JP2021180671A - B1sp融合タンパク質の治療薬、方法、および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2015年6月29日出願の「B1SP融合タンパク質の治療薬、方法、および使用」と題された米国仮特許出願第62/185,772号の利益を請求するものである。
本明細書で使用される“セマドメイン”とは、7つのブレード状のβプロペラを有するおよそ500アミノ酸の特有のタンパク質ドメインを指す。ここでは、セマドメインはまた、突出(extrusion)などの1つ又は複数の長いループおよび/または挿入を含んでいてもよい(Gherardi E.ら、2004)。セマドメインは、1〜7クラスの動物セマフォリン、ウイルスセマフォリン、プレキシンのうちいずれか1つに由来するか、または当技術分野で既知のMETおよびRON受容体チロシンキナーゼ(RTK)に由来していてもよい。あるいは、セマドメインは、1つまたは複数の異なるセマドメイン(図1のセマドメインのクロモアラインメントを参照されたい)由来のβプロペラブレードを組み合わせることによって、形成されていてもよい。セマドメインは、保存された一連のシステイン残基を持つという特徴があり、これらの残基は、4つのジスルフィド結合を形成して構造を安定化する。セマドメインの折り畳みは、中心軸の周囲に放射状に配置された7つのブレードを有する、ベータプロペラの様々なトポロジーである。各ブレードは、4つのストランド(ストランドAからD)の逆平行ベータシートを含有する。各ブレードの内部ストランド(A)は、プロペラの中心でチャネルを裏打ちすると共に、同じ繰り返しのストランドBおよびCは、外側に放射状に広がり、次の繰り返しのストランドDは、ブレードの外縁を形成する。大きなサイズのセマドメインは、単一の挿入ドメインに起因するものではないが、ブレードのほとんどに挿入された追加の二次構造上の要素が存在することによって生じる。セマドメインは、“ループ・アンド・フック”方式を使用して、最初と最後のブレードの間で円を閉じる。ブレードが連続的に構築され、それに伴って、N末端のベータストランドが、第7の(C末端の)ブレードの最も外側のストランド(D)を与えることによって円を閉じる。ベータプロペラは、N末端の延長によってさらに安定化され、ブレード6の外縁に追加の第5のベータストランドをもたらす。本明細書で使用する際、阻害性のセマドメインとは、がん細胞における(1)EGFRリン酸化、(2)c−Metリン酸化、または(3)VEGFRリン酸化を阻害すること、またはがん細胞のR1881誘導性の増殖、接着、もしくは細胞遊走を阻害することが可能な任意のセマドメインを含むことを意味する。
セマフォリンは、保存されたセマドメインを含有する分泌型および膜結合型タンパク質のファミリーに属する。セマフォリンおよびその受容体(主にプレキシンおよびニューロピリン)は、ヒト腫瘍で異常発現している。セマフォリンシグナルは、腫瘍による血管新生、浸潤、および転移の調節に重要な役割を果たす。本開示では、前立腺がんおよび他のがんを治療するためにセマフォリン媒介性シグナル伝達経路を標的として阻害する、B1SP融合タンパク質の使用を詳述する。本明細書に記載の結果は、B1SP融合タンパク質がセマフォリンシグナル伝達の強力な阻害剤であること、およびがんの治療での使用を示している。B1SP融合タンパク質は、ニューロピリンおよびプレキシンに用量依存的に結合する。B1SP融合タンパク質治療によって、用量依存的および濃度依存的に、前立腺がん細胞の細胞生存能の阻害と細胞死の誘導とを引き起こすことができる。さらに、B1SP融合タンパク質は、前立腺がん細胞の細胞接着を阻害することが、本明細書に示されている。B1SP融合タンパク質は、前立腺がん細胞のEGFRリン酸化とR1881誘導性増殖とを阻害することが、本明細書に示されている。
B1SPは、プレキシンB1およびNRP1に用量依存的に結合する。DU145細胞を洗浄し、標示の用量のB1SPタンパク質で1時間処理した。次いで、細胞をDPBSで3回洗浄し、次に溶解した。プロテインGアガロースを使用して、細胞性タンパク質との複合体をなすB1SPタンパク質を単離した。タンパク質複合体を3回洗浄した後、試料緩衝液を添加した。試料を煮沸してウェスタンブロットにより分析した。示したのは、B1SP処理に対する代表的な用量依存性である。組換えヒトIgGFcを対照として使用した。Syngene Gene Tools(商標)バージョン4.02(Synoptics Ltd.(商標)、ケンブリッジ、イギリス)を使用して、B1SP融合タンパク質との複合体中のNRP1およびプレキシンB1の濃度測定分析を実施した。図3Cおよび図3Dでは、プレキシンB1およびNRP1とのB1SPの結合を測定した。DU145細胞を洗浄し、標示の用量のB1SPタンパク質で1時間処理した。次いで、細胞をDPBSで3回洗浄して、次に溶解した。プロテインGアガロースを使用して、細胞性タンパク質との複合体をなすB1SPタンパク質を単離した。タンパク質複合体を3回洗浄した後、試料緩衝液を添加した。試料を煮沸してウェスタンブロットにより分析した。示したのは、B1SP処理に対する代表的な用量依存性である。組換えヒトIgGFcを対照として使用した。NRP1またはプレキシンB1のどちらかとの複合体中のB1SPの相対量を、3回の独立した実験から決定した後、Syngene Gene Tools(商標)バージョン4.02(SynopticsLtd.(商標)、ケンブリッジ、イギリス)を使用して、B1SP融合タンパク質との複合体中のNRP1およびプレキシンB1の濃度測定分析を実施した。
C4−2去勢−抵抗性(CRPC)異種移植モデル用に、6〜8週齢の雄胸腺欠損ヌードマウス(Harlan Sprague Dawley,Inc.(商標)、インディアナポリス、インディアナ州)に、メトキシフルラン麻酔下で27ゲージの針を介して、C4−2細胞(1×106)を両側腹部領域の皮下に接種した。週1回、体重、腫瘍体積、および血清PSAレベルを測定した。血液試料を尾静脈の切創から取得し、Roche Diagnostics Cobas411(商標)イムノアッセイシステムによって血清PSAを決定した。このシステムは、増強型化学発光技術(ECL(商標))を使用した、免疫学的分析用の自動化ランダムアクセスマルチチャンネル分析器である。C−42腫瘍を担持したマウスが200mm3超の腫瘍体積に達するか、または血清PSAが75ng/mLより大きなレベルに達した際に、イソフルラン麻酔下で陰嚢を介して去勢を実施した。PSAが去勢前のレベルに戻った際に、処理を週に3回行った。腫瘍体積は、ノギス測定によってモニターし、長さ×幅×深さ×0.5236の式によって計算した。18頭のマウスを、10mg/KgのB1SPまたはPBS対照を用いた処理について2群に無作為化した。週1回、血清PSAレベルを測定した。血液試料を尾静脈の切創から取得し、Roche Diagnostics Cobas411(商標)イムノアッセイシステムによって血清PSAを決定した。このシステムは、増強型化学発光技術(ECL(商標))を使用した、免疫学的分析用の自動化ランダムアクセスマルチチャンネル分析器である。LNCaP腫瘍を担持したマウスが200mm3超の腫瘍体積に達するか、または血清PSAが75ng/mLより大きなレベルに達した際に、イソフルラン麻酔下で陰嚢を介して去勢を実施した。PSAが去勢前のレベルに戻った際に、処理を行った。
プレキシンB1 siRNA1(Hs_PLXNB1_6、Qiagen(商標)、モントリオール、ケベック州)を検証した。プレキシンB1 siRNA2は(Swierczら、2008年)により既に検証済みであり、合成した(ThermoScientific(商標)、ロックフォード、イリノイ州)。HiPerFect(商標)試薬(Qiagen(商標)、モントリオール、ケベック州)を製造業者の記載の通りに使用して、スクランブルsiRNA(AUCAAACUGUUGUCAGCGCUGUU)、プレキシンB1 siRNA1(CCGGGUGGAAUUUAUCCUUGAUU)、またはプレキシンB1 siRNA2(ACCACGGUCACCCGGAUUCUU)のいずれか(10nM)を用いて、LNCaP細胞をトランスフェクションした。トランスフェクト細胞を72時間、インキュベーションし、次いで、セマ3C:Fc(100nM)の存在下および非存在下で10分間、インキュベーションした。細胞を洗浄し、次いで溶解した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により、溶解物(30μg)からプレキシンB1レベルを分析した。ウェスタンブロットを抗プレキシンB1および抗リン酸化Shcでプロービングした。ローディング対照として抗ビンキュリンおよび抗Shcを用いて、ブロットをリプロービングした。RNAiMax(商標)試薬を製造業者(Invitrogen(商標)、ミシサガ、オンタリオ州)の指示の通りに使用し、スクランブルsiRNA、プレキシンB1 siRNA1またはプレキシンB1 siRNA2のいずれか(10nM)を用いて、DU145細胞をトランスフェクションした。72時間のインキュベーション後、細胞を96穴平底プレートに20,000細胞/穴で再度撒き、4時間接着させた。残りの細胞を溶解し、ウェスタンブロットによりプレキシンB1発現についてアッセイした。ローディング対照としてビンキュリンを用いて、ブロットをリプロービングした。結合アッセイの前に、培地を血清不含のDMEMで16時間置き換えた。次いで、0.5%BSAを含有するHBHA[20mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、1mM MgCl2]緩衝液を用いて、細胞を1回洗浄した。APTagベクターのみまたはAP−SEMA3Cコンストラクトを発現する293T細胞から得たOpti−MEM1条件培地を、線形かつ等価のAP酵素活性の範囲を見出すため、PNPPアッセイでアッセイした。等量のAP−セマ3C CMを等量のHBHA緩衝液に希釈することによって、AP−セマ3Cを適用し、その結果、酵素活性0.877を得た。APTagは、まずOpti−MEMに1:4で希釈し、次いで、等量のこの1:4希釈APTag CMを等量のHBHAに希釈した。AP−Tag CMの酵素は1.069であった。
図13では、LNCaP細胞およびC4−2細胞(2.5×104)を6穴プレート中に24時間撒き、その間、フェノールレッドまたは血清のないRPMIに培地を置換した。B1SPを標示の濃度で添加して、細胞を37℃、5%CO2で4日間、インキュベーションした。穏やかに掻き取ることによって、培地および接着性細胞から細胞を回収した。次いで、細胞を1300rpmで遠心分離し、PBS中で1回洗浄して、プロテアーゼ阻害剤を含有する200μLのNP40溶解緩衝液で溶解した。試料(30μg)をSDS PAGEにより分離した。総PARPおよび切断PARP(9542、9541、Cell Signaling Technologies Inc.(商標)ビバリー、マサチューセッツ州)を用いて、ゲルをイムノブロッティングした。抗アクチンを用いてブロットをリプロービングして、タンパク質溶解物が等しくローディングされたことを示した。
セマフォリンおよびその受容体(主にプレキシンおよびニューロピリン)は、ヒト腫瘍で異常発現している。セマフォリン3Cの結合およびシグナル伝達には、プレキシンB1の共役受容体であるニューロピリン1または2の相互作用が必要である。B1SP融合タンパク質は、セマフォリンとの結合をニューロピリンと競合し、それによって、プレキシンB1を介したシグナル伝達を阻害することにより、セマフォリンシグナル伝達を阻害する可能性がある。図3Aおよび図3Bに示されるように、B1SP融合タンパク質は、NRP1およびプレキシンB1と用量依存的に共免疫沈降する。図3Cおよび図3Dは、B1SPがプレキシンB1およびNRP1と用量依存的に結合することを示す。棒グラフは、NRP1またはプレキシンB1のどちらかとの複合体中のB1SPの相対量を表す。この量は、3つの独立したウェスタンブロッティング実験に続いて、B1SP融合タンパク質との複合体中のNRP1およびプレキシンB1の濃度測定分析を行うことにより得られたものである。
スクランブルsiRNA、またはプレキシンB1を標的とする2つの別個のsiRNAを用いて、DU145細胞をトランスフェクションした。全細胞の溶解物およびプレキシンB1抗体でプロービングしたウェスタンブロット分析による、72時間のインキュベーション後のプレキシンB1のタンパク質レベルの阻害(データ示さず)。次いで、抗ビンキュリンを用いてブロットをプロービングして、タンパク質溶解物が均等にローディングされたことを示した。スクランブルsiRNAまたはプレキシンB1 siRNAを用いてトランスフェクションしたDU145細胞とのAP−セマ3C結合。実施したAP−セマ3C結合の平均およびSEMは、4連で計算した。プレキシンB1のノックダウンの結果、AP−セマ3Cの結合が、対照のスクランブルsiRNAに比較して、プレキシンsiRNA1で2.4倍、プレキシンB1 siRNA2で1.9倍低減された。プレキシンB1のサイレンシングに応答して、セマ3C−媒介性のSHCリン酸化にも減少があった。スクランブルsiRNAまたはプレキシンB1 siRNAを用いて、LNCaP細胞をトランスフェクションし、次いで、72時間、インキュベーションした。細胞を16時間、血清飢餓の状態とし、次いで、SEMA3C(100nM)の存在下または非存在下で10分間、インキュベーションした。プレキシンB1抗体を用いてウェスタンブロットをプロービングして、プレキシンB1および抗リン酸化SHCが特異的に阻害されていることを示した。抗SHCおよび抗ビンキュリンローディング対照として、ブロットをリプロービングした(データ示さず)。
驚くべきことに、図14に示されるように、DU145細胞において、B1SPを添加することによって、プレキシンB1とHER2/ErbB2との相互作用が亢進される(すなわち米国特許第9,198,966号に基づく)。
図4は、LNCaP細胞におけるEGFRリン酸化の阻害を示す。LNCaP細胞を24時間、血清飢餓の状態とした後、B1SP融合タンパク質条件培地(CM)を2時間、4時間、および6時間の時点で添加した後、EGF(5.0ng/mL)で10分間刺激した。細胞を回収して、EGFRリン酸化(pEGFR)の発現および総EGFR発現について評価した。ローディング対照として抗ビンキュリンでブロットをリプロービングした。タイムコース終了時でのEGFRリン酸化を比較するため、また、LNCaPにおいてEGFRリン酸化を刺激する能力にインキュベーション時間が及ぼすいかなる影響も抑えるため、対照として、6時間の時点で、非処理細胞を同様に刺激するかまたはそのまま溶解した。
(A)では、標示の通りに合成アンドロゲン(R1881)で細胞を処理し、PrestoBlue増殖アッセイを使用して、5日間にわたって細胞の増殖を評価した。(B)では、濃度を増加させたB1SPと組み合わせて、R1881(1nM)でLNCaP細胞を処理し、4日間にわたって細胞の増殖をモニターした。(C)では、B1SPが成長に及ぼす阻害効果を、アンドロゲン(R1881)感受性の成長の最大のパーセンテージとして表現している。図8Aは、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0μMのB1SP融合タンパク質について、4日間にわたる細胞の増殖を表すものとして、蛍光強度(FI)を示す。同様に、図8Bは、R1881(1nM)および2μM、1μM、および0μMのB1SP融合タンパク質で処理したLNCaP細胞における4日間にわたる細胞の増殖を表すものとして、EtOH対照と共に、蛍光強度(FI)を示す。図8Dは、B1SP融合タンパク質の用量応答性のプロットをlogスケール上に示す。
還元条件下(R)および非還元条件(NR)下での精製B1SPタンパク質のクマシー染色により、精製したCM中B1SPの分子量を確定した(データ示さず)。B1SP融合タンパク質のクマシーブルー染色により、97kDaの単量体(R)および193kDaの二量体(NR)が示された。同様に、B1SP融合タンパク質を分泌するCHO細胞から回収した条件培地を、N末端抗プレキシンB1抗体を用いたウェスタンブロットによって評価した(データ示さず)。
図10Aおよび10Bに示されるように、B1SP融合タンパク質の処理によって、前立腺がん細胞(すなわちLNCaP細胞またはDU145細胞)の接着が阻害される。細胞をカルセインAM(12.5μM)でパルスし、30分間、インキュベーションした。フィブロネクチン(50μg/mL)がプレコートされた96穴プレートに細胞(1×105)を播種し、軽く遠心分離した後、B1SP融合タンパク質の存在下および非存在下で16〜24時間、インキュベーションした。洗浄によって非接着細胞を除去する前後で、細胞の蛍光を測定した。データは、3連の穴の接着の平均(%)を表す。
図11A〜Cは、B1SP融合タンパク質がアンドロゲン感受性のLNCaP細胞の増殖を阻害することを示す。A:細胞を標示の通りに合成アンドロゲン(R1881)で処理した。PrestoBlue増殖アッセイを使用して、5日間にわたって細胞の増殖を評価した。B:濃度を増加させたB1SPと組み合わせて、LNCaP細胞をR1881(1nM)で処理した。細胞の増殖を4日間にわたってモニターした。C:成長に及ぼすB1SP融合タンパク質の阻害効果を、アンドロゲン(R1881)感受性の成長の最大のパーセンテージとして表現して表す。
去勢抵抗性C4−2異種移植片を担持した胸腺欠損nu−/−マウスを去勢し、20mg/kgのB1SPまたはPBS対照を用いて週2回、処理した。B1SP融合タンパク質を用いた処理によって、C4−2腫瘍の成長(図11A)および血清PSAの増悪(図11B)が抑制された。図12は、(A)PBS対照(n=9)または(B)B1SP(n=7)で処理した個別の去勢抵抗性C4−2異種移植片担持マウス(CRPC)の7日目から14日目の血清PSAレベルの変化を示す。図13は、LNCaP細胞およびC4−2細胞をB1SP融合タンパク質で処理することにより、PARP切断に関するイムノブロット分析によってモニターされたように、用量依存的にアポトーシスが誘導されることを示す。
種々のがん細胞株をB1SP媒介性の増殖感受性について供試して、がんのタイプを処理した際のB1SPの有効性を表すものとして、各細胞のタイプのIC50値を計算した。LNCaP細胞、C42細胞、MR49F細胞、U87MG細胞、Caki−1細胞、Caki−2細胞、およびT24細胞の阻害を、PBS対照と比較した際のB1SPの用量増加(すなわち2、1、0.5、0.25、および0.125μM)に応答した増殖について試験した。LNCaP細胞には、上記に記載したように、EtOHおよびPBS対照を使用し、R1881も投与した。GraphPadプリズムソフトウェアを使用して、4日目のデータを0日目に正規化した。C4−2はCRPC細胞であり、MR49F細胞はエンザルタミド依存的な(10μM)LNCaP由来細胞であり、U87MGは神経膠芽腫細胞であり、Caki−1およびCaki−2は腎カルシノーマ細胞であり、T24は膀胱がん細胞である。
B1SPおよびB1R4をHEK293T細胞で発現させたが、B1SPのみ条件培地中に分泌された。B1SPおよびB1R4発現クローンを用いて、HEK293T細胞をトランスフェクションした。24時間後、培地をOpti−Memに置き換えて、5%CO2中37℃でさらに48時間インキュベーションした。条件培地を回収して濃縮し、抗プレキシンB1を全細胞溶解物(WCL)に、HRPコンジュゲート抗Fc抗体を条件培地(CM)に使用したイムノブロッティングによって分析した。B1R4の分泌は追加のPSIドメインによって阻害されたものと推察された(すなわちB1SPはPSIドメインを1つのみ有する)。
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配列番号1
SCAQHLDCAS CLAHRDPYCG WCVLLGRCSR RSECSRGQGP EQ
配列番号2(B1SP融合体−分子量、ホモ二量体、168kD、アミノ酸配列)
MPALGPALLQALWAGWVLTLQPLPPTAFTPNGTYLQHLARDPTSGTLYLGATNFLFQLSPGLQLEATVSTGPVLDSRDCLPPVMPDECPQAQPTNNPNQLLLVSPGALVVCGSVHQGVCEQRRLGQLEQLLLRPERPGDTQYVAANDPAVSTVGLVAQGLAGEPLLFVGRGYTSRGVGGGIPPITTRALWPPDPQAAFSYEETAKLAVGRLSEYSHHFVSAFARGASAYFLFLRRDLQAQSRAFRAYVSRVCLRDQHYYSYVELPLACEGGRYGLIQAAAVATSREVAHGEVLFAAFSSAAPPTVGRPPSAAAGASGASALCAFPLDEVDRLANRTRDACYTREGRAEDGTEVAYIEYDVNSDCAQLPVDTLDAYPCGSDHTPSPMASRVPLEATPILEWPGIQLTAVAVTMEDGHTIAFLGDSQGQLHRVYLGPGSDGHPYSTQSIQQGSAVSRDLTFDGTFEHLYVMTQSTLLKVPVASCAQHLDCASCLAHRDPYCGWCVLLGRCSRRSECSRGQGPEQWLWSFQPELGCLGSGGGSGGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
セマドメイン−アノテーションなし
構造安定化ドメイン(PSI=プレキシン−セマフォリン−インテグリンドメイン)
リンカー
ヒンジ
半減期延長ドメイン(FC領域)
配列番号3(B1SP融合体−配列番号2の融合タンパク質をコードする核酸配列)
atgcctgctctgggcccagctcttctccaggctctctgggccgggtgggtcctcaccctccagccccttccaccaactgcattcactcccaatggcacgtatctgcagcacctggcaagggaccccacctcaggcaccctctacctgggggctaccaacttcctgttccagctgagccctgggctgcagctggaggccacagtgtccaccggccctgtgctagacagcagggactgcctgccacctgtgatgcctgatgagtgcccccaggcccagcctaccaacaacccgaatcagctgctcctggtgagcccaggggccctggtggtatgcgggagcgtgcaccagggggtctgtgaacagcggcgcctggggcagctcgagcagctgctgctgcggccagagcggcctggggacacacaatatgtggctgccaatgatcctgcggtcagcacggtggggctggtagcccagggcttggcaggggagcccctcctgtttgtggggcgaggatacaccagcaggggtgtggggggtggcattccacccatcacaacccgggccctgtggccgcccgacccccaagctgccttctcctatgaggagacagccaagctggcagtgggccgcctctccgagtacagccaccacttcgtgagtgcctttgcacgtggggccagcgcctacttcctgttcctgcggcgggacctgcaggctcagtctagagcttttcgtgcctatgtatctcgagtgtgtctccgggaccagcactactactcctatgtggagttgcctctggcctgcgaaggtggccgctacgggctgatccaggctgcagctgtggccacgtccagggaggtggcgcatggggaggtgctctttgcagctttctcctcggctgcaccccccactgtgggccggcccccatcggcggctgctggggcatctggagcctctgccctctgtgccttccccctggatgaggtggaccggcttgctaatcgcacgcgagatgcctgctacacccgggagggtcgtgctgaggatgggaccgaggtggcctacatcgagtatgatgtcaattctgactgtgcacagctgccagtggacaccctggatgcttatccctgtggctcagaccacacgcccagccccatggccagccgggtcccgctggaagccacaccaattctggagtggccagggattcagctaacagctgtggcagtcaccatggaagatggacacaccatcgctttcctgggtgatagtcaagggcagctgcacagggtctacttgggcccagggagcgatggccacccatactccacacagagcatccagcaggggtctgcagtgagcagagacctcacctttgatgggacctttgagcacctgtatgtcatgacccagagcacacttctgaaggttcctgtggcttcctgtgctcagcacctggactgtgcatcttgccttgctcacagggacccatactgtgggtggtgcgtgctccttggcaggtgcagtcgccgttctgagtgctcgaggggccagggcccagagcagtggctatggagcttccagcctgagctgggctgtctgggatccggtggcggttccggtggtggaggcggaagcggcggtggaggatcaGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号4(ALB−L−SDPSIまたはALB SRGLI)は、N末端にアルブミンを有し、このアルブミンはリンカー、次いでSEMA3Cセマドメイン、次いでフーリンの天然の切断部位で切り縮められたpsiに融合されている。MAFRTICVLVGVFICSICVKHHHHHHHHMKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSGGGSGGGGGSGGGGSGSSQPQARVYLTFDELRETKTSEYFSLSHHPLDYRILLMDEDQDRIYVGSKDHILSLNINNISQEALSVFWPASTIKVEECKMAGKDPTHGCGNFVRVIQTFNRTHLYVCGSGAFSPVCTYLNRGRRSEDQVFMIDSKCESGKGRCSFNPNVNTVSVMINEELFSGMYIDFMGTDAAIFRSLTKRNAVRTDQHNSKWLSEPMFVDAHVIPDGTDPNDAKVYFFFKEKLTDNNRSTKQIHSMIARICPNDTGGLRSLVNKWTTFLKARLVCSVTDEDGPETHFDELEDVFLLETDNPRTTLVYGIFTTSSSVFKGSAVCVYHLSDIQTVFNGPFAHKEGPNHQLISYQGRIPYPRPGTCPGGAFTPNMRTTKEFPDDVVTFIRNHPLMYNSIYPIHKRPLIVRIGTDYKYTKIAVDRVNAADGRYHVLFLGTDRGTVQKVVVLPTNNSVSGELILEELEVFKNHAPITTMKISSKKQQLYVSSNEGVSQVSLHRCHIYGTACADCCLARDPYCAWDGHSCSRFYPTGKR
配列番号5(SDPSI−L−ALB)は、SEMA3Cセマドメインと、フーリン切断部位で切断されたpsiドメインとを有し、Psiドメインは、GSリンカーと、次いでアルブミンに融合されている。
MAFRTICVLVGVFICSICVKGSSQPQARVYLTFDELRETKTSEYFSLSHHPLDYRILLMDEDQDRIYVGSKDHILSLNINNISQEALSVFWPASTIKVEECKMAGKDPTHGCGNFVRVIQTFNRTHLYVCGSGAFSPVCTYLNRGRRSEDQVFMIDSKCESGKGRCSFNPNVNTVSVMINEELFSGMYIDFMGTDAAIFRSLTKRNAVRTDQHNSKWLSEPMFVDAHVIPDGTDPNDAKVYFFFKEKLTDNNRSTKQIHSMIARICPNDTGGLRSLVNKWTTFLKARLVCSVTDEDGPETHFDELEDVFLLETDNPRTTLVYGIFTTSSSVFKGSAVCVYHLSDIQTVFNGPFAHKEGPNHQLISYQGRIPYPRPGTCPGGAFTPNMRTTKEFPDDVVTFIRNHPLMYNSIYPIHKRPLIVRIGTDYKYTKIAVDRVNAADGRYHVLFLGTDRGTVQKVVVLPTNNSVSGELILEELEVFKNHAPITTMKISSKKQQLYVSSNEGVSQVSLHRCHIYGTACADCCLARDPYCAWDGHSCSRFYPTGKGSGGGSGGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHHHH*
配列番号6 SEMA3C:FC 2つのフーリン切断部位に変異を有し、C末端にリンカーおよびFc領域を有する、完全長SEMA3C。ヒトセマフォリン3Cのアミノ酸1〜20はシグナルペプチドをコードする;(ヒトSEMA3CのGly21〜Ser738:Arg551Ala、Arg552Ala、Arg611Ala、Arg612Ala);IEGRMDリンカーペプチド配列;ヒトIgG1(Pro100〜Lys330)およびリンカーDKTHTCPPCP。MAFRTICVLVGVFICSICVKGSSQPQARVYLTFDELRETKTSEYFSLSHHPLDYRILLMDEDQDRIYVGSKDHILSLNINNISQEALSVFWPASTIKVEECKMAGKDPTHGCGNFVRVIQTFNRTHLYVCGSGAFSPVCTYLNRGRRSEDQVFMIDSKCESGKGRCSFNPNVNTVSVMINEELFSGMYIDFMGTDAAIFRSLTKRNAVRTDQHNSKWLSEPMFVDAHVIPDGTDPNDAKVYFFFKEKLTDNNRSTKQIHSMIARICPNDTGGLRSLVNKWTTFLKARLVCSVTDEDGPETHFDELEDVFLLETDNPRTTLVYGIFTTSSSVFKGSAVCVYHLSDIQTVFNGPFAHKEGPNHQLISYQGRIPYPRPGTCPGGAFTPNMRTTKEFPDDVVTFIRNHPLMYNSIYPIHKRPLIVRIGTDYKYTKIAVDRVNAADGRYHVLFLGTDRGTVQKVVVLPTNNSVSGELILEELEVFKNHAPITTMKISSKKQQLYVSSNEGVSQVSLHRCHIYGTACADCCLARDPYCAWDGHSCSRFYPTGKRRSAAQDVRHGNPLTQCRGFNLKAYRNAAEIVQYGVKNNTTFLECAPKSPQASIKWLLQKDKDAAKEVKLNERIIATSQGLLIRSVQGSDQGLYHCIATENSFKQTIAKINFKVLDSEMVAVVTDKWSPWTWASSVRALPFHPKDIMGAFSHSEMQMINQYCKDTRQQHQQGDESQKMRGDYGKLKALINSIEGRMDPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHHHH*
配列番号7(スクランブルsiRNA)
AUCAAACUGUUGUCAGCGCUGUU
配列番号8(プレキシンB1siRNA1)
CCGGGUGGAAUUUAUCCUUGAUU
配列番号9(プレキシンB1siRNA2)
ACCACGGUCACCCGGAUUCUU
配列番号10 B1R4
MPALGPALLQALWAGWVLTLQPLPPTAFTPNGTYLQHLARDPTSGTLYLGATNFLFQLSPGLQLEATVSTGPVLDSRDCLPPVMPDECPQAQPTNNPNQLLLVSPGALVVCGSVHQGVCEQRRLGQLEQLLLRPERPGDTQYVAANDPAVSTVGLVAQGLAGEPLLFVGRGYTSRGVGGGIPPITTRALWPPDPQAAFSYEETAKLAVGRLSEYSHHFVSAFARGASAYFLFLRRDLQAQSRAFRAYVSRVCLRDQHYYSYVELPLACEGGRYGLIQAAAVATSREVAHGEVLFAAFSSAAPPTVGRPPSAAAGASGASALCAFPLDEVDRLANRTRDACYTREGRAEDGTEVAYIEYDVNSDCAQLPVDTLDAYPCGSDHTPSPMASRVPLEATPILEWPGIQLTAVAVTMEDGHTIAFLGDSQGQLHRVYLGPGSDGHPYSTQSIQQGSAVSRDLTFDGTFEHLYVMTQSTLLKVPVASCAQHLDCASCLAHRDPYCGWCVLLGRCSRRSECSRGQGPEQWLWSFQPELGCLQVAAMSPANISREETREVFLSVPDLPPLWPGESYSCHFGEHQSPALLTGSGVMCPSPDPSEAPVLPRGADYVSVSVELRFGAVVIAKTSLSFYDCVAVTELRPSAQCQACVSSRWGCNWCVWQHLCTHKASCDAGPMVASHQSPLVSPDPPARGGPSPSPPTAPKALATPAPDTLPVEPGAPSTATASDISPGASPSLLSPWGPWAGSGSISSPGSTGSPLHEEPSPPSPQNGPGTAVPAPTDFRPSATPEDLLASPLSPSEVAAVPPADPGPEALHPTVPLDLPPATVPATTFPGAMGSVKPALDWLTREGGELPEADEWTGGDAPAFSTSTLLSGDGDSAELEGPPAPLILPSSLDYQYDTPGLWELEEATLGASSCPCVESVQGSTLMPVHVEREIRLLGRNLHLFQDGPGDNECVMELEGLEVVVEARVECEPPPDTQCHVTCQQHQLSYEALQPELRVGLFLRRAGRLRVDSAEGLHVVLYDCSVGHGDCSRCQTAMPQYGCVWCEGERPRCVTREACGEAEAVATQCPAPLIHSVEPLTGPVDGGTRVTIRGSNLGQHVQDVLGMVTVAGVPCAVDAQEYEVSSSLVCITGASGEEVAGATAVEVPGRGRGVSEHDFAYQDPKVHSIFPARGPRAGGTRLTLNGSKLLTGRLEDIRVVVGDQPCHLLPEQQSEQLRCETSPRPTPATLPVAVWFGATERRLQRGQFKYTLDPNITSAGPTKSFLSGGREICVRGQNLDVVQTPRIRVTVVSRMLQPSQGLGGSGGGSGGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
Claims (54)
- 生物学的有効量のB1SP融合タンパク質をがん細胞に投与することを含み、前記B1SP融合タンパク質は、
(a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、がんを治療するための方法。 - 前記B1SP融合タンパク質は、前記構造安定化ドメインと前記半減期延長ドメインとの間に、リンカーおよびヒンジのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記構造安定化ドメインは、SCAQHLDCASCLAHRDPYCG WCVLLGRCSRRSECSRGQGPEQである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生物学的有効量は、がん細胞の細胞死を引き起こすか、または前記がん細胞の増殖を阻害するのに充分な量である、請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記がん細胞は、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、腎がん、神経膠芽腫、または子宮体がんである、請求項4に記載の方法。
- 前記がん細胞は前立腺がんである、請求項4または5に記載の方法。
- 前記前立腺がんは、アンドロゲン受容体(AR)陽性前立腺がんである、請求項4、5または6に記載の方法。
- 半減期延長部分は、断片結晶化可能領域(Fc領域)、免疫グロブリン結合ドメインドメインB(IgBD)、Novozymes Albufuseアルブミン、血清アルブミン、ユビキチン、ポリエチレングリコール(PEG)部分(PEG化)、Amunix XTEN、ポリペプチド骨格を有する非構造化ポリマー、ポリグリシン、エラスチン様ポリペプチド、ポリシアル酸、PAS化(Pro、AlaおよびSer(PAS))、糖鎖修飾、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとのカップリング)、およびHeptune(ヘパロサンのコンジュゲーション)から選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- アンドロゲン受容体(AR)陽性前立腺がんを死滅させるか、またはその増殖を阻害するための方法であって、B1SP融合タンパク質を含む生物学的有効量の組成物にAR陽性前立腺がんを接触させることを含み、前記B1SP融合タンパク質は、
(a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、方法。 - アンドロゲン枯渇療法およびB1SP融合タンパク質を施用することを含み、前記B1SP融合タンパク質は、
(a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、アンドロゲン依存性前立腺がんの成長を阻害する方法。 - 前記B1SP融合タンパク質は、前記構造安定化ドメインと前記半減期延長ドメインとの間に、リンカーおよびヒンジのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項9または10に記載の方法。
- アンドロゲン枯渇療法および前記B1SP融合タンパク質は、ほぼ同時に開始される、請求項10に記載の方法。
- 前記B1SP融合タンパク質は、アンドロゲン枯渇療法後に、および前記アンドロゲン依存性がんがアンドロゲン非依存性となる前に開始される、請求項10に記載の方法。
- 前記アンドロゲン枯渇療法は、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)類似体を投与することを含む、請求項10、12または13に記載の方法。
- アンドロゲン枯渇療法は、抗アンドロゲン治療を施用することを含む、請求項10、12または13に記載の方法。
- 前記アンドロゲン枯渇療法は、副腎アンドロゲン阻害剤を投与することを含む、請求項10、12または13に記載の方法。
- 前記アンドロゲン枯渇療法は外科的である、請求項10、12または13に記載の方法。
- 前記アンドロゲン枯渇療法および前記SEMA3C阻害剤は、1つまたは複数のさらに別の治療レジメン(複数可)と共に施用される、請求項10、12〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記治療レジメンは、化学療法レジメンである、請求項18に記載の方法。
- 前記治療レジメンは、放射線療法レジメンである、請求項17に記載の方法。
- 半減期延長部分は、断片結晶化可能領域(Fc領域)、免疫グロブリン結合ドメインドメインB(IgBD)、Novozymes Albufuseアルブミン、血清アルブミン、ユビキチン、ポリエチレングリコール(PEG)部分(PEG化)、Amunix XTEN、ポリペプチド骨格を有する非構造化ポリマー、ポリグリシン、エラスチン様ポリペプチド、ポリシアル酸、PAS化(Pro、AlaおよびSer(PAS))、糖鎖修飾、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとのカップリング)、およびHeptune(ヘパロサンのコンジュゲーション)から選択される、請求項9〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記B1SP融合タンパク質は配列番号2を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- がんを治療するための医薬品の製造へのB1SP融合タンパク質の使用であって、前記B1SP融合タンパク質は、
(a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、使用。 - がんを治療するためのB1SP融合タンパク質の使用であって、前記B1SP融合タンパク質は、
(a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、使用。 - 前記B1SP融合タンパク質は、前記構造安定化ドメインと前記半減期延長ドメインとの間に、リンカーおよびヒンジのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項23または24に記載の使用。
- 前記構造安定化ドメインは、SCAQHLDCASCLAHRDPYCG WCVLLGRCSRRSECSRGQGPEQである、請求項23、24または25に記載の使用。
- 前記治療は、がん細胞の細胞死を引き起こすか、または前記がん細胞の増殖を阻害するのに充分な量である、請求項23〜26のいずれか1項に記載の使用。
- 前記がん細胞は、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、腎がん、神経膠芽腫、または子宮体がんである、請求項23〜27のいずれか1項に記載の使用。
- 前記がん細胞は前立腺がんである、請求項23〜28のいずれか1項に記載の使用。
- 前記前立腺がんは、アンドロゲン受容体(AR)陽性前立腺がんである、請求項23〜29のいずれか1項に記載の使用。
- 半減期延長部分は、断片結晶化可能領域(Fc領域)、免疫グロブリン結合ドメインドメインB(IgBD)、Novozymes Albufuseアルブミン、血清アルブミン、ユビキチン、ポリエチレングリコール(PEG)部分(PEG化)、Amunix XTEN、ポリペプチド骨格を有する非構造化ポリマー、ポリグリシン、エラスチン様ポリペプチド、ポリシアル酸、PAS化(Pro、AlaおよびSer(PAS))、糖鎖修飾、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとのカップリング)、およびHeptune(ヘパロサンのコンジュゲーション)から選択される、請求項23〜30のいずれか1項に記載の使用。
- 前記B1SP融合タンパク質は、配列番号2を含む、請求項23〜31のいずれか1項に記載の使用。
- (a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、がんの治療のためのB1SP融合タンパク質。 - 前記構造安定化ドメインと前記半減期延長ドメインとの間に、リンカーおよびヒンジのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項33に記載のB1SP融合タンパク質。
- 前記構造安定化ドメインは、SCAQHLDCASCLAHRDPYCG WCVLLGRCSRRSECSRGQGPEQである、請求項33または34に記載のB1SP融合タンパク質。
- 前記治療は、がん細胞の細胞死を引き起こすか、または前記がん細胞の増殖を阻害するのに充分な量である、請求項33、34または35のいずれか1項に記載のB1SP融合タンパク質。
- 前記がん細胞は、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、腎がん、神経膠芽腫、または子宮体がんである、請求項33〜36のいずれか1項に記載のB1SP融合タンパク質。
- 前記がん細胞は前立腺がんである、請求項33〜37のいずれか1項に記載のB1SP融合タンパク質。
- 前記前立腺がんは、アンドロゲン受容体(AR)陽性前立腺がんである、請求項33〜38のいずれか1項に記載のB1SP融合タンパク質。
- 半減期延長部分は、断片結晶化可能領域(Fc領域)、免疫グロブリン結合ドメインドメインB(IgBD)、Novozymes Albufuseアルブミン、血清アルブミン、ユビキチン、ポリエチレングリコール(PEG)部分(PEG化)、Amunix XTEN、ポリペプチド骨格を有する非構造化ポリマー、ポリグリシン、エラスチン様ポリペプチド、ポリシアル酸、PAS化(Pro、AlaおよびSer(PAS))、糖鎖修飾、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとのカップリング)、およびHeptune(ヘパロサンのコンジュゲーション)から選択される、請求項33〜39のいずれか1項に記載のB1SP融合タンパク質。
- 配列番号2を含むアミノ酸配列を有する、請求項33〜40のいずれか1項に記載のB1SP融合タンパク質。
- B1SP融合タンパク質を生理的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物であって、前記B1SP融合タンパク質は、
(a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、医薬組成物。 - 前記B1SP融合タンパク質は、前記構造安定化ドメインと前記半減期延長ドメインとの間に、リンカーおよびヒンジのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項42に記載の医薬組成物。
- 前記構造安定化ドメインは、SCAQHLDCASCLAHRDPYCG WCVLLGRCSRRSECSRGQGPEQである、請求項42または43に記載の医薬組成物。
- 前記治療は、がん細胞の細胞死を引き起こすか、または前記がん細胞の増殖を阻害するのに充分な量である、請求項42、43または44のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記がん細胞は、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、腎がん、神経膠芽腫、または子宮体がんである、請求項43〜45のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記がん細胞は前立腺がんである、請求項43〜46のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記前立腺がんは、アンドロゲン受容体(AR)陽性前立腺がんである、請求項43〜47のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 半減期延長部分は、断片結晶化可能領域(Fc領域)、免疫グロブリン結合ドメインドメインB(IgBD)、Novozymes Albufuseアルブミン、血清アルブミン、ユビキチン、ポリエチレングリコール(PEG)部分(PEG化)、Amunix XTEN、ポリペプチド骨格を有する非構造化ポリマー、ポリグリシン、エラスチン様ポリペプチド、ポリシアル酸、PAS化(Pro、AlaおよびSer(PAS))、糖鎖修飾、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとのカップリング)、およびHeptune(ヘパロサンのコンジュゲーション)から選択される、請求項43〜48のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記B1SP融合タンパク質は、配列番号2を含むアミノ酸配列を有する、請求項43〜49のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前立腺がんの治療での使用のためのB1SP融合タンパク質および取扱説明書を含み、前記B1SP融合タンパク質は、
(a)セマドメイン、
(b)構造安定化ドメイン、および
(c)半減期延長部分
を含む、商業用パッケージ。 - 前記B1SP融合タンパク質は、前記構造安定化ドメインと前記半減期延長ドメインとの間に、リンカーおよびヒンジのうち1つまたは複数をさらに含む、請求項51に記載の商業用パッケージ。
- 半減期延長部分は、断片結晶化可能領域(Fc領域)、免疫グロブリン結合ドメインドメインB(IgBD)、Novozymes Albufuseアルブミン、血清アルブミン、ユビキチン、ポリエチレングリコール(PEG)部分(PEG化)、Amunix XTEN、ポリペプチド骨格を有する非構造化ポリマー、ポリグリシン、エラスチン様ポリペプチド、ポリシアル酸、PAS化(Pro、AlaおよびSer(PAS))、糖鎖修飾、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとのカップリング)、およびHeptune(ヘパロサンのコンジュゲーション)から選択される、請求項51または52に記載の商業用パッケージ。
- 前記B1SP融合タンパク質は、配列番号2を含むアミノ酸配列を有する、請求項51〜53のいずれか1項に記載の商業用パッケージ。
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