresión de ICAT. Estos parámetros se invirtieron después del tratamiento con ARNic selectivo para el gen de gastrina. Finalmente, se proporcionan datos que demuestran que el bloqueo de los efectos de progastrina también se puede lograr con anticuerpos dirigidos específicamente contra progastrina, incapaces de unirse a gastrina extendida con glicina o a gastrina.
De este modo, se proporcionan pruebas de concepto y datos científicos suficientes para el uso de ARNic, ARNhc o de anticuerpos dirigidos contra progastrina para inducir la expresión de ICAT y bloquear e invertir la tumorigénesis de colon asociada con una actividad constitutiva de beta-catenina/Tcf4.
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo que se une específicamente a la progastrina, para su utilización en el tratamiento del cáncer colorrectal.
2. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según la reivindicación 1, en el que la ruta transcripcional mediada por beta-catenina/Tcf-4 del cáncer colorrectal que es tratado está constitutivamente activa.
3. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según la reivindicación 1, en el que las células del cáncer colorrectal que es tratado contienen una mutación en su gen adenomatous polyposis coli (APC).
4. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según la reivindicación 1, en el que las células del cáncer colorrectal que es tratado contienen una mutación en su gen de beta-catenina.
5. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es selectivo para la progastrina en comparación con las formas amidada o extendida con glicina de la gastrina 17 y la gastrina 34.
6. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según la reivindicación 5, que se une a una región C-terminal de la progastrina humana.
7. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según la reivindicación 5, que se une a FGRRSAEDEN (SEC ID n°:31).
8. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según la reivindicación 5, que se une a una región N-terminal de la progastrina humana.
9. Anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo para su utilización según la reivindicación 5, que se une a SWKPRSQQPDAPLGT (SEC ID n°:32).
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