FR2876913A1 - Modulation de la transmission synaptique par les semaphorines et ses applications - Google Patents

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Abstract

La présente Invention est relative à l'utilisation des sémaphorines pour moduler la transmission synaptique et à ses applications, pour le traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale, et pour le criblage de médicaments actifs sur ces pathologies.

Description

La présente Invention est relative à l'utilisation des sémaphorines pour
moduler la transmission synaptique et à ses applications, pour le traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale, ainsi que pour le criblage de médicaments actifs sur ces pathologies.
Les pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale, affectant notamment la neurotransmission, englobent de nombreuses maladies génétiques et acquises caractérisées par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones (baisse d'activité ou hyperactivité) telles que par exemple: l'épilepsie, l'autisme, l'anxiété, l'angoisse, la dépression et les troubles bipolaires, le stress, l'hyperactivité, la maladie de Parkinson, la schizophrénie, les troubles du sommeil, les troubles de la santé mentale, les troubles cognitifs, en particulier liés à l'âge, les ataxies, et les pathologies affectant la neurotransmission, en particulier les maladies génétiques affectant un récepteur de neurotransmetteur. Les épilepsies sont un exemple de dérégulation de l'activité électrique cérébrale conduisant à une hyperactivité neuronale. Les anxiétés se caractérisent également par le fait que certaines régions du cerveau sont hyperactives. A l'opposé, les troubles cognitifs, notamment liés à l'âge, sont des exemples de pathologies caractérisées par une diminution de l'activité des réseaux neuronaux.
Les traitements de ces pathologies, lorsqu'ils existent posent des problèmes liés notamment à des effets secondaires indésirables des molécules utilisées. Par exemple, les anxiolytiques comme les benzodiazépines permettent d'abaisser le niveau d'activité neuronale en favorisant les mécanismes d'inhibition. Toutefois, la cible moléculaire de ce traitement, le GABA, est très répandue dans le système nerveux. En conséquence, ce type de traitement induit des effets secondaires comme la somnolence et la réduction des réflexes.
Une meilleure compréhension du fonctionnement des réseaux neuronaux et notamment des molécules impliquées dans la régulation de l'activité de ces réseaux, permettrait de mettre au point des médicaments mieux adaptés au traitement des pathologies liées à leur dysfonctionnement.
La famille des sémaphorines regroupe des protéines de signalisation intercellulaire, membranaires ou sécrétées, dont certaines ont une fonction de guidage des axones et l'une d'entre elle participe à la signalisation du système immunitaire.
Les sémaphorines sont caractérisées par la présence, à leur extrémité NH2, d'un domaine d'environ 500 acides aminés comprenant 17 cystéines conservées (domaine sémaphorine ou séma ; pour une revue sur les sémaphorines voir notamment Raper, J. A., Curr. Opin Neurobiol., 2000, 10, 88-). Les sémaphorines ont été divisées en 8 classes en fonction de l'organisation de domaines additionnels; les classes 1 et 2 sont présentes chez les invertébrés, les classes 3 à 7 chez les vertébrés, alors que la dernière classe (classe V) est codée par des virus. Les sémaphorines de classes 2, 3 et V sont sécrétées et les autres sont ancrées à la membrane cellulaire par une liaison de type phosphatidylinositol ou un domaine transmembranaire. Le domaine sémaphorine est un élément clé de la signalisation; il a notamment été montré pour les sémaphorines de classe 3, que des sémaphorines tronquées comprenant uniquement le domaine sémaphorine sont biologiquement actives lorsqu'elles sont produites sous la forme de dimère; le domaine carboxy-terminal contenant des acides aminé basiques et un domaine immunoglobuline facilite la liaison des sémaphorines de classe 3 à leur récepteur.
Les récepteurs des sémaphorines sont des complexes multimoléculaires comprenant des neuropilines (NP-1 ou NP-2), des plexines et des molécules d'adhésion cellulaire de la superfamille des immunoglobulines (L1; Raper et al., précité ; Castellani et al., Neuron, 2000, 27, 237-249) ; les neuropilines à elles seules sont capables de lier les sémaphorines mais la transduction du signal implique la présence de plexine et de molécule d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines qui jouent le rôle de co-récepteurs. En outre, il a été montré que les différentes sémaphorines jouent le rôle d'agonistes ou d'antagonistes vis-à-vis des récepteurs NP1 et NP-2; par exemple SémaA et SémaE sont des antagonistes du récepteur NP-1 et des agonistes du récepteur NP-2 (Takahashi et al., Nature Neuroscience, 1998, 1, 487-493).
Parmi les sémaphorines de vertébrés, les sémaphorines sécrétées (classe 3) ont été particulièrement étudiées. Au moins six membres qui jouent un rôle important dans le développement du tissu nerveux, ont été identifiés (Séma3A à 3F).
Ces molécules représentent un signal majeur de répulsion pour le guidage des axones, empêchant ainsi les axones d'innerver des territoires inappropriés du tissu nerveux en développement (Raper, précité). Ainsi, les sémaphorines apportent des contraintes structurales au bourgeonnement associé au cablage physiologique du système nerveux (Giger et al., J. Neurosci. Res., 1998, 52, 27-). La régulation positive de leur expression après une lésion suggère que les sémaphorines pourraient également limiter la régénération axonale chez l'adulte (Giger et al., précité ; Pasterkamp et al., Brain. Res. Dev., 2001, 35, 36- ; Niclou et al., Mol. Cell. Neurosci., 2003, 24, 902-). Ces propriétés des sémaphorines sont liées à leur capacité à modeler la morphologie des terminaisons axonales; elles provoquent des réarrangements dynamiques de l'actine du cytosquelette qui induisent la rétraction ou l'extension des composants filopodes ou lamellipodes des cônes de croissance (Liu et Strittmatter, Curr. Opini., Cell. Biol., 2001, 13, 619-).
Il a notamment été montré qu'une forme soluble du récepteur LI ou un peptide mimant L1 (ASNKL, FASNKL, FASNKLGTAM) sont capables d'inhiber le signal de répulsion induit par Séma3A et sont donc utiles comme médicament pour favoriser la régénération neuronale/axonale et traiter les maladies neurodégénératives (Demande Internationale WO 03/089470).
En outre, le brevet US 5639856 suggère l'utilisation de fragments peptidiques de sémaphorines représentant des antagonistes de récepteurs de sémaphorines, pour bloquer le signal de répulsion induit par le sémaphorines au niveau du cône de croissance des neurones, de façon à favoriser la régénération neuronale/axonale post-traumatique et traiter les maladies neurodégénératives.
Les inventeurs ont montré que les sémaphorines qui jouent un rôle dans le développement des réseaux neuronaux au cours du développement embryonnaire sont également capables de moduler la transmission synaptique chez l'adulte.
La mise en évidence de cette nouvelle propriété des sémaphorines, liée à la liaison des sémaphorines à un récepteur synaptique, ouvre des perspectives très intéressantes pour le traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale.
En conséquence, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par une sémaphorine et un modulateur de sémaphorine, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale.
Définitions - On entend par sémaphorine, une protéine de la famille des sémaphorines telle que définie ci-dessus, un dérivé fonctionnel, notamment un variant fonctionnel de ladite sémaphorine, ou bien un polynucléotide (ADN ou ARN) codant ladite sémaphorine ou ledit dérivé, de préférence inclus dans un vecteur d'expression actif dans les cellules de mammifères.
- On entend par modulateur un activateur ou un inhibiteur. - On entend par modulateur de sémaphorine un modulateur de l'expression et/ou de la fonction d'une sémaphorine.
- On entend par fonction d'une sémaphorine, la fonction modulatrice (activatrice ou inhibitrice) de la transmission synaptique de ladite sémaphorine; cette fonction résulte de la liaison de ladite sémaphorine à un récepteur synaptique et de la transduction d'un signal médié par ledit récepteur.
- On entend par dérivé fonctionnel de sémaphorine, une 15 sémaphorine modifiée possédant la fonction modulatrice de la transmission synaptique telle que définie ci-dessus.
- On entend par récepteur de sémaphorine aussi bien un récepteur qu'un corécepteur de ladite sémaphorine, à savoir: toute molécule de la membrane plasmique d'une cellule de mammifère qui est: (i) exprimée dans la région synaptique des neurones, (ii) capable de lier une sémaphorine et de transduire le signal résultant de cette liaison (récepteur au sens strict) ou de transduire le signal résultant de cette liaison (co-récepteur), et d'induire une modulation de la transmission synaptique, du fait de cette liaison.
L'effet de ladite sémaphorine ou dudit modulateur de sémaphorine sur la transmission synaptique peut être mesuré par les techniques classiques d'électrophysiologie connues de l'Homme du métier comme par exemple: le patchclamp, l'enregistrement extra-cellulaire ou l'utilisation de sondes sensibles au potentiel.
- On entend par pathologie liée à un dérèglement de l'activité 30 neuronale, affectant notamment la neurotransmission, toute maladie génétique ou acquise caractérisée par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones (baisse d'activité ou hyperactivité) telle que par exemple l'une des pathologies précitées.
L'invention englobe l'utilisation de sémaphorines de n'importe quelle espèce (vertébré ou invertébré). Les séquences de sémaphorines de certaines espèces (séquences d'ADNc et séquences en acides aminés correspondantes) sont disponibles dans les bases de données de séquences, notamment dans GENBANK et dans la base de données du NCBI.
Les séquences de sémaphorines d'autres espèces peuvent être déterminées par clonage de lADNc correspondant, à l'aide d'amorces choisies à partir des séquences connues, selon les techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'Homme du métier.
L'invention englobe également l'utilisation de dérivés de sémaphorine (sémaphorines modifiées), notamment de variants de sémaphorine correspondant à une protéine fonctionnelle telle que définie ci-dessus. Les modifications qui sont introduites dans ladite protéine par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon nonlimitative: mutation (insertion, délétion, substitution) d'au moins un acide aminé dans la séquence de ladite sémaphorine (obtention de variants de sémaphorine), addition d'une séquence de fusion (obtention d'une protéine de fusion ou protéine chimérique), substitution de résidus d'acides aminés par des résidus d'acides aminés non-naturels (acides aminés D ou analogues d'acides aminés), modification de la liaison peptidique, cyclisation, addition de groupements chimiques au niveau des chaînes latérales des acides aminés, couplage à une molécule d'intérêt, notamment une molécule permettant le passage de la barrrière hématoméningée; ledit couplage est réalisé par l'intermédiaire d'une liaison non-covalente ou covalente telle qu'une liaison peptidique (obtention d'une sémaphorine chimérique). En outre, lorsque ladite sémaphorine correspond à une protéine membranaire, elle peut avantageusement être tronquée, notamment par délétion du domaine transmembranaire, de façon à obtenir une protéine sécrétée. Ces modifications sont destinées en particulier à moduler (augmenter ou diminuer) l'affinité ou la spécificité des sémaphorines pour un de leur récepteur, à augmenter la stabilité, la pénétration et la diffusion dans le tissu nerveux, ou à faciliter la purification desdites protéines.
Les vecteurs dans lesquels on peut insérer une séquence d'intérêt dans une cassette d'expression contenant les éléments régulateurs de transcription et de traduction appropriés (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote, sont connus de l'Homme du métier; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte). On peut utiliser entre autres les acides nucléiques nus (ADN, ARN, linéaire ou circulaire), notamment les plasmides, et les vecteurs viraux tels que les adénovirus, notamment les adénovirus canins, les rétrovirus, les lentivirus, les herpesvirus, les AAV (Adeno-Associated-Virus), les poxvirus, et en particulier les canarypox, les rhabdovirus et le virus de l'encéphalite vénézuélienne. De préférence, on utilise des vecteurs possédant un tropisme naturel pour le tissu nerveux (herpesvirus, rhabdovirus, virus de l'encéphalite vénézuélienne) ou induit par la formation de pseudo-particules virales comprenant une protéine d'enveloppe d'un virus neurotrope comme notamment la glycoprotéine du virus de la rage (lentivirus pseudotypé, par exemple).
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite 20 sémaphorine est sécrétée; de préférence il s'agit d'une sémaphorine de classe 3, comme par exemple Séma3A.
Parmi les modulateurs de sémaphorine, on peut citer les substances qui modulent la réponse des sémaphorines dans le guidage axonal, ainsi que les agonistes et les antagonistes de récepteur de sémaphorine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit modulateur est sélectionné dans le groupe constitué par les nucléotides cycliques et le monoxyde d'azote.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant sélectionné dans le groupe constitué par: les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines (IgCAM).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant exprimé dans la région synaptique des neurones.
Selon une disposition avantageuse de ces modes de réalisation, ledit 5 récepteur est la neuropiline NP-1.
Un agoniste de récepteur de sémaphorine est défini dans la présente invention, par toute molécule capable de mimer l'effet de ladite sémaphorine sur un récepteur synaptique, c'est-à-dire une molécule capable de mimer la liaison de la sémaphorine audit récepteur synaptique et/ou d'induire la transduction du signal médié par ledit récepteur ou l'un de ses co-récepteurs.
Un antagoniste de récepteur de sémaphorine est défini dans la présente invention par, toute molécule capable d'inhiber/bloquer l'effet de ladite sémaphorine sur un récepteur synaptique, c'est-à-dire une molécule capable d'inhiber la liaison de la sémaphorine audit récepteur synaptique et/ou d'inhiber la transduction du signal médié par ledit récepteur ou l'un de ses co-récepteurs; en outre l'inhibition de cette liaison peut être de nature compétitive (antagoniste se liant au récepteur) ou non- compétitive (antagoniste se liant à la sémaphorine).
Cette définition englobe les sémaphorines dans la mesure où les différentes sémaphorines jouent le rôle d'agonistes ou d'antagonistes, vis-à-vis des récepteurs NP-1 et NP-2; par exemple SémaA et SémaE sont des antagonistes du récepteur NP-1 et des agonistes du récepteur NP-2 (Takahashi et al., Nature Neuroscience, 1998, 1, 487-493).
Des molécules capables de mimer la liaison d'une sémaphorine à un récepteur synaptique sont notamment des fragments de sémaphorine incluant le site de liaison audit récepteur ou d'autres molécules, notamment des peptides mimant le site de liaison au récepteur de ladite sémaphorine (mimotope de sémaphorine).
Des molécules capables d'inhiber la liaison d'une sémaphorine à un récepteur synaptique sont notamment des fragments de ladite sémaphorine incluant le site de liaison audit récepteur ou des fragments de récepteur incluant le site de liaison à ladite sémaphorine, ou bien d'autres molécules, notamment des peptides mimant, soit le site de liaison au récepteur de ladite sémaphorine (mimotope de la sémaphorine), soit le site de liaison à la sémaphorine du dit récepteur (mimotope du récepteur).
Parmi ces fragments, on peut citer notamment les peptides décrits dans le Brevet US 5639856 et dans la Demande Internationale WO 03/089470.
D'autres mimotopes peuvent notamment être isolés, par criblage d'une banque de molécules, par un test de liaison à un anticorps dirigé contre ledit site de liaison de la sémaphorine (mimotope de sémaphorine) ou du récepteur de la sémaphorine (mimotope de récepteur).
En outres d'autres agonistes ou antagonistes de récepteur de sémaphorine peuvent également être identifiés par un test fonctionnel permettant de mesurer la transmission synaptique, à l'aide d'une méthode connue de l'Homme du métier, comme précisé ci-dessus.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite molécule est associée à au moins une substance permettant le franchissement de la barrière hémato-méningée. Parmi ces substances, on peut citer notamment des peptides membranaires, tels que les peptides Pep:TransTM (http://www.syntem.com/english/techpeptrans.html).
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite pathologie est caractérisée par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones (baisse d'activité ou hyperactivité) et est sélectionnée dans le groupe constitué par: l'épilepsie, l'autisme, l'anxiété, l'angoisse, la dépression et les troubles bipolaires, le stress, l'hyperactivité, la maladie de Parkinson, la schizophrénie, les troubles du sommeil, les troubles de la santé mentale, les troubles cognitifs, en particulier liés à l'âge, les ataxies, et les pathologies affectant la neurotransmission, en particulier les maladies génétiques affectant un récepteur de neurotransmetteur.
Conformément à l'invention, ladite molécule (sémaphorine ou modulateur de sémaphorine) est sous la forme d'une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou une substance porteuse.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.
Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par: les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactideco-glycolide)) ou aurifère, et les nanoparticules.
Ladite composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale,intra-rachidienne), entérale (orale, sublinguale), ou locale (intracérébrale: intra-thécale ou intraventriculaire) ou par toute autre voie, et éventuellement par voies multiples.
Elle peut être administrée en une ou plusieurs fois ou en libération continue (perfusion), notamment au moyen de micropompes osmotiques ou associés à tout moyen physique ou chimique, notamment à des agents encapsulants comme les systèmes de dispersion collloïdaux et les polymères, afin d'avoir une dose thérapeutiquement efficace au site d'action (tissu nerveux).
Elle peut se présenter sous la forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granules, de sirop, de suppositoires, de préparations injectables, de pommades, de crèmes, de gels, d'aérosol, lesquels sont préparés selon les méthodes usuelles. Dans ces formes galéniques, ladite molécule est incorporée à des excipients habituellement employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Ladite molécule est destinée à être introduite in vivo dans les cellulescibles (neurones), soit par diffusion passive, soit en utilisant des méthodes physiques telles que la microinjection, soit en l'associant à toute(s) substance(s) permettant le passage de la barrière hématoméningée.
Elle peut notamment être administrée directement au niveau de son site d'action (cerveau, moelle épinière). Alternativement, elle peut être administrée par voie parentérale, après avoir été préalablement intégrée dans un liposome ou une nanoparticule qui contient avantageusement un peptide permettant le franchissement de la barrière hémato-méningée.
La posologie utile varie en fonction de l'affection à traiter, de la voie et du rythme d'administration, ainsi que de la nature et du poids de l'espèce à traiter (humaine ou animale).
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage 5 de molécules capables de moduler la transmission synaptique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une banque de molécules à tester avec au moins un récepteur de sémaphorine, et b) la sélection des molécules capables de moduler la transmission 10 synaptique.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit récepteur est sélectionné dans le groupe constitué par les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines (IgCAM).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit récepteur est exprimé dans la région synaptique des neurones.
Selon une disposition avantageuse des modes de mise en oeuvre précédents dudit procédé, ledit récepteur est la neuropiline NP-1.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, il comprend, une étape de pré-sélection des molécules capables de se lier 20 au(x)dit(s) récepteur(s), préalablement à l'étape b) de sélection.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre dudit procédé, l'étape b) est réalisée en compétition avec une sémaphorine sécrétée, de préférence de classe 3, de manière préférée de type 3A (Séma3A).
La banque de molécules est un ensemble de molécules apparentées par leur structure, leur origine ou leur fonction, notamment une banque combinatoire incluant des molécules qui diffèrent entre elles par le remplacement systématique ou aléatoire de leurs constituants élémentaires. Il s'agit par exemple d'une banque d'oligomères tels que des peptides, des oligonucléotides (aptamères) et des oligosaccharides, d'une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps, ou bien d'une banque de molécules organiques autres que des oligomères, cycliques ou non- cycliques, notamment des petites molécules organiques, c'est-à-dire de masse moléculaire inférieure à 2500 Da, de préférence inférieure à 2000 Da, de manière préférée inférieure à 1500 Da, de manière plus préférée inférieure à 1000 Da, de manière encore plus préférée inférieure à 750 Da.
Le criblage de la banque de molécules et l'identification des molécules capables de se lier à la cible (sémaphorine ou récepteur de sémaphorine) sont réalisées par toute méthode connue de l'Homme du métier permettant la mesure de l'interaction entre deux partenaires (ELISA, transfert d'énergie par résonance (FRET), polarisation de fluorescence, résonance plasmonique de surface). Le criblage est réalisé à l'aide d'une cible ou d'un dérivé de la cible tel qu'un fragment comprenant au moins le site d'intérêt, un mimotope, ou bien encore un anticorps anti- idiotypique représentant l'image interne dudit site d'intérêt de la cible. La dite cible et ses dérivés ou bien l'anticorps ou le fragment d'anticorps sont éventuellement, immobilisés sur un support approprié, et/ou marqués par tout moyen permettant l'obtention d'un signal mesurable, connus de l'Homme du métier. En outre, la spécificité de la liaison peut être démontrée par un test de liaison en compétition, avec un ligand (sémaphorine/récepteur) marqué.
L'identification des molécules capables de moduler la transmission synaptique est réalisée par un test fonctionnel, à l'aide d'une méthode connue de l'Homme du métier, comme précisé ci-dessus; il s'agit, notamment d'un test in vitro ou ex vivo, dans un système cellulaire approprié (lignée cellulaire ou échantillon de tissu nerveux mis en culture (culture en tranche ou culture organotypique), ou bien in vivo, chez un organisme approprié. Les cellules en culture peuvent être immortalisées ou en culture primaire, adhérentes ou en suspension. L'organisme vivant peut être n'importe quel organisme de laboratoire ou d'étude (rongeurs, porcs, bovins, ovins...) transgénique ou non- transgénique.
Parmi les systèmes cellulaires et les organismes appropriés, on peut citer notamment ceux qui sont des modèles d'un processus pathologique caractérisé par un dysfonctionnement de l'activité des réseaux neuronaux ou une anomalie de décharge des neurones.
Les polynucléotides tels que définis dans l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Mc, Library of Congress, USA). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle.
Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des 5 cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.
Les protéines et dérivées (protéines de fusion ou protéine chimérique) sont produites à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier; l'ADNc est cloné dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité.
Les peptides peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 illustre la diminution de la transmission de l'excitation synaptique, induite par Séma3A. (A) Cinétique de variation de la pente du potentiel d'excitation post-synaptique (EPSP) après application de Séma3A dans le bain de liquide céphalo-rachidien artificiel. Le graphique supérieur représente la superposition de deux courbes de potentiel d'excitation post-synaptique correspondant aux coupes d'hippocampe incubées en présence de surnageant contrôle (trait fin, étoile vide), ou minutes après incubation en présence de surnageant contenant Séma3A (trait épais, étoilepleine). (B) Résumé des modifications normalisées de la pente d'EPSP, après application de surnageant contrôle (CS), de surnageant Séma3A dilué 10 fois (Séma3A/10), de surnageant Séma3A dilué 5 fois (Séma3AI5), et de surnageant Séma3A ou LIFc, non-dilués. (C) La stimulation répétée (panneau supérieur) ou prolongée (panneau inférieur) par Séma3A, induit une diminution de la transmission synaptique répétée (panneau supérieur) ou prolongée (panneau inférieur).
- la figure 2 illustre la mise en évidence de sites de liaison à la sémaphorine 3A, dans la région CAI de l'hippocampe de l'adulte. Séma3A a été incubée avec des coupes de cerveau et détectée dans la couche correspondant aux corps cellulaires et dans les régions correspondant aux dendrites apicales et distales des cellules pyramidales. L'organisation cellulaire du tissu a été visualisée par coloration au bisbenzimide. Echelle = panneaux de gauche (a, b, c, e, f, h, i) : 250 m; panneaux de droite (d, g, j) : 25 m.
- la figure 3 illustre l'expression de NP-1 dans l'hippocampe de l'adulte et sa localisation pré-synaptique. (A-a) Hybridation in situ montrant que le transcrit NP-1 est détecté dans le gyrus dentate, et les régions CA 1 et CA3. (A, b-d) Observations confocales d'expériences d'immunocytochimie sur des coupes de cerveau adulte, pour la détection, dans la région CA1, de la protéine NP-1 (b) et d'un marqueur synaptique (synaptophysine (SYN) ; c et d (agrandissement d'un région de c)). Echelle = 10 m. La colocalisation avec la synaptophysine indique que NP-1 est distribué dans le compartiment pré-synaptique. (B) Analyse du contenu en synaptophysine, PSD-95 et NP-1 d'extraits d'hippocampe adulte, de synaptosomes, de la fraction de densité non-post-synaptique (non-PSD pour non-Post-Synaptic Density) et de plusieurs fractions de densité post-synaptique (PSDI, PSDII, PSDIII). Les immunoblots indiquent que le compartiment présynaptique est enrichi en NP-1 comme en synaptophysine. En revanche, NP-1 n'est pas présente dans les fractions PSD, contrairement au marqueur postsynaptique PSD-95 qui est présent en grande quantité dans ces fractions PSD.
- la figure 4 représente un modèle du mécanisme de diminution de la transmission synaptique induit par Séma3A. A: Séma3A agit sur les axones en développement et induit une rétraction des filopodes et des lamellipodes formant le cône de croissance. Cette rétraction qui est initiée par la liaison de Séma3A avec NP-1, conduit à un effondrement du cône de croissance. B: Dans la région CAI de l'hippocampe, chez l'adulte, le récepteur NP-1 de Séma3A est exprimé au niveau de la membrane présynaptique. Séma3A qui pourrait être sécrétée par les afférences entorhinales, se lie à la protéine NP-1 du complexe moléculaire formant le récepteur et active le récepteur. Cette activation induit une réponse de rétraction morphologique de la synapse, semblable à celle de la rétraction du cône de croissance se produisant lors du guidage axonal. Cet effondrement diminue la transmission synaptique en augmentant la taille de l'espace intersynaptique.
Exemple 1: L'application de sémaphorine exogène diminue la transmission synaptique 1) Matériels et méthodes a) Electrophysiologie Des coupes d'hippocampe (400 m) ont été préparées à partir de souris âgées de six à huit semaines. Les coupes ont été réalisées dans une solution (280 mM sucrose, 26mM NaHCO3, 10 mM D-glucose, 1,3 mM KC1, 1mM CaC12, 10 mM MgC12) et maintenues pendant une heure à température ambiante, dans un liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) oxygéné (95 % 02 / 5 % CO2; ACSF: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 0,8 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 3mM CaCl2, X mM Dglucose).
Chaque coupe a été transférée dans une chambre d'enregistrement contenant du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné comme ci-dessus et maintenue à 34 C. Les neurones ont été visualisés par vidéomicroscopie infrarouge (DIC pour Differential Interference Contrast). Toutes les expériences ont été réalisées en présence de picrotoxine (100 M SIGMA), un antagoniste du récepteur au GABA de type A. La région CA1 a été séparée de la région CA3 par section au couteau de la coupe d'hippocampe avant la mesure, de façon à éviter une activité épileptiforme. Les potentiels d'excitation post-synaptique (EPSP) des champs extracellulaires ont été enregistrés dans le stratum radiatum, à l'aide de microélectrodes de mesure en verre, remplies de NaCl 3M. Les électrodes de stimulation en verre, remplies de tampon salin extracellulaire, ont été placées dans le stratum radiatum. Les stimuli (durée de 0,1 à 0,15 mS) de 0,1 à 3mA ont été délivrés à une fréquence de 0,3 Hz pour les mesures de la transmission synaptique basale. Toutes les drogues ont été appliquées dans le bain de liquide céphalo-rachidien artificiel. Les signaux analogues ont été filtrés à 3 kHz et l'acquisition des séquences de 400 ms a été réalisée à un rythme de 12 kHz à l'aide du logiciel (ACQUISITM, BIO-LOGIC). Les résultats exprimés par la moyenne + écart type, ont été analysés à l'aide du test de Mann- Whitney.
b) Production de sémaphorine et de LIFc Des cellules COS7 ont été transfectées de façon transitoire par un vecteur recombinant d'expression de la Séma3A fusionnée à une étiquette myc, à l'aide de lifofectamineTM, comme décrit dans Castellani et al., Neuron, 2000, 27, 237-.
Trois jours plus tard, le surnageant cellulaire a été récolté et dialysé pendant 3 jours, contre du liquide céphalo-rachidien artificiel. Le surnageant contenant Li Fc a été obtenu de façon similaire, à partir de cellules sécrétant Li Fc, transfectées de façon stable (Castellani et al., précité). Le surnageant contrôle est constitué par du surnageant de cellules non-transfectées, dialysé avec du liquide céphalo-rachidien artificiel.
2) Résultats L'effet des sémaphorines sur la transmission synaptique a été étudié dans l'hippocampe avec la sémaphorine 3A (Séma3A). Les potentiels d'excitation post-synaptiques des champs extracellulaires (EPSP) évoqués par la stimulation des collatérales de Schaffer ont été enregistrés dans la région CA1 de fines coupes d'hippocampe de souris âgées de 6 à 8 semaines. L'application de Séma3A exogène dans le bain, diminue de façon significative la pente de la courbe d'EPSP à 80 % 9 % de celle du groupe contrôle (n = 5 coupes, test de Mann-Whitney, p<0,001, figure 1A). La diminution de la transmission synaptique est dose dépendante, étant donné que l'application de Séma3A diluée d'un facteur 5 induit une réduction plus faible mains néanmoins significative, de la transmission synaptique (91 % 7 %, n = 3 coupes, p<0,05; figure 1B). Aucun abaissement du niveau de transmission n'est induit par l'application de Séma3A diluée d'un facteur 10 (103 + 6 %, n = 3 coupes, p>0,1, figure 1B).
De plus, l'application de surnageant contrôle, obtenu dans des conditions similaires, mais dépourvu de Séma3A, n'a aucun effet significatif sur la pente de la courbe d'EPSP (97 % + 5 %, n = 5 coupes, p>0,1, figure 1B). Cette diminution de la transmission synaptique, induite par Séma3A n'est pas associée à une réduction de la voilée pré-synaptique (100 + 1 %, n = 3, p>0,1), indiquant que Séma3A n'a pas d'effet sur l'excitabilité des axones pré-synaptiques. De plus, l'abaissement du niveau de transmission synaptique induit par Séma3A n'est pas associé à une augmentation significative du rapport de l'amplitude des réponses à une stimulation couplée (104 + 7 %, n = 5, p>0,1), suggérant que Séma3A n'agit pas en réduisant la probabilité de libération du neurotransmetteur.
La diminution de la transmission synaptique est liée de façon étroite à la présence de Séma3A dans le cerveau. Ainsi, l'application répétitive ou 5 prolongée de Séma3A, induit une diminution de la transmission synaptique répétitive ou prolongée (figure 1C).
En revanche, l'application dans le bain des coupes d'hippocampe, d'une forme soluble de la molécule d'adhésion cellulaire de la superfamille des immunoglobulines Ll (L1Fc) qui stimule efficacement la pousse des neurites, n'a pas d'effet sur la transmission synaptique (107 11 %, n = 3 coupes, p>0,5, figure 1B) dans un intervalle de temps comparable à celui de Séma3A.
Exemple 2: Analyse des sites de liaison à la Séma3A de l'hippocampe adulte 1) Matériels et méthodes Les surnageants des cellules transfectées ou non de l'exemple 1 ont été utilisés pour localiser les sites de liaison à la Sémaphorine 3A de l'hippocampe adulte, par immunomarquage. De manière plus précise, des coupes sagittales de cerveau de souris (30 m) ont été préparées à l'aide d'un vibratome. Les molécules de Séma3A-myc ont été pré-agrégées avec des immunoglobulines anti-c myc (50 gg/ml, hybridome 9E10, SIGMA), pendant 1 heure, puis incubées pendant 1 heure avec des coupes en suspension. L'immunodétection a été réalisée à l'aide d'un anticorps secondaire marqué au rouge Texas. Après des lavages en PBS, les coupes ont été contre-colorées avec du bisbenzimide (1:10000), pendant 5 minutes, puis montées avant l'observation.
2) Résultats La distribution des sites de liaison à la Sémaphorine 3A de l'hippocampe adulte, a été analysée par incubation de coupes sagittales de cerveau avec une protéine Séma3A recombinante marquée par un épitope myc. Les molécules de Séma3A ont été pré-agrégées avec des anticorps anti- myc avant l'incubation avec les coupes de cerveau. Dans ces conditions, la liaison de Séma3A est visualisée par un marquage dans les régions CA1 et CA3 de l'hippocampe, ainsi que dans le stratum granulosum et le dentate gyrus. Dans la région CA1, le marquage est distribué dans la couche de cellules pyramidales et dans la région apicale des dendrites, où les collatérales de Schaffer se terminent (Figure 2). Ainsi, des sites de liaison de Séma3A existent à un moment et à une localisation appropriée pour médier les changements dans la transmission synaptique, qui sont induits par l'application de Séma3A. Exemple 3: NP-1 est localisé dans le compartiment pré-synaptique 1) Matériels et méthodes a) Hybridation in situ La sonde d'ARN antisens complémentaire du transcrit NP-1 a été marquée à l'une de ses extrémités, à l'aide du système de transcription in vitro pour sonde à ARN (Riboprobe In vitro Transcription Systems; PROMEGA) et du mélange pour marquage de l'ARN à la Digoxygénine (DIG-RNA Labelling Mix; ROCHE). Les photos ont été prises avec un appareil photographique (DX 30 CCD; KAPPA), à l'aide du logiciel fourni par le fabricant (KAPPA).
b) Immunohistochimie Les tissus fixés ont été coupés (30 m d'épaisseur) à l'aide d'un vibratome. Les coupes ont été incubées dans du PBS 0,1 M, pH 7,4, additionné de 20 % de sérum de veau foetal, puis elles ont été incubées toute la nuit avec l'anticorps primaire: anticorps polyclonal de lapin anti-NP-1 (1: 1000) ; anticorps monoclonal de souris antisynaptophysine (1: 100, ROCHE) ; anticorps monoclonal de rat (IgG) antiLl de souris (1: 100; R&D SYSTEMS), anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-PSD-95 (1: 100, ABR). Après des lavages, les coupes ont été incubées avec un anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de lapin, couplé à la fluorescéine (NP-1) ou un anticorps d'âne anti-IgG de souris couplé au rouge Texas (synaptophysine ou PSD-95) ou anti-IgG de rat couplé au rouge Texas (LI), dilué au 1: 400 (JACKSON IMMUNORESEARCH). Les images confocales ont été obtenues à l'aide d'un microscope (Axiovert 135M, ZEISS) muni d'un objectif à immersion (63x) et d'un système d'imagerie pour confocale à enregistrement laser (LSM 410, ZEISS).
c) Fractionnement post-synaptique de densité et imu no- m empreintes (immunoblots) Les fractions de densité post-synaptique (PSD pour Post-Synaptic Density) de l'hippocampe de souris ont été préparées comme décrit dans Cho et al., Neuron, 1992, 9, 929. Brièvement, des extraits d'hippocampe de souris ont été centrifugés pour éliminer les noyaux et les débris tissulaires, le surnageant a ensuite été centrifugé à 10 000 g, de façon à obtenir un culot brut de membranes (P2). Une fraction enrichie en synaptosomes a été préparée par centrifugation en gradient discontinu de saccharose du culot P2 remis en suspension. Pour extraire la fraction PSDI, les synaptosomes ont été dilués dans 0,5 % de Triton X-100.
Les fractions PSD II et III ont été remises en suspension et centrifugées respectivement dans du Triton X-100 (0,5 %) ou du Sarcosyle (6 %). Les échantillons ont été mélangés dans du tampon de migration contenant du SDS et des quantités égales de protéines ont été séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide (7,5 %) contenant du SDS (SDS- PAGE), puis elles ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. L'immunoréactivité a été révélée avec un système de chimioluminescence. Les anticorps suivants ont été utilisés: anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-GluR2 (1:100, CHEMICON INC.), anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-synaptophysine (1: 1000, ROCHE PRODUCTS), anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-PSD95 (1: 1000, AFFINITY BIO REAGENTS) et anticorps polyclonal de lapin anti-NP-1 (1: 1000).
2) Résultats La localisation cellulaire des sites de liaison à Séma3A a été analysée en se concentrant sur NP-1. Dans un premier temps, l'expression de NP-1 et de Séma3A dans l'hippocampe de souris adulte, a été étudiée par hybridation in situ.
Le transcrit NP-1 est détecté dans les régions CA1 et CA3 et dans le gyrus dentate du cerveau adulte (figure 3). Le transcrit Séma3A est produit de façon abondante dans le gyrus dentate mais est absent dans les régions CAl et CA3. La détection immunocytochimique de NP-1 révèle un profil d'expression ressemblant à celui des sites de liaison à la sémaphorine 3A, comme le stratum pyramidale et le stratum radiatum de la région CA1. La distribution de la protéine NP-1 a été analysée en même temps que celle du marqueur synaptique synaptophysine dans une expérience de double-marquage en immunofluorescence. Les analyses confocales montrent que l'expression de NP-1 est sous la forme de points et co- localise avec le marquage de la synaptophysine dans la région CA1. Ces observations indiquent que NP-1 est un constituant des synapses de l'hippocampe (Figure 3). La localisation sub-cellulaire de NP-1 dans les compartiments synaptiques a été examinée plus en détail, par double marquage de NP-1 et du marqueur post-synaptique PSD-95. L'imagerie confocale montre que les marquages de NP-1 et de PSD-95 ne co-localisent pas mais sont étroitement apposées, indiquant que NP-1 possède une localisation pré- synaptique. L'expression synaptique de NP-let sa localisation pré- synaptique ont été confirmées à partir des fractions synaptosomales et PSD (Post-Synaptic Density), séparées par centrifugation en gradient de saccharose et extraction par le triton/sarcosyle. Les préparations ont été contrôlées par détection de marqueurs pré- et post-synaptiques, en immunoblot. Le marqueur pré-synaptique synaptophysine est détecté uniquement dans la fraction synaptosomale mais pas dans la fraction PSD. En revanche, le marqueur post-synaptique sous-unité Glu R2 du récepteur au glutamate de type AMPA, est détecté uniquement dans la fraction PSD (figure 3). Les résultats confirment ceux du double-marquage avec la synaptophysine, et démontrent la présence de NP-1 dans la fraction synaptosomale mais pas dans la fraction PSD, indiquant que NP-1 possède une localisation pré-synaptique (Figure 3). Ces profils d'expression sont compatibles avec un rôle de NP1/Séma3A au niveau des synapses, ayant des répercussions sur les neurones de la région CA1 (Figure 4).

Claims (18)

REVENDICATIONS
1 ) Utilisation d'un modulateur de sémaphorine, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale.
2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine.
3 ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit agoniste ou antagoniste est une sémaphorine.
4 ) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite sémaphorine est une sémaphorine sécrétée.
5 ) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite sémaphorine sécrétée est de classe 3.
6 ) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite sémaphorine de classe 3 est Séma3A.
7 ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant sélectionné dans le groupe constitué par: les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines (IgCAM).
8 ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant exprimé dans la région synaptique des neurones.
9 ) Utilisation selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisée en ce que ledit récepteur est la neuropiline NP-1.
10 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit modulateur est sélectionné dans le groupe constitué par les nucléotides cycliques et le monoxyde d'azote.
11 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite molécule est associée à une substance permettant le franchissement de la barrière hémato-méningée.
12 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ladite pathologie est caractérisée par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones et est sélectionnée dans le groupe constitué par: l'épilepsie, l'autisme, l'anxiété, l'angoisse, la dépression et les troubles bipolaires, le stress, l'hyperactivité, la maladie de Parkinson, la schizophrénie, les troubles du sommeil, les troubles de la santé mentale, les troubles cognitifs, en particulier liés à l'âge, les ataxies, et les pathologies affectant la neurotransmission, en particulier les maladies génétiques affectant un récepteur de neurotransmetteur.
13 ) Procédé de criblage de molécules capables de moduler la transmission synaptique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une banque de molécules à tester, avec au 10 moins un récepteur de sémaphorine, et b) la sélection des molécules capables de moduler la transmission synaptique.
14 ) Procédé de criblage selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit récepteur est sélectionné dans le groupe constitué par les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines.
15 ) Procédé de criblage selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit récepteur est exprimé dans la région pré-synaptique des neurones.
16 ) Procédé de criblage selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisé en ce que ledit récepteur est la neuropiline NP-1.
17 ) Procédé de criblage selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de pré-sélection des molécules capables de se lier au(x)dit(s) récepteur(s), préalablement à l'étape b) de sélection.
18 ) Procédé de criblage selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite étape de pré-sélection est réalisée en compétition avec une sémaphorine sécrétée, de préférence de classe 3, de manière préférée Séma3A.
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