JP2018506994A - 非天然セマフォリン３およびそれらの医学的使用 - Google Patents

非天然セマフォリン３およびそれらの医学的使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、非天然型突然変異セマフォリン３分子に関する。特に、本発明は、例えば、血管新生疾患およびがんの治療における改善された特性および薬理作用を示す突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関する。さらに、本発明は、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそのような核酸を含むベクターおよび宿主に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドを製造する方法に関し、疾患の治療に、特に血管新生疾患、腫瘍および／またはがんの内科的介入にそれらを使用する方法に関する。

Description

本発明は、非天然型突然変異セマフォリン３分子に関する。特に、本発明は、例えば、血管新生疾患およびがんの治療における改善された特性および薬理作用を示す突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関する。さらに、本発明は、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそのような核酸を含むベクターおよび宿主に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドを製造する方法に関し、疾患の治療に、特に血管新生疾患、腫瘍および／またはがんの内科的介入にそれらを使用する方法に関する。
がんの発生、進行および転移は、血管新生、すなわち新しい血管の形成に決定的に依存する。さらに、血管の壁を覆う血管内皮細胞（ＥＣ）における弱い細胞間接触に起因する屈曲、漏出、および鞘性壁周皮細胞の欠如などの異常により、がん血管は、構造的および機能的に異常である（Goel et al., 2011）。結果として、血管透過性ががん組織において一般的に高くなり、タンパク質および体液が血管外コンパートメントに蓄積して、間質圧が著しく上昇し、最終的に抗がん薬の送達が阻害される（Goel et al., 2011）。さらに、慢性酸素不足は、肝細胞増殖因子／Ｍｅｔチロシンキナーゼシグナル伝達を上方制御する（Michieli, 2009）ものであり、これは、異常な血管透過性と相まって、がん細胞の血管内への侵入、血流を介しての播種および転移に著しく有利である。がんにおける血管の構造および機能の正常化は、標準的な血管新生阻害療法に随伴する不適切な血管の除去によってその代わりに損なわれ得る、標準的な抗がん療法の有効性のかなり大きな増大をもたらし得る（Van der Veldt et al., 2012）。注目すべきことに、多くの証拠により、血管正常化療法の最も効果的な恩恵が、がん幹細胞の著しい増加（Conley et al., 2012）、がん細胞の分化の誘導（Michieli, 2009）ならびにがんの浸潤および転移の刺激（Michieli, 2009；Sennino and McDonald, 2012）などの種々の低酸素駆動型現象のがんにおける軽減によってどのようして得られるかが示されている。したがって、ほぼ正常な血管ネットワークにおける異常ながん血管を転換する能力を得るために、生理学的血管形態形成を下支えし、したがって、例えば、（固形）がんにおけるように、異常な血管形態形成が起こり、かつ／または正常な血管形態形成が乱される障害の治療における医学上有用である分子が特定される必要がある。
セマフォリン３Ａ（マウスにおけるＳｅｍａ３ＡおよびヒトにおけるＳＥＭＡ３Ａとしても公知である）は、生理的血管正常化分子である。従来技術研究で、がん血管系／がんにおける異常な血管の発生を正常化することを目的とした療法に原理上は薬理学的に活用され得る分子が特定された（Goel et al., 2011）。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの、血管新生促進因子の阻害は、がん血管系を正常化し得る。それにもかかわらず、この種の臨床的介入による主要な障害は、これらの血管新生促進因子が限定的で一時的な有効性を示すという事実によって表される（Goel et al., 2011）。さらに、血管ネットワークは、血管新生促進および血管新生阻害因子の同時かつバランスのとれた制御下にあり、それらの両方の機能ががん組織において変化している（Maione et al., 2012；Maione et al., 2009）。
胚血管の発達中に、ＥＣは、多細胞生物における主なクラスの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）受容体である、インテグリンを阻害することによって、血管系の再形成に必要な可塑性を血管系に与える分泌型クラス３セマフォリン（Ｓｅｍａ３としても公知）の自己分泌化学反発シグナルを発生する（Serini et al., 2003）。がんの種々のトランスジェニックマウスモデルにより、がん血管新生時にセマフォリン３Ａが、ＥＣにおいても発現し、前悪性病変に存在する内因性阻害剤としての役割を果たすが、がんの進行時に喪失することが明らかにされた（Maione et al, 2009）。重要なことに、顕性がん病変におけるセマフォリン３Ａの欠如は、ＥＣにおけるインテグリンの活性化の劇的な増大と明らかに相関していた（Maione et al., 2009）。体細胞遺伝子の導入によりセマフォリン３Ａをがんに再導入することによって、活性内皮インテグリンの生理的量が回復し、血管密度の低下、血管の構造的および機能的正常化、がんの成長および転移の阻害、ならびに著しい生存延長が最終的にもたらされる（Maione et al., 2012；Maione et al., 2009）。したがって、セマフォリン３Ａは、生理学的血管正常化物質であり得る（Serini et al., 2012）。
セマフォリン３Ａは、７種のクラスへの分類がそれらのＣ末端に位置する特有のドメインの類似性に依拠するセマフォリン（Ｓｅｍａと呼ぶ）ファミリーに属している（Tran et al., 2007）。それらのＮ末端は、７枚のβプロペラである「ｓｅｍａドメイン」（Gherardi et al., 2004）とそれに続くプレキシン−セマフォリン−インテグリン（ＰＳＩ）ドメインを含む。
セマフォリンは、プレキシン（Kumanogoh and Kikutani, 2013；Tamagnone et al., 1999）を介してシグナルを伝達するホモ二量体リガンドであり、プレキシンは、細胞外ｓｅｍａドメイン、ならびにＥＣＭタンパク質へのインテグリン媒介細胞接着を促進するそれらの能力について公知である（Kinbara et al., 2003；Shattil et al., 2010）２つの低分子量ＧＴＰアーゼであるＲ−Ｒａｓ（Kumanogoh and Kikutani, 2013；Tran et al., 2007）およびＲａｐ１（Bos and Pannekoek, 2012；Wang et al., 2012）を阻害する細胞質ゾルＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）活性を有するｓｅｍａドメイン含有受容体の一クラスである。セマフォリン３Ａは、細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ＥＲＫ１／２）の活性化およびリン酸化を介してシグナルを伝達する（Kruger et al., 2005）。膜結合セマフォリンのｓｅｍａドメインのホモ二量体は、プレキシンのｓｅｍａドメインに高い親和力で直接結合する。これは、プレキシンの二量体化および活性化を誘発する（Janssen et al., 2010；Nogi et al., 2010）。セマフォリン３Ａのような、一部のセマフォリンでは、受容体複合体は、Ａ型プレキシン（プレキシンＡ）と共同してニューロピリン１（Ｎｒｐ１）により形成され（Tamagnone et al., 1999）、リガンド結合およびシグナル伝達サブユニットを示す（Kumanogoh and Kikutani, 2013）。一貫して、ｓｅｍａ−ＰＳＩおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインの下流おいて、セマフォリン３Ａおよび他の分泌型セマフォリンは、Ｃ末端塩基性アミノ酸ストレッチを含む。ジスルフィド結合Ｉｇ様ドメインは、ｓｅｍａドメインホモ二量体化を物理的に安定化し得るが、Ｃ末端塩基性ストレッチは、Ｎｒｐ１の細胞外部分におけるｂ１サブドメインのセマフォリン３Ａとの高親和性結合に必要である（図１）（Kumanogoh and Kikutani, 2013）。
セマフォリン３Ａは、切断されたならば、分子のこのＣ末端部分の放出をもたらし得る、複数のフリンプロテアーゼ認識モチーフを含む。これは、Ｎｒｐ１へのセマフォリン３Ａの結合ならびにセマフォリン３Ａホモ二量体の安定化の障害をもたらす（Adams et al., 1997；Koppel and Raper, 1998；Parker et al., 2010；Parker et al., 2012）。セマフォリン３Ａは、プレキシンに高親和力で直接結合しない（Tamagnone et al., 1999）ので、そのフリン依存性切断およびＮｒｐ１結合の欠如が、いくつかの生物学的状況における活性の劇的喪失、特に、ニューロン成長円錐の崩壊をもたらすことが見いだされた（Koppel and Raper, 1998）。とりわけ、フリンプロテアーゼは、組織に広く存在し、これは、セマフォリン３Ａに対する固有の調節機構を備えている。さらに、これらのプロテアーゼは、セマフォリン３Ａの活性を短寿命にし得る。
Ｎｒｐ１へのセマフォリン３Ａの結合は、がんの進行を促進する無血管がん領域内へのマクロファージのセマフォリン３Ａ誘発性侵入の原因となる（Casazza et al., 2013）。したがって、野生型セマフォリン３ＡとＮｒｐ１との高親和性相互作用は、有効な抗がん薬としてのその利用可能性を制限し、がんの進行に有利でさえある可能性がある。
本発明の基礎をなす技術的問題は、血管新生障害、腫瘍性疾患および／またはがんの療法の改善のための手段および方法の提供である。
技術的問題は、下文に記載し、添付の特許請求の範囲において明らかにされる実施形態の提供により解決される。
本発明は、非天然型／遺伝子改変型／突然変異型のクラス３のセマフォリン、特に、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択される、非天然型／遺伝子改変／突然変異セマフォリン、最も好ましくは、非天然型／遺伝子改変／突然変異セマフォリン３Ａに関する。
したがって、本発明は、
（ａ）配列番号２に示す野性型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、または
（ｂ）他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野性型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、かつ
（ｃ）前記セマフォリン３が、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択され、好ましくは前記セマフォリン３がセマフォリン３Ａである、
突然変異セマフォリン３（あるいは血管新生の阻害剤として機能するその機能性断片または前記突然変異セマフォリンもしくは前記機能性断片を含む融合タンパク質／ポリペプチド）に関する。
したがって、本発明は、一般的に、天然に存在せず、配列番号２に示す例示的なセマフォリン３Ａの１０６位におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含むセマフォリン３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄを提供する。下文にセマフォリン３Ａ以外のセマフォリン３タンパク質、すなわち、セマフォリン３Ｂ、ＣおよびＤにおけるこの突然変異の対応する位置を例示する。
これらの突然変異セマフォリン３の例は、配列番号２に示す野性型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；配列番号６に示す野性型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；配列番号１０に示す野性型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；または配列番号１４に示す野性型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸を含むセマフォリンである。
言い換えれば、本発明は、非天然型／遺伝子改変型セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよび／またはセマフォリン３Ｄを提供し、前記セマフォリン３、前記その機能性断片および／または前記融合タンパク質／ポリペプチドは、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、ここで、
Ｘ１は、ＫまたはＮであり、
Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
Ａ３は、前記アラニンを置換する前記親水性アミノ酸である。
本明細書で提供するコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤは、本発明において初めて特定する。
本発明はまた、本発明の非天然型ポリペプチド、すなわち、本明細書で特徴付け、記載した突然変異セマフォリン３Ａ、突然変異セマフォリン３Ｂ、突然変異セマフォリン３Ｃおよび／または突然変異セマフォリン３Ｄからなる群から選択される突然変異セマフォリン３をコードする核酸分子に関する。また非天然型セマフォリン３の本明細書で定義した機能性断片をコードする核酸分子および本発明の非天然型セマフォリン３または前記機能性断片を含む融合タンパク質／ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本明細書に示したように、本発明の機能性断片および融合ポリペプチド／タンパク質は、血管新生の驚くほど高い阻害を保持し、かつ／または疾患組織（がん組織および／または腫瘍におけるように）の驚くほど高い血管正常化の能力がある。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明のポリペプチドは、本明細書で定義した突然変異セマフォリン３またはその機能性断片である。本発明のポリペプチドは、突然変異セマフォリン３（または本明細書で定義したような突然変異セマフォリン３の機能性断片）を含む融合タンパク質も含む。本発明のポリペプチド、特に本明細書で定義した融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として、かつ／または血管正常化剤として機能し、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは、親水性アミノ酸により置換され、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
特に、本発明は、核酸分子に関し、コードされる突然変異セマフォリン３（または前記その機能性断片もしくは前記融合ポリペプチド／タンパク質）は、アミノ酸配列コンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、ここで、
Ｘ１は、ＫまたはＮである、アミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
アラニン（Ａ３）は、前記親水性アミノ酸、特にリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジン、より好ましくはリシンまたはアルギニン、最も好ましくはリシンにより置換されている。
本明細書で提供する非天然型／人工／突然変異セマフォリン（あるいはそれらの本明細書で述べた機能性断片および／または前記非天然型／人工／突然変異セマフォリンを含む融合タンパク質あるいは前記セマフォリンの前記非天然型／人工／突然変異機能性断片）は、高い医療的潜在能力を有する。添付の実施例において例示するように、本明細書で提供する発明の分子の医療的用途は、ｉｎ ｖｉｖｏがんモデルにおけるがんの進行および転移の驚くべき低減である。このｉｎ ｖｉｖｏでの効果は、野生型セマフォリン３Ａのような天然に存在するセマフォリンについて文書化されたまたは認められた任意の効果と比べて驚くほど優れている。本明細書で定義したセマフォリン３の本明細書で特定されたコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤ内の親水性アミノ酸による（天然に存在する）アラニン（Ａ３）の人工的置換を含む特定の選択されるセマフォリン（セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択されるクラス３のセマフォリン）による、この驚くべき効果を本明細書で例示する。前記セマフォリンにおける（または前記モチーフを含むその機能性断片における）この置換は、前記セマフォリン（セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択される）の非修飾の天然に存在する野生型と比較して、そのプレキシン受容体に対する親和性の驚くべき増大をもたらす。言い換えれば、本発明は、クラス３の、突然変異セマフォリン３Ａ、突然変異セマフォリン３Ｂ、突然変異セマフォリン３Ｃおよび突然変異セマフォリン３Ｄからなる群から選択される非天然型、突然変異セマフォリンを提供する。したがって、本発明は、突然変異セマフォリン３Ａ、突然変異セマフォリン３Ｂ、突然変異セマフォリン３Ｃおよび突然変異セマフォリン３Ｄからなる群から選択されるクラス３の非天然型、突然変異セマフォリンを提供する。本明細書で述べた突然変異セマフォリン３（または本発明のこれらの突然変異セマフォリンの機能性断片および本明細書で述べた突然変異非天然型セマフォリンもしくはそれらの機能性断片を含む融合タンパク質）は、プレキシン受容体に驚くほど高い親和力で結合する。結合親和性の増大は、両価性（ambivalent）Ｎｒｐ１タンパク質の関与の必要を回避する。さらに、突然変異セマフォリン３（または本明細書で述べたその機能性断片または本明細書で述べた融合タンパク質）とプレキシン受容体との間の高親和性結合は、所望の血管正常化および／または生理的、非疾患血管新生をもたらすその下流経路を効果的に誘発する。理論により拘束されるものではないが、本発明の突然変異セマフォリン３（または機能性断片またはそれを含む本発明の融合タンパク質）は、複数のフリンプロテアーゼ認識モチーフを含むＩｇ様ドメイン／塩基性ストレッチ領域と無関係にそのプレキシン受容体との高親和性結合を可能にする。特定の実施形態では、本発明は、Ｉｇ様ドメイン／塩基性ストレッチ領域が欠失している、突然変異セマフォリン３またはその断片に関する。上述のようにまた添付の図２に示すようにプロテアーゼ（フリン）切断部位の欠如のため、本発明のタンパク質の保持時間は、延長し得る。
下文の添付のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実施例で実証されているように、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択されるセマフォリン３（またはその機能性断片）のコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける親水性アミノ酸によるアラニンＡ３の置換がそのプレキシン受容体への結合の増大をもたらすことが驚くべきことに見いだされた。したがって、発明の非天然型突然変異セマフォリン３（あるいはその機能性断片または前記セマフォリン３を含む融合ポリペプチド／タンパク質もしくはそれらの機能性断片）は、Ｎｒｐ１と無関係にプレキシン受容体に高い親和力で結合する。セマフォリン３のコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける（またはその突然変異／修飾を有する前記コンセンサスモチーフを含む前記セマフォリン３の機能性断片における）親水性アミノ酸によるアラニンの置換が、プレキシン受容体の驚くべき活性化の増大、およびヒトＥＣの走触性移動の驚くべき阻害の増大をもたらすことも本明細書で実証されている。プレキシン受容体結合および活性化は、インテグリン活性化、細胞接着およびＥＣＭタンパク質上の移動の制御における重要なステップである。理論により拘束されるものではないが、セマフォリンによるプレキシン受容体の活性化により、インテグリンが不活性化し、ひいてはＥＣＭ内の細胞の運動性が低下する。細胞移動は、がん細胞の進行および転移巣播種に不可欠である。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３（およびその機能性断片）は、がんの進行および転移を効果的に阻害するために用いることができる。理論により拘束されるものではないが、発明の突然変異セマフォリン３（および／またはその機能性断片および／または前記突然変異セマフォリンもしくは本明細書で定義した機能性断片を含む融合タンパク質／ポリペプチド）は、対応するプレキシン受容体に高親和力で結合し、対応する下流経路を効果的に活性化し、細胞運動性を効果的に阻害する。実施例において示し、実証するように、クラス３の特定のセマフォリン（セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄ）における本明細書で定義した人工的に導入された修飾は、がんの進行および／または転移のｉｎ ｖｉｖｏでの低減の増大を示す驚くほどに有効な分子をもたらす。本明細書で述べた突然変異／非天然型セマフォリン様分子は、天然セマフォリン３と比較した場合、驚くほどにより良好なｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ特性を示す。セマフォリン３のコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける（あるいは前記突然変異モチーフを有するその機能性断片におけるまたは本明細書で定義した非天然型セマフォリン３を含むもしくは本明細書で定義した機能性断片を含む融合ポリペプチド／タンパク質における）アラニンの置換ががんの進行および転移の低減の増大をもたらすことが本明細書で示され、かつ添付の実施例において示されている。前記アラニン（Ａ３）の置換は、好ましくは親水性アミノ酸、最も好ましくはリシンである。非天然型の突然変異セマフォリン３におけるがんの進行および転移のこのもたらされる低減は、野性型セマフォリン３Ａのような従来のまたは天然セマフォリンについて認められる効果よりも驚くべきことに優れている。特に、本明細書に示したｉｎ ｖｉｖｏデータにより、がんの成長および転移巣体積（metastasis volume）の驚くほどにさらに高い阻害が証明されている。ヒトがんの２つのマウスモデルにより、有益な薬理効果が証明されている。
したがって、添付の実施例で実証されているように、および本明細書で説明するように、本発明のセマフォリン（および／またはその機能性断片および／または本明細書で述べた融合ポリペプチド／タンパク質）は、従来のまたは天然セマフォリンと比較して血管新生障害および／または腫瘍性疾患の治療に優れている。
本発明のセマフォリンの（または機能性断片（複数可）または本発明の非天然型セマフォリンを含むもしくは前記機能性断片を含む融合ポリペプチド／タンパク質の）優れた効果は、例えば、添付の実施例におけるセマフォリン３Ａ Ａ１０６Ｋ（１０６位におけるアラニンのリシンへの突然変異）（例えば、配列番号１８または２０に示すセマフォリン３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ）（添付の図３参照）のようなコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける親水性アミノ酸によるアラニン（Ａ３）の置換に起因する。添付の実施例において示すように、保存モチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける点突然変異（例えば、配列番号４３または４４に示す核酸配列をコードする、セマフォリン３Ａ ΔＩｇ−ｂ）（添付の図２参照）を欠くことを除いて、セマフォリン３Ａ Ａ１０６Ｋと同じ構造を有するセマフォリン３構築物は、有益な薬理効果を示さなかった。したがって、本発明において実証された驚くべき有益な効果は、マウスならびに／またはヒトＳｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３ＣおよびＳｅｍａ３ＤのＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける本明細書で述べた突然変異に帰すことができる。好ましくは、本発明は、アラニン（Ａ３）における本明細書で定義した突然変異を含むＳｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３ＣおよびＳｅｍａ３Ｄからなる群から選択されるヒトセマフォリン３（または本明細書で定義したコンセンサスモチーフを含むこれらのヒトセマフォリンの機能性断片）に関する。最も好ましくは、本発明は、配列モチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおけるアラニン（Ａ３）の本明細書で述べた置換を含む本明細書で定義したモチーフを含む突然変異ヒトＳｅｍａ３Ａ（または前記ヒトＳｅｍａ３Ａの機能性断片）に関する。前記置換は、親水性アミノ酸による置換、最も好ましくはリシン（Ｋ）による置換である。突然変異させたアラニン（Ａ３）は、マウスならびにヒトＳｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３ＣおよびＳｅｍａ３Ｄに見いだすことができる高度に保存された配列モチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤの一部である。添付の図３を参照のこと。これと整合して、添付の実施例に示されている同等の有益な効果は、（ヒト）Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃおよび／またはＳｅｍａ３Ｄにおける親水性アミノ酸（Ｋのような）による前記アラニンの置換により予測され、また得られることが妥当と思われる。
ヒトならびにマウスＳｅｍａ３Ｅ、Ｓｅｍａ３ＧおよびＳｅｍａ３Ｆは、天然に存在する親水性アミノ酸を有し、アラニンＡ３残基は、コンセンサス配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫに存在する。したがって、それらは、配列番号２に示すセマフォリン３Ａの１０６位に対応する位置に親水性アミノ酸を有する。Ｓｅｍａ３ＥおよびＳｅｍａ３Ｇの両方がこの位置にリシンを含み、Ｓｅｍａ３Ｆはセリンを含む。それにもかかわらず、Ｓｅｍａ３ＥおよびＳｅｍａ３Ｆは、以下で説明し、添付の実施例で示すように本発明のセマフォリン３について示された発明の特性を示さない。Ｓｅｍａ３Ｆにおける１０７位におけるリシンによるセリンの置換は、プレキシンＡ、Ｂ、ＣまたはＤ受容体への結合を増大させない。さらに、この突然変異体は、本発明の突然変異セマフォリン３または機能性断片について本明細書で示されている、１０７位にセリンを示すその野生型カウンターパートよりも効果的にＥＣの移動を阻害することができない。添付の実施例２および図１２を参照のこと。さらに、Ｆｃタグセマフォリン３Ｅおよびセマフォリン３Ｆは、親水性アミノ酸によるアラニンの本発明の置換を含む例示的な突然変異セマフォリン３Ａほど強くはＥＣの移動を阻害することができない。例示的図１３を参照のこと。したがって、本明細書で提供する本発明の突然変異セマフォリン、すなわち、突然変異セマフォリン３Ａ、突然変異セマフォリン３Ｂ、突然変異セマフォリン３Ｃおよび突然変異セマフォリン３Ｄは、配列番号２に示すセマフォリン３Ａの１０６位に対応する位置に天然に存在する親水性アミノ酸を含むセマフォリン３と比較してＥＣ細胞の運動性の驚くほどに優れた阻害剤である。細胞運動性の示された強い阻害は、本発明の突然変異セマフォリン３タンパク質が天然に存在するセマフォリン３と比較して血管新生障害および／または腫瘍性疾患の療法において優れていることを示すものである（下文も参照）。
したがって、本発明は、（ヒト）Ｓｅｍａ３Ｅ、Ｓｅｍａ３Ｆおよび／またはＳｅｍａ３Ｇに関連しない。
Ｓｅｍａ３Ａ／３Ｂ／３Ｃもしくは３Ｄにおける（またはその機能性断片における）コンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける例えば、リシンによるアラニン（Ａ３）の置換（とりわけ、Ｓｅｍａ３Ａの交換Ａ１０６Ｋのような）は、２種のトランスジェニックマウスモデル、すなわち、自然発症膵神経内分泌がん（ＲｉｐＴａｇ２）および膵管腺がん（ＰＤＡＣ）におけるがんの成長および転移巣形成の阻害の増大をもたらす。実施例２を参照のこと。ＰＤＡＣマウスは、高頻度かつ致死的ヒト膵がん組織型のモデルである。最も重要なことに、かつ驚くべきことに、非経口的に送達されたＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋは、ＡＡＶ８野生型Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と比較してＰＤＡＣマウスにおける優れた薬理効果を示す。詳細には、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋは、がんの成長を６４％（添付の図１１Ａ参照）、肝臓転移の発生率を８１％（添付の図１１Ｂ参照）阻害し、転移巣体積を７８％減少させた。ＡＡＶ−８送達野生型Ｓｅｍａ３Ａは、がんの成長を５２％（添付の図１０Ａ参照）、肝臓転移の発生率を５９％阻害したにすぎなかった。さらに、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋは、ヒトがんを繰り返すマウスモデルにおける血管面積を減少させ、周皮細胞の被覆を増大させることによってがん血管の正常化を促進し、血管潅流を増加させ、がん低酸素を阻害した（添付の図１１Ｃ参照）。
したがって、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋのような、本発明の突然変異／非天然型セマフォリンは、従来の非修飾セマフォリンと比較してがんの進行および転移巣播種の低減にすぐれた効果をもたらす。
さらに、非経口的に投与したＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋは、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）送達全長Ｓｅｍａ３Ａと同様にＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの生存期間を延長させた。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋは、ｉ）がん体積の６７％の減少をもたらし；ｉｉ）がん血管面積を５１％効果的に減少させ（添付の図９Ａ参照）；ｉｉｉ）周皮細胞被覆の増加によりがん血管の正常化を有利にし（添付の図９Ｂ参照）；ｉｖ）潅流を増大させ（添付の図９Ｃ参照）、組織低酸素を低減した（添付の図９Ｄ参照）。したがって、本発明は、Ｎｒｐ１結合と無関係である、その驚くべき治療効果を実証する。
さらに、突然変異セマフォリン３タンパク質（および／またはその機能性断片および／または前記突然変異セマフォリンもしくはそこで定義した断片を含む融合タンパク質／ポリペプチド）の優れた効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験においても証明されている。添付の実施例を参照のこと。突然変異セマフォリン３Ａ Ａ１０６Ｋに見いだされたような、セマフォリン３またはその機能性断片のコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける親水性アミノ酸によるアラニン（Ａ３）の置換は、野生型Ｓｅｍａ３ＡまたはＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂと比較してプレキシンＡ４への高親和性結合をもたらす。添付の実施例を参照のこと。さらに、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋは、従来のセマフォリンと比較してＲａｐ１低分子量ＧＴＰアーゼのＧＴＰ負荷の阻害の増大（添付の図８Ａ参照）およびＥＲＫ１／２キナーゼのリン酸化の増大（添付の図８Ｂ参照）を示す。したがって、突然変異セマフォリン３（またはその機能性断片またはそれを含む融合ポリペプチド／タンパク質）は、天然ヒトＳｅｍａ３Ａのような、従来のセマフォリンと比較してプレキシンサブユニットに例外的に高い親和力で結合し、がん血管の正常化をもたらすその下流経路を効果的に誘発する。
さらに、セマフォリン３タンパク質は、ＥＣＭタンパク質へのＥＣの走触性移動などの、インテグリンを介する細胞運動性を制御する。ＥＣＭタンパク質上およびＥＣＭタンパク質へのインテグリン媒介性細胞移動は、血管形成（血管新生）および全身へのがん細胞の播種（転移）などの、いくつかの生理学的および病理学的状況において極めて重要な役割を果たす（Desgrosellier and Cheresh, 2010）。したがって、従来のまたは非天然型セマフォリン３またはその機能性断片に反応しての細胞の移動を解析した。驚くべきことに、セマフォリン３またはその機能性断片のコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける親水性アミノ酸によるアラニン（Ａ３）の置換は、従来のセマフォリンと比較してヒト臍静脈内皮細胞（ＥＣ）の方向性がある移動のさらに高い阻害をもたらす（添付の図６Ａ〜Ｃ参照）。市販のヒト野生型セマフォリン３Ａおよびマウスセマフォリン３ＡΔＩｇ−ｂは、ＥＣの運動性を１９〜２５％低下させたにすぎなかった（表３）。重要なことに、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋのような、突然変異セマフォリン３タンパク質（および／またはその機能性断片および／または前記突然変異セマフォリンもしくはそこで定義した断片を含む融合タンパク質／ポリペプチド）は、ＥＣの運動性の最も効果的な阻害剤である。特に、最大（３，５ｎＭ）用量の市販のヒトＳＥＭＡ３Ａ ＷＴは、ＥＣの方向性がある移動を２０％阻害したが、１７．５倍低い（０．２ｎＭ）用量のヒトＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ（例えば、配列番号１８）は、ＥＣの運動性を４６％阻害した（表４）。
したがって、本発明の突然変異セマフォリン３（またはその機能性断片および／または突然変異、非天然型セマフォリンもしくはそれらの機能性断片を含む本発明の融合ポリペプチド／タンパク質）は、従来のセマフォリンと比較して細胞の運動性の優れた阻害剤である。細胞運動性の阻害は、がん細胞の転移性播種も減弱させる。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３（またはその機能性断片および／または突然変異、非天然型セマフォリンもしくはそれらの機能性断片を含む本発明の融合ポリペプチド／タンパク質）は、従来のセマフォリンと比較してがん細胞の形成および転移性播種の優れた阻害剤である。
したがって、添付の実施例における実験データは、血管新生障害および／または腫瘍性疾患／がんの療法の改善に本発明の突然変異セマフォリン３（または機能性断片またはそれを含む融合タンパク質／ポリペプチド）を使用する明確な論理的根拠となるものである。
本発明は、とりわけ従来の血管新生阻害剤と比べて以下の利点を有する。本発明の１つの利点は、本発明の化合物、すなわち、本明細書で述べた突然変異セマフォリン／その機能性断片／融合タンパク質／ポリペプチドは、プレキシン受容体に高い親和力で結合するが、それにもかかわらず、がんの進行を促進する無血管腫瘍領域へのマクロファージのＮｒｐ−１依存性セマフォリン誘導性侵入を回避する。さらなる利点として、本発明の化合物は、プレキシン受容体シグナル伝達を効果的に誘発する。さらなる有利な特性として、本発明の化合物は、Ｎｒｐ１と無関係にプレキシン受容体を活性化する。さらに、本発明の化合物は、従来のセマフォリン３タンパク質と比較してＥＣの移動をより効果的に阻害する。本発明の化合物は、プロテアーゼにより切断されず、保持時間の延長がもたらされる。さらなる利点として、本発明の化合物（タンパク質ならびにそれをコードする核酸分子）は、非経口的に送達することができる。本発明の化合物は、新しい血管の形成を予防し、それにより、腫瘍の成長または広がりを停止させるまたは遅くするのに優れている。本発明の化合物は、血管面積を減少させ、がん血管を正常化し、がん血管の潅流を増大させ、かつ／または組織低酸素を低減させるのに優れている。本発明の化合物は、血管正常化剤として用いることができ、すなわち、がん血管が正常化し、がん血管の潅流が増大し、かつ／または組織低酸素が低減する。本発明のさらなる利点は、がんの成長がより効果的に阻害されることである。さらなる有利な特性として、本発明のタンパク質および／または核酸分子は、転移発生率を低減させ、転移巣体積を減少させる。したがって、本発明は、がんの進行および転移巣播種を阻害するのに優れた効果を有する。
本明細書で用いられる、本発明による「突然変異セマフォリン３」、「遺伝子改変セマフォリン３」、「非天然型セマフォリン３」または「非天然セマフォリン３」という用語は、本明細書で定義したセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃまたはセマフォリン３Ｄの突然変異型を意味する。突然変異セマフォリン３は、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む点が野生型セマフォリン３またはその機能性断片と異なる。特に、セマフォリン３の突然変異型は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置における親水性アミノ酸によるアラニンの置換を含む。言い換えれば、セマフォリン３タンパク質におけるコンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤ（配列番号７３にも示されている）におけるアラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に突然変異している（表１）。したがって、突然変異セマフォリン３Ａは、配列番号２または４に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、アミノ酸配列を含む。突然変異セマフォリン３Ｂは、配列番号６または８に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、アミノ酸配列を含む。突然変異セマフォリン３Ｃは、配列番号１０または１２に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、アミノ酸配列を含む。突然変異セマフォリン３Ｄは、配列番号１４または１６に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、アミノ酸配列を含む。前記親水性アミノ酸は、例えば、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジン、より好ましくはリシンまたはアルギニン、最も好ましくはリシンであり得る。親水性アミノ酸は、非タンパク質構成または非標準α−アミノ酸（例えば、オルニチンおよびシトルリンなど）であり得ることも本明細書で認識される。親水性アミノ酸によるアラニンの置換が、がんの成長および転移巣の形成のさらに高い阻害をもたらすことが上文および添付の実施例において示されている。一般的に、セマフォリン３における親水性アミノ酸への突然変異は、プレキシン受容体に対する高い結合親和性をもたらす。突然変異セマフォリン３の結合の増大は、プレキシン受容体およびそれらの下流シグナル伝達の活性化の増大をもたらす。プレキシン受容体は、がん細胞の進行および転移における重要な側面である、インテグリンの活性化、細胞接着およびＥＣＭタンパク質上またはＥＣＭタンパク質への移動の制御に極めて重要である。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３は、血管新生の阻害剤として、かつ血管正常化剤として用いることができる。
特に、本発明は、突然変異セマフォリンがセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択されることを意味する突然変異セマフォリン３タンパク質に関する。同様に、本発明に関連して突然変異セマフォリン３または突然変異セマフォリン３タンパク質に言及する場合、これは、突然変異セマフォリン３Ａ、突然変異セマフォリン３Ｂ、突然変異セマフォリン３Ｃおよび突然変異セマフォリン３Ｄを意味するものとする。本発明の最も好ましい態様では、突然変異セマフォリン３は突然変異セマフォリン３Ａである。突然変異セマフォリン３は、セマフォリン３Ｅ、セマフォリン３Ｆまたはセマフォリン３Ｇでないことが本明細書において理解される。さらに、本発明による突然変異セマフォリン３は、例えば、モウコノウマ（Equus przewalskii）に由来するセマフォリン３ＢアイソフォームＸ２または例えば、アムールトラ（Panthera tigris altaica）に由来するセマフォリン３ＢアイソフォームＸ６を含まないことが本明細書において理解される。そのようなセマフォリンは、アラニンＡ３が親水性アミノ酸により置換されている、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含まない。さらに、本発明による突然変異セマフォリン３は、血管新生の阻害剤として、かつ／または血管正常化剤として機能する。
本明細書で用いられる「セマフォリン３Ａ」、「セマフォリン３Ｂ」、「セマフォリン３Ｃ」および「セマフォリン３Ｄ」、「Ｓｅｍａ３Ａ」、「Ｓｅｍａ３Ｂ」、「Ｓｅｍａ３Ｃ」および「Ｓｅｍａ３Ｄ」、「ＳＥＭＡ３Ａ」、「ＳＥＭＡ３Ｂ」、「ＳＥＭＡ３Ｃ」および「ＳＥＭＡ３Ｄ」という用語は、主としてタンパク質を意味する。本明細書で定義し、本発明により使用される「Ｓｅｍａ３Ａ」、「Ｓｅｍａ３Ｂ」、「Ｓｅｍａ３Ｃ」および「Ｓｅｍａ３Ｄ」は、好ましくはヒト「Ｓｅｍａ３Ａ」、「Ｓｅｍａ３Ｂ」、「Ｓｅｍａ３Ｃ」および「Ｓｅｍａ３Ｄ」である。本明細書で定義し、本発明により使用される「セマフォリン３Ａ」、「セマフォリン３Ｂ」、「セマフォリン３Ｃ」および「セマフォリン３Ｄ」は、好ましくはヒト「Ｓｅｍａ３Ａ」、「Ｓｅｍａ３Ｂ」、「Ｓｅｍａ３Ｃ」および「Ｓｅｍａ３Ｄ」である。本明細書で定義し、本発明により使用される「ＳＥＭＡ３Ａ」、「ＳＥＭＡ３Ｂ」、「ＳＥＭＡ３Ｃ」および「ＳＥＭＡ３Ｄ」は、好ましくはヒト「Ｓｅｍａ３Ａ」、「Ｓｅｍａ３Ｂ」、「Ｓｅｍａ３Ｃ」および「Ｓｅｍａ３Ｄ」である。
Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋまたはセマフォリン３Ａ Ａ１０６Ｋは、本明細書および添付の実施例においてＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６ＫΔＩｇ−ｂとも呼ぶ。
野生型セマフォリン３のアミノ酸配列およびコード化ヌクレオチド配列は、当技術分野で周知である。核酸配列は、以下の受託番号を用いてＮＣＢＩのような公開データベースにおいて検索することができる（以下の配列は、ＮＣＢＩデータベースから検索された）。
ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ａ、配列番号１に対応する＞ｇｉ｜１００９１３２１５｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００６０８０．２｜；マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ａ、配列番号３に対応する＞ｇｉ｜３４０５２３０９８｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００９１５２．４｜）；ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｂ、配列番号５に対応する＞ｇｉ｜５８６７９８１７９｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１２９００６０．１｜；マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｂ、配列番号７に対応する＞ｇｉ｜６１５２７６３１９｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１０４２７７９．２｜；ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｃ、配列番号９に対応する＞ｇｉ｜３３５０５７５２５｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００６３７９．３｜；マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｃ、配列番号１１に対応する＞ｇｉ｜１１８１３０８４２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１３６５７．５｜；ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｄ、配列番号１３に対応する＞ｇｉ｜４１４０６０８５｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿１５２７５４．２｜；またはマウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｄ、配列番号１５に対応する＞ｇｉ｜２８２８４７３４３｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０２８８８２．４｜
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５は、野生型全長セマフォリン３タンパク質をコードする。
対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのような公開データベースにおいて検索することができる。以下の配列は、ＮＣＢＩデータベースから検索された。
ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ａ、配列番号２に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００６０７１．１｜；
マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ａ、配列番号４に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０３３１７８．２；
ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｂ、配列番号６に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１２７６９８９．１｜；
マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｂ、配列番号８に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０３６２４４．１；
ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｃ、配列番号１０に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００６３７０．１｜；
マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｃ、配列番号１２に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０３８６８５．３；
ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｄ、配列番号１４に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿６８９９６７．２｜；または
マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｄ、配列番号１６に対応する｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０８３１５８．３
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１６は、野生型全長セマフォリン３タンパク質のアミノ酸配列を含む。
本発明のセマフォリン３のアミノ酸配列は、例えば、マウスならびにヒトセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３ＤについてＵｎｉｐｒｏｔからも得ることができる。
一実施形態では、本発明は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されており、前記セマフォリン３がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される、突然変異セマフォリン３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、突然変異セマフォリン３に関し、前記突然変異セマフォリン３は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されているアミノ酸配列を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されており、前記セマフォリン３がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される、突然変異セマフォリン３またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその断片に関し、前記突然変異セマフォリン３または前記その断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、またはセマフォリン３タンパク質の他のセマフォリンにおける、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されているアミノ酸配列を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
上で説明したように、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
上で説明したようにかつ表１に例示したように、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンは、配列番号２の１０６位におけるセマフォリン３Ａの固有のアラニンまたは配列番号２の１０６位におけるセマフォリン３Ａの前記固有のアラニンに対応する、セマフォリン３Ａ、３Ｂ、３Ｃもしくは３Ｄ、好ましくはセマフォリン３Ａの公知の野生型配列における固有のアラニンアミノ酸残基を意味する。それは、配列番号２の１０６位、配列番号６の１０５位、配列番号１０の１０４位または配列番号１４の１２０位における前記固有のアラニンと相同である公知の野生型配列、例えば、セマフォリン３Ａ、３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄにおける特定のアミノ酸残基も意味する。例示的な相同アミノ酸残基は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり得る。最も好ましくは、特定のアミノ酸残基は、アラニンである。
対応する位置における他の野生型配列における対応するアミノ酸残基は、好ましくは下記のような関連配列について標準相同性スクリーニングまたはＰＣＲ媒介スクリーニング手法により選択することができる。アラニンまたは対応するアラニンは、本発明による突然変異セマフォリン３において親水性アミノ酸により置換されているかまたはそれに変化している。
本明細書で言及し、説明したように、他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは、配列番号２に示す１０６位における前記セマフォリン３Ａの前記固有のアラニンに対応するセマフォリン３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄの公知の野生型配列における固有のアラニンアミノ酸残基を意味する。対応するアラニンは、突然変異セマフォリン３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄにおいて親水性アミノ酸により置換されている。言い換えれば、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニン、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニン、または配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンは、親水性アミノ酸により置換される。
配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンは、配列番号６の１０５位におけるセマフォリン３Ｂの固有のアラニンまたは配列番号６の１０５位におけるセマフォリン３Ｂの前記固有のアラニンに対応するセマフォリン３Ｂの公知の野生型配列における固有のアラニンアミノ酸残基を意味する。配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンは、配列番号１０の１０４位におけるセマフォリン３Ｃの固有のアラニンまたは配列番号１０の１０４位におけるセマフォリン３Ｃの前記固有のアラニンに対応するセマフォリン３Ｃの公知の野生型配列における固有のアラニンアミノ酸残基を意味する。配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンは、配列番号１４の１２０位におけるセマフォリン３Ｄの固有のアラニンまたは配列番号１４の１２０位におけるセマフォリン３Ｄの前記固有のアラニンに対応するセマフォリン３Ｄの公知の野生型配列における固有のアラニンアミノ酸残基を意味する。本明細書で言及し、詳述したように、対応する位置における対応するアミノ酸残基は、好ましくは相同性の比較により選択することができる。ポリペプチドまたはヌクレオチド配列間の相同性は、それらの配列類似性から一般的に推測される。複数の配列のアライメントを本明細書で用いて、各配列のどの領域または特定のアミノ酸が相同であるかを示すことができる。セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を参照配列として用いることができる。相同性は、好ましくはアミノ酸の一定のストレッチ、例えば、１０、より好ましくは２０、より好ましくは３０、より好ましくは５０もしくはより好ましくは１００アミノ酸残基にわたって存在する、または最も好ましくは、相同性は、アミノ酸ストレッチ全体にわたって存在する。セマフォリン３タンパク質の例示的なアミノ酸ストレッチの例示的なアミノ酸配列アライメントを表１に示す。対応するアラニンは、突然変異セマフォリン３に含まれるアミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける最も好ましくはＡ３である。したがって、本発明の突然変異は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤの助けにより特定することもできる。
本明細書で述べたように、本発明は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含む、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含む突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
言い換えれば、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、またはセマフォリン３Ｂ、ＣもしくはＤにおける、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。言い換えれば、他のセマフォリンは、セマフォリン３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄである。
言い換えれば、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片であって、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択され、前記突然変異セマフォリン３は、
配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；
配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；
配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；または
配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含む。
本発明の最も好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａである。言い換えれば、本発明は、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片に関し、前記突然変異セマフォリン３Ａは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含む。
上で概要を述べたように、また添付の実施例で示すように、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおけるアラニン（Ａ３）の置換により、セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤポリペプチドが強力な血管新生の阻害剤となる。したがって、突然変異セマフォリンに含まれるアミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおいて、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に突然変異している。すなわち、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、前記突然変異セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択され、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、
配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；
配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；
配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；または
配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸
を含み、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、
Ｘ１は、ＫまたはＮである、アミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
アラニン（Ａ３）は、前記親水性アミノ酸により置換されている。
言い換えれば、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、前記突然変異セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択され、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、
Ｘ１は、ＫまたはＮである、アミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
アラニン（Ａ３）は、親水性アミノ酸により置換されており、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、
配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；
配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；
配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；または
配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸
を含む。
以下の説明は、すべての異なる実施形態を含む。以下は、血管新生の阻害剤として機能する活性を主として有する本明細書で提供する非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質もしくはそれらの本明細書で述べた機能性断片もしくは本明細書で述べた機能性ｓｅｍａドメインおよび／または前記非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質もしくは前記非天然型／人工／突然変異機能性断片を含む融合タンパク質／ポリペプチドもしくは前記セマフォリン３タンパク質の前記機能性ｓｅｍａドメインに関する。言い換えれば、本発明の化合物、すなわち、本明細書で述べた突然変異セマフォリン３タンパク質／その機能性断片／機能性ｓｅｍａドメイン／融合タンパク質／ポリペプチドは、血管新生の阻害剤として機能する活性を主として有する。一般的に、血管新生の阻害剤は、新しい血管の形成を妨げ、それにより、腫瘍の成長または広がりを停止または遅くする。本明細書で示したように、本発明の化合物は、血管面積を減少させ、がん血管を正常化し、すなわち、周皮細胞被覆を増加させ、がん血管の潅流を増大させ、かつ／または組織低酸素を低減させる。したがって、本発明のアミノ酸配列および／または核酸配列は、血管新生の直接的かつ／または間接的阻害剤に関連する。一般的に、血管新生の阻害剤は、ＥＣなどの細胞の表面上の受容体および／または下流シグナル伝達経路における他のタンパク質にも結合し、それらの活性をブロックする。添付の実施例に示すように、突然変異セマフォリン３、その機能性断片、機能性ｓｅｍａドメイン、本発明の融合タンパク質またはポリペプチドは、そのプレキシン受容体、例えば、プレキシンＡ４またはプレキシンＡ２などのＡ型プレキシンに高い親和力で結合する、すなわち、非常に低いナノモル／サブナノモル範囲の解離定数ＫＤを示す。したがって、本発明のアミノ酸配列および／または核酸配列は、血管新生を直接的かつ／または間接的に阻害する。特に、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、そのプレキシン受容体に対する親和性を有し、６ｎＭより低い解離定数ＫＤを有する。好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、そのプレキシン受容体に対する親和性を有し、４ｎＭより低い解離定数ＫＤを有する。より好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、そのプレキシン受容体に対する親和性を有し、２ｎＭより低い解離定数ＫＤを有する。最も好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、そのプレキシン受容体に対する親和性を有し、１ｎＭより低い解離定数ＫＤを有する。解離定数ＫＤは、添付の実施例から明らかであるアッセイなどの、当技術分野で公知の標準的方法により測定することができる。突然変異セマフォリン３ＡがプレキシンＡ４受容体に高い親和力で結合する、すなわち、非常に低いナノモル／サブナノモル範囲の解離定数ＫＤを示すことが添付の実施例で実証されている。さらに、突然変異セマフォリン３ＢがプレキシンＡ２受容体に高い親和力で結合すること、すなわち、非常に低いナノモル／サブナノモル範囲の解離定数ＫＤを示すことが実証されている。
さらに、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片、機能性ｓｅｍａドメインまたは融合タンパク質／ポリペプチドは、Ｒａｐ１ ＧＴＰ負荷を阻害する（６５％）。したがって、本発明のアミノ酸配列および／または核酸配列は、血管新生に関連する下流シグナル伝達経路を媒介する。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、添付の実施例で示されるように、血管新生を直接的かつ／または間接的に阻害する。特に、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、Ｒａｐ１ ＧＴＰ負荷を少なくとも５０％阻害する。好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、Ｒａｐ１ ＧＴＰ負荷を少なくとも５５％阻害する。なおより好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、Ｒａｐ１ ＧＴＰ負荷を少なくとも５５％阻害する。最も好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、Ｒａｐ１ ＧＴＰ負荷を少なくとも６５％阻害する。Ｒａｐ１ ＧＴＰ負荷の阻害は、添付の実施例から明らかであるアッセイなどの、当技術分野で公知の標準的方法により測定することができる。さらに、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片、機能性ｓｅｍａドメインまたは融合タンパク質／ポリペプチドは、ＥＲＫ １／２リン酸化を活性化する（３．９倍）。特に、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、ＥＲＫ １／２リン酸化を少なくとも２．５倍活性化する。好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、ＥＲＫ １／２リン酸化を少なくとも３．０倍活性化する。より好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、ＥＲＫ １／２リン酸化を少なくとも３．５倍活性化する。最も好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、ＥＲＫ １／２リン酸化を少なくとも４．９倍活性化する。ＥＲＫ １／２リン酸化の活性化は、添付の実施例から明らかであるアッセイなどの、当技術分野で公知の標準的方法により測定することができる。
さらに、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片、機能性ｓｅｍａドメイン、融合タンパク質またはポリペプチドは、ＥＣなどの、細胞の運動性を阻害する（４６％）。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片および本発明の融合タンパク質／ポリペプチドは、細胞の運動性の（優れた）阻害剤および／またはがん細胞の転移性播種の阻害剤である。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、がん細胞の転移性播種を阻害する。特に、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、内皮細胞などの細胞の運動性を少なくとも３０％阻害する。好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、内皮細胞などの細胞の運動性を少なくとも３５％阻害する。なおより好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、内皮細胞などの細胞の運動性を少なくとも４０％阻害する。最も好ましい態様では、本発明の突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、内皮細胞などの細胞の運動性を少なくとも４５％阻害する。細胞の運動性は、添付の実施例から明らかであるアッセイなどの、当技術分野で公知の標準的方法により測定することができる。
さらなる実施形態では、本発明は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３またはその機能性断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子に関し、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されており、前記セマフォリン３はセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、血管新生の阻害剤として機能する前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されているアミノ酸配列を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、血管新生の阻害剤として機能する遺伝子改変セマフォリン３またはその機能性断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子に関し、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されており、前記セマフォリン３はセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、遺伝子改変セマフォリン３またはその機能性断片に関し、血管新生の阻害剤として機能する前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されているアミノ酸配列を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
さらなる実施形態では、本明細書で提供する非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質もしくはそれらの本明細書で述べた機能性断片および／または前記非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質もしくは前記非天然型／人工／突然変異機能性断片を含む融合タンパク質／ポリペプチドまたは前記セマフォリン３タンパク質の前記機能性ｓｅｍａドメインまたは本明細書で提供するポリペプチドは、血管正常化剤として機能する活性を有する。言い換えれば、本発明の化合物、すなわち、本明細書で述べた突然変異セマフォリン３タンパク質／その機能性断片／機能性ｓｅｍａドメイン／融合ポリペプチド／タンパク質は、血管正常化剤として機能する活性を有し、血管正常化剤は、がん血管を正常化する、すなわち、周皮細胞被覆を増加させ、がん血管の潅流を増大させ、組織低酸素を低減し、かつ／またはがんへの薬物送達を改善する。したがって、本発明のアミノ酸配列および／または核酸配列は、直接的かつ／または間接的血管正常化剤に関連する。
したがって、本発明は、血管正常化剤として機能する突然変異セマフォリン３またはその機能性断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子に関し、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されており、前記セマフォリン３はセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
さらに、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、血管正常化剤として機能する前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されているアミノ酸配列を含み、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。
以下の説明は、別途明確に述べない限り、上文で述べた本発明の実施形態のそれぞれに関するものである。
突然変異セマフォリン３タンパク質、遺伝子改変セマフォリン３タンパク質または関連ポリペプチド（その機能性断片および／または前記突然変異セマフォリン３タンパク質を含む融合タンパク質または本明細書で提供し、定義した特定のセマフォリン３タンパク質との少なくとも５５％の同一性を有する前記セマフォリン３タンパク質の前記突然変異機能性断片など）は、血管新生阻害剤としての活性を主として有する。
さらに、突然変異セマフォリン３タンパク質、遺伝子改変セマフォリン３タンパク質または関連ポリペプチド（その機能性断片および／または前記突然変異セマフォリン３タンパク質を含む融合タンパク質または本明細書で提供し、定義した特定のセマフォリン３タンパク質との少なくとも５５％の同一性を有する前記セマフォリン３タンパク質の前記突然変異機能性断片など）は、血管正常化剤としての活性を主として有する。
好ましい態様では、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸分子は、好ましくは配列番号１に示す核酸配列と少なくとも５０％相同／同一である。そのような核酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号１のいずれか１つに示されている核酸配列と少なくとも５２％、５３％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸分子は、好ましくは配列番号５に示す核酸配列と少なくとも４８％相同／同一である。そのような核酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号５のいずれか１つに示されている核酸配列と少なくとも５０％、５２％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸分子は、好ましくは配列番号９に示す核酸配列と少なくとも５５％相同／同一である。そのような核酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号９のいずれか１つに示されている核酸配列と少なくとも５７％、６０％、６３％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸分子は、好ましくは配列番号１３に示す核酸配列と少なくとも４５％相同／同一である。そのような核酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号１３のいずれか１つに示されている核酸配列と少なくとも４８％、５０％、５３％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸分子は、好ましくは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のいずれか１つに示す核酸配列と少なくとも５５％相同／同一である。そのような核酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のいずれか１つに示す核酸配列と少なくとも５６％、５８％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードするすべての態様の核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のいずれか１つに示す核酸配列と少なくとも６０％相同／同一である。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のいずれか１つに示す核酸配列と少なくとも７０％相同／同一である。なおより好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のいずれか１つに示す核酸配列と少なくとも８０％相同／同一である。最も好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードする核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のいずれか１つに示す核酸配列と少なくとも９０％相同／同一である。上で定義したオーソロガス／相同／同一配列は、より長いまたはより短いアイソフォーム、スプライス変異体および融合転写物にも含まれ得る。本明細書で用いられる「オーソロガスタンパク質」または「オーソロガス遺伝子」という用語は、それらが共通の祖先に由来するため、互いに類似である異なる種におけるそれぞれタンパク質および遺伝子を意味する。
公知の核酸配列のオーソログまたは他の関連配列の特徴付けのためのハイブリダイゼーションアッセイは、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, “Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)を参照のこと。
核酸に関連して本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズすること」という用語は、任意の程度の厳しさの条件下でのハイブリダイゼーションに関するものである。一般的に、サザンまたはノーザンハイブリダイゼーションなどの、核酸のハイブリダイゼーションは、様々な程度の厳しさの実験条件下で実施することができる。通常、膜などの固体担体上に固定化された核酸を適切な緩衝液および温度条件下で別の類似核酸（プローブと呼ぶ）を含む液体と接触させるが、これはプローブと固定化核酸との相互作用を選択的に可能にするためであり、プローブは、試験する固定化核酸との一定の程度の配列同一性を有する。一般的にハイブリダイゼーション、特にハイブリダイゼーションの後の洗浄ステップに用いる緩衝液は、標準クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ；生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液とも呼ぶ）である。２０倍濃縮ＳＳＣ緩衝液は、３Ｍ ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含み、ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に調整され、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。対応する２０倍ＳＳＣ緩衝液のＮａ＋濃度は、３．３Ｍ（すなわち、３．３ｍｏｌ／Ｌ）であり、それは、１０倍ＳＳＣ緩衝液については１．６５Ｍ、５倍ＳＳＣ緩衝液については０．８２５Ｍ、２倍ＳＳＣ緩衝液については０．３３Ｍ、１倍ＳＳＣ緩衝液については０．１６５Ｍ、０．１倍ＳＳＣ緩衝液については０．０１６５Ｍである。プローブの非特異的結合を低減するためにホルムアミドまたはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をＳＳＣ緩衝液に加えることができる。ハイブリダイゼーションの厳しさは、プローブの配列に存在するヌクレオチドＧおよびＣの百分率（％Ｇ＋Ｃ）ならびにハイブリダイゼーション条件、特に温度、Ｎａ＋の濃度およびホルムアミドまたはＳＤＳ（存在する場合）の濃度に依存する。一般的に、ハイブリダイゼーション温度が高いほど、またナトリウム（Ｎａ＋）濃度が低いほど、厳しさが高くなる。したがって、ハイブリダイゼーションの厳しさは、ハイブリダイゼーションの温度、ＳＳＣ緩衝液の濃度（およびしたがってナトリウム濃度）および任意選択でＳＳＣ緩衝液に加えられるホルムアミド（またはＳＤＳ）の濃度を適切に選択することによって制御することができる。異なる濃度のＳＳＣ緩衝液をハイブリダイゼーション手順の異なるステップに用いる場合、最も濃縮されたＳＳＣ緩衝液（一般的に最終洗浄ステップに用いられる緩衝液）中のナトリウムおよびホルムアミドの濃度が決定的である。
したがって、プローブの所定のＧＣ含量ならびにハイブリダイゼーションの後の洗浄に用いられる最も濃縮された緩衝液（一般的に最終洗浄ステップに用いられる緩衝液）中のナトリウムおよびホルムアミド（存在する場合）の特定の濃度においては、ハイブリダイゼーションの厳しさは、（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションについて）以下の式を用いて計算することができる有効融解温度（Ｔｍ）を下回る特定の度数のセ氏温度（例えば、２５℃以下）にハイブリダイゼーション温度を調節することによって制御することができる。
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇＭ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（ホルムアミド％）
上の式中、「Ｔｍ」は、その直下では両配列が互いにハイブリダイズするために供試固定化核酸の配列がプローブの配列の１００％と一致する必要がある温度であり、「ｌｏｇＭ［Ｎａ＋］」は、緩衝液中のｍｏｌ／Ｌ単位のナトリウム（Ｎａ＋）の濃度の１０を底とする対数（ｌｏｇ１０）であり、「％Ｇ＋Ｃ」は、プローブの配列におけるヌクレオチドＧおよびＣの百分率（ＧＣ含量）であり、「ホルムアミド％」は、緩衝液中の％（容積／容積）単位のホルムアミドの濃度である。周知のように、決定すべきプローブの長さは、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメーターを構成する。
さらにハイブリダイゼーション温度は、Ｔｍを下回り、ハイブリダイゼーションの厳しさが低下する。特に、ハイブリダイゼーション温度が計算Ｔｍを１．４℃下回るごとに、ハイブリダイゼーションは、１％の配列ミスマッチの存在のもとにさらに起こる。すなわち、ハイブリダイゼーション温度が計算Ｔｍを少なくともｘ・１．４℃下回る場合、プローブおよび供試固定化核酸の配列のｘ％のミスマッチは、依然としてハイブリダイゼーションにつながる。例えば、Ｔｍが９０℃と計算され、ハイブリダイゼーション実験を５５℃（すなわち、Ｔｍを３５℃下回る）で行う場合、プローブの配列の少なくとも８２．１％と一致する核酸配列は、プローブとハイブリダイズする（すなわち、３５℃／１．４℃＝２５．０で、これは１００％−２５．０％＝７５．０％を意味する）。
本明細書で用いられる「ストリンジェント条件」下のハイブリダイゼーションは、好ましくはハイブリダイゼーション温度がＴｍ（上で説明した式を用いて計算される）を約３５℃以下下回ることを意味し、これは、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な約７５．０％（すなわち、１００％−（３５℃／１．４℃）％）の最小限の配列同一性に対応する。より好ましくは、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション温度がＴｍを約３０℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約７８．６％の最小限の配列同一性に対応する）を意味し、なおより好ましくは、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション温度がＴｍを約２５℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約８２．１％の最小限の配列同一性に対応する）を意味し、なおより好ましくは、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション温度が、Ｔｍを約２０℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約８５．７％の最小限の配列同一性に対応する）を、なおより好ましくはＴｍを約１５℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約８９．３％の最小限の配列同一性に対応する）を、なおより好ましくはＴｍを約１０℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約９２．９％の最小限の配列同一性に対応する）を、なおより好ましくはＴｍを約７℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約９５．０％の最小限の配列同一性に対応する）を、またなおより好ましくはＴｍを約５℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約９６．４％の最小限の配列同一性に対応する）を、さらにより好ましくはＴｍを約３℃以下下回ること（ハイブリダイゼーションに必要な約９７．９％の最小限の配列同一性に対応する）を意味する。逆に、「非ストリンジェント条件」下のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション温度が、厳しいハイブリダイゼーションに必要な上で規定した温度を下回ることを意味する。さらに指定されない場合、条件は、好ましくは厳しくない。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook (2001) loc. cit.；Ausubel (1989) loc. cit.、またはHiggins and Hames (Eds.) “Nucleic acid hybridization, a practical approach” IRL Press Oxford, Washington DC, (1985)に記載されている従来のプロトコールに従って確立することができる。条件の設定は、十分に当業者の技術の範囲内にあり、当技術分野で記載されたプロトコールに従って決定することができる。
本発明によれば、２つ以上の核酸配列に関連する「相同性」もしくは「相同性パーセント」または「同一性」もしくは「同一性パーセント」もしくは「同一性百分率」または「配列同一性」という用語は、当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いて、または手作業によるアライメントおよび視覚的査察によって測定される比較の領域にわたり（好ましくは全長にわたり）、または指定の領域（例えば、機能性ｓｅｍａドメイン）にわたり比較し、最大の一致が得られるようにアライメントした場合に、同じである、または同じであるヌクレオチドの規定の百分率を有する２つ以上の配列または部分配列を意味する。例えば、７０％〜９０％またはそれを超える配列同一性を有する配列は、実質的に同一であるとみなすことができる。そのような定義は、試験配列の相補体にも適用される。好ましくは記載されている同一性は、長さが少なくとも約１５〜約２５ヌクレオチドである領域にわたり、より好ましくは、長さが少なくとも約５０〜約１００ヌクレオチドである領域にわたり、なおより好ましくは、長さが少なくとも約８００〜約１２００ヌクレオチドである領域にわたり、最も好ましくは、全長にわたり存在する。当業者は、例えば、当技術分野で公知である、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680）またはＦＡＳＴＤＢ（Brutlag Comp. App. Biosci. 6(1990), 237-245）に基づくものなどのアルゴリズムを用いて配列間の同一性パーセントをどのようにして決定するかを知る。
ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは、一般的に配列における内部の非一致欠失または付加、すなわち、ギャップをその計算において考慮していないが、これは、同一性％の過大評価を避けるために手作業により矯正することができる。しかし、ＣＬＵＳＴＡＬＷは、その同一性の計算において配列ギャップを考慮に入れている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムも当業者が利用可能である（Altschul, (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300；Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）。核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff (1989) PNAS 89:10915）は、５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。
核酸配列におけるヌクレオチドが、例えば、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のヌクレオチド配列における特定の位置に対応するかどうかを判断するために、当業者は、当技術分野で周知の手段および方法、例えば、手作業による、または本明細書で言及したようなコンピュータプログラムを用いることによる、アライメントを用いることができる。例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ＢＬＡＳＴを表す、ＢＬＡＳＴ２．０（Altschul (1997), loc. cit.；Altschul (1993), loc. cit.；Altschul (1990), loc. cit.）は、局所配列アライメントを検索するために用いることができる。ＢＬＡＳＴは、上述のように、配列類似性を判定するためにヌクレオチド配列のアライメントを発生させる。アライメントの局所的性質のため、ＢＬＡＳＴは、正確な一致を判定するのに、または類似配列を特定するのに特に有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムアウトプットの基本的単位は、ハイスコアセグメント対（High-scoring Segment Pair）（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、そのアライメントが局所的に最大であり、アライメントスコアが使用者により設定された閾値またはカットオフスコアを満たすまたは超える、任意であるが、等しい長さの２つの配列断片からなる。ＢＬＡＳＴアプローチは、クエリ配列とデータベース配列との間のＨＳＰを探索し、見いだされた任意の一致の統計的有意性を評価し、使用者選択の有意性の閾値を満たす一致のみを報告することである。パラメーターＥは、データベース配列の一致を報告するための統計的に有意な閾値を設定するものである。Ｅは、全データベース検索に際してのＨＳＰ（または一連のＨＳＰ）の偶然の出現の予測される頻度の上限と解釈される。その一致がＥを満たすデータベース配列は、プログラムアウトプットで報告される。
ＢＬＡＳＴ（Altschul (1997), loc. cit.；Altschul (1993), loc. cit.；Altschul (1990), loc. cit.）を用いる同様なコンピュータ技術は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどのヌクレオチドデータベースにおける同一または関連分子を検索するために用いられる。この解析は、多重膜ベースのハイブリダイゼーションよりはるかに速い。さらに、コンピュータ検索の感度を修正して、任意の特定の一致が正確または類似と分類されるかを判断することができる。検索の基礎は、以下のように定義され、
２つの配列の間の類似性の程度および配列の一致の長さの両方を考慮に入れている、積スコアである。例えば、４０の積スコアでは、一致は、１〜２％の誤差の範囲内で正確であり、７０では、一致は、正確である。より低いスコアは、関連分子を特定するものであり得るが、類似分子は、１５から４０の間の積スコアを示すものを選択することによって通常特定される。配列アライメントを発生することができるプログラムの他の例は、当技術分野で公知である、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson (1994) Nucl. Acids Res. 2:4673-4680）またはＦＡＳＴＤＢ（Brutlag (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245）である。
「核酸配列の相同性／同一性」に関する上文に示した説明および定義は、必要な変更を加えれば、突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片またはポリペプチドのメンバーの「アミノ酸配列」、特に配列番号２（ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ａ）、配列番号６（ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｂ）、配列番号１０（ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｃ）、配列番号１４（ヒト（Homo sapiens）ＳＥＭＡ３Ｄ）、配列番号４（マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ａ）、配列番号８（マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｂ）、配列番号１２（マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｃ）および配列番号１６（マウス（Mus musculus）Ｓｅｍａ３Ｄ）に示すアミノ酸配列に適用される。配列番号２に示す野生型ヒトセマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置にリシンを含むセマフォリン３タンパク質の例示的な配列は、配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示されている。
突然変異セマフォリン３タンパク質または遺伝子改変セマフォリン３タンパク質は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に示すアミノ酸配列を有し、血管新生の阻害剤として機能する野生型セマフォリン３タンパク質／ポリペプチドとの少なくとも５５％の相同性／同一性を有する。
好ましい態様では、本発明の提供する突然変異セマフォリン３は、好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも５０％相同／同一である。そのようなアミノ酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードするアミノ酸配列は、配列番号２のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも５２％、５３％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本発明の本明細書で提供する突然変異セマフォリン３は、好ましくは配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも４８％相同／同一である。そのようなアミノ酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードするアミノ酸配列は、配列番号６のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも５０％、５２％、５３％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本発明の本明細書で提供する突然変異セマフォリン３は、好ましくは配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％相同／同一である。そのようなアミノ酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードするアミノ酸配列は、配列番号１０のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも５７％、６０％、６３％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本発明の本明細書で提供する突然変異セマフォリン３は、好ましくは配列番号１４に示すアミノ酸配列と少なくとも４５％相同／同一である。そのようなアミノ酸配列は、オーソロガス／相同／同一である（かつしたがって関連する）配列も含み得ることが理解される。より好ましくは、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３をコードするアミノ酸配列は、配列番号１４のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも４８％、５０％、５３％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％相同／同一であり、より高い値の配列同一性が好ましい。
特定の態様では、本発明の本明細書で提供する突然変異セマフォリン３は、好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のいずれか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも５５％相同／同一である。より好ましくは、突然変異セマフォリン３は、例えば、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６に示すアミノ酸配列を有する野性型セマフォリン３タンパク質／ポリペプチドとの少なくとも５７％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％の相同性／同一性を有し、より高い値が好ましい。最も好ましくは、突然変異セマフォリン３は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に示すアミノ酸配列を有する野性型セマフォリン３タンパク質／ポリペプチドとの少なくとも９９％の相同性を有する。
本発明は、上述の野性型アミノ酸配列から逸脱したポリペプチドも含み、前記逸脱は、例えば、アミノ酸および／またはヌクレオチドの単独のまたは組み合わされた、置換（複数可）、欠失（複数可）、付加（複数可）、挿入（複数可）、重複（複数可）、逆位（複数可）および／または組換え（複数可）の結果であり得る。これらの逸脱は、天然に存在または当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によりもたらされ得る。例えば、Sambrook（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)）およびAusubel, “Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing Associates, and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載さている技術を参照のこと。対立遺伝子変異は、天然に存在する対立遺伝子変異体および合成により生成したまたは遺伝子改変による変異体であり得る。突然変異セマフォリン３および／またはその断片をコードする上述の核酸分子の様々な誘導体、対立遺伝子変異体、ホモログまたはアナログによりコードされるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質断片は、分子量、免疫学的反応性、立体配座などのような特定の共通の特性、および電気泳動移動度、クロマトグラフィーにおける挙動、沈降係数、至適ｐＨ、安定性、溶解度、分光学的特性などのような物理的特性を共有し得る。
本明細書で言及する「相補体」、「逆相補体」および「逆配列」という用語は、次の例で述べる。配列５’ＡＧＴＧＡＡＧＴ３’については、相補体は、３’ＴＣＡＣＴＴＣＡ５’であり、逆相補体は、３’ＡＣＴＴＣＡＣＴ５’であり、逆配列は、５’ＴＧＡＡＧＴＧＡ３’である。
本発明は、
（ａ） 配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３の群から選択される核酸配列によりコードされるポリペプチドであって、
配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、かつ
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
前記ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
配列番号２の１０６位、配列番号６の１０５位、配列番号１０の１０４位または配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、
前記ポリペプチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義したポリペプチドをコードする核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、
および
（ｄ）血管新生の阻害剤として機能し、（ｂ）で言及したポリペプチドのいずれか１つとの少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択することができる本明細書で定義した突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関する。
最も好ましい実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
配列番号１に示す核酸配列によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義したポリペプチドをコードする核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド；
（ｄ）血管新生の阻害剤として機能し、（ｂ）で言及したポリペプチドのいずれか１つとの少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチド
の群から選択することができる本明細書で定義した突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片に関する。
特定の態様では、本明細書で定義した突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、
（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３の群から選択される核酸配列を有する核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、かつ
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
前記ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
配列番号２の１０６位に対応する、配列番号６の１０５位に対応する、配列番号１０の１０４位に対応するまたは配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、
前記ポリペプチド、
（ｃ）配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子によりコードされるポリペプチドであって、配列番号２の１０６位に対応する、配列番号６の１０５位に対応する、配列番号１０の１０４位に対応するまたは配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、前記ポリペプチド、
（ｄ）（ａ）または（ｃ）で定義した核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされるポリペプチド、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドとの少なくとも５５％の同一性を有し、血管新生の阻害剤として機能するポリペプチド、ならびに
（ｆ）（ａ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれか１つで定義した核酸分子のヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む血管新生の阻害剤として機能するポリペプチド
の群から選択することができる。
特定の態様では、突然変異セマフォリン３、その機能性断片またはポリペプチドは、配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基；配列番号４の１０６位に対応するアラニン残基；配列番号６の１０５に対応するアラニン残基；配列番号８の１０５位に対応するアラニン残基；配列番号１０の１０４位に対応するアラニン残基；配列番号１２の１０４位に対応するアラニン残基；配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基；または配列番号１６の１２０位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
最も好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３Ａ、その機能性断片またはポリペプチドは、配列番号４の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
言い換えれば、本発明は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン；配列番号４に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン；配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニン；配列番号８に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニン；配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニン；配列番号１２に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニン；配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニン；または配列番号１６に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、突然変異セマフォリン３またはその断片に関する。
したがって、当業者は、本発明の突然変異が特定の位置により本明細書で定義され、例えば、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが置換されている場合、相同性の比較により見いだすことができる、対応するアミノ酸（位置）が、他のセマフォリン３Ａポリペプチドまたはセマフォリン３Ｂ、ＣもしくはＤポリペプチドなどの、他のセマフォリン３タンパク質にも存在し得ることを意味することは、明らかであることを理解する。したがって、さらなる野性型配列の特定および／または本発明により突然変異させた野生型セマフォリン３Ａの１０６位におけるアラニンに対応する関連する特定のアミノ酸残基の検出のために標準の相同性スクリーニング（例えば、配列アライメント）またはＰＣＲ媒介スクリーニング技術を用いることができる。
最も好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片に関する。
配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置にリシンが配置されている、全長ヒトまたはマウス突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣもしくはＤに関する。したがって、代わりに親水性アミノ酸を含むことは、天然に存在するセマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤに存在する、例えば、配列番号２に示す１０６位に対応する固有のアラニンが、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤにおいて親水性アミノ酸、好ましくはリシンに突然変異または変化していることを意味する。
ヒト突然変異セマフォリン３Ａを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１０６位に配置されている、配列番号５８に示すアミノ酸配列を有する。
マウス突然変異セマフォリン３Ａを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１０６位に配置されている、配列番号６０に示すアミノ酸配列を有する。
ヒト突然変異セマフォリン３Ｂを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１０５位に配置されている、配列番号６２に示すアミノ酸配列を有する。
マウス突然変異セマフォリン３Ｂを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１０５位に配置されている、配列番号６４に示すアミノ酸配列を有する。
ヒト突然変異セマフォリン３Ｃを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１０４位に配置されている、配列番号６６に示すアミノ酸配列を有する。
マウス突然変異セマフォリン３Ｃを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１０４位に配置されている、配列番号６８に示すアミノ酸配列を有する。
ヒト突然変異セマフォリン３Ｄを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１２０位に配置されている、配列番号７０に示すアミノ酸配列を有する。
マウス突然変異セマフォリン３Ｄを構成する例示的ポリペプチドは、リシンが１２０位に配置されている、配列番号７２に示すアミノ酸配列を有する。
したがって、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、突然変異セマフォリン３は、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２またはその機能性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の好ましい態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片に関し、突然変異セマフォリン３Ａは、配列番号５８または配列番号６０であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、機能性断片は、下文で詳述するｓｅｍａドメインである。
さらに、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、
（ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、かつ
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３の群から選択される核酸分子；
（ｂ）配列番号２の１０６位における、配列番号６の１０５位における、配列番号１０の１０４位におけるまたは配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義した核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子；
（ｄ）血管新生の阻害剤として機能し、（ｂ）で言及したポリペプチドのいずれか１つとの少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで定義した核酸分子のヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸分子であって、縮重核酸分子が血管新生の阻害剤として機能するポリペプチドをコードしている核酸分子
の群から選択することができる。
特定の態様では、本明細書で定義したコード化突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、
（ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、かつ
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３の群から選択されるＤＮＡ配列を有する核酸分子を含む核酸分子；
（ｂ）配列番号２の１０６位における、配列番号６の１０５位における、配列番号１０の１０４位におけるまたは配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義した核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子；
（ｄ）血管新生の阻害剤として機能し、（ｂ）で言及したポリペプチドのいずれか１つとの少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸分子；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで定義した核酸分子のヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸分子であって、縮重核酸分子が血管新生の阻害剤として機能するポリペプチドをコードしている核酸分子
の群から選択することができる。
最も好ましい実施形態では、本明細書で定義したコード化突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片は、
（ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１に示す核酸分子；
（ｂ）配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２に示すポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義した核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子；
（ｄ）血管新生の阻害剤として機能し、（ｂ）で言及したポリペプチドのいずれか１つとの少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで定義した核酸分子のヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸分子であって、縮重核酸分子が血管新生の阻害剤として機能するポリペプチドをコードしている核酸分子
の群から選択することができる。
特定の態様では、本明細書で定義したコード化突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、
配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号３の９６５〜９６７位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号７の７１２〜７１４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号１１の４９８〜５００位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号１５の９０４〜９０６位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５に定義されている核酸配列を含む核酸分子
の群から選択することができる。
配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、または７１は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置にリシンが配置されている、全長ヒトまたはマウス突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤをコードする核酸配列に関する。
突然変異ヒトセマフォリン３Ａをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５７の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号５７に定義する核酸配列を含む。
突然変異マウスセマフォリン３Ａをコードする例示的な核酸分子は、配列番号５９の９６５〜９６７位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号５９に定義する核酸配列を含む。
突然変異ヒトセマフォリン３Ｂをコードする例示的な核酸分子は、配列番号６１の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号６１に定義する核酸配列を含む。
突然変異マウスセマフォリン３Ｂをコードする例示的な核酸分子は、配列番号６３の７１２〜７１４位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号６３に定義する核酸配列を含む。
突然変異ヒトセマフォリン３Ｃをコードする例示的な核酸分子は、配列番号６５の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号６５に定義する核酸配列を含む。
突然変異マウスセマフォリン３Ｃをコードする例示的な核酸分子は、配列番号６７の４９８〜５００位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号６７に定義する核酸配列を含む。
突然変異ヒトセマフォリン３Ｄをコードする例示的な核酸分子は、配列番号６９の３９８〜４００位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号６９に定義する核酸配列を含む。
突然変異マウスセマフォリン３Ｄをコードする例示的な核酸分子は、配列番号７１の９０４〜９０６位におけるヌクレオチドがリシンアミノ酸をコードする、配列番号７１に定義する核酸配列を含む。
配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９または配列番号７１に示す核酸は、全長突然変異セマフォリン３タンパク質をコードする。したがって、本発明は、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９および配列番号７１からなる群から選択される核酸を含む核酸分子により突然変異セマフォリン３がコードされる、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関する。本発明の好ましい態様では、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片であって、突然変異セマフォリン３Ａは、核酸配列番号５７または配列番号５９を含む核酸分子によりコードされる。好ましい態様では、機能性断片は、下文で詳細に述べるｓｅｍａドメインである。
特定の態様では、本明細書で定義したコード化突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、
配列番号１のヌクレオチド６３１〜６３３位におけるコドンが前記親水性アミノ酸をコードするコドンにより置換され、
配列番号５のヌクレオチド５５９〜５６１位におけるコドンが前記親水性アミノ酸をコードするコドンにより置換され、
配列番号９のヌクレオチド８７２〜８７４位におけるコドンが前記親水性アミノ酸をコードするコドンにより置換され、
配列番号１３のヌクレオチド３９８〜４００位におけるコドンが前記親水性アミノ酸をコードするコドンにより置換されている、
配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３に定義する核酸配列を含む核酸分子
の群から選択することができる。
親水性アミノ酸をコードするコドンは、本発明によれば、「親水性アミノ酸」をコードする、標準遺伝コード（とりわけ、Stryer (1995), “Biochemistry”, Freeman and Company, ISBN 0-7167-2009-4に示されている）に従う、コドンを意味する。特定の態様では、Ｋは、Ｋをコードするコドンによりコードされる。特定の好ましい態様では、Ｋは、コドンＡＡＧまたはＡＡＡによりコードされる。遺伝コードの縮重は、同じアミノ酸配列が多様な形でコードされ、翻訳されることを可能にする。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンは、それぞれ６種のコドンによりコードされるが、バリン、プロリン、トレオニン、アラニンおよびグリシンは、それぞれ４種のコドンによりコードされる。しかし、そのような同義コドンの使用頻度は、真核生物および原核生物におけるゲノムごとに異なる。例えば、哺乳動物における同義コドン選択パターンは、非常に類似しているが、酵母（Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae））、細菌（大腸菌（E. coli）など）および昆虫（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）など）などの進化的に遠い生物は、ゲノムコドン使用頻度の明らかに異なるパターンを示す。したがって、コドン最適化遺伝子は、本発明で用いることができる。コドン最適化遺伝子の設計には、生物におけるコドン使用頻度、隣接頻度、ＲＮＡの安定性、二次構造の形成の可能性、合成経路および当遺伝子の意図される将来のＤＮＡ操作を含む、様々な因子を考慮に入れるべきである。本明細書ではコドン最適化核酸配列を用いることができると考えられる。そのようなコドン最適化遺伝子（配列番号１７、１９、４３および４４）を添付の実施例で用いた。
本明細書で示したように、コンセンサスモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおける親水性アミノ酸によるアラニンの置換により、有益な薬理効果がもたらされる。
したがって、本発明のアミノ酸配列は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、
Ｘ１は、ＫまたはＮである、アミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
アラニン（Ａ３）は、前記親水性アミノ酸により置換されている。
言い換えれば、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、前記突然変異セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択され、好ましくは、前記突然変異セマフォリンはセマフォリン３Ａであり、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、
Ｘ１は、ＫまたはＮである、アミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
アラニン（Ａ３）は、前記親水性アミノ酸により置換されている。
Ａ３は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンを、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンを、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンを、配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンを意味する。「Ａ３」は、通常、固有のアラニンを意味する。しかし、「Ａ３」は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの、アラニンと相同であるアミノ酸残基も意味し得る。最も好ましくは、「Ａ３」は、アラニンである。さらに、「Ｃ」、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｇ」、「Ｋ」および「Ｄ」により定義されるアミノ酸残基は、突然変異セマフォリン３がセマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択される限り、前記それぞれの定義されたアミノ酸残基と相同であるアミノ酸残基も意味し得る。本発明によれば、突然変異セマフォリン３は、３Ｅ、ＦまたはＧでない。本発明の好ましい態様では、「Ｘ１」は、イソロイシンまたはバリンでない。
前記親水性アミノ酸は、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンからなる群から選択される。より好ましくは、前記親水性アミノ酸は、リシンまたはアルギニンであり、最も好ましくは、前記親水性アミノ酸は、リシンである。
「親水性アミノ酸」という用語は、好ましくはＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸を意味する。標準的な三文字アミノ酸コードおよび一文字コードによれば、アルギニンは、（Ａｒｇ）または（Ｒ）と略記することができる。リシンは、（Ｌｙｓ）または（Ｋ）と略記することができる。アスパラギン酸は、（Ａｓｐ）または（Ｄ）と略記することができる。グルタミン酸は、（Ｇｌｕ）または（Ｅ）と略記することができる。グルタミンは、（Ｇｌｎ）または（Ｑ）と略記することができる。アスパラギンは、（Ａｓｎ）または（Ｎ）と略記することができる。ヒスチジンは、（Ｈｉｓ）または（Ｈ）と略記することができる。セリンは、（Ｓｅｒ）または（Ｓ）と略記することができる。トレオニンは、（Ｔｈｒ）または（Ｔ）と略記することができる。Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴは、親水性非荷電アミノ酸であり、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＨは、親水性荷電アミノ酸である。前記親水性アミノ酸は、非タンパク質構成および／または非標準α−アミノ酸（例えば、オルニチンおよびシトルリンなど）であり得ることも本明細書で認識される。
本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含むアミノ酸配列に関し、前記親水性アミノ酸はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される。好ましい態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含むアミノ酸配列に関し、前記親水性アミノ酸はＫ、Ｒ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される。より好ましい態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含むアミノ酸配列に関し、前記親水性アミノ酸はＫまたはＲである。最も好ましい態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含むアミノ酸配列に関し、前記親水性アミノ酸はＫである。
特定の態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含むアミノ酸配列に関し、アミノ酸配列モチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおけるアラニン（Ａ３）はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される前記親水性アミノ酸により置換されている。特定の態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、アミノ酸配列モチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおけるアラニン（Ａ３）はＫ、Ｒ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される前記親水性アミノ酸により置換されている。好ましい態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、アミノ酸配列モチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおけるアラニン（Ａ３）はＫまたはＲである前記親水性アミノ酸により置換されている。特に好ましい態様では、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、アミノ酸配列モチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤにおけるアラニン（Ａ３）はＫである前記親水性アミノ酸により置換されている。
さらに、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含むポリペプチドに関し、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、配列番号２の１０６位に、配列番号６の１０５位に、配列番号１０の１０４位にまたは配列番号１４の１２０位に前記親水性アミノ酸を含む。特定の態様では、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）、逆位（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。最も好ましくは、本発明は、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含むポリペプチドに関し、前記突然変異セマフォリン３Ａまたは前記その機能性断片は、配列番号２の１０６位に親水性アミノ酸を含み、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）、逆位（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
言い換えれば、本発明のアミノ酸配列は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、配列番号２の１０６位に、配列番号６の１０５位に、配列番号１０の１０４位にまたは配列番号１４の１２０位に前記親水性アミノ酸を含み、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）、逆位（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
特定の態様では、本発明のアミノ酸配列は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に関し、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片は、配列番号２の１０６位に、配列番号４の１０６位に、配列番号６の１０５位に、配列番号８の１０５位に、配列番号１０の１０４位に、配列番号１２の１０４位に、配列番号１４の１２０位に、または配列番号１６の１２０位に前記親水性アミノ酸を含み、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）、逆位（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
以下は、融合タンパク質／ポリペプチドに含まれる突然変異セマフォリン３タンパク質に関する。融合タンパク質／ポリペプチドに含まれる突然変異セマフォリン３タンパク質は、突然変異セマフォリン３タンパク質の機能性断片でもあり得る。言い換えれば、以下は、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドに含まれる非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片に関する。
最も好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３の本明細書で提供する発明の機能性断片は、機能性ｓｅｍａドメインを含み、ｓｅｍａドメインは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に親水性アミノ酸を含み、かつｓｅｍａドメインは、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有する。「ｓｅｍａドメイン」という用語は、セマフォリン３タンパク質の構造ドメインを意味する。一般的に、セマフォリンは、ｓｅｍａドメインフォールド［ＮＣＢ１位置特異的スコアリングマトリックス（ＰＳＳＭ）ＩＤ：２１４７４７；Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）：ｓｍａｒｔ００６３０およびｃ１１５６９３］を含み、これは、従来技術において、いわゆるβプロペラトポロジーの約５００アミノ酸長変異と記載されている（Chen et al., 2011；Gherardi et al., 2004）。より一般的には、βプロペラタンパク質は、中心チャンネルの周りの羽根としても公知の環状に配列した構造モジュールにより形成された広範囲のファミリーのディスク様構造である。各羽根は、四本鎖逆平行βシートである。鎖は、Ａ〜Ｄ鎖と表され、それぞれのＮ末端から始まっている（Chen et al., 2011；Gherardi et al., 2004）。各羽根の内側の鎖（Ａ）は、プロペラの中心のチャンネルの内面となり、同じ繰返し体のＢおよびＣ鎖は、放射状に外へ広がり、次の繰返し体のＤ鎖は、羽根の外縁を形成している。各シートの内側の鎖（Ａ鎖）が中心軸に平行に伸びているが、外側の鎖（Ｄ鎖）は垂直に伸び（各βシートをひずませて、プロペラの羽根のように見える）、これが組み合わされて、ドメインにプロペラ様の外観をもたらす。一般的に、従来技術で述べられるｓｅｍａドメインは、７枚羽根βプロペラであり、βプロペラフォールドの最大の公知の変異体である。大きなサイズのｓｅｍａドメインは、いくつかの羽根に挿入されたさらなる二次構造要素の存在によって生じ、Loveおよび共同研究者らが最初のセマフォリン結晶構造を述べた（Love et al., 2003）ときに、彼らLoveによって突起（extrusions）と呼ばれた、βプロペラの主として上部表面上のいくつかの長いループを生ずる。ｓｅｍａドメインは、突起１（羽根１と羽根２との間）および突起２（羽根５の内側）と名付けられた２つの突起を示す。ｓｅｍａドメインは、最初の羽根と最後の羽根との間の円を閉じるために「ループおよびフック」システムを使用する。フォールドは、シート間疎水性接触によって、また大部分の構造において、Ｎ末端β鎖が、第７の（Ｃ末端）羽根の最外鎖（Ｄ）を提供することによって円を閉じる「ベルクロ（登録商標）」型の環閉鎖によって安定化する。βプロペラは、羽根６の外縁上のさらなる第５のβ鎖を提供する、Ｎ末端の延長によってさらに安定化する。例えば、セマフォリン３Ａでは、ｉ）羽根１は、さらなる鎖およびらせんを有し、ｉｉ）羽根４は、余分のらせんを有し、羽根５は、３つのらせんおよび２つの鎖からなる最大の挿入を有する（Antipenko et al., 2003）。ｓｅｍａドメインは、構造を安定化するためのＣｙｓ１０３−Ｃｙｓ１１４、Ｃｙｓ１３２−Ｃｙｓ１４４、Ｃｙｓ２６９−Ｃｙｓ３８１およびＣｙｓ２９３−Ｃｙｓ３４１の４つのジスルフィド結合を形成する、保存された一連のシステイン残基を特徴とし得る。したがって、本発明によるｓｅｍａドメインは、Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１１４、Ｃｙｓ１３２−Ｃｙｓ１４４、Ｃｙｓ２６９−Ｃｙｓ３８１およびＣｙｓ２９３−Ｃｙｓ３４１のうちの少なくとも１つまたはすべてを含み得る。
セマフォリンにおいて、ｓｅｍａドメインの羽根７のＣ末端β鎖は、ｓｅｍａドメインβプロペラの羽根６の側面に隣接する、約５０アミノ酸長のプレキシンセマフォリンインテグリン（ＰＳＩ）ドメイン（ＮＣＢＩ ＰＳＳＭ−ＩＤ：２１４６５５；ｓｍａｒｔ００４２３）に直接入っている（Love et al., 2003）。ＰＳＩは、二本鎖逆平行βシートにより形成されたドメインであり、３つのジスルフィド架橋により結合した２つのフランキング短αらせんを有し、内側ドメインコアを形成している。この反復モチーフは、セマフォリン、プレキシンを含む数種の細胞外受容体およびαβインテグリンヘテロダイマーのβサブユニットに見いだされる（Xiong et al., 2004）。プレキシン、セマフォリンおよびインテグリンＰＳＩドメイン間の重要な差異は、プレキシンおよびセマフォリンにおける鎖間ＡＢループが明確により短いことである。プレキシン、セマフォリンおよびインテグリンＰＳＩドメインの全体的な構造は、ドメインのＣ末端ハーフが異なり、ＰＳＩのこの部分の機能がその特異的な構造上の状況によってどのように規定されるかが示唆される。
セマフォリンのｓｅｍａドメインとプレキシン受容体のｓｅｍａドメインとの間のヘテロ二量体インターフェースは、セマフォリンのｓｅｍａドメインに含まれる３つのモチーフ／配列／コンセンサスモチーフを含み得る。上述のように、セマフォリンのｓｅｍａドメインは、その構造フォールド内に突起１（羽根１と羽根２との間）および突起２（羽根５の内側）と名付けられた２つの突起を含む。セマフォリンとプレキシン受容体との間のインターフェースに含まれている３つのコンセンサスモチーフ／配列／モチーフは、セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤにおけるｉ）本明細書でモチーフ１と呼ぶ突起１（例えば、配列番号２５に対応する配列番号２のＳＥＭＡ３Ａアミノ酸１０４〜１１３；配列番号２８に対応する配列番号６のＳＥＭＡ３Ｂアミノ酸１０３〜１１２；配列番号３１に対応する配列番号１０のＳＥＭＡ３Ｃアミノ酸１０２〜１１１；配列番号３４に対応する配列番号１４のＳＥＭＡ３Ｄアミノ酸１１８〜１２７）；ｉｉ）本明細書でモチーフ２と呼ぶ羽根３（例えば、配列番号２６に対応する配列番号２のＳＥＭＡ３Ａアミノ酸２１４〜２２１；配列番号２９に対応する配列番号６のＳＥＭＡ３Ｂアミノ酸２１３〜２２０；配列番号３２に対応する配列番号１０のＳＥＭＡ３Ｃアミノ酸２１１〜２１８；配列番号３５に対応する配列番号１４のＳＥＭＡ３Ｄアミノ酸２３１〜２３８）；およびｉｉｉ）本明細書でモチーフ３と呼ぶ羽根４（例えば、配列番号２７に対応する配列番号２のＳＥＭＡ３Ａアミノ酸２７４〜２８７；配列番号３０に対応する配列番号６のＳＥＭＡ３Ｂアミノ酸２７４〜２８７；配列番号３３に対応する配列番号１０のＳＥＭＡ３Ｃアミノ酸２７１〜２８４；配列番号３６に対応する配列番号１４のＳＥＭＡ３Ｄアミノ酸２９１〜３０４）に局在している。したがって、本発明のｓｅｍａドメインは、モチーフ１、モチーフ２および／またはモチーフ３を含み得る。
配列番号２５、２８、３１または３４に示す（突起１／モチーフ１）のアミノ酸配列（それぞれセマフォリンＡ、Ｂ、ＣまたはＤのアミノ酸配列に対応する）は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤ（Ｘ１は、ＫまたはＮであり、Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸である）に対応し、配列番号２５、２８、３１または３４は、Ｎ末端システイン（Ｃ）を欠き、Ｃ末端におけるさらなるアミノ酸を含む。配列番号２５、２８、３１または３４に示す（突起１／モチーフ１）のアミノ酸配列は、本明細書で述べる突然変異セマフォリン３、本発明のその機能性断片または本発明による機能性ｓｅｍａドメインに含まれ、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている。したがって、突然変異セマフォリン３の機能性断片は、配列番号２５、２８、３１および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている。好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３Ａの機能性断片は、配列番号２５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている。
配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６に示すアミノ酸配列（それぞれセマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤのアミノ酸配列に対応する）は、それぞれ配列番号２５、２８、３１または３４（モチーフ１）に対応し、その差異は、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６に示すアミノ酸配列が、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に配置されているリシンを有することである。配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６に示すアミノ酸配列は、本明細書で「モチーフ１＊」と呼ぶ。本明細書で述べる突然変異セマフォリン３、その機能性断片または本発明の機能性ｓｅｍａドメインは、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。最も好ましい実施形態では、本発明の突然変異セマフォリン３Ａの機能性断片は、配列番号５３に示すアミノ酸配列を含む。
要約すると、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３の本明細書で述べた機能性断片は、
・ Ｘ１がＫまたはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されている、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤ；
・ 配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２５、２８、３１および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列；または
・ アミノ酸配列配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６
を含み、
機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの性質／特性を有し、セマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧの性質／特性を有さない。
突然変異セマフォリン３の機能性断片は、モチーフ１＊のアミノ酸配列（配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６）に加えてモチーフ２のアミノ酸配列（配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２または配列番号３５）および／またはモチーフ３のアミノ酸配列（配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３または配列番号３６）を含み得る。したがって、突然変異セマフォリン３または突然変異セマフォリン３の本発明の機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５または配列番号３６のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＫまたはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）は、親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有するべきである。本発明の突然変異セマフォリン３の機能性断片がセマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧの特性を有すべきでないことがここで理解される。好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３Ａの機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて配列番号２６または配列番号２７に定義されている１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、Ｋであり、Ｘ２は、Ｗであり、アラニン（Ａ３）は、親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａの特性を有するべきである。
ＰＳＩドメインは、機能性ｓｅｍａドメイン、突然変異セマフォリン３の機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドの立体配座構造および／または構造の完全性を安定させる。ＰＳＩドメインの断片が突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチド、より好ましくは機能性ｓｅｍａドメインを安定させる機能を有する限り、突然変異セマフォリン３の機能性断片は、ＰＳＩドメインの断片を含んでいてよい。セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤのＰＳＩドメインは、それぞれコンセンサスモチーフ／配列／モチーフ配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８に示す保存アミノ酸配列を共有する。したがって、本発明のＰＳＩドメインは、以下の配列、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８のうちの１つまたは複数を含む。ヒトセマフォリン３ＡのＰＳＩドメインの例示的アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基５１７〜５６７に及ぶ。添付の実施例に示すように、かつひいてはより好ましくは、フリンプロテアーゼ切断部位を欠いている、より短いＰＳＩドメインの例示的アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基５１７〜５４８に及ぶ。例示的なＰＳＩドメインを以下に示す：ヒトセマフォリン３ＡのＰＳＩドメインの例示的アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基５１７〜５４８に及び、ヒトセマフォリン３ＢのＰＳＩドメインの例示的アミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸残基５１６〜５４７に及び、ヒトセマフォリン３ＣのＰＳＩドメインの例示的アミノ酸配列は、配列番号１０のアミノ酸残基５１４〜５４５に及び、ヒトセマフォリン３ＤのＰＳＩドメインの例示的アミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸残基５３４〜５６５に及ぶ。
さらに、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３または突然変異セマフォリン３の機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、ＫまたはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２は、Ｗ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）は、親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有するべきである。本発明の突然変異セマフォリン３の機能性断片がセマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧの特性を有すべきでないことがここで理解される。好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３または突然変異セマフォリン３Ａの機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて配列番号２６、配列番号２７または配列番号４５のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１は、Ｋであり、Ｘ２は、Ｗであり、アラニン（Ａ３）は、親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａの特性を有するべきである。上文で示したアミノ酸配列、とりわけ配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６は、天然に存在するセマフォリン３タンパク質のアミノ酸配列に関連して存在し得る。これらのアミノ酸配列は、人工アミノ酸リンカー、例えば、セリン−グリシンリンカーと結合させることができることも本明細書で認識される。本発明による機能性断片が、突然変異セマフォリン３、その機能性断片、機能性断片または機能性ｓｅｍａドメインを含む融合タンパク質について上述したように、例えば、血管新生の阻害剤としての、かつ／または血管正常化剤としての機能を示す限り、突然変異セマフォリン３タンパク質の機能性断片の長さは、制限されない。そのような機能性断片は、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００または６００アミノ酸の長さを有し得ることが認識される。好ましくは、そのような断片は、約４００〜５００アミノ酸の長さを有する。好ましくは、そのような断片は、約３００〜４００アミノ酸の長さを有する。好ましくは、そのような断片は、約１００〜３００アミノ酸の長さを有する。非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片のアミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端および／またはアミノ酸配列の本体において短縮することができることが本明細書で認識される。例えば、１０、２０、３０、４０または５０個のアミノ酸を欠失させることができることが本明細書で認識される。機能性断片が突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有する限り、これらの欠失／修飾は、本発明の範囲から逸脱しない。さらに、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸を有する、本明細書で提供する機能性断片または本明細書で提供する機能性断片を含む融合タンパク質／ポリペプチドが、例えば、突然変異セマフォリン３、その機能性断片、機能性断片または機能性ｓｅｍａドメインを含む融合タンパク質の、血管新生の阻害剤としてのかつ／または血管正常化剤としての上文で定義した機能／活性を有する限り、これらの欠失／修飾は制限されない。
最も好ましい実施形態では、本発明による突然変異セマフォリン３の機能性断片は、機能性ｓｅｍａドメインを含み、前記ｓｅｍａドメインは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に親水性アミノ酸を有する。言い換えれば、本発明による突然変異セマフォリン３は、機能性ｓｅｍａドメインを含み得るものであり、前記ｓｅｍａドメインは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に親水性アミノ酸を有する。本発明の機能性ｓｅｍａドメインは、モチーフ１＊における述べたアミノ酸配列を含み、またはＸ１がＫもしくはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されている、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、前記ｓｅｍａドメインは、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有するべきである。突然変異セマフォリン３の本明細書で述べた機能性ｓｅｍａドメインがセマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧの特性を有すべきでないことがここで理解される。さらに、本発明の機能性ｓｅｍａドメインは、モチーフ１＊のアミノ酸配列（配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６）に加えてモチーフ２のアミノ酸配列（配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２または配列番号３５）および／またはモチーフ３のアミノ酸配列（配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８）を含み得る。さらに、機能性ｓｅｍａドメインは、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）、逆位（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含み得る。さらに、機能性ｓｅｍａドメインは、さらなるアミノ酸欠失（複数可）を含み得る。機能性ｓｅｍａドメインのアミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端および／またはアミノ酸配列の本体において短縮することができることが本明細書で認識される。例えば、１０、２０、３０、４０、５０または１００個のアミノ酸を欠失させることができることが本明細書で認識される。機能性ｓｅｍａドメインが上文で定義した突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有する限り、これらの欠失／修飾は、本発明の範囲から逸脱しない。さらに、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸を有する、本明細書で提供する機能性ｓｅｍａドメインまたは本明細書で提供する前記ｓｅｍａドメインを含む融合タンパク質が、例えば、突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片の、または機能性断片もしくは機能性ｓｅｍａドメインを含む融合タンパク質の、血管新生の阻害剤としてのかつ／または血管正常化剤としての上文で定義した機能／活性を有する限り、これらの欠失／修飾は制限されない。機能性ｓｅｍａドメインがセマフォリンの別の機能性ｓｅｍａドメインおよびプレキシン受容体と相互作用することが本明細書で理解される。これは、ｓｅｍａドメインの異なる表面曝露領域により起こり得る。理論により拘束されることなく、ｓｅｍａドメインは、その表面上に少なくとも２つの異なる領域を示す。第１の領域は、セマフォリンの別のｓｅｍａドメインへのその結合を支持し、第２の領域は、プレキシン受容体へのその結合に関与する。
本発明の突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片をコードする例示的な核酸分子は、
配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドに置換されている、配列番号１の６０１〜１２０６のヌクレオチド；
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドに置換されている、配列番号５の５２９〜１１３７のヌクレオチド；
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドに置換されている、配列番号９の８４２〜１４４４のヌクレオチド；または
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドに置換されている、配列番号１３の３６８〜９８２のヌクレオチド
を含み得る。
配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３は、それぞれ野生型ヒトセマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤをコードする全長核酸配列である。
好ましい実施形態では、本発明の突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片をコードする核酸分子は、配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドに置換されている、配列番号１の６０１〜１２０６のヌクレオチドを含む。
さらに、本発明の突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインもしくは機能性断片をコードする例示的な核酸分子は、配列番号５７の６０１〜１２０６のヌクレオチド；配列番号６１の５２９〜１１３７のヌクレオチド；配列番号６５の８４２〜１４４４のヌクレオチド；または配列番号６９の３６８〜９８２のヌクレオチドを含み得る。配列番号５７、６１、６５または６９は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置にリシンが配置されている、それぞれ突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤをコードする核酸配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片をコードする核酸分子は、配列番号５７の６０１〜１２０６のヌクレオチドを含む。
さらに、例示的なポリペプチドは、突然変異セマフォリン３の機能性断片を含み、機能性断片は、以下に示す本発明の突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインを含むまたは機能性ｓｅｍａドメインである。
言い換えれば、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、以下に示す本発明の突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインを含むまたは機能性ｓｅｍａドメインである。
配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１；
配列番号６の１０５位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２２；
配列番号１０の１０４位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２３；
配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２４。
好ましい実施形態では、本発明の突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片のアミノ酸配列は、配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む。
配列番号４９、５０、５１または５２は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置においてアラニンがリシンにより置換されている、それぞれ突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの例示的な機能性ｓｅｍａドメインまたは例示的な機能性断片のアミノ酸配列を含む。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片の例示的なアミノ酸配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態では、本発明の突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片のアミノ酸配列は、配列番号４９に示すアミノ酸配列を含む。機能性ｓｅｍａドメインの断片も本明細書で認識される。例えば、ｓｅｍａドメインは、本明細書で定義した例示的なｓｅｍａドメインの短縮型も含み得る。
以下は、本発明の最も好ましい実施形態である、融合タンパク質／ポリペプチドに関する。最も好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質である。融合タンパク質は、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性断片、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性ｓｅｍａドメイン、安定化ドメインおよび／または二量体化ドメインを含む。突然変異セマフォリン３の上文で定義した機能性断片のいずれか１つは、融合タンパク質に含まれ得るものであって、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性／性質を有し、セマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧのそれを有さない。言い換えれば、融合タンパク質は、本発明による突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み得る。
したがって、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２５、２８、３１および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。任意選択で、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、Ｘ１がＫまたはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されている、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含む。任意選択で、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２５に示すアミノ酸配列を含み、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応する位置におけるアラニンは親水性アミノ酸により置換されている。任意選択で、好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号５３に示すアミノ酸配列を含む。
さらに、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５または配列番号３６のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１がＫまたはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有するべきである。本発明の突然変異セマフォリン３の機能性断片がセマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧの特性を有すべきでないことがここで理解される。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含み、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて、配列番号２６または配列番号２７に定義されている１つまたは複数の以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＷであり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａの特性を有するべきである。
さらに、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８のいずれか１つに定義されている１つもしくは複数の以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１がＫまたはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有するべきである。本発明の突然変異セマフォリン３の機能性断片がセマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧの特性を有すべきでないことがここで理解される。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含み、突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片は、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに加えて、配列番号２６、配列番号２７または配列番号４５のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の以下のアミノ酸配列を含み、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＷであり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されており、機能性断片は、突然変異セマフォリン３Ａの特性を有するべきである。
最も好ましい実施形態では、本発明は、機能性ｓｅｍａドメインを含む融合タンパク質に関し、突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメイン内で、配列番号２の野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されているまたはセマフォリン３Ｂ、３Ｃもしくは３Ｄにおける前記アラニン１０６に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている。言い換えれば、本発明の融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３の機能性断片を含み、前記機能性断片は、機能性ｓｅｍａドメインを含み、ｓｅｍａドメインは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に親水性アミノ酸を含む。言い換えれば、本発明の融合タンパク質は、機能性ｓｅｍａドメインを含み、ｓｅｍａドメインは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に親水性アミノ酸を含む。
本発明の融合タンパク質に含まれる機能性ｓｅｍａドメインは、モチーフ１＊に示すアミノ酸配列（配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６）を含み、または本発明の融合タンパク質に含まれる機能性ｓｅｍａドメインは、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、Ｘ１がＫまたはＮであるアミノ酸であり、Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸に置換されており、機能性ｓｅｍａドメインは、セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有するべきである。本発明の融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインがセマフォリン３Ｅ、ＦまたはＧの特性を有すべきではなく、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有するべきであることがここで理解される。さらに、本発明の機能性ｓｅｍａドメインを含む融合タンパク質は、モチーフ１＊のアミノ酸配列（配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６）に加えてモチーフ２のアミノ酸配列（配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２または配列番号３５）および／またはモチーフ３のアミノ酸配列（配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３または配列番号３６）を含み得る。さらに、融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片は、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）、逆位（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含み得る。融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片のアミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端および／またはアミノ酸配列の本体において短縮することができることが本明細書で認識される。例えば、１０、２０、３０、４０、５０または１００個のアミノ酸を欠失させることができることが本明細書で認識される。機能性断片または機能性ｓｅｍａドメインが突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有する限り、これらの欠失／修飾は、本発明の範囲から逸脱しない。さらに、突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片を含む融合タンパク質が、前記非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質または前記セマフォリン３タンパク質の前記非天然型／人工／突然変異機能性断片または機能性ｓｅｍａドメインを含む融合タンパク質／ポリペプチドの、例えば、血管新生の阻害剤としてのかつ／または血管正常化剤としての上文で定義した機能／活性を示す限り、これらの欠失／修飾は制限されない。融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３の短いアイソフォームも含み得る。
融合タンパク質に含まれ得る突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片をコードする例示的な核酸分子を以下に示す。
配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１のヌクレオチド６０１〜１２０６；配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５のヌクレオチド５２９〜１１３７；配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９のヌクレオチド８４２〜１４４４；または配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３のヌクレオチド３６８〜９８２。
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本発明の機能性ｓｅｍａドメインを含み、ｓｅｍａドメインは、配列番号１のヌクレオチド６０１〜１２０６を含む核酸分子によりコードされ、配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴは、親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている。
融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片をコードする例示的な核酸分子は、配列番号５７のヌクレオチド６０１〜１２０６；配列番号６１のヌクレオチド５２９〜１１３７；配列番号６５のヌクレオチド８４２〜１４４４；または配列番号６９のヌクレオチド３６８〜９８２を含み得る。配列番号５７、６１、６５または６５は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置にリシンが配置されている、それぞれ全長突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤをコードする核酸配列を含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインをコードする核酸分子は、配列番号５７のヌクレオチド６０１〜１２０６を含む。
さらに、例示的な融合タンパク質／ポリペプチドは、突然変異セマフォリン３の機能性断片を含み得、機能性断片は、以下に定義する突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインを含むまたは機能性ｓｅｍａドメインである：
配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１；
配列番号６の１０５位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２２；
配列番号１０の１０４位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２３；または
配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２４。
好ましい実施形態では、融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインのアミノ酸配列は、配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む。
配列番号４９、５０、５１および５２は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンがリシンにより置換されている、融合タンパク質に含まれ得る、それぞれ突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの例示的な機能性ｓｅｍａドメインまたは機能性断片のアミノ酸配列を含む。したがって、例示的な融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３の機能性断片を含み得、機能性断片が配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２からなる群から選択されるｓｅｍａドメインを含むまたはｓｅｍａドメインである。好ましい実施形態では、融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインのアミノ酸配列は、配列番号４９に示すアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に加えて安定化ドメインを含む。前記安定化ドメインは、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片、または本明細書で提供する機能性ｓｅｍａドメインの立体配座構造および／または構造の完全性を安定させる。上文で定義したように、そのような安定化ドメインは、ＰＳＩドメインまたはその断片であり得る。したがって、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含む融合タンパク質は、ＰＳＩドメインにより安定させることができる。安定化ドメインは、ＰＳＩドメインまたはその断片を含み、前記ＰＳＩドメインは、以下のコンセンサス配列モチーフ：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８の１つを含み得る。ヒトセマフォリン３ＡのＰＳＩドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基５１７〜５６７に及ぶ。添付の実施例に示すように、したがってより好ましくは、ＰＳＩドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基５１７〜５４８に及ぶ。融合タンパク質に含められ得る例示的なＰＳＩドメインを以下に示す。ヒトセマフォリン３ＡのＰＳＩドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基５１７〜５４８に及び、ヒトセマフォリン３ＢのＰＳＩドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸残基５１６〜５４７に及び、ヒトセマフォリン３ＣのＰＳＩドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１０のアミノ酸残基５１４〜５４５に及び、ヒトセマフォリン３ＤのＰＳＩドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸残基５３４〜５６５に及ぶ。
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み得、機能性断片は、ｓｅｍａドメインおよびＰＳＩドメインを含む。したがって、例示的な融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み得、その機能性断片は、以下のアミノ酸配列を含む。
配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶ；
配列番号６の１０５位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４７に及ぶ；
配列番号１０の１０４位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１０のアミノ酸残基１〜５６５に及ぶ；または
配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１４のアミノ酸残基１〜５４５に及ぶ。好ましい実施形態では、融合タンパク質に含まれる突然変異セマフォリン３Ａの機能性断片は、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶポリペプチドを有し、配列番号２の１０６位のアラニン残基は、親水性アミノ酸により置換されている。
言い換えれば、融合タンパク質は、ｓｅｍａドメインおよびＰＳＩドメインを含む突然変異セマフォリン３を含み得る。したがって、例示的な融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む突然変異セマフォリン３を含み得る。
配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶ；
配列番号６の１０５位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４７に及ぶ；
配列番号１０の１０４位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１０のアミノ酸残基１〜５６５に及ぶ；または
配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１４のアミノ酸残基１〜５４５に及ぶ。
添付の実施例で示すように、かつ上文で説明したように、突然変異セマフォリン３タンパク質の二量体化により、ＥＣ移動の阻害効果が増大する。したがって、本発明の突然変異セマフォリン３タンパク質は、好ましくは二量体の形態である。突然変異セマフォリン３タンパク質の機能性ｓｅｍａドメインは、二量体化およびプレキシン受容体への結合に関与し得る。そのプレキシン受容体へのセマフォリン３の結合は、プレキシン受容体の細胞質領域の活性化をもたらし、これが活発な下流シグナル伝達をもたらす。理論により拘束されることなく、プレキシン受容体は、セマフォリン誘導性二量体化により活性化される。したがって、本発明の最も好ましい実施形態では、本明細書で提供する突然変異セマフォリン３または突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインもしくは機能性断片は、別の本明細書で提供する突然変異セマフォリン３または突然変異セマフォリン３の機能性ｓｅｍａドメインもしくは機能性断片との二量体の形態である。融合タンパク質に含まれる非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質または非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片の二量体化は、前記機能性断片により、例えば、機能性ｓｅｍａドメイン自体により誘導することができ、かつ／または二量体化ドメインにより誘導／促進することができる。
最も好ましい実施形態では、融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３、突然変異セマフォリン３の機能性断片および／または安定化ドメインに加えて二量体化ドメインを含む。言い換えれば、融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に加えて、分子の構造的完全性を安定させる安定化ドメインおよび／またはホモもしくはヘテロ二量体を誘導する二量体化ドメインを含む。言い換えれば、融合タンパク質は、安定化ドメインおよび／または二量体化ドメインを含み得る。「二量体化ドメイン」は、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片または本明細書で提供する機能性ｓｅｍａドメインの空間的近接を誘導／促進するドメインを意味する。「二量体」は、弱いまたは強い、すなわち、分子間または共有結合性であり得る結合によって結合した２つの構造上類似の単量体からなるオリゴマーである。二量体を形成する２つの単量体は、同じ融合タンパク質にまたは２つの融合タンパク質に含まれ得る。二量体化ドメインは、２つの二量体化ドメインが互いに１０−５Ｍ〜１０−６Ｍの範囲内の解離定数ＫＤを有する限り、いずれかの二量体化ドメインであり得る。セマフォリン３の２つのｓｅｍａドメインの結合親和性は、１０−５〜１０−６Ｍの範囲内にあることが見いだされた（Antipenko et al., 2003）。二量体化ドメインは、Ｃ末端ＩｇＧ定常ドメイン、ＤＡＲＰｉｎおよびロイシンジッパーの群から選択することができる。好ましい実施形態では、二量体化ドメインは、ＩｇＧ定常ドメインである。なおより好ましい実施形態では、二量体化ドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ドメインである。なおより好ましい実施形態では、二量体化ドメインは、ＩｇＧ１である。ヒトＩｇＧ１のそのような例示的なアミノ酸およびコード化核酸配列を配列番号３７、３８および４１に示す。最も好ましい実施形態では、ＩｇＧ１ドメインの定常断片は、１０４〜３３０位に及ぶアミノ酸配列を含む二量体化ドメインとして用いる。そのような例示的なアミノ酸配列を配列番号４１に示す。マウスＩｇＧ１定常断片も用いることができ、対応するアミノ酸および核酸配列を配列番号３９、４０および４２に示す。例えば、ロイシンジッパーおよび／または免疫グロブリンＣＨ３もしくはＦｃ断片のような定常ドメインがヘテロまたはホモ二量体化する親和性の強さは、約１０−５〜１０−６Ｍの範囲の解離定数ＫＤと推定される。ｓｅｍａドメインの二量体の解離定数は、１０−５〜１０−６Ｍの範囲内にあると推定された（Antipenko et al., 2003）。一般的に、本明細書で言及したＫＤｓは、４〜３８℃、好ましくは４〜２０℃（例えば、１０℃）もしくは２０〜３８℃（例えば、３０℃）の温度および／または４，５〜８のｐＨ（例えば、７のｐＨ）（ｉ）に適用され、（ｉｉ）それらにおけるものであり、または（ｉｉｉ）それらで測定すべきである。添付の実施例に示すように、二量体化ドメイン、例えば、ＩｇＧ１ドメインは、ジスルフィド架橋により安定させることができる。二量体化ドメイン、例えば、ＩｇＧ１ドメインの２つの単量体は、二量体内のジスルフィド架橋により安定させることができる。
最も好ましい実施形態では、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質もしくはその機能性断片または前記セマフォリン３タンパク質（複数可）もしくは前記その機能性断片（複数可）を含む融合タンパク質は、互いにホモまたはヘテロ二量体を形成する。「ホモ二量体」という用語は、２つの同一の単量体が二量体の形態にあることを意味する。「ヘテロ二量体」という用語は、２つの異なる単量体が二量体の形態にあることを意味する。
特定の態様では、二量体の２つの単量体は、１つの融合タンパク質に含まれ得る。２つの非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の２つの本明細書で提供する機能性断片または２つの本明細書で提供する機能性ｓｅｍａドメインが１つの融合タンパク質に含まれ得ることが本明細書で認識される。さらなる態様では、野生型タンパク質も、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片または本明細書で提供する機能性ｓｅｍａドメインと一緒に二量体を形成し得る。したがって、野生型セマフォリン３またはその機能性断片は、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質の本明細書で提供する機能性断片または本明細書で提供する機能性ｓｅｍａドメインと一緒に、１つの融合タンパク質に含まれ得、融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有する。「第１のポリペプチド」という用語は、二量体における第１の単量体を意味することがここに理解される。「第２のポリペプチド」という用語は、二量体における第２の単量体を意味する。特定の態様では、融合タンパク質は、２つの非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質（複数可）の２つの本明細書で提供する機能性断片、もしくは２つの本明細書で提供する機能性ｓｅｍａドメイン、２つの安定化ドメインおよび／または１つもしくは２つの二量体化ドメイン（複数可）を含み得る。融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３、その機能性断片、機能性ｓｅｍａドメインおよび／または本発明の本明細書で述べたポリペプチドを任意の組合せで含み得るものであって、融合タンパク質は、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性を有する。以下の態様では、そのような組合せを例示する。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能するセマフォリン３またはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、前記セマフォリン３タンパク質がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃまたはセマフォリン３Ｄの群から選択される第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換され、前記セマフォリン３タンパク質がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃまたはセマフォリン３Ｄの群から選択される第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能するセマフォリン３またはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、前記セマフォリン３タンパク質がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｂまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｃまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ａまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｄまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｂまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、セマフォリン３またはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、前記セマフォリン３タンパク質がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｂまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｂまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｂまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｃまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｂまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｄまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｃまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、セマフォリン３またはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、前記セマフォリン３タンパク質がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｃまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｃまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｃまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｄまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｄまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、セマフォリン３またはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、前記セマフォリン３タンパク質がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される第２のポリペプチドとを含む。
特定の態様では、本発明の融合タンパク質は、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｄまたはその機能性断片を含む第１のポリペプチドであって、配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第１のポリペプチドと、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３Ｄまたはその機能性断片を含む第２のポリペプチドであって、配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている第２のポリペプチドとを含む。
突然変異セマフォリン３の融合タンパク質は、以下のドメイン
（ｉ）ｓｅｍａドメイン；
（ｉｉ）ＰＳＩドメイン；および
（ｉｉｉ）ＰＳＩドメインのＣ末端と融合したＣ末端ＩｇＧ定常ドメイン
を含み、セマフォリン３のモチーフＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤに含まれるアラニン（Ａ３）残基がリシンに突然変異していることをさらに特徴とし、セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択されることも本明細書で認識される。
融合タンパク質は、機能性ｓｅｍａドメインを含み、前記ｓｅｍａドメインは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンの代わりに親水性アミノ酸ならびに二量体化ドメインおよび／または安定化ドメインを含む。
言い換えれば、融合タンパク質は、機能性ｓｅｍａドメインを含み、前記ｓｅｍａドメインは、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択され、前記ｓｅｍａドメインは、
配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；
配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；
配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；または
配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸
を含み、
前記融合タンパク質は、二量体化ドメインおよび／または安定化ドメインをさらに含む。
最も好ましくは、融合タンパク質は、機能性ｓｅｍａドメインであって、前記機能性ｓｅｍａドメイン内で配列番号２の野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されまたはセマフォリン３Ｂ、３Ｃもしくは３Ｄにおける前記アラニン１０６に対応するアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、機能性ｓｅｍａドメイン、ならびにＩｇＧ１および／または安定化ドメインである二量体化ドメインであって、安定化ドメインは、ＰＳＩドメインである、二量体化ドメインを含む。最も好ましい態様では、融合タンパク質は、セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメインを含み、前記ｓｅｍａドメインは、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含み、前記融合タンパク質は、二量体化ドメインおよび／または安定化ドメインをさらに含む。
本発明の最も好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質／ポリペプチドは、ＰＳＩドメインと融合している機能性ｓｅｍａドメインを含み得る（添付の実施例に示すように）。結果として生じるｓｅｍａ−ＰＳＩドメインは、二量体化ドメイン、例えば、ＩｇＧ１ドメインの定常断片と融合している。さらに、そのような融合タンパク質は、Ｎｒｐ１結合および／またはフリン切断性Ｉｇ様（配列番号２の５８０〜６７０に及ぶアミノ酸）／塩基性領域（配列番号２の７１５〜７７１に及ぶアミノ酸）を欠いている。そのような融合タンパク質は、本明細書で最も好ましい実施形態であり、そのようなコード化融合タンパク質の例示的な核酸分子は、
配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１のヌクレオチド３１６〜１９５９に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５のヌクレオチド２４７〜１８８７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９のヌクレオチド５６３〜２１９７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；または
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３のヌクレオチド４１〜１７３５に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列
を有する核酸配列を含み得る。
最も好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３Ａの融合タンパク質は、配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１のヌクレオチド３１６〜１９５９に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列によりコードされる。
コドン最適化核酸配列を添付の実施例に示すように用いることができることが本明細書で予期される（配列番号１７、１９、４３および４４）。
最も好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ｓｅｍａドメイン、安定化ドメインおよび二量体化ドメインを含む。機能性ｓｅｍａドメインを安定化ドメイン、例えば、ＰＳＩドメインと融合させる。結果として生じるｓｅｍａ−ＰＳＩドメインを二量体化ドメイン、例えば、配列番号３８または４１に示すＩｇＧ１ドメインの定常断片と融合させる。そのような例示的な融合タンパク質は、ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩおよび二量体化ドメインを含み、融合タンパク質は、
配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
配列番号６の１０５位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４７に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
配列番号１０の１０４位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１０のアミノ酸残基１〜５６５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；または
配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１４のアミノ酸残基１〜５４５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列
を含む。
最も好ましい実施形態では、突然変異セマフォリン３Ａの融合タンパク質は、配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶポリペプチドおよび配列番号４１に示すアミノ酸配列を含む。
突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩドメイン、ＩｇＧ１ドメインを含む例示的な融合タンパク質を配列番号１８または２０に示す。突然変異セマフォリン３Ｂ、突然変異セマフォリン３Ｃまたは突然変異セマフォリン３Ｄの機能性ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩドメイン、ＩｇＧ１ドメインを含む例示的な融合タンパク質をそれぞれ配列番号７６、７８または７９に示す。配列番号１８は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンがリシンにより置換されている、ヒト突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩドメインおよびＩｇＧ１のヒト定常断片を含む融合タンパク質を示す。配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンがリシンにより置換されている、ヒト突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩドメインおよびＩｇＧ１のヒト定常断片を含む融合タンパク質をコードする対応する核酸配列を配列番号１７に示す。配列番号７４および７５は、発明の突然変異を有さないセマフォリン３Ｂの例示的な融合タンパク質のアミノ酸配列およびコード化核酸配列を示す。
配列番号２０は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンがリシンにより置換されている、マウス突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩドメインおよびＩｇＧ１のヒト定常断片を含む融合タンパク質を示す。配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンがリシンにより置換されている、マウス突然変異セマフォリン３Ａの機能性ｓｅｍａドメイン、ＰＳＩドメインおよびＩｇＧ１のマウス定常断片を含む融合タンパク質をコードする対応する核酸配列を配列番号１９に示す。
本明細書で述べる融合タンパク質は、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性断片もしくはセマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性ｓｅｍａドメイン、二量体化ドメインおよび／または安定化ドメインが異なる源に由来する、例えば、異なる種に由来する、異種タンパク質であり得る。非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性断片、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性ｓｅｍａドメイン、二量体化ドメインおよび／または安定化ドメインを天然に存在するセマフォリン３タンパク質に見いだされるように結合／融合させることができ、その際に突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの特性が維持されることが本明細書で理解される。さらに、非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性断片、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性ｓｅｍａドメイン、二量体化ドメインおよび／または安定化ドメインを天然に見いだされないように結合／融合させることができる。非天然型／人工／突然変異セマフォリン３タンパク質、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性断片、セマフォリン３の非天然型／人工／突然変異機能性ｓｅｍａドメイン、二量体化ドメインおよび／または安定化ドメインをアミノ酸リンカー、例えば、セリン−グリシンリンカーを介してコンジュゲート／結合させることができる。そのようなリンカーは、当技術分野で公知であり、例えば、タンパク質ドメイン間に存在する短いペプチド配列であり得る。リンカーは、隣接タンパク質ドメインが互いに自由に動くことができるようにグリシンおよびセリンのような柔軟性のある残基からしばしば構成されている。２つの隣接するドメインが互いに立体的に妨害しないことを保証することが必要である場合、より長いリンカーが用いられる。非ペプチド結合も本明細書で認識される。そのような非ペプチド結合は、例えば、Ｃｙｓ側鎖間のジスルフィド結合、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）またはスルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）、金属キレート化／錯化基などの、化学架橋剤により生じるチオエーテル結合または非ペプチド共有結合、および非共有結合性タンパク質−タンパク質相互作用を含み得る。これらは、本発明の単なる実施形態であり、修正は、融合タンパク質内において容易に行うことができ、本発明の主旨から逸脱することなく用いられることは、当業者に明らかである。
免疫グロブリン様ドメインを付加することによって突然変異セマフォリン３またはその機能性断片の安定性を最適化することができること、血清中半減期の延長のような薬物動態学的特性を同時に向上させることおよびプロテアーゼによるタンパク質分解からの保護も本明細書で認識される。さらに、構成の安定性は、製造を最適化することによって増大させることができる。ドメインを共有結合させるために用いられるリンカー配列は、しばしば凝集体をもたらすので、機能性薬物を得るために容易に再構築することができる２つまたは３つのポリペプチドを最初に製造する製造ラインが確立された。そのような技術は、２種のポリペプチドを共有結合させるための指向性（directed）ジスルフィド架橋または架橋試薬を利用する。他の技術は、ロイシンジッパードメインのようなヘテロまたはホモ二量体化ドメイン、Ｆｃドメインおよびノブ・イントゥー・ホール技術のようなその他のものを利用する（例えば、国際公開第２００７／０６２４６６号パンフレット参照）。
本発明はまた、本発明の核酸配列（複数可）を含むベクターに関する。
多くの適切なベクターが分子生物学の分野における当業者に公知であり、その選択は、所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学で通常用いられている他のベクターなどがある。当業者に周知である方法を用いて、様々なプラスミドおよびベクターを構築することができる。例えば、Sambrook et al.（上記引用文中）およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989),(1994)に記載されている技術を参照のこと。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達用のリポソーム内に再構成することができる。特定のポリペプチドの発現が必要である場合、関連配列を発現ベクターに導入することができる。一般的なクローニングベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＧＢＴ９を含む。一般的な発現ベクターは、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴを含む。
好ましくは前記ベクターは、遺伝子標的ベクターおよび／または遺伝子導入ベクターである。治療用遺伝子（例えば、ワクチン接種用）をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ技術により細胞に導入することに基づいている、遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な応用の１つである。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のための適切なベクター、ベクターシステムおよび方法は、文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539；Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919；Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374；Muhlhanser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086；Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；国際公開第９４／２９４６９号パンフレット；国際公開第９７／００９５７号パンフレット、Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640またはVerma, Nature 389 (1997), 239-242およびそれらに引用されている参考文献を参照のこと。特定の態様では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の態様では、ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ８であり、したがって、ベクターは、ＡＡＶ８ベクターである。ＡＡＶベクターは、遺伝子治療用に魅力的である。ＡＡＶシステムは、長期遺伝子発現、ヘルパーウイルスなしに自律的に複製することが不可能であること、分裂および非分裂細胞の形質導入ならびに野生型感染による病原性の欠如を含むいくつかの利点を有する。ＡＡＶ血清型が異なる臓器向性を示すことが本明細書で認識される。したがって、異なるＡＡＶ血清型を用いて、本発明のタンパク質／ポリペプチドを異なる臓器のがんに導くことができる。各種のＡＡＶベクターを標準プロトコールに従って遺伝子療法に用いることができる（Grieger et al., 2012およびAsokan et al., 2012）ことが本明細書で認識される。
本発明の核酸分子および上述のベクターは、細胞への直接導入またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介する導入のために設計することができる。さらに、バキュロウイルスシステムまたはワクシニアウイルスもしくはセムリキ森林ウイルスに基づくシステムを本発明の核酸分子の真核細胞発現システムとして用いることができる。組換え産生に加えて、本発明のタンパク質の断片、融合タンパク質または抗原性断片は、固相技術を用いて直接ペプチド合成により生成することができる（Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成は、用手技術を用いてまたは自動化により実施することができる。自動化合成は、例えば、製造業者により提供された使用説明書に従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて達成することができる。種々の断片を別個に化学的に合成し、化学的方法を用いて結合させて、全長分子を生成させることができる。
特定の態様では、ベクターは、本明細書で定義した前記核酸配列に作動可能に連結した調節配列である核酸配列を含む。
「調節配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現をもたらすのに必要である、ＤＮＡ配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物では、制御配列は、一般的にプロモーター、リボソーム結合部位およびターミネーターを含む。原核生物では、一般的な制御配列は、プロモーター、ターミネーターおよび、場合によっては、エンハンサー、転写活性化因子または転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低限、その存在が発現に必要であるすべての構成要素を含むものとし、さらなる有益な構成要素も含み得る。
「作動可能に連結した」という用語は、そのように記述される構成要素が、それらがそれらの意図された仕方で機能することを可能にする関係にある、並置を意味する。コード配列に「作動可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような仕方でライゲーションされる。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸を用いることが好ましいことは、当業者に明らかである。
列挙したベクターは、発現ベクターでもあり得る。「発現ベクター」は、選択される宿主を形質転換するために用いることができ、選択される宿主におけるコード配列の発現をもたらす。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクターまたは組込み型ベクターであり得る。発現は、好ましくは翻訳可能ｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核および／または真核細胞における発現を保証する調節エレメントは、当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは、転写の開始を保証する通常のプロモーターならびに任意選択で、転写の終結および転写物の安定化を保証するポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞における発現を可能にする可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌（E. coli）におけるＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬプロモーターまたは哺乳類および他の動物細胞におけるＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
転写の開始に関与するエレメントに加えて、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流の、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位などの転写終結シグナルも含み得る。さらに、用いられる発現システムによって、ポリペプチドを細胞コンパートメントに導くまたはそれを培地中に分泌することができるリーダー配列は、列挙した核酸配列のコード配列に付加することができ、当技術分野で周知である。リーダー配列（複数可）は、翻訳、開始および終結シーケンスにより適切な段階でアセンブルされ、好ましくはリーダー配列は、翻訳タンパク質またはその一部の細胞周辺腔または細胞外媒体中への分泌を誘導することができる。したがって、そのようなリーダー配列は、シグナルペプチドでもあり得る。したがって、突然変異セマフォリン３ポリペプチドは、シグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、分泌経路に向うことが定められているタンパク質のＮ末端に通常存在するアミノ酸の短いストレッチである。そのようなタンパク質は、小胞体、ゴルジまたはエンドソームのような特定のオルガネラ内に存在するまたは細胞から分泌されるものを含む。シグナルペプチドは、切断され、活性ポリペプチドは、通常シグナルペプチドを含まない。場合によっては、異種配列は、所望の特性、例えば、発現組換え産物の安定化または簡略化精製をもたらすＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。これに関連して、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡまたはｐＥＦ−ｎｅｏ（Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025およびRaum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの適切な発現ベクターが当技術分野で公知である。
好ましくは、発現制御配列は、トランスフェクト真核宿主細胞の形質転換を可能にするベクターにおける真核生物プロモーターシステムであるが、原核生物宿主の制御配列も用いることができる。ベクターが適切な宿主に組み込まれたならば、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適する条件下で維持され、所望の通りに、本発明のポリペプチドの収集および精製が後続し得る。例えば、添付の実施例を参照のこと。
本発明は、本発明のベクターにより形質転換された宿主または本発明の核酸分子を含む宿主に関する。前記宿主は、原核または真核細胞であり得る。大腸菌（E. coli）または枯草菌（Bacillus subtilis）のような適切な原核／細菌細胞は、クローニングに一般的に用いられるものである。前記真核生物宿主は、哺乳類細胞であり得る。好ましい実施形態では、前記哺乳類細胞は、とりわけ、ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎）細胞、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＢＨＫまたはＰＣ１２細胞のような神経細胞および／または培養細胞である。特に好ましい実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞株は、エプスタイン−バーウイルス核抗原１（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１または２９３Ｅ）を適切に発現する。一般的に、これは、大規模トランスフェクションに最も一般的に用いられる細胞株である（CSH Protocols; 2008; doi:10.1101/pdb.prot4976）。
列挙した宿主が哺乳類細胞であり得ることが特に認識される。特に好ましい宿主細胞は、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、エプスタイン−バーウイルス核抗原１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１、または２９３Ｅ）を含む。
「細胞」または「哺乳類細胞」という用語は、これに関連して用いられているように、複数の細胞および組織に含まれる細胞も含み得る。スクリーニングまたはバリデーション法に用いる細胞は、疾患、例えば、血管新生疾患、がんまたはセマフォリン依存性プレキシン受容体活性化に関連する疾患に罹患している（トランスジェニック）非ヒト動物またはヒトからの試料から得ることができる。細胞（例えば、腫瘍細胞および同類のもの）はまた、患者試料（例えば、生検）から、特に上文または下文で定義した疾患に罹っている患者／対象からの生検／複数の生検から得ることができるまたはそれに由来し得る。したがって、細胞は、ヒト細胞であり得る。再び、本スクリーニングまたはバリデーション法に用いるそのような細胞は、生検試料のような、組織または組織試料に含まれ得る。本発明はまた、本発明のベクターを形質転換したまたはトランスフェクトした宿主を提供する。前記宿主は、本発明の上述のベクターまたは本発明の上述の核酸分子を宿主に導入することによって作製することができる。宿主における少なくとも１つのベクターまたは少なくとも１つの核酸分子の存在は、上述の突然変異セマフォリン３またはその断片をコードする遺伝子の発現を媒介し得る。宿主に導入される、本発明の上述の核酸分子またはベクターは、宿主のゲノムに組み込まれ得るまたは染色体外に維持され得る。宿主は、原核または真核細胞であり得る。
代替発現システムは、昆虫システムまたは昆虫細胞発現システムである。１つのそのようなシステムにおいて、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア属（Trichoplusia）幼虫における外来遺伝子を発現させる。列挙した核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子などの、ウイルスの非必須領域内にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。前記コード配列の挿入の成功により、ポリヘドリン遺伝子が不活性化し、外被タンパク質外被を欠く組換えウイルスが生成する。次いで組換えウイルスを用い、本発明のタンパク質を発現させるスポドプテラ・フルギペルダ（S. frugiperda）細胞またはトリコプルシア属（Trichoplusia）幼虫に感染させる（Smith, J. Virol. 46 (1983), 584；Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227）。特定の態様では、ｐＦＢＤＭベクターを発現のために用いることができる。ＭｕｌｔｉＢａｃバキュロウイルスＤＮＡへの挿入は、ＤＨ１０ ＭｕｌｔｉＢａｃ大腸菌（E. coli）細胞における形質転換時にＴｎ７転位配列により媒介される（Berger et al., 2004；Fitzgerald et al., 2006）。ウイルスの増幅および発現は、Ｓｆ２１（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および／またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni））（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞において実施することができる。
さらなる調節エレメントは、転写および翻訳エンハンサーを含み得る。有利には、本発明の上述のベクターは、選択可能および／またはスコラブルマーカーを含む。
形質転換細胞ならびに、例えば、植物組織および植物の選択に有用な選択可能マーカー遺伝子は、当業者に周知であり、例えば、メトトレキセートに対する耐性をもたらす、ｄｈｆｒの選択の根拠としての代謝拮抗薬耐性（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシンに対する耐性をもたらす、ｎｐｔ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995）およびハイグロマイシンに対する耐性をもたらす、ｈｙｇｒｏ（Marsh, Gene 32 (1984), 481-485）を含む。さらなる選択可能遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする、ｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする、ｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号パンフレット）およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性をもたらすＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）またはブラスチシジンＳに対する耐性をもたらすアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）に由来するデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338）が記載された。
有用なスコラブルマーカーも当業者に公知であり、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121）、緑色蛍光タンパク質（Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47）またはβ−グルクロニダーゼ（Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907）をコードする遺伝子である。この実施形態は、列挙されたベクターを含む細胞、組織および生物の簡易かつ迅速スクリーニングに特に有用である。
上述のように、列挙した核酸分子は、例えば、精製のためだけでなく、遺伝子治療の目的のためにも、細胞中の本発明のポリペプチドを発現させるために単独でまたはベクターの一部として用いることができる。本発明の上述のポリペプチドのいずれか１つをコードするＤＮＡ配列（複数可）を含む核酸分子またはベクターが細胞に導入され、これが次に目的のポリペプチドを産生する。ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ技術により治療用遺伝子を細胞に導入することに基づく、遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な応用の１つである。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のための適切なベクター、方法または遺伝子送達システムは、文献に記載され、当業者に公知である。例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539；Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919；Anderson, Science 256 (1992), 808-813；Verma, Nature 389 (1994), 239；Isner, Lancet 348 (1996), 370-374；Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086；Onodera, Blood 91 (1998), 30-36；Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699；Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292；Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51；Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；国際公開第９４／２９４６９号パンフレット；国際公開第９７／００９５７号パンフレット；米国特許第５，５８０，８５９号明細書；米国特許第５，５８９，４６６号明細書；またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640を参照のこと。列挙した核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介する導入用に設計することができる。好ましくは、前記細胞は、生殖系列細胞、胚細胞もしくは卵細胞であるまたはそれらに由来すし、最も好ましくは、前記細胞は、幹細胞である。胚性幹細胞の例は、とりわけ、Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428に記載されている幹細胞であり得る。
「原核生物」という用語は、本発明のタンパク質の発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子を形質転換またはトランスフェクトすることができる、すべての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主は、例えば、大腸菌（E. coli）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）および枯草菌（Bacillus subtilis）などの、グラム陰性ならびにグラム陽性細菌を含み得る。「真核」という用語は、酵母、高等植物、昆虫および好ましくは哺乳類細胞を含むことを意味する。組換え生産方法に用いられる宿主によって、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、グリコシル化され得るまたは非グリコシル化され得る。本発明のポリペプチドのコード配列およびそれに加えてプロテインＡタグに遺伝子操作により融合させたものを含むプラスミドまたはウイルスの使用が特に好ましい。上述のポリヌクレオチドは、当業者に一般的に公知のいずれかの技術を用いて宿主に形質転換またはトランスフェクトするために用いることができる。さらに、融合し、作動可能に連結した遺伝子を作製し、それらを例えば、哺乳類細胞および細菌において発現させる方法は、当技術分野で周知である（Sambrook, loc cit.）。
本明細書では本発明により使用されるポリペプチドの産生の方法も提供するものであって、前記方法は、本発明のポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主を培養し／生育させ、任意選択で産生されたポリペプチドを培養から回収／単離することを含む。
形質転換宿主を発酵槽中で増殖させ、当技術分野で公知の技術により培養して、最適な細胞増殖を達成することができる。次いで本発明のポリペプチドを増殖培地、細胞溶解物または細胞膜画分から単離することができる。例えば、本発明の微生物発現ポリペプチドの単離および精製は、例えば、分取クロマトグラフ分離および例えば、本発明のポリペプチドのタグに対するまたは添付の実施例で述べるようなモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの免疫学的分離などのあらゆる従来の手段によるものであり得る。
発現を可能にする、宿主の培養の条件は、そのような方法に用いられる宿主システムおよび発現システム／ベクターに依存することが当技術分野で公知である。組換えポリペプチドの発現を可能にする条件を実現するために修正すべきパラメーターは、当技術分野で公知である。したがって、適切な条件は、さらなる発明インプットの非存在下で当業者が決定することができる。
発現したならば、本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野の標準的方法により精製することができる。Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N.Y. (1982)を参照のこと。少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８〜９９％またはより高い均一性が製薬学的用途に最も好ましい。所望の通りに部分的にまたは均一性が得られるまで、精製されたならば、本発明のポリペプチドは、治療に（体外を含む）またはアッセイ法を開発し、実施するのに用いることができる。さらに、培養からの本発明のポリペプチドの回収の方法の例は、添付の実施例で述べる。
本明細書で詳述したように、本発明はまた、突然変異セマフォリン３、その機能性断片または前記突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片を含む本発明の融合タンパク質に特異的に結合する抗体に関する。特に、本明細書では突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に特異的に結合する抗体を提供するものであって、前記抗体は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンを置換している親水性アミノ酸を含むエピトープに特異的に結合し、または他のセマフォリン３における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されており、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される。したがって、本発明は、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に特異的に結合する抗体に関し、前記抗体は、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；配列番号６に示す野生型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；配列番号１０に示す野生型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸；または配列番号１４に示す野生型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンの代わりに親水性アミノ酸を含むエピトープに特異的に結合し、前記セマフォリン３は、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択される。
本発明による、「抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびに結合特異性を依然として保持しているその誘導体または断片を含む。抗体の産生の技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Harlow and Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988およびHarlow and Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に記載されている。本発明による「抗体」という用語は、キメラ、単鎖およびヒト化抗体、ならびにとりわけ、Ｆａｂ断片、Ｅｐｈ受容体、エフリンまたはホスファターゼ細胞外ドメインおよびＦｃからなる融合タンパク質のような抗体断片などの実施形態も含む。抗体断片または誘導体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、単一ドメインＶＨまたはＶｈＨもしくはＶ−ＮＡＲドメインなどの、Ｖ様ドメイン、ならびにミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディまたは化学的にコンジュゲートさせたＦａｂ’多量体などの多量体の形式をさらに含む。例えば、Harlow and Lane (1988)および(1999)、Altshuler (2010) Biochemistry (Moscow) 75, 1584-605またはHolliger (2005) Nature Biotechnology 23, 1126-36を参照のこと。様々な手段が当技術分野で公知であり、そのような抗体および／または断片の産生に用いることができる。したがって、（抗体）誘導体は、ペプチド模倣物質により製造することができる。さらに、単鎖抗体の産生のための記載された技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照のこと）は、本発明のポリペプチド（複数可）および融合タンパク質に特異的な単鎖抗体を産生させるように適応させることができる。また、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現させるためにトランスジェニック動物を用いることができる。最も好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の作製のために、連続細胞株培養により産生される抗体をもたらす、あらゆる技術を用いることができる。そのような技術の例は、当技術によりさらに開発された最初のハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 495）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor (1983) Immunology Today 4, 72）およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77）を含む。抗体という用語はまた、ヒト化抗体に関する。非ヒト（例えば、マウスまたはウサギ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体の他の抗原結合配列など）である。しばしば、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性および容量（capacity）を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）の残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見いだされない、残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良し、最適化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にヒト免疫グロブリンのそれも含み得る。さらなる詳細については、Jones Nature 321 (1986), 522-525; Reichmann Nature 332 (1998), 323-327およびPresta Curr Op Struct Biol 2 (1992), 593-596を参照のこと。
抗体のヒト化のよく知られている方法は、非ヒト「ドナー」抗体の機能性抗原結合部位をヒト「アクセプター」抗体上に移植する、ＣＤＲグラフティングを含む。ＣＤＲグラフティング法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書および米国特許第６，４０７，２１３号明細書に記載されている。別の関連する方法は、遺伝子再構成および遺伝子変換を受けることができる１つまたは複数のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むように遺伝子組換えが行われているトランスジェニック動物からのヒト化抗体の産生である（例えば、米国特許第７，１２９，０８４号明細書参照）。ヒト化抗体を設計し、作製するさらなる方法は、米国特許出願公開第０７／２９０，９７５号明細書、米国特許出願公開第０７／３１０，２５２号明細書および米国特許出願公開第２００３／０２２９２０８号明細書にまたはQueen PNAS (1989), 10029-10033により記載されている。
ＢＩＡｃｏｒｅシステムに用いられる表面プラズモン共鳴は、本発明のポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率および／または選択性のような効率を高めるために用いることができる（Schier (1996) Human Antibodies Hybridomas 7, 97；Malmborg (1995) J. Immunol. Methods 183, 7）。本発明に関連して、「抗体」という用語は、細胞中で発現させることができる、抗体構築物、例えば、とりわけ、ウイルスまたはプラスミドベクターを介してトランスフェクトし、かつ／または形質導入することができる抗体構築物を含むことも認識される。本発明に関連して述べる抗体は、言及したポリペプチドまたは本明細書で定義した突然変異セマフォリン３のエピトープと特異的に結合／相互作用することができる。「と特異的に結合／相互作用する」という用語は、本発明により用いられているように、抗体が類似の構造のエピトープと交差反応しないまたは本質的にしないことを意味する。検討中の抗体のパネルの交差反応性は、例えば、目的のエピトープに対するおよび多数の多かれ少なかれ（構造的かつ／または機能的に）密接に関連するエピトープに対する通常の条件下での前記抗体のパネルの結合を評価することによって試験することができる。その関連する状況において目的のエピトープ（例えば、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片の構造における特定のモチーフ）に結合するが、他のエピトープのいずれにも結合しないまたは本質的に結合しない抗体のみが、目的のエピトープに対して特異的であり、したがって、本発明による抗体であるとみなされる。対応する方法は、例えば、Harlow and Lane, 1988 and 1999, loc citに記載されている。抗体は、言及したポリペプチド、好ましくは突然変異セマフォリン３に固有である、配座または連続エピトープに特異的に結合する／と相互作用する。配座または不連続エピトープは、ポリペプチド抗原について一次配列において分離されているが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原へと折りたたまれるときに分子の表面上に集合する２つ以上の不連続アミノ酸残基の存在によって特徴付けられる（Sela (1969) Science 166, 1365；Laver (1990) Cell 61, 553）。エピトープに寄与する２つ以上の不連続アミノ酸残基は、１つまたは複数のポリペプチド鎖（複数可）の別個の部分に存在する。これらの残基は、ポリペプチド鎖（複数可）が３次元構造に折りたたまれて、エピトープを構成するときに分子の表面上に集合する。対照的に、連続または直線状エピトープは、ポリペプチド鎖の単一直線状セグメントとして存在する、２つ以上の不連続アミノ酸残基からなる。
抗体断片の作製のために様々な技術が開発された。伝統的に、これらの断片は、完全な抗体のタンパク質分解によって得られた（Morimoto et al (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；およびBrennan et al (1985) Science 229:81参照）。抗体断片は、上述の組換え宿主細胞および抗体ファージライブラリーにより直接的に作製することもできる。Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌（E. coli）から直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter et al (1992) Bio/Technology 10:163-167）。他のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の作製のための他の技術は、当業者には明らかである。他の実施形態では、最適な抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号パンフレット、米国特許第５，５７１，８９４号明細書および米国特許第５，５８７，４５８号明細書を参照のこと。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されているように、「線状抗体」でもあり得る。そのような線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。
少なくとも２種のエピトープに対する結合特異性を有する二重特異性抗体（Millstein et al (1983), Nature 305:537-539）は、突然変異セマフォリン３の２種のエピトープに結合し得る。完全な抗体をタンパク質分解により切断してＦ（ａｂ’）２断片を作製する、化学結合を用いる技術などの、抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術も記載された（Brennan et al (1985) Science 229:81）。Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌（E. coli）から回収し、化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成することができる（Shalaby et al (1992) J. Exp. Med. 175:217-225）。「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替法となるものである（Hollinger et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448）。
「Ｆａｂ断片」は、一般的に１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域からなっている。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成し得ない。「Ｆｃ」領域は、一般的に抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によりかつＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結合している。「Ｆａｂ’断片」は、一般的に１つの軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン含む１つの重鎖の一部と、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の領域も含む。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、一般的に２つの軽鎖ならびに２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、したがって、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって結合している２つのＦａｂ’断片からなっている。「Ｆｖ領域」は、一般的に重および軽鎖の両方の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。２を超える抗体価を有する抗体が予期される。３つ以上の抗原結合部位および２つ以上の可変ドメインを有する多価の「オクトパス」抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に作製することができる（米国特許出願公開第２００２／０００４５８６号明細書；国際公開第０１／７７３４２号パンフレット）。例えば、三重特異性抗体を作製することができる（Tutt et al (1991) J. Immunol. 147:60.)。
本明細書で提供する結合分子／抗体／抗原結合断片は、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３フレームワーク内、より好ましくヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３フレームワーク内にある。ＩｇＧ１またはＩｇＧ３内、好ましくヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３フレームワーク内の結合分子、抗体またはこれらの抗体の抗原結合断片は、ワクチン療法に使用するのに特に好ましい。
以下の例示的アッセイは、候補抗体が本発明による突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に実際に特異的に結合することを判定するために用いることができる。
配列番号２に示すセマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に親水性アミノ酸を含むエピトープに選択的かつ特異的に結合する抗体は、例えば、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイにより特定することができる。そのようなアッセイを実施するために、Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウエル透明ポリスチレンＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｉｐｗｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（製品＃２５９２）を４℃の０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）中で漸増量（０．０２ｎＭ〜３．５ｎＭ）のアフィニティー精製突然変異セマフォリン３（もしくはその機能性断片）または精製野生型セマフォリン３（もしくはその機能性断片）により終夜被覆する。その後、５％ＢＳＡを添加した０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で室温で２時間反応をブロックする。等量の生成した抗体を含む溶液を４℃で終夜インキュベートすることにより捕捉する。非結合物質は、ＰＢＳ−Ｔによる広範な洗浄によって除去する。抗突然変異セマフォリン３抗体の結合は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中でウエルを適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とともに４℃で１時間インキュベートすることにより検出する。さらなる洗浄の後、突然変異セマフォリン３結合（もしくはその機能性断片結合）または野生型セマフォリン３結合（もしくはその機能性断片結合）抗突然変異セマフォリン３抗体をオルトフェニレンジアミンとの発色反応により検出する。突然変異セマフォリン３（もしくはその機能性断片）に特異的に結合するが、野生型セマフォリン３（もしくはその機能性断片）には特異的に結合しない抗体を選択する。
さらなる実施形態では、本発明による核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片または融合タンパク質／ポリペプチドは、医薬として使用することができる。すなわち、本明細書で提供し、述べた突然変異セマフォリン３またはその機能性断片は、医薬に用いる。「医薬」および「医薬組成物」という用語は、本明細書で同義で用いる。したがって、「医薬組成物」に関して本明細書に示す定義および説明は、必要な変更を加えて、「医薬」という用語に適用される。
「がんの治療」のような、本明細書で用いている「障害または疾患の治療」という用語は、当技術分野で周知である。「障害または疾患の治療」は、障害または疾患が患者／対象において疑われるまたは診断されたことを意味する。障害または疾患に罹患していることが疑われた患者／対象は、当業者が特定の病的状態に帰す（すなわち、障害または疾患を診断する）ことができる特定の臨床および／または病理学的症状を一般的に示す。
障害または疾患の「治療」は、例えば、障害もしくは疾患の進行の停止（例えば、症状の悪化なし）または障害もしくは疾患の進行の遅延（進行の停止が一過性にすぎない場合）をもたらし得る。障害または疾患の「治療」は、障害または疾患に罹患している対象／患者の部分奏功（例えば、症状の改善）または完全奏功（例えば、症状の消失）ももたらし得る。したがって、障害または疾患の「治療」は、例えば、障害もしくは疾患の進行の停止または障害もしくは疾患の進行の遅延をもたらし得る、障害または疾患の改善も意味し得る。そのような部分または完全奏功には、再発が後続し得る。対象／患者が治療に対する広範囲の反応（例えば、上述の例示的な反応）を経験し得ることを理解すべきである。障害または疾患の治療は、とりわけ、根治治療（好ましくは完全奏効および最終的に障害または疾患の治癒をもたらす）および待機的治療（症状軽減を含む）を含む。したがって、「治療」という用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果はまた、疾患／病的状態／障害もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防することに関して予防的であり、かつ／または疾患／病的状態／障害および／もしくは疾患／病的状態／障害に帰せられる有害影響を部分的もしくは完全に治療することに関して治療的であり得る。「がんの予防」のような、本明細書で用いる「障害または疾患の予防」という用語も当技術分野で周知である。例えば、本明細書で定義した障害または疾患に罹る傾向があると推測される患者／対象は、特に障害または疾患の予防による恩恵を受け得る。対象／患者は、障害または疾患に対する、遺伝的素因を含むがこれに限定されない、感受性または素因を有し得る。そのような素因は、例えば、遺伝マーカーまたは表現型インジケーターを用いて標準的アッセイにより判定することができる。本発明により予防される障害または疾患は、患者／対象において診断されなかったまたは診断できなかった（例えば、患者／対象が臨床または病理学的症状を示さない）ことを理解すべきである。したがって、「予防」という用語は、臨床および／または病理学的症状が診断もしくは判定されるまたは主治医が診断もしくは判定することができる前の本発明の化合物の使用を含む。
本発明は、本発明の核酸分子、本発明の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片、本発明の融合タンパク質またはポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、医薬賦形剤を含み得る。前記医薬賦形剤は、医薬担体、媒体および／または希釈剤を含み得るまたは媒体および／または希釈剤であることが本明細書で理解される。１つの特定の実施形態では、前記医薬担体は、ウイルスである。好ましい実施形態では、前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ８である。ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療に用いることができる。したがって、一態様では、本発明は、アデノウイルスゲノムのエレメントおよび真核生物転写プロモーターの制御下にある突然変異セマフォリン３またはその断片を含むヌクレオチド配列を提供する。この核酸配列は、ベクターが個体の細胞に導入される場合に前述の異種遺伝子の発現を可能とするベクターとして機能することができる。
さらに、本発明は、医薬として使用する医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、血管新生障害、がん、腫瘍、腫瘍性疾患、血管性網膜症、血液脳関門透過性変化、神経炎症性障害、炎症性障害、骨粗鬆症、乾癬、肥満、マイコバクテリア感染および／または肉芽腫の治療に使用するための医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、固形腫瘍である、腫瘍の治療に使用するための医薬組成物を提供する。特に、本発明は、膵臓腫瘍である、腫瘍の治療に使用するための医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、膵臓がん、子宮頚がん、乳がん、結腸がん、黒色腫、前立腺がん、膀胱がんおよび舌がんからなる群から選択される、がんの治療に使用するための医薬組成物を提供する。特に、本発明は、膵臓がんの治療に使用するための医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、血管正常化、腫瘍成長の低減、転移の低減または生存期間の延長が伴う、医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、抗増殖薬、抗がん薬、細胞増殖抑制薬、細胞毒性薬および／または放射線療法と併用して投与するものとする、医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドを提供する。特定の好ましい態様では、医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドは、非経口的に投与するものとする。
さらに、本発明は、がんの成長を阻害し、肝臓転移または転移巣体積を低減し、血管面積を低減し、かつ／または周皮細胞被覆を増大させることによりがん血管の正常化を促進し、かつ／または血管潅流を増大させ、がん低酸素を阻害するための腫瘍またはがんの治療に使用するための医薬組成物、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドまたはコード化核酸分子を提供する。
医薬組成物、核酸分子、ベクター、前記突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドは、他の治療剤と併用して用いることができる。本発明の化合物を同じ疾患に対して活性な第２の治療剤と併用して用いる場合、各化合物の用量は、化合物を単独で用いる場合の用量と異なり得る。本発明の化合物と第２の治療剤との併用は、本発明の化合物と一緒の第２の治療剤の投与を含み得る。そのような投与は、同時（simultaneous）／同時（concomitant）投与を含み得る。しかし、下文でも説明するように、連続／個別投与も想定される。
好ましくは、本発明の化合物と併用して投与される第２の治療剤は、抗がん薬である。本発明による医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して投与される抗がん薬は、腫瘍血管新生阻害剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤、表皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤または血管内皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤）；細胞毒性薬（例えば、プリンおよびピリミジン類似物質代謝拮抗薬などの、代謝拮抗薬）；有糸分裂阻害薬（例えば、微小管安定化薬または抗有糸分裂アルカロイド）；白金配位錯体；抗腫瘍抗生物質；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタードまたはニトロソ尿素）；内分泌薬（例えば、副腎皮質ステロイド、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストまたはソマトスタチン類似体）；あるいは腫瘍細胞において誤調節される特定の代謝経路において過剰発現し、かつ／またはさもなければ関与する酵素もしくは受容体を標的とする化合物（例えば、ＡＴＰおよびＧＴＰホスホジエステラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤（セリン、トレオニンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エーベルソンプロテインチロシンキナーゼ））ならびに様々な増殖因子、それらの受容体および対応するキナーゼ阻害剤（表皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖因子阻害剤、インスリン様増殖因子受容体阻害剤および血小板由来増殖因子受容体キナーゼ阻害剤など））；メチオニン、アミノペプチダーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、シクロオキシゲナーゼ１またはシクロオキシゲナーゼ２阻害剤）およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤）であり得る。
本発明の医薬組成物、核酸、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して抗がん薬として用いることができるアルキル化剤は、例えば、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド、メクロレタミン（クロルメチン）、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イフォスファミド、ベンダムスチンまたはトロフォスファミドなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチンまたはセムスチンなど）、アルキルスルホネート（ブスルファン、マンノスルファンまたはトレオスルファンなど）、アジリジン（ヘキサメチルメラミン（アルトレタミン）、トリエチレンメラミン、ＴｈｉｏＴＥＰＡ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリエチレンチオホスホルアミド）、カルボクオンまたはトリアジクオンなど）、ヒドラジン（プロカルバジンなど）、トリアゼン（ダカルバジンなど）またはイミダゾテトラジン（テモゾロミドなど）であり得る。
本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して抗がん薬として用いることができる白金配位錯体は、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンまたはトリプラチンテトラナイトレートであり得る。
本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して抗がん薬として用いることができる細胞毒性薬は、例えば、葉酸類似体代謝拮抗薬（アミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセドまたはラルチトレキセドなど）、プリン類似体代謝拮抗薬（クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン（そのプロドラッグ型アザチオプリンを含む）、ペントスタチンまたは６−チオグアニンなど）およびピリミジン類似体代謝拮抗薬（シタラビン、デシタラビン、５−フルオロウラシル（そのプロドラッグ型カペシタビンおよびテガフルを含む）、フロクスリジン、ゲムシタビン、エノシタビンまたはサパシタビンなど）であり得る。
本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して抗がん薬として用いることができる有糸分裂阻害薬は、例えば、タキサン（ドセタキセル、ラロタキセル、オルタキセル、パクリタキセル／タキソールもしくはテセタキセルなど）、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシンもしくはビノレルビンなど）、エポチロン（エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥもしくはエポチロンＦなど）またはエポチロンＢ類似体（イクサベピロン／アザエポチロンＢなど）であり得る。
本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して抗がん薬として用いることができる抗腫瘍抗生物質は、例えば、アントラサイクリン（アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシンもしくはゾルビシンなど）、アントラセンジオン（ミトキサントロンもしくはピキサントロンなど）またはストレプトミセス属（Streptomyces）から単離された抗腫瘍抗生物質（アクチノマイシン（アクチノマイシンＤを含む）、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣを含む）もしくはプリカマイシンなど）であり得る。
本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して抗がん薬として用いることができるチロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、アキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、ソレフェニブ、スニチニブまたはバンデタニブであり得る。
本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して抗がん薬として用いることができるトポイソメラーゼ阻害剤は、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ベロテカン、ルビテカンまたはラメルラリンＤなど）またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、テニポシドもしくはドキソルビシンなど）であり得る。
さらなる抗がん薬を本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドと併用して用いることができる。抗がん薬は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、タモキシフェン、アムサクリン、ベキサロテン、エストラムスチン、イロフルベン、トラベクテジン、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アルボシジブ、セリシクリブ、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、エファプロキシラル、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィン、テモポルフィン、ベルテポルフィン、アリトレチノイン、トレチノイン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アトラセンタン、ボルテゾミブ、カルモフル、セレコキシブ、デメコルシン、エレスクロモール、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、マソプロコール、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、オマセタキシン、シティマゲン、セラデノベク、テガフル、テストラクトン、チアゾフリン、チピファニブおよびボリノスタットのような、生物学的または化学的分子を含み得る。
増殖性疾患に関与するがんまたは腫瘍マーカー／因子／サイトカインに対する抗体、抗体断片、抗体構築物（例えば、単鎖構築物）および／または修飾抗体（ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、「完全ヒト化」抗体など）のような生物学的製剤も本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドとの併用療法アプローチに用いることができる。そのような生物学的分子の例は、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｅｄｉｔｕｘ（登録商標）、抗ＣＤ１９／ＣＤ３構築物（例えば、欧州特許第１０７１７５２号明細書参照）および抗ＴＮＦ抗体（例えば、Taylor PC. Antibody therapy for rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 2003. 3(3):323-328）である。本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／またはポリペプチドとの併用療法アプローチに用いることができるさらなる抗体、抗体断片、抗体構築物および／または修飾抗体は、Taylor PC. Curr Opin Pharmacol. 2003, 3(3):323-328；Roxana A. Maedica. 2006. 1(1):63-65に見いだすことができる。
上記で言及した組合せは、医薬製剤の形で用いるために好都合に提示することができる。そのような組合せの個々の成分は、好都合な経路により個別または組み合わせた配合医薬製剤で連続的にまたは同時に（simultaneously）／同時に（concomitantly）投与することができる。投与が連続的である場合、本発明の医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドあるいは第２の治療剤を最初に投与することができる。同時に投与する場合、組合せは、同じまたは異なる医薬組成物で投与することができる。同じ製剤で併用する場合、２つの化合物が安定で、互いにおよび製剤の他の成分と適合性がなければならないことは、十分に理解されよう。別個に製剤化される場合、それらはいずれかの好都合な製剤として提供され得る。
医薬組成物、核酸分子、ベクター、突然変異セマフォリン３、その機能性断片および／または融合タンパク質／ポリペプチドは、放射線療法などの、理学療法と併用して投与することもできる。放射線療法は、本発明の化合物の投与の前、後または同時に開始することができる。例えば、放射線療法は、化合物の投与の１〜１０分、１〜１０時間または２４〜７２時間後に開始することができる。しかし、これらの時間枠は、限定的と解釈すべきでない。対象は、放射線、好ましくはガンマ線に曝露し、放射線は、数時間、数日間および／または数週間にわたり施行される１回または複数回の照射で送達することができる。ガンマ線は、標準的線量および計画を用いて標準的放射線療法プロトコールに従って送達することができる。
したがって、本発明は、がんの治療または予防、特に膵臓がんの治療または予防に用いるための、核酸分子、突然変異セマフォリン３、その機能性断片、融合タンパク質もしくはポリペプチドおよび／またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグまたは薬学的に許容される賦形剤と一緒に前述の物質のいずれかを含む医薬組成物に関し、化合物または医薬組成物は、抗がん薬と併用しておよび／または放射線療法と併用して投与するものとする。
言い換えれば、本発明は、医薬として使用するための本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、本発明の融合タンパク質もしくは本発明のポリペプチドを提供する。さらに本発明は、血管新生障害、がん、腫瘍性疾患、血管性網膜症、血液脳関門透過性変化、神経炎症性障害、骨粗鬆症、肥満、マイコバクテリア感染および／または肉芽腫の治療に使用するための本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または本発明の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または本発明の融合タンパク質／ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、固形腫瘍である、腫瘍の治療に使用するための本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または本発明の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または本発明の融合タンパク質／ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、膵臓腫瘍、子宮頚がん、乳がん、結腸がん、黒色腫、前立腺がん、膀胱がんおよび舌がんからなる群から選択される腫瘍の治療に使用するための本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または本発明の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または本発明の融合タンパク質／ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、膵臓がんの治療に使用するための本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または本発明の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または本発明の融合タンパク質／ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、血管正常化、腫瘍成長の低減、転移の低減または生存期間の延長が伴う、本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または本発明の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または本発明の融合タンパク質／ポリペプチドを提供する。
「血管新生」という用語は、血管ＥＣが先在血管から発生し、毛細血管が組織に侵入する方法で形成されることを意味する。形成過程は、プロテアーゼによる血管基底膜の消化、血管ＥＣの移動／増殖および管腔の形成である。「血管新生障害」は、動脈硬化症、高血圧、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性血管障害または血管奇形などの血管疾患；肝炎、肺炎、糸球体腎炎、甲状腺炎、骨炎、滑膜炎、破骨、軟骨融解、リウマチ、気管支喘息、類肉腫症、Ｃｒｏｗ−Ｆｕｋａｓｅ症候群、パンヌス、アレルギー性浮腫、潰瘍、腹水、腹膜硬化症または組織癒着などの炎症性疾患；糖尿病性網膜症、網膜静脈の閉塞または加齢黄斑変性などの眼内血管新生性疾患；子宮機能不全、胎盤機能不全、卵巣機能亢進または卵胞嚢胞などの生殖系疾患；網膜症、脳卒中、血管性認知症またはアルツハイマー病などの中枢神経系疾患；固形がん、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫または造血器潰瘍などのがんである。
「がん」は、本発明によれば、細胞の制御されない分裂、および浸潤による隣接組織内への直接増殖により、またはがん細胞が血流もしくはリンパ系により運ばれる、転移による遠隔部位への移植により広がるこれらの細胞の能力を特徴とする障害または疾患のクラスを意味する。腫瘍性疾患は、がん、腫瘍のいずれかの形であり得るまたは膵臓がん、乳がん、上皮がん、肝細胞癌腫、胆管細胞がん、胃がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がん、舌がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がんおよび腎臓がん；肺がん、胃がん、小腸のがん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがんもしくは甲状腺のがんから選択される。
血管新生阻害剤は、上記の疾患におけるその状態が血管新生によって重篤になり得る疾患に対する予防または治療剤として用いることができる。血管新生阻害剤が効果を有する疾患は、血管疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖系疾患、中枢神経系疾患、がんなどである。本発明のベクターの形の製剤（遺伝子治療剤）は、上記のそれぞれの形態の投与に応じた異なる形態のものであり得る。例えば、それが有効成分である本発明のＤＮＡを含む注射剤である場合、注射剤は、通常の方法により調製することができる。遺伝子治療剤の基礎原料は、それが注射に通常用いられる基礎原料である限り、特に限定されない。それは、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム、塩化ナトリウムおよび無機塩の混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストランもしくはグルコースなどの溶液、グリシンもしくはアルギニンなどのアミノ酸溶液、または有機酸溶液もしくは塩溶液およびグルコース溶液の混合物である。注射剤は、浸透圧調節剤、ｐＨ調整剤などの助剤、ゴマ油もしくはダイズ油などの植物油、レシチンもしくは非イオン性界面活性剤などの界面活性剤などを用いて溶液、懸濁液または分散系として通常の方法により調製することができる。上記の注射剤は、粉末化または凍結乾燥などの操作により使用時に溶解する製剤であり得る。
さらに、本発明は、本発明による突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片の、核酸分子の、融合タンパク質の、ポリペプチドのまたは宿主の使用を提供する。
さらに、本発明は、薬学的に活性な量の本発明の核酸分子、または本発明による突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、本発明の融合タンパク質、ポリペプチド、本発明のまたは本明細書で述べるような方法により製造された医薬組成物をそのような治療を必要とする対象に投与するステップを含む血管新生障害および／または腫瘍性疾患および／またはがんの治療の方法を提供する。
本発明により治療される対象または患者は、動物（例えば、非ヒト動物）、脊椎動物、哺乳類、げっ歯類動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えば、マウス）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物（例えば、ネコ）、ブタ科動物（例えば、ブタ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、霊長類、類人猿（例えば、サルまたは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、ギボン）またはヒトであり得る。本発明との関連においては、経済的、農学的または科学的に重要な動物を治療すべきであることが特に認識される。科学的に重要な生物は、マウス、ラットおよびウサギを含むが、これらに限定されない。例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のようなミバエおよびエレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）のような線虫などの下等生物も科学的アプローチにおいて用いることができる。農学的に重要な動物の非限定的な例は、ヒツジ、ウシおよびブタであるが、例えば、ネコおよびイヌは、経済的に重要な動物と考えることができる。好ましくは、対象／患者は、哺乳類であり、より好ましくは、対象／患者は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、類人猿、マーモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、ギボン、ヒツジ、ウシまたはブタ）であり、最も好ましくは、対象／患者は、ヒトである。
薬学的有効量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重より高いことがあり得る。さらに、薬学的有効量は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重より低いことがあり得る。特に好ましい態様では、本発明は、本発明による治療の方法を提供し、薬学的有効量は、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
製剤のＤＮＡの含量は、疾患の治療目的、投与部位、投与回数、所望の治療期間、患者の年齢もしくは体重などによって異なり、適切に調節することができることが本明細書で認識される。それは、患者（体重が６０ｋｇ）に対して通常約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇの本発明のタンパク質をコードするＤＮＡである。
医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、医薬組成物の送達の部位、投与方法、投与計画および開業医に公知の他の因子を考慮に入れて、適正医療規範と調和した方法で製剤化し、投与する。したがって、本明細書における目的のための医薬組成物の「有効量」は、そのような考慮によって決定される。
当業者は、個体に投与される医薬組成物の有効量は、とりわけ化合物の性質に依存することを知っている。
本明細書で提供する組成物の投与は、とりわけ、１日２回、毎日、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、週１回、隔週に１回、２週に１回、毎月１回などの投与を含む。
例えば、前記化合物が（ポリ）ペプチドまたはタンパク質である場合、１回当たり非経口的に投与される医薬組成物の総薬学的有効量は、上記のように、これは治療上の裁量にゆだねられるが、患者の体重の約１μｇタンパク質／ｋｇ／日〜１５ｍｇタンパク質／ｋｇ／日の範囲にある。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇタンパク質／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１〜１ｍｇタンパク質／ｋｇ／日である。連続的に投与する場合、医薬組成物は、一般的に、１日当たり１〜４回の注射により、または例えば、ミニポンプを用いた持続皮下注入により、約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時の投与速度で投与される。静注バッグ溶液も用いることができる。変化を観測するのに必要な治療の期間および反応が起こる治療後の間隔は、所望の効果によって異なると思われる。個別の量は、当業者に周知である通常の試験によって決定することができる。
本発明の医薬組成物は、非経口、経口、直腸、嚢内、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤、滴剤もしくは経皮貼付剤による）または口腔内投与することができる。特に好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口投与する。
本発明の医薬組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」とは、ウイルス、非毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、封入材料またはあらゆる種類の製剤助剤を意味する。本明細書で用いられる「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、気管内、鼻腔内、胸骨内、皮下および関節内注射ならびに注入を含む投与方法を意味する。
医薬組成物はまた、持続放出システムにより適切に投与される。持続放出組成物の適切な例は、成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langer et al., J. Biomed. Master. Res. 15:167-277 (1981)およびR. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)）、エチレン酢酸ビニル（R. Langer et al., Id.）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）を含む。持続放出医薬組成物はまた、リポソームに封入された化合物を含む。医薬組成物を含むリポソームは、以下に示されている本質的に公知の方法により調製される：独国特許第３，２１８，１２１号明細書、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980)；欧州特許第５２，３２２号明細書；欧州特許第３６，６７６号明細書；欧州特許第８８，０４６号明細書；欧州特許第１４３，９４９号明細書；欧州特許第１４２，６４１号明細書；特開８３−１１８００８号広報；米国特許第４，４８５，０４５号明細書および第４，５４４，５４５号明細書；ならびに欧州特許第１０２，３２４号明細書。通常、リポソームは、脂質含量がコレステロールとして約３０モルパーセントを超え、選択される割合が最適な療法について調節される、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型のものである。
非経口投与のために、医薬組成物は、一般的に所望の純度のそれを薬学的に許容される担体、すなわち、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある担体と混合することによって単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁剤または乳剤）に製剤化する。
一般的に、製剤は、医薬組成物の成分を液体担体または微細固体担体または両方と均一かつ緊密に接触させることによって調製する。次いで、必要な場合、製品を所望の製剤に成型する。好ましくは担体は、非経口担体、より好ましくはレシピエントの血液と等張性である溶液である。そのような担体媒体の例は、水、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性媒体ならびにリポソームもここで有用である。担体は、等張性および化学的安定性を向上させる物質などの少量の添加物を適切に含む。そのような物質は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸もしくはそれらの塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）（ポリ）ペプチド、例えば、ポリアルギニンもしくはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸もしくはアルギニンなどのアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。
治療的投与に用いられる医薬組成物の成分は、無菌性でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２μｍ膜）による濾過により容易に達成される。医薬組成物の治療用成分は、無菌的アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能な栓を有する静注バッグまたはバイアルに入れる。
医薬組成物の成分は、通常、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアル中に水性溶液としてまたは復元用の凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌバイアルに５ｍｌの濾過滅菌済み１％（重量／容積）水性溶液を充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌性注射用水を用いて凍結乾燥化合物（複数可）を復元することによって調製する。
本発明はさらに、本明細書で定義した突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、融合タンパク質、核酸分子、抗体および／または医薬組成物を含むキットに関する。そのようなキットは、例えば、がん、腫瘍および／または腫瘍性疾患の治療に用いることができ、前記腫瘍、がん、腫瘍性疾患は、固形腫瘍、特に膵臓腫瘍／がんである。
本発明による「核酸分子」という用語は、コードおよび、当てはまるならば、非コード配列（プロモーター、エンハンサーなどのような）を含む。
「ポリペプチド」、「（ポリ）ペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で同義で用い、１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシル基との間で形成されるアミド結合により結合した２つ以上のアミノ酸のポリマーを意味する。アミノ酸残基とも呼ばれる、ペプチドまたはタンパク質に含まれるアミノ酸は、２０種の標準タンパク質構成α−アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ）からだけでなく、非タンパク質構成および／または非標準α−アミノ酸（例えば、オルニチン、シトルリン、ホモリシン、ピロリシンまたは４−ヒドロキシプロリン）ならびにβ−アミノ酸（例えば、β−アラニン）、γ−アミノ酸およびδ−アミノ酸からも選択することができる。好ましくは、ペプチドまたはタンパク質に含まれるアミノ酸残基は、α−アミノ酸、より好ましくは２０種の標準タンパク質構成α−アミノ酸（Ｌ−異性体またはＤ−異性体として存在し得る、好ましくはすべてＬ−異性体として存在する）から選択される。ペプチドまたはタンパク質は、非修飾であり得るあるいは例えば、そのＮ末端において、そのＣ末端において、かつ／またはそのアミノ酸残基のいずれかの側鎖における官能基において（特に１つまたは複数のＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕおよび／またはＡｒｇ残基の側鎖官能基において）修飾され得る。そのような修飾は、例えば、Wuts PG & Greene TW, Greene’s protective groups in organic synthesis, John Wiley & Sons, 2006に対応する官能基について記載された保護基のいずれかの結合も含み得る。そのような修飾は、１つもしくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の共有結合（ＰＥＧ化ペプチドもしくはタンパク質を形成する）、グリコシル化および／または１つもしくは複数の脂肪酸によるアシル化（例えば、１つもしくは複数のＣ８−３０アルカン酸またはアルケン酸；脂肪酸アシル化ペプチドまたはタンパク質を形成する）も含み得る。ペプチドまたはタンパク質に含まれるアミノ酸残基は、例えば、線状分子鎖（線状ペプチドまたはタンパク質を形成する）として存在し得るまたは１つもしくは複数の環（環状ペプチドまたはタンパク質に対応する）を形成し得る。ペプチドまたはタンパク質はまた、２つ以上の同一または異なる分子からなるオリゴマーを形成し得る。本明細書で用いられる「ドメイン」という用語は、特定の構造および／または機能を自律的にとることができるアミノ酸配列の任意の領域／部分に関する。本発明との関連においては、したがって、「ドメイン」は、機能ドメインまたは構造ドメインであり得る。
「コンセンサス配列」または「コンセンサス配列モチーフ」という用語は、配列アライメントにおける各位置に見いだされる、ヌクレオチドまたはアミノ酸の、最も頻度の高い残基の計算された整列である。それは、関連する配列を互いに比較し、類似配列モチーフを計算する、多重配列アライメントの結果である。
本明細書で用いられる「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語またはその文法的変異形は、記述された特徴、整数、ステップまたは成分を規定するものと解釈すべきであるが、１つまたは複数のさらなる特徴、整数、ステップ、成分またはその群の追加を排除しない。この用語は、「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」を含む。
したがって、「含む（comprising）」／「含む（including）」／「有する（having）」という用語は、さらなる成分（または同様に特徴、整数、ステップなど）が存在し得る／可能性があることを意味する。
「からなる（consisting of）」という用語は、さらなる成分（または同様に特徴、整数、ステップなど）が存在しないことを意味する。
「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語またはその文法的変異形は、本明細書で用いる場合、記述された特徴、整数、ステップまたは成分を規定するが、さらなる特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群が、特許請求した組成物、装置または方法の基本的および新規の特性を実質的に変化させない場合にのみ、１つまたは複数のさらなる特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の追加を除外しない。
したがって、「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語は、特定のさらなる成分（または同様に特徴、整数、ステップなど）が存在し得るもの、すなわち組成物、装置または方法の本質的特性に実質的に影響を及ぼさないものを意味する。言い換えれば、「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語（「実質的に含む（comprising substantially）」という用語と本明細書で同義で用いることができる）は、装置または方法の本質的な特性が他の成分の存在によって実質的に影響を受けないならば、必須の成分（または同様に特徴、整数、ステップなど）に加えて組成物、装置または方法における他の成分の存在を可能にする。
「方法」という用語は、化学、生物学および生物物理学の技術分野の当業者に公知であるまたは当業者によって公知の方法、手段、手法および手順から容易に開発される方法、手段、手法および手順を含むが、これらに限定されない所定の課題を遂行するための方法、手段、手法および手順を意味する。
「約」という用語は、好ましくは表示された数値の±１０％、より好ましくは表示された数値の±５％、特に表示された正確な数値を意味する。
本明細書で用いられる「約」という用語は、表示された数値の±１０％、特に表示された数値の±５％を意味する。「約」という用語を用いる場合には、表示された正確な数値への具体的な言及も含まれる。「約」という用語を、所定の核酸におけるヌクレオチドの数のような、整数で定量化されるパラメーターに関連して用いる場合、表示された数値の±１０％または±５％に対応する数は四捨五入して最も近い整数にするものとする。例えば、「約２５ヌクレオチド」という表現は、２３〜２８ヌクレオチドの範囲、特に２４〜２６ヌクレオチドの範囲を意味し、好ましくは２５ヌクレオチドという特定の値を意味する。
本発明は、以下の非限定的な図面および実施例を参照することによってさらに説明する。特に明記しない限り、組換え遺伝子技術の確立された方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)に記載されている通りに用いた。
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、そのｉｎ ｖｉｖｏ位置から除去された組成物に適用される。好ましくは本発明の単離された組成物または化合物は、それらのｉｎ ｖｉｖｏ位置に存在する他の物質（例えば、他のタンパク質または他の化合物）を実質的に含まない（すなわち、精製または半精製組成物または化合物）。
示した定義および説明は、これらの項目にも適用でき、必要な変更を加えて適用する。上記によれば、本発明は、特定の実施形態における以下の項目に関する。
１． 配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換され、前記セマフォリン３がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される、血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３またはその機能性断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
２． 前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片が血管新生の阻害剤として機能する、項目１に記載の核酸分子。
３． 前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片がアミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、ここで、
Ｘ１がＫまたはＮであり、
Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
アラニン（Ａ３）が前記親水性アミノ酸により置換されている、
項目１または２に記載の核酸分子。
４． （ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、かつ
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３の群から選択される核酸分子；
（ｂ）配列番号２の１０６位における、配列番号６の１０５位における、配列番号１０の１０４位におけるまたは配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義した核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子；
（ｄ）血管新生の阻害剤として機能し、（ｂ）で言及したポリペプチドのいずれか１つとの少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つで定義した核酸分子のヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸分子であって、縮重核酸分子が血管新生の阻害剤として機能するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、項目１から３のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
５． 前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片が配列番号２の１０６位、配列番号６の１０５位、配列番号１０の１０４位または配列番号１４の１２０位に前記親水性アミノ酸を含む、項目１から４のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
６． 前記突然変異セマフォリン３またはその機能性断片がアミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の突然変異を含む、項目１から５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
７． 前記親水性アミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される、項目１から６のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
８． 前記親水性アミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される、項目７に記載の核酸分子。
９． 前記親水性アミノ酸残基がＫまたはＲである、項目７に記載の核酸分子。
１０． 前記親水性アミノ酸残基がＫである、項目７に記載の核酸分子。
１１． ＫがコドンＡＡＧまたはＡＡＡによりコードされる、項目１から１０のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
１２． 前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片が突然変異ヒトまたはマウスセマフォリン３またはその機能性断片である、項目１から１１のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
１３． 前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片が配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の配列（複数可）を含む、項目１から１２のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
１４． （ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１の６０１〜１２０６のヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５の５２９〜１１３７のヌクレオチド；
（ｃ）配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９の８４２〜１４４４のヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３の３６８〜９８２のヌクレオチド
を含む、項目１から１３のいずれか１つに記載の核酸分子。
１５． 配列番号５７の６０１〜１２０６のヌクレオチド；配列番号６１の５２９〜１１３７のヌクレオチド；配列番号６５の８４２〜１４４４のヌクレオチド；または配列番号６９の３６８〜９８２のヌクレオチドを含む、項目１から１４のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
１６． 前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片が
（ａ）配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１；
（ｂ）配列番号６の１０５位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２２；
（ｃ）配列番号１０の１０４位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２３；または
（ｄ）配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２４
に示すアミノ酸配列を含む、項目１から１５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
１７． 前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片が配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２の群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１から１６のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
１８． 前記ポリペプチドが融合タンパク質である、項目１から１７のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
１９． 前記ポリペプチドが前記突然変異セマフォリン３もしくは前記その機能性断片、安定化ドメインおよび／または二量体化ドメインを含む、項目１８に記載の核酸分子。
２０． 前記安定化ドメインがプレキシンセマフォリンインテグリン（ＰＳＩ）ドメインであり、前記ＰＳＩドメインが１つまたは複数の次の配列：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８を含む、項目１８または１９に記載の核酸分子。
２１． 前記二量体化ドメインが別のそのような二量体化ドメインとの１０−５Ｍ〜１０−６Ｍの範囲の解離定数ＫＤを有する、項目１８から２０のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
２２． 前記二量体化ドメインがＣ末端ＩｇＧ定常ドメイン、ＤＡＲＰｉｎおよびロイシンジッパーの群から選択される、項目１８から２１のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
２３． 前記ＩｇＧ定常ドメインがＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、項目２２に記載の核酸分子。
２４． （ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１のヌクレオチド３１６〜１９５９に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
（ｂ）配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５のヌクレオチド２４７〜１８８７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
（ｃ）配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９のヌクレオチド５６３〜２１９７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
（ｄ）配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３のヌクレオチド４１〜１７３５に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列
を有する核酸酸配列を含む、項目１から２３のいずれか１つの項目に記載の核酸分子。
２５． 前記ポリペプチドが
（ａ）配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６の１０５位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４７に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１０の１０４位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１０のアミノ酸残基１〜５６５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１４のアミノ酸残基１〜５４５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列
を含む、項目１から２４のいずれか１つに記載の核酸分子。
２６． 項目１から２５のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。
２７． 遺伝子標的ベクターまたは遺伝子導入ベクターである、項目２６に記載のベクター。
２８． アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目２６または２７に記載のベクター。
２９． アデノ随伴ウイルスベクターがＡＡＶ８ベクターである、項目２６から２８のいずれか１つの項目に記載のベクター。
３０． 項目２６から２９のいずれか１つの項目に記載のまたは項目１から２２に記載の核酸分子を含むベクターにより形質転換された宿主。
３１． 哺乳類細胞である、項目３０に記載の宿主。
３２． 哺乳類細胞がＨＥＫ細胞である、項目３０または３１に記載の宿主。
３３． ＨＥＫ細胞がＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１またはＨＥＫ２９３Ｅ細胞である、項目３０から３２のいずれか１つの項目に記載の宿主。
３４． 項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子によりコードされる前記ポリペプチド、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片を産生させる方法であって、項目３０から３３のいずれか１つの項目に記載の宿主を培養し／生育させ、任意選択で産生されたポリペプチドを単離することを含む、方法。
３５． 項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
３６． 血管新生の阻害剤として機能し、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニン、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換されている、アミノ酸配列を含む突然変異セマフォリン３またはその機能性断片であって、前記セマフォリン３がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される、突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
３７． 血管新生の阻害剤として機能する、項目３６に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
３８． アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、ここで、
Ｘ１がＫまたはＮであり、
Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
アラニン（Ａ３）が前記親水性アミノ酸により置換されている、項目３６から３７のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
３９． 前記突然変異セマフォリン３が
（ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、かつ
配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３の群から選択される核酸分子によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の１０６位に対応する、配列番号６の１０５位に対応する、配列番号１０の１０４位に対応するまたは配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｃ）で定義した核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド；
（ｄ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドとの少なくとも５５％の同一性を有し、血管新生の阻害剤として機能するポリペプチド；ならびに
（ｅ）（ａ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれか１つで定義した核酸分子のヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として縮重している核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む血管新生の阻害剤として機能するポリペプチド
の群から選択される、項目３６から３８のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４０． 配列番号２の１０６位、配列番号６の１０５位、配列番号１０の１０４位または配列番号１４の１２０位に前記親水性アミノ酸を含む、項目３６から３９のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４１． アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）欠失（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、項目３６から４０のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４２． 前記親水性アミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される、項目３６から４１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４３． 前記親水性アミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される、項目４２に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４４． 前記親水性アミノ酸がＫまたはＲである、項目４２に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４５． 前記親水性アミノ酸がＫである、項目４２に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４６． 突然変異ヒトもしくはマウス突然変異セマフォリン３またはその機能性断片である、項目３６から４５のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４７． 配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の配列を含む、項目３６から４６のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４８． （ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１の６０１〜１２０６のヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５の５２９〜１１３７のヌクレオチド；
（ｃ）配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９の８４２〜１４４４のヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３の３６８〜９８２のヌクレオチド
を含む核酸分子によりコードされる、項目３６から４７のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
４９． 配列番号５７の６０１〜１２０６のヌクレオチド；配列番号６１の５２９〜１１３７のヌクレオチド；配列番号６５の８４２〜１４４４のヌクレオチド；または配列番号６９の３６８〜９８２のヌクレオチドを含む核酸分子によりコードされる、項目３６から４８のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
５０． （ａ）配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１；
（ｂ）配列番号６の１０５位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２２；
（ｃ）配列番号１０の１０４位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２３；または
（ｄ）配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２４
に示すアミノ酸配列を含む、項目３６から４９のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
５１． 配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２の群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目３６から５０のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
５２． 項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含むポリペプチド。
５３． 融合タンパク質である、項目５２に記載のポリペプチド。
５４． 前記突然変異セマフォリン３もしくは前記その機能性断片、安定化ドメインおよび／または二量体化ドメインを含む、項目５２または５３に記載のポリペプチド。
５５． 前記安定化ドメインがプレキシンセマフォリンインテグリン（ＰＳＩ）ドメインであり、前記ＰＳＩドメインが１つまたは複数の次の配列：配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８を含む、項目５２または５４に記載のポリペプチド。
５６． 前記二量体化ドメインが別のそのような二量体化ドメインとの１０−５Ｍ〜１０−６Ｍの範囲の解離定数ＫＤを有する、項目５２から５５のいずれか１つの項目に記載のポリペプチド。
５７． 前記二量体化ドメインがＣ末端ＩｇＧ定常ドメイン、ＤＡＲＰｉｎおよびロイシンジッパーの群から選択される、項目５２から５６のいずれか１つの項目に記載のポリペプチド。
５８． ＩｇＧ定常ドメインがＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、項目５７に記載のポリペプチド。
５９． （ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１のヌクレオチド３１６〜１９５９に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
（ｂ）配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５のヌクレオチド２４７〜１８８７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
（ｃ）配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９のヌクレオチド５６３〜２１９７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
（ｄ）配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３のヌクレオチド４１〜１７３５に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列
を有する核酸酸配列を含む核酸分子によりコードされる、項目５２から５８のいずれか１つの項目に記載のポリペプチド。
６０． （ａ）配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６の１０５位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４７に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１０の１０４位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１０のアミノ酸残基１〜５６５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１４のアミノ酸残基１〜５４５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列
を含む、項目５２から５９のいずれか１つの項目に記載のポリペプチド。
６１． 項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片に特異的に結合する抗体であって、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンを置換している親水性アミノ酸を含むエピトープに特異的に結合し、または他のセマフォリン３タンパク質における、配列番号２に示す野生型セマフォリン３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置におけるアラニンが親水性アミノ酸により置換され、前記セマフォリン３がセマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄの群から選択される、抗体。
６２． 項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子または項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドを含み、医薬賦形剤を任意選択で含む医薬組成物。
６３． 項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドを含み、医薬賦形剤を任意選択で含む、項目６２に記載の医薬組成物。
６４． 医薬賦形剤がウイルスである医薬担体である、項目６２または６３に記載の医薬組成物。
６５． 前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目６２から６４のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
６６． アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ８である、項目６２から６５のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
６７． 医薬として使用するための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
６８． 血管新生障害、がん、腫瘍、腫瘍性疾患、血管性網膜症、血液脳関門透過性変化、神経炎症性障害、骨粗鬆症、肥満、マイコバクテリア感染および／または肉芽腫の治療における使用のための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
６９． 腫瘍が固形腫瘍である、項目６８に記載の使用のための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目６８に記載の使用のための項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目６８に記載の使用のための項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目６８に記載の使用のための項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６８に記載の使用のための項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
７０． 腫瘍が膵臓腫瘍である、項目６８または６９に記載の使用のための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目６８または６９に記載の使用のための項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目６８または６９に記載の使用のための項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目６８または６９に記載の使用のための項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６８または６９に記載の使用のための項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
７１． 前記がんが、膵臓がん、子宮頚がん、乳がん、結腸がん、黒色腫、前立腺がん、膀胱がんおよび舌がんからなる群から選択される、項目６８から７０のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目６８から７０のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目６８から７０のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目６８から７０のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６８から７０のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
７２． 血管正常化、腫瘍成長の低減、転移の低減または生存期間の延長が伴う、項目６８から７１のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目６８から７１のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目６８から７１のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目６８から７１のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６８から７１のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
７３． 前記核酸分子、前記ベクター、前記突然変異セマフォリン３、前記その機能性断片、前記ポリペプチドまたは前記医薬組成物を抗増殖薬、抗がん薬、細胞増殖抑制薬、細胞毒性薬および／または放射線療法と併用して投与するものとする、項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目６８に記載の使用のための項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
７４． 前記核酸分子、前記ベクター、前記突然変異セマフォリン３、前記その機能性断片、前記ポリペプチドまたは前記医薬組成物を非経口的に投与するものとする、項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、項目６８に記載の使用のための項目２６もしくは２９のいずれか１つの項目に記載のベクター、項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドまたは項目６８から７２のいずれか１つの項目に記載の使用のための項目６２から６６のいずれか１つの項目に記載の医薬組成物。
７５． 項目１から２５のいずれか１つの項目に記載の核酸分子によりコードされる突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片のまたは項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片のまたは項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチドのまたは項目３０から３３のいずれか１つの項目に記載の宿主の使用。
７６． 薬学的有効量の項目１から２３のいずれか１つの項目に記載の核酸分子、または項目３６から５１のいずれか１つの項目に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、項目５２から６０のいずれか１つの項目に記載のポリペプチド、項目６２から６８のいずれか１つの項目に記載のもしくは項目３４に記載の方法により製造された医薬組成物をそのような治療を必要とする対象に投与するステップを含む血管新生障害、腫瘍性疾患および／またはがんの治療の方法。
７７． 前記対象がヒトである、項目７６に記載の治療の方法。
７８． 前記薬学的有効量が０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である、項目７６または７７に記載の治療の方法。
本発明は、以下の非限定的な図面および実施例を参照することによってさらに説明する。
特に明記しない限り、組換え遺伝子技術の確立された方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)に記載されている通りに用いた。
Ｓｅｍａ３Ａ−Ｎｒｐ１−プレキシンＡ４シグナル伝達複合体を示す図である。Ｓｅｍａ３Ａは、そのＮＨ２末端におけるｓｅｍａドメインとそれに続くＰＳＩドメイン、Ｉｇ様ドメインおよびさらなる短いＣ末端塩基性ストレッチ（ｂ）の存在を特徴とする。Ｎｒｐ１の細胞外部分は、２つの反復補体結合ドメイン（ａ１−ａ２ドメイン）、２つの凝固因子様ドメイン（ｂｉ−ｂ２ドメイン）および膜近傍メプリン／Ａ５／ミュー−ホスファターゼ（ＭＡＭ；ｃ）相同性ドメインを含む。プレキシンＡ４は、細胞外ｓｅｍａドメインとそれに続く多重ＰＳＩおよびインテグリン−プレキシン−転写因子（ＩＰＴ）ドメインを特徴とするが、細胞内ではハーフスプリット（half-split）ＧＡＰドメインを示す。Ｓｅｍａ３ＡのＣ末端塩基性ストレッチは、Ｎｒｐ１のｂ１ドメインに高い親和性で（黒枠二重矢印）結合し、これが二量体Ｓｅｍａ３ＡをプレキシンＡ４に近接した状態に維持する共受容体として作用する。理論により拘束されるものではないが、Ｓｅｍａ３Ａは、非常に低い親和性のｓｅｍａドメイン−ｓｅｍａドメイン相互作用（灰色枠二重矢印）によりプレキシンＡ４の二量体化および活性化を促進し、これがＲ−ＲａｓおよびＲａｐ１ ＧＴＰ負荷の阻害ならびにＥＲＫ１／２のリン酸化をもたらす。 Ｓｅｍａ３Ａタンパク質構築物の概略図である。Ｓｅｍａ３Ａ突然変異体の以下の代表的なものを示す。（Ａ）さらなるＰＳＩドメインまたは機能性ｓｅｍａドメインの構造を安定させ得るドメイン（安定化ドメイン）を有するまたは有さないＡ１０６Ｋ突然変異体を含むＳｅｍａ３Ａドメイン；（Ｂ）Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６ＫΔＩｇ−ｂ；（Ｃ）Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよび（Ｄ）全長ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。 同上 マウスＳｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｄ、Ｓｅｍａ３Ｅ、Ｓｅｍａ３ＦおよびＳｅｍａ３Ｇのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。マウスＳｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｄ、Ｓｅｍａ３Ｅ、Ｓｅｍａ３ＦおよびＳｅｍａ３ＧならびにヒトＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＳＥＭＡ３ＣおよびＳＥＭＡ３Ｄのタンパク質配列を一文字アミノ酸コードで示す。（Ａ）ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤペプチドモチーフを強調する（太文字）。（Ｂ）ｓｅｍａドメインとプレキシンのｓｅｍａドメインとの間の強い相互作用を可能にすると予測される３つのコンセンサス配列モチーフを太字で強調する。（Ｃ）ＰＳＩドメインにおける１つのコンセンサス配列モチーフを太字で強調する。保存は、ＣｌｕｓｔａｌＷコンセンサス記号で示し、アステリスク（＊）は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示し、コロン（：）は、強く類似した特性の群間の保存−Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ２５０マトリックスにおける＞０．５のスコアを示し、ピリオド（．）は、弱く類似した特性の群間の保存−Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ２５０マトリックスにおける≦０．５のスコアを示す。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 Ａ型プレキシンおよびＮｒｐ１受容体へのセマフォリン３および突然変異セマフォリン３タンパク質の結合の解析を示す図である。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）および全長Ｓｅｍａ３Ａ ＷＴ、突然変異Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂまたは突然変異Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂのｃＤＮＡｓを融合させて、対応するＡＰコンジュゲートＳｅｍａ３Ａリガンドを作製した。ｉｎ ｓｉｔｕ結合アッセイにおいて、ＣＯＳ−７細胞に異なる候補受容体をトランスフェクトした。特定の受容体を発現する細胞へのリガンド結合は、ホスファターゼ基質ニトロブルーテトラゾリウムにより示された。（Ｂ−Ｄ）リガンド（Ｂ、Ｃ、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ；Ｄ、Ｓｅｍａ３Ａ ＷＴ）の種々の濃度で結合するプレキシンＡ４（Ｂ、Ｃ）またはＮｒｐ１（Ｄ）の結合曲線（Ｂ、Ｄ）およびスキャチャード解析（Ｃ）を、ＡＰ基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートの発色性転換の分光分析により独立に定量化した。（Ｅ）プレキシンＡ４受容体に対するＳｅｍａ３Ａ ＷＴ、Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの推定親和性を示す。プレキシンＡ４受容体を発現するＣＯＳ−７細胞へのＡＰコンジュゲートＳｅｍａ３Ａ ＷＴ、突然変異Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂまたは突然変異Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂのリガンドの結合曲線をＡＰ基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートの発色性転換の分光分析によって独立に定量化した。プレキシンＡ４へのＳｅｍａ３Ａ ＷＴ、突然変異Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂまたは突然変異Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの結合は、それぞれ７ｎＭ、２００ｎＭおよび０．７ｎＭの推定Ｋｄを示す。（Ｆ）ｉｎ ｓｉｔｕ結合アッセイにおいて、ＣＯＳ−７細胞に各種のＡ型プレキシン受容体または対照の目的のための緑色蛍光タンパク質（モック）をトランスフェクトした。各種のＡ型プレキシン受容体を発現する細胞へのＦｃタグＳＥＭＡ３Ｂ ΔＩｇ−ｂ、ＳＥＭＡ３Ｂ Ａ１０５Ｋ ΔＩｇ−ｂおよびＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの結合は、免疫細胞化学においてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体によって示された。ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）の配合物をＡＰ基質として用いたところ、ＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体がヒトＦｃタグ組換えＳＥＭＡ３タンパク質に結合した位置に不溶性の黒柴色生成物が生成した。 同上 同上 同上 ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ組換えタンパク質の精製を示す図である。タンパク質は、ヒトＨＥＫ２９３細胞において産生させ、プロテインＡ−セファロース上で上清から精製し、溶出し、非還元または還元条件下でＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ゲルにより分析した。レーン：１）分子量マーカー；２）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ細胞培養培地；３）非結合プロテインＡ；４）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ画分１；５）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ画分２；６）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ画分３；７）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ細胞培養培地；８）非結合プロテインＡ；９）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ画分１；１０）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ画分２；１１）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ画分３；１２）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ、プール画分１、２および３；１３）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ、プール画分１、２および３（還元型）；１４）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ、プール画分１、２および３；１５）ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ、プール画分１、２および３（還元型）。非還元条件では、ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの両方が分解生成物を伴わずに約２００ｋＤａ二量体として出現する。 ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂがＥＣの方向性がある移動を阻害するのに市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴより有効であることを示す図である。Ｉ型コラーゲン（１μｇ／ｍｌ）への方向性を有するＥＣの移動を実時間解析により解析した。（Ａ−Ｃ）ＥＣの移動を、０，２ｎＭ（Ａ）、０，９ｎＭ（Ｂ）、および３，５ｎＭ（Ｃ）のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ（灰色実線）もしくはＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ（黒色点線）もしくはＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ（黒色破線）の非存在下（対照、黒色実線）または存在下でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムプラットフォームのＣＩＭ−Ｐｌａｔｅｓ １６において４時間にわたって追跡した。各曲線は、４回の技術的反復実験の平均値±ＳＤである。統計解析：結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。＊ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ対ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ＷＴ；＃ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ対ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ；＊、＃ｐ＜０．０５、＊＊、＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊、＃＃＃ｐ＜０．００１。（Ｄ、Ｅ）対照サイレンス（Ｄ）またはプレキシンＡ４サイレンス（Ｅ）ＥＣを、１，８ｎＭのＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの非存在下（対照、黒色実線）または存在下（黒色破線）で２時間半にわたり移動させた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上 同上 同上 同上 ヒトＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂタンパク質がＥＣの方向性がある移動を阻害するのに市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴより有効であることを示す図である。Ｉ型コラーゲン（１μｇ／ｍｌ）への方向性を有するＥＣの移動を実時間解析により解析した。ＥＣの移動を、（Ａ）等モル（０，９ｎＭ）量の市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ（灰色実線）もしくはＦｃタグヒトＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ（黒色点線）；（Ｂ）３，５ｎＭの市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ（灰色実線）もしくは０，２ｎＭのＦｃタグヒトＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ（黒色点線）の非存在下（対照、黒色実線）または存在下でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムプラットフォームのＣＩＭ−Ｐｌａｔｅｓ １６において４時間にわたって追跡した。各曲線は、４回の技術的反復実験の平均値±ＳＤである。統計解析：結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。＊ＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ対ＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上 ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂがＥＣにおける生化学的シグナル伝達を誘発するのに市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴより有効であることを示す図である。（Ａ）０，０２ｎＭのＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ、Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂまたはＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂで１分間処理したまたは処理しなかったＥＣにおける活性Ｒａｐ１ ＧＴＰのプルダウンアッセイ。インプット画分中に検出された総Ｒａｐ１を用いて、活性Ｒａｐ１の標準化光学濃度（Ｎ．Ｏ．Ｄ．）を計算した。（Ｂ）０，２ｎＭのＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴまたはＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂまたはＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂで１５分間処理したまたは処理しなかったＥＣにおける活性化ホスホ−ＥＲＫ１／２のウエスタンブロット解析。総ＥＲＫ１／２のウエスタンブロット解析を用いて、活性ＥＲＫ１／２のＮ．Ｏ．Ｄ．を計算した。類似の結果を有する３回の独立したアッセイの代表的なものを示す。バンドを定量化し、対照に対するＮ．Ｏ．Ｄを計算した（値は、平均値±ＳＤである；ｎ＝３ 独立したアッセイ）。統計解析：結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂがＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの血管新生を阻害し、がん血管系を正常化することを示す図である。示したように染色した対照およびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ処理がん組織の免疫蛍光解析。共焦点画像は、１群当たり７匹のマウスおよびがん当たり５視野の代表的なものである。（Ａ）抗Ｍｅｃａ３２ Ａｂ（緑）を用いて、血管ＥＣを染色した。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、血管面積を５１％有意に減少させた。（Ｂ）抗α−平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）を、抗Ｍｅｃａ３２（緑）と併用して用いて、周皮細胞（赤）を検出した。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、血管周皮細胞を著しく増加させた。（Ｃ）対照およびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂで処理したマウスをＦＩＴＣ−レクチン（緑）で心臓潅流し、次いで、がん組織を抗Ｍｅｃａ３２ Ａｂ（赤）で染色した。対照がんは、不十分に潅流された血管系を示したが、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、がん血管の潅流を増大させた。（Ｄ）Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、屠殺の前にマウスにピモニダゾール（Maione et al 2012）を注射することによって検出されたがん低酸素を効果的に阻害した。 ＡＡＶ８−全長ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴがＰＤＡＣマウスモデルにおけるがんの成長および転移成形を阻害することを示す図である。以前に記載されたように（Maione et al 2009, 2012）、ＡＡＶ８媒介体細胞遺伝子導入によって全長ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴをＰＤＡＣマウスの膵臓に形質導入した。ＡＡＶ８−ＬａｃＺを対照として形質導入した。ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ遺伝子治療の３週間後に、マウスを屠殺し、解析した。ＡＡＶ８−ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴは、がんの体積を５２％阻害し（Ａ）、肝臓転移発生率を５９％低下させた（Ｂ）。１群当たりのマウスの数（ｎ＝１０）。統計解析：Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。＊＊ｐ＜０．０１。 Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂがＰＤＡＣマウスモデルにおけるがんの成長を阻害し、転移形成を阻害し、周皮細胞による血管被覆を増加させることを示す図である。（Ａ、Ｂ）がんを有するＰＤＡＣマウスを３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂにより３週間治療した。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、がんの体積を６４％収縮させ（Ａ）、肝臓転移の発生率を８１％阻害する（Ｂ）。１群当たりのマウスの数（ｎ＝１０）。統計解析：Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）抗ＮＧ２（赤、周皮細胞を標識するため）および抗Ｍｅｃａ３２ Ａｂ（緑）で染色したＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ処理および対照がん組織の免疫蛍光解析の共焦点画像。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、対照と比較して、血管周皮細胞を著しく増加させた。画像は、１群当たり７匹のマウスおよびがん当たり５視野の代表的なものである。 同上 Ｓｅｍａ３Ｆ Ａ１０６Ｋが内皮細胞の移動の阻害を増大させないことを示す図である。Ｉ型コラーゲン（１μｇ／ｍｌ）への方向性を有するＥＣの移動を実時間解析により解析した。ＥＣの移動を、３，５ｎＭのＦｃタグＳｅｍａ３Ｆ ΔＩｇ−ｂ（黒色点線）もしくはＦｃタグＳｅｍａ３Ｆ Ｓ１０７Ｋ ΔＩｇ−ｂ（破線）の非存在下（対照、黒色実線）または存在下でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムプラットフォームのＣＩＭ−Ｐｌａｔｅｓ １６において４時間にわたって追跡した。各曲線は、４回の技術的反復実験の平均値±ＳＤである。統計解析：結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。＊ＦｃタグＳｅｍａ３Ｆ ΔＩｇ−ｂ対対照；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂがＥＣの方向性がある移動を阻害するのに市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ｅより有効であることを示す図である。Ｉ型コラーゲン（１μｇ／ｍｌ）への方向性を有するＥＣの移動を実時間解析により解析した。（Ａ−Ｂ）ＥＣの移動を，等モル量のＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ（Ａ−Ｂ，黒色破線）もしくは市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ｅ ＷＴ（灰色実線）非存在下（対照、黒色実線）または存在下でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムプラットフォームのＣＩＭ−Ｐｌａｔｅｓ １６において４時間にわたって追跡した。各曲線は、４回の技術的反復実験の平均値±ＳＤである。統計解析：結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。＊ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ対ＦｃタグＳＥＭＡ３Ｅ ＷＴまたはＦｃタグＳｅｍａ３Ｆ ＷＴ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上
以下の非拘束の実施例により、本発明を例示する。
Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、特異的結合剤、プレキシンＡ４の強力な活性化剤およびＥＣの走触性移動の阻害剤である
材料および方法
細胞結合アッセイおよびスキャッチャード解析
ｉｎ ｓｉｔｕ結合アッセイは、以前に記載されたプロトコール（Tamagnone et al 1999）に修正を加えたものを用いて実施した。特に、種々のセマフォリン受容体を発現するｃＤＮＡ構築物をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を４８ウエルクラスターディッシュのウエルに播種した。次いで、それらを、分泌胎盤アルカリホスファターゼと融合させた組換えセマフォリン分子（例えば、Ｓｅｍａ３Ａ−ＡＰ）を含む完全培地を用いて３７℃で１時間インキュベートした。５回の洗浄の後、細胞を固定し、６５℃で１０分間加熱して、内因性ホスファターゼを不活性化し、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞染色のためにＮＢＴ−ＢＣＩＰ（ニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）ＡＰ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｓ３７７１）を用いてインキュベートした。リガンド結合の定量的評価のために、受容体発現細胞を漸増濃度のＡＰコンジュゲートリガンド（あらかじめ測定された比活性／μｇを有する）を用いてインキュベートした。細胞結合ＡＰ活性は、発色性可溶性基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｐ７９９８）を用いてインキュベートし、多ウエル分光光度計（４０５ｎｍでの吸光度）により測定することによって最終的に明らかにされた。Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いてスキャッチャードプロット解析を行った。
走触性内皮細胞移動アッセイ
ヒト臍静脈ＥＣの実時間における方向性がある移動は、マイクロ電子センサーアレイがマイクロプレートウエルに組み込まれている電気インピーダンスベースのシステムである、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）によりモニターした。インピーダンスベースのｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムは、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＴＣＡ）機器に基づいている。機器の中核部は、Ｅ−ｐｌａｔｅである。Ｅ−ｐｌａｔｅ １６は、使い捨てプレートであり、Ｅ−ｐｌａｔｅ １６上の個々のウエルは、ウエルにおける細胞が絶えずモニターされることを可能にするセンサー電極アレイが組み込まれていた。ＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．２を用いて実験ファイルをセットアップする。このソフトウエアは、インピータンス値を変換して、細胞指数（ＣＩ）、平均値、最大および最小値、標準偏差（ＳＤ）、半数効果濃度（ＥＣ５０）、半数阻害濃度（ＩＣ５０）などのパラメーターを得る。次いで、ＣＩ単位で表されたデータは、あらゆる種類の数学的および統計的解析のためにエクスポートすることができる。
このアッセイでは、本発明者らは、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＤＰ機器のＣＩＭ−Ｐｌａｔｅ １６を用いることにより、ＥＣの方向性がある移動を実時間でモニターした。ＣＩＭ−Ｐｌａｔｅの上部チャンバー底部側（下部チャンバーに面する側）を組織培養フード内で３０μｌのＩ型コラーゲン（１μｇ／ｍｌ）で３０分間コーティングした。各下部チャンバーウエルに最初に１６０μｌの血清不含Ｍ１９９培地（Ｓｅｍａ３Ａを含むまたは含まない）を満たし、次いで上部チャンバーにアセンブルした。アセンブルしたプレートを３７℃で１時間インキュベートして、平衡化した（３０μｌの血清不含培地を上部チャンバーの各ウエルに加えた）。ＥＣを剥離し、３００００細胞／１００μｌの最終濃度に再懸濁した。ブランクステップを開始して、細胞培養培地のバックグラウンドインピーダンスを測定し、これをＣＩ値を計算するための参照インピーダンスとして用いた。次いで１００μｌの細胞懸濁液（３０，０００細胞）を上部チャンバーの各ウエルに加えた。ＣＩＭ−Ｐｌａｔｅ １６を、ＣＯ２インキュベーター中で平衡化したＲＴＣＡ ＤＰ機器に入れた。ＲＴＣＡ ＤＰ機器を用いてＥＣの移動を連続的にモニターした。
統計的評価のために、結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。時間内に各実験条件の技術的反復実験に関するＲＴＣＡ機器からエクスポートされたＣＩデータについて平均値、標準偏差およびｐ値を計算した。移動データは、対照試料を１００％とみなした百分率として表す。
Ｒａｐ１−ＧＴＰプルダウンアッセイ
ＥＣを最初に３時間飢餓状態にし、次いで、０．０２ｎＭのＳＥＭＡ３Ａで３７℃で１分間処理したまたは処理しなかった。次いで、活性Ｒａｐ１−ＧＴＰを、グルタチオンアガロース樹脂により単離したヒトＲａｌグアニンヌクレオチド解離刺激因子（ＲａｌＧＤＳ）のＲａｐ１結合ドメイン（ＲＢＤ）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質上に引き下ろした。本発明者らは、製造業者のガイドラインおよび検出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品カタログ＃１６１２０）により活性Ｒａｐ１プルダウンアッセイを進めた。インプット画分中に検出された総Ｒａｐ１を用いて、活性Ｒａｐ１−ＧＴＰの標準化光学濃度（Ｎ．Ｏ．Ｄ．）を計算した。類似の結果を有する３回の独立したプルダウンアッセイの代表的なものを示す。バンドを定量化し、対照に対するＮ．Ｏ．Ｄ．を計算した（値は、平均値±ＳＤである；ｎ＝３独立したアッセイ）。統計的評価のために、結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。
ＥＲＫ１／２リン酸化
ＥＣを最初に３時間飢餓状態にし、次いで、ＳＥＭＡ３Ａ［０．２２５ｎＭ］で３７℃で１５分間処理したまたは処理しなかった。本発明者らは、細胞を溶解し、抗ホスホＥＲＫ１／２［マウス抗ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２；Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（クローンＥ１０）；希釈１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、製品カタログ＃９１０６］および抗Ｔｏｔ ＥＲＫ［ウサギ抗ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（クローン１３７Ｆ５）；希釈１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、製品カタログ＃４６９５］抗体を用いたＷＢによるタンパク質解析を進めた。総タンパク質の量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。同等量のタンパク質がプレキャストＢｏｌｔ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。次いで、タンパク質をＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｍｉｎｉ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）に転移させ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃：６５−６１２０）またはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．カタログ＃：１１−０３５−０６２）によりプローブし、増強化学発光法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ＃ＮＥＬ１０５００１ＥＡ）により検出した。インプット画分中に検出された、総ＥＲＫ１／２を用いて、ホスホ−ＥＲＫ１／２のＮ．Ｏ．Ｄ．を計算した。類似の結果を有する３回の独立したプルダウンアッセイの代表的なものを示す。バンドを定量化し、対照に対するＮ．Ｏ．Ｄ．を計算した（値は、平均値±ＳＤである；ｎ＝３独立したアッセイ）。統計的評価のために、結果を両側不等分散性Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。
ヒトおよびマウスセマフォリン３タンパク質は、保存タンパク質である。配列番号１に示すヒトセマフォリン３Ａは、配列番号５に示すヒトセマフォリン３Ｂと少なくとも５２％相同／同一である。さらに、配列番号１に示すヒトセマフォリン３Ａは、配列番号９に示すヒトセマフォリン３Ｃと少なくとも４５％相同／同一である。さらに、配列番号１に示すヒトセマフォリン３Ａは、配列番号１３に示すヒトセマフォリン３Ｄと少なくとも５３％相同／同一である。さらに、配列番号３に示すマウスセマフォリン３Ａは、配列番号１３または配列番号１５に示すヒトまたはマウスセマフォリン３Ａと少なくとも５３％相同／同一である。さらに、配列番号３に示すマウスセマフォリン３Ａは、配列番号１１に示すマウスセマフォリン３Ｃと少なくとも４５％相同／同一である。
結果
本発明者らは、Ｓｅｍａ３Ａ ＷＴに由来する新規で、精製するのが容易で、かつ非経口的に送達可能な突然変異合成タンパク質を提供するために戦略を策定した。この突然変異体は、以下の特徴、すなわち、ｉ）Ｎｒｐ１に結合することができない；ｉｉ）フリンプロテアーゼ切断部位を欠く；ｉｉｉ）安定に二量体である；かつｉｖ）プレキシンに高い親和性で結合することができるという特徴を含むべきである。したがって、新規な組換えマウスＳｅｍａ３Ａ突然変異タンパク質を作製した。この例示的な突然変異Ｓｅｍａ３Ａは、融合タンパク質の型で設計した。この突然変異セマフォリン３Ａは、表２に要約する特徴を含み、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂと呼ぶ（表２および図２）。例示的なアミノ酸配列を配列番号１８または２０に示す。さらに、突然変異セマフォリン３Ｂ、ＣおよびＤの対応する融合タンパク質も作製した。これらの突然変異体は、本明細書でＳｅｍａ３Ｂ Ａ１０５Ｋ−Ｆｃ、Ｓｅｍａ３Ｃ Ａ１０４Ｋ−ＦｃおよびＳｅｍａ３Ｄ Ａ１２０Ｋ−Ｆｃ（それぞれ配列番号７６、７８または７９に示す）と呼ぶ。１０６位のアラニンを保持しているが、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂと同じ構造を含むセマフォリン３Ａの突然変異体は、Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂと呼び、そのような分子の核酸配列を配列番号４３または４４（それぞれヒトおよびマウスＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ）に示す。
Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ突然変異体は、以下の特徴および利点によって特徴付けられる。
１）Ｓｅｍａ３Ａ ＷＴのＮｒｐ１結合およびフリン切断性Ｉｇ様／塩基性領域（例えば、アミノ酸５４９〜７７２）が欠失している；
２）突然変異マウスＳｅｍａ３Ａの残りのＳｅｍａ−ＰＳＩドメイン領域（例えば、アミノ酸１〜５４８）が、ＩｇＧ１定常断片（例えば、マウスに由来する）（Ｆｃ、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインにより形成される）までのそのＣ末端と融合して、二量体化を誘導する。ＩｇＧ１ Ｆｃは、突然変異Ｓｅｍａ３Ａタンパク質のセファロースプロテインＡ上の容易かつ大規模精製を可能にした；
３）Ｓｅｍａ３Ａ ＷＴのＡｌａ１０６残基がＬｙｓにより置換され（Ａ１０６Ｋ）、これにより、突然変異体にＡ型プレキシンであるプレキシンＡ４に対する高い（Ｋｄ＝０．７ｎＭ）親和性が付与された。
突然変異および野生型セマフォリン３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、標準的なタンパク質精製を用いて得られた。特に、ヒトおよびマウスＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ（それぞれ配列番号１８または２０に示されている）ならびにマウスＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂがサービスより常用のタンパク質精製を用いて得られた。ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ全長は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；カタログ＃１２５０−Ｓ３−０２５から購入した。配列番号１９と呼ばれるＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂコード化ｃＤＮＡは、合成遺伝子設計（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）により作製された。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂコード化ｃＤＮＡ（配列番号１９）を次にｐＵＰＥ発現ベクターにサブクローニングした。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂコード化ｃＤＮＡを運ぶｐＵＰＥ発現ベクターのトランスフェクショングレードの調製物（Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ ｐＵＰＥ）を、次にエプスタイン−バーウイルス核抗原１を安定に発現する懸濁液で増殖しつつあるＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１または２９３Ｅ）、すなわち、大規模トランスフェクションに用いられる細胞株に一時的にトランスフェクトした。１週間後に、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ ｐＵＰＥ ＨＥＫ２９３Ｅ懸濁培養の培地を遠心分離によって収集した。融合タンパク質をプロテインＡ−セファロースにバッチ式で結合させた。ビーズを回収し、重力流カラムに移した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でカラムを洗浄することにより、特異的に結合したタンパク質を除去した。２０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．７を用いて結合した融合タンパク質を溶出し、０．９ｍｌの画分を、中和のための０．１ｍｌの１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４ ｐＨ８．０を含むエッペンドルフチューブ中に回収した。
Ｓｅｍａ３ＡにおけるＡ１０６Ｋ突然変異の機能を正確に示すために、Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ組換えタンパク質を作製した。Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂは、Ｉｇ様／塩基性領域を欠いていたが、野生型残基Ａｌａ１０６を保存していた（図２）。Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ突然変異体の両方の生化学的および生物学的活性を、市販の全長ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；カタログ＃１２５０−Ｓ３−０２５）のそれと比較した。
リガンド−受容体 ｉｎ ｓｉｔｕ結合アッセイ（Flanagan et al., 2000；Tamagnone et al., 1999）により、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートＳｅｍａ３Ａ ＷＴがＣＯＳ細胞中のＮｒｐ１と相互作用していたことが確認された。しかし、Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂもＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ突然変異体もＮｒｐ１と相互作用しなかった（図４Ａ）。
セマフォリンタンパク質は、プレキシンを介してシグナルを伝達するリガンドである（Kumanogoh and Kikutani, 2013；Tamagnone et al., 1999）。したがって、プレキシンファミリーメンバーに直接結合するこれらの構築物の能力をスクリーニングした。重要なことに、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、Ｓｅｍａ３Ａ ＷＴまたはＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ突然変異体と比較して高い親和性でプレキシンＡ４に結合した（図４ＡおよびＢ）。スキャッチャードプロット解析により評価したとき、プレキシンＡ４へのＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの結合親和性は、０．７ｎＭのＫｄに増加した（図４Ｃ）。比較して、Ｎｒｐ１へのＳｅｍａ３Ａ ＷＴの結合のＫｄは、１，１ｎＭであり（図４Ｄ）、これは、以前のデータ（Takahashi et al., 1999）と一致している。さらに、他のＡ型プレキシンは、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂへの検出可能な結合を示さなかった（図４Ａ）。したがって、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの結合は、プレキシンＡ４に対して高度に特異的であった。最後に、リガンド結合アッセイにより、プレキシンＡ４受容体に対するＳｅｍａ３Ａ ＷＴ、Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの親和性範囲を推定することが可能であり、プレキシンＡ４へのそれぞれＳｅｍａ３Ａ ＷＴ、突然変異Ｓｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂまたは突然変異Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの結合が７ｎＭ、２００ｎＭおよび０．７ｎＭの推定Ｋｄをどのように示すかを明らかにすることが可能であった（図４Ｅ）。さらに、プレキシンに対する突然変異セマフォリン３Ｂの結合親和性を解析した（図４Ｆ）。例えば、例示的なＳｅｍａ３Ｂ Ａ１０５Ｋ−Ｆｃは、プレキシンＡ２への高い結合親和性での結合を示した。Ｓｅｍａ３Ｂ Ａ１０５Ｋ−Ｆｃと同じ構築物デザインを有するが、１０５位におけるアラニンからリシンへの突然変異を欠いているセマフォリン３Ｂ（ＳＥＭＡ３Ｂ ΔＩｇ−ｂ）は、突然変異型と比較して結合の増大を示さなかった。上述のように、セマフォリン３タンパク質とそのプレキシン受容体との強い相互作用は、受容体活性化およびセマフォリン３下流シグナル伝達に重要である。したがって、これらのデータは、突然変異セマフォリン３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを血管新生阻害および／または脈管形成阻害療法の改善に用いることができるという証拠を提供するものである。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏシステムにおけるさらなる解析を突然変異セマフォリン３Ａに関して本明細書で例示する。
ＥＣＭタンパク質へのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣまたはＥＣ）の走触性移動を評価するために、本発明者らは、ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂタンパク質を作製し、精製した（図２、３、５）。等モル量のＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂ、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂタンパク質およびＳＥＭＡ３Ａ ＷＴをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムプラットフォーム（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）においてＩ型コラーゲンなどの、ＥＣＭタンパク質へのＥＣの走触性移動の阻害について比較した（図６）。ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、広範囲の濃度（０，２〜３，５ｎＭ）にわたってＥＣの方向性がある移動を阻害するのにＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂまたは市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴよりも常に有効であった（図６Ａ〜Ｃ）。表３に詳細を示すように、マウスＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、ＥＣの方向性がある移動を３６〜４５％阻害したが、市販のヒトＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴおよびマウスＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６ＫΔＩｇ−ｂは、それぞれＥＣの運動性を２３〜２５％および１９〜２４％低下させたにすぎなかった。さらに、プレキシンＡ４の遺伝子サイレンシング実験で、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂに応答するＥＣの移動が対照レベルに増大した。したがって、ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂのＥＣの走触性に対する阻害活性は、プレキシンＡ４に依存しており（図６Ｄ、Ｅ）、これは、そのＡ型プレキシン受容体結合プロファイル（図４Ａ）と一致している。
本発明者らは、その生物学的活性をそのマウスの対応するものと本質的に重ね合わすことができた、ヒトＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂを作製し、試験した（図７）。表４に詳細を示すように、最大（３，５ｎＭ）用量の市販のヒトＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴは、ＥＣの方向性がある移動を２０％阻害したが、１７．５倍低い（０．２ｎＭ）用量のヒトヒトＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、ＥＣの運動性を４６％阻害した。さらに、Ｆｃタグにより誘発されたＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋの二量体化により、ＥＣの方向性がある移動の阻害がさらに増大した（データは示さず）。
Ｓｅｍａ３Ｆは、Ｓｅｍａ３Ａの１０６位に相同性の比較により対応する位置に極性アミノ酸、すなわち、セリン（Ｓｅｒ１０７）を有する。これは、対応する位置に疎水性アラニンを含む、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ、Ｓｅｍａ３ＣおよびＳｅｍａ３Ｄと対照的である。したがって、制御目的のために、本発明者らは、極性Ｓｅｒ１０７を正に荷電したＬｙｓに突然変異させること（Ｓｅｍａ３Ｆ Ｓ１０７Ｋ）が、プレキシン（複数可）に対するＳｅｍａ３Ｆの親和性およびＥＣＭタンパク質へのＥＣの移動を阻害する能力の有意な増加をもたらすかどうかを検討した。ＣＯＳ細胞におけるリガンド−受容体ｉｎ ｓｉｔｕ結合アッセイにより、本発明者らは、ＡＰコンジュゲートＳｅｍａ３Ｆ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ｆ Ｓ１０７Ｋ ΔＩｇ−ｂ突然変異体がＡ、Ｂ、ＣまたはＤプレキシンファミリーメンバーのいずれの型に対しても高い親和性で結合しなかったことを見いだした。したがって、本発明者らは、等モル（３．５ｎＭ）量のＳｅｍａ３Ｆ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ｆ Ｓ１０７Ｋ ΔＩｇ−ｂの、ＥＣＭタンパク質へのＥＣの移動を阻害する能力がおおむね重ね合わすことができるものであることを見いだした（図１２）。同様に、ＳＥＭＡ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、ＦｃタグＳＥＭＡ３Ｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＳｅｍａ３Ｆ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と比較してＥＣの方向性がある移動の阻害の増大を示した（図１３）。ＥＣ移動アッセイは、それぞれ当モル量のタンパク質を用いて実施した。したがって、理論により拘束されるものではないが、本発明者らは、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６の場合におけるような、置換されるアミノ酸が疎水性である場合、Ｓｅｍａ３タンパク質への正に荷電したアミノ酸の合成による導入が、プレキシン受容体（複数可）に対するそれらの親和性および化学反発活性を増大させる可能性がより高いと結論した。言い換えれば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの場合における親水性アミノ酸の本明細書で述べた人工的導入により、抗血管新生および／または脈管形成作用が増大する。
下流シグナル伝達に対するＳｅｍａ３Ａ構築物の効果を試験するために、Ｓｅｍａ３Ａ結合パートナーのプルダウンアッセイを実施した。ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、Ｒａｐ１小ＧＴＰアーゼのＧＴＰ負荷を阻害する（図８Ａ）のに、およびＥＲＫ１／２キナーゼのリン酸化を誘発する（図８Ｂ）のにＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよび市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴよりも有意に強力であった。詳細には、市販のＦｃタグＳＥＭＡ３Ａ ＷＴ、ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、それぞれ、ｉ）Ｒａｐ１ ＧＴＰ負荷を４２％、４４％および６５％阻害し、ｉｉ）ＥＲＫ１／２リン酸化を１．９５倍、２．３倍および３．９倍活性化した。
したがって、新規ＦｃタグＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ突然変異体は、ｉ）受容体プレキシンＡ４に高親和性で特異的に結合し、ｉｉ）プレキシンシグナル伝達のはるかにより強力な活性化剤であり、ｉｉｉ）ＥＣ機能のはるかにより強力な阻害剤であり、ｉｖ）Ｎｒｐ１と相互作用せず、かつｖ）切断される可能性がないと結論することができた。
これにより、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂを特異的結合剤、プレキシンＡ４の強力な活性化剤およびＥＣの走触性移動の阻害剤となっている。
Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、膵臓がんにおけるがんの成長および転移を効果的に阻害する
本ｉｎ ｖｉｔｒｏデータおよび自発膵神経内分泌がん（ＲＩＰ−Ｔａｇ２）のマウスモデルを用いた前臨床における経験（Maione et al., 2012；Maione et al., 2009）を考慮して、本発明者らが以前にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）−８−媒介遺伝子導入により観察したように（Maione et al., 2012；Maione et al., 2009）、がんの進行を停止させ、ＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの生存期間を延長させる広範囲［０，５〜５ｍｇ／ｋｇ／マウス、浸透圧ミニポンプまたは腹腔内（ｉ．ｐ．）により4週間送達された］のＦｃタグＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂおよびＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの能力を少なくとも１６週齢まで評価した。本発明者らは、任意の治療方法によって送達されたどの用量のＳｅｍａ３Ａ ΔＩｇ−ｂもＡＡＶ−８全長Ｓｅｍａ３Ａ（Maione et al., 2012；Maione et al., 2009）のようにＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの生存期間を延長させることができなかったことを見いだした。これに反して、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、ＡＡＶ−８全長Ｓｅｍａ３Ａと類似した生存促進活性を示し、したがって、これによって、プレキシンＡ４結合活性の増大が、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂに強力なＮｒｐ１非依存性抗がん作用を与えることが示唆される。特に、週３回のｉ．ｐ．注射による３ｍｇ／ｋｇのＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの送達は、がんの進行を阻害するための最も有効かつ非毒性治療計画であり、がん血管系を正常化し、ＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの生存期間を延長させる。実際、生理食塩水投与対照と比較して、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂによるＲＩＰ−Ｔａｇ２の１カ月の治療（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、週３回）は、ｉ）がんの体積の６７％の減少をもたらし、ｉｉ）がん血管面積を５１％効果的に減少させ（図９Ａ）、ｉｉｉ）周皮細胞の被覆の増加によりがん血管の正常化を有利にし（図９Ｂ）、ｉｖ）潅流を増大させ（図９Ｃ）、組織の低酸素を低減させた（図９Ｄ）。
さらに、著しくより高頻度で、致死的なヒト膵臓がん組織型のマウスモデル、すなわち、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）の同系Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ／−；ｐ５３Ｒ１７２Ｈ同所性マウスモデルにおけるＳｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂの効果を解析した。全長ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴは、ＡＡＶ−８媒介遺伝子導入により同所性ＲａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ／−；ｐ５３Ｒ１７２ＨＰＤＡＣマウスモデルに送達した（Maione et al., 2009）。全長ＳＥＭＡ３Ａ ＷＴによる治療は、３週間後にがんの成長（５２％）および肝臓転移（５９％）の両方の阻害をもたらした（図１０Ａ、Ｂ）。先行する有望なデータが得られたので、本発明者らは、次にがんを有するＰＤＡＣマウスを精製Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂ突然変異体タンパク質（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、週３回）により治療し、がんの成長および転移形成に対するその薬理効果を評価した。Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂタンパク質は、がんの成長を著しく阻害し（６４％）（図１１Ａ）、肝臓転移の発生率を８１％低下させ（図１１Ｂ）、転移巣体積を７８％減少させた。最も重要かつ驚くべきことに、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、ＰＤＡＣマウスにおいてＳｅｍａ３Ａ全長と比較してがんの進行および転移巣播種を低減させるのにより強い効果を発揮した。ＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの治療と一致して、Ｓｅｍａ３Ａ Ａ１０６Ｋ ΔＩｇ−ｂは、周皮細胞の被覆を増大させ（図１１Ｃ）、血管潅流を増加させ、がん低酸素を阻害することによって、ＰＤＡＣマウスモデルにおいても血管面積を減少させ（データは示さず）、がん細胞血管の正常化を促進した。
本明細書で引用したすべての参考文献は、参照によって完全に組み込まれる。本発明を今や十分に説明したので、本発明の精神もしくは範囲またはその任意の実施形態に影響を及ぼすことなく、本発明を条件、パラメーターなどの広く、同等の範囲内で実施することができることは、当業者が理解するであろう。
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Claims (49)

  1. 突然変異セマフォリン３またはその機能性断片であって、前記突然変異セマフォリン３が、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｂ、セマフォリン３Ｃおよびセマフォリン３Ｄからなる群から選択され、前記突然変異セマフォリン３または前記その機能性断片が、アミノ酸配列ＣＸ１Ｘ２Ａ３ＧＫＤを含み、ここで、
    Ｘ１がＫまたはＮである、アミノ酸であり、
    Ｘ２がＷ、ＭおよびＬの群から選択されるアミノ酸であり、
    アラニン（Ａ３）が親水性アミノ酸により置換されている、
    突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  2. 配列番号２に示す野性型セマフォリン３Ａの１０６位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；
    配列番号６に示す野性型セマフォリン３Ｂの１０５位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；
    配列番号１０に示す野性型セマフォリン３Ｃの１０４位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸；または
    配列番号１４に示す野性型セマフォリン３Ｄの１２０位に対応するアラニンの代わりに前記親水性アミノ酸
    を含む、請求項１に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  3. 前記セマフォリン３が
    （ａ） 配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３の群から選択される核酸配列によりコードされるポリペプチドであって、
    配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
    配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、
    配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換され、かつ
    配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが前記親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、
    前記ポリペプチド、
    （ｂ）配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
    配列番号２の１０６位、配列番号６の１０５位、配列番号１０の１０４位または配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、
    前記ポリペプチド、
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義したポリペプチドをコードする核酸分子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、
    および
    （ｄ）血管新生の阻害剤として機能し、（ｂ）で言及したポリペプチドのいずれか１つとの少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチド
    からなる群から選択される、請求項１または２に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  4. （ａ）配列番号２の１０６位；
    （ｂ）配列番号６の１０５位；
    （ｃ）配列番号１０の１０４位；または
    （ｄ）配列番号１４の１２０位
    に親水性アミノ酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  5. 機能性ｓｅｍａドメインを含み、アミノ酸置換（複数可）、付加（複数可）、欠失（複数可）および重複（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  6. 前記親水性アミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、ＤおよびＨの群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  7. 前記親水性アミノ酸がＫまたはＲである、請求項１から６のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  8. 前記アラニンを置換する前記親水性アミノ酸がＫである、請求項６に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  9. 配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または配列番号４８のいずれか１つに定義されている１つまたは複数の配列（複数可）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  10. 前記セマフォリン３または前記その機能性断片をコードする核酸分子が
    （ａ）配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１の６０１〜１２０６のヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５の５２９〜１１３７のヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９の８４２〜１４４４のヌクレオチド；または
    （ｄ）配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３の３６８〜９８２のヌクレオチド
    を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  11. 前記機能性ｓｅｍａドメインを含み、前記ｓｅｍａドメインが
    （ａ）配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１；
    （ｂ）配列番号６の１０５位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２２；
    （ｃ）配列番号１０の１０４位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２３；または
    （ｄ）配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２４
    に示すアミノ酸配列から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  12. 前記突然変異セマフォリン３が配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３またはその機能性断片。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項に定義されている血管新生の阻害剤として機能する突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含む融合タンパク質。
  14. 前記機能性ｓｅｍａドメインが
    （ａ）配列番号２の１０６位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２１；
    （ｂ）配列番号６の１０５位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２２；
    （ｃ）配列番号１０の１０４位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２３；または
    （ｄ）配列番号１４の１２０位に対応するアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２４
    に定義されているポリペプチドを含むまたはポリペプチドである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 請求項１から１２のいずれか一項に定義されている突然変異セマフォリン３またはその機能性断片を含み、
    （ａ）安定化ドメイン；および／または
    （ｂ）二量体化ドメイン
    をさらに含む、請求項１３または１４に記載の融合タンパク質。
  16. （ａ）前記安定化ドメインがプレキシンセマフォリンインテグリン（ＰＳＩ）ドメインであり、前記ＰＳＩドメインが配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７もしくは配列番号４８のうちの１つもしくは複数の配列を含み、かつ／または
    （ｂ）前記二量体化ドメインが別のそのような二量体化ドメインとの１０−５Ｍ〜１０−６Ｍの範囲内の解離定数ＫＤを有し、かつ／もしくは前記二量体化ドメインがＣ末端ＩｇＧ定常ドメイン、ＤＡＲＰｉｎおよびロイシンジッパーの群から選択される、
    請求項１５に記載の融合タンパク質。
  17. 前記ＩｇＧ定常ドメインがＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
  18. 配列番号１の６３１〜６３３位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１のヌクレオチド３１６〜１９５９に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
    配列番号５の５５９〜５６１位におけるヌクレオチドＧＣＡが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号５のヌクレオチド２４７〜１８８７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；
    配列番号９の８７２〜８７４位におけるヌクレオチドＧＣＴが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号９のヌクレオチド５６３〜２１９７に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列；または
    配列番号１３の３９８〜４００位におけるヌクレオチドＧＣＣが親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドにより置換されている、配列番号１３のヌクレオチド４１〜１７３５に及ぶ核酸配列および配列番号３７のヌクレオチド２９５〜９９０に及ぶ核酸配列
    を有する核酸酸配列を含む核酸分子によりコードされる、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  19. 配列番号２の１０６位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号２のアミノ酸残基１〜５４８に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
    配列番号６の１０５位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号６のアミノ酸残基１〜５４７に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；
    配列番号１０の１０４位におけるアラニン残基が親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１０のアミノ酸残基１〜５６５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列；または
    配列番号１４の１２０位におけるアラニン残基が前記親水性アミノ酸により置換されている、配列番号１４のアミノ酸残基１〜５４５に及ぶアミノ酸配列および配列番号４１に示すアミノ酸配列
    を含む、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  20. 配列番号１８、配列番号７６、配列番号７８および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  21. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片にまたは請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質に特異的に結合する抗体。
  22. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片または請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
  23. 請求項２２に記載の核酸分子を含むベクター。
  24. 遺伝子標的ベクターまたは遺伝子導入ベクターである、請求項２３に記載のベクター。
  25. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２３または２４に記載のベクター。
  26. 前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ８ベクターである、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のベクター。
  27. 請求項２３から２６のいずれか一項に記載のベクターにより形質転換された、または請求項２２に記載の核酸分子を含む宿主。
  28. 哺乳類細胞である、請求項２７に記載の宿主。
  29. 前記哺乳類細胞がＨＥＫ細胞である、請求項２７または２８に記載の宿主。
  30. 前記ＨＥＫ細胞がＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１またはＨＥＫ２９３Ｅ細胞である、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の宿主。
  31. 請求項２７から３０のいずれか一項に記載の宿主を培養し／生育させ、任意選択で、産生されたポリペプチドを単離することを含む、請求項２２に記載の核酸分子によりコードされる前記突然変異セマフォリン３、前記その機能性断片または前記融合タンパク質を産生させる方法。
  32. 請求項２２に記載の核酸分子によりコードされ、かつ／または請求項３１に記載の方法により産生されるポリペプチド。
  33. （ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片；
    （ｂ）請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質；および／または
    （ｃ）請求項２２に記載の核酸分子
    を含み、任意選択で医薬賦形剤を含む医薬組成物。
  34. 前記医薬賦形剤が医薬担体である、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 前記医薬担体が、ウイルスである、請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ８である、請求項３５または３６に記載の医薬組成物。
  38. 医薬として使用するための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸分子、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３１により産生されるポリペプチド。
  39. がん、腫瘍、腫瘍性疾患、血管新生障害、血管性網膜症、血液脳関門透過性変化、神経炎症性障害、骨粗鬆症、肥満、マイコバクテリア感染および／または肉芽腫の治療における使用のための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸分子、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３１により産生されるポリペプチド。
  40. 固形腫瘍であるがん、腫瘍および／または腫瘍性疾患の治療における使用のための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸分子、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３１により産生されるポリペプチド。
  41. 前記がんが、膵臓がん、子宮頚がん、乳がん、結腸がん、黒色腫、前立腺がん、膀胱がんおよび舌がんからなる群から選択される、請求項３９もしくは４０に記載の使用のための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項３９もしくは４０に記載の使用のための請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３９もしくは４０に記載の使用のための請求項２２に記載の核酸分子、請求項３９もしくは４０に記載の使用のための請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３９もしくは４０に記載の使用のための請求項３１により産生されるポリペプチド。
  42. 前記腫瘍、がんまたは腫瘍性疾患が膵臓腫瘍／がんである、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の使用のための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、３９から４１のいずれか一項に記載の使用のための請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の使用のための請求項２２に記載の核酸分子、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の使用のための請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３９から４１のいずれか一項に記載の使用のための請求項３１により産生されるポリペプチド。
  43. 血管正常化、腫瘍成長の低減、転移の低減および／または生存期間の延長が伴う、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の使用のための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の使用のための請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の使用のための請求項２２に記載の核酸分子、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の使用のための請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３９から４２のいずれか一項に記載の使用のための請求項３１により産生されるポリペプチド。
  44. 前記突然変異セマフォリン３もしくは前記その機能性断片、前記融合タンパク質、前記核酸分子、前記医薬組成物および／または前記ポリペプチドを抗増殖薬、抗がん薬、細胞増殖抑制薬、細胞毒性薬および／または放射線療法と併用して投与するものとする、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の使用のための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の使用のための請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の使用のための請求項２２に記載の核酸分子、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の使用のための請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３９から４３のいずれか一項に記載の使用のための請求項３１により産生されるポリペプチド。
  45. 前記突然変異セマフォリン３もしくは前記その機能性断片、前記融合タンパク質、前記核酸分子、前記医薬組成物および／または前記ポリペプチドを非経口投与するものとする、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の使用のための請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の使用のための請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の使用のための請求項２２に記載の核酸分子、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の使用のための請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項３９から４４のいずれか一項に記載の使用のための請求項３１により産生されるポリペプチド。
  46. 医薬としての請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２１に記載の抗体、請求項２２に記載の核酸分子、請求項２３から２６のいずれか一項に記載のベクター、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の宿主、請求項３１により産生されるポリペプチドおよび／または請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  47. 薬学的有効量の請求項１から１２のいずれか一項に記載の突然変異セマフォリン３もしくはその機能性断片、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２２に記載の核酸分子、請求項２３から２６のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１により産生されるポリペプチドおよび／または請求項３３から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物をそのような治療を必要とする対象に投与するステップを含む血管新生障害、腫瘍性疾患および／またはがんの治療方法。
  48. 前記対象がヒトである、請求項４７に記載の治療方法。
  49. 前記薬学的有効量が０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である、請求項４７または４８に記載の治療方法。
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