JPH09505725A - セマホリン遺伝子群 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規クラスのタンパク質、セマホリン、セマホリンをコードしている核酸、セマホリンペプチド、並びにセマホリン及びセマホリンをコードしている核酸を使用する方法を明らかにする。セマホリンペプチド及び受容体のアゴニスト及びアンタゴニストは、神経細胞の増殖及び再生の強力なモジュレーターを提供する。本発明は、医薬組成物、細胞の増殖／分化を調節するための化学ライブラリーをスクリーニングする方法；関連した遺伝子のプローブとして、並びに遺伝的神経疾患の診断薬として、遺伝地図作成に使用される、セマホリン遺伝子由来の核酸；神経疾患発症の治療のための特異的な細胞及び動物の系を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 セマホリン遺伝子群 本特許出願においてなされたこの研究は、部分的にザナショナルインスティチ ューツオブヘルス(the National Institutes of Health)によって援助された。 該政府機関は、この出願に基づき発行されるあらゆる特許における権利を持つこ とができる。 序論 技術分野 本発明の技術分野は、神経細胞の成長に関与するペプチド、ポリペプチドおよ びポリヌクレオチドに関する。発明の背景 神経系の接続の特異性、即ち特定のシナプス接続の複雑なパターンは、ニュー ロンの成長端部、即ち成長円錐がその正確な標的を見出すべく長距離を移動する につれて、発育中に広がり始める。その移動に伴って、該成長端部は、最終的に その正確な標的と接触し、かつこれを認識するための著しく適格な様式で、一連 の選択点と対面し、かつこれらを正確に横切る。 成長円錐誘導キュー(cues)の同定が、全く神経生物学の究極の目的である。こ れらはニューロンが何時成長し、何処で成長し、また何時成長を停止するかを語 ってくれる化合物である。このような化合物およびその拮抗物質の医学的用途は 膨大であり、ニューロン成長再生能力の調節、神経変性疾患の治療、および遺伝 性の神経欠陥のマッピング（例えば、診断）を包含する。 数十年に渡る集中的な研究において、化学誘因物質および忌避物質、標識化経 路、細胞接着分子、等の種々の仮説がこの誘導を説明するために提起された。最 近の、幾つかの一連の実験では、反発がニューロンの誘導において重要な役割を 演じていることが示唆され、成長円錐を阻害または圧潰し得る２種の見掛け上無 関係の因子（「軸索成長阻害剤」および「コラプシン(collapsin)」）が報告され ている。関連する文献 この分野における大多数の文献に関する最近の概説については、グッドマン＆ シャッツ(Goodman & Shatz)(1993)，Cell，72/Neuron，10，77-98を参照のこと 。グラスホッパーファシクリン(grasshopper fasciclin)IV（最近はG-セマホリ ン(Semaphorin)Iと呼ばれている）の説明は、コロドキン(Kolodkin)(1992)，Neu ron 9，831-845に見られる。コラプシンおよび軸索成長阻害剤に関する最近の報 告は、それぞれレーパー＆カファマー(Raper and Kapfhammer)(1990)，Neuron 4 ，21-29;年７月日付けの「ジーヌズアンドディベロップメント／ファンクション オブブレイン(Genes and Development/Function of Brain)」に関するGIBCO-BRL シンポジウムにおいて、レーパーにより提示された要約;およびシュワブ＆カロ ニ(Schwab and Caroni)(1988)，J．Neurosci，8，2381;およびシュネル＆シュワ ブ(Schnell and Schwab)(1990)，Nature，343，269に含まれている。 発明の概要 新規な一群のタンパク質、セマホリン類、セマホリン類をコードする核酸、お よびセマホリン類およびセマホリン類をコードする核酸の利用法を開示する。セ マホリン類は、第一の公知の群の、成長円錐阻害剤として機能するヒトタンパク 質、および一群のウイルス性、特にポックスウイルス性病理発生および腫瘍発生 に関与するタンパク質を包含する。本発明は、神経成長円錐および免疫細胞上に 見出されるレセプタを包含するセマホリン−特異的レセプタ群をも開示する。 本発明は、セマホリンレセプタと特異的に結合する、セマホリンペプチドを包 含する薬物、およびセマホリンと特異的に結合する、セマホリンレセプタペプチ ドを包含する薬物を提供する。これらの薬物は神経細胞の成長、免疫応答性およ びウイルス性病理発生の有力な調節剤を与え、神経学的疾患および神経再生の処 置並びに診断、過敏症および移植−拒絶反応を含む免疫調節、およびウイルス性 および腫瘍発生性感染症／疾患の治療における用途が見出されている。 セマホリン類、セマホリンレセプタ類、セマホリンをコードする核酸類、およ びその固有の部分も、セマホリンまたはセマホリンレセプター媒介細胞活性の調 節剤用の、化学ライブラリーのスクリーニングにおいて、遺伝子地図の作成にお いて、関連遺伝子用のプローブとして、遺伝神経学的、免疫学的および腫瘍発生 性疾患に関する診断試薬として、また神経学的、免疫学的、腫瘍発生学的および ウイルス性疾患療法の開発のための特異的な細胞および動物系の作成において、 種々の用途が見出されている。 特定の態様の説明 本発明は、神経および免疫細胞機能において重要な新規なタンパク質群、即ち セマホリン類およびセマホリンレセプタ類を開示する。本発明は、またセマホリ ンレセプタと特異的に結合する、セマホリンペプチド類を含有する薬剤、および セマホリンと特異的に結合する、セマホリンレセプタペプチド類を含有する薬剤 をも提供する。これらの薬剤は広範な臨床的、治療的並びに研究的用途、特に特 異的にセマホリンレセプタ結合を模倣し、もしくは妨害することにより、神経お よび／または免疫細胞機能を調節する薬剤としての用途が見出されている。例え ば、セマホリンレセプタ拮抗物質として作用することが示されている、選択され たセマホリンペプチドは、細胞レセプタとの固有のセマホリン結合を、競争的に 阻害することにより効果を発揮する。かくして、標的レセプタに依存して、これ らの薬剤はセマホリンにより媒介される神経細胞成長円錐反発または接触阻害を 遮断するのに使用することができる。このような薬剤は広範な臨床的用途、例え ば神経細胞成長が、例えば神経細胞、神経変性疾患等に外傷性の障害等を与える ことが示されている場合における用途が見出されている。広範囲のセマホリン− およびセマホリンレセプタ−特異的結合薬物およびこれらを同定し、製造し、か つ利用する方法を以下に説明する。 特に興味ある結合剤は、セマホリンレセプタと特異的に結合し、かつこれと拮 抗するセマホリンペプチド、およびセマホリンと特異的に結合し、かつ固有のレ セプタとの結合を阻害する、セマホリンレセプタペプチドである。主としてセマ ホリンペプチドについて例示されるが、以下の説明の大部分は、同様にセマホリ ンレセプタペプチドにも当てはまる。 本発明のセマホリンペプチドはセマホリンの固有の部分であり、かつセマホリ ン結合特異性を有する。セマホリンの「固有の部分」は、これまでに公知のタン パク質の何れにも見出されない点で、従来のものに対して固有のアミノ酸配列を もつ。従って、固有の部分は、少なくとも新規なペプチドを規定するのに十分に 長いアミノ酸配列長さをもつ。固有のセマホリン部分は、特定のアミノ酸配列に 依存して、約５〜約25残基、好ましくは５〜10残基の範囲で、その配列長が変動 することが分かっている。固有のセマホリン部分は、対象とするセマホリン部分 の配列と、既知のペプチド／タンパク配列データベースとを比較することにより 、容易に同定される。好ましい固有部分は、記載されたセマホリン配列のセマホ リンドメイン（Ig−様の、細胞内および貫膜ドメイン並びにシグナル配列を除外 する）、特にセマホリンレセプタ、とりわけヒト変種のレセプタに結合する領域 から導かれる。好ましいセマホリンレセプタの固有部分は、セマホリン結合ドメ イン、特にセマホリンリガンド、とりわけヒト変種のリガンドと接触する残基を もつ領域から導かれる。特に好ましいペプチドを以下で更に説明する。 目的とするペプチドは遊離のものであるか、あるいは他の原子または分子とカ ップリングしていてもよい。しばしば、該ペプチドは、該目的とするペプチドを 含むより大きなポリペプチドの一部として存在し、ここで該ポリペプチドの残部 はセマホリン−またはセマホリンレセプター由来のものである必要はない。また 、目的のペプチドは「実質的に完全な長さ」のセマホリンドメインまたは記載さ れたセマホリン／レセプタ配列の少なくとも約200、好ましくは少なくとも約250 、より好ましくは少なくとも約300のアミノ酸を含む、またはこれらをコードす るセマホリンレセプタ配列の一部として存在することもできる。かくして、本発 明はまた実質的に完全な長さのセマホリンドメインまたはセマホリンレセプタの 配列に実質上類似する配列を含むポリペプチドをも提供する。「実質上類似する 」配列は、少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約60%、最も好ましくは 少なくとも約80%の配列同等性をもつ。該配列が異なる場合、その違いは、一般 的に点挿入／欠損または保存性の置換、即ちシステイン／スレオニンまたはセリ ン置換、酸性／酸性または親水性／親水性アミノ酸置換等である。 目的のセマホリンペプチド／ポリペプチドは「孤立(isolated)」しており、こ れはその天然状態においてこれらと結合している少なくとも幾つかの物質を伴わ ないことを意味する。一般的に、孤立したペプチド／ポリペプチドは、与えられ たサンプル中の全ペプチド／タンパク質の、少なくとも約１重量％、好ましくは 少なくとも約10重量％、より好ましくは少なくとも約50重量％を構成する。純粋 なペプチド／ポリペプチドなる用語により、全ペプチド／タンパク質、少なくと も約90重量％、好ましくは少なくとも約95重量％、およびより好ましくは約99重 量％を意味する。目的とするペプチド／タンパク質の重量には、該目的とするセ マホリン／レセプタペプチド／ポリペプチド、特にペプチド、タンパク質、検出 可能な標識、グリコシル化物、ホスホリル化物等に共有結合的にカップリングし たあらゆる原子、分子、基またはポリマーを含むものとする。 目的とするペプチド／ポリペプチドは、どの様な他の成分が該サンプル中に存 在するか、および存在する場合には、該ペプチド／ポリペプチドが何と共有結合 しているかに依存して、当業者には公知の種々の方法で単離または精製すること ができる。精製法は、ペプチドの場合には、電気泳動法、分子的技術、免疫学的 技術およびクロマトグラフィー技術、特にアフィニティークロマトグラフィーお よびRP-HPLC法を包含する。適当な精製技術に関する一般的な概論については、 スコープス(Scopes)，R.の、プロテインピュアリフィケーション(Protein Purif ication)，スプリンガー−フェアラグ(Springer-Verlag)，NY(1982)を参照のこ と。 目的とするペプチド／ポリペプチドは、一般的に天然産のアミノ酸を含むが、 D-アミノ酸またはペプチド結合によりカップリングされたアミノ酸類似体または ペプチド結合類似体も使用可能である。アミノ酸類似体は、該必須のセマホリン ／レセプタ結合特異性のために、構造的にアミノ酸に類似する天然産のアミノ酸 以外のモノである。適当な類似体は当業者には公知であり、β−γ−δアミノお よびイミノ酸、シクロヘキシルアラニン、アダマンチル酢酸等、そのアミド窒素 の修飾体、α−炭素、アミドカルボニル、骨格修飾体等を包含する。オリゴカル バメートの合成およびスクリーニングに関する一般的な説明については、モーガ ン＆ガイナー(Morgan and Gainor)(1989)，Ann．Repts．Med．Chem，24，243- 252;スパトラ(Spatola)(1983)，ケミストリー＆バイオケミストリーオブアミノ アシッズ，ペプチズ＆プロテインズ(Chemistry and Biochemistry of Amino Aci ds，Peptides and Proteins)，Vol VII(バインシュタイン(Weinstein);およびチ ョー(Cho)等(1993)，Science，261，1303-1305を参照のこと。 目的のセマホリンペプチド／ポリペプチドは「セマホリン結合特異性」を有し ており、このことは該目的のペプチド／ポリペプチドが、１以上の記載されたセ マホリンに対して特異的であり、かつセマホリン−特異的レセプタ、抗体等によ って識別可能な分子構造を維持していることを意味する。それ故に、セマホリン 結合特異性は、セマホリン−特異的免疫学的エピトープ、レクチン結合サイト等 および好ましくはレセプタ結合サイトによって与えられ得る。類推的に、該セマ ホリンレセプタペプチド／ポリペプチドは「セマホリンレセプタ結合特異性」を 有し、このことはこれらのペプチド／ポリペプチドが、１以上の記載されたセマ ホリンレセプタに特異的でありしかもセマホリン、レセプタ−特異的抗体等によ って特異的に識別され得る分子構造を維持していることを意味する。 「特異的結合」は、例えばセマホリン由来のペプチドと、成分の混合物とを接 触させ、選択的にセマホリンと結合するこれら成分を同定することにより、経験 的に決定される。特異的結合は、組み換えセマホリンペプチドを使用して、イン ビトロでまたは本明細書に記載するような細胞発現系内で、標識リガンドとの競 合によって最も有利に示される。一般的に、目的とするセマホリンの特異的結合 は、以下に例示するように、インビトロ条件下で、10^-6M、好ましくは10^-8M、よ り好ましくは10^-10Mの結合アフィニティーをもつ。 該ペプチド／ポリペプチドは、ここに記載しもしくは引用した物理的、化学的 および分子学的技術、あるいは当業者にとって公知の手段を利用して、他の化合 物で修飾し、もしくはこれらと結合して、そのセマホリン結合特異性、またはこ こに記載しもしくは当業者にとって公知の方法によってアッセイできるような、 他の性質、例えば溶解度、膜輸送適性、安定性、結合特異性およびアフィニティ ー、化学的反応性、毒性、生物学的利用性、局在性、検出性、インビボ半減期等 に影響を与えることができる。例えば、点変異を、記載されるセマホリンポリペ プチドをコードするDNA中のヌクレオチドのサイト指向性変異形成によって、あ るいはインビトロペプチド合成中に導入する。 更に結合特異性／アフィニティーを調節するための他の修飾法は、化学的／酵 素的介入（例えば、脂肪酸−アシル化、プロテオリシス、グリコシル化）、およ び特に該ペプチド／ポリペプチドが大きなポリペプチド中に組み込まれる場合に は、特定の発現宿主の選別等を包含する。特に、記載されるセマホリンペプチド の多くは、ホスホリル化されたまたは脱ホスホリル化されたセリンおよびスレオ ニン残基を含む。例えば、ロバーツ(Roberts)等(1991)，Science，253，1022-10 26およびウエグナー(Wegner)等(1992)，Science，256，370-373に記載の方法を 参照のこと。アミノおよび／またはカルボキシル末端は、例えばアミノ基につい ては、アシル化またはアルキル化によって、およびカルボキシル基についてはエ ステル化またはアミド化等によって、官能性とすることができる。記載されるペ プチド／ポリペプチドの多くは、また例えばグリコシダーゼ等の酵素によって分 断または修飾され、あるいは例えばレクチンによって、該レセプタを精製／同定 するのに使用することの可能な、グリコシル化サイトおよびパターンを含む。例 えば、該記載されるセマホリンペプチドのＮまたはO-結合グリコシル化サイトは 、欠失させるかあるいは他の必須アミノ酸、例えばN-結合グリコシル化改変のた めにLysまたはHisで置換することができ、あるいは欠失または極性置換を、O-結 合グリコシル化を調節するために、SerおよびThr残基に導入する。グリコシル化 変異体は、また適当な宿主細胞、例えば酵母、昆虫または種々の哺乳動物細胞を 選択することにより、あるいはインビトロ法、例えばノイラミニダーゼ消化等に よっても生成される。有用な発現系はCOS-7、293、BHK、CHO、TM4、CV1、VERO-7 6、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、MMT 060562、TRI細胞、バキュロウイル ス系等を包含する。該記載されるセマホリンペプチド／ポリペプチドの他の共有 結合による修飾は、標的アミノ酸残基と、選択された側鎖または末端と反応性の 、有機誘導体化（例えば、メチル-3-[(p-アジド−フェニル)ジチオ]プロピオイ ミデート）または架橋剤（例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタ ン）とを反応させることにより導入できる。治療並びに診断的な局在化のために 、セマホリンおよびそのペプチドは、直接（放射性同位元素、蛍光体等）または 検出可能なシグナルを与えることのできる試薬、例えば心筋キ ナーゼ標識サイトで間接的に標識できる。 以下に14組の好ましいセマホリンペプチドを挙げるが、ここで括弧内の部分は 括弧内に含まれる残基の任意のもので占められ、また「Ｘ」は該位置が20個の自 然にコードされるアミノ酸の何れかによって占有され得ることを意味する。これ らの例示されたペプチドは光度に保存された構造を維持し、該構造が重要なセマ ホリン結合特異性を与える。 以下のペプチドは、各組の特に好ましいペプチドを表す。 以下の14組のものは、好ましいペプチドであるが、バリオラメジャー(Variola major)またはワクシニア(Vaccinia)ウイルスの読み取り枠でコードされるセマ ホリンペプチドを除く。 以下の２組のものは、好ましいペプチドであるが、バリオラメジャー(Variola major)またはワクシニア(Vaccinia)ウイルスグラスホッパーセマホリン(Grassh opper Semaphorin)Iの読み取り枠でコードされるセマホリンペプチドを除外する 。 以下の５組は、バリオラメジャー(Variola major)またはワクシニア(Vaccinia )ウイルスの読み取り枠でコードされるセマホリンペプチドを包含するペプチド 群である。従って、これらのウイルスペプチドはそれ自体新規ではないが、本発 明は、免疫抑制剤および抗−ウイルス療法のターゲットとしてのこれらペプチド の、これまでに予想されておらず、しかも予測し得ない有用性を開示する。 上記セマホリン配列データは、当業者が利用可能な免疫学的方法、クロマトグ ラフィー法または合成法を使用する、広範囲の他のセマホリン−およびセマホリ ンレセプタ−特異的結合試薬を定義するために利用する。 特に有意なものは、セマホリン−特異的レセプタの固有部分を含むペプチドお よび実質的に完全な長さのセマホリンレセプタの配列と実質上類似する配列を含 むポリペプチドである。セマホリンペプチドを使用すれば、これらレセプタは、 該ターゲットレセプタに対するリガンドが公知の場合には、当業者には公知の、 例えば以下の例において説明されるような発現クローニングを包含する種々の技 術によって同定される。発現クローニングを利用した、公知のリガンドを用いる レセプタ単離の他の例については、スタウントン(Staunton)等(1989)，Nature， 339，61;デービス(Davis)等(1991)，Science，253，59;リン(Lin)等(1992)，Cel l，68，775;ギアリング(Gearing)等(1989)，EMBO，8，3667;アルフォ＆シード(A ruffo & Seed)(1987)，PNAS，84，8573およびこれらに含まれる参考文献を参照 のこと。一般的に、COS細胞をトランスフェクションして、cDNAライブラリーま たはPCR生成物を発現させ、セマホリン／レセプタペプチド／ポリペプチドと結 合するペプチド／ポリペプチドを生産する細胞を単離する。ニューロセマホリン レセプタについては、胎児脳cDNAライブラリーが好ましく、免疫セマホリンレセ プタに対しては、活性化されたリンパ系または骨髄細胞系もしくは炎症または遅 延−型の過敏症のサイト由来の組織からのライブラリーが好ましく、また腫瘍細 胞によって利用されて、免疫監視機構を逃れあるいは免疫応答(オンコセマホリ ン(oncosemaphorins))を抑制する、セマホリンおよびセマホリンレセプタ変種に 対しては、宿主免疫系に抵抗性の癌細胞または腫瘍細胞由来のライブラリーが好 ましい。また、公知のセマホリン／レセプタ配列に基くPCRプライマー、例えば 本明細書に記載するものは、このような組織／細胞からのPCR生成物の増幅のた めに使用される。固定化リガンドまたは抗体を利用する、他のレセプタ／リガン ド単離法は当業者には公知である。 レセプタ結合特異性を有するセマホリンレセプタペプチドは、他のセマホリン レセプタをもつ保存された共通配列を含む種々の方法により、リガンドまたはレ セプタ−特異的抗体との架橋により、あるいは好ましくはかかるペプチドをセマ ホリン結合またはセマホリン−レセプタ結合の分裂についてスクリーニングする ことにより同定される。必要な結合活性をもつセマホリンレセプタペプチドを同 定する方法は本明細書に記載され、あるいは当業者には公知である。類似の方法 によって、セマホリンレセプタペプチドを、セマホリン結合特異性をもつ、特に レセプタ特異性をもつ付随的なセマホリンペプチドを定義するのに使用する。 これら種々のセマホリンおよびセマホリンレセプタペプチドを、セマホリンの 機能性ドメインを画成し、セマホリンと結合する化合物を同定し、セマホリン− 媒介神経および免疫細胞機能を調節できる化合物の設計、および付随的なセマホ リンおよびセマホリンレセプタ−特異的結合試薬を定義するのに利用する。例え ば、欠失変異体を含むセマホリン変異体は、上記セマホリン配列から発生し、例 えば本明細書に記載されるような、細胞を主体とするアッセイにおける反発を媒 介し、あるいは凝集を妨害する能力についてアッセイすることにより、特異的タ ンパク−リガンドまたはタンパク−タンパク相互作用にとって重要な領域を特定 するのに使用される。更に、記載されるタンパク質のX-線結晶学的データは、決 定された構造をもつ、あるいは成長円錐の成長および誘導の調節に相補性の結合 分子を合理的に設計するのに使用される。 付随的なセマホリン−およびレセプタ−特異的試薬は、一価型に修飾し得る特 異的抗体、例えばFab、Fab'またはFv、特異的結合性オリゴペプチドまたはオリ ゴヌクレオチド、および最も好ましくは低分子量有機レセプタアンタゴニスト等 を包含する。例えば、記載されるセマホリンおよびレセプタペプチドを免疫原と して使用して、セマホリン−およびレセプタ−特異的ポリクローナルまたはモノ クローナル抗体を生成する。一般的な方法については、ハーロー＆レーン(Harlo w and Lane)(1988),アンチボディーズ，アラボラトリーマニュアル(Antibodies ，A Laboatory Manual)，コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Sprin g Harbor Laboratory)を参照のこと。抗−イディオタイプ抗体、特に内部イメー ジ抗−イディオタイプ抗体は、また本明細書の開示を利用して調製される。 セマホリンおよびセマホリン−レセプタ由来のポリペプチドおよびペプチドに 加えて、他の有望な試薬が、合成並びに天然化合物の大きなライブラリーからス クリーニングされる。例えば、多数の手段が、サッカライド、ペプチドおよび核 酸を主成分とする化合物の無作為のおよび意図的な合成のために利用可能である 。また、バクテリア、真菌、植物および動物抽出物としての天然化合物のライブ ラリーが入手可能であるか、あるいは容易に作成できる。更に、天然および合成 により作成されたライブラリーおよび化合物は、公知の化学的、物理的および生 化学的手段により容易に修飾される。例えば、それぞれヒューテン(Houghten)等 およびラム(Lam)等(1991)，Nature，354，84および81;およびブレーク＆リッチ −デービス(Blake and Litzi-Davis)(1992)，Bioconjugate Chem.，3，510を参 照のこと。 有用な試薬は、目的のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸を含む化合 物を使用した一連のアッセイにより同定される。広範なインビトロの、細胞を含 まない結合アッセイ、特にセマホリンまたはセマホリンレセプタペプチドを含む 固定化化合物への特異的結合に関するアッセイが、使用するのに便利であること が分かっている。余り好ましくはないが、細胞を主体とするアッセイも、有力な 試薬の特異的効果を測定するのに使用でき、あるいはセマホリン−レセプタ結合 をアッセイできる。これについては、例えばスネル＆シュワブ(Schnell and Sch wab)(1991)の上記文献を参照のこと。場合により、細胞内C-末端ドメインはオリ ゴペプチドまたはポリペプチドドメインをコードする配列で置換され、この配列 は天然のレセプタとは異なるリガンド結合に、検出可能な細胞内シグナルを与え る。有用な細胞内ドメインはヒトインシュリンレセプタおよびTCRのドメイン、 特にキナーゼ活性をもつドメインおよびカルシウム流入を開始できるドメインを 含み、該カルシウム流入はFura-2を宿主細胞に予め担持させておくことにより蛍 光測定法により有利に検出される。より好ましいアッセイは候補試薬の、固定化 セマホリンまたはレセプタペプチドへの、簡単な細胞を含まないインビトロ結合 法あるいはその逆の方法を包含する。光誘起平行合成(light directed parallel synthesis)法については、フォドー(Fodor)等(1991)，Science，251，767を参 照のこと。このようなアッセイは、ボリュムドラッグスクリーニング(volume dr ug screening)に適した大規模の高処理量の利用を可能とする。 有用な試薬は、典型的にはセマホリンに結合するあるいはセマホリンとそのレ セプタとの結合を分裂するものである。好ましい試薬はセマホリン−特異性であ って、かつ他のニューロンまたはリンパ様細胞膜タンパク質と交叉反応しないも のである。有用な試薬は、多数の化学的試薬の組に見出すことができるが、典型 的にはこれらは有機化合物、好ましくは小さな有機化合物である。小さな有機化 合物は、150以上でかつ約4500未満、好ましくは約1500未満、より好ましくは約5 00未満の分子量を有する。その例は、ペプチド、サッカライド、ステロイド、複 素環式化合物、多環式化合物、置換芳香族化合物等である。 選択された試薬は、薬効、安定性、薬理的相容性等を高めるために修飾するこ とができる。ある試薬の構造の特定は、付随的な試薬を同定し、発生させ、スク リーニングするために使用できる。例えば、ペプチド試薬を同定する場合、これ らを上記のような種々の方法で修飾して、例えばタンパク分解に対する安定性を 高めることができる。他の安定化法は、例えばリポソーム等への封入法を包含す る。 目的とする結合剤は、当業者には公知の種々の方法で調製できる。例えば、約 60アミノ酸以下のペプチドは、今日では公知の市販品として入手可能な自動合成 装置を使用して、容易に合成することができる。また、DNA配列を所定のペプチ ドをコードするように調製し、原核生物または真核生物宿主中で発現させるため に、適当な発現ベクター中に挿入することができる。今日では、多数の発現ベク ターが入手でき、発現し、かつ単離するための能力宿主の形質転換のための公知 の方法において利用できる。必要ならば、該所定のペプチドをコードする読み取 り枠を、分泌のためのシグナル配列に接合して、培地からの単離を可能とするこ ともできる。所定の配列を調製し、該配列を発現ベクターに挿入し、能力宿主を 形質転換し、かつ該生成物を産出するための培地中で該宿主を育成する方法は米 国特許第4,710,473号、同第4,711,843号および同第4,713,339号に見出すことが できる。 治療上の用途については、本明細書に記載する組成物および薬物を、任意の有 利な方法で投与できる。小さな有機化合物は、好ましくは経口的に投与され、大 きな分子量（例えば、１kDを越え、一般的には３kDを越え、より一般的には10kD を越えるもの）をもつ組成物および薬物は、有利には製薬上または生理学的に許 容される担体、例えばリン酸緩衝塩水、塩水、脱イオン水等に分散させて、好ま しくは腸管外投与される。典型的には、該組成物は保持されている生理液体、例 えば血液または骨液に添加される。CNS投与については、種々の技術が、治療薬 の血液脳関門を横切る輸送を促進するのに利用され、該技術は外科的なまたは一 時的にCNS脈管内皮細胞間の接着接触を解除する薬物およびこのような細胞を横 切る移動を容易にする化合物の注入等の方法を包含する。 例として、開示された治療薬の多くが、直接注射または注入、例えばエーロゾ ル等による局所投与、気管内／鼻内投与、眼内投与、例えば繊維（コラーゲン等 の）浸透圧ポンプによる移植体内／移植体上への投与、適当な形質転換細胞を含 む移植体の移植等で投与することが可能である。特に有用な適用は、塗布、埋設 または治療用のペプチドを含むコラーゲン繊維等の繊維、タンパクポリマーの誘 導などを包含する。他の有用な方法は、オットー(Otto)等(1989)，J．Neuroscie nce Research，22，83-91およびオットー＆アンシッカー(Otto and Unsicker)(1 990)，Neuroscience，10，1912-1921に記載されている。一般に、投与量は経験 的に決定され、典型的にはレシピエントの体重１kg当たり約10〜1000μｇの範囲 内である。ペプチド剤の場合、その濃度は、一般的に単位投与剤中約50〜500μg /mlの範囲内であろう。他の添加剤、例えば安定化剤、殺菌剤等を含むこともで きる。これらの添加剤は公知の量で存在するであろう。 本発明は、記載されたセマホリンおよびセマホリンレセプタペプチドおよびポ リペプチドをコードし、かかるポリペプチドをコードする配列と実質的に同一の 配列を含む単離された核酸配列をも提供する。「単離された核酸配列」は天然の 染色体またはその天然の状態での転写物以外のものとして存在し、典型的には通 常天然の染色体上で結合している少なくとも幾つかのヌクレオチド配列から取り 出される。相補的配列を、厳密度の低い条件下で、例えば50℃にてSSC(0.9M塩水 /0.09Mクエン酸ナトリウム)中で、上記のセマホリン配列の固有部分とハイブリ ッド化する。これは55℃にてSSCで洗浄した場合に結合状態を維持する。相補的 核酸の非−類似の領域は、好ましくはあるいは相同的核酸の場合には、冗長なコ ドンを与えるヌクレオチド変化領域である。部分的に純粋なヌクレオチド配列が 、与えられた画分に存在する全核酸の、少なくとも約５重量％、好ましくは少な くとも約30重量％およびより好ましくは少なくとも約90重量％を構成する。 上記核酸配列の固有の部分は以前に知られている核酸配列と区別するのに十分 な長さのものである。従って、固有部分は、少なくとも新規なオリゴヌクレオチ ドを画成するのに十分な長さを有する。好ましい核酸部分は固有のセマホリンペ プチドをコードする。PCRプライマーとして使用されるもの以外の、本発明のこ れらの核酸およびその部分は、通常少なくとも約60bpおよび通常約60kb未満の長 さにある。PCRプライマーは、一般的に約15〜100ヌクレオチドの範囲の長さにあ る。 幾つかの完全な長さのセマホリンをコードするヌクレオチド(cDNA)配列を第１ 〜８図に記載した。本発明は、また転移、トランスバージョン、欠失、挿入また は他の修飾、例えば交互スプライシングによって修飾された上記の配列をも提供 し、また調節配列を含む、ゲノムセマホリン配列および遺伝子フランキング配列 をも提供し、これらはセンスおよびアンチセンスのDNAおよびRNAを包含する。好 ましいDNA配列部分は、上記の好ましいアミノ酸配列部分をコードする部分を含 む。セマホリン発現の阻害が示されるアンチセンス用途に対しては、特に有用な オリゴヌクレオチドは長さにおいて約10〜30ヌクレオチドの範囲にあり、かつ上 記のATG開始サイトを包囲する配列、特に開始サイトから約５ヌクレオチド前で 始まり、該開始サイト後の約10ヌクレオチドをコードする、上記配列によって規 定されるオリゴヌクレオチドを含む。他の特に有用なセマホリン変異体は、貫膜 セマホリンの記載された細胞質C-末端の欠失または置換修飾を含む。従って、セ マホリン結合アフィニティーをもつが、変更された細胞内シグナル形質導入能を もつセマホリン変異体が生成される。 修飾されたセマホリン−コード配列またはセマホリン−様の機能をもつタンパ ク質をコードする関連する配列に対しては、一般的に少なくともそのセグメント と上記のセマホリン配列の少なくとも一部との間に実質的な配列の同一性、好ま しくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なく とも90%の同一性が存在するであろう。相同性セグメントは、特にセマホリンド メイン−コード領域およびタンパク−タンパク、特にセマホリン−レセプタ相互 作用に関与するタンパクドメインをコードする領域内にあり、かつかかるセグメ ント内の差異は特に保存性の置換である。 典型的には、本発明のセマホリンペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 異種配列と結合している。このような異種配列の例は、調節配列、例えばプロモ ータ、エンハンサー、応答要素、シグナル配列、ポリアデニル化配列等、イント ロン、5'および3'非−コード領域等を含む。他の有用な異種配列は当業者には公 知であるか、あるいはここに引用した参考文献に記載されている。本発明の特定 の態様によれば、該セマホリンコード配列の部分は、適当なシグナル配列および 場合により融合相手、例えばβ-Galを使用して、異種配列によってスプライスさ れて、可溶性の分泌型の融合タンパク質を生成する。 記載された配列は、また他の天然セマホリンおよびその同族体を同定し、かつ 単離するのに利用される。特に、記載された核酸配列は低厳密度下でのハイブリ ダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして使用され、例えば機能性の セマホリンドメインをコードするオリゴヌクレオチドを³²P-標識し、低厳密度下 でのλcDNAライブラリーのスクリーニングで使用して、関連する機能性ドメイン をもつタンパク質をコードする類似のcDNAを同定する。付随的に、上記のセマホ リンの少なくとも一部をコードする核酸を、セマホリンの組織特異的発現並びに 時間に伴う発現の変化、特に器官の発生または細胞分裂中の該変化を特徴付けす るのに使用する。 該セマホリンをコードする核酸は、標準的なマニュアル、例えばモレキュラー クローニング(Molecular Cloning),アラボラトリーマニュアル(A Laboratory Ma nual)(第２版、サンブロック、フリッシュ＆マニアティス(Sambrook，Fritsch a nd Maniatis)，コールドスプリングハーバー)、カレントプロトコールインモレ キュラーバイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、オーフベル 、ブレント、キングストン、モア、フェイドマン、スミス＆スツール(Aufubel， Brent，Kingston，More，Feidman，Smith and Stuhl)編、グリーンパブリッシン グ社、ウイリー−インターサイエンス、NY，NY，1992）に記載の方法あるいは当 業者にとって公知の方法で、その他の精製、合成、修飾、配列決定、発現、トラ ンスフェクション、投与または他の利用に付すことも可能である。例えば、該核 酸を修飾して、安定性、溶解性、結合アフィニティーおよび特異性等を変えるこ とができ、セマホリン−コード配列は選択的なメチル化等に付すことができる。 本発明の核酸配列は、また直接または間接的に、検出可能なシグナルを与えるこ とのできる標識で修飾することもできる。標識の例は、放射性同位元素、蛍光物 質、ビオチン付加等を包含する。 本発明は、またセマホリンペプチド、ポリペプチドまたはその類似体をコード する核酸を含むベクターをも提供する。種々の原核生物および真核生物宿主内で 発現させるための、プラスミドおよびウイルスベクターを包含する大多数のベク ターが記載されている。有利には、ベクターは、また該セマホリン−コード部分 に機能可能に結合したプロモータをも含む。ベクターは、しばしばクローニング または発現用の一以上の複製系、該宿主中での選別用の一以上のマーカー、例え ば抗生物質耐性を含むであろう。この挿入されるセマホリンコード配列は、合成 し、天然源から単離し、ハイブリッド等として調製することができる。適当な宿 主細胞を、エレクトロポレーション、CaCl₂媒介DNA取り込み、ウイルス感染、マ イクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル(microprojectile)または 他の方法を包含する任意の適当な方法で、形質転換し／トランスフェクションし ／感染することができる。 適当な宿主細胞は、バクテリア、古細菌、真菌、特に酵母、および植物並びに 動物細胞、特に哺乳動物細胞を包含する。特に興味のあるものは、E.コリ(E．co li )、B.ズブチリス(B．subtilis)、サッカロマイセスセレビシアエ(Saccharomyc es cerevisiae) 、SF9細胞、C129細胞、293細胞、CHO、COS、Hela細胞、不死化哺 乳動物骨髄およびリンパ球細胞系、および多能性細胞、特に哺乳類ES細胞および 受精卵である。好ましい複製系はM13、ColE1、SV40、バキュロウイルス、ラムダ 、アデノウイルス、AAV、BPV等を包含する。多数の転写開始および終止調節領域 が単離され、種々の宿主中の異種タンパク質の転写および翻訳において有効であ ることが示されている。これら領域、単離法、取扱い法等の例は当分野で周知で ある。適当な発現条件の下で、宿主細胞は組み換え技術的に生成されるセマホリ ンまたはその類似体の源として使用できる。 安定に形質転換された細胞およびトランスジェニック動物を製造するために、 上記のセマホリンをコードする核酸を組み換え法によって宿主ゲノムに組み込む ことができる。例えば、このような配列を細胞にマイクロインジェクションし、 内性遺伝子、その類似体または偽遺伝子またはセマホリン−コード遺伝子との実 質的な同一性をもつ配列のサイトにおいて、相同性組み換えを行うことができる 。他の組み換えを主体とする方法、例えば特に多能性細胞等における、非−相同 性組み換え、内性遺伝子の相同性組み換えによる欠失法は、付随的な用途をもた らす。好ましいトランスジェニック体および安定な形質転換体は上記のレセプタ 遺伝子を過度に発現し、かつ薬剤開発における用途および疾患モデルとしての利 用が見出される。また、麻酔された細胞および動物は、開発並びに機能研究にお ける用途が見出されている。通常は囓歯目の、トランスジェニック動物をES細胞 ま たは受精卵から製造する方法は、当業者には公知である。 本明細書に記載する組成物および方法は、遺伝子治療を実施するのに利用でき る。これについては、例えばツー(Zhu)等(1993)，Science，261，209-211;グチ エレッツ(Gutierrez)等(1992)，Lancet，339，715-721を参照のこと。例えば、 細胞を、変更されたセマホリン発現または調節の実施を可能とする遺伝子調節配 列と機能可能に結合されたセマホリン配列により、トランスフェクションする。 セマホリンの翻訳を調節するために、細胞を、相補的なアンチセンスポリヌクレ オチドでトランスフェクションすることができる。セマホリントランスフェクシ ョン細胞の輸注を包含する遺伝子療法に対しては、投与は経験的に確認される多 数の変数に依存するであろう。例えば、細胞数は、輸注すべき細胞の安定性に依 存して変動するであろう。輸注用の媒体は、典型的には緩衝塩水溶液または他の 薬理的に許容される溶液である。同様に、他の投与される組成物、例えばトラン スフェクションされた核酸、タンパク質等の量は、投与法、該治療の目的等に依 存するであろう。 以下の実施例は例示の目的で与えられるものであり、本発明を限定するもので はない。 実施例 Ｉ．グラスホッパーセマホリンＩ(SEQ ID NO:57および58)(以前にファシクリンI Vと呼んだもの)の単離並びに特徴付け 選択的束生において機能する細胞表面分子を同定するために、一連のモノクロ ーナル抗体(MAb)のスクリーニングを実施した。これらのスクリーニングの大部 分において使用した免疫原は、幼生期のグラスホッパーの神経系の隣接セグメン ト神経節間の長手方向の連結部（縦軸索の集団）を由来とする膜であった。これ らのスクリーニング生成物から、MAb 3B11および8C6を使用して、２種の表面糖 タンパク質、ファシクリンＩおよびファシクリンIIを精製し、かつその特徴付け をした。これについては、バスチアニ(Bastiani)等，1987を参照のこと。これら 両者をコードする遺伝子は後にクローニングした。スノー(Snow)等，1989;ジン( Zinn)等，1988;およびハレルソン＆グッドマン(Harrelson and Goodman)，198 8を参照のこと。 これらのスクリーニング中に単離された他のMAb、MAb 6F8を本研究で選択した 。というのは、まさにファシクリンＩおよびファシクリンIIと同様に、このMAb によって認識される抗原が、CNSの発育中に軸索経路は異なるが、重複するサブ セット上で発現されるからである。この6F8抗原は、生きた処方中および活性剤 を添加してない固定処方中両者においてインキュベートした場合のMAb結合によ って示されるように、細胞表面の外側に局在しているように思われる。この6F8 抗原は、軸索の束（以下を参照）のサブセット上に発現される表面糖タンパク質 であるので、我々はこれをファシクリンIVと呼ぶ。 ファシクリンIVの発現は、軸索形成前の胚発育の初期に開始する。29%の発育 時点で、発現は正中線メセクトデルム細胞の表面上で、セグメント半分当たり、 約５〜７個の神経芽細胞および関連する外胚葉細胞上に見られる。この発現は、 ファシクリンＩおよびファシクリンII両者について観測されたメセクトデルムお よび神経芽細胞関連発現を連想させるが、各場合において、該パターンは神経芽 細胞および関連外胚葉細胞の異なるサブセットに転換される。 38%の発育時点で、該CNS中の軸索形成の開始後直ぐに、ファシクリンIVの発現 は、該軸索の表面上および３つの対、即ちMP4、MP5およびMP6正中線後代の細胞 本体、３つのＵ型運動ニューロンおよび該Ｕ型運動ニューロンに近接する幾つか の未確認のニューロン上で観測される。これは、この時点でMP1およびdMP2ニュ ーロン上に発現されるファシクリンIIおよび該Ｕ型ニューロン上に発現されるが 、如何なる正中線プリカーサ後代上にも発現されないファシクリンＩとは対照的 である。 軸索経路のサブセット上におけるファシクリンIVの発現は、40%の発育時点辺 りで、該第一の縦および交連軸索経路の確立後に、最もよく観測される。この時 点において、該タンパク質は２つの縦軸索束、交連軸索束のサブセット、該正中 線に沿って前面に延びた神経路、および分節神経(SN)および分節間神経(ISN)根 における神経束のサブセット上で発現される。 具体的には、ファシクリンIVは、該Ｕ型束、部分的には該Ｕ型ニューロンによ って開拓される縦経路（隣接する神経分節間）、およびA/P縦束（部分的には、 各神経分節内のＵ型束の発現）上で発現される。更に、ファシクリンIVは、第二 のより狭い、内側の、かつより腹側の縦経路上で発現される。該Ｕ型軸索は、該 ISNを開拓するにつれて、転回して該CNSを出る。該Ｕ型軸索および該ISN内の他 の多くの軸索はファシクリンIVを発現する。該Ｕ型束後方から該ISN接合部まで の連なりもファシクリンIV−ポジティブである。縦経路の別々のサブセットに対 するファシクリンIVの特異性は、同一の胚中でのファシクリンIVおよびファシク リンIIの発現と比較することにより理解でき、ファシクリンIVは該Ｕ型およびA/ P経路上で発現し、一方でファシクリンIIは該MP1経路で発現される。 該内側繊維路(MFT)内の軸索も、ファシクリンIVを発現する。このMFTは該正中 線プリカーサMP4、MP5およびMP6の後代の３つの対によって開拓される。このMFT は、実際に３つの別々の神経束を含む。これら２つのMP4後代の軸索は背側のMFT 束を開拓し、次いで前方交連の後方端部において分岐し、一方で該２つのMP6の 後代の軸索は腹側のMFT束を開拓し、次いで後方交連の前方端部において分岐す る。ファシクリンIVは、該６個のMP4、MP5およびMP6ニューロンの細胞本体上お よびその成長円錐および軸索上で発現され、それにつれて該MFT中を前方に延び 、かつ該２つの交連の一方において分岐する。しかしながら、この発現において は、一旦これらの軸索が分岐し、かつ該縦通路を横方向にかつ末梢神経根に向か って延び始め、そのファシクリンIVの発現は穏やかに減少する。かくして、ファ シクリンIVは、該MFT中および該前方および後方交連両者におけるその初期の分 岐中で、該軸索に対する標識となる。これは他の交連束上でも発現されるものと 考えられる。しかしながら、ファシクリンIVの交連による発現は、該後方交連の 後方端部に沿ったファシクリンIIの一時的発現または該前方並びに後方交連両者 における幾つかの異なる交連軸索束上でのファシクリンＩの発現から明白である (バスチアニ(Sastiani)等，1987;ハレルソン＆グッドマン(Harrelson and Goodm an)，1988)。 ファシクリンIVは、また該SN中の該CNSを出てゆく運動性の軸索のサブセット 上でも発現される。該SNは、これがCNSを出てゆく際に、一方は前方へのおよび 他方は後方への、２つの主な分枝に分離される。該前方分枝中の運動性の軸索の ２つの大きな束は高濃度でファシクリンIVを発現し、該後方の分枝中における運 動性軸索の一つの細い束はより低濃度で該タンパク質を発現する。ファシクリン IVは、また該ISN中の多数の軸索上でも発現される。 該CNSおよび神経根の、約40%の発育時点における、ファシクリンIV、ファシク リンIIおよびファシクリンＩの発現パターンは、そのパターンに幾分かの重なり がある（例えば、ファシクリンIVおよびファシクリンＩ両者は該Ｕ型軸索を標識 する）が、これら３種の表面糖タンパク質は、成育中のCNS中の軸索経路の別々 のサブセットを標識する。ファシクリンIVは発育中の肢芽中の上皮帯上で発現される ファシクリンIVは、周辺帯中の発育中の肢芽上皮上で発現され、34.5%の発育 時点において、これらの帯(band)は、推定上のセグメント境界をなす該上皮中の 狭窄に関して局在化することができる。転子／股関節部セグメント境界に対して 遠位の帯に加えて、帯は脛骨、大腿骨、股関節にも見られ、また発生の後期に第 五の帯が足根に見出される。ファシクリンIVは、また大腿骨の背側部における新 生の弦音器官中でも発現される。該脛骨、転子、および股関節における帯は四肢 を完全に包囲する。しかしながら、大腿帯は不完全であり、このセグメントの前 部上皮上にギャップを含む。 ファシクリンIV−ポジティブ上皮のこれら帯に関するTi1軸索経路の位置は、 該Ti1成長円錐の誘導の際のファシクリンIVの潜在的役割を示唆している。第一 に、転子におけるファシクリンIV発現の帯（これは、該Ti1成長円錐と遭遇した 際に、幅において約３個の上皮細胞径にある）は、軸方向の位置であり、そこで 該成長円錐は、近接移動から周辺分岐伸張へと再配向する。転回位置を特徴付け る該Ti1細胞はこの帯内にあり、通常は中心または近接細胞層上にある。第二に 、大腿部にはもう一つの遠位ファシクリンIV発現帯があるが、ここではTi1成長 の変化は観測されず、この帯には、ファシクリンIV発現細胞が該Ti1成長円錐に よって横断されないようなギャップがこの帯中に存在する。該Ti1軸索は、また 該股関節部内のファシクリンIV発現領域と遭遇する可能性があり、ここで該成長 円錐、該上皮細胞および該Cx1指針細胞は、未だ研究されていない。 上皮細胞の帯表面に渡るファシクリンIV発現に加えて、MAb 6F8によって可視 化されるように、ファシクリンIVタンパク質は、斑点状のパターン中のこれら細 胞の基底表面上にも見出される。この斑点状の染みは、HRP免疫細胞化学の人工 産物ではない。というのは、MAb 6F8の蛍光法による可視化も斑点状であるから である。ファシクリンIVの非−神経発現は、肢芽に制限されない。ファシクリン IV発現の周辺上皮帯は、また食道下部の下顎状構造および発達中の触覚上にも見 られる。ファシクリンIVを指向するMAbは肢芽中のTi1軸索経路の形成を変更できる 該Ti1軸索経路の形成の際の重要な選択点における、上皮帯上のファシクリンI Vの発現は、このタンパク質がこの位置において成長円錐誘導に関与するか否か という疑問を提示する。この問題に回答するために、我々は、MAb 6F8または6F8 Fabフラグメントの存在下または不在下で、正常な経路形成に必要な5%発育中に 、胚または上皮絨帯（例えば、オコーナー(O'Connor)等，1990）を培養した。こ れらの実験で使用した培養条件下で、不完全なTi1経路が四肢の14%について観測 され（チャン(Chang)等，1992）、これがこれら条件を使用して観測した異常性 のベースラインを画成する。コントロールとして、我々は他のMAbおよびそのFab フラグメントを使用したが、これらはこれらニューロンおよび上皮細胞の表面に 結合するか（表面タンパク質ファシクリンＩに対するMAb 3B11）または結合しな い（波形の核タンパク質に対するMAb 4d9;パーテル(Patel)等，1989）。MAb 6F8 のTil経路形成に及ぼすインパクトを評価するために、我々はMAb 6F8で処理した 後に観測される迷入性経路の割合を、MAb 3b11および4D9について観測された値 と比較した。我々の培養物は、成育の32%において開始し、この時該Til成長円錐 は未だ転子／股関節境界部の丁度末端の上皮に達しておらず、従ってファシクリ ンIVを発現する上皮細胞に遭遇していない。培養の約30時間後（-4%の発育）に 、胚を固定し、HRPに対する抗体で免疫染色して、該肢芽中の該Til軸索および他 のニューロンを可視化した。該Til経路のランク付けの基準および「異常」の定 義は実験手順中に詳細に記載されている。 MAb 6F8は経路形成を停止しないが、幾つかの型の明確な、異常な経路が観測 される。これらの欠陥は、一般的に成長円錐がまず該転子中のファシクリンIV発 現細胞と接触した際に開始する。通常は、該Tilニューロン各々は単一の軸索を もち、またこれら２種の細胞の軸索は該転子内の該経路の該当部分において束ね られる。MAb 6F8で処理した後に、多数の長い軸索分岐が該転子内およびその近 傍に観測される。経路の主な２つの組がこれらの分岐を採り、異常四肢の36%に おいて、多数の長い軸索分岐が、Cx1細胞の末端部領域中の下面に拡がる。該領 域はファシクリンIV発現上皮細胞の帯を含む。該転子の該下面領域において、こ れらの分枝は、しばしば近接して独立に転回して、該Cx1細胞と接触し、かくし てこの領域における該経路を完成する。 異常四肢47%において見られる、第二の主な経路欠陥の組において、軸索分枝 は異常な背面位置において該転子を離れ、かつ近接して該転子／股関節境界を横 切って拡がる。次いで、これらの軸索は、しばしば該Cx1ニューロンと接触しつ つ、下面に進路を変える。残りの17%の欠陥は該転子に対して遠位の脱束生、下 面転子近傍で転回できずに、該四肢の後方区画に連なる軸索分枝および該転子／ 股関節境界を横切り、下面への転回なしに近接して拡がる軸索分枝を含む。 MAb 6F8の存在下で培養した場合、43%の四肢が誤って形成されたTil経路を示 し(n=381)、これに比してMAb 3B11(n=230)では11%であり、またMAb 4D9(n=20)で は5%であった。これらの割合は、ハイブリドーマ上澄から濃縮したMAbによる処 理、これらの上澄から単離したIgGおよびこれらのIgG処方物から単離したFab(以 下の実験部分参照)からプールしたものである。誤って形成されたTil経路の頻度 および観測される欠陥の型は、抗体調製法および使用した抗体の型とは無関係に 、有意な変動を示さなかった。FabはIgGと同様の結果を示すので、MAb 6F8の効 果は二価のIgGによる架橋のためではない。 まとめると、MAb 6F8で処理した後、該Til経路は典型的には異常な形態を示し 、該転子の丁度末端部およびファシクリンIV発現サイトにおいて開始する。上記 Til経路欠陥の２つの最も共通した型は実験四肢の36%において生じる（MAb 6F8 で処理）が、コントロール四肢の僅かに4%において見られたに過ぎない(MAb 3B1 1および4D9で処理)。ファシクリンIVcDNAは新規な内在性タンパク質をコードする グラスホッパーファシクリンIVを、MAb 6F8カラム上に、粗製胚グラスホッパ ー溶解物を通すことにより精製した。アフィニティー精製後に、該タンパク質を 溶出し、沈殿させ、変性し、システイン位置で修飾し、かつトリプシンまたはLy s-Cで消化した。個々のペプチドは逆相HPLCによって分割し、標準的方法を利用 して微量配列決定した。 これらのタンパク分解フラグメント由来のアミノ酸配列を、PCR実験用のオリ ゴヌクレオチドプローブ生成のために使用して、生成物を得、これをジン(Zinn) 胚グラスホッパーcDNAライブラリー（スノー(Snow)等，1988）からcDNAを単離す るのに利用した。これらcDNAの配列解析は、アミノ酸の２つの強力な疎水性の伸 張をもつタンパク質をコードする単一の読み取り枠(ORF)、20個のアミノ酸のア ミノ−末端シグナル配列および25個のアミノ酸の潜在的な貫膜ドメイン（アミノ 酸627にて開始する）の存在を明らかにする。かくして、推定されたタンパク質 は605個のアミノ酸の細胞外ドメイン、貫膜ドメイン、および78個のアミノ酸の 細胞質ドメインを有する。該成熟ファシクリンIVタンパク質の計算された分子量 は80kdであり、これは以下に記載するような、アフィニティー精製された内在性 タンパク質のウエスタンブロット解析により確認される。このタンパク質の該細 胞外ドメインは16個のシステイン残基を含み、これらは３つのルーズなクラスタ ーになるが、繰り返しドメインを構成せず、かつシステイン繰り返しをもつ公知 の他のモチーフとは類似しない。また、該細胞外ドメインには、N-結合糖タンパ ク質に対する６個の可能なサイトも存在する。N-グリカナーゼによる、アフィニ ティー精製したファシクリンIVの処理は、ファシクリンIVが実際にN-結合オリゴ サッカライドを含むことを立証している。ファシクリンIVは、BLASTPを使用した PIRデータベース（アルツシュル(Altschul)等，1990）中の他のタンパク質と比 較した場合に、配列類似性を全く示さず、従ってこれは新規な型Ｉの内在性膜タ ンパク質である。 該ファシクリンIVcDNAによってコードされる該タンパク質の細胞質ドメインに 対するポリクローナル抗血清を使用して、発育40%におけるグラスホッパー胚を 染色した。観測された染色パターンはMAb 6F8について見られたものと同一であ った。ウエスタンブロット解析において、この抗血清は、我々がMAb 6F8を使用 してアフィニティー精製し、次いで微量配列決定分析に付した該タンパク質を識 別する。付随的に、該ポリクローナル血清は、グラスホッパー胚の膜由来の同様 な分子量をもつタンパク質を認識する。これらデータを一緒に考慮すると、我々 の得たこの配列が実際にファシクリンIVであることを示す。 昆虫神経系中の軸索経路のサブセットを標識する４種の他の細胞表面タンパク 質（ファシクリンＩ、ファシクリンII、ファシクリンIIIおよびニューログリア ）は、インビトロでS2細胞内にトランスフェクションした場合に、特異抗体細胞 接着を媒介できる（スノー(Snow)等，1989;エルキンス(Elkins)等，1990b;グレ ニングロー(Grenningloh)等，1990）。ファシクリンIVが特異抗体細胞接着分子 として機能できるか否かを知るために、完全なORFをもつファシクリンIVcDNAを 誘発性のメタロチオネインプロモータ（バンチ(Bunch)等，1988）の制御下にお き、S2細胞中にトランスフェクションし、正常な非−接着性S2細胞中での接着を 促進するその能力をアッセイした。銅で誘発した後、ファシクリンIVを、ウエス タンブロット解析および上記のようなポリクローナル抗血清による誘発S2細胞の 細胞表面染色によって示されるように、これらのS2細胞中で合成した。 我々はファシクリンIV発現の誘導の際に凝集が全く生じないことを観測した。 従って、このことは、他の４種のタンパク質とは対照的に、ファシクリンIVが特 異抗体細胞接着分子として機能しないことを示唆している。また、ファシクリン IV−媒介凝集が、幾つかの他の翻訳後の修飾、または該S2細胞により与えられる のではない補助因子を必要とすると考えられるが、明らかにこのタンパク質はこ のS2細胞アッセイにおいて、前にテストした他の４種の軸索糖タンパク質とは異 なる挙動を示す。このことは、該胚の四肢におけるファシクリンIVの発現パター ンと一致している。というのは、該Til成長円錐ではなく、該上皮細胞のみがフ ァシクリンIVを発現し、しかも抗体遮断実験は、ファシクリンIVがこれら成長円 錐の該上皮誘導において機能していることを示しているからである。このような 結果は、ファシクリンIVが異好性接着またはシグナル系中で機能することを示唆 している。議論 ファシクリンIVは、CNSにおいて束生状態にある軸索群上で発現され、このこ とは他の昆虫軸索糖タンパク質と全く同様に、これがこれら軸索を一緒に結合す る、特異抗体細胞接着分子として機能することを示唆している。しかも、肢芽中 では、ファシクリンIVは上皮の帯上では発現されるが、この帯に沿って再配向さ れる該成長円錐上では発現せず、このことは異好性機能を示唆している。ファシ クリンIVが特異抗体様式ではなく寧ろ異好性様式で機能することは、S2細胞凝集 アッセイにおける特異抗体接着の欠如によって支持される。これとは対照的に、 ファシクリンＩ、ファシクリンII、ファシクリンIIIおよびニューログリアは、 全て特異抗体細胞接着分子として機能できる（スノー(Snow)等，1989;エルキン ス(Elkins)等，1990b;グレニングロー(Grenningloh)等，1990）。 cDNA配列解析は、ファシクリンIVが、現時点のデータベースにおける如何なる タンパク質とも関連しない新規な配列をもつ、内在性の膜タンパク質であること を示している。従って、ファシクリンIVは新規な型のタンパク質を表し、これは 発育中の肢芽中のパイオニア成長円錐の該上皮誘導において機能している。発育 中のCNS中の軸索経路のサブセット上でこれを発現させることにより、ファシク リンIVはCNSの成長円錐の誘導においても機能する。 MAb遮断実験から得られた結果は、該四肢中でのTil成長円錐誘導および軸索形 態発生における幾つかの問題点を明らかにしている。まず、該四肢中での成長円 錐挙動の顕著な変化は、転子／股関節境界領域に遭遇した際の、基部での停止お よび突起の周辺部延長の開始である(ベントレー＆コーディー(Bentley and Caud y)，1983;コーディー＆ベントレー(Caudy and Bentley)，1987)。これは、該転 子内の上皮細胞の帯が周辺成長を促進し、あるいは該転子／股関節境界およびそ の丁度末端の領域を含む該細胞が、成長円錐の移動を阻害するか、あるいは該移 動に反発するか、あるいはその両方であることによるものと考えられる。MAb 6F 8による処理後の該転子／股関節境界を横断する多数の軸索分枝の伸張は、該転 子／股関節境界細胞（これらはファシクリンIVを発現しない）が反発性でないか あるいは阻害性であることを示唆している。かくして、該境界におけるこの挙動 の変化は、ファシクリンIV発現上皮細胞の、該Til成長円錐からの突起の周辺部 への広がりを促進する能力によるものと考えられる。 第二に、MAb 6F8による処理は、ファシクリンIV発現上皮細胞上の該転子内で の、該２つのTilニューロンの軸索の頻繁な脱束生並びに異常な多数の軸索分枝 の形成をもたらす。以前の研究は、非−神経基質上で発現されるリガンドに対す る抗体による処理（ランドメッサー(Landmesser)等，1988）または基質リガンド の推定上の競争阻害剤による処理（ワン＆デンバーグ(Wang and Denburg)，1992 ）が脱束生および高い軸索分枝形成を促進できることを示した。我々の結果は、 Til軸索：軸索束生および軸索分枝形成も、基質リガンドとの相互作用によって 強く影響され、またファシクリンIVが該転子内のこの相互作用の成分であると考 えられることを示唆している。 第三に、MAb 6F8の軸索分枝形成および該転子／股関節境界の横断に及ぼす効 果にも拘らず、依然として分枝が該転子内および該股関節の末端領域内両者にお いて下面で成長する顕著な傾向が維持されている。結局、該成長円錐の下面での 移動を促進することのできる全てのシグナルは、MAb 6F8処理によって遮断され ていなかった。抗体処理は、ファシクリンIVの下方成長指向性がより活発であっ て、他の特徴よりも該処理によって余り無力化されていない閾値効果であると考 えられ、また下方移動を促進する誘導情報は、ファシクリンIVとは独立であると 考えられる。我々が観測した該異常経路が実際に如何にして形成されるかを決定 する、経時ビデオ実験はこれらの問題を解決することができる。 これらの結果は、ファシクリンIVが、該転子／股関節境界の丁度末端部の該Ti l成長円錐に対する誘導キューとして機能し、これらの成長円錐が基底成長を停 止し、かつ周辺部へ広がるために必要とされること、およびTil経路形成におけ るファシクリンIVの機能が該Til成長円錐上でのレセプタ／リガンド間の相互作 用から生じ、また上皮細胞の帯の表面上のファシクリンIVが成長円錐形態および それに引き続く再配向における変化を生ずることを立証している。ファシクリン IVが、接着の調節、シグナル導入機能、またはこの２つの組み合わせを通して、 成長円錐の形態および配向におけるこの変化を引き出すものと考えられる。実験手順 免疫細胞化学 グラスホッパー胚を、U.C.バークレー(Berkeley)において保持されているコロ ニーから得、これを全胚の発育の割合によって段階付けした（ベントレー(Bentl ey)等，1979）。これら胚をPBS中で細断し、40分間PEM-FA(0.1M PIPES(pH6.95) ，2.0mM EGTA，1.0mM MgSO₄，3.7%ホルムアルデヒド)中で固定し、１時間PBT(1x PBS，0.5%トライトン(Triton)X-100，0.2% BSA)中で３回洗浄し、5%の正常な山 羊血清を含むPBT中で30分間遮断し、一次抗体中で４℃にて一夜インキュベート した。MAb 8G7を含むPBTの代わりに、PBSap(1xPBS，0.1%サポニン，0.2% BSA)を 使用した。抗体希釈は以下の通りであった：MAb 6F8 1:1,ファシクリンIVバクテ リア融合タンパク質に対するポリクローナル抗血清(♯98-3)1:400;MAb 8G7 1:4; MAb 8C6 1:1。これらの胚をPBT中で３回１時間に渡り洗浄し、少なくとも２時間 室温にて、二次抗体中でインキュベートした。該二次抗体はHRP-複合山羊抗−マ ウスおよび抗−ラットIgG(ジャクソンイムノリサーチラボ(Jackson Immunoresea rch Lab))であり、1:300に希釈された。胚をPBT中で３回１時間に渡り洗浄し、 次いでPBT中の0.5%ジアミノベンジジン(DAB)中で反応させた。この反応をPBS中 で数回洗浄することにより停止させ、該胚を一連のグリセリン(50%，70%，90%) 中で分離させ、ノーマルスキー(Nomarski)または明視野光学顕微鏡に載せ、観測 した。二重標識処方物として、この第一のHRP反応を0.06% NiCl含有PBT中で実施 し、次いで洗浄し、遮断し、かつ該第二の一次抗体中で一夜インキュベートした 。この第二の抗体を、上記のようにDAB反応によって可視化した。モノクローナ ル抗体の存在下で培養した胚を固定し、RITC（モレキュラープローブズ(Molecul ar Probes)）と複合化した山羊抗-HRP（ジャクソンイムノリサーチラボ(Jackson Immunoresearch Lab)）中で一夜インキュベートし、PBT中で３回１時間に渡り 洗浄し、90%グリセロール、2.5%DABCO(ポリサイエンスズ(Polysciences))中に入 れ、エピフルオレッセンス(epifluorescence)下で観察した。S2細胞を、1:400に 希釈したポリクローナル血清♯98-3で染色し、以前に記載されたように処理した （スノー(Snow)等，1989）。モノクローナル抗体遮断実験 機能遮断につきテストするために、モノクローナル抗体試薬を以下のようにし て調製した。ハイブリドーマ上澄をH₂O-飽和NH₄SO₄で20%とし、氷中で１時間イ ンキュベートし、４℃にて20分間、15000gで遠心処理した。この上澄をH₂O-飽和 NH₄SO₄で56%とし、４℃にて一夜、上記の如く遠心処理した。得られたペレット を、約1/40体積の元のハイブリドーマ上澄を使用してPBS中に再懸濁し（しばし ばスラリー状態を維持）、1xPBS(２回交換)に対して４℃にて一夜透析した。こ の試薬を「濃縮ハイブリドーマ上澄」という。精製したIgGを、イムノピュアプ ラスインモビライズドプロテインA IgGピュアリフィケーションキット(Immunopu re Plus Immobilized Protein A IgG Purification Kit;ピアース(Pierce))を使 用して得、該濃縮ハイブリドーマ上澄からIgGを単離した。Fabフラグメントを、 前に単離したIgGから、イムノピュアFabプリパレーションキット(Immunopure Fa b Preparation Kit;ピアース(Pierce))を使用して得た。遮断実験のために、各 試薬を新たに作成した補充RPMI培地(オコーナー(O'Connor)等，1990))中に希釈 し、10体積の同一の培地に対して４℃にて一夜透析した。希釈は以下の通りであ った：濃縮ハイブリドーマ上澄1:4;IgG 150mg/ml;Fab 75mg/ml。 培養実験のための胚を注意して、発育の31%〜32%に段階付けした。各クラッチ (clutch)中の胚は、典型的には相互に胚発育において1%異なるので、培養期間の 開始時点における該Tilニューロンの成長円錐はほぼ大腿中央部に位置し、該転 子／股関節境界から十分遠位にあった。各クラッチから、少なくとも２つの四肢 を切開し、上記の如く(オコーナー(O'Connor)等，1990))Tilニューロンを親油性 染料DiI(モレキュラープローブズ(Molecular Probes))で標識して、該Til成長円 錐の正確な位置を確認した。培養前に、胚を滅菌し、かつ細断した（チャン(Cha ng)等，1992）。胚を包む膜全体および背面の膜を該胚から除去し、培養中の該 試薬の利用を確認した。胚を無作為に幾つかの群に分割し、上記の遮断剤の一種 中で培養した。培養は、間欠的に攪拌することにより、30℃にて30時間実施した 。この培養期間の終了時点において、胚を固定し、免疫細胞化学により、上記の 如く分析する為に処理した。 各培養実験に対して、各肢内の該Til経路の計数は、第二の観測者により確認 した。これら二人の観測者間には統計的に有意な変動は観測されなかった。MAb 培養胚由来の四肢を、MAbを含まない培養胚由来の代表的な正常な四肢と比較し て、該正常なTil経路から大幅なズレがある場合には、異常として評価した。こ のTil経路は、以下の観測された諸特徴の１以上について異常として評価した。( 1)該経路に沿った任意の場所の約2.5mmの最小間隔についての脱束生、(2)転子内 の腹側に拡がった多数の軸索分枝、(3)Cx1細胞に対して背側で、転子／股関節境 界を横断し、かつ次いで該股関節中で腹側に転回する１以上の軸索分枝の存在、 (4)該転子／股関節セグメント境界を横断し、腹側に転回せず、かつ近接して該C NSに向かって連続する軸索分枝の存在、および(5)該転子内で腹側に拡がった軸 索が該Cx1細胞と接触せず、かつ該細胞に近接して再配向していない。テストし た各MAbに対して、観測された異常なTil経路の割合としてデータを示した。生デ ータを第１表に示す。タンパク質のアフィニティー精製および微量配列決定 グラスホッパーファシクリンIVを、粗製胚グラスホッパー溶解物(バスチアニ( Bastiani)等，1987))を、モノクローナル抗体6F8を接合したアフィーゲル(Affi- Gel)15カラム(バイオラド(Bio Rad))に通すことにより精製した。タンパク質を 、50mMのDEA(pH11.5)，0.1%のラウリルジメチルアミンオキシド（カルビオケム( Cal Bio Chem)）および１mMのEDTAにより溶出した。次いで、タンパク質を沈殿 させ、変性し、システイン部分で修飾し、トリプシンまたはLys-C(ベーリンガー −マンハイム(Boehringer-Mnnheim))によって消化した。個々のペプチドをRP-HP LCによって分割し、かつ標準的方法を利用して微量配列決定（アプライドバイオ システムズ(Applied Biosystems)4771マイクロシーケンサー(Microsequencer)) した。PCR 法 40%-50%のグラスホッパー胚由来の、poly(A)+RNAに対して相補的なDNAを調製 した（サンブロック(Sambrook)等，1989）。パーキンエルマー(Perkin Elmer)Ta qポリメラーゼ（サイキ(Saiki)等，1988）を使用してPCRを実施し、微量配列決 定により求められた幾つかのファシクリンIVペプチドのタンパク配列の一部に対 応する両配向において、オリゴヌクレオチドを部分的に縮重（グラスホッパ ーコドンバイアスを基にして）した。これらのオリゴヌクレオチドは、該ペプチ ド由来のDNA配列を全く含まないように設計され、残りの9-12塩基対を残した（ この塩基対は増幅された生成物の正確な同一性を確認のために使用できる）。こ れら配列のあらゆる可能な組み合わせを試み、40サイクルを実施した。各サイク ルのパラメータは以下の通りであった：96℃にて１分間；１分間に渡り、アニー ル温度を周期的に下げた（２℃／サイクル、65℃にて開始し、残りの35サイクル に対しては55℃にて終了した）；および72℃にて１分間。反応生成物をM13 mp10 のSmaサイト内でクローニングし、配列決定した。２つの生成物、即ち長さが107 4bpおよび288bpの生成物は、ファシクリンIVペプチド（該オリゴヌクレオチドは これを由来とする）の付随的なアミノ酸配列をコードする、該オリゴヌクレオチ ド配列に対するDNA 3'を含んでいた。これら２つのフラグメントは共通の１個の 末端をもち、これらを増幅するのに利用した該オリゴヌクレオチドは、アミノ酸 配列MYVQFGEEおよびMDEAVPAF(ファシクリンIV残基29-386)、およびHTLMDEAおよ びKNYVVRMDG(ファシクリンIV残基376-472)に対応する。 cDNAの単離及び配列分析 両方のPCR生成物を用いて、グラスホッパーの胚のcDNAライブラリーから１×1 0⁶クローンをスクリーニングした（Snowらの論文(1988)）。両方の断片とハイブ リッド形成した21クローンを回収し、かつ１個の2600bpクローンを、ジデオキシ チェインターミネーター法（Sangerらの論文(1977)）及び塩基配列決定装置(Seq uenase)（米国バイオケミカル社）を用いて、配列決定した。鋳型は、プラスミ ドクローンの超音波処理によって生じた挿入断片を含むM13 mp10ベクターから調 製した。１種のcDNAは、オリゴヌクレオチド及びプラスミドDNAの二本鎖配列決 定法（Sambrookらの論文(1989)）を用いて両方の鎖を、完全に配列決定し、ギャ ップを埋めた。更に２種のcDNAを、二本鎖配列決定法によって分析し、3'末端側 、402bpの転写物を得た。これら３種のcDNAを全て用いて、前述の完全な転写物 を含むプラスミドを構成した。この完全な転写物の配列は、全リーディングフレ ーム中に、5'末端が452bp及び3'末端が217bpであるような、終止コドンを含む翻 訳されていない配列を有する、長さ2860bpのものである。予想されたタンパク質 の配列は、FASTDB及びBLASTPプログラム（インテリジェネティックス社）を 用いて分析した。ファスシクリンIV ORFは、ファスシクリンIVのトリプシン及び Lys-Cペプチドのミクロシークエンシングによって決定された、11ペプチド配列 の中の10個を、明確に含む。 細菌性融合タンパク質からのポリクローナル抗体の作成 細菌性trpE融合タンパク質は、pATH（Koernerらの論文(1991)）ベクター、細 胞外配列をコードしている３個の制限断片、及び細胞外及び細胞内配列をコード している１個の断片（770bp HindIII/Eco RI、これはアミノ酸476-730を含む） を用いて構築した（♯98-3と指称する）。融合タンパク質は、精製した封入体抽 出物の作成によって単離し（Spindlerらの論文(1984)）、かつRIBIアジュバント （イムノケムリサーチ社）中に乳化したタンパク質-70mgを用いて、ラットを免 疫感作した。２週間間隔でラットに注射し、各注射後７日間血清を採取した。血 清は、45％発生のグラスホッパーの胚で、組織学的に試験した。構成体♯98-3は 、強力な応答を示し、かつMAb 6F8のものと同一の染色パターンを呈した。２種 の細胞外構成体は、応答が弱かったが、同様にファスシクリンIV染色パターンを 示した。免疫感作前の血清は全て、グラスホッパーの胚を染色しなかった。 S2細胞のトランスフェクション、凝集アッセイ、及びウェスタンブロット分析 完全な長さのファスシクリンIV cDNAを含む制限断片を、pRmHa-3（Bunchらの 論文(1988)）にクローン化し、かつプラスミドpPC4（Jokerstらの論文(1989)） でショウジョウバエのS2細胞（Schneiderらの論文(1972)）に共形質転換し、こ れはa-アマニチン耐性をもたらした。S2細胞は、リポフェクチン(Lipofectin)試 薬及び若干変更した推奨プロトコール(BRL)を用いて形質転換した。その他のS2 細胞の操作は、接着(adhession)アッセイを含む、本質的に論文に記載されたも のである（Snowらの論文(1989)）。形質転換した細胞株におけるファスシクリン IVの発現は、0.7mMまでのCuSO₄を添加し、かつ少なくとも48時間インキュベート することによって、接着アッセイ及び組織に関して誘導された。ノーザンブロッ ト分析は、ファスシクリンIVの転写、並びにポリクローナル血清♯98-3によるS2 細胞の表面に関連した染色を確認し、これは該細胞の表面にファスシクリンIVが 輸送されていることを、強力に示している。S2細胞及びグラスホッパーの胚の膜 の調製、PAGE、及びウェスタンブロット法を、シグナルを増幅された化学発 光式免疫検出システムキット（アメルシャム社）を用いて検出した以外は、前述 の方法に従って行った（Elkinsらの論文(1990 b)）。装載した各標本の列(lane) 毎のタンパク質の量を下記に示す：ファスシクリンIVタンパク質、-5ng；S2細胞 膜、40mg；グラスホッパーの膜、80mgであった。装載したタンパク質の量は、該 抗体と共にインキュベーションする以前に、そのブロットをポンソーS染色する ことで、変更した。 遺伝子バンク登録番号： 本願明細書中に報告された配列の登録番号は、L00709である。 II．トリボリウム（配列番号：63及び64）、ショウジョウバエ・セマホリンI（ 配列番号：59及び60）、ショウジョウバエ・セマホリンII（配列番号：61及び62 ）、ヒト・セマホリンIII（配列番号：53及び54）、ワクシニアウイルス・セマ ホリンIV（配列番号：55及び56）、及び大痘瘡（天然痘）ウイルス・セマホリン IV（配列番号：65及び66）の単離及び特徴化 我々は、ショウジョウバエ由来の可能性があるセマホリンI相同体の単離を試 みて、（cDNA及びゲノムライブラリーの両方の）標準の低緊縮性(low stringenc y)スクリーニング法において、我々のG-セマホリンI cDNAを使用した。我々はこ れらのスクリーニングには成功しなかった。この配列は新規のものであり、かつ 該データベースのいずれとも類似性がなかったので、次に我々は、その他の、よ り近縁関係の昆虫において、セマホリンI相同体を同定することができるかどう かを調べることを試みた。その後可能であるならば、これらの配列を比較し、最 大の保存配列を見つけ、かつ次にこれらの保存配列を基にしたプローブ（すなわ ちPCR用のオリゴヌクレオチドプライマー）を用いて、ショウジョウバエの相同 体を見つけようとした。 この方法において、我々は低緊縮性スクリーンで、G-セマホリンI cDNAを使用 して、バッタ(Locust)のロクスタ・ミグラトリア(Locusta migratoria)の胚のRN Aから作成したライブラリー由来の、及びコオロギのアケタ・ドメスチカ(Acheta domestica)のcDNA胚のライブラリー由来の、セマホリンI cDNA類をクローン化 した。我々はPCRを用いて、カブトムシのトリボリウム(Tribolium)のゲノムDN A由来の、及びガのマンジュカ(Manduca)由来のゲノム断片をクローン化した。そ の後、トリボリウムゲノムDNA断片を用いて、cDNAクローンを単離し、かつ最終 的にトリボリウムcDNAの完全なORFを配列決定した。 その間に、我々は完全なグラスホッパーの配列と、部分的トリボリウム及びマ ンジュカの配列を組み合わせて、ショウジョウバエのセマホリンI相同体をクロ ーン化するために、PCR用のプライマーを設計することを可能にする保存配列を 同定した。プライマーのいくつかの対は、いくつかの異なるバンドを生じ、これ をサブクローン化し、配列決定し、かつこれらのバンドのいくつかは、ショウジ ョウバエのセマホリン相同体の部分配列を提供した。これらのバンドの１つは、 我々がD-セマホリンIIと称する、明らかに異なる、より分岐した(divergent)遺 伝子である部分配列をもたらした。 PCR生成物の配列を基に、我々は２種の異なるショウジョウバエ遺伝子を同定 し、一方はセマホリンI相同体として、かつ他方は第二の関連した遺伝子として 現れたことがわかった。D-セマホリンI相同体の完全なORF配列は、G-セマホリン Iと同一の全体構造を示した：シグナル配列、システイン16個を有する約550個の アミノ酸の細胞外ドメイン、25個のアミノ酸の膜貫通ドメイン、及び117個のア ミノ酸の細胞質ドメインである。我々はD-セマホリンIIの配列決定を終了後、該 データベース中の相同体の調査を開始し、更に本願明細書中に記載されたその構 造的特徴のいくつかを明らかにした。セマホリンIIの配列は、異なる構造である ことが示された：16個のアミノ酸のシグナル配列、システイン16個を有する-525 個のアミノ酸ドメインで、66個のアミノ酸の単一の免疫グロブリン(Ig)ドメイン を伴い、それに73個のアミノ酸の短い非反復配列が続いている。ここでは、膜貫 通ドメイン又はこのタンパク質のC-末端の可能性のあるリン脂質結合(linkage) のいずれも、証拠がない。従って、D-セマホリンIIタンパク質は、それを産生す る細胞から分泌されることは明らかである。グラスホッパー、トリボリウム、及 びショウジョウバエのセマホリンI cDNA配列に加え、D-セマホリンII cDNAの配 列を、本願明細書中で示している。更に、我々は同様の方法を用いて、ガのマン ジュカ・セクスタ、バッタのロクスタ・ミグラトリア及びコオロギのアケタ・ド メスチカのセマホリンI遺伝子を同定した。 この昆虫のセマホリン遺伝子の巨大なファミリーを用いて、我々はヒト遺伝子 を探すためのPCR用プライマーを設計するために、強い相同体がある正確な(righ t)アミノ酸（それらのコドンに基づいた最少の縮重を持つ）の十分に伸長した数 を特定した。我々は、オリゴヌクレオチドプライマーのセットを設計し、かつい くつかのヒトのcDNAライブラリー：胎児脳ライブラリー（ストラータジーン社） 、及び成人海馬ライブラリーにあてはめた。我々は最終的に、自己プライマー化 せず、従ってヒトに由来する真のセマホリン様cDNAの良い候補であるような、正 確なサイズのヒトcDNAのPCRバンドを得た。これらのバンドを精製し、サブクロ ーン化し、かつ配列決定した。 全載in situハイブリッド形成実験は、D-セマホリンI及びIIが、胚のCNSにお いて、ニューロンの異なるサブセットによって発現することを示した。D-セマホ リンIは、他のニューロンに加え、正中線にそった特定の細胞によって、発現す るのに対して、D-セマホリンIIは、正中線では発現しないが、ニューロンの異な るサブセットによって発現する。更にD-セマホリンIIは、特定の運動ニューロン の神経刺激伝達期の以前及び期間中に、筋肉のサブセットによっても発現する。 多糸染色体においては、D-セマホリンI遺伝子は（遺伝子−バンド−染色体）29E 1-22Lに、かつD-セマホリンIIは53C9-102Rにマッピングされている。我々は、D- セマホリンI遺伝子における機能突然変異、及び重篤な表現型を引き起こすこと が明らかな、D-セマホリンII遺伝子におけるP-因子トランスポゾン対の挿入の消 失を確認している。 我々はG-セマホリンI、T-セマホリンI、D-セマホリンI及びD-セマホリンIIの 配列を列記し、かつ有意な類似性を有する他の配列を求めて、これらの配列を配 列データーベースを基に調べたところ、興味深い所見が見つかった：これらのセ マホリン類は、ワクシニアウイルス由来のA39Rのオープンリーディングフレーム (ORF)、並びに大痘瘡（天然痘）ウイルス由来のA43R ORFと配列の類似性を共有 し、かつこれらのウイルスのORFと共有されたアミノ酸は、昆虫のタンパク質が それらの最大の類似性を共有しているような領域と同じ部位にあることが発見さ れた。これらのウイルスのORFは、推定されるシグナル配列で始まり、セマホリ ン遺伝子と配列類似性がある数百のアミノ酸が続き、次にいずれの膜結合シグ ナルも伴わない末端を形成している（おそらく感染した細胞によって生成された タンパク質は、分泌されると考えられる。）。 我々は、これらのウイルスのセマホリンが、該ウイルスによって都合がよいよ うに利用された適当な宿主タンパク質であって、これがまさに神経系において成 長円錐の伸長を阻害することによって機能が明らかになるように、免疫系におい ては免疫応答を阻害又は減弱するようにほとんど機能する宿主の相補体(counter parts)を有するであろうと推論した。ウイルスが宿主細胞受容体の分泌された形 状をコードしていると考えられる状況に似て、これらのウイルスは、感染した細 胞に多数の分泌されたリガンドを生じさせ、阻害シグナルの模倣を引き起こし、 その結果その免疫応答の低下を促進する。 III.エピトープで標識したヒトセマホリンIII（hSIII）を用いるマウスCNSセマ ホリンIII受容体の単離及び特徴化 マウス胎児の脳組織からmRNAを単離し、これを用いて、哺乳類の発現ベクター pCMX（Davisらの論文、Science、253:59(1991)）において、cDNAライブラリーを 構成した。 このトランスフェクション及びスクリーニング法は、Linらの論文(Cell、68:7 75(1992))を変更して行った。ガラス製のスライドフラスコ上で増殖したCOS細胞 を、cDNAクローンのプールでトランスフェクションし、次にセマホリンドメイン のC-末端が平滑にされた放射性ヨウ素で標識したhSIIIと結合した。平行して、 同様に処理したCOS細胞を、セマホリンドメインのC-末端が平滑にされた標識し ていないヒトセマホリンIIIと結合し、ヒトのプロトがん遺伝子c-mycの生成物に 由来するアミノ酸10個のエクステンション(extension)と接合した。この修飾さ れたhSIIIは、hSIII受容体及び該c-myc標識のエピトープに特異性を持つマウス のモノクローナル抗体の間の架橋として、標識したリガンドを用いて、hSIII受 容体の同定をもたらす。従って、標識していないhSIIIの結合後、この細胞は、 直接標識されたモノクローナルに暴露するか、もしくはシグナル増幅を増強する ために二次抗マウス標識抗体でその後に修飾する。 その後細胞を固定し、かつ実質的にLinらの方法（前述）で、暗視野顕微鏡を 用いて、スクリーニングした。正のクローンが同定され、かつジデオキシチェイ ンターミネーター法によるマウスのCNSセマホリンIII受容体cDNAクローンの配列 分析を用い、完全長の受容体をコードしている配列を構成した。 IV．タンパク質−タンパク質であるH-SemaIII−H-SemaIII受容体薬のスクリーニ ングアッセイのプロトコール Ａ．試薬 −中和したアビジン：PBSを溶媒とする、20μg/ml −ブロッキングバッファー：PBSを溶媒とする、BSA５％、ツイーン20 0.5％；１ 時間、室温 −アッセイバッファー：KCl 100mM、HEPES 20mM pH7.6、EDTA 0.25mM、グリセロ ール１％、NP-40 0.5％、BME 50mM、BSA 1mg/ml、プロテアーゼインヒビターカ クテル − ³³P H-SemaIII 10％保存液：50,000〜500,000cpmを標識し、かつ平滑にしたH- SemaIII（ベックマンカウンター）を補充した、10^-8-10^-6Mの“冷”平滑な（セ マホリンドメイン）H-SemaIII。スクリーニング期間は、４℃で保存。 −プロテアーゼインヒビターカクテル(100×):PBS 10mlを溶媒とする、トリプシ ンインヒビター(BMB♯109894)1mg、アプロチニン(BMB♯236624)1mg、ベンズアミ ジン(Sigma♯B-6506)2.5mg、ロイペプチン(BMB♯1017128)2.5mg、APMSP(BMB♯91 7575)1mg、NaVO₃(Sigma♯S-6508)0.2mM。 −H-SemaIII受容体：PBSを溶媒とするビオチン化されたH-SemaIIIビオチン化受 容体、10^-3-10^-6M。 Ｂ．アッセイプレートの調製 −25℃で短くとも１時間、もしくは４℃で一晩、１ウェルにつき保存用N-アビジ ン120μlで被覆。 −PBS 200μlで、２回洗浄。 −ブロッキングバッファー150μlでブロック。 −PBS 200μlで、２回洗浄。 Ｃ．アッセイ −１ウェルにつきアッセイバッファー40μl添加 −候補試薬を10μl添加 −³³P-H-SemaIII 10μlを添加（5,000-50,000cpm/0.1-10pmol／ウェル＝最終濃 度10^-9-10^-7M） −混合 −25℃で、１時間インキュベート −H-SemaIII受容体40μlを添加（0.1-10pmol／アッセイバッファー40μl） −25℃で、１時間インキュベート −PBS 200μlで４回洗浄して、この反応を停止する。 −シンチレーションカクテルを150μl添加 −最高カウントを測定 Ｄ．対照のアッセイ（各プレートに配置） a.非特異的結合（受容体添加せず） b.80％の阻害で溶解（非ビオチン化された受容体） 前述の結果から、本願明細書中に記載された方法及び組成物を、診断用プロー ブ及び治療薬を調製及び同定するために使用することができることは、明らかで ある。更にこれは、宿主におけるセマホリン応答性の変更に影響を及ぼすことが できるという利益を示す本記載を読むことで、当業者にとって明らかであるだろ う。 本願明細書中に引用された出版物及び特許出願は全て、各個々の出版物又は特 許出願が参照として引用されることが明確にかつ個別に指摘されているように、 参照として本願明細書中に引用される。前述の発明は、理解を助けるために図面 及び実施例によって詳細に記載されているが、本発明の内容から見て通常の当業 者にとって、添付されたクレームの精神又は範囲を離れない範囲で、これをある 程度変更及び修飾することができることは容易に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/435 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 7/06 9356−4Ｈ 16/18 7/08 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 14/435 ＺＮＡ 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 16/18 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｎ 5/10 0276−2Ｊ Ｍ Ｃ１２Ｐ 21/02 0276−2Ｊ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 0276−2Ｊ Ｇ Ｇ０１Ｎ 33/50 0276−2Ｊ 33/566 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/53 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ ＡＢＢ 33/566 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 コロドキン アレックス エル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94720 バークレイ ライフ サイエンス アネックス 519 ユーシー バークレ イ キャンパス (72)発明者 マーティス ディヴィッド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94720 バークレイ ライフ サイエンス アネックス 519 ユーシー バークレ イ キャンパス (72)発明者 ベントレイ ディヴィッド アール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94720 バークレイ ライフ サイエンス アネックス 519 ユーシー バークレ イ キャンパス (72)発明者 オコーナー ティモシー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94720 バークレイ ライフ サイエンス アネックス 519 ユーシー バークレ イ キャンパス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．セマホリンの固有部分を含む少なくとも５個のアミノ酸を有する単離された ポリペプチドであって、かつセマホリン結合特異性を有する、単離されたペプチ ド。 ２．前記セマホリンが、ヒトのセマホリンを含む、請求の範囲第１項記載の単離 されたペプチド。 ３．請求の範囲第１項記載のペプチドと特異的に結合する、単離された抗体。 ４．請求の範囲第１項記載のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む 、単離された核酸であって、該配列が天然には該配列と結合しないようなヌクレ オチドと結合し、かつその配列がワクシニアウイルスのA39 ORF以外である、単 離された核酸。 ５．請求の範囲第３項記載の核酸を含む細胞。 ６．請求の範囲第７項記載の核酸を含むトランスジェニックゲッ歯類であって、 この核酸が、該ゲッ歯類に対して異種のものである、トランスジェニックゲッ歯 類。 ７．セマホリンの組換え固有部分の生成の方法であって、該ペプチドの発現に適 した条件下で、請求の範囲第４項記載の細胞を培養する工程、及び該ペプチドを 回収する工程を含む方法。 ８．セマホリン受容体へのセマホリンの結合に関連した疾患の診断又は治療に有 用な医薬品を同定する方法であって、下記の工程を含む方法： 請求の範囲第１項記載のペプチドに、見込みのある薬剤のパネルを接触する 工程； 該ペプチドへの、前述の多数の見込みのある薬剤の結合を測定する工程； 該ペプチドに特異的に結合する前述の多数の医薬品を同定する工程； ここで、該医薬品が、細胞内受容体へのセマホリンの結合に関連した疾患の 診断又は治療に有用であるような方法。 ９．遺伝子座に関連した神経疾患の疾病素質について患者を診断する方法であっ て、下記の工程を含む方法： 患者から体細胞を採取する工程； 該体細胞からゲノムDNAを単離する工程； 該ゲノムDNAを、請求の範囲第１項記載のペプチドをコードしているDNA配列 を含むプローブと、該プローブが相同DNAとハイブリッド形成するような条件下 で接触する工程； 前記プローブとハイブリッド形成している該ゲノムDNAの領域を同定する工 程； ここで、該領域の配列の有無が、神経疾患の疾病素質と関連している方法。 10．神経損傷又は疾患、もしくは病的ウイルス感染症を有する患者の治療法であ って、下記の工程を含む方法： 請求の範囲第１項記載のペプチド及び医薬として許容できる担体を含有する 医薬組成物を、治療に有効な量、患者に投与する工程； ここで、前記ペプチドが、該患者において、神経細胞の成長円錐機能又はウ イルス病原性を変更する方法。 11．セマホリンのアミノ酸配列と実質的に類似のアミノ酸配列を含み、かつセマ ホリンとの結合特異性を有する、単離されたポリペプチド。 12．セマホリン受容体の固有部分を含む少なくとも５個のアミノ酸を有する単離 されたペプチドであって、セマホリン受容体結合特異性を有する、単離されたポ リペプチド。 13．請求の範囲第12項記載のペプチドと、特異的に結合する、単離された抗体。 14．請求の範囲第12項記載のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む 単離された核酸であって、該配列が、天然には該配列と結合しないようなヌクレ オチドと結合している、単離された核酸。 15．請求の範囲第14項記載の核酸を含む細胞。 16．請求の範囲第12項記載のセマホリン受容体ペプチドの組換え固有部分の生成 法であって、請求の範囲第14項記載の細胞を、該ペプチド発現に適した条件下で 培養する工程、及び該ペプチドを回収する工程を含む方法。 17．細胞内受容体へのセマホリンの結合に関連した疾患の診断又は治療に有用な 医薬品を同定する方法であって、下記の工程を含む方法： 請求の範囲第12項記載のペプチドに、見込みのある薬剤のパネルを接触する 工程； 該ペプチドへの、前述の多数の見込みのある薬剤の結合を測定する工程； 該ペプチドに特異的に結合する前述の多数の医薬品を同定する工程； ここで、該医薬品が、細胞内受容体へのセマホリンの結合に関連した疾患の 診断又は治療に有用であるような方法。 18．遺伝子座に関連した神経疾患の疾病素質について患者を診断する方法であっ て、下記の工程を含む方法： 患者から体細胞を採取する工程； 該体細胞からゲノムDNAを単離する工程； 該ゲノムDNAを、請求の範囲第12項記載のペプチドをコードしているDNA配列 を含むプローブと、該プローブが相同DNAとハイブリッド形成するような条件下 で接触する工程； 前記プローブとハイブリッド形成している該ゲノムDNAの領域を同定する工 程； ここで、該領域の配列の有無が、神経疾患の疾病素質と関連している方法。 19．神経損傷又は疾患、もしくは病的ウイルス感染症を有する患者の治療法であ って、下記の工程を含む方法： 請求の範囲第12項記載のペプチド及び医薬として許容できる担体を含有する 医薬組成物を、治療に有効な量、患者に投与する工程； ここで、前記ペプチドが、該患者において、神経細胞の成長円錐機能又はウ イルス病原性を変更する方法。 20．セマホリン受容体のアミノ酸配列と実質的に類似のアミノ酸配列を含み、か つセマホリン受容体との結合特異性を有する、単離されたポリペプチド。