JP2014511377A - B型プレキシンのアンタゴニストおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
iRNAの相補的領域は、標的RNAへのsiRNAの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、従ってRNAiを媒介する。哺乳動物細胞では、siRNAは約21〜25ヌクレオチドの長さである。siRNA配列は、相補的な塩基対合相互作用を介してsiRNAと標的RNAを一緒に結び付けるのに十分な長さである必要がある。siRNAの長さは、好ましくは10ヌクレオチド以上で、標的RNAと安定的に相互作用するのに十分な長さであり、具体的には15〜30ヌクレオチド、さらに具体的には15および30ヌクレオチドの間の任意の整数、最も好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、および30ヌクレオチドである。「十分な長さ」とは、予想される条件下で意図した機能を提供するのに十分な長さである15ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドを意味する。「安定的に相互作用する」とは、低分子干渉RNAと標的核酸との(例えば、生理的条件下で標的中の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することによる)相互作用を意味する。一般的に、そのような相補性はsiRNAとRNA標的の間で100%であるが、必要に応じてそれより低くてもよく、好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%である。例えば、21塩基のうち19塩基が塩基対を形成すればよい。種々の対立遺伝子変異体間での選択が求められる場合には、標的配列を他の対立遺伝子配列から効果的に識別するために、標的遺伝子に対する100%相補性が必要とされる。対立遺伝子標的間で選択を行う場合、長さの選択もまた重要な要因である。というのは、長さは対立遺伝子の差異を区別する能力および相補性パーセントに関与するもう1つの要因であるからである。線虫(C. elegans)、ショウジョウバエ、植物、および哺乳動物を含めて、生物内の遺伝子をサイレンシングするためにRNAiを用いることに関する方法は、当技術分野で知られている(例えば、Fire 1998, Nature 391:806-811; Fire 1999, Trends Genet. 15, 358-363; Sharp 2001, Genes Dev. 15,485-490; Hammond 2001, Nature Rev. Genet. 2, 1110-1119; Tuschl 2001, Chem. Biochem. 2, 239-245; Hamilton 1999, Science 286, 950-952; Hammond 2000, Nature 404, 293-296; Zamore 2000, Cell 101, 25-33; Bernstein 2001, Nature 409, 363-366; Elbashir 2001, Genes Dev. 15, 188-200; WO 0129058; WO 09932619; およびElbashir 2001, Nature 411: 494-498を参照されたい)。
a) B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストであると予想される化合物を、B型プレキシンおよびErbB-2を含む細胞と、B型プレキシンとErbB-2との相互作用の防止を可能にする条件下で、接触させるステップ;および
b) 該化合物がB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止する能力があるかどうかを判定し、それによって、該相互作用が防止された場合には、該化合物をB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストとして同定するステップ;
を含んでなる。
以下の実施例は単に本発明を説明するものである。それらは、何であれ、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
1.1 抗体
次の抗体を使用した:ウサギポリクローナル抗切断型カスパーゼ3(Cell Signaling社)、ウサギポリクローナル抗CD31(Abcam社)、マウスモノクローナル抗ErbB-2(クローンE2-4001、Invitrogen社)、ウサギポリクローナル抗ホスホErbB-2[Y1248] (Cell Signaling社)、ウサギポリクローナル抗ホスホErbB-2[Y1248] (Sigma-Aldrich社)、ラットモノクローナル抗Mac-3(クローンM3/84、BD Pharmingen社)、ヤギポリクローナル抗プレキシン-B1(R&D systems社)、マウスモノクローナル抗プレキシン-B1(クローン439512、R&D Systems社)、ウサギモノクローナル抗RhoA(クローン67B9、Cell Signaling社)、ウサギポリクローナル抗RhoB(Cell Signaling社)、ウサギモノクローナル抗RhoC(クローンD40E4、Cell Signaling社)、マウスモノクローナル抗αチューブリン(Sigma社)、ヤギポリクローナル抗VSV(Thermo社)、マウスモノクローナル抗ホスホチロシン(クローン4G10、Upstate Biotechnology社)、マウスモノクローナル抗FLAG(クローンM2、Sigma社)、ウサギポリクローナル抗MYC(Sigma社)、マウスモノクローナル抗HA(クローンHA-7、Sigma社)、トラスツズマブ(Genentech社)。
ErbB-2、FLAG-PDZ-RhoGEF、MYC-RhoA、HA-R-RasおよびRnd1のヒトcDNAを保持する真核生物発現プラスミドは以前(18)に記載された。ヒトVSV-プレキシン-B1は親切にもL. Tamagnone (Torino大学, Torino, イタリア)によって提供された。HA-RhoBおよびHA-RhoCはD. Brandt (Marburg大学, Marburg, ドイツ)から得られた。ヒトErbB-2 V664Eは親切にもAxel Ullrich (マックス・プランク生化学研究所, Martinsried, ドイツ)によって提供された。配列番号2のアミノ酸1514-2135を欠くヒトVSV-プレキシン-B1ΔC (PlxB1ΔC)はPCRにより生成して、pcDNA3にクローニングした。
RNA抽出はRNeasyキット(Qiagen社)を用いてメーカーの説明書に従って行った。RT-PCRは標準試薬およびプロトコル(Fermentas社)を用いて行った。ヒト組織におけるmRNA発現を分析するために次のプライマーを使用した:プレキシン-B1 (plxnb1): 5'-CAGCCACCACTTCGTGAGTGCC-3'(センス)(配列番号6)および5'-GGTGACTGCCACAGCTGTTAGCTG-3'(アンチセンス)(配列番号5);β-アクチン: 5'-ATGGATGATGATATCGCCGCG-3'(センス)(配列番号7)および5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'(アンチセンス)(配列番号8)。マウス組織におけるmRNA発現を分析するために次のプライマーを使用した:プレキシン-B1 (plxnb1): 5'-GGTGGAAAGGTACTATGCAGACATCAG-3'(センス)(配列番号9)および5'-CCTCCTCCAGGGCAGTGATGATC-3'(アンチセンス)(配列番号10);β-アクチン: 5'-GGTGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'(センス)(配列番号11)および5'-GAGGAAGAGGATGCGGCAGTGG-3'(アンチセンス)(配列番号12)。すべてのプライマーはイントロンスパニング(intron-spanning)であった。
プレキシン-B1発現をノックダウンするために用いたsiRNAの配列は、ACCACGGUCACCCGGAUUC(配列番号3)であった(IBA社, Goettingen, ドイツ)。対照siRNAおよびErbB-2に対するsiRNAはQiagen社から購入した。
MCF-7およびBT-474細胞は、ドイツ微生物・細胞培養コレクション(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures: DSMZ, Braunschweig, ドイツ)から入手した。T-47DおよびSK-BR-3は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Manassas, USA)から入手した。SK-OV-3細胞はセルラインサービス(CLS, ドイツ)から入手した。すべての細胞株はそれぞれDSMZ、ATCCおよびCLSのプロトコルに従って培養した。BT-474細胞は、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen社)をメーカーの説明書に従って用いて、低分子干渉RNA(siRNA)でトランスフェクトした。タンパク質相互作用試験およびRhoプルダウンアッセイは、siRNAトランスフェクションの48時間後に実施した。HEK 293細胞は、リン酸カルシウム法を用いてcDNAプラスミドでトランスフェクトした。
siRNA非感受性プレキシン-B1を得るために、野生型および変異型(Y1708F/Y1732F)プレキシン-B1をコードするcDNAのコード領域の位置3855(C→T)および3858(G→A)にサイレント変異を導入した。得られた配列をレトロウイルスベクターpLNCX2 (Clontech社)にサブクローニングした。選択およびレトロウイルストランスフェクションは以前(18)に記載されたとおりに実施した。
プレキシン-B1の安定したノックダウンを有するBT-474細胞を作製するために、本発明者らは、Mission shRNAシステム(Sigma-Aldrich社)をメーカーの説明書に従って使用した。簡単に述べると、細胞にshRNAおよびピューロマイシン耐性をコードするレンチウイルスを感染させた。選択後、ノックダウンの成功をウェスタンブロット法により確認した。
ウェスタンブロット法は標準的な実験プロトコルに従って実施した。免疫沈降は氷冷した放射性免疫沈降緩衝液(150mM NaCl, 50mM Tris pH7.4, 5mM EDTA pH8.0, 1%トリトンX-100, 0.1%SDS, 0.5%デオキシコール酸ナトリウム, プロテアーゼ阻害剤および2mM Na3VO4)中で行った。
組換えヒト可溶性Sema4D (Q92854に示されるアミノ酸配列の残基1-657)は、以前(18)に記載されたとおりにチャイニーズハムスター卵巣細胞から精製した。N末端にHisタグを付加した組換えペプチド(ヒトプレキシン-B1(配列番号2)のアミノ酸35-150を含む)は、大腸菌内で発現させ、ニッケルアガロース(GenScript社, USA)を用いた金属イオンアフィニティクロマトグラフィーで精製した。このペプチドは、ヤギを免疫して本研究で用いる抗プレキシン-B1抗体を引き出すための、R&D Systems社(USA)により採用されたペプチドに対応する。ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインを生成するために、最初に、配列番号2に示されるヒトプレキシン-B1のアミノ酸残基20から1491までの完全な細胞外ドメイン(ECD)を使用しようとした。しかし、この組換えタンパク質は可溶性形態で産生可能でなかった。それゆえ、ヒトプレキシン-B1のECDの以下のトランケート型組換え体の組換え生産性および溶解性を試験して、次の結果を得た:
a) 配列番号2のアミノ酸残基20-1298 (セマフォリンドメイン、3つのPSIドメイン、および3つのIPTリピートを含む):可溶性でない;
b) 配列番号2のアミノ酸残基20-1160 (セマフォリンドメイン、3つのPSIドメイン、および1つのIPTリピートを含む):可溶性でない;
c) 配列番号2のアミノ酸残基20-1068 (セマフォリンドメインおよび3つのPSIドメインを含む):可溶性でない;
d) 配列番号2のアミノ酸残基20-678 (セマフォリンドメインおよび2つのPSIドメインを含む):生産性良好、溶解性不良;
e) 配列番号2のアミノ酸残基20-543 (セマフォリンドメインおよび1つのPSIドメインを含む):生産性良好、溶解性良好;
f) 配列番号2のアミノ酸残基20-473 (セマフォリンドメインのみを含む):生産性良好、溶解性不良。
ヒトプレキシン-B1の精製された細胞外ドメイン(配列番号2のアミノ酸20-534;実施例1.9参照)に対するモノクローナル抗体は、Koehler and Milstein (47)に記載の方法に従ってマウスにおいて生起させた。全部で1236のハイブリドーマ上清をELISAによって試験した。163のハイブリドーマ上清が、陽性シグナル、すなわち免疫に使用した組換えタンパク質への結合、を示した。これらの上清を次の能力に関してさらに試験した:ウェスタンブロットで組換えヒトプレキシン-B1タンパク質を認識する能力、Sema4Dリガンドの天然ヒトプレキシン-B1(受容体)への結合を阻害する能力、プレキシン-B1の下流エフェクターであるRhoAのSema4D誘導活性化を阻害する能力、およびプレキシン-B1を発現する細胞に結合する能力。これらのハイブリドーマ上清のうち4つ、すなわち#93、#538、#19および#527は、図11に詳しく示されるように、前記試験の1以上で陽性であった。抗体はハイブリドーマの上清からプロテインA/Gセファロースアフィニティカラムで精製した。
活性化された細胞性RhoA、RhoB、RhoCおよびR-Rasの量は、以前(18)に記載されたように、GSTと、ロテキン(Rhotekin)のRho結合ドメイン(GST-RBD)またはRaf1のRas結合ドメイン(GST-Raf1)とからなる融合タンパク質を用いた沈降によって測定した。すべてのRhoプルダウン実験は、0.5%FBSを含有する培地中で一晩飢餓させた後に実施した。細胞は、細胞溶解に先立って、Sema4Dと20分間、プレキシン-B1の組換え細胞外部分もしくはトラスツズマブと45分間、またはマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1; クローン#93, 1.8ng/μl)と60分間、インキュベートした。
増殖アッセイのために、細胞を24ウェルプレートに播種し、siRNAでトランスフェクトした。次に、細胞を5日間連続してNeubauerチャンバーを用いてカウントした(データ点あたり3ウェル)。並行して、siRNAノックダウン効率をウェスタンブロット法によりモニタリングした。遊走アッセイのために、対照shRNAまたはプレキシン-B1に対するshRNAを安定的に発現する5x104個のBT-474細胞を一晩血清飢餓させ、24ウェルプレートでThinCertフィルターインセット(孔径8.0μm)(Greiner bio-one社)上に播種し、そして20%血清に対して遊走させた。24時間後、フィルターの上面の非遊走細胞を綿棒で取り除き、遊走細胞をトルイジンブルーで染色してカウントした。浸潤アッセイのために、細胞をsiRNAトランスフェクションの24時間後に血清飢餓させた。siRNAトランスフェクションの48時間後、1x105個のBT-474細胞を増殖因子低減Matrigel浸潤チャンバー(Growth Factor Reduced Matrigel Invasion Chamber)(孔径8.0μm)(BD Biosciences社)に播種した。BT-474細胞は20%血清に対して48時間浸潤させた。フィルターの上面の非浸潤細胞を綿棒で取り除いた後、浸潤細胞をトルイジンブルーで染色してカウントした。siRNAノックダウン効率はウェスタンブロット法によりルーチンに評価した。SK-OV-3細胞を用いた浸潤アッセイでは、2.5x104個の血清飢餓細胞を10%血清に対して16時間浸潤させた。
リン酸カルシウム法を用いて、HEK293細胞は、プレキシン-B1およびPDZ-RhoGEFをコードするプラスミドと共に、3DA.Luc(三元複合体因子の結合部位を欠く変異型血清応答エレメント(SRE.L)の制御下でホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミド(48))でトランスフェクトした。トランスフェクションの36時間後、細胞を血清飢餓状態で12時間培養し、OneGloキット(Promega社)をメーカーの説明書に従って用いてホタルルシフェラーゼの活性を測定した。得られた値は、CellTiter Fluoキット(Promega社)により測定された細胞数に対して正規化した。
MCF-7細胞をマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(クローン#93)の非存在下または存在下で処理した。1時間後、細胞をPBSで洗浄し、myc-Sema4Dと共に30分間インキュベートした。未結合のSema4DをPBSで洗浄して除去し、結合したSema4DはHRPコンジュゲート化抗myc抗体を用いて検出した。HRP活性は、OPD発色性基質(Dako社)を用いてメーカーのプロトコルに従って測定した。
MMTVneuマウス(5)をJackson Laboratory(ストック番号002376)から購入した。プレキシン-B1ノックアウトマウス(plxnb1-/-)は以前(31)に記載されたとおりに作出した。plxnb1+/- x MMTVneu;plxnb1+/-交配からの雌動物は、本研究の全期間にわたり未受精のまま維持した。本発明者らは、マウスの腫瘍を触診によって毎週モニタリングした。触知可能な腫瘍が最初に出現してから8.5週間後にマウスを犠牲にした。腫瘍を摘出して秤量した。4%PFA中での一晩(4℃)の固定およびエタノール中での脱水後に、肺の写真を撮った。次いで、肺を組織学のためにさらに処理し、ミクロトーム上で薄片(切片厚5μm)にした。切片をH&Eで染色し、転移の存在について分析した。分析した切片間の距離は50μmであった。
MMTVneu原発腫瘍の悪性度はH&E染色切片で評点した。分析した腫瘍ごとに、1、2または3のサブスコアを次のパラメータのそれぞれに割り当てた:腺腔形成度(1=75%超、2=10〜75%、3=10%以下)、核異型度(1=均一、2=形状および大きさが中等度に変化、3=著しい変化)、および分裂像数(1=0〜9/10hpf、2=10〜19/10hpf、3=20以上/10hpf)。サブスコアを加算して合計スコアを得た。3〜5の合計スコアは悪性度1に相当し、6〜7の合計スコアは悪性度2に相当し、そして8〜9の合計スコアは悪性度3に相当する。原発マウス腫瘍の局所浸潤性は、周囲の結合組織へのそれらの浸潤に基づいてH&E染色切片で評価した。各腫瘍は「低」または「高」浸潤性であると判定され、ここで「低」浸潤性は周囲の組織への単一細胞浸潤を示さない腫瘍として定義され、そして「高」浸潤性は周囲の組織への単一細胞浸潤を伴う腫瘍として定義される。免疫組織化学は、標準試薬およびプロトコル(Vector Laboratories社)を用いてパラフィン包埋切片で実施した。ホスホErbB-2スコアは、明確に確立されたErbB-2スコアと同様に分析した:スコア0は外周膜に有意な染色がないことを表し、一方スコア1+、2+および3+はホスホErbB-2[Y1248]の陽性の外周膜染色に対応する(1+:腫瘍細胞の1%以上に弱い染色または10%未満に中等度の染色;2+:腫瘍細胞の10%以上に中等度の染色または30%未満に強い染色;3+:30%を超える腫瘍細胞に強い染色)。ヤギポリクローナル抗プレキシン-B1抗体(R&D Systems社)の特異性を試験するために、組織スライドに適用する前に、該抗体を免疫に用いるペプチドと共に質量比1:5で室温にて1時間プレインキュベートした。
血管新生の分析のために、腫瘍切片をCD31について染色して画像化した(腫瘍あたりランダムに選択された3視野、倍率100x)。定量化は、記載(49)されたとおりにコンピュータ支援デジタル画像解析により行った。マクロファージは腫瘍切片で抗Mac-3抗体により染色し、マクロファージ数を腫瘍あたりランダムに選択された3視野(倍率200x)でコンピュータ支援デジタル画像解析によりカウントした。アポトーシスの分析のために、切片を切断型カスパーゼ3について染色し、陽性細胞を腫瘍あたりランダムに選択された10視野(倍率400x)でカウントした。
凍結したおよびパラフィン包埋した乳癌組織は、国立腫瘍疾病センター(National Centre for Tumor Diseases: NCT, Heidelberg, ドイツ)の組織バンクによって提供された(図10)。ErbB-2スコアは、抗ErbB-2抗体(Dako社、クローンA0485)を用いた免疫組織化学法によって決定した。ErbB-2スコア0は染色なしを表す一方で、ErbB-2スコア1+、2+および3+はErbB-2の陽性染色に対応する(1+:腫瘍細胞の10%に弱い染色;2+:腫瘍細胞の10〜30%に中等度の染色;3+:腫瘍細胞の30%超に強い染色)。
ヒト乳癌患者の次のデータセットは、遺伝子発現オムニバス(GEO)レポジトリhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/からダウンロードした:GSE1456, GSE2034, GSE3494, GSE4922, GSE5327, GSE7390, GSE11121, GSE12093。すべてのデータセットはプラットフォームHG-U133a CELファイルに対してフィルター処理した。バッチ全体は1548アレイで構成され、Affymetrixパワーツール(正規化法RMA)で前処理した。HG-U133Aアノテーションファイルはhttp://www.affymetrix.comからダウンロードした。ERBB-2プローブセットID 216836_s_atを用いて、アレイをErbB-2過剰発現腫瘍とErbB-2非過剰発現腫瘍とにグループ分けした。本発明者らは、200アレイをErbB-2過剰発現腫瘍として、1348アレイをErbB-2非過剰発現腫瘍として同定した。以前の研究では、ErbB-2 mRNA発現レベルは免疫組織化学法で測定されたタンパク質発現レベルに相関することが示された(50)。ErbB-2過剰発現を有するアレイのグループ内で、2つのサブグループがプレキシン-B1発現レベル(プローブセット215807_s_at)に基づいて特定された:一方のサブグループは最低のプレキシン-B1発現を有する60アレイを含み、他方のサブグループは最高のプレキシン-B1発現を有する60アレイを含んでいた。低プレキシン-B1発現を有する60アレイは利用可能な22の臨床データセットにマッピングされ、高プレキシン-B1発現を有する60アレイは利用可能な39の臨床データセットにマッピングされた。同様に、ErbB-2過剰発現を有しないアレイのグループ内で、2つのサブグループがプレキシン-B1発現レベルに基づいて特定された:一方のサブグループは最低のプレキシン-B1発現を有する100アレイを含み、他方のサブグループは最高のプレキシン-B1発現を有する100アレイを含んでいた。低プレキシン-B1発現を有する100アレイは利用可能な19の臨床データセットにマッピングされ、高プレキシン-B1発現を有する100アレイは利用可能な62の臨床データセットにマッピングされた。異なるアレイは異なる臨床エンドポイントを与えたので、本発明者らは、RFS(無再発生存率)、DMFS(無遠隔転移生存率)およびDFS(無病生存率)を組み合わせて、1つの統一された臨床エンドポイント(無病生存率)とした。生存期間(年数)および生存イベントデータを用いて、本発明者らは生存解析を行った。本発明者らは両グループにおいて十分なイベントを有していたので、自由度1のカイ二乗分布をもつと仮定した。R関数(Survおよびsurvfit)を用いてカプラン・マイヤー曲線をプロットすることによって、本発明者らは、さまざまな生存ラインを実証することができた。これらのラインは互いに交差しなかったので、本発明者らは、イベント発生率がCoxモデルに比例すると仮定した。したがって、本発明者らは、生存曲線を比較するためにログランク検定(これらの知見によってWilcoxonより高いパワー)を選んだ。ログランク検定はR survdiff関数で実行した。全生存率の解析のために、本発明者らは上述したものと同じアレイグループ(ErbB-2過剰発現、最低プレキシン-B1発現を有する60アレイ、最高プレキシン-B1発現を有する60アレイ)を採用し、これらのグループをGEOデータセットからの利用可能な疾患特異的生存率(DSS)データにマッピングした。本発明者らは、低プレキシン-B1発現を有するグループの7アレイおよび高プレキシン-B1発現を有するグループの13アレイをDSS値にマッピングすることができた。カプラン・マイヤー曲線は上述したようにR関数でプロットした。ErbB-2過剰発現を有する200アレイのグループ内では、エストロゲン受容体(ER)の状態に関するデータは77アレイで入手できた。これらのうち、29アレイはER陰性であり(28は臨床転帰データがある)、48アレイはER陽性であった(31は臨床転帰データがある)。利用可能な臨床転帰データがあるアレイをプレキシン-B1の発現について分類し、上述したようにカプラン・マイヤー曲線をR関数でプロットした。
統計的有意性は両側t検定(図2E、図2F、図2H、図2K、図2L、図3B、図3F、図3G、図6B〜D、図7C)、フィッシャーの正確確率検定(図3D)およびログランク検定(図3A、図4D、図4E、図9A〜C)により評価した。0.05未満のp値を有意と見なした。*は有意水準<0.05を示し、**は有意水準<0.01を示し、***は有意水準<0.001を示す。
本研究における動物の管理と使用のすべての処置は、動物実験倫理委員会(local animal ethics committee)(Regierungspraesidium, Karlsruhe, ドイツ)により承認された。凍結およびパラフィン包埋乳癌組織は、国立腫瘍疾病センター(NCT, Heidelberg, ドイツ)の組織バンクから、該組織バンクの規制およびHeidelberg大学の倫理委員会の承認に従って、提供された。患者は組織の使用に対してインフォームドコンセントを与えた。
2.1 ErbB-2の過剰発現はプレキシン-B1およびRho GTPアーゼの活性化をもたらす。
ErbB-2の過剰発現がプレキシン-B1をリン酸化して活性化するのに十分であるかどうかを試験するために、本発明者らは、HEK293細胞において野生型または構成的に活性なErbB-2を過剰発現させた。これは、プレキシン-B1のチロシンリン酸化(図1A)ならびにRhoA(図1B)およびRhoC(図1D)の活性化をもたらしたが、RhoB(図1C)の活性化はプレキシン-B1リガンドに関係なく生じなかった。細胞内ドメインを欠くプレキシン-B1変異体の発現はRhoAおよびRhoCの活性化をブロックし、このことは、プレキシン-B1シグナル伝達がErbB-2の下流でのRhoAおよびRhoC活性化に確かに必要であることを示している(図1B、図5)。プレキシン-B1は、Rhoシグナル伝達を媒介するその能力に加えて、R-RasのためのGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)であることが示された(29)。R-RasGAP活性がErbB-2によるプレキシン-B1リン酸化とは無関係であることを示した以前の研究(18)と一致して、野生型または構成的に活性なErbB-2の過剰発現はプレキシン-B1のR-RasGAP活性に影響を及ぼさなかった(図1E)。これらのデータは、ErbB-2の過剰発現が結果的にプレキシン-B1およびRhoシグナル伝達の活性化につながることを示している。
癌細胞におけるErbB-2/プレキシン-B1シグナル伝達の役割を調べるために、本発明者らは、プレキシン-B1およびRhoA活性に関して数種類のヒト乳癌細胞株を比較した。基礎プレキシン-B1リン酸化およびRhoA活性はErbB-2を過剰発現する癌細胞株においてのみ検出可能であったが、このことは、この経路が高レベルのErbB-2発現を有する乳癌細胞において活発であるが、低レベルのErbB-2発現を有する乳癌細胞では活発でないという概念に一致する(図2A)。これに合致して、BT-474細胞(高レベルのErbB-2を内因的に発現する)でのErbB-2のノックダウンは、プレキシン-B1チロシンリン酸化およびRhoA/RhoC活性の著しい減少をもたらした(図2B)。ErbB-2過剰発現BT-474細胞におけるプレキシン-B1発現の低下はErbB-2チロシンリン酸化に影響を及ぼさなかったが、それはRhoAおよびRhoC活性の強い阻害をもたらした(図2Cおよび2D)。活性RhoBは、その腫瘍抑制機能について知られているが(30)、BT-474細胞では検出されなかった(データは示さず)。したがって、プレキシン-B1はErbB-2過剰発現をRhoAおよびRhoCの活性化に結び付けている。RhoAおよびRhoCの浸潤促進(pro-invasive)細胞効果を踏まえて、本発明者らは、ErbB-2が、プレキシン-B1のリン酸化および活性化を介したRhoAとRhoCの活性化によって、腫瘍細胞の浸潤を促進するかどうかを試験した。プレキシン-B1のノックダウンはErbB-2過剰発現BT-474細胞の増殖に影響を与えなかった(図2E)が、それらの遊走能と浸潤能を強く低減させた(図2F、図6Bおよび6C)。ErbB-2によるプレキシン-B1リン酸化が癌細胞の浸潤性にとって必要であるかを試験するために、本発明者らは、野生型プレキシン-B1のsiRNA耐性バージョンと、ErbB-2によりリン酸化されないプレキシン-B1(Y1708F/1732F)変異体のsiRNA耐性バージョンを発現させた(18)。内因性プレキシン-B1のsiRNA媒介ノックダウンの後で、リン酸化部位欠損プレキシン-B1を発現する細胞は、活性RhoA/RhoCのレベルが著しく低下し、かつ野生型プレキシン-B1を発現する細胞より浸潤が劇的に少なかった(図2Gおよび2H)。癌細胞浸潤におけるそれらの確立された役割に一致して、RhoAまたはRhoCのノックダウンはBT-474細胞の浸潤能を弱めた(図6D)。
プレキシン-B1がin vivoでもErbB-2依存性転移を媒介するかどうかを試験するために、本発明者らは、乳腺に野生型ErbB-2を過剰発現して転移性乳癌を発症するトランスジェニックMMTVneuマウスを使用した(5)。MMTVneuマウスの原発腫瘍と同様に、肺転移腫瘍もプレキシン-B1を発現した(図8A)。MMTVneuマウスは、プレキシン-B1欠損マウスと交配させたが、このプレキシン-B1欠損マウスは生存力および繁殖力があり、正常な乳の分泌を示し、明白な欠陥を何も持ち合わせていない(31,32)。本発明者らは、プレキシン-B1が無腫瘍生存率または原発腫瘍の大きさに影響を及ぼさないことを見出した(図3Aおよび3B、図8Bおよび8C)。原発腫瘍の組織学的検査は、血管新生または免疫細胞浸潤に対するプレキシン-B1除去の影響を何も明らかにしなかった(図8D〜G)。プレキシン-B1はErbB-2の下流でシグナル伝達するという概念に一致して、プレキシン-B1発現の低下は癌細胞のErbB-2チロシンリン酸化に影響を与えなかった(図8Hおよび8I)。原発腫瘍の悪性度はグループ間で同様であった(図8Jおよび8K)が、プレキシン-B1欠損腫瘍は局所浸潤性が減少する傾向を示した(図8Lおよび8M)。肺の検査は肉眼で見える転移の著しい減少を明らかにした(図3Cおよび3D)。組織学的分析では、肺内転移数の強い減少が確認された(図3E〜3G)。これらの結果から、プレキシン-B1は腫瘍形成または腫瘍増殖に影響を及ぼさないが、in vivoでのErbB-2依存性乳癌の転移には必要であることが示される。
ErbB-2/プレキシン-B1シグナル伝達がヒト乳癌においても何らかの役割を果たしているかどうかを調べるために、本発明者らは、ヒト乳癌組織でのプレキシン-B1の発現を研究した(図10Aおよび10B)。プレキシン-B1のmRNAおよびタンパク質は、ErbB-2スコアとは無関係に、分析したすべての乳癌組織で検出可能であった(図4Aおよび4B)。ErbB-2過剰発現乳癌の患者からのサンプル(図10C)では、本発明者らは、プレキシン-B1がチロシンリン酸化されていることを見出したが、ErbB-2陰性乳癌ではプレキシン-B1のチロシンリン酸化を検出することができなかった(図4C)。このことから、ErbB-2はヒト乳癌組織においてもプレキシン-B1をリン酸化して活性化することが示された。
転移促進性の受容体型チロシンキナーゼであるErbB-2は、全乳癌の約30%において過剰に発現される。癌細胞の浸潤および転移を推進するErbB-2の下流のシグナル伝達事象は、いまだに明らかでない。ここで、本発明者らは、ErbB-2の過剰発現がセマフォリン受容体プレキシン-B1の活性化につながることを示す。プレキシン-B1は、転移促進性の低分子量GTPアーゼRhoAおよびRhoCのErbB-2依存的活性化に必要とされ、ヒト乳癌細胞の浸潤挙動を促進した。ErbB-2過剰発現乳癌のマウスモデルでは、プレキシン-B1をコードする遺伝子の除去が転移の発生を強く抑制し、また、ErbB-2過剰発現乳癌のヒト患者では、低レベルのプレキシン-B1発現が良好な予後と有意に相関していた。したがって、プレキシン-B1は、ErbB-2陽性癌、特にErbB-2陽性乳癌における新たな治療標的を表している。
局所的増殖よりもむしろ転移が乳癌における主要な予後因子であることを考えれば、転移の根底にある分子機構の解明は非常に重要である。Rho GTPアーゼは細胞遊走の重要な調節因子であり、Rhoシグナル伝達は癌細胞の浸潤および転移を促進する(23-28)。プレキシン-B1がErbB-2と相互作用し、さらにRhoGEFタンパク質とも相互作用してRhoAを調節することができるという事実は、本発明者らに、プレキシン-B1がErbB-2の下流で作用してErbB-2過剰発現をRho GTPアーゼの活性化に結び付けることができるかどうかを試験するように促した。ErbB-2を過剰発現するヒト乳癌細胞では、プレキシン-B1はチロシンリン酸化されたが、このプレキシン-B1のチロシンリン酸化ならびにRhoA/RhoC活性はErbB-2のsiRNA媒介ノックダウンによってブロックされた。プレキシン-B1発現のノックダウンはErbB-2チロシンリン酸化に影響を及ぼさなかったものの、それはRhoAおよびRhoC活性だけでなく癌細胞の浸潤をも抑制した。内因性プレキシン-B1タンパク質をプレキシン-B1の変異型(ErbB-2によりリン酸化されるチロシン残基を欠く)で置き換えると、やはりRhoA/RhoC活性および癌細胞の浸潤能が強く低下した。さらに、抗プレキシン-B1抗体またはプレキシン-B1の組換え細胞外ドメイン(PlxB1ext)によるErbB-2とプレキシン-B1との相互作用の妨害は、RhoA/RhoC活性および癌細胞浸潤を低減させた。これらのin vitro知見に基づいて、本発明者らは、ErbB-2の過剰発現がプレキシン-B1のリン酸化および活性化をもたらすという結論に達する。これは、RhoGEF11/12タンパク質(20-22)およびRhoA/RhoCの活性化ならびに癌細胞浸潤の増加につながる(図4F)。
Claims (15)
- 薬剤として使用するための、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するB型プレキシンのアンタゴニスト。
- 転移性癌の治療用の薬剤として使用するための、請求項1記載のアンタゴニスト。
- 前記転移性癌が、乳癌、卵巣癌、胃癌、および子宮癌からなる群より選択される、請求項2記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが、B型プレキシン遺伝子またはその転写産物に特異的にハイブリダイズすることができかつB型プレキシンポリペプチドの発現を妨げる核酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
- 前記核酸が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスRNA、モルフォリノオリゴヌクレオチド、リボザイム、および三重らせん形成剤からなる群より選択される、請求項4記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストがB型プレキシンポリペプチドに特異的に結合し、かつB型プレキシンポリペプチドのErbB-2への結合を阻害する、請求項1〜4のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストがB型プレキシンの細胞外ドメインに結合する、請求項6記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが、抗体、アプタマー、ペプチド、およびポリペプチドからなる群より選択される、請求項6または7記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが、細胞毒性である化合物、癌細胞の細胞増殖もしくは分化を阻害する化合物、癌細胞のアポトーシスを誘導する化合物、および/または腫瘍の血管新生を防止する化合物と組み合わせて、前記薬剤中で使用される、請求項1〜8のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
- 前記化合物が、トラスツズマブ、ベバシズマブ、タモキシフェン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン、Ara-C(シタラビン)、CCNU(クロロエチルシクロヘキシルニトロソウレア)、ヒドロキシウレア、アドリアマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ドキソルビシン、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカンからなる群より選択される、請求項9記載のアンタゴニスト。
- B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストを同定するための方法であって、次のステップ:
a) B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストであると予想される化合物を、B型プレキシンおよびErbB-2を含む細胞と、B型プレキシンとErbB-2との相互作用の防止を可能にする条件下で、接触させるステップ;および
b) 該化合物がB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止する能力があるかどうかを判定し、それによって、該相互作用が防止された場合には、該化合物をB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストとして同定するステップ;
を含んでなる方法。 - 前記相互作用が細胞の移動および/または浸潤特性を測定することによって判定される、請求項11記載の方法。
- 機能性の細胞内ドメインを欠くB型プレキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項13記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
- 前記アンタゴニストが請求項14記載のポリペプチドである、請求項1〜4および6〜10のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018521062A (ja) * | 2015-06-29 | 2018-08-02 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | B1sp融合タンパク質の治療薬、方法、および使用 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2993185A1 (en) * | 2014-09-05 | 2016-03-09 | Ruprecht-Karls-Universität | Monoclonal antibodies for the treatment of osteoporosis, multiple sclerosis and neoplastic diseases |
EP3693380A1 (en) | 2019-02-11 | 2020-08-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Dual inhibition of plexin-b1 and plexin-b2 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001014420A2 (en) * | 1999-08-25 | 2001-03-01 | University Of Torino | Novel members of the plexin family and uses thereof |
JP2006516594A (ja) * | 2003-01-31 | 2006-07-06 | エンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル(イ エヌ エス ウ エール エム) | 抗−cd100抗体の使用 |
WO2010129917A2 (en) * | 2009-05-08 | 2010-11-11 | Vaccinex, Inc. | Anti-cd100 antibodies and methods for using the same |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US5994524A (en) | 1994-07-13 | 1999-11-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Polynucleotides which encode reshaped IL-8-specific antibodies and methods to produce the same |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
CA2386270A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | University Of Massachusetts | Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference |
JP4353799B2 (ja) * | 2001-10-09 | 2009-10-28 | ザ・ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ | 転移に関連するホスファターゼ |
AU2003285878B2 (en) | 2002-11-07 | 2011-04-28 | Immunogen, Inc. | Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same |
WO2006110593A2 (en) | 2005-04-07 | 2006-10-19 | Macrogenics, Inc. | Biological targets for the diagnosis, treatment and prevention of cancer |
AU2006271880A1 (en) | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Stichting Katholieke Universiteit | Plexin D1 as a target for tumor diagnosis and therapy |
CL2007002070A1 (es) | 2006-07-14 | 2008-02-08 | Ac Immune S A Genentech Inc | Anticuerpo quimerico o humanizado, o fragmentos de ellos, que se adhieren especificamente a por lo menos un epitopo en la proteina beta-amiloide; molecula de acido nucleico que lo codifica; composicion que lo comprende; su uso para tratar enfermedade |
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2015
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001014420A2 (en) * | 1999-08-25 | 2001-03-01 | University Of Torino | Novel members of the plexin family and uses thereof |
JP2006516594A (ja) * | 2003-01-31 | 2006-07-06 | エンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル(イ エヌ エス ウ エール エム) | 抗−cd100抗体の使用 |
WO2010129917A2 (en) * | 2009-05-08 | 2010-11-11 | Vaccinex, Inc. | Anti-cd100 antibodies and methods for using the same |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JPN6015042552; J Biol Chem. 283(4), 2008, 1893-901 * |
JPN6015042555; BMC Cancer. 10:611, 2010, 1-11 * |
JPN6015042559; Cell 99(1), 1999, 71-80 * |
JPN6015042561; Mol Cell Biol. 29(23), 2009, 6321-34 * |
JPN6015042564; J Cell Biol. 165(6), 2004, 869-8 * |
JPN6016024895; Blood 105, 2005, 3042-50 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018521062A (ja) * | 2015-06-29 | 2018-08-02 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | B1sp融合タンパク質の治療薬、方法、および使用 |
JP2021180671A (ja) * | 2015-06-29 | 2021-11-25 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | B1sp融合タンパク質の治療薬、方法、および使用 |
JP7193590B2 (ja) | 2015-06-29 | 2022-12-20 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | B1sp融合タンパク質の治療薬、方法、および使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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